›

Đề tài Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập từ cây cọ Hạ Long (Livistona halongensis T.H. Nguyen & Kiew) và cây Rau má [Centella asiatica (Linn.) Urban]

pdf 118 trang yendo 8760
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đề tài Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập từ cây cọ Hạ Long (Livistona halongensis T.H. Nguyen & Kiew) và cây Rau má [Centella asiatica (Linn.) Urban]", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfde_tai_nghien_cuu_cau_truc_va_hoat_tinh_sinh_hoc_mot_so_hop.pdf

Nội dung text: Đề tài Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập từ cây cọ Hạ Long (Livistona halongensis T.H. Nguyen & Kiew) và cây Rau má [Centella asiatica (Linn.) Urban]

  1. MỞ ĐẦU Công nghiệp phát triển, đời sống con người được nâng cao nhưng mặt trái của nó là thảm họa môi trường. Dẫn đến, con người gặp phải các chứng bệnh nan y như ung thư, HIV/AIDS, bệnh tim mạch hay là những dịch bệnh phức tạp, nguy hiểm mới xuất hiện gần đây: viêm đường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, v.v đồng thời một số loài động, thực vật bị đưa vào sách đỏ và tuyệt chủng. Thực tế đó đã thúc đẩy các nhà khoa học phải tìm ra các thuốc chữa bệnh mới có tác dụng chọn lọc, hiệu quả cao và giá thành rẻ hơn để điều trị các bệnh hiểm nghèo cũng như tìm cách bảo vệ, bảo tồn các loài động thực vật quý hiếm. Một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra các chất có hoạt tính tiềm năng, có thể phát triển thành thuốc chữa bệnh cho con người, gia súc và cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên. Trải qua hàng triệu năm tiến hóa các hợp chất thiên nhiên có khả năng tương thích với nhau dễ dàng, tương đối phù hợp với cơ thể sống, ít độc hơn và đặc biệt là thân thiện với môi trường. Từ thiên nhiên người ta đã phân lập được rất nhiều hợp chất có hoạt tính quý để làm thuốc chữa bệnh phục vụ cho đời sống xã hội. Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính được sử dụng trực tiếp để làm thuốc, ngoài ra chúng còn được dùng làm "Mô hình" cho các nghiên cứu tổng hợp và bán tổng hợp các loại thuốc mới. "Mô phỏng tự nhiên" là một trong những con đường đặc biệt hiệu quả và kinh tế để tìm ra các loại thuốc mới nhằm chữa bệnh cho người, gia súc và cây trồng chính vì vậy để tạo ra các loại biệt dược, thực phẩm bổ dưỡng phục vụ đời sống con người thì "Nghiên cứu sàng lọc về mặt hóa học nguồn 1
  2. tài nguyên thiên nhiên" là một trong những hướng nghiên cứu hiện đang được các nhà khoa học ở trong và ngoài nước đặc biệt quan tâm. Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có nguồn thực vật rất đa dạng và phong phú với khoảng 12.000 loài, đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá. Trong số đó đã có rất nhiều loại cây cỏ được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh cho người, gia súc và cây trồng, tuy nhiên hiệu quả kinh tế vẫn còn hạn chế bởi việc khai thác và sử dụng hầu như là vẫn dựa vào kinh nghiệm dân gian. Trong những năm gần đây, ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên đã được trang bị nhiều phương tiện hiện đại, các phương pháp nghiên cứu tiên tiến đã được áp dụng nên nhiều công trình khoa học nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của một số chi, loài, họ thực vật của Việt Nam đã được công bố, góp phần làm sáng tỏ tính năng cũng như tăng cường hiệu quả trong khai thác và sử dụng nguồn tài nguyên thiên nhiên này. Qua tra cứu họ Cau, trên thế giới có khoảng 236 chi, 3500 loài. Ở Việt Nam bao gồm 5 phân họ, 8 tông, 15 phân tông, 39 chi, 103 loài, 2 thứ. Theo thống kê của TS. Trần Thị Phương Anh [1] thì họ Cau ở Việt Nam có 39 chi, 103 loài và 2 thứ, trong đó phát hiện thêm 26 loài trong họ Cau mới thấy ở Việt Nam, đồng thời bổ sung thêm một số loài mới cho khoa học, có nhiều loài là đặc hữu của Việt Nam, nhiều loài đứng trước nguy cơ tuyệt chủng và được ghi trong Sách đỏ Việt Nam. Trong họ Cau có rất nhiều cây đã gắn liền với đời sống của nhân dân ta từ lâu đời. Ví dụ: Cây cau, cây dừa, cây cọ, cây song, cây mây, . Bao đời nay, người Việt Nam cũng như một số nơi trên thế giới như Trung Quốc, Australia, . . . đã sử dụng các loài trong họ cau để làm nhà, sản xuất đồ thủ công mỹ nghệ, làm thuốc, làm thực phẩm vv. Tuy nhiên cho đến nay hầu như có rất ít công trình nghiên cứu về cấu trúc hoá học và hoạt tính sinh học của các cây trong họ Cau của Việt Nam được công bố. 2
  3. Cây rau má là loài cây rất thường thấy ở các vùng có khí hậu nhiệt đới. Trong dân gian rau má được sử dụng để làm rau ăn, làm nước giải khát và đặc biệt nó đã được sử dụng trong nhiều bài thuốc để trị một số các chứng bệnh thường gặp ở người và gia súc. Ở Việt Nam, cây rau má cũng rất quen thuộc với chúng ta. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập từ cây cọ hạ long (Livistona halongensis T.H. Nguyen & Kiew) và cây Rau má [Centella asiatica (Linn.) Urban]” Với mục tiêu như trên, luận án đặt ra nhiệm vụ là: - Thu thập mẫu thực vật và xử lý mẫu - Điều chế các cao chiết từ mẫu thực vật - Phân lập các hợp chất từ các cao chiết mẫu thực vật - Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được - Thử hoạt tính của một số dịch chiết và hợp chất phân lập được 3
  4. Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Chi Cọ (Livistona. R. Br. ) Trên thế giới, chi Cọ (Livistona R.Br.) thuộc họ Cau (Arecaceae) có khoảng 36 loài, phân bố ở Nam và Đông Nam châu Á, Oxtrâylia, Châu Phi và rải rác một số khu vực trên thế giới [2]. Ở Việt Nam, cọ là những cây mọc hoang phổ biến ở những vùng đồi núi, trung du. Chúng còn được trồng làm cây cảnh ở nhiều nơi, và gồm có bốn loài như sau : - Cọ hạ long (Livistona halongensis T.H. Nguyen & Kiew). - Cọ [Livistona saribus (Lour.) Merrie. ex A. Chev.], còn có tên kè đỏ. - Cọ xẻ [Livistona chinensis (Jacq.) R.Br.], còn gọi là kè tàu. - Kè bắc bộ (Livistona tonkinensis Magalon). Sau đây chúng tôi xin giới thiệu tóm tắt một số loài của chi cọ: 1.1.1. Đặc điểm thực vật và ứng dụng của chi Cọ 1.1.1.1. Cây cọ xẻ (Livistona chinensis): Cây cọ xẻ được giới thiệu tại hình 1.1 Hình 1.1. Cây cọ xẻ 4
  5. Cây cọ xẻ còn gọi là kè tàu có nguồn gốc ở Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Nam Nhật Bản, Đài Loan và Việt Nam, được trồng rộng rãi ở nhiều vùng á nhiệt đới, nhiệt đới và ở nhiều đảo biển. Ở Việt Nam, cây phân bố tại Yên Bái, Tuyên Quang (Chạm Chu), Bắc Kạn, (Chợ Đồn), Thái Nguyên (Thần Sa, Đại Từ), Quảng Ninh (Ba Mùn), Hà Nội, Ninh Bình ), Kon Tum (Đắc Glei) Tên gọi Livistona chinensis do nhà khoa học người Áo Nicolaus Joseph von Jacquin phát hiện lần đầu tiên ở Trung Quốc và công bố dưới tên khoa học Latania chinensis Jacq. (1801). Về sau nhà khoa học người Anh Robert Brown cùng nhà khoa học người Đức Karl Friedrich Philipp von Martius công bố lại dưới tên Livistona chinensis (Jacq.) R.Br. ex Mart (1838); trong đó tính ngữ “chinensis” có nghĩa là ở Trung Quốc, tên tiếng Anh là Chinese fan palm hoặc Chinese fountain palm. Ở Trung Quốc nó được gọi là Bồ Quì [3]. Cây mọc đơn độc cao 8 – 15 m, đường kính 20 – 30 cm, hình trụ, nhẵn, có nhiều vòng do sẹo lá để lại. Lá hình quạt, xẻ thuỳ hình chân vịt thành nhiều thuỳ. Bẹ lá có sợi, mép lá có gai dẹp, cong. Lưỡi gốc phiến lá hình bán nguyệt có chóp. Thuỳ lá hình đường, đỉnh thuỳ xẻ đôi sâu 10 – 15 (30) cm, các thuỳ rủ xuống. Cụm hoa phân nhánh 2 – 3 lần, lá bắc cỡ 26 x 4 cm, 2 sống, xẻ một bên, không có lông, nhánh con mảnh, dài 10 – 15 cm. Hoa thành nhóm 4 – 5 hoa đính trên mấu lồi. Hoa hình cầu, có cạnh, đường kính khoảng 2 mm; đài 3, tràng hợp ở gốc, xẻ 3 thùy, hình tam giác; nhị 6, chỉ nhị ngắn, bao phấn hình bầu dục; bầu hình trứng ngược; vòi nhuỵ ngắn. Quả hình bầu dục, cỡ 1 – 1,5 x 0,8 – 1 cm có màu xanh lục. Hạt 1, hình bầu dục [1]. Cây ra hoa tháng 4, có quả tháng 5 – 6 [4] . Thu hái hạt suốt mùa thu, mùa đông, thu hái lá và rễ quanh năm, rửa sạch, phơi khô. 1.1.1.2. Cây cọ (Livistona saribus (Lour.) Merrie. ex A. Chev.): Cây cọ được giới thiệu tại hình 1.2 5
  6. Hình 1.2. Cây cọ Là một loài cây mọc đơn độc, thân cột, mang lá tập trung trên đỉnh thân tạo thành một vòm tán hình cầu. Thân cao 20 – 25 m, đường kính 15 – 30 cm, hình trụ, khi non có nhiều cuống lá còn tồn tại, sau nhẵn, có sẹo do lá để lại. Về tên gọi, ngoài cọ còn có nhiều tên khác nữa như cọ đỏ, cọ nam, kè, lá gồi , tên tiếng Trung là Đại diệp Bồ quì, tên tiếng Anh là Taraw palm. Xét về nguồn gốc, vào giữa thế kỉ 19 người ta cho rằng nó là loài được phát hiện đầu tiên ở Việt Nam. Năm 1836, nhà khoa học người Hà Lan Karl Ludwig von Blume đã công bố tên khoa học là Saribus cochinchinensis. Đến năm 1837, nhà khoa học người Đức Karl Friedrich Philipp von Martius công bố lại dưới tên khoa học là Livistona cochinchinensis. Năm 1919, nhà khoa học người Hoa Kỳ Elmer Drew Merril cùng nhà khoa học người Pháp Auguste Jean Baptiste Chevalier đã công bố lại tên khoa học là Livistona saribus [5]. Ở nước ta, cây mọc hoang vùng đồi trung du miền Bắc và miền Trung, là cây đặc sắc của rừng ven suối, đất ẩm vùng núi tới 1500m. Cây Phân bố rải rác trong rừng nhiệt đới ở Hà Giang (Bắc Quang), Bắc Kạn (Na Rì), Yên Bái, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hải Phòng (Cát Bà), Thái Nguyên, 6
  7. Hà Tây (Ba Vì: Thủ Pháp), Hà Nội, Quảng Trị, Lâm Đồng (Langbiang), Đồng Nai (Biên Hoà), TP Hồ Chí Minh (Thủ Đức). . . . Cây có dáng đẹp trồng trang trí trong các khu du lịch, resort, công viên hoặc làm cây cảnh nhỏ trồng ở chậu dùng trang trí nội thất Cây ra hoa vào tháng 12-2, ra quả vào tháng 5-7 hàng năm [4]. 1.1.1.3. Cây cọ bắc bộ (Livistona tonkinensis): Là cây đặc hữu của Việt Nam. Thân thẳng, cao 25 – 30 m, đường kính khoảng 25 cm. Khi non có nhiều cuống lá còn tồn tại, sau nhẵn, có sẹo do lá để lại. Lá xẻ thuỳ hình chân vịt cách gốc 80 – 90 cm thành 50 – 60 thuỳ. Bẹ lá có sợi. Mép cuống có gai dài 2,5 cm, lưỡi gốc phiến hình bán nguyệt có chóp, cỡ 2 x 2 cm. Thuỳ hình đường, thuỳ to nhất cỡ 130 – 150 x 4 cm, đỉnh thuỳ xẻ đôi sâu khoảng 2 cm, thuỳ thẳng đứng. Cụm hoa dài 60 – 70 cm; lá bắc cỡ 18 x 3 cm, 2 sống, xẻ một bên, có lông rải rác. Nhánh con dài khoảng 20 cm, mảnh, hoa mọc trên những mẫu lồi. Quả bầu dục, cỡ 2 – 3 x 1 – 1,5 cm, xanh màu ôliu, có cuống dài khoảng 2 mm. Cây này mọc trên đồi, núi đất, có quả vào tháng 8 đến tháng 10. Cây được trồng nhiều ở Bắc Việt Nam: Bắc Kạn (Chợ Đồn), Sơn La (Xuân Nha), Lào Cai (Bảo Thắng), Tuyên Quang (Chạm Chu), Phú Thọ (Xuân Sơn), Thanh Hoá (Bá Thước, Quan Hoa) [1]. 1.1.1.4. Cây cọ hạ long (Livistona halongensis): Cây cọ hạ long được giới thiệu tại hình 1.3 Đây là một trong 13 loài thực vật đặc hữu của Vịnh Hạ Long, mới được phát hiện từ năm 1999, là loài mới cho khoa học, đặc trưng cho hệ sinh thái rừng núi đá trên đảo miền Bắc Việt Nam. Cây đơn độc, cao đến 10 m, đường kính khoảng 20 cm. Lá xẻ thuỳ hình chân vịt thành nhiều thuỳ; bẹ lá có sợi, mép lá có gai, mặt dưới có sọc màu vàng; lưỡi gốc phiến xẻ 2 thùy tròn. Cụm hoa thẳng, dài hơn lá. Cuống cụm hoa kéo dài nên cụm hoa dài hơn lá; lá bắc hình ống. Hoa nhỏ, hình trứng, màu vàng kem nhạt, vươn lên trên tán; đài nhẵn, hình ống, đỉnh xẻ 3 thuỳ. Tràng dài khoảng 2 mm, xẻ 3 thuỳ; nhị 6 dài 7
  8. khoảng 1 mm; bầu hình bầu dục, vòi nhuỵ nhỏ. Quả hình cầu, đường kính 1 – 1,2 cm, màu xanh đậm sáng. Hình 1.3. Cây cọ hạ long Cây ra hoa từ tháng 4 đến tháng 6, có quả vào tháng 7 [1]. Cây có hình thái đẹp, thích hợp làm cây cảnh, trồng ở các khu du lịch nên có giá trị kinh tế cao, nhưng số lượng còn lại rất ít [6]. 1.1.1.5. Ứng dụng của một số loài trong chi cọ: Các loại cọ xẻ (Livistona chinensis) và kè nam (Livistona saribus; L. cochinchinensis Mart.) có hình dáng đẹp nên ở nước ta và một số nước trồng chủ yếu để làm đai xanh, tôn tạo cảnh quan cho nhiều không gian xanh đô thị, thường gặp nhất là ở các công viên, khu văn hóa, các biệt thự Ở một vài vùng cây cọ xẻ, kè nam mọc tự nhiên, người dân còn lấy lá non chầm nón, kết áo đi mưa (tơi); lá già có thể dùng để lợp nhà, đan túi xách, đan mũ, dệt chiếu, làm quạt. Thân già được dùng làm cột, làm máng nước. Gốc chồi 8
  9. lá có thể dùng làm rau ăn. Quả cọ có thể nấu chín để ăn hoặc ép lấy dầu, và là một món đặc sản của miền tây Nghệ An [10]. Rễ cây kè nam dùng chữa bạch đới, khí hư, thường phối hợp với những vị khác như rễ cau, rễ tre, rễ cây móc với lượng bằng nhau, sắc đặc uống làm 2 lần trong ngày. Liều dùng hàng ngày 6 - 12 g [11]. Theo đông y, cây cọ xẻ (Livistona chinensis) có vị ngọt và chát, tính bình, hạt làm tiêu ung thư, khối u, rễ có tác dụng giảm đau [11, 12]. Y học dân gian Trung Quốc dùng hạt cọ xẻ chữa ung thư mũi, họng, thực quản, ung thư rau, bệnh bạch cầu. Rễ cây này được dùng để trị hen suyễn, giảm đau do tiêm. Liều dùng 15-30 g, dạng thuốc sắc. Lá để trị chảy máu tử cung 1, 11]. Đơn thuốc chứa cọ xẻ ở Trung Quốc: - Chữa ác tính: Dùng hạt cọ xẻ 30 g, nấu với thịt lợn nạc 30 g trong 2 giờ. - Chảy máu tử cung: Dùng cuống lá cọ xẻ đốt thành tro, hoà vào nước uống, hoặc sao lên và nấu nước uống. - Trong vị thuốc dân gian, hạt cây cọ xẻ L. chinensis R.Br. có tên “Quỳ thụ tử”. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu về chi cọ 1.1.2.1. Thành phần hóa học * Nghiên cứu trong nước: Trước đây, hầu như chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu về các cây thuộc chi cọ. Đầu năm 2011, Giang Thị Kim Liên và cộng sự thông báo trên tạp chí Hoá học đã phân lập được 4 hợp chất từ các dịch chiết của quả cọ xẻ (Livistona chinensis), gồm: 5,7,4’-trihydroxy–3’,5’–dimetoxy– flavon (tricin, 1), 2–(hydroxy–metyl) phenyl–D–glucopyranosid (salicin, 2), stigmast–5,22–dien–3β–O–β–D–glucopyranosid (stigmasterol glucosid, 3), saccharose (4) [13]. 9
  10. OCH3 3' 2' 4' OH 8 1' 5' HO 9 O 2 OCH 7 6' 3 6 10 4 3 5 OH O 1. Tricin HO O HO O OH OH HO 2. Salicin 29 28 22 21 24 27 25 19 20 23 12 17 26 11 16 13 18 1 H 9 14 15 2 10 8 H H HO 6' 4 O 3 5 7 6 5' O 4' HO 1' 2' HO 3' HO 3. Stigmasterol glucosid 10
  11. HO 6 HO 1' 5 O O 1 2' 5' 4 OH HO O CH OH HO 2 3' 2 3 4' HO HO 4. Saccharose * Nghiên cứu trên thế giới: Trong chi cọ, cây cọ xẻ được nghiên cứu nhiều về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học. Singh, R.P. và Kaur G. (Ấn Độ) nghiên cứu định tính thành phần hoá học cho thấy rằng các hợp chất phenol có hàm lượng cao [14]. Maurer – Menestrina và cộng sự (Brazil) đã tách và xác định cấu trúc của một betaxylan (polysacharid) có nhiều nhóm thế từ nhựa quả cọ xẻ [15]. Tao Yuan và cộng sự đã phân lập và xác định được cấu trúc 14 hợp chất trong quả cọ xẻ, chúng gồm 3 chất mới là hai depsidon (5, 6), một benzofuran (7) và 11 hợp chất đã biết là: 3-stilben, 4-steroid, 3-flavan-3-ol, và 1 alkaloid : trans-3,5,3',5'-tetrahydroxy-4'-metoxy-stilben (8), cis- 3,5,3',5'-tetrahydroxy-4'-metoxy-stilben (9), 4-hydroxy-3',5'-dimetoxystilben (10), 5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3β-ol (11), 5α,8α-epidioxy-22E- ergosta-6,9,22-trien-3β-ol (12), 24-etylcholest-4-en-3-on (13), 6β-hydroxy- stigmast-4-en-3-on (14), catechin (15), epicatechin (16), epiafzelechin (17), terreusinon (18) [16]. 11
  12. 8 O 8 7 O 6 7 5 O H 6 1 6' 5 O CH 3 1' 1 6' 5' 1' OH 5' 4 2 OH HO 3 O 2' 4 2 HO 3 O 2' 9 4' 3' 9 3' 4' HO HO 7' 7' 5. Depsidon 1 6. Depsidon 2 OCH3 R3 4 5 R1 3a 3' 2' R4 3 6 4' 2 HO 7 R5 1' 1a O R2 OCH3 5' 6' 8. (E) R1=R2=R3=R5=OH R4=OCH3 9. (Z) R1=R2=R3=R5=OH R4=OCH3 7. 10. (E) R =R =OCH R = OH R =R =H Benzofuran 1 2 3 4 5 3 12
  13. Từ quả cọ xẻ, Xiaobin Zeng, và cộng sự đã tách được 11 hợp chất flavonoid với 3 chất mới (19, 20, 21) và 8 chất đã biết là: tricin (1), quercetin 3-O-β-D-glucopyranosid (22), isorhamnetin 3-O-β-D-glucopranosid (23), rhamnazin 3-O-β-D-glucopyranosid (24), (-)-epiafzelechin (25), (+)–catechin (26), 2R,3R-3,5,7,3’,5’ pentahydroxyflavan (27), (–)-catechin (28) [17]. OH OH OH HO O HO O OH HO OH OH OH OH 19. 2S,3S-3,5,7,3',5'-pentahydroxyflavan 20. 2R,3R-3,5,6,7,8,4'-hexahydroxyflavan OH OH HO O OH HO OH OH 21. 2R,3R-3,5,6,7,8,3',5'-heptahydroxyflavan Đặc biệt, từ cây cọ úc (Livistona australis), năm 2009, Samy K El- Desouky (Ai cập) và cộng sự đã phân lập từ lá 1 chất mới là dẫn xuất pyranon: 3-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-6-metyl-4H-pyran-4-on (29) [18]. Năm 2011, Mona E.S. Kassem tại trung tâm nghiên cứu quốc gia (Ai cập) cùng các cộng sự đã phân lập ra 1 hợp chất muối mới : flavon glycosid 13
  14. sunphat (30) cùng 14 hợp chất flavonoid đã biết, gồm: genkwanin-6-C-β- glucopyranosid (31), genkwanin-8-C-β-D-glucopyranosid (32), isovitexin (33), isoorientin (34), orientin (35), tricin 7-O-β- D-glucopyranosid (36) tricin 4'-O-β-glucopyranosid (37) luteolin 7-O-β-glucopyranosid (38), quercetin 3-O--glucopyranosid (22) quercetin 3-O-β-galactopyranosid (39), tricin (1), quercetin (40), apigenin (41) và luteolin (42) [19]. OCH3 OH H OH Glu OH O HO O O H3CO O HO OCH3 H OSO3Na H H OH O OH O 30. Flavon sunphat glycosid 32. Genkwanin-8-C--D-glucopyranosid 14
  15. 41. Apigenin 42. Luteolin 1.1.2.2. Hoạt tính sinh học Tại Việt Nam, Giang Thị Kim Liên và cộng sự đã báo cáo kết quả thăm dò hoạt tính sinh học các dịch chiết từ quả cọ xẻ như sau: các dịch chiết n- hexan và MeOH có hoạt tính ức chế sinh trưởng đối với vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus aureus với nồng độ IC50 lần lượt là 46,77 và 209,71 μg/ml. Ở hoạt tính chống oxi hoá, dịch chiết MeOH quả cọ xẻ có hoạt tính ức chế hoạt động của enzym peroxydaza với IC50 là 61,22 μg/ml. Dịch chiết MeOH quả cọ xẻ có hoạt tính gây độc tế bào đối với 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm là: KB (ung thư biểu mô), MCF – 7 (ung thư vú) và Hep-G2 (ung thư gan) với các giá trị IC50 lần lượt là 68,04; 88,30 và 101,25 μg/ml [13]. 15
  16. Singh, R.P. và Kaur G. (Ấn Độ) thông báo hoạt tính chống tạo mạch (antiangiogenic) và hoạt tính chống tăng sinh tế bào (antiproliferative) in vitro của dịch chiết quả và hạt cọ xẻ. Phân đoạn chứa các hợp chất phenol của cây này có hoạt tính phá màu (hemolytic) [20]. Nhóm tác giả trên cũng đưa ra giả thiết là hàm lượng cao các hợp chất phenol có trong cây cọ xẻ là nguyên nhân gây chết các tế bào [14]. Nhóm nghiên cứu của Hoang W.C. (Đài Loan) đã thông báo hoạt tính ức chế enzym sinh trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor, EGF) và enzym hoạt tính phân bào (Mitogen – activated protein kinase, MAPK) trong các dòng tế bào ung thư ở người bởi một phân đoạn protein kí hiệu là LC–X được tách và tinh chế từ hạt cọ xẻ [21]. Zhong Z.G. và cộng sự đã công bố rằng dịch chiết ethyl acetat rễ cọ xẻ thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng đối với 7 dòng tế bào ung thư thử nghiệm, bao gồm: ung thư dạ dày SGC 7901, ung thư máu L 1210, P 388D1, ung thư cuống họng Hela, ung thư gan hele 7404, ung thư hắc tố da (melanoma B16) và ung thư thần kinh chuột nhắt lai chuột cống NG 108 – 15 [22]. Dịch chiết cồn và dịch chiết nước hạt cọ xẻ đã được Cheng S. và cộng sự nghiên cứu rất chi tiết về hoạt tính ức chế tế bào ung thư máu HL 60, kết quả cho thấy dịch chiết cồn có hoạt tính tốt hơn [23]. Muneo Tsukiyama và cộng sự (Nhật Bản) đã nghiên cứu tác dụng chống tích tụ mỡ, làm căng da, chống nhăn, giảm béo của dịch chiết hạt cọ xẻ. Vì vậy, có thể nghiên cứu để sử dụng dịch chiết hạt cọ xẻ trong mĩ phẩm [24]. Ngoài ra, các hợp chất khung flavan được phân lập ra từ quả cọ xẻ như 3 chất mới (19, 20, 21) và (-)-epiafzelechin (25), (+)-catechin (26), 2R,3R- 3,5,7,3’,5’ penthahydroxyflavan (27), (–)-catechin (28) được biết đến với các hoạt tính sinh học nổi trội như: *.) Hoạt tính chống oxy hóa 16
  17. Epicatechin (25) được báo cáo là có tác động giống insulin, với các hiệu ứng bảo vệ hồng cầu. (-) Epicatechin cũng chống lại sự peroxy hóa lipid và ức chế sự tạo khối của các tiểu cầu. (-) Epicatechin có tác dụng trong việc hỗ trợ kiểm soát các biến chứng thứ cấp của bệnh tiểu đường. Các polyphenol nói chung cũng được chứng minh là hữu ích trong việc bảo tồn đảo tụy chuột in vitro [25]. Catechin (26), là một hợp chất phenol chống oxy hóa tự nhiên. Trong nghiên cứu của Nakayma và cộng sự [26], catechin thể hiện hoạt tính ngăn - chặn độc tính tế bào của O2 và H2O2 trên tế bào chuột đồng Trung Quốc V79. *.) Hoạt tính đối với hệ tim mạch: Lavollay, Neumann, Porrot, đã chứng minh: Catechin (26) có tác dụng mạnh hơn vitamin C trong việc giữ bền thành mạch, chủ yếu là do khả năng điều hòa, làm giảm sức thấm vào mao mạch, ngăn cản không cho protit của máu thẩm dịch qua các mô khác, có tác dụng dự phòng vỡ mao mạch, gây xuất huyết , gây phù thũng [27, 28]. Epicatechin (25), có thể cải thiện lưu thông máu và có lợi ích tiềm năng cho sức khỏe tim [25]. *.) Hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư Chất mới phân lập từ quả cọ xẻ: 2S,3S–3,5,7,3′,5′–pentahydroxyflavan (19) có tác dụng ức chế đáng kể đối với dòng tế bào HL–60 với IC50 là 0,2 ± 0,01 và CNE–1 với IC50 là 1,0 ± 0,1 μM áp đảo so với các hợp chất tham khảo trong các thử nghiệm [16, 17]. Hợp chất muối mới flavon glycosid sunphat (30), từ cây cọ úc (Livistona australis) được Mona E.S. Kassem (Ai cập) cùng các cộng sự phân lập ra, có hoạt tính chống oxi hoá tốt, đã được đánh giá bằng cách xác định mức glutathion (GSH) của máu [19]. 17
  18. 1.2. Chi rau má (Hydrocotyle; Centella) 1.2.1. Đặc điểm thực vật và ứng dụng Rau má là cây thân thảo, mọc hoang ở khắp nơi, đặc biệt là ở những nơi đất ẩm. Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, vào can, tỳ vị có tác dụng dưỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu. Rau má thường dùng để làm thuốc bổ dưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy. Tham khảo các tài liệu [29, 30] thấy ở Việt Nam có 12 loài rau má: *. Rau má, liên tiền thảo: Centella asiatica (L.) Urb. *. Rau má chevalier: Hydrocotyle chevalieri (Chern.) Tard. *. Rau má trung quốc: Hydrocotyle chinensis (Dunn) Craib. *. Rau má java, rau má lá to: Hydrocotyle nepalense Hook. *. Rau má pételot: Hydrocotyle petelotii Tard. *. Rau má dạng sanh cầu: Hydrocotyle pseudosanicula De Boiss. *. Rau má xiêm: Hydrocotyle siamica Craib. *. Rau má nhỏ: Hydrocotyle sibthorpioides LamK. *. Rau má bắc bộ: Hydrocotyle tonkinensis Tard. *. Rau má wilford: Hydrocotyle wilfordii Maxim. *. Rau má lá sen: Hydrocotyle vulgaris (L.) *. Rau má lá sen: Hydrocotyle bonariensis (L.) 1.2.1.1. Rau má java, rau má lá to: Cây Rau má lá to được giới thiệu tại hình 1.4 Rau má lá to (Hydrocotyle nepalense Hook), (H. javanica Thunb.), thuộc họ Hoa tán [Apiaceae], nó còn được gọi là rau má dại, rau má rừng. Cây thảo có thân mọc bò trên mặt đất, dài 0,5-1,2m. Rau má lá to thường thấy ở các nước như Nêpan, Ấn Ðộ, Trung Quốc, Malaixia, Inđônêxia và Việt Nam. Ở nước ta, cây này thường thấy mọc tập trung thành từng đám lớn 18
  19. ở những nơi ẩm ướt tại các tỉnh Lạng Sơn, Hà Tĩnh, Bắc Thái, Khánh Hoà, Lâm Ðồng, Kontum, Ninh Thuận. Hình 1.4. Cây rau má lá to Theo Đông y rau má lá to có vị cay, hơi đắng, nó có tác dụng chỉ huyết, chỉ thống tán ứ thanh nhiệt, thanh phế chỉ khái. Ở một số nước như Ấn Ðộ, Sri Lanca, Malaixia, Trung Quốc cây này được dùng trị chứng thổ huyết, ho, đau bụng, gãy xương, lở ngứa, chó cắn, làm thuốc sát trùng. Ðồng bào Dao dùng toàn cây, giã ra, rắc xuống nước để duốc cá. 1.2.1.2. Rau má nhỏ, rau má mỡ Tên khoa học: Hydrocotyle sibthorpioides Lam. (H. rotumdifolia Roxb.), thuộc họ Hoa tán [Apiaceae]. Cây thảo thân nhỏ sống nhiều năm, mọc hoang ở những chỗ ẩm thấp ven đường đi, bờ ruộng ẩm. Cây này thường được dùng để trị các chứng bệnh như: viêm gan vàng da, xơ gan cổ trướng, sỏi mật, ỉa chảy, bệnh đường tiết niệu, sỏi niệu; cảm cúm, ho, ho 19
  20. gà, viêm miệng, viêm hầu, sưng amidan viêm kết, trị viêm kẽ mô quanh móng tay, eczema, bệnh zona và chảy máu cam. 1.2.1.3. Rau má lá sen: Cây Rau má lá sen được giới thiệu tại hình 1.5 Cây rau má lá sen [Hydrocotyle vulgaris (L.)], Thuộc họ hoa tán [Apiaceae], là loài mới được phát hiện ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Hình 1.5. Cây rau má lá sen Loài rau má lá sen - Hydrocotyle vulgaris rất dễ bị nhầm với loài rau má lá sen - Hydrocotyle bonariensis bởi chúng mọc xen lẫn với nhau và có hình dạng rất giống nhau. Hai loài cây cùng tên rau má lá sen này chỉ khác nhau ở bộ phận hoa nên thường hay bị lẫn khi thu hái. 1.2.1.4. Rau má thường (Rau má): Cây Rau má thường được giới thiệu tại hình 1.6 20
  21. Trong số các loài rau má thì cây rau má thường [Centella asiatica (Linn.) Urban], là loài rau má đã được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Cây rau má thường có tên khoa học là Centella asiatica (Linn.) Urban, thuộc họ hoa tán [Apiaceae]. Ngoài ra còn có các tên gọi khác như là Tích huyết thảo, Liên tiền thảo. Ở nước ta cây này thường được gọi một cách đơn giản là rau má Rau má là loài cây thân thảo mọc bò, rễ mọc từ các mấu của thân, cây phân nhánh nhiều trên mặt đất. Lá rau má có cuống dài mọc ra từ gốc hoặc từ các mấu. Lá hình hơi tròn, có mép khía tai bèo, trông giống như những đồng tiền nhỏ xếp nối tiếp nhau. Hoa ra ở nách lá, tạo thành cụm từ 1đến 5 bông, hình tán đơn, cuống hoa màu trắng hoặc phớt đỏ. Quả dạng dẹt, có sống khá rõ ràng. Hình 1.6. Cây rau má thường Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, có tác dụng dưỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu. Nó thường dùng để làm thức ăn bổ dưỡng, thuốc sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy, trị chứng cảm mạo phong nhiệt, thuỷ đậu sởi, sốt da vàng 21
  22. mặt, viêm họng, sưng amidan, viêm khí quản, ho, viêm đường tiết niệu, đái dắt, buốt 1.2.1.5. Cây rau má trong một số bài thuốc dân gian [31] Trong dân gian ngoài việc sử dụng rất rộng rãi để làm rau ăn, làm nước giải khát , cây rau má còn được sử dụng trong một số bài thuốc dân gian như: - Toa căn bản, ra đời vào khoảng năm 1950 do cụ Võ Văn Hưng, một lương y giàu kinh nghiệm ở Miền đông nam bộ soạn. Sau đó được Bác sĩ Nguyễn Văn Hưởng, Bộ trưởng Bộ Y tế thời bấy giờ hưởng ứng và khuyến khích sử dụng. Toa này gồm 10 vị là toa thuốc rất quen thuộc ở các Bệnh viện, trạm y tế từ bộ đội đến nhân dân, đã góp phần rất lớn trong việc bảo vệ sức khoẻ nhân dân trong suốt hai thời kỳ kháng chiến chống Pháp và chống Mỹ. Toa căn bản có đặc điểm là không có độc tính, dễ sử dụng, có tác dụng kích thích tiêu hoá, nhuận gan, nhuận trường, lợi tiểu, giải độc và tăng cường sức đề kháng của cơ thể. Tuỳ theo tình trạng của người bệnh và điều kiện của địa phương mà linh động gia giảm vị thuốc hoặc liều thuốc. Toa thuốc gồm: Rau má 8 g, rễ tranh 8 g, lá muồng trâu 4 g, cỏ mần chầu 8 g, cỏ mực 8 g, cam thảo nam 8 g, ké đầu ngựa 8 g, củ sả 4 g, gừng tươi 4 g, vỏ quít 4 g. Đổ 3 chén nước sắc còn non một chén, uống lúc thuốc còn ấm. - Hoàn ích khí, dưỡng âm, trợ cơ, cứu đói. Làm thuốc bổ dưỡng cho trẻ em, người già hoặc ngưòi ốm mới khỏi hoặc dùng làm lương khô mang theo khi đi xa phòng. Toa thuốc gồm 4 vị : Lá dâu tầm, Mè đen, Bột củ mài và Rau má. Mỗi vị ngang nhau, tán bột làm hoàn, mỗi hoàn khoảng 5 g. Mỗi ngày dùng 2 lần, mỗi lần 1 hoặc 2 hoàn. - Thoái nhiệt đơn. Có công dụng giảm nhiệt, hạ sốt, trừ khát, trấn kinh. Rau má 15%, Hoạt thạch 30%, Sắn dây 20%, Sài hồ 15%, Thạch cao 10%, Cam thảo 10%. Tán bột, ngày uống 3 lần, mỗi lần 4g. 22
  23. - Thuốc hạ huyết áp. Rễ nhàu 16 g, Rễ kiến cò 12 g, Lá tre l2 g, Rễ tranh 12 g, Rễ cỏ xước 12 g, Rau má 16 g, Lá dâu 12 g, sắc uống, hoặc làm trà uống thay nước. - Sốt xuất huyết: Rau má 20 g, Cỏ mực 16 g, Rau sam 16 g, Đậu đen 16 g. Sắc uống. - Chảy máu chân răng, chảy máu cam và các chứng chảy máu: Rau má 30 g, Cỏ nhọ nồi và Trắc bá diệp mỗi vị 15 g sao, sắc nước uống. - Khí hư bạch đới: Rau má phơi khô làm thành bột dùng 2 thìa cà phê uống mỗi sáng . - Thống kinh, đau lưng, đau bụng, ăn kém uể oải: Rau má 30 g, ích mẫu 8 g, Hương nhu 12 g, Hậu phác 16 g. Ðổ 600 ml nước, sắc còn 200 ml chia 2 lần uống trong ngày. - Viêm hạnh nhân: Rau má tươi giã lấy nước cốt, hoà ít giấm nuốt từ từ. Ho, đái buốt, đái dắt: Rau má tươi giã lấy nước cốt uống hoặc sắc uống. - Viêm tấy, mẩn ngứa: Rau má trộn dầu giấm ăn, hoặc giã nát vắt lấy nước, thêm đường uống. - Thuốc lợi sữa: Rau má ăn tươi hay luộc ăn cả cái và nước. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu về chi rau má 1.2.2.1.Thành phần hóa học Từ những năm 1940, cây rau má đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Cho đến nay có rất nhiều công trình nghiên cứu công bố về thành phần hóa học của các loài cây rau má cũng như hoạt tính sinh học của chúng. Cây rau má lá sen (Hydrocotyle vulgaris) Năm 2007, từ dịch chiết ethyl acetat của cây rau má lá sen (Hydrocotyle vulgaris), nhóm tác giả Tôn Nữ Liên Hương (Trường Đại Học Cần Thơ) đã phân lập được 16 hợp chất là hexenal, (2E)-hexenal, hexen-1-ol, santalen, β- carnesen, β-cubeben và quercetin 3-O-galactopyranosid (43) [32]. 23
  24. OH OH HO O OH OH O OH O O OH HO 43. Quercetin 3-O-galactopyranosid Cây rau má [Centella asiatica (Linn.) Urban.] + Tinh dầu Nhóm tác giả Qin L.P., Ding R.X. Zhang W.D. và cộng sự đã dùng phương pháp GC - MS để nghiên cứu thành phần tinh dầu cây rau má, qua đó đã xác định 45 chất có trong tinh dầu rau má. Caryophyllen, farnesol và elemen là thành phần chính của tinh dầu rau má [33, 34]. Từ tinh dầu cây rau má sinh trưởng ở Nam Phi, nhóm tác giả này đã tìm 11 monoterpenoid, 9 monoterpenoid chứa oxy, 14 sesquiterpenoid, 5 sesquiterpenoid chứa oxy, và 1 sesquiterpenoid sulfid. α-humulen, β-caryophyllen và bicyclo-germacren là các chất chính trong tinh dầu cây này [35]. + Triterpenoid : Triterpenoid là thành phần quan trọng nhất của cây rau má. Chất lượng của cây rau má được đánh giá bởi hàm lượng của triterpenoid có trong cây. Các triterpen thu được từ cây rau má thường là các axit pentacyclic triterpen và glycosid, chứa khung ursan hoặc khung oleanan như: axit asiatic, asiaticosid, axit madecassic, madecassosid, brahmosid, axit brahmic, brahminosid, thankunisid, isothankunisid, centellosid, axit madasiatic, axit centic, axit cenellic, axit betulinic, axit indocentic, 24
  25. + Flavonoid: Kết quả nghiên cứu của Zainol M. K., Abd-Hamid A., Yusof S., cho thấy quercetin và kaempferol, catechin, rutin và naringin là các hợp chất phenolic chính của cây rau má [36]. + Các hợp chất khác Các hợp chất dạng polysaccharid, polyin, alken, acid amin, acid béo, sesquiterpen, alkaloid, sterol, carotenoid, tanin, chlorophyl, pectin, các muối vô cơ, cũng đã được tìm thấy ở cây rau má. Từ cây rau má Centella asiatica (Linn.) Urban, sinh trưởng ở Srilanka, nhóm tác giả người Nhật (Hisashi Matsuda - Trường đại học Dược, Kyoto- Nhật Bản) đã phân lập được 8 tritecpen glycosid là: centellasaponin A (44), centellasaponin B (45), centellasaponin C (46), centellasaponin D (47), madecassosid (48), asiaticosid (49), asiaticosid B (50) và sceffoleosid (51) [37]. 44: Centellasaponin A 45: Centellasaponin B 25
  26. 46 : Centellasaponin C 47 : Centellasaponin D H C O HO O O HO O OH OH H R O OH HO OH OH O OH HO O CH3 HO OH 48: Madecassosid (R = OH) 50: Asiaticosid B (R = OH) 49 : Asiaticosid (R = H) 51: Sceffoleosid (R = H) Wan-joo-Kim và các cộng sự - Trường đại học Seoun, Hàn Quốc đã phân lập được 4 tritecpen từ cây rau má của Indonesia là: madecassosid (52), asiaticosid (53), axit asiatic (54) và axit madecassic (55), với hàm lượng khá cao [38]. 26
  27. 54: Axit asiatic 55: Axit madecassic Từ cây rau má (Centella asiatica), Yu Q.L. và cộng sự đã phân lập được một hợp chất mới là axit 2α,3β-20,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic (56) [39]. 56 57 Năm 2007, nhóm này còn phân lập được docosyl ferulat, bayogenin, axit 3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic (57), axit 3β,6β,23-trihydroxy- urs-12-en-28-oic (58), axit D-gulonic (59). Đây là những chất lần đầu tiên được tìm thấy ở cây rau má [40]. 27
  28. 58 59 Trong một thông báo khác, Y. Quan Lin còn phân lập thêm được một triterpnen mới là axit 2α,3 β,23-trihydroxy-urs-20-en-28-oic (60) và một saponin mới là dẫn xuất ester của chất (60) - (61): 28-O- β -L- rhamnopyranosyl (1→4)-O- β -D-glucopyranosyl-(1→6)-O- β -D- glucopyranosyl ester [41]. 60: R = H (axit 2α,3β,23-trihydroxy-urs-20-en-28-oic) 61: R = Trisaccharid Nhóm tác giả G. Govindan đã phân lập được từ cây rau má một hợp chất polyacetylen (62) [42]. 28
  29. 62: Methyl 5-[(E)-9-hydroxy-1(1-hydroxyhexeyl)-2-metoxyundeca- 3,10-dien-5,7-diynyloxy] pentanoat 1.2.2.2. Hoạt tính sinh học Cho đến nay trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu công bố về các hoạt tính sinh học của các chất được phân lập từ cây rau má, gồm có: hoạt tính gây độc tế bào, kháng ung thư, hoạt tính chống xơ vữa động mạch, hoạt tính giảm đau và kháng viêm, rút ngắn thời gian chữa lành vết thương, vết bỏng *.) Hoạt tính gây độc tế bào và kháng ung thư của axit asiatic và asiaticosid - Ya-ling Hsu và cộng sự ở khoa Dược, trường đại học Y, Cao Hùng, Đài Loan lần đầu tiên nghiên cứu tác dụng chống ung thư của axit asiatic tách từ cây rau má đối với hai dòng tế bào ung thư vú là MCF-7 và MDA- MB-231, thấy rằng axit asiatic ức chế mạnh sự tăng sinh tế bào thông qua việc làm ngừng chu trình và gây ra giáng hoá của tế bào ung thư [43]. Trong bằng độc quyền sáng chế số US 2004/0097463A1 năm 2004, các tác giả đã sử dụng axit asiatic hoặc asiaticosid để điều trị ung thư. Các loại ung thư đã được nghiên cứu điều trị bao gồm: ung thư biểu mô, ung thư vú, ung thư túi mật, ung thư bàng quang, ung thư não, ung thư cổ, ung thư nhau thai, ung thư dạ dầy, ung thư màng tử cung, ung thư thực quản, ung thư tủy xương. Ngoài ra các hợp chất này còn được sử dụng điều trị bệnh tăng sinh, ví dụ như bệnh vảy nến, u mỡ, u tuyến (ví dụ polyp nội kết), bệnh đa u nang thận [44]. 29
  30. - Mi-Sook Dong và cộng sự ở trường đại học Seoul, Hàn Quốc đã nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào và chống xơ gan của 16 dẫn xuất của axit asiatic trong đó có axit asiatic và asiaticosid đối với tế bào gan HSC-T6 của chuột cống. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất của axit asiatic dao động từ 5,5 µM đến trên 2000 µM [45]. Yoshinati Ohnishi và cộng sự ở trường đại học ToKushima Nhật Bản đã nghiên cứu hoạt tính hiệp đồng ức chế sinh trưởng của tế bào ung thư ruột kết HT-29 khi sử dụng cùng với thuốc chống ung thư irinotecan hydrochlorid (CPT-11). Axit asiatic có tính độc tế bào với tế bào HT-29 tuỳ theo liều lượng. Axit asiatic đẩy nhanh quá trình giáng hoá (tự chết của tế bào) HT-29 thông qua việc hoạt hoá men caspase-3. Việc sử dụng đồng thời axit asiatic và CPT-11 hoặc axit asiatic trước, sau đó đến CPT-11 sẽ có hoạt tính theo số cộng. Tác dụng hiệp đồng sẽ có nếu sử dụng CPT-11 trước, sau đó là axit asiatic. Kết quả này cho thấy, axit asiatic có thể được sử dụng như một tác nhân làm tăng độ nhạy của tế bào ung thư ruột kết khi điều trị với CPT-11 hoặc như một tác nhân làm giảm bớt tác dụng phụ không mong muốn của thuốc CPT-11 [46]. Qua việc nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất của axit asiatic có thể thấy, các dẫn xuất có nhóm 28-COOH có hoạt tính cao hơn các dẫn xuất 28-COOR (R= CH3 hoặc glucosyl). Ba nhóm hydroxy ở vòng A cũng rất quan trọng cho hoạt tính kháng ung thư [46]. - Jung-Ae Kim và Cộng sự ở trường đại học Yeungram, Hàn Quốc đã nghiên cứu hoạt tính của axit asiatic trong việc ức chế ung thư da chuột bởi các tác nhân là 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) và 12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA). Nếu cho chuột dùng axit asiatic trước khi thử với TPA sẽ làm giảm đáng kể những tác động của TPA. Sự có mặt axit asiatic sẽ ức chế sự tạo thành nitric oxit (NO), enzym NO-synthese (NOS) và cyclooxygenase (COX-2) là nhóm tác nhân quan trọng cho sự phát triển của tế bào ung thư, đặc biệt trong giai đoạn mới phát sinh. Kết quả này 30
  31. gợi ý rằng, axit asiatic thể hiện hoạt tính kháng ung thư thông qua việc ức chế sản sinh NO và COX-2 [47]. - Trong bằng độc quyền sáng chế số 6,071,898 đăng ký tại Mỹ, nhóm tác giả Hàn Quốc đã tổng hợp một loạt dẫn xuất của axit asiatic có biến đổi ở vòng A và nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư và bảo vệ gan của chúng. Kết quả so sánh ED50 của 63 và 64 với ED50 của adriamycin cho thấy cả hai dẫn xuất này đều có hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với tế bào ung thư P388D1 [48]. 64 63 Hai hợp chất metyl A (1)-norursa-2,12-dien-23-succinyloxy-2-formyl- 28-oat (65) và metyl A (1)-norursa-2-hydroxymetyl-2,12-dien-23-hydroxy- 28-oat (66) bảo vệ được 23-41% tế bào gan bị gây độc bởi 5µg/ml CCl4 và 40-72% tế bào gan bị gây độc bởi galactosamin. 65 66 *.) Các hoạt tính khác: - Axit asiatic có khả năng làm tăng hoạt tính của thuốc kháng sinh 31
  32. Ví dụ như: Axit asiatic làm tăng hoạt tính của ciprofloxacin và tobramycin đối với dòng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa [48]. - Hoạt tính chống xơ vữa động mạch: Trong bằng độc quyền sáng chế đăng ký tại Hoa Kỳ US 2007/0010459A1, Jan.11, 2007, nhóm nghiên cứu đã sử dụng axit asiatic hoặc hỗn hợp axit asiatic / asiaticosid để điều trị bệnh xơ vữa động mạch và xơ vữa phổi trên động vật thực nghiệm là chó và chuột cống. Các kết quả thu được là rất khả quan [49]. - Hoạt tính giảm đau và kháng viêm của cây rau má: Somchit và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính giảm đau của cây rau má. Tác dụng gảm đau của dịch chiết nước cây này (10, 30, 100 và 300 mg/kg trọng lượng chuột nhắt trắng) được nghiên cứu bằng phương pháp gây đau với axit asiatic và đĩa nóng. Kết quả cho thấy, dịch chiết nước của cây rau má thể hiện hoạt tính chống đau đáng kể ở cả hai mô hình. Hoạt tính kháng đau tương tự như ở aspirin, nhưng yếu hơn morphin. Hoạt tính kháng viêm được nghiên cứu trên chuột cống gây viêm bàn chân bằng prostaflandin E2. Hoạt tính kháng viêm cũng rất nổi bật, hoạt tính này tương tự như các thuốc kháng viêm phi steroid và axit meferamic [50]. - Tác dụng chữa vết thương, vết bỏng: Asiaticosid hỗ trợ điều trị vết thương qua việc làm tăng hàm lượng hydroxyprolin, thành phần của peptid, tăng độ đàn hồi của cơ da, tăng sinh tổng hợp collagen, tăng tạo mạch và tạo biểu mô. Axit asiatic và axit madecassic cũng làm tăng lượng hydroxyprolin, tăng tổng hợp collagen ở vết thương. Asiaticosid cũng tạo ra chất chống oxy hoá (antioxidant) bằng con đường enzym hoặc không enzym như superoxid dismutas, catalas, glutathion peroxidas, vitamin E và axit ascorbic ở các mô mới hình thành [51, 52]. 32
  33. Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu + Vỏ và rễ cây cọ hạ long, thu hái vào tháng 6 năm 2009 tại Vịnh Hạ Long. Tên cây do TS. Trần Thị Phương Anh, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định. Tiêu bản số LH01/2009 được lưu tại Viện Hóa học (Phòng Tổng hợp hữu cơ). + Cây rau má được thu hái vào tháng 8 năm 2010 tại Ba vì Hà nội. Tên cây do cử nhân Ngô Văn Trại và thạc sĩ Nguyễn Thế Anh đồng thời có sự giúp đỡ của TS. Trần Thị Phương Anh xác định, có so sánh với mẫu đang lưu tại phòng Tiêu bản thực vật, viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội. Tiêu bản số RM01/2010 được lưu giữ tại phòng Tổng hợp hữu cơ, viện Hóa học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu thực vật được phơi khô trong bóng râm, hoặc sấy ở 45 oC trong tủ sấy, để nguội, xay nhỏ và chiết với các dung môi có độ phân cực khác nhau như n-hexan, diclometan, metanol. 2.1.2. Dung môi, hóa chất + Các dung môi được sử dụng để chiết tách và tinh chế là: n-hexan, etylaxetat, diclometan, metanol được cất lại qua cột trước khi dùng. + Chất hấp phụ silicagel có cỡ hạt 0,063 mm, pha đảo RP18 và Sephadex LH20 dùng để chạy cột được mua của hãng Merck CHLB Đức và Aldrich, Hoa Kì. + Bản mỏng tráng sẵn trên nhôm với silicagel G60 có chất huỳnh quang F254 của hãng Merck được dùng để kiểm tra quá trình tách trên cột và cũng như độ tinh khiết của chất tách được. 2.1.3. Thiết bị thí nghiệm 33
  34. - Phổ hồng ngoại (FT-IR) được đo dưới dạng viên nén KBr trên máy quang phổ hồng ngoại IMPACT 410-NICOLET (Mỹ) của Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ khối ESI-MS được ghi trên thiết bị khối phổ LC/MSD Agilent series 1100 của Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-MS tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz của Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với TMS là chất chuẩn nội cho 1H- và tín hiệu dung môi làm chuẩn cho 13C-NMR. - Độ quay cực [α]D được đo trên máy JASCO P2000 Polarimeter tại Viện Hóa Sinh biển – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp điều chế các phân đoạn Vỏ và rễ của cây cọ hạ long và cây rau má phần trên mặt đất sau khi đã sấy khô và xay nhỏ được cân chính xác và chiết với các dung môi có độ phân cực khác nhau theo hai cách: + Cách thứ nhất: Ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng, rút dịch chiết và thêm dung môi mới 3 lần, mỗi lần ngâm 4 giờ. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45-50 0C (bằng máy quay cất chân không). Cao thu được được chế thêm nước cất. Sau đó chiết lần lượt với n-hexan, diclometan. Các dịch chiết được cất loại dung môi cho đến khi khô sẽ thu được các cao chiết tương ứng để nghiên cứu tiếp. + Cách thứ hai: Mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với các loại dung môi n-hexan, diclometan và metanol ở nhiệt độ phòng. Với mỗi loại dung môi được rút dịch chiết và thêm dung môi mới ba lần. Mỗi lần ngâm ba tiếng, cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45-50 0C cho tới khô (sử dụng 34
  35. máy quay cất chân không) sẽ thu được các cao chiết tương ứng để nghiên cứu tiếp. 2.2.2. Phương pháp tách và tinh chế chất Các cao chiết trong các dung môi khác nhau được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp. Sắc kí cột (SKC) gồm sắc kí cột thường và sắc kí cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagel. Đối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH20 hoặc pha đảo RP18. Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phương pháp kết tinh phân đoạn để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như kiểm tra quá trình chạy cột bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) với nhiều hệ dung môi khác nhau để xác định Rf tối ưu (Rf 0,4-0,6). 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR). Trong trường hợp cần thiết sẽ điều chế dẫn xuất axetyl của những chất chứa nhóm hydroxyl để khẳng định thêm cấu trúc của chúng. 2.2.4. Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học 2.2.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định * Các chủng vi sinh vật và nấm kiểm định : Vi khuẩn gram (-): + Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442, + Escherichia coli (Ec) ATCC 25922 + Salmonella enterica (Se) Vi khuẩn gram (+): + Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709. + Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633 + Lactobacillus fermentum N4 35
  36. Và nấm: + Candida albicans (Ca) ATCC 10198. * Môi trường nuôi cấy: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller- Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi sinh vật; SAB, SA cho nấm. * Phương pháp: Phương pháp pha loãng nồng độ - Mẫu ban đầu được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử. - Các mẫu được pha thành dãy các nồng độ khác nhau (từ 5 đến 10 nồng độ). - Mẫu ban đầu có nồng độ 40 mg/ml được pha loãng thành các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng: 256; 64; 16; 4 và 1 g/ml. - Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 cfu/ml khi tiến hành thử. - Lấy 10 l dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã pha loãng, thêm 200 l dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ ở 37 0C. Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm raw data. * Chất đối chứng - Kháng sinh Ampicilin cho các chủng vi khuẩn gram (+) và chủng vi khuẩn gram (-) Ec với giá trị IC50 trong khoảng 0,05 – 2 g/ml. - Hỗn hợp kháng sinh Pen/Step cho chủng vi khuẩn gram (-) Pa với giá trị IC50 trong khoảng 4 – 5 g/ml. - Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5 – 1 g/ml. 2.2.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào 36
  37. * Các dòng tế bào: các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC, gồm có: - KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô – là dòng luôn được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào. - Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) – ung thư gan. - LU (Human lung carcinoma) – ung thư phổi. - MCF – 7 (Human breast carcinoma) – ung thư vú. * Phương pháp: phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. - Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh bò (FBS) và các thành phần 0 cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37 C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. * Thử độc tế bào: - Cho 200 l dung dịch tế bào ở pha lỏng nồng độ 3.104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào HepG2, MCF7, KB; môi trường DMEM cho LU-1. - Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128; 32; 8; 2; 0,5 g/ml. Ủ trong điều kiện 0 37 C, 5% CO2 trong 3 ngày. - Giếng điều khiển gồm 200 l dung dịch tế bào nồng độ 3.104 tế 0 bào/ml, ủ ở 37 C, 5% CO2 trong 3 ngày, thêm 50 l MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 37 0C 4 giờ. - Loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO, lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN. * Tính kết quả: 37
  38. GI%: Phần trăm kìm hãm sự phát triển ( Growth Inhibition). Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả GI% của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve. 2.2.4.3. Hoạt tính chống oxy hóa * Phương pháp thử hoạt tính DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng  = 517 nm. Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong methanol (MeOH). Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng độ 128; 32; 8; 2; 0,5 g/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở 37 0C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bước sóng 517 nm. % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau: SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%). EC50 (nồng độ có hiệu lực với 50% cá thể) được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3. Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang: 38
  39. Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH 1.8000 y = 0.3225x + 0.0241 1.6000 R2 = 0.9938 1.4000 1.2000 1.0000 0.8000 0.6000 0.4000 Mật độ quang học (OD) học quang độ Mật 0.2000 0.0000 0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000 Nồng độ DPPH mM * Phương pháp thử hoạt tính peroxydaza Nguyên liệu: Máu tươi được chống đông bằng ADC (Adenine dextrose citrate), pha loãng 10-20 lần bằng nước cất. Chia thành các ống nhỏ 0,5-1 ml. Dùng cho thí nghiệm cất trong tủ lạnh -80oC. Khi dùng pha loãng thêm 25- 50 lần bằng RB. H2O2 (0,2 N hay 2%). Indigocarmin: chuẩn bị dung dịch stock-80 0C: 0,1 N, pha loãng 100 lần sẽ thu được dung dịch phản ứng 0,001 N. Chất thử: -Pha loãng bằng DMSO: dịch gốc 20 mg/ml, tiếp theo pha loãng 1:4 tạo thành 1 dãy 5 nồng độ. -Pha loãng bằng dung dịch đệm: tạo một dãy 5 nồng độ mới từ dãy nồng độ trên bằng cách pha loãng 7,8 lần với dung dịch đệm. Phản ứng: 50 l dung dịch đệm axetat natri pH 4,7 0,1 N 10 l chất thử pha trong DMSO và RB 60 l enzyme pha loãng 500 lần 60 l H2O2 0,2N hay 2% 20 l Indigocarmin 0,001 N 39
  40. 50 l TCA 20% Giếng điều khiển âm không có enzim, không có chất thử, giếng điều khiển dương enzim hoạt động 100%, không có chất thử. Để thời gian phản ứng ở nhiệt độ phòng trong vòng 20-25 phút, dừng phản ứng bằng TCA. Đọc kết quả ở bước sóng 610 nm. 2.3. Phân lập các hợp chất từ cây cọ hạ long 2.3.1. Tách và tinh chế các chất từ vỏ cây cọ hạ long 3 kg vỏ tươi được sấy ở 450C, thu được 900 g khô, xay nhỏ và ngâm chiết với n-hexan (3 lần x 1,5 lít), sau đó tiếp tục chiết với CH2Cl2 (3 lần x 1,5 lít) và cuối cùng chiết bằng metanol 90% (3 lần x 1,5 lít), ở nhiệt độ phòng. Thời gian rút dịch chiết đối với mỗi loại dung môi là từ 3-6 giờ/lần. Quay cất dung môi dưới áp suất giảm, ở nhiệt độ 50 0C, thu được 4,9 g cao n- hexan, 3,1 g cao diclometan và 24,9 g cao MeOH. Từ các kết quả thử hoạt tính sinh học các dịch chiết n-hexan, CH2Cl2, MeOH và qua kiểm tra sắc ký bản mỏng các dịch chiết của vỏ cây cọ hạ long, chúng tôi tập trung phân lập các chất từ dịch chiết n-hexan. 2.3.1.1. Phân lập các chất từ cao chiết n-hexan (theo sơ đồ 2.1) Phần cao chiết n-hexan được khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng và thuốc hiện là CeSO4. Sau khi thử nghiệm với các hệ dung môi khác nhau để tìm hệ dung môi thích hợp cho sắc ký cột, đã tìm thấy hệ dung môi phù hợp là n- hexan/EtOAc. 4,9 g cao chiết n-hexan được hòa tan vừa đủ bằng CH2Cl2 và trộn với 5 g silicagel, quay cất đến khô, sau đó nghiền thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên silicagel. Bột silicagel có tẩm dịch chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký. Silicagel Merck (200 gam) được nhồi vào cột sắc ký có kích thước 2 cm x 80 cm theo phương pháp nhồi ướt với hệ dung môi n-hexan/EtOAc = 98/2. 40
  41. Sau khi cột được nén bằng máy nén khí đã tương đối ổn định, bột silicagel tẩm dịch chiết được đưa lên cột, và giải hấp với hệ dung môi rửa giải là n- hexan/EtOAc có độ phân cực tăng dần, thu được 6 phân đoạn chính. - Phân đoạn 1 (250 mg) được tinh chế bằng sắc ký cột nhanh trên SiO2 (n-hexan:EtOAc = 100:0 – 95:5) thu được 50 mg chất 68 (ký hiệu là: LHVn5a). - Phân đoạn 2 (62 mg) được tinh chế lại trên cột sắc ký nhanh (SiO2, n- hexan:EtOAc = 98:2 – 90:10) thu được 30 mg chất 67 (ký hiệu là: LHVn6). - Phân đoạn 3 (40 mg) được tinh chế lại trên cột sắc ký nhanh (SiO2, n- hexan:EtOAc = 98:2 – 90:10) thu được 28 mg chất 69 (ký hiệu là: LHVn4). - Phân đoạn 4 (56 mg) được tinh chế lại trên cột SiO2 (n-hexan:EtOAc = 98:2 – 85:15) thu được 36 mg chất 70 (ký hiệu là: LHVn7). - Phân đoạn 5 (360 mg) được kết tinh lại (n-hexan:EtOAc = 1:1) thu được 50 mg chất 71 (ký hiệu là: CT1). - Phân đoạn 6 (1260 mg) được kết tinh lại (n-hexan:EtOAc = 1:1) thu được 650 mg chất 72 (ký hiệu là: LHVH2). 41
  42. Mẫu vỏ cọ khô xay nhỏ (900 g) 1.Chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, CH2Cl2 và MeOH 2. Cô đuổi dung môi 3,1 g 4,9 g 24,9 g cao CH2Cl2 cao n-hexan cao MeOH (LHVd) (LHVn) (LHVm) SKC silicagel: n-hexan/ EtOAc (98:2 70:30) Pđ 1 Pđ 2 Pđ 3 Pđ4 Pđ5 Pđ6 250 mg 62 mg 40 mg 56 mg 360 mg 1260 mg SKC silicagel: n-hexan/ EtOAc (98:2 85:15) Kết tinh: n-hexan/ EtOAc (1:1) LHVn6 LHVn5a LHVn4 LHVn7 CT1 LHVH2 30 mg 30 mg 28 mg 36 mg 50 mg 650 mg 68 67 69 70 71 72 Sơ đồ 2.1. Phân lập các chất từ vỏ cây cọ hạ long (L. halongensis) 42
  43. Từ cao chiết n-hexan của vỏ cây cọ hạ long đã phân lập được 6 chất sạch, bao gồm: 2.3.1.2. Số liệu phổ các chất tách từ cao chiết n-hexan của vỏ cây cọ hạ long *). Chất 67 (LHVn6): Cyclomusalenon -1 - Phổ IR (KBr) max (cm ): 3067 (=CH2), 3030 (cyclopropyl); 2930, 2867 (CH2, CH3); 1712 (C=O); 1640 (=CH2); 1457, 1373, 1097, 885 (=CH2). - Phổ khối phân giải cao ESI-MS, ion dương; m/z = 425,38076 [M + H]+; M = 424 (C30H48O). 1 - Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,32 (1H, d, J = 3,8 Hz, H-19A); 0,55 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-19B); 0,80 ( 3H, d, J = 6,4 Hz, CH3-21); 0,92 (3H, s, CH3-29); 0,92 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3-30); 0,93 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-28); 0,99 (3H, s, CH3-18); 1,57 (3H, s, CH3-27); 2,32-2,36 (2H, m, H-2); 4,60 (2H, s, H2-26). 43
  44. - Phổ 13C-NMR: xem bảng 3.1. *). Chất 68 (LHVn5a): Cycloleucadenon -1 - Phổ IR (KBr) max (cm ): 3072 (=CH2); 3030 (cyclopropyl); 2936, 2872 (CH2, CH3); 1715 (C=O); 1640 (=CH2); 1643, 1459, 1378, 1113, 890, (=CH2). + - Phổ khối phân giải cao ESI-MS: m/z = 439,39012 [M + H] (C31H51O); M = 438 (C31H50O). 1 - Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,56 (1H, d, J = 3,9 Hz, H-19A); 0,79 (1H, brs, H-19B); 0,91 (3H, s, CH3-29); 0,88 (3H, d, J = 7,1 Hz, CH3-21); 0,92 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-28); 0,99 (3H, s, CH3-18); 1,05 (3H, s, CH3-30); 1,10 (3H, s, CH3-31); 1,64 (3H, t, J = 4,1 Hz, CH3-27); 2,30 (1H, ddd, J = 2,6, 4,2, 14,0 Hz, H-2A); 2,70 (1H, dt, J = 6,4, 14,0 Hz, H-2B); 4,67 (br s, H2-26). - Phổ 13C-NMR: xem bảng 3.2. *). Chất 69 (LHVn4): 3β- Cyclomusalenol -1 - Phổ IR (KBr) max (cm ): 3341 (OH); 3076 (=CH2), 3030 (cyclopropyl); 2926, 2876 (CH2, CH3); 1647, 1376, 1048, 887 (=CH2). 1 - Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,13 (1H, d, J = 3,9 Hz, H-19A); 0,38 (1H, d, J = 2,9 Hz, H-6α); 0,53 (1H, d, J = 3,9Hz, H-19B); 0,58 (1H, d, J = 12,0 Hz, H6β); 0,86 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3-21); 0,88 (3H, s, CH3-18); 0,99 (3H, d, J = 6,9 Hz, CH3-28); 0,96 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-30); 0,98 (3H, s, CH3-29); 1,64 (3H, s, CH3-27); 3,2 (1H, dt, J = 10,9, 4,8 Hz, H- 3α); 4,67 (2H, s, H2-26). - Phổ 13C-NMR: xem bảng 3.3. Sự gán phổ dựa vào so sánh với phổ của 3β – cyclomusalenol, 3-epi-Cyclomusalenol và phổ 2D-NMR của chất 69. *). Chất 70 (LHVn7): Stigmast-4-en-3-on 44
  45. -1 - Phổ IR (KBr) max (cm ): 2969, 2926, 2869, 1678 (carbonyl liên hợp); 1615, 1646, 1378, 873. 1 - Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,71 (3H, s, CH3-18); 0,82 (3H, d, J = 6,7 Hz, CH3-26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-27); 0,86 (3H, d, J = 7,4 Hz, CH3-21); 0,91 (3H, t, J = 6,3 Hz, CH3-29); 1,18 (3H, s, CH3- 19); 2,26 (1H, ddd, J = 2,4, 3,9, 14,5 Hz, H-2A); 5,72 (1H, br s, H-4). - Phổ 13C-NMR: xem bảng 3.4. *). Chất 71 (CT1): Stigmasterol 1 - Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,70 (3H, s, CH3-18); 0,79 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3-26); 0,80 (3H, t, J = 7,5 Hz, CH3-29); 0,84 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3-27); 1,01 (3H, s, CH3-19); 1,02 (3H, d, J = 6,7 Hz CH3- 21); 3,51 (1H, m, H-3α); 5,02 (1H, dd, J = 8,7, 15,2 Hz, H-22); 5,16 (1H, dd, J = 8,6, 15,2 Hz, H-23); 5,35 (d, J = 5,4 Hz, H-6). 13 - Phổ C-NMR (CD3Cl, 125 MHz)  (ppm): 37,3 (C-1), 31,7 (C-2), 71,8 (C- 3), 42,4 (C-4), 140,8 (C-5), 121,7 ( C-6), 31,9 (C-7), 31,9 (C-8), 50,2 (C-9), 36,6 (C-10), 21,1 (C-11), 39,7 (C-12), 42,3 (C-13), 56,9 (C-14), 25,4 (C-15), 28,9 (C-16), 56,0 (C-17), 12,2 (C-18), 19,0 (C-19), 40,5 (C-20), 19,4 (C-21), 138,3 (C-22), 129,3 (C-23), 51,3 (C-24), 31,9 (C- 25), 19,0 (C-26), 21,1 (C- 27), 25,4 (C-28), 12,2 (C-29). - Phổ ESI-MS ion dương của chất 71 cho các pic tại m/z = 414,8 [M+2]+ và m/z = 395,8 [M+1-H2O], như vậy khối lượng phân tử của 71 là m/z = 412 phù hợp với công thức C29H48O. *). Chất 72 (LHVH2): β-sitosterol 1 - Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,68 (3H, s, CH3-18); 0,77 (3H, d, J = 6,6 Hz, CH3-27); 0,84 (3H, d, J = 6,6 Hz, CH3-26); 0,85 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-21); 0,91 (3H, t, J = 6,4 Hz, CH3-29); 1,01 (3H, s, CH3- 19); 3,52 (1H, m, H-3α); 5,35 (1H, m, H-6). 45
  46. *. Phản ứng khử 67 bằng NaBH4 Dựa vào số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 69 gợi ý chất 69 có cùng khung carbon với chất 67. Qua so sánh các tài liệu tham khảo, cho ta suy ra cấu trúc của chất 69 là 3β-cyclomusalenol. Để khẳng định thêm cấu trúc của chất 69 chúng tôi tiến hành khử hóa chất 67 với NaBH4 trong methanol với quy trình như sau: 0,05 mmol (22 mg) 67 được hòa trong MeOH (0,5 ml), 0,1 mmol (3,7 mg) NaBH4 được cho thêm vào. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng 4 giờ. Sau đó cho thêm 1,5 ml H2O, trung hòa bằng axit HCl (5%) tới pH = 4 và chiết với EtOAc. Sản phẩm được rửa với nước, làm khan với Na2SO4, cô cất dung môi dưới áp suất thấp, sau đó được tách bằng sắc ký cột silicagel trên với hệ dung môi n-hexan/ETOAC 1:1 thu được sản phẩm 69 (15 mg) và đồng phân 69a (5mg). 46
  47. 2.3.2. Tách và tinh chế các chất trong rễ cây cọ hạ long (theo sơ đồ 2.2) 2.3.2.1. Phân lập các chất có trong cao chiết rễ cây cọ hạ long 900 g rễ cây cọ hạ long đã được sấy khô, nghiền nhỏ, ngâm chiết với n- hexan (3 lần x 1,5 lít), sau đó tiếp tục chiết với CH2Cl2 (3 lần x 1,5 lít) và cuối cùng chiết bằng metanol 90% (3 lần x 1,5 lít), ở nhiệt độ phòng. Thời gian rút dịch chiết đối với mỗi loại dung môi là từ 3-6 tiếng/lần. Quay cất dung môi dưới áp suất giảm, ở nhiệt độ 50 0C thu được 2,1 g cao n–hexan; 2,0 g cao CH2Cl2 và 38 g cao MeOH. *. Phân lập chất từ cao chiết n-hexan Cao chiết n–hexan của rễ cây cọ hạ long (lấy 2,1 g) được tiến hành phân lập các chất theo phương pháp sắc kí cột trên chất hấp phụ là silicagel, dung môi rửa giải là hỗn hợp n–hexan:EtOAc với lượng EtOAc tăng dần 98:2 đến 70:30 thu được 6 phân đoạn, qua kiểm tra các phân đoạn trên sắc ký bản mỏng, ta chọn phân đoạn 4 để tinh chế chất sạch. Phân đoạn 4 (150 mg) được tinh chế bằng sắc ký cột nhanh trên SiO2 (n- hexan:EtOAc = 98:2) thu được 60 mg hỗn hợp gồm 2 chất chính có Rf gần trùng nhau không thể tách bằng sắc ký cột silicagel. Do đó chúng tôi thực hiện phản ứng axetyl hóa bằng anhydrit axetic trong pyridin, tinh chế trên cột sắc ký nhanh (SiO2, n-hexan:EtOAc = 100:0 - 95:5) thu được chất 73 sạch ký hiệu LHRn2 (10 mg) và chất 74 LHRn3 (15 mg). *. Phân lập chất từ cao chiết MeOH 10 g cao chiết MeOH của rễ cây cọ hạ long được phân lập bằng phương pháp sắc kí cột trên chất hấp phụ là silicagel, dung môi rửa giải là CH2Cl2: MeOH với lượng MeOH tăng dần 98:2 đến 60:40, thu được 9 phân đoạn, kiểm tra các phân đoạn trên sắc ký bản mỏng, chọn các phân đoạn 4, 6, 9 để tinh chế tiếp, thu chất sạch: 47
  48. - Phân đoạn 4 (660 mg) được tinh chế bằng sắc ký cột nhanh trên SiO2 (CH2Cl2:EtOAc = 100:0 - 70:30) thu được 3 chất sạch là chất 75, 76 và 77 có ký hiệu lần lượt là : LHRm1 (40 mg), LHRm2 (30 mg), LHRm3 (25 mg). - Phân đoạn 6 (100 mg) được tinh chế bằng sắc ký cột nhanh trên SiO2 (n- EtOAc: MeOH = 100:0 - 80:20) thu được 32 mg chất 78 sạch, ký hiệu là: LHRm4 - Phân đoạn 9 (156 mg) được axetyl hoá bằng anhydrit axetic trong dung môi pyridin, tinh chế bằng sắc ký cột nhanh trên SiO2 (n-hexan:EtOAc = 100:0 - 80:20) thu được 40 mg chất 79 sạch, ký hiệu là: LHRm6. 48
  49. Mẫu rễ cọ khô xay nhỏ (900g) 1.Chiết lần lượt với các dung môi : n-hexan, CH2Cl2 và MeOH 2. Cô đuổi dung môi 2,1 g 2,0 g 38 g cao n-hexan cao diclometan cao MeOH (LHRn) (LHRd) (LHRm) SKC silicagel: n-hexan/ EtOAc SKC silicagel: CH2Cl2/ (98:2 70:30) MeOH (98:2 - 60:40) Pđ 4 150 mg Pđ 4 Pđ 6 Pđ 9 SKC silicagel: n-hexan/ EtOAc 660 mg 100 mg 156 mg (98:2 85:15) Axetyl hóa (CH3CO)2O Pđ 16-40 trong pyridin 60 mg SKC silicagel: SKC silicagel: CH2Cl2-EtOAC EtOAc /MeOH SKC silicagel: (98:2 70:30 (100:0 80:20) Axetyl hóa bằng n-hexan/EtOAc (CH CO) O trong pyridin 3 2 (100:0 80:20) SKC silicagel: n-hexan/ EtOAc (100:0,5 100:1) LHRm4 LHRm6 32 mg 40 mg 79 LHRn2 LHRn3 LHRm1 LHRm2 LHRm3 78 10 mg 15 mg 40 mg 30 mg 25 mg 73 74 75 76 77 Sơ đồ 2.2. Phân lập các chất từ rễ cây cọ hạ long (L. halongensis) 49
  50. Cấu trúc các chất phân lập từ rễ cây cọ hạ long O O 5 4 4a 12'a 3 2' 6' 10' 2 4' 8' 12' 7 1' 8a O 11' 13' 8 3' 5' 7' 9' 73: 6-O-axetyl-2R,8-dimetyl-2-(4R,8R,11-trimetyltridecence-12)chroman, (LHRn2) 74: Stigmast-4-en-3-on, (LHRn3=LHV.n7) 75: 3,5,3’,5’-tetrahydroxy-4-metoxystilben (LHRm1) 76: 2S,3S-3,5,7,3’-tetrahydroxy-5’-metoxyflavan, (LHRm2) 50
  51. 77: β-sitosterol-3-O- β –D-glucopyranosid (β-sitosterol glucosid), (LHRm3) 78: 2R,3R-3,7,3’-trihydroxy-5’-metoxyflavan 5-O--D-glucopyranosid, (LHRm4) OAc OAc AcO OAc O O O OAc AcO OAc OAc 79 : ( LHRm6): Sacharose octaacetat - Để làm sáng tỏ cấu trúc của chất 76 và 78, phản ứng axetyl hoá hai chất 76 và 78 đã được thực hiện với anhydrit axetic trong môi trường pyridin, 51
  52. và tinh chế sản phẩm axetyl hóa bằng sắc ký cột nhanh trên SiO2 (n- hexan:EtOAc = 100:0 - 80:20) thu được chất 80 (20 mg) và 81 (30 mg). *. Quy trình tổng hợp chất 80 và 81. (0,02 mmol) chất 76 hoặc 78 được hòa trong 1 ml pyridin và 0,5 ml anhydrit axetic, hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng qua đêm, cho thêm 20 ml etyl axetat và trung hòa với HCl (1N) đến pH = 6. Sau đó được rửa với dung dịch NaHCO3 (10%), cuối cùng dung dịch được rửa với nước muối bão hòa và được làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi. Chạy cột silicagel với hệ dung môi n-hexan/etyl axetat, thu được chất 80 hoặc 81. 2.3.2.2. Số liệu phổ của các chất phân lập từ rễ cây cọ hạ long +). Chất 73 (LHRn2): 6-O-acetyl-2R,8-dimetyl-2-(4R,8R,11-trimetyltridecence- 12)chroman, Chất 73 được phân lập từ dịch chiết n-hexan rễ cây cọ hạ long dưới dạng dầu, có: 25 0 - [α] D = + 4.4 ( c = 0.58, CH3OH). -1 - Phổ IR (KBr) max (cm ): 2936, 2857, 1760, 1471, 1372, 1209. - Phổ khối phân giải cao HRMS ((+)-ESI): m/z = 457,36838 [M + H]+, ứng với công thức phân tử C30H48O3 . 52
  53. - Phổ 1H-NMR, 13C-NMR (xem bảng 3.5) +). Chất 74 (LHRn3) trùng với chất 70 (LHVn7): Stigmast-4-en-3-on +). Chất 75 (LHRm1): 3,5,3’,5’-tetrahydroxy-4-metoxystilben. 1 - Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 3,83 (3H, s, OMe); 6,20 (1H, t, J =2,1, H-4’, H-5’); 6,46 (2H, d, J = 2,1, H2’, H6’ ); 6,55 (2H, s, H-2, H-6); 6,80 (1H, d, J = 16,2, H-7); 6,85 (d, 1H, J = 16,2, H-8). 13 - Phổ C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 60,86 (OMe); 103,01 (C-4’); 105,98 (C-2’, C-6’); 106,94 (C-2, C-6); 128,94 và 129,49 (C-7 và C-8); 134,81 (C-1); 136,0 (C-1’); 140,89 (C-4); 151,76 (C-3, C-5); 159,67 (C-3’, C-5’). +). Chất 76 (LHRm2): 2S,3S-3,5,7,3’-tetrahydroxy-5’-metoxyflavan - Là chất dạng dầu màu nâu nhạt 25 0 - [ ] D: + 2.7 (c = 2,84, MeOH). -1 - Phổ IR(KBr) max (cm ): 3398 (OH), 2930, 2845, 1625, 1516, 1467, 1272, 1140, 1013, 824. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR: Xem bảng 3.6 - Phổ ESI-MS: m/z=303 [M-H]- (ion âm), tương đương công thức phân tử C16H15O6, Vậy công thức phân tử của LHRm2 là: C16H16O6 +). Chất 77 (LHRm3): β-sitosterol-3-O- β –D-glucopyranosid (β-sitosterol glucosid) 1 - Phổ H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,65 (3H, s); 0,80 (3H, d, J = 6,9); 0,81 (3H, d, J = 6,8); 0,90 (3H, d, J = 6,5), 0,96 (6H, br s); 1,00 (3H, d, J = 6,7); 1,23 (3H, s, H-19); 1,38-1,41 (m, 5H); 1,43-1,49 (m, 4H); 1,62-1,49 (m, 1H); 1,90-1,97 (3H); 2,10-2,17 (1H, m); 2,34-2,38 (1H, m), 2,87-2,91 (1H, m), 3,05-3,08 (2H, m); 3,10-3,14 (2H, m); 3,38-3,48 (2H, 53
  54. m); 3,64 (1H, dd, J = 5,5; 10,1); 4,22 (1H, d, J = 7,8); 4,39 (1H, t, J = 5,7); 4,83 (3H, m); 5,32 (1H, br s). 13 - Phổ C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 11,62; 11,73; 18,56; 18,90; 19,04; 19,65; 20,54; 22,58; 23,80; 25,45; 27,72; 28,69; 31,32; 31,38; 33,31; 35,42; 36,17; 36,78; 38,27; 41,81; 45,11; 49,57; 55,40; 56,13; 61,07; 70,09; 73,43; 76,69; 76,74; 76, 90; 100,75; 121,13; 140,42. +). Chất 78 (LHRm4): 2R,3R-3,7,3’-trihydroxy-5’-metoxyflavan 5-O-- glucopyranosid - Là chất dạng dầu màu nâu nhạt 25 0 - [α] D: – 2.9 (c = 1.22, MeOH). -1 - Phổ IR(KBr) max (cm ): 3423 (OH), 2931, 2860, 1623, 1426, 1275, 1076, 1022, 609. - Phổ HR- ESI-MS: m/z = 489,14618 [M+Na]+ (ion dương), tương đương công thức phân tử C22H26NaO11, 489,13728). Vậy công thức phân tử của LHRm4 là: C22H26O11. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Xem bảng 3.6. +). Chất 79 (LHRm6): Sacharose octaacetat 1 - Phổ H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 1,99 (s, 3H); 2,00 (s, 3H), 2,10 (br s, 15H), 2,17 (s, 3H), 4,12-4,17 (m, 3H), 4,20-4,22 (m, 3H), 4,34 (1H, dd, J = 4,3; 11,9); 4,88 (1H, dd, J = 3,7; 10,4); 5,08 (1H, t, J = 9,8); 5,37 (1H, t, J = 5,9); 5,40 (d, 1H, J = 5,9); 5,45 (1H, t, J = 10,4); 5,69 (1H, d, J = 3,7). 13 - Phổ C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 20,56; 20,59; 20,64; 20,70; 61,69; 62,81; 63,61; 68,12; 68,44; 69,57; 70,22; 74,91; 75,61; 76,76; 77,02; 77,27; 79,06; 89,87; 103,95; 169,51; 169,66; 169,89; 170,03; 170,11; 170,48; 170,70. +). Chất 80 (LHRm2a): 2S,3S-3,5,7,3’-tetraaxetyl-5’-metoxyflavan 54
  55. - Là chất rắn vô định hình màu trắng 1 - Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 1,91, 2,27, 2,29, 2,31 (12H, s, 4 x Me), 2,85 (1H, br d, J = 17,7 Hz, H-4A), 2,96 (1H, dd, J = 17,7, 4,5 Hz, H-4B), 3,87 (3H, s, Me) 5,05 (1H, d, J = 17 Hz, H-2), 5,36 (1H, m, H-3), 6,56 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-6), 6,66 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-8), 6,96 (1H, s, H-4’), 7,19 (2H, s, H-2’/H6’). - Phổ HR-ESI-MS: m/z = 494,93860 [M+Na]+ (ion dương), tương đương công thức phân tử C24H24NaO10, 495,12672. Vậy công thức phân tử của LHRm2a là: C24H24O10. +). Chất 81 (LHRm4a): Peraxetyl 2R,3R-3,7,3’-trihydroxy-5’-metoxyflavan 5-O--glucopyranosid - Là chất rắn vô định hình màu vàng nhạt 1 - Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 1,89, 2,04, 2,05, 2,07, 2,09, 2,29, 2,31 (21H, s, 7 x Me), 2,81 (1H, dd, J = 18,0, 4,1Hz, H-4A), 2,97 (1H, br d, J = 18,0 Hz, H-4B), 3,83 (3H, s, Me), 5,03 (1H, br s, H-2), 5,44 (1H, br s, H-3), 6,38 (1H, d, J = 2,0Hz, H-6), 6,50 (1H, d, J = 2,0Hz, H-8), 6,96 (1H, s, H-4’), 7,17 (1H, s, H-2’), 7,19 (1H, s, H-6’). 13 - Phổ C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 20,5 x 2C, 20,6, 20,7, 21,0, 22,6 (7 x CH3), 25,7 (CH2-4), 55,9 (CH3), 61,9 (CH2-6’’), 66,7 (CH-2), 68,4 (CH- 4’’),70,9 (CH-2’’), 72,1 (CH-3’’), 72,5 (CH-5’’), 76,8 (CH-3), 98,7 (CH-1’’), 101,5 (CH-6), 105,4 (CH-8), 107,1 (C-10), 112,0 (CH-4’) , 121,3 (CH-2’), 124,5 (CH-6’), 129,8 (C-1’), 139,6 (C-3’), 150,0 (C-7), 150,9 (C-5’), 155,2 (C-9), 155,4 (C-5), 168,8, 169,0, 169,1, 169,3, 170,0, 170,1, 170,5 (C). 2.4. Phân lập các hợp chất từ cây rau má (Centella asiatica) (sơ đồ 2.3) Mẫu cây rau má được thu hái tại Sơn Tây, Hà Nội vào tháng 8 năm 2010. Rau má tươi (8 kg) được sấy ở 45 0C, thu được 900 g khô, xay nhỏ và ngâm chiết lần một với 2,5 lít MeOH ở nhiệt độ 80 0C trong 2 giờ, lọc qua phễu lọc thu được 1,5 lít dịch chiết. Bã được chiết thêm 2 lần nữa với MeOH 55
  56. (2 lần x 1,5 lít). Thời gian rút dịch chiết là 2 giờ/lần. Gộp dịch lại, quay cất dung môi dưới áp suất giảm, ở nhiệt độ 50 0C, thu được 165 g cao MeOH. Thêm nước cất vào cao chiết MeOH, sau đó chiết lần lượt với n-hexan và CH2Cl2. Các dịch chiết được cất loại dung môi cho đến khô sẽ thu được 20 g cao n-hexan, 25 g cao diclometan và 120 g cao nước. 120 g cao dịch nước được hòa tan trong 300 ml MeOH, sau đó cho 300 ml dung dịch NaOH 10% và được đun nóng ở 80 0C trong 2 giờ, dung dịch được làm lạnh xuống 10 0C bằng nước đá. Sau đó được trung hòa bằng axit HCl 5% đến pH = 4, lọc kết tủa qua phễu lọc hút chân không, sấy khô thu được 12,5 g chất rắn. 2.4.1. Phân lập chất từ cao chiết nước 12,5 g chất rắn được tách bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH với tỉ lệ MeOH tăng dần: 95:5 và 90:10, đã phân lập được 2 chất chính: Chất 82 (RM1): 3,4 g (0,37% so với trọng lượng khô), chất 83 (RM2): 3,95 g (0,43% so với trọng lượng khô) và 1 hỗn hợp 84 gồm 2 chất (RM3): 0,85 g (0,096%). 56
  57. Mẫu Rau má khô xay nhỏ (900 g) 0 Chiết MeOH 3 lần, t = 80 C, 2h,Thêm H2O Dịch chiết MeOH 1.Cất loại MeOH, 2. Chiết n-hexan, 3.chiết CH2Cl2 Chiết n- hexan Chiết CH2Cl2 Dị ch n-hexan Dịch nước Dịch CH2Cl2 Cất loại dung môi Cất loại dung môi Cao n-hexan – 20 g Cao nước– 120 g Cao CH2Cl2– 25 g Thủy phân NaOH 10%, 2h, t = 800C Dung dịch muối Trung hòa bằng HCl 5%, lọc kết tủa Cặn tủa 12,5 g SKC silicagel: n-hexan/ EtOAc (98:2 - 70:30) RM1 RM2 RM3 3,4 g 3,95 g 0,85 g 82 83 84 Sơ đồ 2.3. Phân lập các chất từ cây rau má [C. asiatica (L.) Urban.] 57
  58. Cấu trúc các chất được phân lập từ cây rau má 84: Stigmasterol glucosid + β-sitosterol glucosid (RM3) 2.4.2. Số liệu phổ của các chất phân lập được từ cây rau má +). Chất 82 (RM1): Axit asiatic -1 - Phổ IR (KBr) max (cm ): 3411 (OH); 2930, 2866 (CH2, CH3); 1690 (COOH), 1459; 1053, 964 (=CH). + - Phổ khối ESI-MS, ion dương; m/z = 487.1 [M - 1] (C30H47O5); M = 488 (ứng với công thức phân tử: C30H48O5). 1 - Phổ H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,71 ( 3H, s, CH3); 0,87 ( 3H, s, CH3); 0,91 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3); 0,99 (3H, s, CH3); 1,06 ( 3H, s, CH3); 1,15 (3H, s, CH3); 2,23 (d, J = 11,5 Hz, 1H-18); 3,29 (d, J = 11,0 Hz, 1H- 23a); 3,38 (d, J = 9,5 Hz, 1H-3); 3,53 (d, J = 11,0Hz, 1H-23b); 3,71 (dt, 1H- 2); 5,26 (br, 1H-12). 13 - Phổ C-NMR (CD3Cl, 125 MHz)  (ppm): 48,0 (C-1), 69,7 (C-2), 78,2 (C- 3), 44,1 (C-4), 48,2 (C-5), 19,1 (C-6), 33,6 (C-7), 40,7 (C-8), 48,5 (C-9), 38,9 58
  59. (C-10), 24,5 (C-11), 126,6 (C- 12), 139,8 (C-13), 43,4 (C-14), 29,1 (C-15), 25,3 (C-16), 48,7 (C-17), 54,3 (C-18), 40,4 (C-19), 40,4 (C-20), 31,7 (C-21), 38,1 (C-22), 66,3 (C-23), 13,9 ( C-24), 17,6 (C-25), 17,7 (C-26), 24,1 (C-27), 181,6 (C-28), 17,8 (C-29), 21,5 (C-30). +). Chất 83 (RM2): Axit madecassic -1 - Phổ IR (KBr) max (cm ): 3416 (OH); 2930, 2867 (CH2, CH3); 1691(COOH), 1457, 1041, 968 (=CH). - Phổ khối phân giải cao ESI-MS, ion dương; m/z = 505.1 [M+H]+ (C30H49O6); M = 504 (ứng với công thức phân tử: C30H48O6). 1 - Phổ H-NMR (CD3OD, 500 MHz) (ppm): 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3); 0,99 (3H, s, CH3); 1,07 (3H, s, CH3); 1,1 (3H, d, J = 3,5 Hz, CH3); 1,3 (3H, s, CH3); 1,4 (3H, s, CH3); 3,31 (d, J = 9,5 Hz, 1H-3); 3,46 (d, J = 11,0 Hz, 1H- 23a); 3,61 (d, J = 11,0Hz, 1H-23b); 3,78 (dt, 1H-2); 4,4 (m, 1H-6); 5,31 (br, 1H-12). 13 - Phổ C-NMR (CD3Cl, 125 MHz) (ppm): 50,3 (C-1), 69,6 (C-2), 78,2 (C- 3), 44,7 (C-4), 48,5(C-5), 68,4 (C-6), 41,2 (C-7), 39,7 (C-8), 48,7 (C-9), 38,1 (C-10), 24,2 (C-11), 126,9 (C- 12), 139,0 (C-13), 43,8 (C-14), 28,8 (C-15), 24,5 (C-16), 48,6 (C-17), 54,3 (C-18), 40,4 (C-19), 40,4 (C-20), 31,6 (C-21), 38,5 (C-22), 65,9 (C-23), 15,3 (C-24), 19,2 (C-25), 19,1 (C-26), 23,9 (C-27), 181,6 (C-28), 17,6 (C-29), 21,5 (C-30). +). Chất 84 (RM3): Hỗn hợp stigmasterol glucosid + β sitosterol glucosid: - Phân lập dưới dạng tinh thể màu trắng, Rf = 0,4 (CH2Cl2:MeOH =85:15). 1 - Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,80 (3H, d, J = 10,0Hz, CH3); 0,90-0,96 (6H, 2 x CH3); 1,04 (3H, d, J = 6,5Hz, CH3); 1,11 (3H, s, CH3); 1,15 (3H, d, J = 10,0Hz, CH3); 3,03-3,04 (1H, m); 3,14-3,16 (1H, m); 3,18 (1H, d, J = 4,5Hz); 3,24-3,28 (1H, m); 3,55-3,61 (1H, m); 3,76-3,80 (1H, dd, J = 5,0Hz, J = 5,5Hz); 4,35 (1H, d, J = 8,0Hz); 4,58 (1H, t, J = 6,0Hz); 5,01 (1H, d, J = 4,0Hz); 5,04 (d, J = 4,5); 5,47 (1H, br s). 59
  60. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cọ hạ long (Livistona halongensis) Mẫu cây cọ hạ long (Livistona halongensis) được chúng tôi thu hái tại Vịnh Hạ Long, Quảng Ninh vào tháng 6 năm 2009 và phân thành các bộ phận gồm: vỏ thân; rễ. Sau khi được sấy khô và nghiền nhỏ, từng bộ phận riêng biệt của cây cọ hạ long được ngâm chiết lần lượt với các dung môi n- hexan, CH2Cl2, MeOH. Cất loại dung môi thu được các cao chiết và tiến hành phân lập chất bằng phương pháp sắc kí cột. Kết quả là từ cao chiết n-hexan, cao chiết MeOH của các bộ phận vỏ và rễ cây cọ hạ long (Livistona halongensis) đã phân lập được 12 chất, trong đó vỏ thân (6 chất); rễ (6 chất) và tạo được 2 dẫn xuất axetat từ các chất phân lập được. 3.1.1 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ vỏ thân cây cọ hạ long (Livistona halongensis) 3.1.1.1. Chất 67 (LHVn6): Cyclomusalenon. - Phổ hồng ngoại của chất 67 có đỉnh hấp thụ của nhóm = CH2 (3067 và 885 cm-1), vòng cyclopropyl (3030 cm-1) và nhóm carbonyl (1712 cm-1) bên cạnh 60
  61. -1 các dao động của nhóm –CH2 và –CH3 (2920, 2867, 1457 và 1373 cm ) (xem hình 3.1). - Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) (xem hình 3.2) cho pic ion phân tử tại + m/z = 425,38078 [M+H] , theo tính toán cho C30H49O là 425,3783. Như vậy công thức phân tử của chất 67 sẽ là C30H48O. Theo số liệu phổ hồng ngoại và phổ khối thì chất 67 có thể là một triterpen xêtôn có chứa vòng cyclopropan 1 13 và nhóm (=CH2). Dự đoán này đã được chứng minh qua phổ H- và C- NMR. - Phổ 1H-NMR (xem hình 3.3) có tín hiệu cộng hưởng của hai proton vòng cyclopropan tại  = 0,324 (1H, d, J = 3,8 Hz, H-19A) và 0,553 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-19B); 4,60 ( 2H, s, =CH2) và tín hiệu của 6 nhóm methyl, trong đó có 3 x d và 3 x s. Các số liệu trên cho phép dự đoán chất 67 là cyclomusalenon. - Phổ 13C-NMR và phổ DEPT (xem hình 3.4) của chất 67 cho thấy có tín hiệu của 30 nguyên tử carbon, trong đó có 6 nhóm CH3, 12 nhóm CH2, 6 nhóm CH và 6 carbon bậc 4. - Phổ H-H-COSY của chất 67 cho thấy có tương tác giữa H2-26 (4,60 ppm) và H3-27 (1,573 ppm) chứng minh sự có mặt của nhóm isopropenyl (-C(CH3) =CH2) trong phân tử chất 67. Vòng cyclopropan cũng được thấy rõ qua tương tác của H19A (0,324 ppm) và H19B (0,553 ppm). Những tín hiệu khác bị trùng lặp nhiều. - Phổ HSQC cho phép chúng ta xác định được độ chuyển dịch hoá học của 13 1 C và H của một số nhóm trong phân tử chất 67 cũng như nhóm CH2 đứng bên cạnh nhóm cacbonyl (C3). Ta thấy rõ tương tác của H2-2 (2,33 ppm) và C-2 (41,0 ppm), tương tác giữa C19 (27,0 ppm) và H19A (0,324 ppm) và H19B (0,553 ppm). 61
  62. - Phổ HMBC cho thấy tương tác của C-3 (213,4 ppm) với H2-2 (2,33 ppm), điều này chứng minh cho nhóm carbonyl ở vị trí C3 là đúng. Ngoài ra còn thấy rõ tương tác giữa H3-27 (1,573 ppm) với C24 (41,6 ppm); C25 (150,2 ppm); C26 (109,4 ppm). Tổng hợp các dữ liệu trên và sau khi so sánh phổ 13C-NMR của chất 67 với phổ của 4-epicyclomusalenon ghi trong cùng điều kiện từ tài liệu [53] và của cyclomusalenon [54] đã kết luận được rằng chất 67 là cyclomusalenon [(24S)-24-metyl-29-norcycloart-25-en-3-on]. Số liệu phổ 13C-NMR của chất 67 so với tài liệu tham khảo được nêu ở Bảng 3.1. Trước đây cyclomusalenon đã được phân lập từ cây chuối hột [ 54, 55]. Đây là lần đầu tiên chất này được phân lập từ chi Cọ thuộc họ Cau. Các số liệu về phổ 1H và 13C-NMR của cyclomusalenon chưa được công bố đầy đủ, chúng tôi bổ sung ở bảng 3.1. 62
  63. 1 13 Bảng 3.1. Số liệu phổ H- và C-NMR (CDCl3) của 67 và của cyclomusalenon STT Chất 67 Cyclomusalenon [54] C H (J=Hz) C H (J=Hz) 1 32,9 32,9 2 41,0 2,329-2,362 (2H, m ) 41,0 3 213,4 213,3 4 50,0 50,0 5 46,1 46,7 6 25,9 25,9 7 25,2 25,2 8 47,1 47,1 9 25,0 25,0 10 29,3 29,3 11 27,2 27,2 12 32,8 32,8 13 45,3 45,4 14 48,8 48,8 15 35,4 35,4 16 28,1 28,1 17 52,2 52,2 18 17,9 0,99 (3H, s) 17,9 0,997 (3H, s) 0,32(1H, d, J= 3,8 Hz, H-19A) 0,393 (1H, d, J= 4,3) 19 27,0 27,0 0,55 (1H, d, J=4,0 Hz, H-19B) 0,618 (1H, d, J=4,0) 20 36,0 36,0 21 18,3 0,80( 3H, d, J=6,4 Hz) 18,4 0,871 (3H, d, J=6,4 ) 22 33,9 33,9 23 31,5 31,5 24 41,6 41,6 25 150,2 150,2 26 109,4 4,60(2H, s) 109,4 4,671 (2H, s) 27 18,7 1,57(3H, s) 18,7 1,639 (3H, s) 28 19,2 0,93 (3H, d, J=6,2 Hz) 19,2 1,002 (3H, d, J=7,0) 29 20,2 0,92 (3H, s) 20,2 0,899 ( 3H, s) 30 10,8 0,92 (3H, d, J=6,4 Hz) 10,8 0,989 (3H, d, J=6,4 ) 63
  64. Hình 3.1. Phổ hồng ngoại IR(KBr) của chất 67 (Cyclomusalenon) Hình 3.2. Phổ khối phân giải cao của chất 67 (Cyclomusalenon) 64
  65. 1 Hình 3.3. Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của chất 67 (Cyclomusalenon) Hình 3.4. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 67 (Cyclomusalenon) 65
  66. 3.1.1.2. Chất 68 (LHVn5a): Cycloleucadenon. - Phổ hồng ngoại của chất 68 cho các tín hiệu hấp thụ của nhóm cyclopropyl -1 -1 -1 ở 3030cm , nhóm =CH2 ở 3072; 890 cm và của nhóm carbonyl ở 1715 cm -Phù hợp với phổ hồng ngoại, phổ 1H-NMR của 68 cho các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho vòng cyclopropan tại  = 0,566 (1H, d, J= 3,9 Hz, H- 19A), 0,791 (1H, br s, H-19B), 4,66 (2H, m, =CH2) và tín hiệu của 7 nhóm methyl trong đó có hai tín hiệu methyl doublet. - Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 68 cho thấy có tín hiệu của 31 nguyên tử carbon, trong đó có 7 nhóm CH3, 12 nhóm CH2, 5 nhóm CH và 7 carbon bậc 4. Từ các số liệu phổ thu được cho thấy 68 và 67 là hai chất có cùng một cấu trúc khung, tuy vậy 68 có nhiều hơn một nhóm CH3. Điều này cũng được khẳng định thêm qua phổ ESI-MS phân giải cao với pic ion giả + phân tử tại m/z =439,39012 (C31H51O) [M+H] . Như vậy chất 68 có công thức phân tử là C31H50O (M= 438). So sánh các dữ liệu của phổ 1H- và 13C-NMR của chất 68 với phổ của cycloleucadenone được ghi trong cùng dung môi [56] cho thấy chúng hoàn toàn giống nhau. Vậy có thể kết luận, chất 68 chính là cycloleucadenon. Từ lá cây Tillandsia fasciculata, năm 2001, người ta đã phân lập được cycloleucadenon [56] và đây là lần đầu tiên chất này được phân lập từ chi Cọ thuộc họ Cau. 66
  67. 1 13 Bảng 3.2. Số liệu phổ H- và C-NMR (CDCl3) của hợp chất 68 và cycloleucadenon ST Cycloleucadenon [56] T Chất 68 C C H (J=Hz) C H (J=Hz) 1 33,4 33,4 2,30(1H, ddd, J=2,6, 14,0 Hz, H-2A) 2,30 (1H, ddd, J= 14,0, 4,5, 2,5 Hz, H-2A) 2 37,5 2,70(1H, dt, J=6,4, 14,0 Hz, H-2B) 37,5 2,70(1H, dt, J= 14,0, 6,5 Hz, H-2B) 3 216,5 216,6 4 50,2 50,2 5 48,5 48,4 6 21,5 21,5 7 28,4 28,1 8 47,9 47,9 9 21,1 21,1 10 26,0 26,0 11 26,8 26,8 12 32,8 32,8 13 48,8 48,7 14 45,3 45,3 15 35,6 35,6 16 25,8 25,9 17 52,3 52,3 18 18,0 0,99 (3H, s, CH3-18) 18,0 0,99 (3H, s, H-18) 0,566 (1H, d, J= 3,9 Hz, H-19A) 0,56 (1H, d, J= 4,5 Hz, H-19A) 19 29,6 29,6 0,791 (1H, br.s, H-19B) 0,78 (1H, d, J= 4,5 Hz,, H-19B) 20 36,0 36,0 21 18,4 0,88 ( 3H, d, J=7,1 Hz, CH3-21) 18,3 0,87 ( 3H, d, J=6,5 Hz, H-21) 22 33,9 33,9 23 31,5 31,5 24 41,6 41,6 25 150,2 150,2 26 109,4 4,67 (br.s, H2 -26) 109.4 4,67(2H, m, H -26) 27 18,7 1,64 ( 3H, t, J = 4,1 Hz, CH3-27 ) 18,7 1,64( 3H, brs, H-27 ) 28 20,2 1,05( 3H, s, CH3-30 ) 20,1 1,05 ( 3H, s, H-28 ) 29 19,3 1,10 ( 3H, s, CH3-29 ) 19,3 1,10 ( 3H, s, H-29 ) 30 22,2 0,91 ( 3H, s, CH3-29 ) 22,2 0,90 ( 3H, s, H-30 ) 31 20,7 0,92 ( 3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-31 ) 20,8 67
  68. 1 Hình 3.5. Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của chất 68 (Cyclolaucadenon) 1 Hình 3.6. Phổ H-NMR dãn rộng (CDCl3, 500 MHz) của chất 68 (Cyclolaucadenon) 68
  69. 13 Hình 3.7. Phổ C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của chất 68 (Cyclolaucadenon) Hình 3.8. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 68 (Cyclolaucadenon) 69
  70. Hình 3.9. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT dãn rộng của chất 68 (Cyclolaucadenon) 3.1.1.3. Chất 69 (LHVn4): 3β- Cyclomusalenol . - Phổ hồng ngoại của chất 69 cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl -1 -1 -1 (3341 cm ), nhóm =CH2 (3076 và 887 cm ), nhóm cyclopropyl (3030cm ). - Phổ 1H- và 13C-NMR của chất 69 gợi ý chất 69 có cùng khung carbon với chất 67. Sự có mặt của nhóm isopropenyl thể hiện qua các tín hiệu ở: H = 70
  71. 4,66 (2H, s) và C = 109,3 (t) và 150,2 ppm (s). So với phổ của chất 67 thì phổ của chất 69 không chứa nhóm carbonyl ở vị trí C-3 mà chứa nhóm hydroxyl [H: 3,20 (1H, dt, J=10,9, 4,8 Hz, H-3α, C: 77,0 (d), C-3]. Nhóm hydroxyl ở C-3 được xác định là ở vị trí β (3β-OH) dựa vào sự tách vạch của tín hiệu của H-3 là một dt. Trong trường hợp 3α-OH thì tín hiệu của H-3 sẽ là một singlet (s). - Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 69 cho thấy có tín hiệu của 30 nguyên tử carbon, trong đó có 6 nhóm CH3, 12 nhóm CH2, 7 nhóm CH và 5 carbon bậc 4. - Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) cho pic ion giả phân tử tại m/z = + 427,36355 phù hợp với công thức phân tử là (C30H51O) [M+H] . Như vậy công thức phân tử của chất 69 sẽ là C30H50O. Từ các số liệu phổ ở trên, kết hợp so sánh với số liệu phổ 1H-NMR của 3β- Cyclomusalenol phân lập được từ cây chuối hột (Musa balbisiana colla) [61], có thể kết luận chất 69 là 3β-cyclomusalenol [(24S),14α, 24-dimetyl- 9β,19-cyclo-5α-cholest-25-en- 3β-ol]. Chất 69 đã được tách từ cây chuối tiêu (Musa sapientum) [57, 58]. Ngoài ra, Hiroyuki và cộng sự đã thông báo có tìm thấy 3β-cyclomusalenol từ rễ của ba loài dương xỉ tại Nhật Bản [59]. Và nhóm tác giả này đã phân lập được 3β-cyclomusalenol dưới dạng acetat từ rễ của hai loài dương xỉ: Polypodium formosanum và Polypodium niponicum [60]. Nhưng đây là lần đầu tiên chất 69 được phân lập từ chi Cọ thuộc họ Cau. Để khẳng định thêm cấu trúc của chất 69 chúng tôi tiến hành khử hóa chất 67 với NaBH4 trong metanol. Sau khi tách, tinh chế sản phẩm phản ứng bằng sắc ký cột chúng tôi thu được chất 69 và đồng phân 3α-OH của nó (3- epi-cyclomusalenol) với tỉ lệ 3:1 [61, 62]. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của sản phẩm chính khi khử hóa chất 67 so với phổ của chất 69 (bảng 3.2) tách từ vỏ cây cọ hạ long là hoàn toàn đồng nhất. 71
  72. 1 13 Bảng 3.3. Số liệu phổ H- và C-NMR (CDCl3) của hợp chất 69, 3β – cyclomusalenol và 3-epicyclomusalenol S T Chất 69 3β -cyclomusalenol [61] 3-epicyclomusalenol [63] T C C H (J=Hz) H (J=Hz) C H (J=Hz) 1 26,8 27,2 2 33,0 34,8 3 72,3 3,2(1H, dt, J=10,9, 4,8 Hz, H-3α) 3,21 m (H-3α) 76,6 3,21(1H, m, H-3β) 4 41,0 43,4 5 37,9 44,6 6 24,5 24,7 7 24,8 25,2 8 46,9 46,9 9 23,2 23,6 10 30,2 29,6 11 26,9 27,0 12 32,9 32,9 13 45,3 46,7 14 49,0 48,9 15 35,3 35,3 16 28,0 28,0 17 52,2 52,2 18 17,7 0,883 (3H, s) 0,96 s 17,7 0,96(3H, s) 0,137 (1H, d, J= 3,9 Hz, H-19A) 0,39 d, (3,9) 0,595(1H, d, J=4,0) 19 26,2 29,7 0,53 (1H, br.d, J= 3,9Hz, H-19B) 0,59 m 0,397(1H,br.d,J=3,7) 20 36,1 36,0 21 18,4 0,86( 3H, d, J=6,4 Hz) 0,86 d, (6,5) 18,4 0,86(3H, d, J=6,4) 22 33,9 33,9 23 31,5 31,5 24 41,6 41,6 25 150, 150,2 3 26 109, 4,67(2H, s) 4,67 d, (1,3) 109,3 4,66(2H, s) 7 27 18,6 1,64( 3H, s) 1,64 s 18,7 1,640( 3H, s) 28 20,2 0,998 (3H, d, J=6,9 Hz) 1,00 d (6,6) 20,1 0,998(3H,d, J=6,9) 29 19,1 0,986 (3H, s) 0,90 s 19,1 0,987 (3H, s) 30 15,5 0,968 (3H, d, J=6,2 Hz) 14,4 0,970(3H, d, J=6,4) 72
  73. 3.1.1.4. Chất 70 (LHRn7 = LHRn3): Stigmast-4-en-3-on. - Phổ hồng ngoại của chất 70 cho đỉnh hấp thụ của nhóm carbonyl liên hợp (1678 cm-1). - Phổ 1H-NMR (Hình 3.10, 3.11, 3.12) cho thấy có hai nhóm metyl với các tín hiệu singlet tại H = 0,71 (3H, s, CH3-18) và H = 1,18 (3H, s, CH3-19), ba nhóm metyl gắn với –CH với các tín hiệu doublet tại: H = 0,82 (3H, d, J = 6,7 Hz, CH3-26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-27), 0,86 (3H, d, J = 7,4 Hz, CH3-21) và nhóm metyl gắn với – CH2 với tín hiệu triplet tại : H = 0,92 (3H, t, J = 6,3 Hz, H-29). Sự có mặt của nhóm carbonyl liên hợp cũng được 13 thấy rõ trong phổ C-NMR (Hình 3.13) với các tín hiệu C =199,598 (s, C- 3), 171,653 (s, C-5) và 123,754 (d, C-4) cũng như tín hiệu H = 5,72 (1H, br s, H-4). - Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 70 có tín hiệu của 29 nguyên tử carbon, trong đó có 6 nhóm CH3, 11 nhóm CH2, 8 nhóm CH và 4 nguyên tử carbon bậc 4. - Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) cho pic ion phân tử tại m/z = + 413,37162 [M+H] . Như vậy công thức phân tử của chất 70 sẽ là C29H48O (M=412). - Phổ 1H- và 13C-NMR của chất 70 hoàn toàn phù hợp với phổ của chất stigmast-4-en-3-on trong tài liệu [64] (xem Bảng 3.4). Như vậy chất 70 chính 73
  74. là stigmast-4-en-3-on. Chất này đã được tách trước đây từ cây Nauclea officinalis thuộc họ Cà phê [64]. 1 Hình 3.10. Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của chất 70 (Stigmast-4-en-3-on) 1 Hình 3.11. Phổ H-NMR dãn rộng (CDCl3, 500 MHz) của chất 70 (Stigmast-4-en-3-on) 74
  75. 1 Hình 3.12. Phổ H-NMR dãn rộng (CDCl3, 500 MHz) của chất 70 (Stigmast-4-en-3-on) Hình 3.13. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 70 (Stigmast-4-en-3-on) 75
  76. 1 13 Bảng 3.4. Số liệu phổ H- và C-NMR (CDCl3) của hợp chất 70 và Stigmast-4-en-3-on STT Chất 70 Stigmast-4-en-3-on [64] C C H (J=Hz) C H (J=Hz) 1 35,7 34,8 2 34,0 2,26 (1H, ddd, J=2.4, 32,8 3.9, 14.5 Hz, H-2A) 3 199,6 198,5 4 123,8 5,72 (1H,br.s, H-4) 122,7 5,72 (1H, s, H-4) 5 171,7 170,5 6 33,0 31,9 7 32,1 31,0 8 35,7 34,6 9 53,9 52,7 10 38,6 37,5 11 23,1 22,0 12 39,7 38,5 13 42,4 41,3 14 55,9 54,9 15 26,2 25,0 16 28,2 27,1 17 56,1 54,9 18 12,0 0,71 (3H, s, CH3-18) 10,9 0,71(3H, s, H-18) 19 19,1 1,18 (3H, s, CH3-19) 18,0 1,18(3H, s, H-19) 20 36,1 35,0 21 17,4 0,86 (3H, d, J=7,4 Hz, CH3-21) 16,3 0,84 (3H, d, 7,4Hz, H-21) 22 33,9 32,9 23 24,2 23,1 24 45,9 44,7 25 29,2 27,1 26 19,8 0,82 (3H, d, J=6,7 Hz, CH3-26) 18,7 0,82 (3H, d, 6,7Hz, H-26) 27 18,7 0,84 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-27) 17,6 0,84 (3H, d, 7,0Hz, H-27) 28 24,2 23,1 29 12,0 0,92 (3H, t, J=6,3 Hz, CH3-29) 10,9 0,92(3H, t, J=6,4Hz, H-29) 76
  77. 3.1.1.5. Chất 71 (CT1): Stigmasterol Chất 71: Được phân lập dưới dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 169- 171oC. - Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu cộng hưởng của 29 cacbon, trong đó có 3 cacbon bậc bốn, 11 cacbon bậc ba, 9 cacbon bậc hai và 6 nhóm metyl. Phổ 13 CNMR cũng cho tín hiệu cộng hưởng của hai liên kết đôi ở vị trí C5 = C6: ( = 140,8 và 121,7) và vị trí C22 = C23: ( = 138,3 và 129,3). 1 - Phổ H-NMR cho thấy có hai nhóm metyl với các tín hiệu singlet tại H = 0,70 (3H, s, H-18) và H = 1,01 (3H, s, H-19), ba nhóm metyl gắn với –CH với các tín hiệu doublet tại: H = 0,798 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-26), 0,848 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-27), 1,02 (3H, d, J = 6,7 Hz, H-21) và một nhóm metyl gắn với – CH2 với tín hiệu triplet tại : H = 0,807 (3H, t, J = 7,5 Hz, H-29). Ở vùng trường thấp cho tín hiệu cộng hưởng của một olefin proton ( = 5,35 (1H, br s, H-6) và hai olefin proton ( = 5,02 (1H, dd, J = 8,7, 15.2 Hz, H-22) và 5,16 (1H, dd, J = 8,6, 15,2Hz, H-23) ; một proton carbinol:  = 3,51 (1H, m, H-3 ) chứng minh cho nhóm β- OH ở vị trí C3. 77
  78. - Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử tại m/z = 414,8 phù hợp với công thức + phân tử là (C29H50O) [M+2H] . Như vậy công thức phân tử của chất 71 sẽ là (C29H48O) với M = 412. Ngoài ra ta còn thấy pic ở m/z = 395,8 [M- H2O +1] . Pic này là pic cơ bản, hình thành do tạo thành dẫn xuất dien liên hợp (3,5-dien) sau khi phân tử 71 bị tách một phân tử nước. Kết hợp các dữ kiện phổ ESI-MS, phổ 1HNMR, 13C-NMR và phổ DEPT cho phép xác định cấu trúc của chất 71 là stigmasterol [64, 65]. Stigmasterol là hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, tồn tại khá phổ biến trong giới thực vật, ví dụ như trong vỏ chuối [66], trong lá cây Euphorbia heterophylla thuộc họ Thầu dầu [67], trong lá cây phèn đen (Phyllanthus reticulatas Poir) [68]. Itoh và cộng sự đã nghiên cứu khả năng phân biệt các sterol khác nhau thông qua hiệu số của thời gian lưu của dẫn xuất 3-oxo của chúng trong sắc ký khí [69]. 3.1.1.6. Chất 72 ( LHVH2): β-Sitosterol Chất 72 được xác định là β-sitosterol qua so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C- NMR của chúng với số liệu trong tài liệu [64, 70] . 78
  79. 3.1.2. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ rễ cây cọ hạ long (Livistona halongensis) 3.1.2.1. Chất 73 (LHRn2): 6-O-acetyl-2R,8-dimetyl-2-(4R,8R,11-trimetyltridecence- 12)chroman 73: (LHR.n2) Chất 73 thu được dưới dạng bột vô định hình, có pic ion phân tử trong phổ khối phân giải cao ESI-HRMS tại m/z = 457,36838 [M + H]+ (theo tính toán cho C30H49O3 là 457,36817). Phổ FT-IR của nó cho thấy các đỉnh hấp thụ ở 2936, -1 2857 (CH3, CH2), 1760 và 1209 cm (phenyl axetat). - Phổ 1H-NMR cho biết phân tử chất 73 có 7 nhóm metyl, trong đó có 3 nhóm thể hiện dưới dạng tín hiệu dublet ở H = 0,84 (J = 5,9 Hz); 0,85 (J = 5,9 Hz); 0,99 (J = 6,8 Hz). Một tín hiệu metyl singlet ở H = 2,13 có thể được gán cho nhóm metyl đính vào vòng thơm; tín hiệu metyl của nhóm axetyl cộng hưởng ở 2,24 ppm và metyl của nhóm isopropenyl xuất hiện ở 1,64 ppm. Ngoài ra, các tín hiệu của hai proton thơm có tương tác meta ở 6,60 và 6,66 ppm (mỗi tín hiệu d, J = 2,6Hz), hai proton olefin (>C=CH2) ở 4,66 ppm cũng như các proton no trong vùng từ 0,80 – 2,80 ppm cũng được quan sát thấy trong phổ 1H-NMR. - Chất 73 cho tín hiệu của 30 nguyên tử cacbon trong phổ 13C-NMR và DEPT, bao gồm 7 nhóm metyl, 8 cacbon thơm, 11 nhóm metylen, 2 nhóm metin và 2 cacbon bậc 4. Sự có mặt của phần 2-methylchroman axetat trong phân tử 73 được chứng minh qua 3 nhóm tín hiệu: vòng thơm, aliphatic metylen và metyl. Các tương tác trong phổ HMBC đã khẳng định cấu trúc của phần 2-methylchroman 79
  80. axetat trong phân tử chất 73. Các tương tác đó là tương tác giữa một cacbon trong cầu ete (C = 150,37, C-8a) với hai proton thơm ở H = 6,60; 6,66 (H-5, H-7), hai proton ở H = 2,72 (2H-4), proton của nhóm methyl gắn với vòng thơm H = 2,13 (8-CH3) và tương tác của cacbon thứ 2 trong cầu ete (C = 76,16, C-2) với bốn proton ở H = 2,72 (2H-4); 1,73; 1,79 (2H-3); 1,56 (2H-1'); nhóm metyl ở H = 1,25. Sự nối kết của nhóm axetyl ở C-6 và nhóm metyl ở C-2 được xác định bằng sự dịch chuyển về phía trường thấp của C-6 (142,51 ppm) và các tương tác quan sát được trong phổ HMBC giữa C-6 và H-5, H-7 (H = 6,60; 6,66); giữa C-2 (76,16 ppm) và 2-CH3 (1,25 ppm). Các dữ liệu phổ đã phân tích cho phép kết luận cấu trúc của đơn vị 2-metylchromanol-6-axetat trong chất 73. Cấu trúc của mạch nhánh được chứng minh qua các tương tác giữa C-12' (C = 149,82) và nhóm metyl bậc 3 ở H = 1,64 (s, 3H-13'), nhóm metyl bậc hai ở H = 1,00 (d, 3H-11') trong phổ HMBC. Vị trí nối kết của mạch nhánh được xác định ở C-2 là do tương tác của 2H-1' (H = 1,56) với C-2 (C = 76,16). Phổ H,H – COSY ( Hình 3.16 và hình 3.17) cho thấy các tương tác H,H phù hợp với cấu trúc dự đoán của chất 73, đặc biệt các tương tác giữa các proton trong đơn vị cấu trúc Chroman cũng như trong nhóm isopropenyl. Cấu hình tuyệt đối tại các vị trí C-2, 4’ và 8’ được xác định dựa vào so sánh với tài liệu tham khảo công bố bởi Browstein và Brem [71, 72]. Theo các tài liệu này, các đồng phân quang học khác nhau của α và δ- tocopherol cho độ chuyển dịch khác nhau nhiều nhất ở vị trí CH3-4’. Do đó, có thể xác định được cấu hình tuyệt đối của chất 73 dựa vào việc so sánh độ chuyển dịch hóa học tại vị trí CH3-4’ với một loạt các đồng phân quang học của δ- tocopherol đã được nghiên cứu và thống kê trong tài liệu. Qua đối chiếu với tài liệu tham khảo, độ chuyển dịch hóa học của CH3-4’ (δC 19,65) hoàn toàn phù hợp với cấu hình tuyệt đối R, R, R của chất 3,4-dehydrotocopherol. Do đó cấu trúc của chất 73 được xác định là 6-O-acetyl-2R,8-dimetyl-2-(4R,8R,11-trimetyltridecence- 80
  81. 12)chroman. Theo tra cứu tài liệu của chúng tôi, chất 73 có cấu trúc tương tự  - tocopherol, tuy nhiên đây là lần đầu tiên nó được tìm thấy trong thiên nhiên và là chất mới. Khi thử hoạt tính kháng oxy hóa thì chất 73 không có hoạt tính. Điều này có nghĩa là mạch nhánh của vitamin E (-tocopherol) đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính chống oxy hóa của vitamin E. Ngoài ra có thể nhóm hydroxy ở vị trí C6 nhân thơm của vitamin E ở dạng tự do cũng đóng vai trò quan trọng cho hoạt tính kháng oxy hóa. 1 13 Bảng 3.5. Phổ H- và C-NMR (CDCl3) của chất 73 (LHR.n2) Vị trí 1H 13C Vị trí 1H 13C 2 - 76,16 2' 1,35 m 20,98 2- 1,25 s 24,25 3', 5', 6', 7', 9', 32,36, 32,72, 32,89, 34,77, 37,40, 3 1,73 m 3101 4' 1,37 m 32,72 4 2,72 m 22,48 4'-CH3 0,84 d (5.9) 19,66 4a - 120,97 8' 1,37 m 32,89 5 6,60 d 119,05 8'-CH3 0,85 d (5.9) 19,75 6 - 142,51 11' 2,10 m 41,48 7 6,66 d 121,13 11'-CH3 1,00 d (6.8) 19,93 8 - 127,31 12' - 149,82 8a - 150,37 12'a 4,66 s 109,22 8- 2,13 s 16,11 13' 1,64 18,86 1' 1,56 m 40,25 CH3CO 2,24 s 21,09 CH3CO - 170,21 81
  82. 1 Hình 3.14. Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của chất 73 (LHRn2) 13 Hình 3.15. Phổ C-NMR và phổ DEPT (CDCl3 ) của chất 73 (LHRn2) 82
  83. Hình 3.16. Phổ H-H-COSY của chất 73 (LHRn2) Hình 3.17. Phổ COSY- dãn rộng của chất 73 (LHRn2) 83
  84. Hình 3.18. Phổ HMBC của chất 73 (LHRn2) 84
  85. Hình 3.19. Phổ HSQC của chất 73 (LHRn2) 85
  86. 3.1.2.2. Chất 75 (LHRm1): 3,5,3’,5’-tetrahydroxy-4-metoxystilben 75: 3,5,3’,5’-tetrahydroxy-4-metoxystilben 1 -Phổ H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz) của chất 75 cho các tín hiệu của một nhóm methoxy ở δH 3,83 (3H, s) cùng với năm proton thơm và hai proton olefin ở vị trí trans tại δH 6,80 (1H, d, J = 16,2 Hz) và 6,85 (1H, d, J = 16,2 Hz). Các tín hiệu proton thơm thuộc hai vòng benzen, trong đó ba proton thuộc một vòng thơm bị thế ở vị trí C-3’ và C-5’ tại δH 6,20 (1H, t, J = 2,1, H-4’); 6,46 (2H, d, J = 2,1, H-2’, H-6’) và hai proton còn lại nằm ở vị trí meta đối với nhau trên vòng A δH 6,55 (2H, s, H-2, H-6). Phân tử của chất 75 có tính đối xứng cao. - Phổ 13C NMR của chất 75 cho tín hiệu của 15 cacbon trong đó có 7 x CH, 1 x OCH3 và 5 x Cq. Hai cacbon olefin xuất hiện ở δC 129,49 và 128,94 ppm. Các số liệu phổ cho thấy chất 75 có chứa khung stilben với 5 nhóm thế trong đó có 4 nhóm OH và một nhóm metoxy. Qua so sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo [73, 74], chứng tỏ chất 75 có công thức cấu tạo là 3,5,3’,5’-tetrahydroxy-4- metoxystilben. Từ các số liệu ESI-MS, phổ hồng ngoại, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, so sánh với tài liệu tham khảo, chúng tôi xác định được cấu trúc của chất 75 như trên. 86
  87. 3.1.2.3. Chất 76 (LHRm2): 2S,3S-3,5,7,3’-tetrahydroxy-5’-metoxyflavan 76: 2S,3S-3,5,7,3’-tetrahydroxy-5’-metoxyflavan - Công thức phân tử của 76 là C16H16O6 được xác định qua pic ion ở m/z 303 [M- H]- (ion âm) và 327 [M+Na]+ (ion dương) trong phổ ESI-MS. Để khẳng định cấu trúc của chất 76, chúng tôi đã axetyl hóa chất 76 tạo dẫn xuất tetraaxetyl 80 của nó. Phổ HR-ESI MS của chất 80 có pic ion ở m/z 494,93860 ( tính toán cho C24H24NaO10 là 495,12972). Từ đó khẳng định chắc chắn công thức phân tử của chất 76 là C16H16O6. 1 - Phổ H-NMR của 76 có singlet ở H 3,87 (C 56,5) chứng tỏ chất 76 có một ’ nhóm metoxy. Phía trường thấp có các tín hiệu singlet ở H 6,93 (2H, H-2 , H- 6’) và 7,02 (1H, H-4’) đặc trưng cho sự có mặt của nhân phenyl có nhóm thế ở C- ’ ’ ’ 1, C-3, C-5 [74]. Tương tác HMBC của C-1 (C 133,7) với H-2 / H-6 và H-2 ’ ’ khẳng định được 2 nhóm thế ở C-3 và C-5 . Cặp doublet có hằng số tương tác meta (J = 2,2 Hz) ở H 5,97 và 5,95 cho thấy vòng A có 2 nhóm thế ở C-5 và C-7. Tín hiệu của 2 nhóm oxymetin ở H 4,88 (H-2), 4,21 (H-3) và cặp doublet kép ở H 2,89 và 2,77 đặc trưng cho khung 3 hydroxyflavan. Tương tác của proton của ’ nhóm methoxy với C-5 (C 148,5) cho biết nhóm này gắn với C-5’. Phân tích đầy đủ tương tác trực tiếp trong phổ HSQC và tương tác qua 2 hoặc 3 liên kết trong 87
  88. phổ HMBC cho phép kết luận cấu trúc của chất 76 là 3,5,7,3’-tetrahydroxy-5’- metoxyflavan. Hằng số tương tác bé của H-2 và H-3 cho biết 2 proton này ở vị trí cis với nhau, như vậy chất 76 sẽ có cấu hình tương đối là (2R, 3R) hoặc (2S, 3S). 25 Chất 76 có năng suất quay cực [α]D = +2,7 ( c = 2,84, MeOH) so sánh với tài liệu [17, 75] gợi ý cho biết cấu hình của chất 76 là 2S, 3S. Bằng kết hợp số liệu phổ phân tích ở trên đã xác định được cấu trúc của 76 là: 2S,3S-3,5,7,3’- tetrahydroxy- 5’- metoxyflavan. Đây là một chất mới, lần đầu tiên tìm thấy trong thiên nhiên. Dẫn xuất 2S,3S-3,5,7,3’,5’-pentahydroxyflavan đã được phân lập từ cây Humboldia laurifolia [75]. Hình 3.20 . Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của chất 76 (LHRm2) 88
  89. Hình 3.21. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT (MeOD) của chất 76 (LHRm2) 3.1.2.4. Chất 77 (LHRm3): β-sitosterol-3-O-β–D-glucopyranosid (β-sitosterol glucosid) 77. (LHR.m3): β-sitosterol glucosid 89
  90. 1 - Số liệu phổ H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của chất 77 xuất hiện các tín hiệu singlet tại δH 0,65 (3H, s), 1,23 (3H, s) 0,96 (3H, s) cùng với các metyl dublet tại δH 0,80 (3H, d, J = 6,9), 0,81 (3H, d, J = 6,8 Hz), 0,90 (3H, d, J = 6,5 Hz) và 1,00 (3H, d, J = 6,7Hz). Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR còn có thể quan sát thấy tín hiệu của một proton vinylic tại δH 5,32 (1H, br s) và tín hiệu của một nhóm metin mang oxi tại 3,42 (1H, m). Các tín hiệu của các proton còn lại bị trùng lấp lên nhau trong khoảng δH 1,0-2,3 ppm. Chất 77 có gắn với một đường glucose được thấy rõ qua cụm tín hiệu của 4 metin proton tại δH 3,05-3,08 (1H, m); 3,10-3,14 (3H, m) và tín hiệu của nhóm metilen mang oxi tại δH 3,64 (1H, dd, J = 5,5; 10,1, H-6A-Glc) và 3,46 (1H, m, H-6B-Glc). Phổ 1H-NMR của chất 77 còn cho tín hiệu của một proton anome tại δH 4,22 (1H, d, J =7,8 Hz) và tín hiệu của các nhóm OH của đường tại δH 4,39 (1H, t, J = 5,7 Hz; 6’-OH) và 4,83 (3H, m; 2’,3’,4’-OH). Trên phổ 13C-NMR của hợp chất 77 cho thấy sự xuất hiện của 35 cacbon trong đó có 29 cacbon của aglycon và 6 cacbon của một nhánh đường. Tín hiệu của liên kết olefin tại δC 121,13 và 140,42, tín hiệu của 6 nhóm metyl tại δC 11,62; 11,73; 18,56; 18,90; 19,04 và 19,65, tín hiệu của một nhóm metin mang oxi của aglycon tại δC 70,09 (C-3). Ngoài ra còn có tín hiệu của một cacbon anome tại δC 100,75 (C-1’) cùng với 4 metin mang oxi tại δC 73,43; 76,69; 76,74 và 76,90. Kết hợp các dữ liệu phổ cho thấy chất 77 là một tritecpen khung prostan có gắn thêm một nhánh đường β-glucopyranose. Qua so sánh với tài liệu tham khảo [75] thấy hoàn toàn phù hợp. Do đó chất 77 được xác định là daucosterol. 3.1.2.5. Chất 78 (LHRm4): 2R,3R-3,7,3’-trihydroxy-5’-metoxyflavan 5-O--D- glucopyranosid 90
  91. 78: 2R,3R-3,7,3’-trihydroxy-5’-metoxyflavan 5-O--D-glucopyranosid - Kết hợp dữ liệu phổ 1H, 13C-DEPT NMR và pic ion m/z 489,14618 [M+Na]+ (tính toán cho C22H26NaO11 là 489,13728), xác định được công thức phân tử của 78 là C22H26O11. - Dữ kiện phổ MS, 1H-, 13C-NMR cho thấy chất 78 có cùng cấu trúc khung và nhóm thế giống chất 76 nhưng có thêm một đường hexose. Tín hiệu của 5 nhóm oxymethin (H 3,4 – 4,9 và C 62-103) cùng với tín hiệu của 1 nhóm oxymethylen (H 3,91; 3,73 và C 62,6) đặc trung cho sự hiện diện của đường glucose. Proton anomeric ở H 4,85(d, J = 7,5 Hz) cho thấy đây là đường β-D-glucopyranose. Tương tác của H-1” (H 4,85) với C-5 (C 158,4) trong phổ HMBC cho biết đường này gắn với C-5. Tín hiệu ở C 158,4 được quy kết cho C-5 mà không phải là C-7 vì nếu là C7 thì phải có tương tác với cả 2 proton liền kề (C-7/H-6, H-8). Cấu hình cis của H-2 và H-3 được xác định qua tín hiệu của 2 proton này là 25 0 singlet ở H 4,87 và 4,21 (br.s). Chất 78 có năng suất quay cực [α] D: – 2.9 (c = 1.22, MeOH) và ngược dấu so với chất 76, cho thấy chất này cấu hình tuyệt đối là 2R, 3R. Từ việc phân tích số liệu phổ 1 chiều, 2 chiều và kết hợp với công thức phân tử đã xác định được cấu trúc của 78 là 2R,3R-3,7,3’-trihydroxy-5’- metoxyflavan 5-O--D-glucopyranosid, đây là một chất mới. Chất 76 và 78 là đại diện của flavonoid với nhóm thế ở C-3’ và C-5’, là cấu trúc ít gặp trong tự nhiên [17, 75]. 91
  92. Bảng 3.6. Số liệu phổ 1H - và 13C-NMR (125 MHz) của chất 76 và 78 Chất 76 (LHRm2) Chất 78 (LHRm4) Vị trí C H C H 2 79,7 4,88 (s) 79,8 4,87 (br s) 3 67,5 4,21 (br s) 67,3 4,21 (br s) 4 22,2 2,77 (dd, 16.8, 2.8) 29,3 2,85 (dd, 3.0, 17.1) 5 157,7 - 158,4 - 6 96,5c 5,97 (d, 2.2) 98,6 6,11 (d, 2.2) 7 157,3 - 157,9 - 8 96,0c 5,95 (d, 2.2) 97,4 6,30 (d, 2.2) 9 158,0 - 157,1 - 10 100,1 - 103,0 - 1’ 133,7 - 133,5 - 2’ 112,5 6,93 (s) 115,2 7,01 (s) 3’ 147,2 - 147,2 - 4’ 115,2 7,02 (s) 112,5 6,93 (br s) 5’ 148,5 - 148,5 - 6’ 119,3 6,93 (s) 119,2 6,93 (br s) 1” - - 102,6 4,85 (d, 7.5) 2” - - 74,9 3,48 (m) 3” - - 78,1 3,41 (m) 4” - - 71,4 3,42 (m) 5” - - 78,2 3,48 (m) 6” - - 62,6 3,91 (m) 5’-OMe 56,53 3,87 s 56,5 3,87 (s) 92
  93. Hình 3.22. Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của chất 78 (LHRm4) Hình 3.23. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT (MeOD) của chất 78 (LHRm4) 93
  94. Hình 3.24 . Phổ HMBC của chất 78 (LHRm4) 94
  95. Hình 3.25. Phổ HSQC của chất 78 (LHRm4) 95
  96. 3.1.2.6. Chất 79 (LHRm6): Sacharose octaacetat 79. (LHRm6): Sacharose octaaxetat 1 - Phổ H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của chất 79 cho thấy tín hiệu của hai đường monosacarit đã bị acetyl hóa hoàn toàn với tín hiệu của 8 nhóm acetoxy 1 cho thấy trên phổ H-NMR tại δH 1,99 (s, 3H, CH3CO); 2,00 (s, 3H, CH3CO), 13 2,10 (br s, 15H, 5 x CH3CO), 2,17 (s, 3H, CH3CO) và trên phổ C-NMR các nhóm CH3CO tại δC 169,51; 169,66; 169,89; 170,03; 170,11; 170,48 và 170,70. 13 Ngoài ra trên phổ C-NMR còn xuất hiện tín hiệu của cacbon anome tại C-1 (δC 89,87), một cacbon bậc 4 tại δC 103,95 (C-2’), 7 tín hiệu CH thuộc vùng đường 1 cùng với sự có mặt của metilen gắn với oxi (3xCH2OH). Phổ H-NMR cho tín hiệu của 7 proton ở vùng đường tại δH 4,12-4,17 (m, 3H), 4,20-4,22 (m, 1H), 4,25-4,31 (m, 3H) cùng với các tín hiệu của các proton ở nhóm CH2OH tại δH 4,34 (1H, dd, J = 4,3; 11,9 Hz); 4,88 (1H, dd, J = 3,7; 10,4 Hz); 5,08 (1H, t, J = 9,8 Hz); 5,37 (1H, t, J = 5,9 Hz); 5,40 (d, 1H, J = 5,9 Hz); 5,45 (1H, t, J = 10,4 Hz). Qua phân tích số liệu phổ và so sánh với tài liệu tham khảo [77] cho thấy chất 79 có công thức cấu tạo của một đường disacarit với thành phần là α-D- glucopyranosyl (1→2)-β-D-fructopyranosid hay còn gọi là saccharose octaaxetat. 96
  97. Hình 3.26: Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của chất 79 (LHRm6) Hình 3.27: Phổ 13C-NMR (MeOD, 125 MHz) của chất 79 (LHRm6) 97
  98. 3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây rau má (Centella asiatica (L.) Urban.) 3.2.1. Chất 82 (RM1): Axit asiatic - Chất 82 (RM1: 3,4 g, 0,37% tính theo trọng lượng mẫu rau má thô), được phân lập từ phân đoạn F2 của cặn chiết MeOH dưới dạng tinh thể màu trắng (CHCl3/MeOH), điểm nóng chảy 324-326°C. - Phổ hồng ngoại: cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl (3411 cm-1), -1 nhóm CH2, CH3 (2930 và 2866 cm ). - Phổ 1H-NMR cho thấy có 6 nhóm metyl trong đó có 4 nhóm metyl gắn với cacbon bậc 4 với các tín hiệu singlet tại: 0,717, 0,871; 0,992; 1,067; 1,158 và hai nhóm metyl gắn với CH với tín hiệu doublet tại H = 0,919 (J = 6,5 Hz) và H = 0,929 (J = 6,5 Hz). Ngoài ra, trên phổ có tín hiệu một nhóm CH2 gắn với OH ở H = 3,297 (d, J = 11,0 Hz; H-23a); H = 3,535 (d; J = 11,0 Hz; H-23b), 2 nhóm hydroxy gắn với CH ở  = 3,387 (J = 9,5 Hz; H-3) và 3,718 (m, H-2) và 1 tín hiệu của nối đôi ở  = 5,260 (br s, H-12). Phổ 13C-NMR và DEPT của chất 82 có mặt của 30 cacbon trong đó có 6 nhóm metyl; 9 nhóm cacbon bậc 2; 8 nhóm cacbon bậc 3 và 7 nhóm cacbon bậc 4, 98