Đề tài Một số đặc điểm dịch tễ học của nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại bệnh viện Việt Đức-Hà Nội, 2010-2011

201 trang yendo 5740

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đề tài Một số đặc điểm dịch tễ học của nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại bệnh viện Việt Đức-Hà Nội, 2010-2011", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

de_tai_mot_so_dac_diem_dich_te_hoc_cua_nhiem_khuan_benh_vien.pdf

Nội dung text: Đề tài Một số đặc điểm dịch tễ học của nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại bệnh viện Việt Đức-Hà Nội, 2010-2011

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm khuẩn bệnh viện (Hospital-Acquired Infections - HAI) (NKBV) là nhiễm khuẩn mà bệnh nhân mắc phải trong thời gian nằm viện là một trong những nguyên nhân chính gây ra tỷ lệ mắc, tử vong cao cho các bệnh nhân tại các bệnh viện trên thế giới [137]. NKBV thường gây nên do các vi khuẩn kháng đa kháng sinh, gây rất nhiều khó khăn cho công tác điều trị, kéo dài thời gian mắc bệnh, nguy cơ tử vong cao [112]. Khi vi khuẩn kháng lại 1 kháng sinh phải thay thế bằng những kháng sinh thế hệ mới có giá thành cao hơn gây nên những thiệt hại lớn về kinh tế. Tại liên minh châu Âu, tỷ lệ tử vong hàng năm do bị nhiễm các chủng vi khuẩn kháng thuốc là 25.000 ca và tại Mỹ là hơn 63.000 ca, và gây thiệt hại cho nền kinh tế bao gồm chi phí điều trị và tạo ra ít sản phẩm lao động. Mỗi năm tại châu Âu là 1,5 tỉ Euro và Mỹ là 1,87 tỉ đô la, cao hơn rất nhiều chi phí cho công tác phòng chống bệnh cúm [43]. Từ năm 2000, sự lây lan nhanh chóng của các chủng vi khuẩn Gram âm là căn nguyên quan trọng gây nhiễm khuẩn bệnh viện có khả năng sinh ra các enzyme (extended-spectrum beta-lactamases; ESBLs) ly giải hầu hết các kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm cephalosporin đã được ghi nhận trên toàn thế giới [103]. Carbapenem là nhóm kháng sinh mạnh nhất “thuộc nhóm lựa chọn cuối cùng” được sử dụng để điều trị cho các trường hợp bị nhiễm khuẩn bệnh viện nặng do các chủng vi khuẩn Gram âm sinh enzym ESBLs. Tuy nhiên do sử dụng rộng rãi loại kháng sinh này đã tạo áp lực cho vi khuẩn kháng lại carbapenem [89]. Enzym ly giải carbapenem mã hóa bởi gen KPC, IMP và VIM được phát hiện ở khắp nơi trên thế giới [89;108]. Enzym OXA-48 ly giải carbapenem tập trung chủ yếu ở các quốc gia vùng Địa Trung Hải, châu Âu và Ấn Độ [82;101;102]. Đặc biệt gần đây nhất vào năm 2008, giới khoa học đã công bố thông tin chấn động, gây quan ngại lớn cho toàn thế giới về việc phát hiện ra các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen New Delhi metallo-beta- lactamase-1 (NDM-1) ở bệnh nhân người Thụy Điển có tiền sử chữa bệnh tại Ấn
2 Độ. Các vi khuẩn mang gen NDM-1 có tính kháng kháng sinh rất mạnh, khả năng lây lan nhanh, dẫn đến nguy cơ làm giảm hiệu quả và vô hiệu hóa nhóm kháng sinh hết sức quan trọng này trong thực hành lâm sàng. Hiện tại các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 đã được báo cáo lây lan ra nhiều quốc gia trên thế giới [70;89;140]. Điều này cho thấy tính kháng kháng sinh của vi khuẩn diễn ra đa dạng, phức tạp, xu hướng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng và nguy hiểm hơn. Đây là vấn đề y tế nghiêm trọng mang tính toàn cầu được tổ chức Y tế Thế giới cảnh báo, nếu không có các nghiên cứu kịp thời và đưa ra giải pháp nhanh chóng và hiệu quả thì sẽ không có kháng sinh để điều trị hiệu quả cho các vi khuẩn này trong 5 – 10 năm tới. Ở Việt Nam, nhiều báo cáo cho thấy tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh tại các bệnh viện đã ở mức độ cao. Trong báo cáo gần đây cho thấy tại một số bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh, các vi khuẩn gram âm là căn nguyên thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện cũng đã kháng lại cephalosporin thế hệ 3 và gia tăng từ 25% năm 2000-2001 lên đến 42% vào năm 2009 [49]. Kháng sinh nhóm carbapenem được đưa vào thị trường Việt Nam vào đầu những năm 2000 và xu hướng sử dụng nhóm kháng sinh này ngày càng gia tăng và mở rộng đặc biệt tại các bệnh viện lớn. Hai căn nguyên gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp là P. aeruginosa và A. baumannii được đánh giá ở 6 bệnh viện năm 2008 cho thấy: 20% các chủng P. aeruginosa và 50% các chủng A. baumannii kháng kháng sinh nhóm carbapenem [49]. Bệnh viện Việt Đức là bệnh viện ngoại khoa đầu ngành với qui mô 500 giường bệnh, mỗi năm bệnh viện thực hiện khoảng 28.000 ca phẫu thuật thuộc nhiều chuyên khoa sâu, luôn trong tình trạng quá tải, gây nhiều khó khăn cho công tác phòng chống nhiễm khuẩn. Kháng sinh chiếm một tỷ lệ lớn trong cơ cấu thuốc sử dụng, trong đó các kháng sinh thế hệ mới như cephalosporin và đặc biệt là kháng sinh nhóm carbapenem được sử dụng thường xuyên tại bệnh viện, chính điều này dẫn đến nguy cơ cao cho các vi khuẩn kháng kháng sinh nói chung trong đó có carbapenem. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có
3 nghiên cứu đầy đủ, toàn diện về tình trạng kháng kháng sinh nói chung và đặc biệt là các nghiên cứu về vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1. Vấn đề vi khuẩn kháng carbapenem là vấn đề rất mới nên hầu như chưa có những nghiên cứu về vấn đề này tại Việt Nam. Việc có những hiểu biết cơ bản và chuyên sâu về vấn đề này bao gồm : dịch tễ học, lâm sàng, các yếu tố nguy cơ, đặc điểm về vi sinh và sinh học phân tử của vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 là hết sức cấp thiết và vô cùng quan trọng trong giai đoạn hiện nay. Những số liệu khoa học này sẽ giúp cho các nhà chuyên môn, các nhà quản lý cũng như các nhà hoạch định chính sách y tế trong việc định hướng sử dụng thuốc, phối hợp thuốc và nhất là đưa ra các giải pháp khống chế sự lây lan của vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 trong bệnh viện và cộng đồng tại Việt Nam. Chính vì sự cần thiết và ý nghĩa thực tiễn đã nêu ở trên chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Một số đặc điểm dịch tễ học của nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại bệnh viện Việt Đức-Hà Nội, 2010-2011” với 3 mục tiêu cụ thể sau. 1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập tại bệnh viện Việt Đức- Hà Nội. 2. Mô tả tình trạng ô nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 trong một số mẫu môi trường bệnh viện Việt Đức. 3. Xác định một số đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1.
4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nhiễm khuẩn bệnh viện Nhiễm khuẩn bệnh viện: “Là nhiễm khuẩn xảy ra sau 48 giờ kể từ khi vào viện, các nhiễm khuẩn này không xuất hiện hay ở trong giai đoạn ủ bệnh lúc nhập viện”. Định nghĩa này bao gồm cả các nhiễm khuẩn của bệnh nhân sau khi ra viện và nhiễm khuẩn nghề nghiệp trên các nhân viên y tế trong bệnh viện [137]. Dựa trên định nghĩa này, các định nghĩa riêng, đơn giản và không cần sử dụng tất cả các kỹ thuật chẩn đoán đã được phát triển cho từng loại nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp, qua đó có thể sử dụng cho công tác giám sát nhiễm khuẩn ở các bệnh viện thiếu hụt các trang thiết bị chẩn đoán hiện đại (bảng 1.1) [48;59;80;137]. Bảng 1.1. Phân loại nhiễm khuẩn bệnh viện Loại nhiễm khuẩn Tiêu chuẩn Nhiễm khuẩn vết mổ Có dịch chảy ra từ vết mổ, abcess hoặc viêm mô lan tỏa tại vết mổ trong tháng đầu tiên sau khi phẫu thuật Nhiễm khuẩn tiết niệu Nuôi cấy dương tính (1 hoặc 2 vi khuẩn) với nồng độ >105vk/ml, có hoặc không có các triệu chứng lâm sàng Nhiễm khuẩn đường hô hấp Có tối thiểu 2 triệu chứng viêm nhiễm đường hô hấp xuất hiện trong thời gian nhập viện: - Ho - Có đờm mủ - Có hình ảnh viêm phổi trên phim X- quang Nhiễm khuẩn khi đặt Có biểu hiện viêm, nổi hạch hoặc có mủ chảy catheter ra từ vị trí đặt catheter Nhiễm khuẩn huyết Sốt hoặc rét và kết quả cấy máu dương tính với ít nhất một tác nhân gây bệnh
5 Hiện nay nhiễm khuẩn bệnh viện là một vấn đề nghiêm trọng tác động đến sức khoẻ toàn cầu. Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới về nhiễm khuẩn bệnh viện từ năm 1995 đến 2010 cho thấy: Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện tính chung cho các quốc gia có thu nhập cao nằm trong khoảng từ 5% đến 12% (hình 1.1) và tỷ lệ chung cho tất cả các quốc gia này vào khoảng 7,6% [138]. Theo ước tính của trung tâm phòng chống và kiểm soát bệnh châu Âu, hàng năm có khoảng 4.100.000 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn bệnh viện và khoảng 37.000 trường hợp tử vong. Phần lớn các trường hợp là nhiễm khuẩn tiết niệu tiếp theo là nhiễm khuẩn đường hô hấp, nhiễm khuẩn sau khi phẫu thuật, nhiễm khuẩn huyết và một số nhiễm khuẩn khác (bao gồm tiêu chảy do Clostridium difficile). S. aureus kháng đa kháng sinh cũng chiếm khoảng 5% các trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện tại liên minh châu Âu [40]. Tại Mỹ năm 2002, tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện vào khoảng 4,5% tương đương với khoảng 1,7 triệu bệnh nhân bị mắc nhiễm khuẩn. Nhiễm khuẩn đường tiết niệu chiếm tỷ lệ cao nhất (36%) tiếp theo là nhiễm khuẩn vết mổ (20%), nhiễm trùng huyết và viêm phổi (11%) [5;67]. Hình 1.1. Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện ở các nước có thu nhập cao *(nguồn WHO, 2011, Report on the Burden of Endemic Health Care- Associated Infection Worldwide) [138]. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện ở các quốc gia có thu nhập trung bình và
6 thấp dao động từ 5,7% đến 19,9% và tỷ lệ tính chung là khoảng 10,1/100 bệnh nhân (hình 1.2) [138]. Trong đó nhiễm khuẩn vết mổ chiếm tỷ lệ cao nhất (29,1%), nhiễm khuẩn tiết niệu (23,9%), nhiễm khuẩn huyết (19,1%), đường hô hấp (14,8%) và các nhiễm khuẩn khác là 13,1% [138]. Hình 1.2. Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện ở các nước có thu nhập thấp và trung bình *(nguồn WHO, 2011, Report on the Burden of Endemic Health Care-Associated Infection Worldwide) [138]. Có rất nhiều tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và sự tác động của các tác nhân này cũng rất khác nhau giữa các nhóm bệnh nhân, các bệnh viện, khoa điều trị và giữa các quốc gia bao gồm: vi rút như viêm gan B, C (lây qua đường tiêm truyền, chạy thận nhân tạo và phẫu thuật nội soi). Vi rút rota và các vi rút đường ruột (lây truyền qua đường phân-miệng) [5;138]. Một số loại ký sinh trùng như Giardia lamblia và nhiều loại nấm Candida albicans, Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans và Cryptosporidium gây nhiễm trùng cơ hội cho các bệnh nhân sau khi điều trị kháng sinh dài ngày và trên các bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch và có thể lây truyền dễ dàng trong bệnh viện [137]. Hiện nay vi khuẩn là một trong những căn nguyên quan trọng hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện bao gồm như C. perfringen là nguyên nhân gây bệnh hoại thư sinh hơi trong bệnh viện [137]. Vi khuẩn Gram dương
7 điển hình là S. aureus (sống ký sinh trên da và mũi) là nguyên nhân gây nhiều loại nhiễm khuẩn trong bệnh viện như viêm phổi, xương, tim và nhiễm khuẩn huyết [137]. Đặc biệt trong 10 năm vừa qua các vi khuẩn Gram âm như Escherichia coli (E. coli), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) và Acinetobacter baumanii (A. baumannii) là nguyên nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn nặng trong các bệnh viện như nhiễm khuẩn vết mổ, viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết, đặc biệt khi các vi khuẩn này đã kháng lại các nhóm kháng sinh thế thệ mới đắt tiền được sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện như cephalosporin và carbapenem là kháng sinh mạnh nhất hiện nay gia tăng một cách nhanh chóng trên toàn thế giới. Điều này đe doạ thực sự đến hiệu quả điều trị cho bệnh nhân tại các bệnh viện trên toàn thế giới [8;42;70;103;140]. 1.2. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Việc phát minh ra kháng sinh ở thế kỷ 20 đã đóng một vai trò quan trọng trong việc khống chế các bệnh nhiễm trùng. Cùng với việc cải thiện điều kiện vệ sinh, nhà ở, dinh dưỡng và chương trình tiêm chủng mở rộng đã góp phần quan trọng làm giảm tỷ lệ tử vong của các bệnh nhiễm trùng và tuổi thọ của con người đã được nâng cao. Cho đến nay nhiều thế hệ kháng sinh khác nhau đã được nghiên cứu và chế tạo thành công đáp ứng kịp thời cho công tác điều trị. Tuy nhiên hiện nay do sự gia tăng tỷ lệ các vi khuẩn kháng kháng sinh trong bệnh viện và cộng đồng là một vấn đề quan trọng hàng đầu trên thế giới cần được nghiên cứu và tìm ra các giải pháp phòng chống một cách hiệu quả. 1.2.1. Lịch sử phát triển kháng sinh Năm 1929 Alexander Fleming là người đầu tiên nghiên cứu và phát minh ra loại thuốc kháng sinh đầu tiên có tên là Penicillin, trong nghiên cứu tác giả quan sát thấy ở trên các đĩa thạch bị nhiễm nấm penicillin (mold
8 penicillin notatum) có khả năng ức chế sự phát triển của tụ cầu, ở trên các đĩa thạch này xuất hiện một vòng vô khuẩn xung quanh khóm nấm do tụ cầu không có khả năng mọc xung quanh khóm nấm. Sau đó tác giả tiến hành nhiều thử nghiệm và thấy rằng các huyền dịch nuôi cấy nấm này có khả năng ức chế sự phát triển của tụ cầu ngay cả khi pha loãng huyền dịch nấm nuôi cấy tới 800 lần, hoạt chất này được đặt tên là penicillin [115]. Tuy nhiên phải đến năm 1939, Ernst Chain và Howard Florey mới tách chiết thành công hoạt chất penicillin và được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trong chiến tranh thế giới lần thứ II. Năm 1946, penicillin bắt đầu được sử dụng trong lâm sàng và có đóng góp to lớn cho y học. Những phát minh này đã tạo ra một cuộc cách mạng khoa học trong nền y học hiện đại và làm tiền đề nghiên cứu và phát triển nhiều hợp chất kháng sinh có nguồn gốc từ thiên nhiên [29;115]. Bác sỹ người Đức Gerhard Domagk đã công bố phát minh tổng hợp được hoạt chất kháng sinh mới prontosil. Đây là thế hệ đầu tiên của các kháng sinh thuộc dòng sulfonamides được sử dụng trong lâm sàng để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường tiết niệu hô hấp và một số bệnh nhiễm trùng khác. Với phát minh này Gerhard Domagk được nhận giải thưởng Nobel năm 1939 [115]. Thập kỷ 50 đến 70 của thế kỷ 20 được coi là thời kỳ hoàng kim của kháng sinh, nhiều loại kháng sinh mới đã được giới thiệu bao gồm: streptomycin, chloramphenicol và tetracycline được sử dụng điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn. Các loại thuốc khác như para aminosalisylic acid và isoniazid cũng được nghiên cứu, sản xuất thành công và sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh lao [31;115]. Cho đến nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều nhóm và các thế hệ kháng sinh khác nhau như cephalosporins, fluoroquinolones, macrolides và carbapenem đã được nghiên cứu và sản xuất thành công, góp phần to lớn cho công tác phòng và điều trị các bệnh nhiễm trùng.
9 1.2.2. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 1.2.2.1. Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Trong tự nhiên phần lớn các vi khuẩn đều sở hữu riêng các gen kháng kháng sinh. Điều này được quan sát thấy trên một số chủng Staphylococcus đã đề kháng với penicillin ngay sau khi được đưa vào sử dụng năm 1946. Dưới áp lực chọn lọc tự nhiên và sự đấu tranh sinh tồn đã giúp các loài vi khuẩn có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh, do vậy sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn thường xuất hiện rất nhanh ngay sau khi kháng sinh được đưa vào sử dụng, ví dụ streptomycin được đưa vào sử dụng năm 1943 đến năm 1959 vi khuẩn đã lại kháng kháng sinh này (bảng 1.2). Tương tự các chủng Shigella dysenteriae phân lập tại vụ dịch lỵ ở Nhật Bản năm 1953 đã kháng đa kháng sinh bao gồm: chloramphenicol, tetracyclin, streptomycin và sulfonamide. Hiện nay hầu hết các vi khuẩn gây bệnh đã kháng lại một hoặc nhiều loại kháng sinh [127]. Bảng 1.2. Sự phát triển đề kháng kháng sinh của vi khuẩn [127] Năm phát hiện Kháng sinh Năm sử dụng đề kháng kháng sinh Sulfonamid 1930 1940 Penicillin 1943 1946 Streptomycin 1943 1959 Chloramphenicol 1947 1959 Tetracyclin 1948 1953 Erythromycin 1952 1988 Vancomycin 1956 1988 Methicillin 1960 1961 Ampicillin 1961 1973 Cephalosporin 1960 1960
10 Trong thời gian gần đây, khoảng 70% các chủng vi khuẩn gây bệnh trong bệnh viện đã kháng lại ít nhất 1 loại kháng sinh thường dùng trong điều trị, đặc biệt một số vi khuẩn như E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa và A. baumannii đã kháng lại tất cả các loại kháng sinh bao gồm cả các kháng sinh mạnh nhất hiện nay như cephalosporin và carbapenem. Đây là một mối lo ngại và thách thức lớn đối với nền y học hiện đại [7;70;88;140]. 1.2.2.2. Phân loại đề kháng Về nguyên lý của kháng sinh là ức chế sự phát triển của vi khuẩn, nhưng nếu trong môi trường kháng sinh ở nồng độ thường dùng mà vi khuẩn vẫn phát triển được gọi là đề kháng [1]. Đề kháng được chia làm hai loại đề kháng giả và đề kháng thật. Đề kháng giả Đề kháng giả là hiện tượng có biểu hiện đề kháng nhưng bản chất không phải do di truyền. Ví dụ khi vi khuẩn nằm trong ổ áp xe hoặc nằm trong các tổ chức hoại tử bao bọc, kháng sinh không thấm được tới ổ viêm chứa vi khuẩn nên không phát huy được hết tác dụng. Khi vi khuẩn ở trạng thái nghỉ (không nhân lên, không chuyển hóa) thì sẽ không chịu tác dụng của thuốc kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách. Thêm vào đó, ở một số bệnh nhân bị suy giảm hệ thống miễn dịch hay chức năng của thực bào bị hạn chế, khi đó cơ thể không đủ khả năng loại trừ những vi khuẩn đã bị ức chế ra khỏi cơ thể, vì thế khi không còn thuốc kháng sinh vi khuẩn sẽ phục hồi và phát triển trở lại [1]. Đề kháng thật + Đề kháng tự nhiên: Là do cấu trúc di truyền của một số loài vi khuẩn, ví dụ một số loài vi khuẩn không có hệ thống vận chuyển kháng sinh hoặc không có đích tác động của kháng sinh như Mycoplasma thuộc loại vi khuẩn không có vách sẽ không chịu tác động của kháng sinh tổng hợp vách,
11 như -lactam. Ở một số các vi khuẩn Gram âm, tế bào vi khuẩn được bao bọc bởi một lớp vỏ bên ngoài sẽ ngăn không cho kháng sinh xâm nhập vào bên trong tế bào [1]. + Đề kháng thu được: Có rất nhiều cơ chế đã được vi khuẩn phát triển để kháng lại kháng sinh. Các đề kháng thu được này liên quan đến sự thay đổi nhiễm sắc thể của vi khuẩn đó hoặc do được truyền các gen kháng kháng sinh nằm trên các plasmid và class I intergron cho vi khuẩn cùng và khác loài thông qua hình thức biến nạp và tiếp hợp [1]. 1.2.3. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Có rất nhiều cơ chế tham gia vào tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Những cơ chế này có thể thay đổi đích tác động, tạo ra các enzym, ngăn cản khả năng gắn vào tế bào vi khuẩn và làm thay đổi đường chuyển hóa (tạo ra các isoenzym). 1.2.3.1. Làm thay đổi đích tác động Vi khuẩn thay đổi đích tác động của kháng sinh do đó kháng sinh không còn vị trí để tác động, ví dụ: A. baumannii kháng lại imipenem và P. aeruginosa kháng ticarcilline và imipenem do chúng thay đổi vị trí gắn vào protein của các kháng sinh [97]. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm quinolone là ức chế hoạt động của đoạn gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym GyrA (ADN gyrase subunit A) và ParC (topoisomerase IV) của tế bào vi khuẩn. Ví dụ tính kháng quinolone của S. typhi xảy ra do đột biến điểm của các đoạn gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym GyrA và ParC trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn [20;126]. 1.2.3.2. Tạo ra các enzym Enzym được tạo ra làm biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc phân tử của kháng sinh. Ví dụ với các enzym beta-lactamase có khả năng phá hủy penicillin được báo cáo trước khi được đưa vào sử dụng vào đầu những năm
12 1940. Sau đó hàng loạt các enzym beta-lactamase có khả năng ức chế hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và carbapenem được phát hiện. Hiện nay đã xác định được hơn 890 loại enzym kháng kháng sinh của vi khuẩn, nhiều hơn số lượng các loại kháng sinh đã được sản xuất và phần lớn các gen mã hóa các enzym này nằm trên các plasmid có thể truyền dễ dàng trong quần thể vi khuẩn cùng và khác loài [8;24]. 1.2.3.3. Làm giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất Làm giảm mức độ thấm của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn trong trường hợp kháng tetracycline hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng trong trường hợp kháng kháng sinh nhóm aminoglycosid [8]. Việc thâm nhập của các kháng sinh nhóm beta-lactam được thực hiện qua các kênh vận chuyển (porin), vi khuẩn biến đổi làm mất các kênh vận chuyển và làm hạn chế sự tác động của nhóm kháng sinh này [8]. Cơ chế bơm đẩy (efflux pump) của các kháng sinh nhóm quinolon của vi khuẩn E. coli và P. aeruginosa, thường liên quan đến hệ thống vận chuyển ion qua màng tế bào [8]. 1.2.4. Các yếu tố nguy cơ gây kháng kháng sinh 1.2.4.1. Lạm dụng sử dụng kháng sinh trong cộng đồng Ở hầu hết các quốc gia đang phát triển kháng sinh có thể mua mà không cần đơn thuốc, các loại kháng sinh sẵn có ở khắp nơi từ các bệnh viện, hiệu thuốc, cửa hiệu, thậm chí người bán hàng rong. Nghiên cứu ở khu vực nông thôn của Bangladesh cho thấy chỉ có 8% số lượng kháng sinh được bán hàng tháng tại các hiệu thuốc là mua theo đơn thuốc của bác sỹ [60]. Thiếu kiến thức về sử dụng kháng sinh của người dân như quên không uống thuốc, dừng kháng sinh khi thể trạng cảm thấy tốt hơn hoặc khi không có khả năng chi trả cho một đợt điều trị đầy đủ trước khi vi khuẩn bị tiêu diệt hoàn toàn [4]. Nhiều người dân tin rằng kháng sinh có thể chữa được các bệnh như
13 nhức đầu, bệnh cúm hay để phòng chống các bệnh lây truyền qua đường tình dục và kháng sinh tiêm có tác dụng mạnh hơn thuốc viên [3;4]. Ngoài ra, các nhân viên bán thuốc do không được đào tạo đầy đủ và cập nhật kiến thức thường xuyên về kháng sinh lại thường tư vấn cho khách hàng khi mua thuốc kháng sinh, thậm chí còn khuyến khích mua kháng sinh khi họ không bị ốm [39;51;53]. 1.2.4.2. Sử dụng kháng sinh trong bệnh viện Hiện nay phương thức sử dụng kháng sinh được chia làm 3 phác đồ điều trị: (1) để phòng chống nhiễm khuẩn: kháng sinh thường được sử dụng trước, trong hoặc sau khi phẫu thuật; (2) theo kinh nghiệm: sử dụng kháng sinh trước khi biết căn nguyên nhiễm khuẩn; và (3) phương thức chọn lọc: sử dụng kháng sinh khi biết căn nguyên gây nhiễm khuẩn. Các nghiên cứu cho thấy nếu các bệnh viện thực hiện tốt công tác giám sát tình trạng sử dụng kháng sinh của phác đồ 1 và 2 sẽ làm giảm áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng lại kháng sinh trong các bệnh viện. Ngoài ra, bệnh nhân điều trị dài ngày trong bệnh viện có sức đề kháng yếu, thường sử dụng kháng sinh kéo dài và dễ bị nhiễm khuẩn chéo với các chủng vi khuẩn kháng đa kháng sinh trong các bệnh viện. Nhiễm khuẩn bệnh viện là yếu tố quan trọng liên quan đến tính kháng kháng sinh của vi khuẩn trên thế giới. Việc phòng chống nhiễm khuẩn bệnh viện gặp rất nhiều khó khăn và tốn kém đặc biệt là các quốc gia đang phát triển. Ví dụ tại Việt Nam, phần lớn các bệnh viện có cơ sở hạ tầng cũ và tình trạng quá tải. Công suất sử dụng giường vượt quá 100%. Hơn nữa người nhà bệnh nhân ở lại viện để chăm sóc người bệnh dẫn đến tình trạng quá tải càng nghiêm trọng [49]. Ngay cả việc không tuân thủ các quy định thực hiện chống nhiễm khuẩn trong bệnh viện, đơn giản như rửa tay và thay găng trước và sau khi thăm khám cho bệnh nhân của các nhân viên y tế, đây là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm khuẩn tại hầu hết các bệnh viện trên thế giới và tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan của
14 các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh không chỉ trong bệnh viện mà còn có nguy cơ lây lan ra ngoài cộng đồng [112]. Việc quản lý chất thải bệnh viện cũng là vấn đề đáng lưu ý, một số nghiên cứu được tiến hành ở các bệnh viện tại Việt nam cho thấy: nước thải của bệnh viện không qua xử lý được thải trực tiếp ra cống sinh hoạt, đồng ruộng và sông ngòi. Thiếu nước cho công tác vệ sinh và rác thải sinh hoạt được thải ra ở gần nguồn nước, điều này sẽ làm tăng nguy cơ lây lan các tác nhân gây bệnh trong đó có các vi khuẩn kháng kháng sinh ra ngoài cộng đồng [49]. 1.2.4.3. Sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi tác động vào tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Tại Bắc Mỹ và Châu Âu, khoảng 50% lượng kháng sinh sản xuất ra được sử dụng trong thức ăn cho gia súc và gia cầm. Phần lớn lượng kháng sinh này được sử dụng như là hoạt chất phụ trợ trong thức ăn để phòng bệnh và tăng trọng bất chấp tình trạng sức khỏe của gia súc và gia cầm sẽ làm tăng tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn như salmonella, E. coli và thông qua thực phẩm sẽ gây bệnh trên người. Tại Đan Mạch, năm 1994 trong khi chỉ có 24kg vancomycin được sử dụng trên người thì có tới 24.000kg apoparcin (biệt dược của vancomycin) được sử dụng cho chăn nuôi. Vancomycin được cho là nguyên nhân tạo ra các chủng enterococcus faecium kháng vancomycin và các chủng vi khuẩn này được phát hiện trên người do ăn phải các sản phẩm thịt bị ô nhiễm. Khi apoparcin bị cấm sử dụng tại Đan Mạch năm 1995, Đức năm 1996 và toàn liên minh châu Âu năm 1997 thì tỷ lệ enterococcus faecium kháng vancomycin phân lập trên người giảm rõ rệt, điều này cho thấy có thể khống chế được sự gia tăng của vi khuẩn kháng thuốc thông qua việc sử dụng kháng sinh [12;116;135;136].
15 1.2.4.4. Do bác sỹ Khi sử dụng kháng sinh sẽ tạo ra áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng thuốc. Sử dụng kháng sinh không hợp lý và thường xuyên sẽ làm tăng nguy cơ kháng kháng sinh của vi khuẩn. Đối với thầy thuốc việc sử dụng kháng sinh theo kinh nghiệm, liều cao, kéo dài và phần lớn không dựa vào các kết quả xét nghiệm xảy ra phổ biến ở các quốc gia đang phát triển. Thầy thuốc phải chịu áp lực khi kê đơn thuốc theo yêu cầu của bệnh nhân ngay cả khi không có chỉ định điều trị bằng kháng sinh. Ở một số quốc gia, nhiều người tin rằng sử dụng kháng sinh theo đường tiêm có tác dụng tốt hơn so với đường uống, điều này đã dẫn đến tình trạng gia tăng việc sử dụng các loại kháng sinh phổ rộng bằng đường tiêm trong khi chỉ cần điều trị bằng đường uống với các kháng sinh thông thường [15;52;92;96]. 1.2.4.5. Chất lượng kháng sinh kém Khi bảo quản nhiệt độ >250C sẽ giảm hoạt tính kháng sinh, kháng sinh quá hạn sử dụng, hàm lượng thấp không những không thể tiêu diệt được hoàn toàn vi khuẩn gây bệnh mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng lại kháng sinh [45;95;122]. Ngoài ra một số kháng sinh được bán tại các nước đang phát triển không chứa đủ hàm lượng như đã ghi trên nhãn thuốc, thành phần chủ yếu trong các loại thuốc giả này thường là bột mỳ. Nhiều nghiên cứu cho thấy có khoảng 65% trong tổng số 751 hoạt chất đã được làm giả tại hơn 28 quốc gia trên thế giới được ghi nhận [4;73;81]. 1.2.4.6. Gia tăng sự đi lại quốc tế Làm lây lan các chủng vi khuẩn kháng thuốc từ 1 quốc gia sang các quốc gia khác trên thế giới qua đường hàng không. Ví dụ: vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại Anh có nguồn gốc từ Ấn Độ [70]. 1.2.4.7. Hệ thống giám sát kháng sinh Tại các quốc gia phát triển đã xây dựng được hệ thống giám sát kháng sinh như Mỹ và liên minh châu Âu chuẩn thức, qua hệ thống này các thông tin về mức
16 độ, xu hướng và phát hiện được các trường hợp kháng thuốc mới của vi khuẩn sẽ được sử dụng để phân tích và đánh giá qua đó sẽ giúp cho các thầy thuốc và các nhà quản lý đưa ra các chính sách phù hợp để ngăn chặn sự gia tăng của vi khuẩn kháng kháng sinh. Tuy nhiên, hiện nay hầu hết tại các quốc gia đang phát triển, các số liệu về tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn chủ yếu dựa vào các báo cáo từ các bệnh viện, và các kết quả từ các hoạt động nghiên cứu. Các số liệu này không thể phản ánh được đầy đủ thực trạng kháng kháng sinh của một quốc gia và không thể sử dụng để so sánh với nhau do chưa có sự thống nhất từ việc lựa chọn cỡ mẫu, phương pháp xét nghiệm phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh. Ngoài ra ở các bệnh viện thường bị thiếu hụt các trang thiết bị, nhân lực hóa chất và thường không được yêu cầu đánh giá chất lượng bằng các hình thức như nội kiểm và ngoại kiểm, do đó các dữ liệu về kháng kháng sinh cũng không thể xem là chính xác và các số liệu này rất khó sử dụng để so sánh giữa các bệnh viện, cộng đồng cũng như giữa các vùng địa lý khác nhau [21;135]. 1.3. Kháng sinh nhóm carbapenem Thienamycin là kháng sinh đầu tiên thuộc nhóm carbapenem được phát hiện và tách chiết từ vi khuẩn Streptomyces cattleya (S. cattleya) sống trong đất. Hoạt chất này có khả năng ức chế quá trình tổng hợp peptidoglycan của tế bào vi khuẩn. Năm 1979 Kahan và cộng sự đã tách chiết thành công thienamycin có độ tinh khiết cao >90% [65;66]. Năm 2003, gen mã hóa quá trình tổng hợp thienamycin của vi khuẩn S. cattleya được phát hiện và giải trình tự, tổng hợp và phát triển thành các kháng sinh thuộc nhóm carbapenem [94]. Kháng sinh thuộc nhóm carbapenem có cấu trúc tương tự như penicillin nhưng nguyên tố lưu huỳnh được thay thế bằng nguyên tố các bon ở vị trí 1 (Hình 1.3). Cấu trúc này có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn kháng kháng sinh phổ rộng sinh enzym beta-lactamase (ESBL) bằng cách ức chế quá trình tổng hợp vỏ ngoài của tế bào vi khuẩn.
17 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của carbapenem Phân loại enzym ly giải kháng sinh nhóm carbapenem Có hai kiểu đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh nhóm carbapenem: (1): tạo ra serine tác động vào amino acide serine tại vị trí 70 hoạt động trong cấu trúc phân tử của kháng sinh nhóm carbapenem (enzym nhóm A và D). (2): và nhóm B, sinh các enzym metallo-beta-lactamase (MBLs), các enzym này hoạt hóa khi có sự tham gia của các ion kim loại có hóa trị 2, thông thường là kẽm [88]. Các enzym kháng carbapenem được chia ra làm 3 nhóm chính (bảng 1.3).
18 Bảng 1.3. Một số đặc tính của các enzym ly giải carbapenem của các chủng vi khuẩn Gram âm [88] Nhóm Enzym Plasmid/ Khả năng ly giải kháng sinh Enzym bị ức enzym Chromosome chế Penicillin Cephalosporin Cephalosporin Cephalosporin Aztreonam Carbapenem thế hệ I thế hệ II thế hệ III SME-1,-2, -3 Chromosome ++ ++ - + + + Clavulanate, Tazobactam, NMC-A Chromosome ++ ++ - + - ++ sulbactam IM-2 Plasmid ++ ++ - + - ++ A GES-4,-5,-6 Plasmid ++ ++ + + - + KPC-2 đến 12 Plasmid ++ ++ - ++ + ++ Clavulanate, Tazobactam, sulbactam, boronic acid IMP-1 đến -33 Plasmid ++ ++ ++ ++ - ++ VIM-1 đến -33 Plasmid ++ ++ ++ ++ - ++ B EDTA NDM-1 đến 6 Plasmid ++ ++ ++ ++ - + KHM-1 Plasmid ++ ++ ++ ++ - ++ OXA-48 Plasmid ++ ++ +/- +/- - + D NaCl OXA-181 Plasmid ++ ++ +/- +/- - +
19 1.4. Tình hình vi khuẩn kháng carbapenem trên thế giới 1.4.1. Kháng carbapenem do enzym carbapenemase nhóm A Enzym nhóm A bao gồm NmcA/IMI, SME, GES và KPC [110;132]. Các enzym này có khả năng ly giải nhiều loại kháng sinh nhóm beta-lactam bao gồm: penicillin, cephalosporin, carbapenem và aztreonam và có thể bị ức chế bởi clavulanic acid và tazobactam (bảng 1.3) [6;]. Enzym IMI và NmcA được mã hóa bởi các gen nằm trên nhiễm sắc thể của một số chủng Enterobacter spp. phân lập tại Anh, Pháp và Agrentina [84;110;111]. IMI- 2 được mã hóa bởi gen IMI-2 nằm trên các plasmid của các chủng Enterobacter asburiae phân lập được từ nước sông tại Mỹ. Enzym SME được mã hóa bởi các gen nằm trên nhiễm sắc thể của các chủng Serratia marcescens phân lập tại Mỹ và được chia thành 3 loại (SME-1, SME-2 và SME-3) [46;84;109]. Enzym nhóm GES được phát hiện lần đầu năm 2000 được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid và có khả năng ly giải các kháng sinh phổ rộng cephalosporin, tuy nhiên một vài enzym thuộc nhóm này (GES-4,-5 và -6) được xác định có khả năng ly giải các kháng sinh nhóm carbapenem [69]. KPC là enzym có tác động quan trọng nhất trên lâm sàng trong các enzym thuộc nhóm A do KPC gây ra tình trạng kháng đa kháng sinh. KPC lần đầu tiên được phát hiện trên chủng K. pneumoniae phân lập ở miền Nam nước Mỹ năm 1996 [141]. Sau đó các trường hợp nhiễm khuẩn bởi các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem được phân lập rải rác tại Mỹ trong thập kỷ 1990 [17;76]. Cho đến những năm 2000, tỷ lệ phân lập các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem trên bệnh phẩm lâm sàng tại Mỹ gia tăng một cách nhanh chóng, nghiên cứu tại Brooklyn-New York cho thấy khoảng 1/3 số chủng K. pneumoniae phân lập năm 2004 mang gen KPC mã hóa enzym KPC ly giải carbapenem [18;19;37]. Năm 2009 tại hầu hết các
20 quốc gia châu Âu có tỷ lệ kháng carbapenem của các chủng K. pneumoniae phân lập từ máu và dịch não tủy <1%; tuy nhiên ở Hy lạp, Đảo Cyprus và Ý tỷ lệ kháng cao hơn lần lượt là 43,5%, 17% và 1,3% [41;114;125]. Hiện nay các trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn mang gen KPC được ghi nhận ở nhiều quốc gia trên thế giới như: ở châu Âu, Nam Mỹ, Israel và Trung Quốc [86;90;91]. 1.4.2. Kháng carbapenem do enzym nhóm B (metallo-beta-lactamases) Nhóm B, metallo-beta-lactamase có khả năng ly giải hầu hết các kháng sinh phổ rộng bao gồm: penicillin, cephalosporin và carbapenem, tuy nhiên các vi khuẩn sinh enzym này còn nhạy cảm với aztreonam. EDTA có thể ức chế các enzym thuộc nhóm B thông qua ức chế Zn2+ (tham gia vào quá trình hoạt hóa enzym) [88]. Enzym metallo-beta-lactamase được phát hiện lần đầu tiên trên B. cereus và Stenotrophomonas maltophilia, các gen mã hóa MBLs phần lớn nằm trên nhiễm sắc thể của các vi khuẩn [93]. Sau đó nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự lây lan nhanh chóng của các gen mã hóa MBLs nằm trên plasmid sang nhiều loại vi khuẩn đường ruột phân lập từ các bệnh phẩm lâm sàng ở nhiều quốc gia trên thế giới [22;74;93]. Các enzym thường gặp nhất được phát hiện trên các chủng vi khuẩn đường ruột bao gồm các enzym IMP, VIM và NDM-1 [22;23;74;93;140]. IMP được phát hiện lần đầu tiên trên các chủng Pseudomonas và Acinetobacter và vi khuẩn đường ruột [62;133;144)]. Hiện nay có khoảng 33 loại enzym thuộc nhóm IMP được xác định có khả năng ly giải carbapenem được phát hiện tại nhiều quốc gia như Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc và Hy Lạp [89;144]. Enzym VIM được xác định có khoảng 33 loại chủ yếu phát hiện trên các chủng P. aeruginosa và một số ít các vi khuẩn đường ruột, tuy nhiên chỉ có VIM-2 là enzym được phát hiện nhiều nhất trên thế giới, ví dụ, VIM-2 gây ra các vụ dịch ở một số quốc gia Nam Âu, Nam Triều Tiên và Đài Loan [106;143].
21 Enzym mới NDM-1 kháng carbapenem được mã hóa bởi gen NDM-1 nằm trên các plasmid được phát hiện lần đầu tiên năm 2008 tại Thụy Điển trên chủng K. pneumoniae phân lập được từ bệnh nhân người Ấn quốc tịch Thụy Điển có tiền sử chữa bệnh tại New Delhi, Ấn Độ sẽ được trình bày ở phần cuối của chương tổng quan tài liệu [140]. 1.4.3. Enzym nhóm D (OXA- type) Enzym OXA-48 được phát hiện lần đầu trên chủng K. pneumoniae phân lập tại Thổ Nhĩ Kỳ năm 2003 [105], sau đó nhiều trường hợp nhiễm khuẩn do vi khuẩn mang gen OXA-48 được phát hiện tại nhiều quốc gia ở châu Âu như Pháp, Đức, Hà Lan [89]. Ngoài ra OXA-181 là một dạng đột biến của OXA-48 có khả năng ly giải carbapenem đã được phát hiện ở Ấn Độ [89]. Gen mã hóa OXA-48/OXA-181 thường nằm trên các plasmid có kích thước khoảng 62,5-70 kb, và có khả năng ly giải carbapenem ở mức độ yếu, và không bị ly giải bởi EDTA và clavulanic acid. Cho đến nay OXA-48 chỉ phát hiện được trên các chủng K. pneumoniae và E. coli, và mức độ kháng carbapenem cao hơn khi có mặt của các gen kháng kháng sinh phổ rộng khác [89]. Ngoài OXA-48 và OXA-181, một số OXA quan trọng khác có khả năng ly giải carbapenem như OXA-23 được phát hiện trên các chủng A. baumannii tại nhiều quốc gia trên thế giới [38]. OXA-51 nằm trên nhiễm sắc thể của A. baumannii phân bố trên toàn cầu và OXA-51 [61]. Hay OXA-58 kháng carbapenem cũng được phát hiện trên các chủng Acinetobacter ở nhiều nơi trên thế giới [79;98]. Nhìn chung vi khuẩn gram âm kháng carbapenem trong các bệnh viện rất đa dạng, do rất nhiều các cơ chế kháng khác nhau. Hầu hết các quốc gia trên thế giới đều ghi nhận sự có mặt của các chủng vi khuẩn gram âm kháng carbapenem. Tuy nhiên không thống kê được tỷ lệ mắc bệnh do các vi khuẩn kháng carbapenem do
22 phần lớn các quốc gia đều không có các báo cáo đầy đủ về mức độ nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn. Điều này cho thấy sự lây lan và gia tăng một cách nhanh chóng các vi khuẩn kháng carbapenem trong giai đoạn hiện nay thực sự là mối đe dọa đến công tác điều trị và cần phải nghiên cứu để đưa ra các giải pháp và các phác đồ điều trị nhằm hạn chế sự gia tăng, lây lan và các loại vi khuẩn này một cách hiệu quả. 1.5.Tình hình kháng carbapenem tại Việt Nam Imipenem là kháng sinh thuộc nhóm carbapenem được đưa vào Việt Nam những năm 2000, đã giảm nhạy cảm với các vi khuẩn gram âm, là căn nguyên chính gây nhiễm khuẩn bệnh viện ở Việt Nam. Hai căn nguyên gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp là P. aeruginosa và A. baumannii được đánh giá ở 6 bệnh viện năm 2008: 20% các chủng P. aeruginosa và 50% các chủng A. baumannii kháng kháng sinh nhóm carbapenem (bảng 1.4) [49]. Bảng 1.4. Mức độ kháng carbapenem của P. aeruginosa và A. baumannii tại 6 bệnh viện năm 2008. P. aeruginosa A. baumannii (%) (%) Meropenem 18 46,2 Imipenem 25 47,1 Nghiên cứu của Nguyễn Phú Hương Lan và cộng sự trên các chủng Acinetobacter phân lập từ 181 bệnh phẩm dịch hút khí quản và 396 mẫu cấy máu dương tính tại Bệnh viện Nhiệt Đới Tp Hồ Chí Minh năm 2010 cho thấy Acinetobacter đa kháng và kháng carbapenem rất cao trong dịch hút khí quản (75%) và trong cấy máu là 31% [2]. Hiện tại vẫn chưa có nhiều nghiên cứu sâu về cơ chế kháng carbapenem tại Việt Nam. Gần đây nghiên cứu của Tatsuya và cộng sự cho thấy các chủng A. baumannii và P. aeruginosa đã kháng carbapenem ở mức độ cao
23 và gen OXA-23 đóng vai trò quan trọng qui định tính kháng carbapenem của các chủng A. baumannii [121]. Tỷ lệ kháng carbapenem của các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện không thể đánh giá một cách chính xác, do Việt Nam chưa có hệ thống giám sát tính kháng kháng sinh của vi khuẩn. Trong tương lai cần phải xây dựng hệ thống giám sát tình trạng kháng kháng sinh và nghiên cứu tác động của các vi khuẩn kháng carbapenem tại Việt Nam nhằm đưa ra các giải pháp hạn chế sự gia tăng, lây lan và đưa ra các phác đồ điều trị cho các loại vi khuẩn này. 1.6. Tác động của vi khuẩn kháng kháng sinh Hiện nay bệnh truyền nhiễm chiếm một tỷ lệ lớn ở các quốc gia đang phát triển và kháng sinh đóng một vai trò quan trọng trong điều trị, giảm tỷ lệ mắc và tử vong. Tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày một gia tăng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe và kinh tế của người dân ở những quốc gia này. Khi bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn kháng thuốc sẽ rất khó khăn cho công tác điều trị, kéo dài thời gian mắc bệnh, nguy cơ tử vong cao [112]. Thông thường, khi vi khuẩn kháng kháng sinh phải thay thế kháng sinh thế hệ mới có giá thành cao hơn. Tại các quốc gia phát triển như liên minh châu Âu, tỷ lệ tử vong hàng năm do bị nhiễm các chủng vi khuẩn kháng thuốc là 25.000 ca và tại Mỹ là hơn 63.000 ca, hậu quả đã gây thiệt hại cho nền kinh tế bao gồm chi phí điều trị và tạo ra ít sản phẩm lao động. Mỗi năm tại châu Âu là 1,5 tỉ EUR và Mỹ là 1,87 tỉ đô la, hơn rất nhiều chi phí hàng năm cho công tác phòng chống bệnh cúm [43]. 1.7. Các kỹ thuật phát hiện vi khuẩn kháng carbapenem 1.7.1. Kỹ thuật thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh 1.7.1.1. Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch Nguyên lý: kháng sinh trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Mueller- hinton đã cấy các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn
24 với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh [32]. Tuy nhiên kỹ thuật là chỉ phát hiện được mức độ nhạy cảm nồng độ kháng sinh đã biết trước, nhưng đây là kỹ thuật đơn giản và giá thành rẻ nên hiện vẫn được sử dụng phổ biến tại các quốc gia đang phát triển để điều trị và giám sát dịch tễ học. 1.7.1.2. Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC) Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa thạch Mueller-hinton hoặc canh thang có chứa nồng độ kháng sinh khác nhau. Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định khi mật độ khuẩn lạc 3. Đây là kỹ thuật chuẩn thức được áp dụng nhằm xác định nồng độ kháng sinh nhỏ nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn, kết quả giúp các bác sỹ lựa chọn và tính toán liều kháng sinh cho bệnh nhân [32]. Tuy nhiên kỹ thuật này có giá thành cao, phức tạp, đầy đủ trang thiết bị và cán bộ có kinh nghiệm để thực hiện. 1.7.1.3. Kỹ thuật E-test Hiện nay E-test được sử dụng rộng rãi tại các quốc gia phát triển. Thanh giấy kháng sinh E-test chứa các phổ kháng sinh có các nồng độ kháng sinh khác nhau được đặt lên đĩa thạch đã được trải huyền dịch vi khuẩn, khả năng ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp nhất sẽ được phát hiện ở phổ kháng sinh (điểm gãy) dựa vào đó các bác sỹ có thể tính toán liều điều trị phù hợp cho bệnh nhân [32]. 1.7.2. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn sinh carbapenemase Phát hiện chính xác vi khuẩn kháng carbapenem trong các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng là một bước quan trọng để phòng và điều trị bệnh. Các nghiên cứu cho thấy một số chủng sinh enzym ly giải carbapenem có nồng độ ức chế tối thiểu nằm trong ranh giới nhạy cảm, do vậy trong các báo cáo trước đây không xác định được tỷ lệ các vi khuẩn sinh enzym kháng carbapenem. Để hạn chế
25 nhược điểm này Viện tiêu chuẩn các phòng xét nghiệm lâm sàng của Mỹ (CLSI) năm 2010 đã khuyến cáo các điểm gãy thấp hơn cho ertapenem, imipenem, meropenem và doripenem (bảng 1.5) [32]. Áp dụng các ranh giới mới này cho phép chúng ta nâng cao hiệu quả điều trị bằng carbapenem mà không cần phát hiện khả năng sinh enzym kháng carbapenem của vi khuẩn. Bảng 1.5. So sánh ranh giới phát hiện các điểm gãy của kháng sinh nhóm carbapenem với các chủng vi khuẩn đường ruột Kháng sinh Điểm gãy theo (M100-S19) Điểm gãy theo (M100-S20) MIC (g/mL) MIC (g/mL) Nhạy Trung Kháng Nhạy Trung Kháng gian gian Doripenem ND ND ND 1 2 4 Ertapenem 2 4 8 0.25 0.5 1 Imipenem 4 8 16 1 2 4 Meropenem 4 8 16 1 2 4 Ghi chú: ND không xác định Hiện nay một số kỹ thuật có thể phát hiện khả năng sinh enzym metallo-beta- lactamase của các chủng vi khuẩn gram âm bao gồm khoanh giấy, MBL E-test và các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và các đoạn dò ADN, cloning và giải trình tự gen mỗi kỹ thuật đều có các ưu nhược điểm, do vậy tùy thuộc vào điều kiện của từng phòng xét nghiệm có thể lựa chọn các kỹ thuật phù hợp (bảng 1.6). [129].
26 Bảng 1.6. Các kỹ thuật phát hiện metallo-beta-lactamase (MBL) [129] Kỹ thuật Tên kỹ thuật Các chất ức chế phối Ưu điểm Nhược điểm hợp Khoanh giấy Ceftazidime và 2- Dễ sử dụng Khoảng cách đặt khoanh giấy không chuẩn và khó mercaptoproprionic acid đọc kết quả Khoanh giấy Imipenem và EDTA Dễ sử dụng và nhận định kết Khoanh giấy chưa được chuẩn hóa. Một số chủng quả vi khuẩn sinh MBL vẫn nhạy cảm với imipenem Vi pha loãng Imipenem và EDTA Dựa trên sự giảm nồng độ Sử dụng cho các nghiên cứu sâu. Tốn nhiều công Vi sinh lâm và10-phenathroline ức chế tối thiểu, dễ nhận sức. Một số chủng vi khuẩn sinh MBL vẫn nhạy sàng định kết quả cảm với imipenem E-test Imipenem và EDTA Có độ nhạy cao, dễ sử dụng Enzym MBL có thể sinh trên các chủng nhạy cảm với imipenem, đôi khi khó xác định được điểm gãy Ly giải Meropenem và EDTA Độ nhạy cao và có thể coi là Sử dụng cho nghiên cứu chuyên sâu, tốn nhiều carbapenem tiêu chuẩn vàng công sức và đôi khi khó nhận định kết quả PCR phát hiện Dễ thực hiện để phát hiện Phải thiết kế các đoạn mồi đặc hiệu, không thể phân gen carbapenem các nhóm gen kháng biệt được các gen trong cùng nhóm, và không phát carbapenem hiện được các gen kháng carbapenem mới Sinh học Sử dụng các Chuyên sâu Các đoạn dò chỉ phát hiện được từng nhóm gen phân tử đoạn dò ADN kháng carbapenem chung. Không phát hiện được sự khác nhau giữa các gen trong cùng nhóm Cloning và giải Tiêu chuẩn vàng Tốn nhiều nhân công, trang thiết bị và giá thành đắt trình tự gen
27 1.8. Các kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh Sự gia tăng nhanh chóng các vi khuẩn kháng kháng sinh hiện là một trong những vấn đề nghiêm trọng hàng đầu tác động đến sức khỏe con người. Phát hiện nguồn truyền nhiễm, phương thức lây truyền cũng như sự biến đổi kiểu gen và mối liên quan của các vi khuẩn kháng kháng sinh ở mức độ phân tử là rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn. Các phương pháp truyền thống như xác định týp huyết thanh, týp sinh học, và đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn giúp ích rất nhiều cho công tác điều trị và điều tra mô tả các đặc điểm dịch tễ học của các vi khuẩn kháng kháng sinh. Tuy nhiên các phương pháp xác định kiểu hình này (mô tả hiện tượng) tốn nhiều công sức, thời gian và thường cho những kết quả khác nhau khi phân tích mối liên hệ của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh theo thời gian, địa điểm hay tại các vụ dịch khác nhau. Để khắc phục những hạn chế này, các nhà khoa học đã dựa vào hệ gen của vi khuẩn để nghiên cứu và phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử cho phép đánh giá sự thay đổi kiểu gen của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, đặc tính, cơ chế kháng, nguồn truyền nhiễm, giám sát dịch tễ học các vụ dịch do vi khuẩn kháng kháng sinh và đặc biệt về các mối liên quan giữa các chủng vi khuẩn ở các thời gian và địa điểm khác nhau trong phạm vi quốc gia và toàn cầu. 1.8.1. Phân tích các plasmid Plasmid là yếu tố ADN nằm ngoài nhiễm sắc thể của hầu hết các chủng vi khuẩn gây bệnh và có thể xác định qua qui trình ly giải tế bào và điện di trên thạch. Phân tích các plasmid được sử dụng để mô tả đặc điểm dịch tễ học của nhiều loại vi khuẩn. Trong các vụ dịch, phân tích plasmid cho phép nhanh chóng xác định sự lây lan của các chủng vi khuẩn gây dịch, đặc biệt là các chủng mang các plasmid kháng kháng sinh [35] Đây là cơ chế kháng kháng sinh quan trọng nhất, do phần lớn tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đều được qui định bởi các gen nằm trên các plasmid và có thể lây truyền trong phạm vi loài và truyền sang
28 các loài vi khuẩn khác thông qua hình thức tiếp hợp (bảng 1.7) [25;26;70;101]. Bảng 1.7. Plasmid mang gen kháng kháng sinh [25;26;70;101] Vi khuẩn Loại plasmid Gen kháng kháng Khả năng truyền plasmid sinh trên plasmid kháng kháng sinh* E. coli FII; A/C; B/O CTX-M, SHV, TEM Có và NDM-1 K. pneumoniae A/C; FI/FII và NDM-1, Oxa-48 Có InCL/M S. typhimurium A/C2 CMY-2-type A Có Citrobacter A/C, L/M ArmA, DHA, SHV Có Enterocloaceae A/C2 VIM-4, CMY-4 Có * Khả năng truyền plasmid kháng kháng sinh được các tác giả thử nghiệm thành công trong phòng thí nghiệm. Các chủng “cho” là các chủng vi khuẩn mang plasmid kháng kháng sinh, và các chủng “nhận” là các chủng E. coli J53, DH5- 1.8.1.1. Tách chiết plasmid Đây là một trong các kỹ thuật đầu tiên sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử về plasmid, xác định được số lượng và kích thước các plasmid trong tế bào vi khuẩn. Trên thế giới, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi để xác định số lượng các plasmid của các vi khuẩn kháng kháng sinh [70]. Tuy nhiên kỹ thuật này có nhiều hạn chế: (1) không phân biệt được các plasmid khác loại nhưng có cùng kích cỡ, (2) các plasmid này có thể tìm thấy trong các vi khuẩn cùng và khác loài, (3) không phát hiện được plasmid mang gen kháng kháng sinh. 1.8.1.2. Phân loại plasmid Hầu hết việc phát hiện và phân loại plasmid cần phải dựa vào các đặc tính về kiểu gen và dựa trên các gen có tính ổn định, đặc biệt là các gen qui định sự nhân lên của các plasmid [36]. Năm 1971 Hedges và cộng sự lần đầu tiên đưa khái niệm phân loại plasmid dựa trên tính ổn định của plasmid trong khi tiếp
29 hợp [34;55]. Năm 1988, Couturier và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật Southern- blotting để phân loại plasmid, tuy nhiên phương pháp này có độ đặc hiệu không cao, tương đối phức tạp và không thể áp dụng để phân tích với số lượng mẫu lớn [33]. Năm 2005, Carattoli và cộng sự phát triển kỹ thuật PCR- based replicon typing, kỹ thuật này sẽ khuếch đại các đoạn gen đặc hiệu qui định sự nhân lên của các plasmid quan trọng của các vi khuẩn đường ruột [26]. Kỹ thuật này đang được nhiều tác giả sử dụng để phân loại các plasmid mang gen kháng kháng sinh, tuy nhiên kỹ thuật này vẫn còn hạn chế do chỉ phân loại được các plasmid thuộc nhóm Inc cổ điển (bảng 1.7) [70;78]. 1.8.1.3. Kỹ thuật Southern blotting phát hiện plasmid mang gen kháng kháng sinh Kỹ thuật Southern-blotting được áp dụng rộng rãi để phát hiện các plasmid mang gen kháng kháng sinh [70]. Nguyên lý của kỹ thuật: dùng enzym S1 cắt các ADN mạch đơn của vi khuẩn và giữ lại plasmid sau đó được điện di trên thạch. Các plasmid sau khi điện di sẽ được chuyển sang màng lai và được lai với các đoạn dò đặc hiệu (sản phẩm PCR của các gen kháng kháng sinh đã được đánh dấu). Các plasmid mang gen kháng kháng sinh cần tìm sẽ được phát hiện trên phim [70;140]. 1.8.1.4. Nghiên cứu khả năng truyền plasmid kháng kháng sinh Định nghĩa Tiếp hợp (conjugation): là sự truyền các vật liệu di truyền thường là các plasmid thông qua hình thức tiếp xúc giữa các tế bào vi khuẩn trong cùng hoặc giữa các loài. Đây là hiện tượng xảy ra một cách tự nhiên trong quần thể vi khuẩn [56;57]. Thông qua hình thức tiếp hợp các plasmid sẽ được chuyển từ tế bào cho “donor” sang tế bào nhận “recipient” qua ống pili thông qua hình thức bơm đẩy. Hiện nay kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi nhằm tìm hiểu khả năng truyền plasmid mang gen kháng kháng sinh trong quần thể vi khuẩn [16;18;54]. [70;130]. Ở Việt Nam kỹ
30 thuật này cũng được sử dụng để phân tích đặc tính của các vi khuẩn mang plasmid kháng kháng sinh [87]. 1.8.2. Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý tổng hợp ADN trong tế bào được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Quá trình tổng hợp ADN được bắt đầu theo chu trình: hai sợi ADN làm khuôn mẫu bị tách ra dưới tác dụng của nhiệt độ. Hai đoạn mồi oligonucleotide từ 20-40 nucleotide sẽ gắn vào các vị trí bổ sung trên đoạn ADN mẫu. Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ được kéo dài về hai phía, tạo ra đoạn ADN mới bổ sung với đoạn khuôn mẫu. Với một cặp mồi đặc hiệu một đoạn ADN nào đó sẽ được tổng hợp sau mỗi chu kỳ nhiệt của PCR. Hàng triệu bản sao sẽ được tổng hợp trong thời gian ngắn và chúng ta có thể phát hiện được các đoạn gen đặc hiệu cần khuếch đại trên thạch điện di. Kỹ thuật PCR hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như Y học, sinh học và nông nghiệp với nhiều mục đích khác nhau như phát hiện các căn nguyên gây bệnh do vi khuẩn hay phát hiện các gen kháng kháng sinh [70;83;85;139]. 1.8.3. Kỹ thuật RAPD-PCR RAPD-PCR (Random amplified polymorphic ADN fingerprinting): Đây là phương pháp đơn giản xác định nhanh chóng kiểu hình của các loại vi khuẩn. Nguyên lý: sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên đơn có kích thước ngắn khoảng 10 nucleotide, qua chu trình nhiệt của phản ứng PCR các đoạn mồi này có thể gắn vào nhiều vị trí khác nhau của ADN để khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn gen của vi khuẩn có kích thước từ 100-1000bp. Dựa vào sự khác nhau của các đoạn ADN của các chủng có thể so sánh mối liên quan của các chủng vi khuẩn trong các nghiên cứu dịch tễ học [13]. RAPD- PCR là kỹ thuật đơn giản, có khả năng phân loại nhanh và tốt hơn so với
31 phương pháp phân loại kinh điển, tuy nhiên kỹ thuật này chỉ định loại được vi khuẩn ở mức độ giới hạn khi so sánh với kỹ thuật PFGE [30;72]. 1.8.4. Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE) Kỹ thuật được sử dụng để phân loại và xác định nguồn gốc của các loại vi khuẩn. Kỹ thuật này sử dụng những enzym giới hạn phù hợp để cắt ADN nhiễm sắc thể thành những phân đoạn không đều (10 đến 30 vạch ADN), các phân đoạn ADN này sẽ được điện di để phân tách các phân đoạn từ 1kb đến 1000kb. Quá trình phân tích dựa trên sự so sánh các đoạn ADN của các chủng vi khuẩn để xác định mối liên quan và nguồn gốc của các chủng vi khuẩn ở các vùng và thời gian khác nhau [123]. Hiện nay PFGE được coi là một trong các tiêu chuẩn vàng trong phân loại cũng như xác định nguồn gốc vi khuẩn [63;75;107]. Ở Việt Nam, kỹ thuật PFGE được sử dụng để phân tích mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh như phân tích mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn S. typhi kháng đa kháng sinh [58;134]. 1.8.5. Kỹ thuật Southern blot phân tích hệ gen vi khuẩn 1.8.5.1. Kỹ thuật Ribotyping Là phương pháp định loại phổ biến sử dụng ADN nhiễm sắc thể và một đoạn dò của ARN. Do tất cả các chủng vi khuẩn có một hay nhiều ARN thông tin phân bố quanh nhiễm sắc thể, trình tự các operon này có tính bảo tồn cao. Do vậy vi khuẩn sẽ được định loại bằng việc sử dụng các đoạn dò hướng trực tiếp tới trình tự ADN mã hóa các ARN thông tin này [14;107]. Trong nghiên cứu dịch tễ học ribotyping là kỹ thuật rất hữu ích trong việc xác định các chủng vi khuẩn gram âm sinh ESBL là căn nguyên gây ra các vụ dịch trên toàn thế giới [9;14;75;99]. Tại Việt Nam, kỹ thuật ribotyping đã được ứng dụng để nghiên cứu mối liên quan dịch tễ học của các chủng S. typhi ở mức độ phân tử [134].
32 1.8.5.2. Kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP) Nguyên lý: ADN nhiễm sắc thể hay các plasmid của vi khuẩn sẽ được cắt bằng các enzym giới hạn thành những đoạn ADN. Các đoạn ADN sẽ được phân tách bằng điện di trên thạch, chuyển lên màng nitrocellulose, sau đó các đoạn cắt này sẽ được lai ghép với một đoạn ADN dò đặc hiệu đã được đánh dấu phóng xạ. Những đoạn ADN có trình tự axit nucleic bổ xung phù hợp sẽ gắn với đoạn dò và được phân biệt dựa vào sự khác nhau về số lượng và kích thước của các phân đoạn ADN [10;118]. Hiện nay kỹ thuật này được sử dụng để phân tích các đặc tính sinh học phân tử của các vi khuẩn kháng đa kháng sinh [120]. 1.8.6. Kỹ thuật Multi Locus Sequence Typing Kỹ thuật Multilocus sequence typing (MLST) được đánh giá kỹ thuật tốt nhất để phân loại kiểu gen của nhiều loại vi khuẩn như: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae và S. aureus [44;47;77]. Ví dụ: Bartual và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật này để phân loại các chủng A. baumannii dựa vào các trình tự gen có độ dài từ 305 đến 513bp tại các vùng bảo tồn (conserved regions) của 7 loại gen: gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi, và rpoD [11]. Kỹ thuật MLST được đánh giá để phân loại kiểu gen tốt hơn kỹ thuật PFGE và RFLP và là một trong rất ít các kỹ thuật được gọi là “thư viện” để xắp xếp, phân loại và được sử dụng trong các nghiên cứu dịch tễ học của các chủng A. baumannii, qua đó có thể xác định các chủng gây dịch, kháng kháng sinh, hay sinh độc tố nhằm giám sát sự lây truyền của chúng trong phạm vi quốc gia và trên thế giới [11]. 1.8.7. Kỹ thuật giải trình tự gen Đây là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để giải trình tự các gen kháng kháng sinh, đặc biệt là phân tích các plasmid mang gen kháng kháng sinh
33 của vi khuẩn. Đây là phương pháp chính xác nhất để xác định các đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn. Tính đến nay đã có hơn 800 plasmid của vi khuẩn đã được giải trình tự gen ( Các nhà khoa học đã chứng minh tính kháng quinolone có liên quan đến các điểm đột biến trên gen GyrA, GyrB, ParC trên ADN của vi khuẩn S.typhi [20;126]. Hiện nay, đã có nhiều bước đột phá trong kỹ thuật giải trình tự gen như kỹ thuật “next-generation sequencing” cho phép giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn một cách nhanh chóng trong một lần giải mã so với hệ thống giải mã trình tự cũ (chỉ giải mã được 35-700bp). Đây là kỹ thuật hữu hiệu để nghiên cứu dịch tễ học cũng như các đặc tính sinh học phân tử, độc tố hay các đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn [68]. Các kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam. Mỗi một kỹ thuật đều có những ưu điểm và hạn chế riêng do vậy cần phối hợp nhiều phương pháp khác nhau nhằm tìm hiểu cơ chế, khả năng lây lan và các biến đổi về kiểu gen của vi khuẩn là cơ sở đưa ra các biện pháp phòng chống vi khuẩn kháng kháng sinh một cách có hiệu quả. 1.9. Vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 1.9.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước NDM-1 là enzym mới thuộc nhóm B, được Yong D và cộng sự công bố lần đầu tiên năm 2008. NDM-1 được phát hiện trên chủng K.pneumoniae và E. coli phân lập từ bệnh nhân bị nhiễm khuẩn đường tiết niệu người Thụy Điển có tiền sử chữa bệnh tại Ấn Độ. Trong nghiên cứu này các tác giả nhận thấy các vi khuẩn này có khả năng ly giải tất cả các kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam trừ aztreonam và sinh enzym metallo-beta- lactamase (MBL) nhưng có kết quả âm tính với các gen mã hóa MBL như: IMP, VIM. SIP, SPM, KHM và SIM [140]. Phân tích về cấu trúc gen
34 plasmid 180kb của vi khuẩn này, nhóm tác giả đã phát hiện được gen mới mã hóa enzym có trọng lượng phân tử 28kDa có khả năng ly giải tất cả các kháng sinh trừ aztreonam và đặt tên là NDM-1 (hình 1.4). Hình 1.4. Đặc điểm các vùng mang gen kháng kháng sinh của plasmid tách chiết từ chủng K. pneumoniae. (A) Đoạn 4,3 kb mang gen NDM-1 được nối với 4,8kb của class I intergron mang các gen kháng kháng sinh arr-2 (kháng rifampicin), ereC (erythromycin), aadA1 (gentamicin), cmlA7 (chloramphenicol) và qacE (sulphomamide). (B) blaCMY-4 gen mã hóa tính kháng kháng sinh cephalothin, ampicillin và amoxicillin-clavulanic acid. Trình tự amino acid của NDM-1 có sự tương đồng rất thấp với các trình tự của các enzym MBL phát hiện trước đó và có 32,4% giống với VIM1 và VIM2 (hình 1.5). Đặc biệt Yong D và cộng sự đã chứng minh khả năng truyền plasmid mang gen NDM-1 của vi khuẩn này sang chủng E. coli J53 ở trong phòng thí nghiệm, đây là một phát hiện quan trọng về khả năng truyền gen NDM-1 cho các vi khuẩn cùng và khác loài [140].
35 Hình 1.5. So sánh mối liên hệ trình tự amino acid của NDM-1 với các enzym metallo-beta-lactamase IMP1, IMP2, IMP-8, VIM1, VIM2, GIM1, SPM1, SIM1 và KHM1. Sự công bố về NDM-1 kháng carbapenem của Yong D và cộng sự là nghiên cứu mang tính đột phá và làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về các vi khuẩn gram âm mang gen NDM-1. Các phương pháp nghiên cứu phát hiện vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 sau này đều dựa trên trình tự gen NDM-1 được giải mã của plasmid pKpANDM-1 của chủng K. pneumoniae KP-05-506 (số đăng ký: FN396876.1) của Yong D và cộng sự [140]. Tuy nhiên phải đến tháng 8/2010 tạp chí khoa học Lancet chuẩn bị công bố thứ 2 về NDM-1 thì vấn đề này mới thực sự thu hút sự quan tâm một cách mạnh mẽ của các nhà khoa học, các chính trị gia và công chúng trên toàn thế giới, trong đó có Việt Nam. Trong nghiên cứu này Kumarasamy và cộng sự đã tiến hành phân tích 180 chủng vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập tại Ấn Độ, Pakistan và Anh. Kết quả cho thấy: (1) tất cả các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 đều kháng tất cả các kháng sinh ở mức độ cao ngoại trừ colistin; (2) kháng sinh carbapenem là nhóm kháng sinh mạnh nhất hiện nay và hiện chưa có kháng sinh thế hệ mới thay thế, (3) hầu hết các chủng vi khuẩn này đều có khả năng truyền các plasmid mang gen NDM-1 trong
36 mô hình phòng thí nghiệm, (4) điều tra dịch tễ học của 37 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 tại Anh có nhiều bệnh nhân có tiền sử đi chữa bệnh tại Ấn Độ và Pakistan, cho thấy các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập tại Anh có thể lây từ Ấn Độ và Pakistan [70]. 1.9.1.1. Đặc điểm dịch tễ ca bệnh nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 Tại châu Âu từ năm 2008 đến 2010 có 13 quốc gia phát hiện được 77 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1, nhiều nhất được phát hiện tại Anh và số ca tăng dần theo các năm: 8 ca năm 2008; 30 ca năm 2009 và 39 ca phát hiện trong 9 tháng đầu năm 2010 [119]. Hiện nay nhiều quốc gia trên thế giới đã công bố sự có mặt của vi khuẩn mang gen NDM-1 như Australia, Canada, Singapore, Trung quốc và Mỹ [28;89;104]. Nordmann và cộng sự đã khái quát sự phân bố các quốc gia phát hiện vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại hình 1.6 [89]. Hình 1.6. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 trên thế giới [89]. Màu đỏ: Các ca bệnh có tiền sử đi đến các quốc gia Ấn Độ, Pakistan hoặc Bangladesh; Màu Xanh: tiền sử đi đến các quốc gia vùng Ban Căng hoặc Trung Đông; Màu đen: Không rõ nguồn gốc.
37 Hiện nay chưa có nhiều các nghiên cứu dịch tễ học truyền thống như bệnh-chứng hay thuần tập để đánh giá các yếu tố nguy cơ liên quan đến nhiễm vi khuẩn gram âm kháng carbapenem mang gen NDM-1. Tại châu Âu, khi điều tra dịch tễ học 77 trường hợp bệnh nhân dương tính với NDM-1 cho thấy: 51 ca tại Anh có độ tuổi mắc từ 2-87 tuổi và tỷ xuất về giới tính nam/nữ là 0,62. Có nhiều loại vi khuẩn mang gen NDM-1 bao gồm: K. pneumoniae (n=31), E. coli (n=36), Enterobacter spp. (n=4), C. freundii (n=3), M. morganii (n=2) và Proteus mirabilis (n=1). Anh và Đức đã công bố xuất hiện các chủng Acinetobacter spp. mang gen NDM-1 [119]. Đáng lưu ý trong 26 trường hợp dương tính với NDM-1 tại các quốc gia châu Âu khác (ngoài Anh), có 14 trường hợp xác định mang vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 nhưng không có triệu chứng lâm sàng, 6 nhiễm khuẩn đường tiết niệu, 3 nhiễm khuẩn phần mềm, 2 nhiễm khuẩn đường tiêu hóa và 1 trường hợp viêm phổi. Trong tổng số 77 ca dương tính tại châu Âu có 4 ca tiến triển thành nhiễm khuẩn huyết và 7 ca tử vong [119]. Các điều tra dịch tễ học phần lớn tập trung tìm hiểu mối liên quan của các ca bệnh với tiền sử điều trị tại bệnh viện ở nước ngoài như Ấn Độ và Pakistan [89]. Có 33/77 trường hợp dương tính với vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại châu Âu có liên quan đến yếu tố dịch tễ này, cho thấy tiền sử điều trị tại các bệnh viện ở Ấn Độ và Pakistan là yếu tố nguy cơ gây nhiễm các vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại châu Âu [70;119;140]. Tuy nhiên tại Ý có 2 ca bệnh dương tính với vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 không có tiền sử đi đến các quốc gia này, nhưng nằm điều trị tại khoa có bệnh nhân có tiền sử điều trị tại Ấn Độ. Vụ dịch nhỏ do vi khuẩn mang gen NDM-1 xảy ra tại một bệnh viện của Anh có liên quan đến sử dụng kỹ thuật nội soi cho 9 bệnh nhân (trước đó thủ thuật này đã sử dụng cho một bệnh nhân có tiền sử đi đến Ấn Độ) [119].
38 Tại Ấn Độ và Pakistan nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 có xu hướng xảy ra ở cộng đồng. Các nghiên cứu chỉ ra rằng gen NDM-1 không lây truyền từ một chủng vi khuẩn mang gen NDM-1 ban đầu mà lây truyền qua các plasmid trong cộng đồng vi khuẩn chí sống trong hệ tiêu hóa của người [70;140]. Hàng trăm tỷ vi khuẩn gram âm sống trong đường tiêu hóa của người là nguy cơ cao cho các vi khuẩn đường ruột mang gen NDM-1 truyền các gen NDM-1 cho các vi khuẩn khác loài sống trong đường tiêu hóa, phát tán và lây lan ra ngoài cộng đồng. Qua đường lây truyền phân-miệng, chủ yếu qua tay chân, thực phẩm hoặc nguồn nước bị ô nhiễm, đặc biệt đối với các quốc gia đang phát triển nơi cộng đồng dân cư sống trong điều kiện vệ sinh thấp kém và thiếu nguồn cung cấp nước sạch. Điều này đã được chứng minh trong nghiên cứu của Walsh TR và cộng sự về sự tồn tại của vi khuẩn mang gen NDM-1 trong môi trường của thủ đô New Delhi-Ấn Độ [131]. Nghiên cứu của Perry và cộng sự đã phát hiện được người lành mang các vi khuẩn đường ruột có gen NDM-1 trong phân của bệnh nhân nằm điều trị tại hai bệnh viện quân đội ở Pakistan [100)]. Đây là vấn đề đặc biệt nghiêm trọng đối với các quốc gia đang phát triển, nơi người dân sống trong các điều kiện vệ sinh thấp kém và thiếu nước sạch. Trên tạp chí Antimicrobial Chemotherapy năm 2012 Walsh TR là tác giả nghiên cứu đầu tiên mang tính đột phá về vi khuẩn mang gen NDM-1 đã ước tính tại Ấn Độ có ít nhất 100 triệu người lành mang vi khuẩn NDM-1 trong phân, đây là nguồn truyền nhiễm quan trọng vi khuẩn mang gen NDM-1 trong cộng đồng dân cư. Tác giả đã phân tích mối liên quan về sự gia tăng tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh với điều kiện vệ sinh thấp kém của người dân. Tại Ấn Độ có khoảng 700 triệu người dân sinh sống không được hưởng các điều kiện vệ sinh tối thiểu. Đây là một trong những yếu tố nguy cơ quan trọng dẫn đến tình trạng vi khuẩn kháng
39 kháng sinh trong đó có vi khuẩn mang gen NDM-1, là nguồn truyền nhiễm nguy hiểm trong môi trường và cộng đồng dân cư [130;131]. 1.9.1.2. Đặc điểm lâm sàng ca bệnh nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 tương tự như các bệnh nhân nhiễm các vi khuẩn kháng kháng sinh nhóm carbapenem (KPC, IMP and VIM ). Các trường hợp không có triệu chứng lâm sàng thường là các trường hợp người lành mang vi khuẩn NDM- 1. Các trường hợp nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 tại bệnh viện được chẩn đoán là nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn vết mổ, nhiễm khuẩn máu, phần mềm và viêm phổi có liên quan đến đặt ống hỗ trợ hô hấp. Nhiều bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 kháng carbapenem có các bệnh mãn tính đi kèm và có tình trạng suy giảm miễn dịch (như đái tháo đường, ung thư hay suy thận) hoặc đang sử dụng các liệu pháp điều trị suy giảm miễn dịch hoặc có sử dụng các thủ thuật y tế can thiệp [70;119]. Một số trường hợp trẻ tuổi và người khỏe mạnh trở thành người lành mang các vi khuẩn mang gen NDM-1 sau khi điều trị ở các bệnh viện tại Ấn Độ và Pakistan [64;104;119;142]. Trên thực tế rất khó xác định chính xác nguyên nhân gây tử vong của các trường hợp nhiễm khuẩn mang gen NDM-1 do chẩn đoán các trường hợp này rất phức tạp và bệnh nhân thường có các bệnh khác đi kèm. 1.9.1.3. Đặc tính sinh học phân tử vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 Thời gian qua, các nghiên cứu dịch tễ học phân tử các vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tập trung phân tích về hệ gen của các vi khuẩn này. Kết quả cho thấy hầu hết các gen NDM-1 mã hóa enzym ly giải carbapenem nằm trên các plasmid có kích thước từ 50kb đến >500kb, một số chủng vi khuẩn mang nhiều plasmid có gen NDM-1 (Hình 1.7)
40 [70;140]. Tuy nhiên có một số chủng mang gen NDM-1 nằm trên chromosome của vi khuẩn, điều này chứng minh các vi khuẩn này có khả năng tái tổ hợp gen NDM-1 [70]. Hình 1.7. Kết quả Southern-blotting các plasmid mang gen NDM-1 của các chủng vi khuẩn phân lập tại Anh. (A) Ảnh điện di plasmid sau khi xử lý bằng enzym S1; (B) sau khi lai với các đoạn dò NDM-1 đặc hiệu, các chủng vi khuẩn có thể mang 1 hoặc nhiều plasmid mang gen NDM-1 [70]. Kỹ thuật phân loại plasmid của Carattoli và cộng sự được các tác giả sử dụng để phân loại các plasmid mang gen NDM-1 [26; 70], kết quả cho thấy các plasmid này thuộc nhóm A/C và FI/FII, tuy nhiên một số plasmid mang gen NDM-1 không thể phân loại theo phương pháp này [70]. Trong ca bệnh đầu tiên, Yong D và cộng sự đã phát hiện khả năng sinh enzym NDM-1 trên các chủng K. pneumoniae phân lập ở nước tiểu và chủng E. coli phân lập trong phân bệnh nhân, cho thấy NDM-1 có thể được truyền trong tự nhiên giữa các vi khuẩn khác loài bằng cách tiếp hợp [140]. Các nghiên cứu đã chứng minh khả năng truyền plasmid mang gen NDM-1 trong mô hình phòng thí nghiệm [70;131]. Kết quả này cho thấy các plasmid mang gen NDM-1 có khả năng truyền một cách dễ dàng trong
41 quần thể vi khuẩn đường ruột sống trong đường tiêu hóa của người. Gần đây nhiều báo cáo còn ghi nhận sự có mặt của các chủng gram âm không thuộc họ vi khuẩn đường ruột mang gen NDM-1 [42]. Bên cạnh các nghiên cứu tập trung vào khả năng lây truyền plasmid mang gen NDM-1 trong quần thể vi khuẩn đường ruột, các tác giả tiến hành nhiều kỹ thuật sinh học phân tử nhằm xác định mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn mang gen NDM-1. Nghiên cứu của Kumarasamy và cộng sự cho thấy hầu hết các chủng E. coli và K. pneumoniae mang gen NDM-1 phân lập tại Anh và Ấn Độ có kiểu gen khác biệt, tuy nhiên 26 chủng K. pneumoniae phân lập tại Haryana-Ấn Độ và 9 chủng K. pneumoniae phân lập tại hai bệnh viện của Anh có cùng chung kiểu gen [70]. Một số báo cáo gần đây cũng ghi nhận một số chủng K. pneumoniae phân lập được tại các thành phố khác nhau của Ấn Độ có cùng chung kiểu gen khi phân tích bằng kỹ thuật PFGE, kết quả đã chứng minh sự lây truyền của các chủng K. pneumoniae ra các thành phố khác nhau của Ấn Độ và sang Anh [27]. Kỹ thuật Multi locus sequence typing (MLST) được các tác giả sử dụng để phân loại và xác định mối liên hệ kiểu gen của các chủng vi khuẩn mang gen NDM-1. Ví dụ K.pneumoniea mang gen NDM-1 được phát hiện đầu tiên trên thế giới thuộc kiểu sequence ST14 [140]. Nghiên cứu của Giske CG và cộng sự trên các chủng K.pneumoniea mang gen NDM-1 phân lập được ở một số quốc gia phát hiện thấy phần lớn các chủng vi khuẩn thuộc kiểu trình tự gen ST14, TS11, ST149, ST231 và ST147 (hình 1.8) [50].
42 Hình 1.8. Cây phả hệ của các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập được tại các quốc gia khi phân tích bằng kỹ thuật MLST Mỗi vòng tròn đại diện cho một kiểu trình tự gen. Có 6 nhóm trình tự gen khác nhau được viết bằng chữ số La mã (I đến VI). Các vùng màu xám xung quanh chỉ thị các chủng K. pneumoniae có cùng kiểu gen [50]. Hiện nay khoảng 451 trình tự gen của các loại vi khuẩn và plasmid mang gen NDM-1 đã được giải mã và đăng tải trên webside của NCBI giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cấu trúc gen hay sự đột biến về kiểu gen của các vi khuẩn hay plasmid mang gen NDM-1 [ ]. Ví dụ plasmid plasmid pKpANDM-1 (số đăng ký: FN396876.1) của chủng K. pneumoniae KP-05-506 của Young D và cộng sự phân lập từ ca bệnh đầu tiên được giải trình tự, giúp chúng ta hiểu được cấu trúc gen của plasmid này, trên cơ sở đó sẽ phân tích sâu cơ chế kháng của plasmid mang gen NDM-1, khả năng truyền, tính kháng kháng sinh và dựa vào trình tự này để
43 thiết kế các đoạn mồi đặc hiệu phát hiện các vi khuẩn mang gen NDM-1 trên thế giới [140]. Dựa vào các trình tự gen NDM-1 của vi khuẩn các nhà khoa học nghiên cứu theo dõi sự tiến hóa của gen này như các đột biến tạo ra các NDM khác nhau, ví dụ: gen NDM-2 kháng carbapenem của chủng A. baumannii (do đột biến gen NDM-1 ở vị trí 82 (nucleotide từ C sang G) làm thay đổi cấu trúc amino acide ở vị trí 28 chuyển từ Proline sang Alanine của Enzym NDM-1 [64]. 1.9.2. Vi khuẩn mang gen NDM-1 tại Việt Nam Sau khi vi khuẩn mang gen NDM-1 được đăng tải trên phương tiện thông tin đại chúng vào cuối tháng 8 năm 2010, đã có nhiều đơn vị tham gia nghiên cứu về vấn đề này như: Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford tại Hà Nội (tiến hành tại bệnh viện các bệnh Nhiệt đới Quốc gia), viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh (nghiên cứu tại bệnh viện Chợ Rẫy, bệnh viện đa khoa tỉnh Bến Tre, bệnh viện Việt- Pháp) và viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương chia làm 2 nhóm: nhóm 1 (nhóm nghiên cứu của chúng tôi) tiến hành ở ba bệnh viện là Việt Đức, Thanh Nhàn và Saint Paul và nhóm 2 tiến hành thu thập các mẫu nước sông của khu vực Hà Nội (Trung tâm nghiên cứu các bệnh Truyền nhiễm của trường đại học Nagasaki tại viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương). Hiện nay các nhóm nghiên cứu về NDM-1 tại Việt Nam đã cùng nhau hợp tác nghiên cứu với đầu mối là viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương với mục tiêu tiến hành nghiên cứu sâu hơn các đặc tính kháng kháng sinh của các vi khuẩn mang gen NDM-1 phân lập được trên bệnh nhân, người lành và môi trường ngoại cảnh. 1.9.3. Các vấn đề tồn tại cần tập trung nghiên cứu tại Việt Nam Sự có mặt của vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại Việt Nam là mối nguy cơ quan trọng tác động đến sức khỏe của người dân cần đề xuất các giải pháp ngăn chặn và khống chế sự lây lan của loại vi
44 khuẩn này trong các bệnh viện và cộng đồng. Có nhiều vấn đề tồn tại cần được tập trung giải quyết như sau: - Cần xác định tỷ lệ mắc vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại các bệnh viện, các đặc điểm lâm sàng, phác đồ điều trị và tác động của vi khuẩn này với bệnh nhân, kinh tế và xã hội của đất nước là các vấn đề quan trọng cần được tiến hành nghiên cứu và làm sáng tỏ. - Các yếu tố nguy cơ liên quan đến đến nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 trong bệnh viện như: tiền sử đi du lịch, điều trị tại các bệnh viện khác, tuổi, giới, các bệnh mãn tính, thời gian nằm viện - Các biện pháp phòng chống sự lây lan của vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 trong bệnh viện. Ở các quốc gia phát triển, các trường hợp nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 và các vi khuẩn kháng carbapenem khác như KPC và OXA-48 phải được cách ly điều trị, tiến hành khử trùng khu vực bệnh nhân và điều tra dịch tễ học. Tuy nhiên ở Việt Nam có nhiều báo cáo về các trường hợp nhiễm vi khuẩn mang gen kháng carbapenem nhưng chưa triển khai cụ thể các giải pháp phòng chống vi khuẩn này. Cần đưa ra các giải pháp phù hợp khi phát hiện thấy vi khuẩn mang gen NDM-1 tại Việt Nam: điều tra các ca bệnh, các biện pháp cách ly, khử khuẩn Trong tương lai cần có kế hoạch phối hợp hành động chặt chẽ giữa các cơ quan trong ngành Y tế về các vấn đề liên quan đến vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại Việt Nam. - Các vấn đề ô nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 trong bệnh viện và môi trường ngoại cảnh cần được nghiên cứu [113]. Trước mắt cần tập trung phát hiện mức độ ô nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 theo thời gian, địa điểm, sự biến động của quần thể plasmid mang các gen kháng kháng sinh bao gồm cả gen NDM-1 trong môi trường ngoại cảnh các bệnh viện có bệnh nhân dương tính với vi
45 khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1, cộng đồng nơi bệnh nhân sinh sống Trên cơ sở đó đưa ra các khuyến cáo phù hợp để ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn này. - Cần nghiên cứu các đặc điểm sinh học phân tử, so sánh mối liên hệ về kiểu gen, các loại plasmid mang gen NDM-1 của các chủng vi khuẩn tại Việt Nam với các quốc gia trên thể giới, qua đó dự đoán nguồn gốc, khả năng lây lan của vi khuẩn này và khả năng truyền plasmid trong quần thể vi khuẩn. - Người lành mang vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 là nguồn truyền nhiễm quan trọng cho các bệnh nhân trong bệnh viện và cộng đồng. Cần tập trung nghiên cứu xác định tỷ lệ người lành ở các đối tượng có nguy cao như bệnh nhân nằm viện có bệnh nhân dương tính với loại vi khuẩn này, thành viên trong gia đình bệnh nhân và cộng đồng nơi có bệnh nhân sinh sống phát hiện, điều trị và giám sát tốt các đối tượng này sẽ làm giảm nguy cơ lây lan vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại Việt Nam. Nhiều vấn đề tồn tại quan trọng liên quan đến vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 cần tập trung giải quyết tại Việt Nam, tuy nhiên cần phải có thời gian, kinh phí và đặc biệt là sự thiết lập hợp tác nghiên cứu giữa các đơn vị trong ngành y tế, chia sẻ thông tin, chủng vi khuẩn, điều tra các ca bệnh Tuy nhiên, do giới hạn về thời gian và kinh phí, một số vấn đề tồn tại sẽ được ưu tiên tiến hành nghiên cứu và đã được đề cập trong phần mục tiêu nghiên cứu của luận án.
46 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu: Chọn có chủ đích bệnh viện Việt Đức-Hà Nội làm địa điểm nghiên cứu bởi các lý do sau: Bệnh viện Việt Đức là bệnh viện ngoại khoa đầu ngành với qui mô 500 giường bệnh mỗi năm thực hiện khoảng 28.000 ca phẫu thuật thuộc nhiều chuyên khoa sâu khác nhau, do vậy bệnh viện luôn luôn trong tình trạng quá tải, công suất sử dụng giường bệnh vượt quá 100%, gây nhiều khó khăn cho công tác phòng chống nhiễm khuẩn. Cũng như các bệnh viện tuyến trung ương khác, kháng sinh chiếm một tỷ lệ lớn trong cơ cấu thuốc sử dụng, trong đó các kháng sinh thế hệ mới như cephalosporin và đặc biệt là kháng sinh nhóm carbapenem được sử dụng thường xuyên tại bệnh viện. Đây là các điều kiện thuận lợi để tạo áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng lại các kháng sinh trong đó có carbapenem tại bệnh viện. Đây là nguy cơ cao cho các vi khuẩn sinh enzym kháng carbapenem bao gồm gen NDM-1. 2.2. Thiết kế nghiên cứu: Dịch tễ học mô tả và phân tích Sử dụng thiết kế nghiên cứu mô tả cho toàn bộ nghiên cứu. Riêng tiểu phần đánh giá yếu tố nguy cơ của mục tiêu 1 sử dụng thiết kế nghiên cứu bệnh chứng (nghiên cứu phân tích). 2.3. Thời gian nghiên cứu - Mục tiêu 1: Từ tháng 8/2010 đến tháng 12/2011 - Mục tiêu 2: Từ tháng 7 đến tháng 12/2011 - Mục tiêu 3: Từ tháng 1/1/2012 đến 30/6/2013
47 2.4. Đối tượng nghiên cứu 2.4.1 Đối tượng nghiên cứu mục tiêu 1: Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học lâm sàng của bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại bệnh viện Việt Đức - Hà Nội. - Bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện kháng carbapenem mang gen NDM-1 được định nghĩa theo đúng định nghĩa của Tổ chức Y tế Thế giới [137], cụ thể như sau: - Xuất hiện nhiễm khuẩn sau ≥ 48 giờ nhập viện - Phân lập được các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen. - Riêng đối tượng nghiên cứu cho tiểu phần đánh giá yếu tố nguy cơ ở nghiên cứu bệnh chứng thì ca bệnh và ca chứng được áp dụng theo tiêu chuẩn sau: Ca bệnh: bệnh nhân phát hiện nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen. Ca chứng: Một ca bệnh sẽ chọn hai ca đối chứng là bệnh nhân có kết quả âm tính với vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 (xác định bằng kỹ thuật PCR) sẽ lựa chọn hai bệnh nhân đứng sau bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 trong danh sách nghiên cứu và không phân biệt tuổi, giới. 2.4.2. Đối tượng nghiên cứu mục tiêu 2: Mô tả tình trạng ô nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 trong môi trường bệnh viện Việt Đức. - Mặt bàn, bề mặt sàn buồng bệnh, bề mặt giường bệnh, khu nhà vệ sinh - Tủ cá nhân của nhân viên y tế và bệnh nhân - Xe đẩy y tế
48 - Máy hút đờm dãi - Rác thải y tế - Tay nhân viên điều dưỡng chăm sóc bệnh nhân 2.4.3. Đối tượng nghiên cứu mục tiêu 3: Xác định một số đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 - Các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập được trên bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện Việt Đức (phân lập từ đối tượng của mục tiêu 1). - Các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập trong môi trường tại bệnh viện Việt Đức (phân lập được ở mục tiêu 2). 2.5. Cỡ mẫu Nghiên cứu 2.5.1. Cỡ mẫu mục tiêu 1: - Cỡ mẫu nghiên cứu cho mô tả đặc điểm dịch tễ học: Đây là một nghiên cứu mới ở trên thế giới và Việt Nam, hiện tại chưa có các công bố về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1. Do vậy ở nghiên cứu này lấy mẫu không xác xuất, chọn mẫu có chủ đích, lấy toàn bộ 240 bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem trong tổng số 6841 bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện Việt Đức trong thời gian nghiên cứu từ tháng 8/2010-31/12 năm 2011. - Cỡ mẫu cho nghiên cứu bệnh chứng: Ca bệnh: Lấy mẫu có chủ đích bao gồm toàn bộ bao gồm toàn bộ 35 bệnh nhân phát hiện nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 của mục tiêu 1 Ca chứng: lấy chủ đích 70 ca chứng (Áp dụng tỷ lệ 1 ca bệnh 2 ca chứng) theo cách thức: một ca bệnh chọn lấy 2 ca âm tính kế tiếp trong danh sách nghiên cứu làm ca chứng.
49 2.5.2. Cỡ mẫu mục tiêu 2: Đây là một nghiên cứu mới ở trên thế giới và Việt Nam và chưa có tiền lệ về tỷ lệ vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 trong môi trường bệnh viện. Do vậy ở mục tiêu này sử dụng phương pháp chọn mẫu không xác suất theo mẫu thuận tiện. Tổng số 200 mẫu tại các vị trí khác nhau của 3 khoa: Phẫu thuật Tiết Niệu, Gan mật và Phẫu thuật tiêu hóa (khoảng 66 mẫu/khoa) được thu thập và xét nghiệm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 trong môi trường bệnh viện Việt Đức. 2.5.3. Cỡ mẫu mục tiêu 3: Cỡ mẫu toàn bộ, bao gồm tất cả các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập được ở bệnh nhân và môi trường ở mục tiêu 1 và 2. 2.6. Lấy mẫu bệnh phẩm và kỹ thuật xét nghiệm 2.6.1. Lấy mẫu bệnh phẩm 2.6.1.1. Bệnh phẩm mục tiêu 1 Các ca bệnh được chẩn đoán trên lâm sàng bị nhiễm khuẩn bệnh viện sẽ được tiến hành lấy mẫu tại các vị trí nghi nhiễm khuẩn (tổ chức bị nhiễm khuẩn, dịch hô hấp, dịch áp xe, nước tiểu ) và được gửi về khoa xét nghiệm vi sinh, bệnh viện Việt Đức để làm xét nghiệm xác định các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện theo thường qui của khoa Vi sinh bệnh viện Việt Đức. 2.6.1.2. Bệnh phẩm mục tiêu 2 Dùng tăm bông vô trùng quét lên bề mặt của các vị trí cần lấy mẫu trong nghiên cứu, cho tăm bông vào các ống thu thập mẫu có chứa 5ml canh thang LB chứa imipenem 2g/ml và chuyển ngay về phòng xét nghiệm vi sinh của bệnh viện Việt Đức. Số lượng các loại mẫu thu thập tại các khoa bao gồm: Tay nhân viên điều dưỡng (28), xe đẩy y tế (12), máy hút đờm (20), tủ cá nhân của nhân
50 viên y tế và bệnh nhân (18), mặt bàn, bề mặt sàn buồng bệnh (29), ga trải giường bệnh (46), khu nhà vệ sinh, chậu rửa tay tại buồng bệnh (16), rác thải y tế (12) và các vị trí lấy mẫu khác là 19 mẫu (tay cầm điện thoại, bàn văn phòng ). 2.6.1.3. Mẫu cho mục tiêu 3: Cỡ mẫu toàn bộ bao gồm các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập được tại mục tiêu 1-2. 2.6.2. Kỹ thuật xét nghiệm: 2.6.2.1. Xác định bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 2.6.2.1.1. Nuôi cấy phân lập vi khuẩn - Các mẫu bệnh phẩm sau khi thu thập sẽ được cấy lên đĩa thạch MacConkey, ủ 370C trong 18-24 giờ. - Lựa chọn các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch làm phản ứng sinh hóa bộ định danh API-20E (Bio-merieux, Pháp) để định danh vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện. 2.6.2.1.2. Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán (được thực hiện tại khoa vi sinh bệnh viện Việt Đức) Mức độ nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện được xác định bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán được thực hiện trên đĩa thạch đã được láng vi khuẩn cần thử nghiệm. Đường kính của vòng ức chế các kháng sinh trên đĩa thạch Mueller-Hinton của vi khuẩn sẽ được ghi lại và tính toán mức độ nhạy cảm dựa tiêu chuẩn CLSI, 2010. Các khoanh giấy kháng sinh thử nghiệm bao gồm imipenem (IMP), meropenem (MEM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM), amikacin (AK) và colistin (CS). Chủng chuẩn
51 quốc tế: Escherichia coli ATCC-25922 được tiến hành song song với các chủng vi khuẩn thử nghiệm [32]. Khi phát hiện ra các chủng vi khuẩn do các chủng vi khuẩn gram âm kháng với ít nhất một kháng sinh trong nhóm carbapenem sẽ lập danh sách của các bệnh nhân bị nhiễm khuẩn này. Sau đó các chủng vi khuẩn sẽ được gửi ngay về phòng thí nghiệm Kháng sinh-khoa Vi khuẩn-Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương để phát hiện gen NDM-1 bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen. 2.6.2.1.3. Kỹ thuật ức chế nồng độ kháng sinh tối thiểu (được thực hiện tại phòng thí nghiệm Kháng sinh -Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương) Nồng độ ức chế kháng sinh tối thiểu của các chủng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng kháng sinh trên thạch Mueller-Hinton dựa theo tiêu chuẩn của CLSI. Các chủng vi khuẩn được cấy trên các đĩa thạch Mueller-Hinton có chứa các nồng độ kháng sinh khác nhau, ủ 370C trong 18-24 giờ, sau đó quan sát xem ở nồng độ kháng sinh nào chủng vi khuẩn không mọc xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh với các chủng vi khuẩn được thử nghiệm. Các kháng sinh thử nghiệm bao gồm imipenem (IMP), meropenem (MEM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM) amikacin (AK) và colistin (CS). Chủng chuẩn quốc tế: Escherichia coli ATCC-25922 được tiến hành song song với các chủng vi khuẩn thử nghiệm [32]. 2.6.2.1.4. PCR phát hiện gen NDM-1 - Tách chiết ADN: Lấy 4-5 khuẩn lạc của vi khuẩn gram âm kháng carbapenem nuôi cấy trên thạch LB qua đêm ở nhiệt độ 370C hòa tan trong 200µl nước siêu sạch đun cách thủy 950C/5phút trong vòng 5 phút, ly tâm 13.000/phút X 15 phút. Thu nước nổi làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR.
52 - Chứng dương là ADN khuôn mẫu tách chiết từ chủng E. coli mang gen NDM- 1 phân lập tại Nhật Bản do TS. Shibayama, Viện Quốc gia các bệnh truyền nhiễm Nhật Bản cung cấp [117]. Chứng âm: Nước siêu sạch. - Các đoạn mồi đặc hiệu sử dụng phát hiện gen NDM-1, các thành phần tham gia phản ứng PCR và chu trình nhiệt để khuếch đại gen NDM-1 được thể hiện tại bảng 1, bảng 2 và bảng 3 (phần 1 phụ lục 2). - Sản phẩm PCR sẽ được điện di trên thạch điện di 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X, nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide (10mg/ml)/10phút - Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel. - Phân tích kết quả: Các chủng vi khuẩn xuất hiện band có cùng kích thước với chứng dương sẽ được tiến hành giải trình tự gen và so sánh với trình tự chuẩn trong ngân hàng gen để xác định chính xác gen NDM-1. 2.6.2.1.5. Giải trình tự xác định gen NDM-1 (phần 2 phụ lục 2) - Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen NDM-1 của các chủng vi khuẩn (tương tự 2.6.2.1.4). - Tinh sạch sản phẩm PCR gen NDM-1 sau khi chạy điện di bằng bộ kít ADN Gel purification (QIAGEN). - Thực hiện phản ứng Bigdye-PCR: Thành phần tham gia phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng Bigdye được trình bày tại bảng 4 và 5 phần 2 phụ lục 2. - Tinh sạch sản phẩm ADN: Cho 45 µl Sam solution và 10 µl X- termination/ mẫu bệnh phẩm. Lắc 2000 vòng/30 phút Ly tâm 3000 vòng trong 2-3 phút lấy nước nổi cho vào máy giải trình tự gen. - Đọc trình tự gen bằng máy đọc trình tự ABI-3130 (Applied Biosystem, Mỹ). - Phân tích trình tự gen: So sánh các đoạn gen với các trình tự chuẩn của ngân hàng gen (số đăng ký trong ngân hàng gen: FN396876.1).
53 2.6.2.2. Xác định vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại môi trường - Ủ mẫu bệnh phẩm thu thập ở 370C trong 6-8 giờ (giai đoạn tăng sinh trong môi trường kháng sinh) ưu tiên các vi khuẩn kháng carbapenem phát triển. Cấy chuyển từ môi trường canh thang LB sang đĩa thạch MacConkey có nồng độ kháng sinh imipenem 2g/ml. Ủ 370C trong 18-24 giờ. Chọn 5- 7 khuẩn lạc mọc trên môi trường Mac Conkey có chứa 2g/ml imipenem sau khi ủ ấm qua đêm, cấy chuyển sang đĩa thạch LB (Luria-Bertani) ở 370C/qua đêm. Chọn khuẩn lạc thuần mọc trên thạch LB để tách chiết ADN làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR phát hiện gen NDM-1 và định danh vi khuẩn bằng thanh định danh API-20E (Bio-Merieux, Pháp). - Kỹ thuật PCR phát hiện gen NDM-1: (tương tự mục 2.6.2.1.4) - Kỹ thuật ức chế nồng độ kháng sinh tối thiểu (MIC): (tương tự mục 2.6.1.2.3). 2.6.2.3. Phân tích đặc điểm sinh học và phân tử các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 (tiến hành tại phòng thí nghiệm kháng sinh-khoa Vi khuẩn-Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương) 2.6.2.3.1. Thử nghiệm khả năng sinh enzym New Delhi metallo-beta- lactamase 1 Thử nghiệm khả năng sinh enzym New Delhi metallo-beta-lactamase 1 của các chủng vi khuẩn mang gen NDM-1, sử dụng hai bộ kít: Bộ kít imipenem, meropenem- SMA của hãng Eiken Co., Tokyo-Nhật Bản sử dụng khoanh giấy có chứa 3mg sodium mercapto acetate (SMA) và 2 khoanh giấy kháng sinh có chứa 10g imipenem và meropenem. Các khoanh giấy này được đặt lên đĩa thạch Mueller-Hinton đã được trải vi khuẩn thử nghiệm như sau: hai khoanh giấy kháng sinh imipenem và
54 meropenem được đặt riêng rẽ và hai khoanh giấy kháng sinh khác được đặt gần khoanh giấy SMA (khoảng cách tính từ tâm của hai khoanh giấy là 16mm sau đó ủ ở 350C trong 18 giờ. Đánh giá kết quả: vòng vô khuẩn của khoanh giấy kháng sinh được đặt cạnh khoanh giấy SMA lớn hơn 5mm so với vòng vô khuẩn của khoanh giấy kháng sinh được đặt một mình được coi là dương tính [124]. Bộ kít thứ hai sử dụng thanh MBL E-test (AB bioMerieux- Nc) một nửa thanh giấy được tẩm imipenem với các giải nồng độ khác nhau và một nửa còn lại được tẩm imipenem và EDTA. Thanh MBL E-test được đặt lên đĩa thạch Mueller-Hinton đã được trải vi khuẩn thử nghiệm và ủ 350C trong 18 giờ. Vòng vô khuẩn ở hai phía của thanh giấy sẽ được so sánh, nếu vòng vô khuẩn ở đầu thanh giấy có tẩm EDTA và imipenem >3 lần so với đầu còn lại cho kết quả dương tính. [7;70]. 2.6.2.3.2. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE (phần 3 phụ lục 2) 2.6.2.3.3. Phân tích số lượng plasmid và phát hiện plasmid mang gen NDM-1 [70] 2.6.2.3.3.1. Phân tích số lượng plasmid của các vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 - Lấy một khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn mang gen NDM-1 trên đĩa thạch LB được nuôi cấy qua đêm ở 370C cấy vào 10ml môi trường canh thang LB, Lắc 120 vòng/phút ở 370C trong 6-8 giờ. Ly tâm 4000 vòng x 20 phút, loại dịch nổi, thu cặn tế bào vi khuẩn và tách chiết plasmid bằng kít Miniprep (QIAGEN). - Plasmid sau khi tách chiết sẽ được điện di trên thạch 0,5% trong dung dịch đệm TAE 1X, nhuộm thạch và chụp ảnh gel dưới ánh sáng tia UV.
55 - Phân tích kết quả: Số lượng và plasmid của các chủng vi khuẩn mang gen NDM-1 sẽ được xác định và so sánh với nhau. 2.6.2.3.3.2. Phát hiện plasmid mang gen NDM-1 bằng kỹ thuật Southern- Blotting (phần 4 phụ lục 2) 2.6.2.3.3.3. Thử nghiệm khả năng truyền plasmid mang gen NDM-1 (phần 5 phụ lục 2) 2.6.2.3.4.4. Phân tích plasmid mang gen NDM-1 Tách chiết plasmid: Các băng plasmid được xác định mang gen NDM-1 bằng kỹ thuật southern-blotting (Phần 2.3.6.2.2) sẽ được cắt khỏi gel điện di sau đó được tinh sạch bằng kít tinh sạnh. Giải trình tự plasmid mang gen NDM-1: Các plasmid mang gen NDM-1 sau khi tinh sạch và được mang sang trung tâm nghiên cứu Genome Vi khuẩn-Viện Nghiên cứu Quốc gia các bệnh Truyền nhiễm Nhật Bản (NIID) để giải trình tự và phân tích. 2.7. Vật liệu nghiên cứu: (Mô tả chi tiết ở phụ lục 6) 2.8. Chỉ tiêu nghiên cứu 2.8.1. Chỉ tiêu nghiên cứu cho mục tiêu 1 - Tỷ lệ bệnh nhân bị nhiễm khuẩn bệnh viện với các vi khuẩn gram âm kháng kháng sinh nhóm carbapenem (có mang gen và không mang gen NDM-1 xác định bằng PCR và giải trình tự gen). - Các căn nguyên gây nhiễm khuẩn bệnh viện: Các loại vi khuẩn Gram âm phân lập từ các bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện Việt Đức tiêu chuẩn: o Các vi khuẩn Gram âm bao gồm: E. coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Proteus, Enterobacter spp., Acinetobacter spp.
56 o Các vi khuẩn kháng ít nhất một kháng sinh trong nhóm carbapenem (imipenem, meropenem) bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch theo tiêu chuẩn của CLSI 2010 [32]. - Tỷ lệ vi khuẩn mang gen NDM-1 được xác định bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen (phần 2.1.6.5). Chủng dương tính với gen NDM- 1 bằng kỹ thuật PCR sau khi xác định bằng giải trình tự gen sẽ được sử dụng làm chứng dương cho kỹ thuật PCR. - Thông tin về nhân khẩu học: Tuổi, giới, nghề nghiệp, trình độ học vấn, địa chỉ, lý do vào viện, ngày vào viện - Các phẫu thuật đã thực hiện: phương pháp mổ, mổ bẩn, mổ sạch - Diễn biến lâm sàng: thời gian điều trị, nặng, nhẹ, thời gian. - Các thủ thuật y tế can thiệp tại bệnh viện: thở máy, đặt sonde - Các bệnh kèm theo: tim mạch, tiểu đường, cao huyết áp, AIDs . - Tình trạng sử dụng kháng sinh trước và trong thời gian nằm viện của các bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem bao gồm cả các trường hợp nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1: imipenem, meropenem, ceftriaxone, ciprofloxacin, - Các yếu tố khác: Tiền sử điều trị ở các bệnh viện khác (trong nước và ngoài nước) trong 6 tháng trước khi vào viện. - Hiệu quả điều trị: khỏi, tử vong, chuyển viện. - Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán và MIC được xác định dựa theo tiêu chuẩn của CLSI, 2010 [32]. 2.8.2. Chỉ tiêu nghiên cứu cho mục tiêu 2 - Mặt bàn, bề mặt sàn buồng bệnh, bề mặt giường bệnh, khu nhà vệ sinh. - Rác thải y tế
57 - Xe đẩy y tế, tủ cá nhân của nhân viên y tế và bệnh nhân. - Tay nhân viên điều dưỡng chăm sóc bệnh nhân. - Các loại vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem phân lập tại các vị trí khác nhau của bệnh viện tại bệnh viện Việt Đức bao gồm: E. coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Proteus, Enterobacter spp., Acinetobacter spp. - Tỷ lệ số mẫu dương tính với vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1. - Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn mang gen NDM-1 vơi các laoij kháng sinh dựa theo tiêu chuẩn của CLSI, 2010 2.8.3. Chỉ tiêu nghiên cứu cho mục tiêu 3. - Vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập trên bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện và trong môi trường bệnh viện được xác định bằng kỹ thuật PCR. - Kiểu gen vi khuẩn mang gen NDM-1 bằng kỹ thuật PFGE. - Số lượng plasmid của các chủng vi khuẩn mang gen NDM-1 được phân tích sau khi tách chiết bằng bộ kit của QIAGEN và điện di trên thạch. - Plasmid mang gen NDM-1 phát hiện bằng kỹ thuật southern-blotting theo phương pháp của Karamunsary và cộng sự [70]. - Tỷ lệ truyền plasmid mang gen NDM-1 trong mô hình phòng thí nghiệm theo phương pháp của Karamunsary và cộng sự [70]. - Phân tích các plasmid mang gen NDM-1 của các chủng vi khuẩn bằng giải trình tự gen và so sánh với các plasmid mang gen NDM-1 trên thế giới. 2.9. Phương pháp thu thập thông tin - Phát hiện ca bệnh: các ca bệnh được các bác sỹ điều trị đã được tập huấn tiến hành thu thập ca bệnh theo đúng định nghĩa và tiêu chuẩn của
58 nghiên cứu. Các thông tin có liên quan đến nghiên cứu được thu thập theo phiếu điều tra in sẵn (phụ lục 4,5). - Nghiên cứu bệnh chứng: được tiến hành thu thập thông tin theo phiếu điều tra theo thiết kế cho nghiên cứu bệnh chứng (cùng 1 phiếu điều tra). 2.10. Xử lý và phân tích số liệu: - Số liệu thu thập được từ phiếu điều tra và bệnh án sẽ được nhập 2 lần độc lập vào máy tính và kiểm tra đối chiếu để tránh sai sót trong quá trình nhập số liệu. Số liệu được quản lý bằng phần mềm exel và được xử lý và phân tích bằng phần mềm SPSS 21.0 (SPSS: An IBM Company). Kết quả được trình bày dưới dạng bảng, đồ thị, biểu đồ. - Nghiên cứu bệnh chứng được phân tích trên phần mềm SPSS 21.0 (SPSS: An IBM Company) với các phân tích đơn biến. Tiếp theo đó các yếu tố liên quan có ý nghĩa thống kê trong phân tích đơn biến được đưa vào phân tích đa biến theo mô hình hồi qui logistic Kết quả nghiên cứu được trình bày dưới dạng các tỷ lệ, tỷ suất chênh (OR-trong phân tích đơn biến), tỷ suất chênh có hiệu chỉnh (adjusted OR-trong phân tích đa biến) và khoảng tin cậy (mặc định là 95%). - Phần mềm Finch-Tivi và DNA-Blast được sử dụng để so sánh đoạn gen phát hiện được với trình tự NDM-1 chuẩn trong ngân hàng gen. - Phân tích mối liên hệ kiểu gen của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 bằng phần mềm Bionumeric- 6.5 để tạo cây phả hệ. - Phần mềm Inter plasmid Analyzing tool được sử dụng để so sánh trình tự gen của các plasmid mang gen NDM-1 tại bệnh viện Việt Đức và các plasmid mang gen NDM-1 tại các nơi trên thế giới trong ngân hàng gen 2.11. Kiểm soát sai số có thể xảy ra trong quá trình nghiên cứu Các qui trình lấy mẫu, xét nghiệm và sàng lọc vi khuẩn kháng carbapenem được thực hiện theo thường qui chuẩn thức của bệnh viện
59 Việt Đức và được các bác sỹ và nghiên cứu viên chuyên gia giầu kinh nghiệm có uy tín của bệnh viện Việt Đức và của phòng nghiên cứu phòng nghiên cứu kháng sinh-khoa vi khuẩn-viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương sẽ đảm bảo được độ tin cậy của nghiên cứu. Chủng chuẩn quốc tế E. coli ATCC 25922 được thử nghiệm song song với các chủng vi khuẩn gram âm mang gen NDM-1 về tính nhạy cảm kháng sinh và theo tiêu chuẩn CLSI 2010 để tính toán mức độ nhạy cảm kháng sinh sẽ đảm bảo được sự chính xác của thử nghiệm. Sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu để phát hiện gen NDM-1 bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen, sau đó so sánh với trình tự gen chuẩn trong ngân hàng gen sẽ đảm bảo được mức độ chính xác của kết quả và sai số. Các chuyên gia của Đơn vị nghiên cứu lâm sàng đại học Oxford tại Hà Nội và các chuyên gia ở phòng nghiên cứu kháng sinh-khoa vi khuẩn số 2 - viện Nghiên cứu Quốc gia các bệnh Truyền nhiễm Nhật Bản và đơn vị nghiên cứu trực tiếp sang phòng thí nghiệm kháng sinh-Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương, trao đổi, đi thực địa tại địa điểm nghiên cứu và cùng tham gia thực hiện các thí nghiệm, điều này sẽ hạn chế được nhiều sai số. Phân tích plasmid bằng kỹ thuật giải trình tự gen được thực hiện tại trung tâm genome của vi khuẩn-viện Nghiên cứu quốc gia các bệnh Truyền nhiễm Nhật Bản sẽ đảm bảo được tính chính xác của số liệu. Các số liệu thô của nghiên cứu được đưa ra thảo luận và đánh giá bởi các chuyên gia của Đơn vị nghiên cứu lâm sàng đại học Oxford tại Hà Nội và các chuyên gia tại phòng nghiên cứu kháng sinh-khoa vi khuẩn số 2 - viện Nghiên cứu Quốc gia các bệnh Truyền nhiễm Nhật Bản sẽ đảm bảo được độ tin cậy của số liệu. Một số kết quả làm tại viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương được kiểm tra lại tại phòng nghiên cứu kháng sinh-khoa vi khuẩn số 2-viện Nghiên
60 cứu Quốc gia các bệnh Truyền nhiễm Nhật Bản như: PCR xác định NDM-1, khả năng sinh enzym metallo-beta-lactamase 1, giải trình tự gen NDM-1 và PFGE sẽ đảm bảo được độ tin cậy của số liệu. Số liệu được nhập hai lần vào phần mềm Exel để tránh sai số. 2.12. Đạo đức nghiên cứu - Nghiên cứu đảm bảo chỉ áp dụng các biện pháp không ảnh hưởng tới chất lượng điều trị của bệnh viện, sức khỏe, quyền lợi kinh tế của người bệnh, cũng như không gây phiền hà cho người bệnh và nhân viên y tế. - Nội dung nghiên cứu đã được Hội đồng đạo đức, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương phê duyệt. - Mọi người bệnh tham gia nghiên cứu đều được giải thích về mục đích, nội dung nghiên cứu và tình nguyện tham gia nghiên cứu. Những người bệnh không thể tiếp nhận được giải thích của nghiên cứu viên thì sẽ thực hiện qua người nhà của người bệnh đó.
61 2.13. Sơ đồ nghiên cứu Sơ đồ 1. Tóm tắt các bước nghiên cứu và đơn vị thực hiện mục tiêu 1
62 Sơ đồ 2. Tóm tắt các bước nghiên cứu và đơn vị thực hiện mục tiêu 2
63 Sơ đồ 3. Tóm tắt các bước nghiên cứu và đơn vị thực hiện mục tiêu 3
64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập tại bệnh viện Việt Đức-Hà Nội. 3.1.1. Một số đặc điểm chung của bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem trong nghiên cứu Hình 3.1. Tỷ lệ phát hiện bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem (n=6841) Từ tháng 8 năm 2010 đến 31 tháng 12 năm 2011 đã ghi nhận tổng số 6841 bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện theo đúng tiêu chuẩn định nghĩa ca bệnh tại bệnh viện Việt Đức. Nghiên cứu đã xác định được 240 bệnh nhân nhiễm các chủng vi khuẩn gram âm kháng carbapenem chiếm tỷ lệ 3,51% (hình 3.1)
65 Bảng 3.1. Một số đặc điễm của tuổi và giới của đối tượng nghiên cứu của 240 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem Đặc điểm Số lượng Tỷ lệ % Tuổi 50 108 45 Giới Nam 204 85 Nữ 36 15 Bảng 3.1 cho thấy đối tượng nghiên cứu nằm ở các nhóm tuổi, trong đó 45% có độ tuổi >50 tuổi, 85% là nam giới. Bảng 3.2. Chẩn đoán bệnh lúc nhập viện của 240 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem Chẩn đoán bệnh Số lượng Tỷ lệ % Bệnh đường tiết niệu 30 12,5 Chấn thương 105 43,75 Bệnh Gan mật 12 5 Ung thư 42 17,5 Thần kinh 5 2,1 Tim mạch 13 5,4 Bệnh đường tiêu hóa 12 5 Khác 21 8,75 Bảng 3.2 cho thấy hầu hết bệnh nhân nhập viện do chấn thương tai nạn giao thông (43,75%), ung thư (17,5%), các bệnh đường tiết niệu (12,7%) và tim mạch (5,4%).
66 Bảng 3.3. Mức độ thực hiện phẫu thuật và thủ thuật xâm nhập của 240 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem Loại thủ thuật* Tần số Tỷ lệ % Mổ sạch 58 24,16 Mổ sạch có kiểm soát 129 49,58 Mổ nhiễm khuẩn 45 18,75 Mổ bẩn-nhiễm khuẩn 8 3,33 Đặt nội khí quản 125 52,08 Đặt sonde tiết niệu 232 96,67 Khác 28 11,66 * Một người bệnh có thể được thực hiện nhiều thủ thuật xâm nhập Bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ một số thủ thuật xâm nhập có nguy cơ cao gây NKBV được thực hiện ở các đối tượng nghiên cứu theo trình tự giảm dần gồm: Đặt sonde tiết niệu (96,67%), đặt nội khí quản (52,08%), mổ sạch có kiểm soát (49,58%), mổ sạch (24,16%), mổ nhiễm khuẩn (18,75%) và mổ bẩn-nhiễm khuẩn (3,33%).
67 3.1.2. Một số đặc điểm dịch tễ học của 35 bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại bệnh viện Việt Đức - Hà Nội. 3.1.2.1. Một số đặc điểm của 35 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 Hình 3.2. Tỷ lệ phát hiện bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 (n=35). Tiếp tục phân tích 240 bệnh nhân này nghiên cứu phát hiện được 35/240 (14,58%) bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 (hình 3.2). Các bệnh nhân dương tính với vi khuẩn mang gen NDM-1 đều không có tiền sử đi nước ngoài, hoặc tiếp xúc hay điều trị cùng với các bệnh nhân người nước ngoài.
68 Hình 3.3. Tỷ lệ số lượng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phát hiện được trên bệnh nhân (n=35) Hình 3.3 cho thấy có 94,3% (33/35) bệnh nhân phát hiện được 1 loại vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1. Tuy nhiên rất đáng chú ý là có tới 5.7% (2/35) bệnh nhân tại khoa phẫu thuật Tiết niệu phát hiện có hai loại vi khuẩn khác nhau (C. freundii và Enterobacter spp; Enterobacter spp. và P. rettgeri) kháng carbapenem mang gen NDM-1 trên cùng một người bệnh.
69 Hình 3.4. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn mang gen NDM-1 theo giới (n=35) Nam giới có tỷ lệ phát hiện vi khuẩn mang gen NDM-1 cao hơn nữ giới, lần lượt là 31 (88,6%) và 4 (11,4%). Tỷ xuất về giới tính nam/nữ là 7,75 (hình 3.4). Hình 3.5. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn mang gen NDM-1 theo nhóm tuổi (n=35)
70 Trong 35 ca phát hiện nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 có độ tuổi từ 16-95 tuổi. Nhóm tuổi 60-69; >70 và 50-59 tuổi có tỷ lệ phát hiện cao so với các nhóm tuổi khác (hình 3.5). Bảng 3.4. Phân bố ca bệnh bị nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 theo khoa điều trị (n=35) Khoa điều trị Số lượng bệnh nhân Tỷ lệ % Phẫu thuật Tiết niệu 19 54,3 Phẫu thuật Nhiễm khuẩn 4 11,43 Hồi sức 3 8,58 Phẫu thuật Cấp cứu bụng 2 5,72 Phẫu thuật Chấn thương chỉnh hình 2 5,72 Phẫu thuật Gan mật 1 2,85 Điều trị tự nguyện 1 2,85 Phẫu thuật Tim mạch 1 2,85 Thận lọc máu 1 2,85 Phẫu thuật Hàm mặt và tạo hình 1 2,85 Bảng 3.4 cho thấy khoa phẫu thuật Tiết niệu có tỷ lệ phát hiện cao nhất 19/35 bệnh nhân dương tính với NDM-1 chiếm tỷ lệ 54,3%. Khoa phẫu thuật Nhiễm khuẩn 4 (11,43%), khoa hồi sức phát hiện 3 bệnh nhân (8,58%); Chấn thương chỉnh hình và Cấp cứu bụng mỗi khoa phát hiện 2 trường hợp. Các khoa còn lại phát hiện mỗi khoa một bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1.