Luận văn Nghiên cứu lên men các chủng vi sinh Probiotics và ứng dụng trong chăn nuôi gà

pdf

131 trang yendo 4360

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Nghiên cứu lên men các chủng vi sinh Probiotics và ứng dụng trong chăn nuôi gà", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_van_nghien_cuu_len_men_cac_chung_vi_sinh_probiotics_va.pdf

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu lên men các chủng vi sinh Probiotics và ứng dụng trong chăn nuôi gà

B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN PHÙNG DIP LÀI NGHIÊN CU LÊN MEN CÁC CHNG VI SINH PROBIOTICS VÀ NG DNG TRONG CHĂN NUƠI GÀ LUN VĂN THC SĨ SINH HC BUƠN MA THUT, NĂM 2011
B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN PHÙNG DIP LÀI NGHIÊN CU LÊN MEN CÁC CHNG VI SINH PROBIOTICS VÀ NG DNG TRONG CHĂN NUƠI GÀ Chuyên ngành: Sinh hc thc nghim Mã s: 60 42 30 LUN VĂN THC SĨ SINH HC Ngưi hưng dn khoa hc: PGS.TS. Nguyn Anh Dũng BUƠN MA THUT, NĂM 2011
i LI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cu ca riêng tơi. Các s liu, kt qu nêu trong lun văn là trung thc và chưa đưc ai cơng b trong bt kỳ mt cơng trình nào khác. Mi s giúp đ và các thơng tin trích dn đã đưc nêu rõ ngun gc. Ngưi cam đoan Phùng Dip Lài
ii LI CM ƠN Đ hồn thành lun văn tt nghip này, tơi xin t lịng bit ơn sâu sc đn: PGS.TS Nguyn Anh Dũng, Giám đc Trung tâm Cơng ngh Sinh hc, Trưng Đi Hc Tây Nguyên, ngưi hưng dn khoa hc trc tip đã tn tình hưng dn phương pháp nghiên cu và đĩng gĩp nhiu ý kin quí báu, giúp đ tơi trong sut quá trình hc tp, nghiên cu và hồn thành lun văn. Lãnh đo Trưng Đi Hc Tây Nguyên, tp th thy cơ giáo phịng Sau đi hc, Khoa khoa hc T nhiên&Cơng ngh và Khoa Nơng Lâm nghip. Các bn bè và ngưi thân đã giúp đ, đng viên tơi trong quá trình hc tp và nghiên cu. Trân trng cm ơn. Ngưi thc hin Phùng Dip Lài
iii MC LC M ĐU 1 1. Tính cp thit 1 2. Mc tiêu ca đ tài 2 3. Ý nghĩa khoa hc 2 4. Ý nghĩa thc tin 2 5. Gii hn đ tài 2 CHƯƠNG 1. TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1. Tng quan v vi sinh vt probiotics 3 1.2. Thành phn ca probiotics 3 1.2.1. Bacillus subtilis 4 1.2.2. Lactobacillus acidophilus 5 1.2.3. Saccharomyces cerevisiae 7 1.2.4. Nitrosomonas sp. 10 1.3. Tiêu chí chn la vi sinh vt probiotics 11 1.4. Cơ ch tác đng ca probiotics 11 1.4.1. Tác đng kháng khun 11 1.4.2 . Tác đng biu mơ rut 12 1.4.3. Tác đng min dch 12 1.4.4. Tác đng đn vi khun đưng rut 12 1.4.5. Tác đng tăng kh năng hp th thc ăn 12 1.5. Vai trị ca probiotics 12 1.5.1. Đi vi vt nuơi 12 1.5.2. Đi vi con ngưi 13 1.6. Mt s lưu ý khi s dng probiotics 13 1.7. Yu t nh hưng đn hiu qu ca probiotics 13 1.8. Cơng ngh lên men 14
iv 1.8.1. Ging vi sinh vt 14 1.8.2. Nhân ging vi sinh vt 15 1.8.3. Lên men 16 1.9. Các dng ch phm vi sinh vt (VSV) 18 1.9.1. Ch phm nhân nuơi trên mơi trưng thch bng 18 1.9.2. Ch phm VSV dng dch th 18 1.9.3. Ch phm VSV dng khơ 19 1.9.4. Ch phm VSV dng đơng khơ 19 1.9.5. Ch phm dng bt cht mang 20 1.10. Tình hình nghiên cu 24 1.10.1. Trên th gii 24 1.10.2. Trong nưc 26 CHƯƠNG 2. NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 33 2.1. Ni dung nghiên cu 33 2.2. Phương pháp nghiên cu 33 2.2.1. Đi tưng và vt liu 33 2.2.2. Phương pháp phân lp và bo qun mu 34 2.2.3. Phương pháp phân tích đnh lưng vi sinh vt 36 2.2.4. Phương pháp nghiên cu xây dng quy trình nuơi cy các chng vi sinh probiotics 38 2.2.5. Phương pháp nghiên cu nh hưng ca ch phm probiotics trong chăn nuơi gà 41 2.2.6. Phương pháp x lý thng kê 41 CHƯƠNG 3. KT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 42 3.1. Nghiên cu mơ t đc đim sinh hc ca mt s chng vi sinh Probiotics 42 3.1.1. Đc đim hình thái khun lc ca các chng vi sinh probiotics 42 3.1.2. Đc đim sinh hc ca các chng vi sinh probiotics 43
v 3.1.3. Mi tương quan gia đ đc (ch s OD) và s lưng t bào (CFU/ml) 43 3.2. Nghiên cu quy trình lên men các chng vi sinh probiotics và to ch phm probiotics 47 3.2.1. nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh trưng ca các chng vi sinh probiotics 47 3.2.2. nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh trưng ca các chng vi sinh probiotics 53 3.2.3. nh hưng ca pH đn sinh trưng ca các chng vi sinh probiotics 55 3.2.4. nh hưng ca nhit đ đn sinh trưng ca các chng vi sinh probiotics 57 3.2.5. nh hưng ca đ lc đn sinh trưng ca các chng vi sinh probiotics 59 3.2.6. Xây dng qui trình to ch phm probiotics 61 3.3. nh hưng ca thi gian bo qun đn mt đ VSV ca ch phm 63 3.4. Nghiên cu hiu qu ca vic s dng ch phm probiotics trong chăn nuơi gà 64 3.4.1. nh hưng ca ch phm probiotics đn s lưng trng 65 3.4.2. nh hưng ca ch phm probiotics đn khi lưng trng 67 3.4.3. nh hưng ca ch phm probiotics đn kh năng kháng bnh gà đ trng 69 KT LUN VÀ Đ NGH 73 TÀI LIU THAM KHO 75
vi CÁC CH VIT TT MRS Deman Rogosa Sharpe ĐTQH Đc tính quang hc MCN Mt ct ngang MT Mơi trưng B.subtilis Bacillus subtilis L.acidophilus Lactobacillus acidophilus S.cerevisiae Saccharomyces cerevisiae VSV Vi sinh vt rpm Rounds per minutes (vịng mi phút) TB Trung bình
vii DANH MC CÁC BNG Bng 1.1: Tình hình chăn nuơi gia cm Đak Lak trong 10 năm (20002009) 32 Bng 2.1: nh hưng ca thành phn MT đn sinh trưng ca B.subtilis 38 Bng 2.2: nh hưng ca thành phn MT đn sinh trưng ca L.acidophilus 38 Bng 2.3: nh hưng ca thành phn MT đn sinh trưng ca S.cerevisiae 39 Bng 2.4: nh hưng ca thành phn MT đn sinh trưng ca Nitrosomonas sp. 39 Bng 3.1: Hình thái khun lc ca 4 chng vi sinh vt 42 Bng 3.2: Hình thái t bào ca 4 chng vi sinh probiotics 43 Bng 3.3: Ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) B.subtilis 43 Bng 3.4: Ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) L.acidophilus 44 Bng 3.5: Ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) S.cerevisiae 45 Bng 3.6: Ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) Nitrosomonas sp. 46 Bng 3.7: nh hưng ca thành phn mơi trưng đn sinh trưng ca B. subtilis 48 Bng 3.8: nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh trưng L.acidophilus 49 Bng 3.9: nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh trưng ca S.cerevisiae 50 Bng 3.10: nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh trưng ca Nitrosomonas sp 52 Bng 3.11: nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh trưng ca các chng 54
viii Bng 3.12: nh hưng ca pH đn sinh trưng ca các chng 56 Bng 3.13. nh hưng ca nhit đ đn sinh trưng ca các chng 58 Bng 3.14: nh hưng ca tc đ lc đn sinh trưng ca các chng 59 Bng 3.15: nh hưng ca thi gian bo qun đn sinh trưng ca các chng 63 Bng 3.16: nh hưng ca ch phm probiotics đn s lưng trng 66 Bng 3.17: nh hưng ca ch phm probiotics đn khi lưng trng 67 Bng 3.18: S con gà b nhim bnh TB trong ơ theo ngày 70
ix DANH MC CÁC HÌNH V VÀ Đ TH Đ th 3.1: Đưng tương quan tuyn tính gia A(CFU/ml) và OD625nm ca B.subtilis 44 Đ th 3.2: Đưng tương quan tuyn tính gia A(CFU/ml) và OD600nm ca L.acidophilus 45 Đ th 3.3: Đưng tương quan tuyn tính gia A(CFU/ml) và OD610nm ca S.cerevisiae 46 Đ th 3.4: Đưng tương quan tuyn tính gia A(CFU/ml) và OD625nm ca Nitrosomonas sp. 47 Biu đ 3.1: nh hưng ca thành phn MT đn sinh trưng ca B.subtilis 48 Biu đ 3.2: nh hưng ca MT nuơi cy đn sinh trưng ca L.acidophilus 50 Biu đ 3.3: nh hưng ca thành phn MT đn sinh trưng ca S.cerevisiae 51 Biu đ 3.4: nh hưng ca MT nuơi cy đn sinh trưng ca Nitrosomonas sp. 52 Đ th 3.5: nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh trưng ca các chng 54 Biu đ 3.5: nh hưng ca pH đn các chng 57 Biu đ 3.6: nh hưng ca nhit đ đn các chng 58 Biu đ 3.7: nh hưng ca tc đ lc đn sinh trưng ca các chng 60 Biu đ 3.8: nh hưng ca ch phm probiotics đn s lưng trng 66 Biu đ 3.9: nh hưng ca ch phm probiotics đn khi lưng trng 68 Biu đ 3.10: nh hưng ca ch phm probiotics đn kh năng kháng bnh ca gà đ trng 70
1 M ĐU 1. Tính cp thit ca đ tài "Probiotics là các vi sinh vt sng khi đưa mt lưng cn thit vào cơ th đem li hiu qu cĩ li cho cơ th". Các vi khun sng đưc phân lp t các chng vi khun cĩ li cho cơ th; các chng này qua thc nghim chng minh đưc tác dng cĩ li cho cơ th, khơng gây bnh, cĩ kh năng tn ti khi qua d dày ti rut khơng b tiêu dit bi acid d dày và khi lưu gi phi cĩ kh năng tn ti thi gian dài. Li ích ca vi sinh probiotics là: Đi kháng vi mm bnh probiotics kích thích tăng s lưng hng cu, đi thc bào, t bào lympho và đc tính ca vi khun là tit acid, H 2O2, lysozyme [32]; tác đng lên promoter trong quá trình tăng trưng ca đng vt bi các cht như biotin và vitamin B12[60]; tăng quá trình hp thu dinh dưng; c ch vi sinh vt gây bnh [61]; tăng cưng h thng min dch [16]; cân bng khu h vi sinh vt cho đưng rut; vi sinh probiotics khơng mang mm bnh và cht đc hi [23]. Ngày nay, khuynh hưng s dng liu pháp thay th cho liu pháp kháng sinh dùng trong điu tr bnh ngày càng đưc chú trng và phát trin, nht là nhng bnh do vi sinh vt gây ra. Cĩ th nĩi, liu pháp dùng probiotics đưc xem là liu pháp thay th khc phc đưc nhng nhưc đim ca liu pháp dùng kháng sinh mà gây nhiu phn ng ph, chi phí li cao và tình trng kháng kháng sinh ca vi sinh vt gây bnh. Ngành chăn nuơi Vit Nam đang trong quá trình phát trin theo xu hưng cơng nghip và chuyên mơn hĩa, gĩp phn rt ln vào tng sn phm nơng nghip và là mt b phn khơng th thiu trong nn kinh t quc dân. Chăn nuơi cung cp tht, sa, trng và các sn phm khác cho con ngưi. Vit Nam va tri qua cơn đi dch gia cm, nĩ khơng nhng gây thit hi nng n v kinh t cho nhiu h nơng dân và các trang tri chăn nuơi gia
2 cm qui mơ ln, mà cịn đe do các trung tâm ging gia cm. Theo Trung tâm Khuyn nơng Quc gia cho bit, tng đàn gia cm c nưc hin nay ch hi phc đưc 70% so vi trưc dch (khong 100 triu con, riêng đàn gia cm ging ch mi phc hi 60%). Vi nhiu lý do trên đ xut đ tài: “ Nghiên cu lên men các chng vi sinh probiotics và ng dng trong chăn nuơi gà”. 2. Mc tiêu ca đ tài Xây dng quy trình nuơi cy nhân ging các chng vi sinh probiotics đ ng dng trong chăn nuơi gà. Đánh giá hiu qu ca ch phm probiotics trong chăn nuơi gà đ trng. 3. Ý nghĩa khoa hc Kt qu nghiên cu ca đ tài gĩp phn làm sáng t vai trị ca vic s dng các chng vi sinh probiotics. 4. Ý nghĩa thc tin ng dng ch phm probiotics trong ngành chăn nuơi gim chi phí đu tư và thi gian chăm sĩc, gĩp phn ci thin đi sng ca nơng dân. 5. Gii hn đ tài Trong quá trình thc hin, do thi gian, trang thit b cĩ hn nên ch tin hành theo dõi mt s đi tưng vi sinh vt cĩ li và các ch tiêu cơ bn.
3 CHƯƠNG 1. TNG QUAN TÀI LIU 1.1. Tng quan v vi sinh vt probiotics T “probiotics” cĩ ngun gc t Hy Lp cĩ nghĩa là “cho cuc sng”. Tuy nhiên, đnh nghĩa v probiotics đã phát trin nhiu theo thi gian. Lily và Stillwell (1965) đã mơ t trưc tiên probiotics như hn hp đưc to thành bi mt đng vt nguyên sinh mà thúc đy s phát trin ca đi tưng khác. Phm vi ca đnh nghĩa này đưc m rng hơn bi Sperti vào đu nhng năm by mươi bao gm dch chit t bào thúc đy phát trin ca vi sinh vt (Gomes và Malcata, 2007)[40]. Parker (1974) đã áp dng khái nim này đi vi phn thc ăn gia súc cĩ mt nh hưng tt đi vi cơ th vt ch bng vic gĩp phn vào cân bng h vi sinh vt trong rut ca nĩ. Vì vy, khái nim “probiotics” đưc ng dng đ mơ t là các vi sinh vt sng gĩp phn vào cân bng h vi sinh vt rut” [51]. Đnh nghĩa chung này sau đĩ đưc làm cho chính xác hơn bi Fuller (1989), ơng đnh nghĩa probiotics cha vi sinh vt sng b tr thc ăn nh hưng cĩ li đn vt ch bng vic ci thin cân bng h vi sinh vt rut ca nĩ[22]. Khái nim này sau đĩ đưc phát trin xa hơn: “vi sinh vt sng (vi khun lactic và vi khun khác, hoc nm men trng thái khơ hay b sung trong thc phm lên men) mà th hin mt nh hưng cĩ li đi vi sc khe ca vt ch sau khi đưc tiêu hĩa nh ci thin tính cht h vi sinh vt vn cĩ ca vt ch” (Havenaar và Huis in't Veld, 1994)[36]. 1.2. Thành phn ca probiotics Thành phn ca probiotics thơng dng nht là các vi khun sinh acid lactic. S chng vi sinh vt trong mt ch phm cĩ th nhiu ít khác nhau, các chng cũng cĩ th cùng lồi hoc khác lồi. Probiotics bao gm nhng vi khun cĩ li (vi sinh vt hu ích) như vi khun lactic acid ( L.acidophillus , L.casei , L.rhamnosus , L.bulgaricus ,
4 Carnobacterium ), ging Bacillus (B.subtilis , B.licheniformis , B. megaterium , B.polymyxa , ), Actinomycetes , Nitrobacteria đưc áp dng đ hn ch s nhim bnh đi vi các vi khun gây bnh . Mt s thành phn khác cũng đưc tìm thy trong probiotics là tp hp các enzyme cĩ ngun gc vi sinh vt như amylase, protease, lipase, cellulase, chitinase, mt s vitamin thit yu và cht khống [14]. Ngưi ta cũng dùng bào t ca vi khun như mt probiotics, thưng s dng là Bacillus , Lactobacillus , nm men, Biridobacterium , Streptococcus , ít thơng dng là mt chng đc bit ca Clostridium butyricum . Ch phm cĩ tính cht probiotics gm nhng vi sinh vt sng như các vi khun thuc ging Bacillus, Lactobacillus, Saccharomyces, Nitrosomonas ngưi ta thưng trn vào thc ăn hoc nưc ung. 1.2.1. Bacillus subtilis 1.2.1.1. Đc đim sinh hc Bacillus subtilis là trc khun gram dương, sinh bào t, chiu ngang ca bào t khơng vưt quá chiu ngang ca t bào vi khun, kích thưc 0,5 2,5×1,210,0 m, sp xp thành cp hoc chui; do đĩ khi cĩ bào t vi khun khơng thay đi hình dng, bào t ca vi khun này cĩ sc sng rt lâu. Trc khun cĩ mi nơi trong t nhiên và khi điu kin sng gay go, chúng cĩ kh năng to ra bào t gn như hình cu, đ tn ti trong trng thái "ng đơng" trong thi gian dài. Loi sinh vt này cĩ cc kỳ nhiu lồi khác nhau, trong đĩ đa s là vơ hi. Bacillus subtilis dương tính vi catalase, s dng khí oxy làm cht nhn electron khi trao đi khí trong quá trình trao đi cht. Qua kính hin vi Bacillus subtilis đơn l cĩ hình dng ging nhng chic que, phn ln nhng chic que này cĩ bào t trong hình oval cĩ khuynh hưng phình ra mt đu. Thưng thì ngưi ta quan sát thy tp đồn ca ging sinh vt này rt rng ln, cĩ hình dng bt đnh và đang phát trin lan rng.
5 1.2.1.2. Đc đim sinh lý Ging Bacillus cĩ hình thc sinh sn là nhân đơi: t mt t bào m s hình thành hai t bào con. Trong s các loi vi khun thì Bacillus subtilis cĩ kh năng sinh bào t khi gp mơi trưng khơng thun li cho s sinh trưng ca chúng. Bacillus subtilis là vi khun đi kháng vi các vi sinh vt gây bnh đưng rut ngưi và gia súc đ phịng chng bnh tiêu chy (Madigan, 2001)[ 39]. 1.2.2. Lactobacillus acidophilus L.acidophilus là mt chi ln vi trên 50 lồi thuc h vi khun Lactibacillaceae . Trc khun hình thái đa dng t dài đn dng cu trc khun ngn, kích thưc 0,51,2×1,010,0 m. Thưng xp chui, đc bit giai đon sau ca pha logarit ca s phát trin thưng khơng di đng. Gram dương, âm tính vi catalase, khơng to bào t, nhu cu dinh dưng cao, ưa acid và sn phm cui cùng ca quá trình lên men cacbon là acid lactic, mơi trưng acid c ch s sinh trưng ca các vi sinh vt cĩ hi. L.acidophilus là vi sinh vt k khí khơng bt buc. Do đĩ, trong thc t khi nng đ oxy thp thì hot đng sng đưc duy trì bình thưng. Nhu cu dinh dưng phc tp địi hi aminoacid, peptid, các dn xut ca acid nucleic, các vitamin, mui, acid béo, các ester ca acid béo và cĩ th lên men các loi cacbon. Phát trin thun li trên b mt thch trong điu kin k khí và 510% CO 2. Khun lc trên mơi trưng thch cĩ kích thưc 25 mm, mt khi li, đc và khơng sc t. Khong nhit đ t 553 oC, ti ưu 3040 oC. Chu đưc mơi trưng acid, pH ti ưu thưng 5,55,8 hoc thp hơn. L.acidophilus cĩ vai trị quan trng trong s lên men ca nhiu loi thc phm, t sn phm sa và sa lên men, ngũ cc, các sn phm tht, nưc, nưc thi, bia, go, trái cây và nưc trái cây, rau c lên men, cám và bt nhào
6 chua. Lên men xy ra khi vi khun vào dung dch đưng và cacbonhydrat đ sn xut rưu, CO 2 và acid lactic. Cĩ nhiu sn phm sa lên men mà s dng L.acidophilus . L.acidophilus và các vi khun acid lactic đưc thêm vào sa đ làm gim pH. Khi sa tr thành acid, protein trong sa và coagulate đ to thành gel. Tim năng ca L.acidophilus là hot đng như mt kháng sinh đ chng bnh nhim trùng. L.acidophilus cịn kí sinh trong ming, đưng tiêu hĩa và âm đo ca nhiu lồi đng vt đng nhit trong đĩ cĩ ngưi. Vi tư cách là mt probiotic, nĩ cĩ th đưc s dng đ ngăn chn và x lý chng biotic tiêu chy, nhim khun và men tiêu hĩa nhim trùng. Mt khác nĩ cĩ th giúp cơ th đưc bo v chng li bnh ung thư và nh hưng ca các tr liu bng hĩa cht Hơn na, chúng cĩ th đưc dùng như là mt phịng chng ng đc thc ăn khi đi du lch. Vic phân loi vi khun lactic vào các chi khác nhau phn ln da trên hình thái hc, quá trình lên men cacbonhydrat, nh hưng ca nhit đ, nng đ mui, nng đ acid hoc kim, cu hình ca acid lactic, thành phn ca acid béo và các thành phn ca thành t bào. Cĩ hai con đưng lên men: Glycolysis thì acid lactic là sn phm cui cùng, 6phosphogluconate/phosphoketolase thì ngồi acid lactic cịn cĩ ethanol, acetate và CO 2. Vi khun lactic mang nhiu nhng đc tính cĩ li cho ngưi và vt nuơi: h tr tiêu hố, tăng cưng kh năng min dch, kích thích s phát trin ca vt nuơi Ngồi ra chúng cịn giúp điu tr các bnh v đưng tiêu hố như: tiêu chy, táo bĩn, lon khun Bên cnh đĩ, vi khun lactic cịn cĩ kh năng kìm hãm, c ch các vi sinh vt gây bnh: Candida albicans, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus do chúng sinh các cht: bacteriocin, acid lactic, giúp cân bng khu h vi sinh vt.[60]
7 1.2.3. Saccharomyces cerevisiae 1.2.3.1. Đc đim sinh hc “Nm men (Yeast, Levure) là loi nm đơn bào, sinh sn bng phương thc ny chi hoc t phân đơi t bào”. Nm men phân b rng rãi trong t nhiên, nht là trong các mơi trưng cĩ cha đưng, cĩ pH thp, chng hn như trong hoa qu, rau dưa, mt mía, r đưng, mt ong . Nm men S.cerevisiae đưc bit đn như mt qun th t bào sng đưc con ngưi nuơi cy t c xưa nht. Nm men thuc ging S.cerevisiae cĩ các đc đim sau: sinh sn dinh dưng bng ny chi nhiu phía; khơng to bào t bn; t bào t, nang bào t hình thoi, mi nang cha trên 2 bào t, nang bào t hình cu hoc hình trng, nang chín khĩ v; lên men glucose mnh m; khơng to thành váng sm trên nưc chit mch nha. 1.2.3.2. Đc đim hình thái và kích thưc t bào Nm men S.cerevisiae thưng cĩ cu to đơn bào, cĩ nhân tht, hình trịn, hình trng hay bu dc, hình dài hoc elip. Hình dng ca nm men hu như khơng n đnh. Nĩ ph thuc vào tui ca nm men và điu kin nuơi cy. S.cerevisiae cĩ hình bu dc nu nĩ điu kin giàu cht dinh dưng; trong điu kin ym khí nm men cĩ hình trịn, ngưc li trong điu kin hiu khí t bào kéo dài hơn. Kích thưc t bào thay đi tuỳ thuc ging, lồi, chng. T bào nm men thưng cĩ kích thưc ln gp t 5 đn 10 ln t bào vi khun. Kích thưc trung bình ca t bào nm men như sau: chiu dài: 9 10m, chiu rng: 27m. Ngồi ra kích thưc t bào nm men thay đi theo điu kin nuơi cy, theo tui sinh lý.
8 1.2.3.3. Cu to t bào T bào nm men cũng như nhiu loi t bào khác đưc cu to ch yu t các thành phn cơ bn sau: thành t bào, màng nguyên sinh cht, nhân và các cơ quan khác. 1.2.3.4. S sinh sn ca nm men Nm men S.cerevisiae cĩ 2 phương thc sinh sn đĩ là sinh sn vơ tính bng cách ny chi và sinh sn hu tính bng bào t túi. 1.2.3.4.1. Sinh sn vơ tính bng cách ny chi Ny chi là phương thc sinh sn ch yu ca nm men. điu kin thun li nm men sinh sơi ny n nhanh. Đi vi các ging nm men phát trin mnh, cĩ th quan sát thy tt c t bào đu cĩ chi, do s to chi hu như chim tồn b chu kỳ sng ca t bào nm men. Thc t c t bào m và t bào con đu cĩ th to chi mi trưc khi chúng phân chia. Đi vi các ging nm men phát trin chm hơn, thì các t bào hu như khơng hình thành chi và s to chi ch chim mt phn rt nh trong chu kỳ ca t bào. Chu kỳ này là chu kỳ phát trin ca nm men đĩ là thi gian cn thit k t lúc chi mi hình thành ti lúc t bào này phát trin và bt đu to t bào mi. Quá trình ny chi xy ra đng thi vi s bt đu ca giai đon tng hp DNA. Nhng bưc đu tiên ca quá trình hình thành chi cĩ liên quan đn hin tưng mm hố ca lp thành t bào dưi tác dng ca các enzyme lytic. Enzyme này tn cơng vào các polysaccharide ca thành t bào làm cho chi chui ra khi t bào m. Vt cht mi đưc tng hp s đưc huy đng đn chi và làm cho chi phình to dn lên. Kích thưc ca chi tăng dn lên đn khi chi đt kích thưc ln nht thì mt vách ngăn cĩ cu to phc tp đưc hình thành ti phn c ca chi, vách ngăn này trong thành phn cĩ cha chitin, mannan và glucan. Quá trình phân tách ch hồn thành khi các lp vách ngăn này tách ra và nĩ đ li trên t bào m vt so chi và trên t bào con vt so sinh.
9 Mi khu vc trên thành t bào ch to đưc duy nht mt chi non. Mi khi cĩ t bào mi đưc tách ra thì mt so chi mi li đưc hình thành trên t bào m và do đĩ bng cách đm so chi chúng ta cĩ th xác đnh đưc s lưng chi đã đưc sinh ra trên mi t bào riêng bit. Bng cách này chúng ta cĩ th xác đnh đưc đ trưng thành ca t bào. 1.2.3.4.2. Sinh sn hu tính Bào t túi ca S.cerevisiae thưng cĩ hình dng khác nhau cĩ th là hình cu, hình bu dc, v nhn khơng màu. S.cerevisiae sinh sn đơn tính to thành bào t t t bào riêng l khơng thơng qua tip hp, bào t này khi gp điu kin thích hp s phát trin thành t bào mi. T bào này li tip tc ny chi. Đu tiên tng cp bào t đơn bi kt hp ngay trong túi xy ra s phi hp t bào cht và nhân, t bào lưng bi sinh ra s ny mm và chui qua màng túi. T bào này li sinh sn theo cách ny chi. Sau đĩ nhân bên trong t bào phân ct gim nhim. T bào bin thành túi cha bn bào t túi, và c sinh sn như vy. S. cerevisiae t bào dinh dưng đơn bi sinh sn theo cách ny chi. Sau đĩ 2 t bào kt hp vi nhau xy ra quá trình giao cht và giao nhân to thành t bào dinh dưng lưng bi. T bào ny chi và sinh ra t bào lưng bi khác và sau đĩ chuyn thành bào t túi. Nhân phân ct gim nhim và sinh ra bn bào t túi ri chuyn thành t bào dinh dưng và tip tc sinh sn bng cách ny chi. 1.2.3.5. Tính cht sinh lý, sinh hố Nm men là ví d đin hình ca vi sinh vt hiu khí tuỳ tin. Trong điu kin đ oxy, nm men s phát trin tăng sinh khi là ch yu, cịn rưu khơng trc tip to thành hoc to thành rt ít. Phương trình xy ra trong hơ hp hiu khí: C6H12 O6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2O + Q
10 Quá trình hơ hp hiu khí tri qua quá trình phosphoryl hố và tip tc đi vào chu trình Krebs. đây oxy phân t đưc s dng như mt cht nhn electron cui cùng và glucose b oxy hố hồn tồn thành nưc và CO 2. Ngưc li khi thiu oxy quá trình hơ hp ym khí xy ra và hot đng lên men là ch yu. Nm men khơng cĩ kh năng chu đưc mơi trưng cĩ đ acid cao nên acid pyruvic sinh ra sau con đưng đưng phân ngay lp tc chuyn đi thành CO 2 và acetaldehyte và cui cùng thành rưu etylic. C6H12 O6 2C 2H5OH + 2CO 2 Da vào đc đim trên và mc đích thu nhn sn phm mà cĩ th điu khin quá trình trao đi cht ca nm men.[1] Vách t bào cha mannan và glucan cĩ tác dng hot hĩa đi thc bào, do đĩ giúp tăng cưng min dch. Hp ph đc t và bài thi ra ngồi. Sn xut enzyme tiêu hĩa và các acid hu cơ đưa pH rut xung 45. Vi cu to ca thành t bào nm men là β1,3glucan cĩ th chng mt s bnh khi chúng đưc b sung và cĩ vai trị như vaccine. Chúng hot đng như đi thc bào.[26] 1.2.4. Nitrosomonas sp. Nitrosomonas khơng sinh bào t, t bào nh bé hình bu dc, kích thưc khong 0,51,5m, hiu khí; đưc tìm thy trong đt, nưc thi và các khu vc b ơ nhim cĩ nng đ các hp cht cha nitơ cao; cĩ kh năng chuyn đng và cĩ tiên mao dài cc. pH ti ưu ca Nitrosomonas là 6,09,0 và nhit đ là 30 oC. Trên mơi trưng lng, Nitrosomonas tri qua mt s pha, phát trin tùy thuc điu kin. Hai pha ch yu là pha di đng t bào cĩ mt hay chùm tiên mao và pha tp đồn khun keo các t bào khơng di đng. Ngun cacbon duy nht trong mơi trưng là CO 2 cĩ trong khơng khí và trong thành phn ca CaCO 3. Nguyên liu năng lưng và ngun nitơ cho vi
11 khun giai đon đu là quá trình nitrate hố NH 3 và mui amơn, giai đon hai là nitrite. + 2 NH 3 + 3/2 O 2 → H + NO + H 2O Vi khun nitrate hĩa khơng s dng các cht hu cơ và chuyn hĩa mt cách cht ch đi vi vic oxy hĩa cơ cht NH 3 thành nitrite. Chúng cĩ vai trị quan trng trong x lý cht thi, nưc thi cơng nghip và trong quá trình x lý sinh hc. 1.3. Tiêu chí chn la vi sinh vt probiotics Cĩ kh năng bám dính vào niêm mc đưng tiêu hĩa ca vt ch. Khơng sinh cht đc, khơng gây bnh cho vt ch. Sinh các enzyme hoc các sn phm cui cùng mà vt ch cĩ th s dng đưc. D nuơi cy, cĩ kh năng tn ti đc lp trong mt thi gian dài. Cha s lưng ln các t bào sng. Chu đưc pH thp d dày và mui mt rut non. Cĩ kh năng sng khi đưc đĩng gĩi và đưa vào s dng. Cĩ mùi v chp nhn đưc khi s dng. Khi s dng cn chú ý đn nhit đ. 1.4. Cơ ch tác đng ca probiotics 1.4.1. Tác đng kháng khun Làm gim s lưng vi khun gây bnh đ ngăn chn các mm bnh bng nhiu cơ ch khác nhau: Tit ra các cht kháng khun gm các acid hu cơ, H 2O2, bacterioxin cĩ kh năng c ch vi khun gram (+), gram (). Cnh tranh vi các ngun bnh v trí bám dính vào đưng rut. Cnh tranh dinh dưng cn thit cho s sng sĩt ca mm bnh. Tác đng kháng đc t.
12 1.4.2. Tác đng biu mơ rut Đy mnh s liên kt cht ca nhng t bào biu mơ. Gim vic kích thích bài tit và nhng hu qu do b viêm ca s lây nhim vi khun. Đy mnh s to ra các phân t phịng v như cht nhy. 1.4.3. Tác đng min dch Probiotics như là phương tin phân phát các phân t kháng viêm cho đưng rut. Đy mnh s báo hiu cho t bào ch đ làm gim đáp ng viêm. To đáp ng min dch đ làm gim d ng. Kháng nguyên ca probiotics kích thích t bào niêm mc rut sn sinh kháng th. 1.4.4. Tác đng đn vi khun đưng rut Probiotics giúp to s cân bng tm thi ca h sinh thái đưng rut. Điu này ph thuc vào cơng dng và liu lưng ca ging vi khun. Vi sinh probiotics điu hịa hot đng trao đi cht ca sinh vt đưng rut. 1.4.5. Tác đng tăng kh năng hp th thc ăn Tăng lưng thc ăn ăn vào và kh năng tiêu hĩa: chúng tham gia vào s trao đi cht dinh dưng như cacbon, protein, lipid và khống. 1.5. Vai trị ca probiotics 1.5.1. Đi vi vt nuơi Kích thích tiêu th trit đ ngun thc ăn hơn và làm gim bt s ri lon tiêu hĩa. Đy mnh s tng hp vitamin B. Bo v chng li Escherichia coli , Salmonella và s lây nhim nhng vi khun khác. Ci thin s dung np lactose.
13 Ci thin chc năng min dch. Nâng cao kh năng hp th thc ăn, làm gim h s thc ăn, rút ngn thi gian nuơi. Tăng t l sng và tăng năng sut. Gim chi phí s dng thuc kháng sinh và hĩa cht trong vic điu tr bnh. Giúp ngăn chn nhng ch loét trong h thng tiêu hĩa. 1.5.2. Đi vi con ngưi Tăng hiu qu kinh t và gim thi gian lao đng cho ngưi chăn nuơi, gim ơ nhim mơi trưng. 1.6. Mt s lưu ý khi s dng probiotics Khơng s dng cùng lúc vi các loi hĩa cht và kháng sinh. Nu đã s dng kháng sinh thì sau khi ngưng s dng 35 ngày nên trn vào thc ăn các loi probiotics hoc các loi men vi sinh, luân phiên s dng 5 ngày, sau đĩ ngưng 5 ngày đi vi loi ch phm trn vào thc ăn. Cn lưu ý đn điu kin bo qun các probiotics các nơi cung cp, tránh nơi cĩ ánh nng trc tip. Bên cnh đĩ xem trong thành phn cĩ cha các nhĩm vi sinh vt cĩ li hay khơng, cn xem k các cơng dng và hưng dn s dng đ tùy trưng hp c th ca chung tri gia cm mà s dng đt hiu qu cao. 1.7. Yu t nh hưng đn hiu qu ca probiotics Tình trng dinh dưng và sc khe ca đi tưng s dng. S hin din ca yu t gây stress. S khác bit v di truyn, tui gia các đi tưng s dng. Sc sng và tính n đnh ca probiotics. Liu và s ln s dng. Tương tác vi thuc khác.[14]
14 1.8. Cơng ngh lên men 1.8.1. Ging vi sinh vt Mun cĩ sn phm tt ngồi quy trình cơng ngh thì khâu ging là quan trng nht, nĩ quyt đnh cht lưng sn phm và giá tr kinh t ca quy trình sn xut. Tiêu chun ca ging: vi sinh vt tt; cĩ kh năng sinh tng hp to sinh khi vi hiu sut cao; cĩ kh năng s dng các nguyên liu r tin, d kim như các ph phm, các ph thi; trong quá trình lên men khơng to ra các sn phm ph khơng mong mun; ít mn cm đi vi s tp nhim do vi sinh vt khác; sn xut sinh khi cĩ th tách d dàng ra khi mơi trưng dinh dưng. Tuy nhiên trong quá trình sn xut, các tiêu chun trên khơng phi gn lin vi nhau. Các vi sinh vt thuc nhĩm Eukaryote cĩ kích thưc t bào ln th hình si, do đĩ d dàng tách chúng ra khi mơi trưng dinh dưng bng phương pháp lc ly tâm thơng thưng. Nhưng chúng thưng tn ti mt quy tc chung là kích thưc t bào t l nghch vi hot tính trao đi cht. Các cơng vic ch yu ca cơng tác ging trong sn xut: kim tra đ thun khit ca ging trong lên men; kim tra kh năng hi bin ca ging; hot hĩa ging sau mt thi gian s dng; gi ging bng phương pháp thích hp cĩ th duy trì nhng hot tính ưu vit ca chúng, chng thối hĩa, mt hot tính. Các phương pháp gi ging: Hin nay thưng s dng bn phương pháp chính đ gi ging vi sinh vt đĩ là: ▪ Bo qun trên mơi trưng thch bng, đnh kỳ kim tra cy truyn Ging vi sinh vt đưc gi trên mơi trưng thch nghiêng (đi vi các ging vi sinh vt hiu khí) hoc trích sâu vào mơi trưng thch (đi vi vi sinh vt k khí). Các ng ging đưc bo qun trong t lnh nhit đ 24oC.
15 Đnh kỳ kim tra cy truyn ging, tùy tng ging vi sinh vt khác nhau mà đnh kỳ cy truyn khác nhau, song gii hn ti đa là 3 tháng. ▪ Gi ging trong cát hoc đt sét vơ trùng Do cu trúc hĩa lý cát vá sét là nhng cơ cht tt mang các t bào vi sinh vt, ch yu là nhĩm vi sinh vt cĩ bào t. Cách làm như sau: cát và sét đưc x lý sch, sàng lc qua rây, x lý pH đt trung tính, sy khơ và kh trùng. Sau đĩ bng thao tác vơ trùng trn bào t và cơ cht cát hoc sét trong các ng nghim. Dùng paraffin nĩng chy pht lên nút bơng ca ng nghim đ giúp cho ng ging khơng b m tr li. Ngồi cát và sét, ngưi ta cịn gi ging trong ht ngũ cc hay trên silicagen . Phương pháp bo qun ging trên ch yu cho nm mc và x khun. ▪ Gi ging bng phương pháp lnh đơng Bng phương pháp này da trên nguyên tc c ch s phát trin ca vi sinh vt, đưa chúng vào điu kin lnh sâu 25 oC đn 70 oC. Ngưi ta trn vi sinh vt vi dung dch bo v hay cịn gi là dung dch nhũ hĩa như glycerin 15%, huyt thanh nga (loi khơng cho cht bo qun), dung dch glucose hoc lactose 10% Vic làm lnh đưc tin hành mt cách t t. Khi đ lnh đt 20 oC, nu tip tc làm lnh thì tc đ làm lnh phi đt 1 2oC/phút. Phương pháp bo qun này cĩ ưu đim là bo qun đưc lâu. ▪ Gi ging bng phương pháp đơng khơ V nguyên tc cũng ging như phương pháp đơng lnh nhưng khác ch là đưa cht bo v vào như glutamate 3% hay lactose 1,2% + peptone 1,2% hay saccharose 8% + sa 5% + gelatin 1,5%. Đây là phương pháp bo qun ti ưu nht hin nay, cĩ th ti vài chc năm mi phi làm li. 1.8.2. Nhân ging vi sinh vt Mc đích ca vic nhân ging là đ tăng s lưng t bào vi sinh vt. Trong quy trình lên men thì tùy chng ging vi sinh vt khác nhau mà nhân
16 theo cơ cht và mơi trưng nhân khác nhau, thưng cĩ hai dng ging: t bào sinh dưng và bào t. Trưng hp ging là t bào sinh dưng: đ thu đưc lưng t bào sinh dưng, ngưi ta chn mơi trưng nhân sinh khi là mơi trưng đm bo cho vi sinh vt tn ti thích hp nht, đ vi thi gian ngn nht cho sinh khi vi sinh vt ln nht, thưng dùng mơi trưng dch th (nuơi cy chìm). Trưng hp ging là bào t: thơng thưng chn mơi trưng đc (nuơi cy bán rn như cám go, bt ngơ, thĩc, ). Khi kt thúc mi khâu nhân ging cn kim tra ngay đ thun ca ging và mt đ t bào vi sinh vt cn nhân. 1.8.3. Lên men Là giai đon nuơi cy vi sinh vt đ chúng to sn phm hoc sinh khi vi sinh vt . Đây là khâu quyt đnh mt quy trình lên men. Ngưi ta thưng s dng hai phương pháp lên men là lên men b mt và lên men chìm. 1.8.3.1. Lên men b mt Lên men b mt là thc hin nuơi cy vi sinh vt trên b mt mơi trưng dch th hoc bán rn. Nuơi cy trên b mt dch th (dùng cho nhĩm vi sinh vt hiu khí): tùy tng loi vi sinh vt mà chn mơi trưng thích hp. Khi cho mơi trưng vào thit b lên men phi đm bo cĩ b mt thống, rng. Nuơi cy theo phương pháp này đơn gin nhưng địi hi din tích s dng ln, khĩ t đng quy trình sn xut nên hin nay phương pháp này ít đưc s dng. Nuơi cy b mt s dng mơi trưng bán rn: cĩ th dùng vi sinh vt hiu khí, hoc bán hiu khí, k khí. phương pháp lên men này nguyên liu thưng dùng là: ht go, đu tương, mnh sn, mnh ngơ, bã mía, rơm r, Các loi nguyên liu cha tinh bt trưc khi s dng phi x lý bng cách nu chín. Ngồi các nguyên liu nĩi trên ngưi ta phi b sung các cht
17 dinh dưng vào mơi trưng đ đm bo dinh dưng ca vi sinh vt trong quá trình nhân sinh khi (lên men). Đi vi vi sinh vt hiu khí cn phi cĩ qut thi khí vơ trùng. Trong lên men bán rn, ngồi yêu cu v nguyên liu thì đ m rt cn thit cho quá trình lên men, phi luơn luơn đm bo đ m 6075% (đ m khơng khí 90100%). 1.8.3.2. Lên men chìm Áp dng cho c vi sinh vt hiu khí và k khí. Khi lên men chìm, vi sinh vt đưc nuơi cy mơi trưng dch th s phát trin theo chiu đng ca ct mơi trưng. ►Đ thc hin quá trình lên men chìm cn thc hin tng bưc sau: Thc hin quá trình khuy đo và sc khí. Theo dõi s to bt trong lên men và bin pháp phá bt. Điu chnh pH ca mơi trưng lên men. Theo dõi và điu chnh nhit đ ca mơi trưng lên men. Tip thêm nguyên liu và b sung các cht tin th. Trng thái t bào ca chng ging dùng trong quá trình lên men và đ tp khun. Kim tra s tiêu hao năng lưng, s to thành trong quá trình lên men. Điu cui cùng cũng là quan trng nht đĩ là xác đnh thi gian ca quá trình lên men. ►Thu hi sn phm: khi quá trình lên men kt thúc ngưi ta tin hành thu hi sn phm. Các sn phm ca quá trình tng hp vi sinh vt thưng đưc tích lũy trong t bào hoc trong dung dch nuơi cy [7].
18 1.9. Các dng ch phm vi sinh vt (VSV) 1.9.1. Ch phm nhân nuơi trên mơi trưng thch bng Loi ch phm này đưc sn xut trong phịng thí nghim ln, dùng mơi trưng dinh dưng ca Fred (1932). Ch phm sau khi xut xưng thưng đưc đng trong các chai l thu tinh. Ưu đim là: khun lc VSV thưng nhìn thy đưc, do đĩ cĩ th loi b đưc ngay tp khun bng mt s hố cht cĩ sn trong phịng thí nghim mà khơng cn phi chun b các nguyên liu đt tin. Tuy nhiên loi ch phm VSV này cĩ nhiu hn ch đĩ là: s lưng VSV chuyên tính ít, thi gian bo qun và s dng ngn, vn chuyn xung cơ s sn xut khơng thun tin do đng trong các chai l thu tinh d v. 1.9.2. Ch phm VSV dng dch th Ch phm VSV dng dch th đưc sn xut trong phịng thí nghim hoc trong nhà máy, xí nghip theo quy trình cơng ngh lên men. Theo đĩ cn cĩ h thng máy lc ln hoc ni lên men cĩ h thng điu khin tc đ khí đ to sinh khi ln. Sau đĩ dch VSV đưc đĩng vào chai l hoc bình nha. Loi ch phm VSV này tin li ch khơng cn phi pha hoc trn vi nưc mà cĩ th trn luơn vào ht ging. Cũng cĩ th ly tâm dch vi sinh đ cơ đc sinh khi qua đĩ h giá thành sn phm. Tuy nhiên loi ch phm VSV này cĩ nhng hn ch đĩ là: Ch phm phi luơn bo qun điu kin lnh vì vy khá tn kém và khơng thun li cho vic vn chuyn. Chi phí sn xut ch phm thưng tương đi cao vì dng c cha đng đt tin. Gn đây mt s cơ quan nghiên cu, trin khai (NifTALHoa Kỳ, DOA – Thái Lan, ICRISAT n Đ ) đã nghiên cu thành cơng cơng ngh sn xut ch phm vi sinh vt dng lng, trong đĩ quá trình nhân sinh khi VSV đưc gn lin vi vic x lý sao cho mt đ VSV sau khi lên men luơn đáp ng yêu cu ca tiêu chun quy đnh, nghĩa là đt mc t hàng trăm triu đn hàng t VSV trong 1 ml. Ngồi ra, ngưi ta cũng
19 li dng kh năng sinh bào t, bào nang ca mt s VSV đ sn xut các ch phm VSV dng lng, trong đĩ sau quá trình lên men mt s hố cht chuyn hố tim sinh hoc mt s k thut bc ch oxy, đin th oxy hố kh hoc điu kin dinh dưng đưc áp dng làm cho VSV chuyn t dng sinh dưng sang dng tim sinh. Ch phm VSV dng lng sn xut theo cơng ngh mi đã khc phc đưc các nhưc đim ca ch phm dch th kiu cũ và đang đưc áp dng rng rãi ti nhiu nưc như M, Nht, Canada, Úc và Vit Nam. 1.9.3. Ch phm VSV dng khơ Năm 1965 Scolt và Bumganer đã ch to đưc mt loi ch phm dng khơ. Cách làm như sau: sinh khi VSV đưc cho vào bình sc khí đ đui ht nưc, sau đĩ li tâm đ tách VSV chuyên tính ra khi cơ cht và cho hp ph vào cht mang là bt cao lanh, sau đĩ cho hp th tip vào CaSO 4 hoc NaSO 4 đ thu đưc ch phm VSV dng khơ. Loi ch phm VSV dng khơ cĩ ưu đim là ct tr, vn chuyn rt tin li, d dàng, ch phm khơng b nhim tp, s dng trong thi gian dài (> 1 năm). Nhưng cơng ngh sn xut loi ch phm VSV này phc tp, tn kém, do đĩ hiu qu kinh t khơng cao. 1.9.4. Ch phm VSV dng đơng khơ Ch phm VSV dng đơng khơ đưc sn xut t nhng năm 19401960 M, Úc, Nga. Đ sn xut loi ch phm này sau khi lên men, sinh khi VSV đưc đơng khơ li nhit đ rt thp (20÷ 40 oC). Loi ch phm VSV này cĩ nhiu ưu đim như ít b nhim tp ngay c khi nhit đ rt cao, đ sng sĩt ca VSV chuyên tính rt cao. Ch phm cũng cĩ hn ch, đĩ là t l bám dính và đ sng sĩt ca VSV rt thp đng thi sn xut rt cơng phu và tn kém.
20 1.9.5. Ch phm dng bt cht mang Hin nay hu ht các nưc trên th gii đu sn xut loi ch phm VSV trên nn cht mang, trong đĩ sinh khi VSV đưc tm nhim vào cht mang là các hp cht hu cơ hoc khơng hu cơ t nhiên hoc tng hp cĩ tác dng là nơi trú ng và bo v VSV chuyên tính trong ch phm t khi sn xut đn khi s dng. Cht mang cn cĩ nhng đc đim sau: Kh năng hút nưc cao: 150200%. Hàm lưng cacbonhydrat hu cơ cao, tt nht >60%. Khơng cha các cht đc hi đi vi VSV tuyn chn. Hàm lưng mui khống khơng vưt quá 1%. Kích thưc ht phù hp vi đi tưng s dng. Loi cht mang thưng đưc s dng là bã mía, lõi ngơ nghin, v tru, v cà phê, bt sn, mùn cưa làm cht mang cho ch phm VSV. Loi ch phm trên nn cht mang cĩ ưu đim là: quy trình sn xut đơn gin, d làm, khơng tn kém nhiu dn đn giá thành h, nguyên liu sn cĩ trong t nhiên, mt đ VSV chuyên tính trong ch phm cao, chuyên ch d, tin s dng, đ bám dính ca VSV trên đi tưng s dng cao. Tuy nhiên ch phm dng cht mang bt cũng cĩ nhng nhưc đim như: d b tp nhim bi VSV khơng chuyên tính, cht lưng khơng n đnh, đ sng sĩt ca VSV trong ch phm khơng cao. Nu khơng s dng kp thi, thì ch phm cĩ th b loi b hàng lot vì khơng đm bo mt đ VSV chuyên tính.[7] ► Khái nim v men vi sinh Trong nhng năm gn đây, phong trào chăn nuơi đang phát trin mnh theo hưng thâm canh, đ bn vng địi hi phi cĩ gii pháp tt trong qun lý chung tri và sinh vt nuơi. Hin cĩ xu hưng dùng VSV hay dn xut ca chúng trong chăn nuơi đ khng ch dch bnh, ci thin dinh dưng vt nuơi và ci thin mơi trưng sng. Hin cĩ nhiu loi men vi sinh khác nhau lưu hành trên th trưng và tên gi ca chúng cũng phân loi khơng hồn tồn
21 chính xác. Thut ng “probiotics” đưc dùng khá ph bin nhưng nhiu trưng hp vn chưa chính xác. Các khái nim và tên gi v vic các sn phm cha vi sinh vt đưc gi tên khác nhau tùy vào chc năng hoc là tác dng ca chúng. Vai trị và cơ ch tác đng ca men vi sinh và giá tr tht ca nĩ cũng chưa đưc đánh giá đy đ, phn ln cơ ch đưc suy din da trên các nghiên cu trên ngưi và đng vt. Song mt s cơ ch cũng đã đưc báo cáo và cĩ th là mt trong nhng cơ ch sau: Tit ra các hp cht c ch: cĩ rt nhiu nghiên cu chng minh rng cĩ nhiu dịng vi khun invitro hãm đưc các mm bnh trong chăn nuơi. Nhng nghiên cu này cũng chng minh kh năng kìm hãm vi khun ca nhng dịng vi khun thơng thưng d tìm thy trong mơi trưng (Fuller, 1989). Nhng qun th sinh vt này cĩ th tit vào mơi trưng nhng cht cĩ tính sát khun hoc kìm khun gây nh hưng đn qun th sinh vt khác, nhm gián tip cnh tranh dinh dưng và năng lưng cĩ sn trong mơi trưng. S hin din nhng vi khun này sn sinh cht kìm hãm, cĩ th tit trong rut, trên b mt cơ th vt ch làm rào cn s nhân lên ca vi khun cơ hi gây c ch các VSV gây bnh. Trong sn xut nhng dịng vi khun cĩ kh năng tit ra cht kìm hãm mm bnh đưc ng dng trong các nghiên cu v VSV hu ích. Sn phm cĩ th là cht kháng sinh, siderophores, men phân hy, H 2O2, acid hu cơ, (Sugita et al., 1997) [58]. Thành phn cht tit ra khĩ cĩ th xác đnh đưc nên đưc gi chung là cht c ch. Vi khun lactic t lâu đưc bit là loi tit ra cht kháng vi khun (bacteriocin) chng li các vi khun Gram (+) (khơng chuyên bit). Phn ln các vi khun gây bnh là nhĩm Gram (). Vì vy, tác đng c ch ca vi khun lactic trong b hn ch nhưng nĩ là vi khun khơng cĩ hi và là đi tưng cnh tranh ch cư trú. Nhiu vi khun khác cũng tit ra cht c ch chng li các vi khun gây bnh như Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus (Nair et al.,1985) [46].
22 Cnh tranh dinh dưng và năng lưng: Nhiu qun th vi sinh vt cùng tn ti trong cùng mt h sinh thái thì s cĩ s cnh tranh v dinh dưng và năng lưng. Cnh tranh trong gii vi sinh vt ch yu là xy ra nhĩm d dưng như cnh tranh các cht hu cơ mà ch yu là ngun cacbon và năng lưng. RicoMora (1998) đã cho mt dịng vi khun đưc chn lc cĩ kh năng phát trin trên mơi trưng nghèo hu cơ. Tác gi cy vi khun này vào b nuơi to khuê cùng vi Vibrio alginolyticus thì vi khun Vibrio này khơng phát trin và th nghim invitro khơng thy cĩ s c ch. Do đĩ chng t vi khun đưc chn lc cnh tranh ln át Vibrio trong điu kin nghèo hu cơ. Do vy nhng dịng vi khun chn lc s cĩ ưu th trong vic cnh tranh năng lưng và dinh dưng [55]. Cnh tranh nơi cư trú: Cnh tranh ch bám trong rut ca vt ch cĩ nh hưng rt quan trng đn sc kho ca vt ch. Vic bám dính đưc vào lp màng nhy ca rut là rt cn thit đ vi khun thit lp qun th trong h rut ca cá (Olsson et al., 1992, Westerdahl et al., 1992)[62]. Kh năng bám dính lên thành rut là tiêu chun la chn đu tiên ca vi khun hu ích. S bám dính trên màng rut cĩ th là chuyên bit (các đim hay các phân t tip nhn), khơng chuyên bit (da trên các yu t hĩa lý). Kh năng bám dính và s tăng trưng trên b mt hay là trong lp màng nhy ca thành rut đã đưc th nghim trong ng nghim đi vi vi khun gây bnh trên cá như Vibrio anguillarum và Aeromonas hydrophila (Garcia et al., 1997) và dịng vi khun hu ích s dng trong thí nghim là Carnobacterium K1 (Jưborn et al., 1997) và vài dịng vi khun phân lp cĩ kh năng kìm hãm vi khun Vibrio anguillarum (Olsson et al., 2004)[49]. Ci thin cht lưng mơi trưng: Ci thin cht lưng mơi trưng là mt cơ ch tác đng ca “vi sinh vt hu ích” trong chăn nuơi khi đưa vi sinh vt hu ích vào mơi trưng giúp ci thin cht lưng mơi trưng mà khơng cĩ tác đng trc tip lên cơ th vt nuơi, thưng liên quan đn các nhĩm Bacillus
23 (Verschuere et al., 2000)[61]. Nhĩm vi khun Gram (+) thưng phân hy vt cht hu cơ thành CO 2 tt hơn nhĩm Gram (). Duy trì mt đ vi khun Gram (+) trong chung nuơi s hn ch đưc s tích lũy vt cht hu cơ trong chung trong sut quá trình nuơi, n đnh qun th VSV nh s sn sinh CO 2 t quá trình phân hy các vt cht hu cơ. Ci thin cht lưng mơi trưng là mt trong nhng vai trị quan trng ca vi khun hu ích trong chăn nuơi. Cht lưng mơi trưng cĩ liên quan mt thit đn quá trình hp th và gii phĩng các cht làm bin đi cht lưng mơi trưng, đc bit là s hp th và gii phĩng dinh dưng ca vt nuơi. Ngồi ra phi cung cp đy đ cht dinh dưng đa lưng và vi lưng. Vũ Ngc Út (2008) cho rng s tác đng ca “probiotics” lên vt ch theo hai hưng cĩ li và cĩ hi. Nhng tác đng cĩ li: th nht là ngăn chn vi khun cĩ hi do to các cht kháng khun, cnh tranh thc ăn và khơng gn vi các loi vi khun cĩ hi. Th hai là tương tác vi quá trình trao đi cht ca vt ch hay h sinh vt trong cơ th vt ch vi quá trình enzym h tr cho tiêu hố, gim lưng ammonia hay nhng enzym đc hi và ci thin chc năng ca thành rut. Th ba là ci tin phn ng min dch ca vt ch theo do nng đ kháng th gia tăng và tăng s lưng đi thc bào. Th tư là ci thin mơi trưng, các vi khun cĩ li phân hu các cht hu cơ cĩ t thc ăn dư tha, các cht bài tit và cĩ th ngăn nga s phát trin ca vi khun gây bnh, giúp gim ơ nhim. Ngồi nhng nh hưng cĩ li, nhng tác đng cĩ hi là cnh tranh các cht dinh dưng (glucose và các acid amin) vi vt ch. Vi sinh vt thuc nhĩm Bacillus nh mơi trưng thích hp (va nêu trên) s phát trin s lưng rt ln, cnh tranh s dng ht thc ăn ca nguyên sinh đng vt, các VSV cĩ hi, ngăn cn s phát trin ca chúng. Nh đĩ mà hn ch s dng các hố cht và thuc kháng sinh, gim thay nưc trong quá trình nuơi, gĩp phn ci thin cht lưng mơi trưng sng.[13]
24 1.10. Tình hình nghiên cu 1.10.1. Trên th gii Kháng sinh đưc s dng t chin tranh th gii ln II, và cĩ vai trị như mt loi thuc đ điu tr bnh cho ngưi và đng vt. Chúng đưc s dng rng rãi nhiu quc gia đ ngăn nga mt s bnh và tăng trưng trong chăn nuơi [20]. Nhiu trưng hp, con ngưi quá lm dng kháng sinh trong y hc, cơngnơng nghip đã xut hin vi khun kháng kháng sinh. T đĩ liu pháp mi ra đi là dùng vi sinh probiotics [59]. Nghiên cu vai trị ca vi sinh vt trong ch phm probiotics đã đưc quan tâm mt s nưc trên th gii. H đã nghiên cu và ng dng trong chăn nuơi gia cm, gia súc, thc phm, . Probiotics là các vi sinh vt sng, an tồn và cĩ li cho sc khe ca con ngưi, gia súc, gia cm và mơi trưng. Bao gm các nhĩm vi sinh vt sau: Bacillus , Streptococcus , Lactobacilli , Leuconostoc , Lactococcus , Saccharomyces , [48]. Fumiaki Abe và Norio Ishibashi (1995) đã nghiên cu cho bê và heo con ung vi khun Bifidobacteria và vi khun Lactic . Kt qu cho thy nhĩm gia súc x lý cĩ tăng trng cao hơn nhĩm đi chng, sau 56 ngày tui bê cĩ khi lưng là 31,8kg so vi đi chng cĩ s dng kháng sinh b sung là 25,4kg. Hiu sut s dng thc ăn nhĩm bê cĩ x lý là 2,07 (kg thc ăn/ kg tăng trng) thp hơn so vi nhĩm đi chng là 2,37. S con mc bnh tiêu chy là 1/45con so vi đi chng là 7/45 con. Thí nghim trên heo con, kt qu cho thy: sau 28 ngày tui heo con lơ thí nghim cĩ tăng trng là 5,7 kg so vi đi chng là 4,8 kg và sau 56 ngày tăng trng là 17,3 kg so vi đi chng là 14,5 kg. H s tiêu th thc ăn là 2,16 so vi đi chng là 2,21 kg. Đc bit t l heo con sng là 95% so vi lơ đi chng là 75%.[24] Châu Á đã cĩ nhiu nghiên cu s dng các ch phm vi sinh trong nuơi tơm, đc bit Thái Lan. Jiravanichpaisal & ctv (2007) đã s dng Lactobacillus sp. trong nuơi tơm sú ( P. monodon Fabrius ).[35]
25 Nm men và nm mc cũng đưc s dng đ ci thin t l sng và năng sut u trùng tơm Litopenaeus vannamei (Intriago et al., 1993).[29] Nhng nhà khoa hc t vin nghiên cu thc phm Norwich, nưc Anh báo cáo là nhng probiotics đc bit cĩ th tiêu dit mm bnh vi khun sng rut gia cm, do đĩ giúp loi b mi đe da s ng đc thc phm vi khun t chui thc ăn. S dng probiotics trong nuơi trng thy sn s hn ch dùng mt lưng ln cht kháng sinh và hĩa cht vào ao nuơi thy sn. Đc bit là hn ch đáng k kh năng gây bnh ca mt s vi khun cĩ hi trên đi tưng nuơi đây là bin pháp tăng hiu qu sn xut cĩ ý nghĩa thc tin khơng ch ci thin cht lưng nưc, gim lưng dùng kháng sinh, gim mm bnh trong ao mà cịn cĩ th nâng cao năng sut nuơi và cht lưng ca sn phm. Salah Mesalhy Alya (2008) ng dng thành cơng các vi khun cĩ li mà c th là nhĩm vi khun Bacillus subtilis và Lactobacillus acidophilus trong nuơi cá rơ phi nhm đ hn ch mm bnh do vi khun A.hydrophila gây ra.[56] Vi khun Vibrio là mt thm ha do ngh nuơi tơm Philippine, khi vic s dng kháng sinh đ tr khơng cịn tác dng nhiu ngưc li cịn cĩ th làm cho vi khun kháng thuc, mà xa hơn na là vi khun cĩ nhiu kh năng gây bnh đn con ngưi nu s dng quá liu lưng. Vì lý do đĩ mà probiotics đưc ng dng rng rãi cho ngh nuơi tơm Philippine, nghiên cu cho thy rng cĩ th cu sng 80% tơm bnh khi trong ao nuơi cĩ s dng ch phm sinh hc (Moriarty, 1997).[45] Probiotics đĩng vai trị rt quan trng trong nuơi thy sn. Nhưng vic s dng probiotics cịn ph thuc nhiu vào s am hiu v bn cht ca các VSV cĩ ích và đc đim sinh hc ca đi tưng vt nuơi (Balcázar et al., 2008).[17] Mơ hình nuơi thu sn thâm canh thưng tích lũy nhiu vt cht hu cơ đáy ao do thc ăn dư tha, phân và các cht thi khác ca thu sinh vt làm mơi trưng sng ca vt nuơi b ơ nhim to điu kin cho mm bnh bc
26 phát gây thit hi ln trong nuơi thu sn. Khơng ch vy bào t Bacillus cũng đưc s dng như mt tác nhân sinh hc giúp gim bnh Vibrio trong h thng nuơi thu sn (Skjermo và Vadstein, 2000)[57]. Ba chng vi khun lactic đưa vào mơi trung nuơi luân trùng dùng làm thc ăn cho cá bơn (Gatesoupe, 1991)[25]. Meunpol et al., (2002) s dng probiotic vi dịng vi khun Bacillus S11 trn vào thc ăn viên cơng nghip cho u trùng tơm sú ăn. Sau khi cho ăn thc ăn trn probiotic trong 1 tháng thì cy vi khun Vibrio harveyi ri xc ozone vào tng b (0,333 0,341 mg O 3/ml). T l sng ca tơm đưc xác đnh sau 6 ngày đt cao nht 75% so vi nghim thc đi chng t l sng ch cĩ 18%.[44] 1.10.2. Trong nưc ng dng trong lĩnh vc nơng nghip là sn xut thc ăn chăn nuơi. Mt s vi sinh vt cĩ kh năng sn xut probiotics cĩ tác dng điu hồ h thng vi sinh vt trong đưng tiêu hố và ngưi ta đã li dng đc tính này ca vi sinh vt đ sn xut các ch phm probiotics làm thc ăn b sung trong chăn nuơi.[7] Hin nay Vit Nam đang đy mnh vic nghiên cu đ sn xut probiotics dùng trong chăn nuơi và nuơi trng thy sn. Tuy nhiên sn phm tinh ch thì giá thành cịn cao nên nưc ta hin nay vn s dng ngun nguyên liu ch yu là các loi ph phm ca ngành nơng nghip. Do đĩ giá thành ca probiotics gim xung nhiu và cũng giúp cho vt nuơi tiêu hĩa tt hơn, gim t l bnh và gĩp phn ci thin mơi trưng. Vi sinh vt gây bnh nh hưng rt ln đn năng sut và tính n đnh trong chăn nuơi. Đ kim sốt vi sinh gây hi, phương pháp truyn thng là dùng các hĩa cht dit khun và kháng sinh, tuy nhiên các hĩa cht dit khun như Chlorin ngồi vic làm tăng mt đ Vibrio sau khi s dng, các dn xut ca chlorin cịn là nhng cht gây đt bin và ung thư như: chloroform
27 (CHCl 3), bromodichloromethane (CHBrCl 2), dibromodichloromethane (CHBrCl 2), và bromoform (CHBr 3). Các loi kháng sinh to ra các chng kháng kháng sinh, các plasmid mã hĩa cho cho các gen kháng kháng sinh s truyn t vi sinh vt gây bnh gia cm sang các vi sinh vt gây bnh cho đng vt và ngưi. Vì l đĩ ngày nay nhiu loi kháng sinh đã b cm s dng trong chăn nuơi gia cm nưc ta. Ngày nay probiotics đưc s dng khá hiu qu đ phịng bnh cho ngưi và gia súc, gia cm trên cn. Ti Vit Nam chăn nuơi gia cm ch yu theo phương pháp truyn thng vi quy mơ gia đình. Theo s liu ưc tính s gia cm quy mơ h gia đình đĩng gĩp hàng năm khong 550.000 USD hay 0.5% tng s GDP ca Vit Nam (Otte et al., 2002).[50] Tình hình s dng kháng sinh trong chăn nuơi Vit Nam là đáng báo đng. Nguyn Như Pho (2003) điu tra cho thy trong chăn nuơi heo cĩ s dng ti 19 loi kháng sinh khác nhau và lưng tn dư kháng sinh trong tht heo vưt quá tiêu chun cho phép là 65% chăn nuơi heo cơng nghip và 42% chăn nuơi h gia đình [6]. Đinh Thin Thun (2003) điu tra 628 cơ s chăn nuơi ti Bình Dương cho thy cũng cĩ trên 26 loi kháng sinh đưc s dng. Đc bit chloramphenicol đưc s dng vi tn s cao nht 17,91%, đây là kháng sinh b cm do gây suy tu dn đn t vong. Điu này nh hưng rt ln đn sc khe ca ngưi tiêu dùng. T l tn dư trong tht heo, gà ti Bình Dương là 45,63%, mc đ tn dư cao hơn tiêu chun t 2,516,6 ln và tn dư chloramphenicol là cao nht (65,62% s mu). Đây thc s là con s đáng báo đng và các nhà khoa hc, nhà qun lý cn cĩ bin pháp qun lý, chn chnh thc trng này [8]. Đưc ng dng trong ch bin thc phm cĩ li cho sc khe như sa chua, phomat, kem. Các sn phm probiotics này cĩ cha vi sinh vt cĩ li cho đưng tiêu hĩa, giúp hp th thc ăn tt hơn và ci thin sc khe. Theo
28 t chc Y t th gii, thc phm probiotics là các sn phm thc phm cĩ cha vi sinh vt sng vi lưng t bào đ đm bo mang li li ích cho sc khe. Điu này cĩ nghĩa thc phm chc năng phi đm bo mc đ sng và hot lc trao đi cht ca sinh khi đ tin hành thy phân trong h tiêu hĩa. Do đĩ, phi đưc đm bo tt c các giai đon trong quá trình ch bin thc phm, cũng như đm bo mc đ sng sĩt ca vi khun trong đưng tiêu hĩa. Do nhiu yu t, mt phn ln lưng vi sinh vt cĩ li trong đưng rut b gim hay b tiêu dit như b tiêu chy, s dng kháng sinh trong cha bnh, điu này nh hưng trc tip đn kh năng hot đng ca h tiêu hĩa như thy phân đưng lactose trong sa, gim kh năng hp th thc ăn ca cơ th và gim tính đ kháng ca cơ th. Cơ th cn b sung mt lưng đ ln sinh khi vi khun cĩ li nhm ci thin sc khe. Theo các nghiên cu trưc đây, probiotics là nhng ch phm vi sinh vt sng khi hp thu vào cơ th mang li li ích sau: Ci thin h thng min dch cơ th: thc phm chc năng probiotics cĩ th gĩp phn ci thin h thng min dch ca cơ th, làm tăng hàm lưng globulin. S hp th thc phm probiotics ci thin rõ rt sc đ kháng ca cơ th. Tăng cưng hiu qu ca mt s vaccin như vaccin thương hàn. Kìm hãm s phát trin ca mm bnh và ci thin h thng min dch ca d dày và gim nguy cơ nhim mt s mm bnh ph bin như Salmonella và Shigella. Chng d ng: thc phm probiotics gĩp phn chng li đưc mt s d ng ca cơ th, cung cp nhiu cht quan trng cho cơ th như folic acid, niacin, riboflavin và vitamin B6, B12. Chng ung thư: nhiu nghiên cu đã cho thy vi sinh probiotics cĩ th làm gim nguy cơ ung thư rut kt. Ngồi ra cĩ tác dng kh cht đc gây ung thư cĩ trong cơ th và làm chm s phát trin ca các khi u bưu.
29 Mt s tác dng khác: probiotics cĩ tác dng làm gim nng đ cholesterol trong huyt thanh. Ngồi ra, giúp nhanh chĩng bình phc sau khi mc các bnh tiêu chy và s dng nhiu kháng sinh. ng dng probiotics vào trong ch bin nưc qu m ra mt hưng nghiên cu nhm đa dng hĩa sn phm, tăng cht lưng và to ra nhng sn phm đ ung cĩ li cho sc khe. Vin Nghiên cu Rau Qu đang tp trung nghiên cu và tin ti đưa ra th trưng và to ra nhng sn phm đ ung mi đáp ng nhu cu th hiu và cĩ li cho sc khe cho ngưi s dng trong nưc, đng thi hưng ti xut khu.[15] Bùi Cơng Trc (2003) s dng ba ch phm Paciflor, Pacicoli và Acid pak. Kt qu cho thy ch phm Paciflor ( Bacillus cereus ) làm gim t l heo tiêu chy 24,6% và tăng hiu qu kinh t lên 30% so vi đi chng.[11] Tính kháng khun ca probiotics đưc ng dng nhiu nht trong cơng ngh thc phm cũng như trong dưc phm. S dĩ các vi khun này cĩ kh năng kháng khun tt là do trong quá trình trao đi cht đã to ra các sn phm cĩ tính kháng khun như acid hu cơ (acid lactic và acid acetic), hydroperoxide, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, acetoine, CO 2, reuterin, reutericyclin và bacteriocin Các sn phm trao đi cht này chính là "vũ khí" kháng khun ca probiotics.[34] ▪ Kh năng kháng khun ca các acid hu cơ: các acid hu cơ đưc sinh ra bi vi khun lactic ch yu là acid lactic và acid acetic, các acid này gĩp phn gim pH tiêu dit các vi khun cĩ hi ví d như vi khun Escherichia coli, Clostridium perfringens, Staphilococcus aurius Do ni bào vi khun cĩ pH = 7 nên khi cĩ s chênh lch pH so vi mơi trưng acid bên ngồi, H + t mơi trưng s đi vào bên trong t bào vi khun làm pH ni bào gim. Vi khun phi s dng cơ ch bơm ATPase đ đy H + ra khi t bào làm cho vi khun b mt năng lưng. Mt khác pH gim thì cũng c ch quá trình đưng phân (glycolysis), t bào vi khun cn kit năng lưng dn đn b
30 tiêu dit. Ngồi ra, các anion ca acid cịn gây ri lon s thm thu ca màng t bào. Nhng nguyên nhân này làm cho vi khun b cht.[3] ▪ Kh năng kháng khun ca bacteriocin: bacteriocin là cht kháng khun cĩ bn cht là protein đưc riboxom tng hp t các chui peptit hoc protein c vi khun gram âm và vi khun gram dương. Bacteriocin cĩ tác dng kháng khun đi vi các vi khun gây thi ra và các mm bnh trong thc phm ph bin là vi khun Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus . ▫ Bacteriocin đưc chia thành 4 nhĩm: Nhĩm I là nhĩm lantibiotic, là polypeptit cĩ trng lưng phân t 30KDa, nhĩm IV là các bacteriocin phc tp, ngồi thành phn chính là protein chúng cịn cha lipid và cacbonhydrat. ▫ Cơ ch tác đng bacteriocin rt đa dng, nĩ cĩ th làm bin đi các enzym, c ch s sn sinh bào t, chúng xâm nhp vào t bào làm mt lc đy proton, làm gim th năng ca màng nguyên sinh cht và thay đi pH ni bào do đĩ to ra các l thng khơng th khc phc đưc dn đn t bào b phá v. ▫ Trong cơng ngh thc phm, nisin là bacteriocin đưc nghiên cu và ng dng rng rãi nht trong ch bin và bo qun mt s loi thc phm như phomat, xúc xích, sa chua, mt s loi sn phm tht, rau qu đĩng hp Trong y dưc, bacteriocin cịn đưc ng dng như mt ch phm sinh hc đ điu tr mt s bnh như viêm đưng tit niu, hay nhim trùng đưng tiêu hố Ngồi ra, reuterin và dn xut ca reutericyclin cũng cĩ th c ch các vi khun gram âm và gram dương, nm và đng vt nguyên sinh như giun, sán Các diacetyl, acetaldehyde và acetoin cũng cĩ tác dng kìm hãm đi vi các vi sinh vt cĩ hi ngay c nng thp.[4]
31 Vi khun hu ích đĩng vai trị quan trng trong nuơi trng thy sn, đc bit là liên quan đn sn xut sơ cp, phân hy cht hu cơ, ci thin cht lưng nưc trong ao. Chúng cịn chuyn hĩa các cht đc như ammoniac và hp cht nitơ. Trong thy vc, các vt cht hu cơ khơng ngng b phân hy bi các vi sinh vt vì chúng cn các hp cht này đ làm thc ăn. Các cht hu cơ đưc chúng hp th làm tin cht cho vic xây dng cu trúc cơ th và to năng lưng cho các hot đng sng. Khi y, hp cht hu cơ đưc vi sinh vt bin đi thành các cht nghèo năng lưng và cui cùng trong nhng điu kin thích hp thì chuyn hĩa ngưc li thành các cht vơ cơ ban đu đưc gi là quá trình vơ cơ hố. Quá trình này s tái to tr li vịng tun hồn trong thy vc, to nên s sinh trưng mi ca thc vt. Nu khơng cĩ vi sinh vt phân hy hu cơ thì tồn b quá trình chuyn hĩa vt cht trong thy vc s ngng li và s sng s khơng tn ti đưc. (Đng Th Hồng Oanh, 2005).[12] Vic s dng vi khun đưng rut cĩ li trong thc ăn cho ngưi và đng vt trên cn đã đưc bit đn nhiu. Lactobacillus acidophilus đưc s dng ph bin đ kim sốt và phịng bnh do các vi sinh vt mm bnh trong ng tiêu hĩa ca nhiu đng vt trên cn. Vi khun Lactobacillus rhamnosus cĩ trong yaourt giúp tăng kh năng tiêu hĩa và kháng li vi khun cĩ hi trong đưng rut. Lý thuyt kim sốt sinh hc đã đưc áp dng trong nuơi trng thy sn. Nhiu nhà khoa hc đã c gng s dng mt s loi probiotics trong nuơi thy sn đ điu khin qun th vi to ca nưc trong ao, kim sốt vi sinh vt gây bnh, đ tăng cưng s phân hy các hp cht hu cơ dư tha và ci thin mơi trưng ao nuơi. Ngồi ra, vic s dng probiotics cĩ th gia tăng qun th các sinh vt làm thc ăn, ci thin mc dinh dưng ca các lồi thy sn nuơi và tăng cưng kh năng min dch ca vt nuơi vi mm bnh. Như vy, đnh nghĩa ca probiotics đi vi nuơi trng thy sn đưc m rng, nĩ bao gm c vic b sung vi khun sng vào ao nuơi, nhng vi khun cĩ li
32 này s ci thin thành phn vi sinh vt ca nưc và nn đáy nhm ci thin cht lưng nưc. Probiotics đưc gi đnh là gia tăng tình trng sc khe ca vt nuơi bng vic loi tr các mm bnh hoc hn ch ti đa tác hi trc tip ca mm bnh. Vi khun probiotics cĩ th bám vào b mt bên ngồi ca vt ch hay đi vào trong rut hoc trc tip t nưc hoc qua thc ăn hay qua nhng ht cĩ th tiêu hĩa đưc. Hơn na, s dng probiotics s gĩp phn làm gim s dng hĩa cht, kháng sinh trong phịng và tr bnh cho tơm cá nuơi. Đk Lk là mt tnh cĩ tim năng to ln trong phát trin nơng nghip. Sn xut nơng nghip chim ti 70% GDP. Trong nhng năm gn đây, chăn nuơi đang cĩ chuyn bin tích cc. Nhiu trang tri chăn nuơi theo hưng cơng nghip đang đưc phát trin gĩp phn đáng k thay đi cơ cu nơng nghip. Chăn nuơi ca tnh đang theo hưng phát trin vi qui mơ trang tri va và nh. Thc trng chăn nuơi gà Đk Lk cũng khơng nm ngồi thc trng chung ca Vit Nam hin nay là lm dng kháng sinh và cht thi chăn nuơi gây ơ nhim mơi trưng, nh hưng đn sc khe ca ngưi tiêu dùng. Bng 1.1: Tình hình chăn nuơi gia cm Đk Lk trong 10 năm (20002009) ĐVT: 1000 con Năm 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 Gia 2.849 3.090 3.864 4.543 4.560 4.481 3.514 3.479 5.836 6.279 cm T l 108 125 117 100 98 78 99 167 107 (%) (Ngun: Niên giám thng kê Đk Lk 2009)
33 CHƯƠNG 2. NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 2.1. Ni dung nghiên cu Nghiên cu mơ t đc đim sinh hc ca mt s chng vi sinh probiotics. Nghiên cu quy trình lên men các chng vi sinh probiotics và ch phm probiotics. Nghiên cu hiu qu ca vic s dng ch phm probiotics trong chăn nuơi gà đ trng. 2.2. Phương pháp nghiên cu 2.2.1. Đi tưng và vt liu 2.2.1.1. Đi tưng nghiên cu Mt s vi sinh vt đi din trong ch phm probiotics là: Bacillus subtilis , Lactobacillus acidophilus , Saccharomyces cerevisiae , Nitrosomonas sp. thu thp t Vin Sinh hc Nhit Đi. Gà đ trng – ging Chibi – Thái Lan, 19 tun tui. 2.2.1.2. Mơi trưng nuơi cy Mơi trưng cao thtpeptone nuơi cy Bacillus subtilis vi cơng thc: cao tht 3g, peptone 10g, NaCl 5g, agar 15g, nưc ct 1000 ml, pH 6,0.[9] Mơi trưng MRS nuơi cy Lactobacillus acidophilus : glucose 20g, peptone 10g, cao tht 10g, cao nm men 5g, Naaxetate.3H 2O 5g, Na 3PO 4 2g, ammonium citrate 2g, tween 80 1g, MgSO 4.7H 2O 0,2g, MnSO 4.4H 2O 0,05g, agar 15g, nưc ct 1000ml, pH 6,2.[52] Mơi trưng Hansen nuơi cy Saccharomyces cerevisiae : glucose 50g, peptone 10g, KH 2PO 4 3g, MgSO 4 3g, agar 20g, nưc ct 1000 ml, pH 6,0.[9] Mơi trưng Winogradski phân lp Nitrosomonas sp.: (NH 4)2SO 4 2g, K2HPO 4 1g, MgSO 4.7H 2O 0,5g, FeSO 4.7H 2O 0,4g, NaCl 2g, nưc ct 1000
34 ml, CaCO 3 1g (cn lưu ý chn nhng ht CaCO 3, vì xung quanh ht này t l vi khun cao nht).[10] Kh trùng mơi trưng 1atm, trong thi gian 30 phút. 2.2.1.3. Thit b và đa đim nghiên cu Thit b: ni hp vơ trùng, bung cy vi sinh, t lnh, t sy, t m, kính hin vi, máy ct nưc, máy quang ph UV/Vis, máy lc, pH meter, cân phân tích, . Đa đim nghiên cu: ● Phịng thí nghim B mơn Sinh hc thc vt Khoa Nơng lâm Trưng Đi hc Tây Nguyên. ● Tri gà xã EaKao, Tp. Buơn Ma Thut. 2.2.2. Phương pháp phân lp và bo qun mu 2.2.2.1. Phân lp vi sinh vt Phân lp vi sinh vt là quá trình tách riêng các lồi vi sinh vt t qun th ban đu. 2.2.2.1.1. Nguyên tc Tách ri các t bào vi sinh vt. Nuơi cy các t bào trên trong mơi trưng dinh dưng đc trưng đ cho khun lc riêng r, cách bit nhau. 2.2.2.1.2. Quá trình phân lp vi sinh vt dng thun khit Vi hu ht các loi mu nghiên cu, quá trình phân lp vi sinh vt dng thun khit gm các bưc cơ bn: To ra các khun lc riêng r t qun th vi sinh vt ban đu (mu dng lng). + Tip tc pha lỗng nng đ cn thit. + Cy mu trên mơi trưng đc trưng ca nĩ. Phân lp các vi sinh vt trên mơi trưng đc đĩa peptri.
35 +Hút 0.1 ml dch mu đã pha lỗng cho vào đĩa peptri cĩ mơi trưng thích hp. + Dùng que gt thy tinh phân phi dch mu tri đu khp mt thch, ta s nhn đưc các khun lc riêng r. Kim tra đ tinh khit ca ging mi phân lp. + Kim tra vt cy: Quan sát s sinh trưng ca vi sinh vt qua vt cy trên mơi trưng đc. • Nu vt cy cĩ b mt và màu sc đng đu, thun nht chng t ging mi phân lp tinh khit thì gi li. • Nu vt cy khơng đng nht thì loi b. + Kim tra li đ thun chng ca các khun lc • Chn các khun lc riêng r trên mơi trưng thch nghiêng. • Tách các khun lc này ra và hịa tan, pha lỗng nng đ cn thit trong nưc ct vơ trùng. • Nh 1 git dch trên vào đĩa peptri cĩ mơi trưng. • Dùng 1 que gt phân phi git dch đu khp mt thch đĩa peptri. • Đt đĩa peptri trên vào t m vi nhit đ và thi gian thích hp tùy loi vi sinh vt. • Sau ly ra quan sát các khun lc riêng r. S thun khit ca khun lc là biu hin s thun khit ca ging.[10] 2.2.2.2. Phương pháp mơ t đc đim hình thái, đc đim sinh hc Mơ t các đc đim sinh hc, hình thái ca các lồi dưi kính hin vi. Sau khi nuơi cy 24h tin hành quan sát khun lc đơn dưi kính lúp đ xác đnh hình dng, cu trúc, màu sc, mt ct ngang.[2] Làm tiêu bn vi thuc nhum methyl blue và quan sát t bào bng kính hin vi quang hc đ phĩng đi 100×10.
36 Bacillus subtilis (dương tính vi catalase) và Lactobacillus acidophilus (âm tính vi catalase). Vi khun cĩ enzyme catalase đ phân hy H 2O2, đây là phn ng giúp phân bit hai vi khun này. • Trên mt lame sch, đt mt git nưc oxy già (H 2O2). • Dùng dây cy ly chính xác khun lc cn th đt vào git oxy già. • Nu cĩ bt khí si lên là catalase dương tính, ngưc li là âm tính. Nitrosomonas sp. • Mơi trưng đã hp kh trùng và b sung 1ml mu cy, 30 oC trong 48h. • Ly vài tinh th diphenylamine hịa tan trong 1 git H 2SO 4 đm đc. Sau đĩ thêm mt git dch cn kim tra. Tin hành trên bn s trng s thy xut hin màu xanh thm. 2.2.2.3 Bo qun và gi ging Bo qun và gi ging thí nghim bng cách cy truyn trong đĩa peptri và ng thch nghiêng. Dùng que cy hơ trên ngn la đèn cn, đ ngui, sau đĩ gt nh lên khun lc ri ria lên mt thch ca đĩa và ng theo nhng hình dng khác nhau. Dùng nút bơng đã kh trùng ming ng, đu ng đưc gĩi kín bng giy báo đã đưc kh trùng. Ghi ngày tháng cy lên đĩa và ng, sau đĩ đ vào t m 30 oC. Sau 12 ngày, khi khun lc đã mc đu và mnh, gĩi bc ng ging và đ vào t lnh khong 04oC. Các ng ging cĩ th gi đưc trong thi gian là 12 tháng và phi cy truyn gi ging trong khong thi gian đĩ.[9] 2.2.3. Phương pháp phân tích đnh lưng vi sinh vt Hút chính xác 100 l mu, cho vào đĩa peptri (cĩ mơi trưng đc trưng + agar) vơ trùng và tri đu trên b mt thch. Thc hin pha lỗng mu trong dung dch NaCl 0,5%. Các dng c tin hành thí nghim đu vơ trùng và mi thao tác đưc thc hin trong điu kin vơ trùng. Thí nghim thc hin ba đ pha lỗng liên tip, mi đ pha lỗng thc hin 3 đĩa peptri. Thí nghim
37 lp li hai ln, 12 ngày, đm khun lc xut hin trên các đĩa cĩ s khun lc t 10 đn 100. Lưng vi sinh vt cĩ trong mu đưc tính như sau: N A(CFU/ml(g))= n1Vf 1+ .+n iVfi Trong đĩ: A (Colony Forming Unit/ml): đơn v hình thành khun lc trong 1 ml mu. N: tng s khun lc đm đưc trên các đĩa đưc chn. V: th tích mu cy vào mi đĩa (ml). ni: s lưng đĩa cy ti đ pha lỗng th i. fi: đ pha lỗng tương ng. ►Phương pháp pha lỗng dung dch Chun b ng nghim: ly đ ng nghim cho mc đích pha lỗng. Ra sch ng nghim và sy kh trùng 160 oC trong 1 gi. Đt ng nghim vào bung cy vơ trùng và bt đèn cc tím trong 30 phút. Hút 9 ml nưc mui sinh lý vơ trùng cho vào các ng nghim. Hút 1 ml dung dch mu cho vào ng nghim th nht, lc đu. Sau đĩ, hút 1 ml dch t ng th nht sang ng th hai ri lc đu và c như vy tip tc hút sang các ng tip theo cho đn nng đ cn pha. Khi đưc dung dch cĩ nng đ cn thit ta tin hành cy tri lên các đĩa peptri. ►Phương pháp chun b ging thí nghim Chun b các bình tam giác cha 100 ml mơi trưng nuơi cy đã kh trùng đ hot hĩa ging. Dùng que cy ly ging t các ng ging đưa vào các bình tam giác, lc đu bng tay hoc bng máy lc đ hot hĩa ging trong 24 gi nhit đ phịng 2830 oC. Ging hot hĩa này đưc s dng cho các thí nghim trong quy trình nuơi cy. Lưu ý: Tt c các dng c đu phi vơ trùng và mi thao tác phi đưc thc hin trong box cy vơ trùng. Phương pháp đo đ đc bưc sĩng 625 nm.
38 2.2.4. Phương pháp nghiên cu xây dng quy trình nuơi cy các chng vi sinh probiotics Các thí nghim nh hưng ca điu kin ngoi cnh đn sinh trưng và phát trin ca vi sinh vt. * Thí nghim 1: nh hưng ca mơi trưng nuơi cy Bng 2.1: nh hưng ca thành phn MT đn sinh trưng ca B.subtilis MT1B MT2B MT3B Cao tht 3g Cao tht 3g Cao tht 3g Bacillus Peptone 10g CO(NH 2)2 10g (NH 4)2SO 4 10g subtilis NaCl 5g NaCl 5g NaCl 5g Nưc ct 1000ml Nưc ct 1000ml Nưc ct 1000ml Bng 2.2: nh hưng ca thành phn MT đn sinh trưng ca L.acidophilus MT1L MT2L MT3L Glucose 20g Glucose 20g Glucose 20g Peptone 10g CO(NH 2)2 10g (NH 4)2SO 4 10g Cao tht 10g Cao tht 10g Cao tht 10g Cao nm men 5g Cao nm men 5g Cao nm men 5g Naaxetate.3H 2O Naaxetate.3H 2O Naaxetate.3H 2O 5g 5g 5g Lactobacillus Na 3PO 4 2g Na 3PO 4 2g Na 3PO 4 2g acidophilus Ammonium citrate Ammonium citrate Ammonium citrate 2g 2g 2g Tween 80 1g Tween 80 1g Tween 80 1g MgSO 4.7H 2O 0,2g MgSO 4.7H 2O 0,2g MgSO 4.7H 2O 0,2g MnSO 4.4H 2O MnSO 4.4H 2O MnSO 4.4H 2O 0,05g 0,05g 0,05g Nưc ct 1000ml Nưc ct 1000ml Nưc ct 1000ml
39 Bng 2.3: nh hưng ca thành phn MT đn sinh trưng ca S.cerevisiae MT1S MT2S MT3S Glucose 50g Maltose 50g Shaccarose 50g Peptone 10g Peptone 10g Peptone 10g Saccharomyces KH 2PO 4 3g KH 2PO 4 3g KH 2PO 4 3g cerevisiae MgSO 4 3g MgSO 4 3g MgSO 4 3g Nưc ct 1000 Nưc ct 1000 Nưc ct 1000 ml ml ml Bng 2.4: nh hưng ca thành phn MT đn sinh trưng ca Nitrosomonas sp. MT1N MT1’N MT2N MT2’N (NH 4)2SO 4 (NH 4)2SO 4 NaNO2 1g NaNO2 2g 2g 4g K2HPO4 0,5g K2HPO4 0,5g K2HPO 4 1g K2HPO 4 1g MgSO 4.7H 2O MgSO 4.7H 2O MgSO 4.7H 2O MgSO 4.7H 2O 0,3g 0,3g Nitrosomonas 0,5g 0,5g Na2CO3 1g Na2CO3 1g sp. FeSO 4.7H 2O FeSO 4.7H 2O NaCl 0,5g NaCl 0,5g 0,4g 0,4g FeSO 4 0,1g FeSO 4 0,1g NaCl 2g NaCl 2g Nưc ct 1000 Nưc ct 1000 Nưc ct Nưc ct ml ml 1000 ml 1000 ml Nuơi cy trên các mơi trưng khác nhau, lp li 3 ln đ tìm mơi trưng ti ưu cho s sinh trưng và phát trin ca các chng. * Thí nghim 2: nh hưng ca thi gian nuơi cy Sau khi tìm đưc mơi trưng ti ưu. Vi bình tam giác 250ml cĩ cha 49 ml mơi trưng tương ng, hp kh trùng 121 oC, 1atm, 30 phút. B sung vào mi bình tam giác 1 ml dung dch ging đã hot hĩa. Tin hành theo dõi vi
40 các khong thi gian nuơi cy: 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 96h vi ba ln lp li. Tin hành đo đ đc vi các bưc sĩng tương ng. * Thí nghim 3: nh hưng ca pH Vi mơi trưng và thi gian sinh trưng thích hp, tin hành chun đ pH ca mơi trưng bng cách s dng máy đo pH meter và hĩa cht chun đ là KOH 1N và HCl 1N. Thí nghim nh hưng ca pH vi 7 cơng thc và ba ln lp li: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 8,0; 8,5. Dùng bình tam giác 250ml cĩ cha 49 ml mơi trưng tương ng, hp kh trùng 121 oC, 1atm, 30 phút. B sung vào mi bình tam giác 1 ml dung dch ging đã hot hĩa. * Thí nghim 4: nh hưng ca nhit đ Vi mơi trưng, thi gian nuơi cy và pH thích hp. Thí nghim vi 5 cơng thc (20 oC, 25 oC, 30 oC, 35 oC, 40 oC) và 3 ln lp li. Dùng bình tam giác 250 ml cha 49 ml mơi trưng đã hp kh trùng 121oC, 1atm, 30 phút và b sung 1 ml dung dch ging đã hot hĩa. * Thí nghim 5: Nghiên cu nh hưng ca tc đ lc đn sinh trưng ca các chng Điu kin nuơi cy khác là ti ưu t các thí nghim trên. Tin hành nghiên cu nh hưng ca tc đ lc vi 5 cơng thc (0, 100, 150, 200, 250 rpm) và 3 ln lp li. Dùng bình tam giác 250 ml cha 49 ml mơi trưng đã hp kh trùng 121 oC, 1atm, 30 phút và b sung 1 ml dung dch ging đã hot hĩa. Ch tiêu theo dõi: mt đ t bào CFU/ml. Phương pháp theo dõi mt đ t bào theo phương pháp đo đ đc và đm khun lc trên đĩa. * Thí nghim 6: nh hưng ca thi gian bo qun đn hot tính và mt đ t bào ca ch phm probiotics: Thí nghim theo dõi mt đ t bào sng tin hành đnh kỳ (mt tháng mt ln liên tip trong 6 tháng), hồ tan 1g ch phm trong 100 ml dung dch nưc mui NaCl 0,1% vơ trùng ri pha lỗng nhiu nng đ khác nhau (10 510 8) tri 1ml dch pha lỗng lên mơi trưng dng đĩa
41 thch. Sau 3648h tin hành phân tích mt đ vi sinh vt bng cách đm s lưng khun lc hình thành trên đĩa thch theo phương pháp ca Koch vi 3 ln lp li. Ch tiêu theo dõi: mt đ t bào CFU/g. 2.2.5. Phương pháp nghiên cu nh hưng ca ch phm probiotics trong chăn nuơi gà Thành phn thc ăn ca gà đ trng là: bt bp, lúa nghin, nưc ging. Thí nghim gm 3 lơ: Lơ thí nghim 1: đi chng (khơng b sung ch phm probiotics). Lơ thí nghim 2(CT1): b sung 0,5g ch phm probiotics trong 50kg thc ăn vi mt đ 5,3×10 10 CFU/g. Lơ thí nghim 3(CT2): b sung 1,0g ch phm probiotics trong 50kg thc ăn vi mt đ 5,3×10 10 CFU/g. ► Mi cơng thc tương ng vi 1 lơ và 3 ln lp li, s lưng con cho mi lơ là 500 con. Các ch tiêu theo dõi: S lưng trng: đm s trng các lơ thí nghim trên ngày. Khi lưng trng: cân trng mi lơ thí nghim theo ngày (kg/300 qu trng). S con gà b nhim bnh: đm trên tng lơ theo ngày. 2.2.6. Phương pháp x lý thng kê Các s liu đưc x lý thng kê theo phn mm MSTATC version 2.10 ca Đi hc bang Michigan. Các s liu đưc phân tích ANOVA và đưc trc nghim phân hng LSD value vi mc ý nghĩa 0,01 và 0,05. Đ th và phương trình tương quan gia ch s mt đ quang OD và s khun lc trên đĩa đưc x lý trên phn mm EXCEL 2003 ca Microsoft, các biu đ khác cũng đưc x lý trên phn mm này.
42 CHƯƠNG 3. KT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 3.1. Nghiên cu mơ t đc đim sinh hc ca mt s chng vi sinh probiotics 3.1.1. Đc đim hình thái khun lc ca các chng vi sinh probiotics Đ mơ t đc đim sinh hc ca các chng, chúng tơi s dng mơi trưng ti thiu đ nuơi cy: MT Cao thtpeptone ( B.subtilis ), MT MRS (L.acidophilus ), MT Hansen ( S.cerevisiae ), MT Winogradski I ( Nitrosomonas sp.). Quan sát hình thái ca khun lc và hình thái t bào ca vi sinh vt. Đc đim hình thái khun lc ca 4 chng vi sinh probiotics đưc mơ t bng 3.1. Bng 3.1: Hình thái khun lc ca 4 chng vi sinh vt Hình thái khun lc sau 48h nuơi cy Th E. Các chng Hình Kích ĐT Màu MC B Đ Cu màu vi cata dng thưc QH sc N mt đc trúc diphenyl lase amine 1,5 Trng Ht Khơng Bacillus subtilis Trịn Đc Li Trơn Nht + mm ngà nh màu Lactobacillus 2,5 Ht Khơng Trịn Đc Trng Li Trơn Nht acidophilus mm ln màu Ăn Saccharomyces G Bt Ht Khơng Trịn 3mm Đc Trng vào cerevisiae gh nhão ln màu thch Nitrosomonas 0,5 Trng Ht Xanh Trịn Đc Li Trơn Nht sp. mm bc nh thm
43 3.1.2. Đc đim sinh hc ca các chng vi sinh probiotics Bn chng vi sinh probiotics đưc cy ria trên đĩa peptri. Sau 3648h làm tiêu bn đ quan sát trên kính hin vi. Tiêu bn t bào đưc quan sát vt kính 40×, 100×. Bng 3.2: Hình thái t bào ca 4 chng vi sinh probiotics Hình thái t bào sau 48h nuơi cy Chng Hình dng Kích thưc B. subtilis Hình que 34 m L. acidophilus Hình que 67 m S. cerevisiae Hình ovan 56 m × 23 m Nitrosomonas sp. Hình que 45 m 3.1.3. Mi tương quan gia đ đc (ch s OD) và s lưng t bào (CFU/ml) Trong nghiên cu này, theo dõi mt đ t bào theo phương pháp đo đ đc và đm khun lc trên đĩa. Do đĩ vic dng đưng chun và phương trình tương quan gia ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) là cn thit cho các đánh giá sau này cũng như cĩ th so sánh kt qu ca nghiên cu này vi các nghiên cu khác. Thí nghim kim tra mt đ t bào theo thi gian sinh trưng ca B.subtilis bi phương pháp đo đ đc và đm khun lc trên đĩa. Nuơi cy và kim tra mt đ theo thi gian 12h, 24h, 36h và 48h. Kt qu đưc th hin qua bng 3.3. Bng 3.3: Ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) B.subtilis Thi gian (h) OD 625nm S lưng t bào (CFU/ml) 12 0,056 2,8×10 9 24 0,190 9,6×10 9 36 0,471 1,2×10 10 48 0,559 1,7×10 10 Đưng chun và phương trình tương quan gia ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) đưc th hin qua đ th 3.1.
44 y = 4E11x 0.0697 R2 = 0.8867 0.6 0.5 0.4 0.3 Series1 0.2 Linear (Series1) OD625nm 0.1 0 0 5E+09 1E+10 1.5E+10 2E+10 A (CFU/ml) Đ th 3.1: Đưng tương quan tuyn tính gia A(CFU/ml) và OD625nm ca B.subtilis Theo đ th 3.1, phương trình tương quan gia ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) là: y = 4E11x – 0,0697 Trong đĩ: x là s lưng t bào (CFU/ml). y là ch s OD. Tương t cũng xây dng đưc đưng tương quan tuyn tính gia ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) ca L.acidophilus theo thi gian sinh trưng. Kt qu thu đưc bng 3.4 và đ th 3.2. Bng 3.4: Ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) L.acidophilus Thi gian (h) OD 600nm Tng mt đ khun lc (CFU/ml) 12 0,054 3,1×10 9 24 0,194 1,0×10 10 36 0,485 1,4×10 10 48 0,700 2,0×10 10
45 y = 4E11x 0.1115 R2 = 0.952 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Series1 0.3 Linear (Series1) OD600nm 0.2 0.1 0 0 5E+09 1E+10 1.5E+1 2E+10 2.5E+1 0 0 A (CFU/ml) Đ th 3.2: Đưng tương quan tuyn tính gia A(CFU/ml) và OD600nm ca L.acidophilus Theo đ th 3.2, phương trình tương quan gia ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) là: y = 4E11x – 0,1115 Trong đĩ: x là s lưng t bào (CFU/ml). y là ch s OD. Thí nghim kim tra mt đ t bào ca S.cerevisiae cũng đưc tin hành theo phương pháp đo đ đc và đm khun lc trên đĩa, tương t chúng tơi thu đưc kt qu bng 3.5. Bng 3.5: Ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) S.cerevisiae Thi gian (h) OD 610nm Tng mt đ khun lc (CFU/ml) 12 0,089 3,8×10 9 24 0,196 8,5×10 9 36 0,521 1,1×10 10 48 0,536 1,7×10 10
46 y = 4E11x 0.0341 R2 = 0.7883 0.7 0.6 0.5 0.4 Series1 0.3 Linear (Series1) OD610nm 0.2 0.1 0 0 5E+09 1E+10 1.5E+10 2E+10 A (CFU/ml) Đ th 3.3: Đưng tương quan tuyn tính gia A(CFU/ml) và OD610nm ca S.cerevisiae Theo đ th 3.3, phương trình tương quan gia ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) là: y = 4E11x – 0,0341 Trong đĩ: x là s lưng t bào (CFU/ml). y là ch s OD. Đi vi Nitrosomonas sp. cũng đưc tin hành tương t nhưng đưc theo dõi 12h, 24h và 36h. Kt qu thu đưc bng 3.6. Bng 3.6: Ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) Nitrosomonas sp. Thi gian (h) OD 625nm Tng mt đ khun lc (CFU/ml) 12 0,080 3,2×10 9 24 0,252 9,8×10 9 36 0,533 1,5×10 10
47 0.6 y = 4E11x 0.0649 2 0.5 R = 0.958 0.4 Series1 0.3 Linear (Series1) OD625nm 0.2 0.1 0 0 5E+09 1E+10 1.5E+10 2E+10 A (CFU/ml) Đ th 3.4: Đưng tương quan tuyn tính gia A(CFU/ml) và OD625nm ca Nitrosomonas sp. Theo đ th 3.4, phương trình tương quan gia ch s OD và s lưng t bào (CFU/ml) là: y = 4E11x – 0,0649 Trong đĩ: x là s lưng t bào (CFU/ml). y là ch s OD. 3.2. Nghiên cu quy trình lên men các chng vi sinh probiotics và to ch phm probiotics 3.2.1. nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh trưng ca các chng vi sinh probiotics Đ cĩ cơ s khoa hc cho vic gi ging, nghiên cu quy trình sn xut và s dng các ch phm vi sinh, cn phi nm rõ các đc đim sinh hc và ngun dinh dưng cn thit ca các chng. Các ngun dinh dưng khác nhau đu nh hưng đn s sinh trưng và phát trin ca chúng. Vì vy, tin hành nuơi cy các chng VSV trên các mơi trưng khác nhau đ tìm mơi trưng ti ưu cho s sinh trưng và phát trin ca chúng.
48 B. subtilis đưc nuơi trên 3 mơi trưng đ xác đnh mơi trưng nào vi khun này phát trin tt cho vic nhân sinh khi t bào. Các thí nghim đưc tin hành nhit đ phịng 2830 oC và đt trên máy lc 200 vịng/phút, thi gian nuơi cy 48h. Sau đĩ ly dung dch nuơi cy đo OD bưc sĩng 625nm đ xác đnh mt đ t bào, kt qu đưc trình bày bng 3.7. Bng 3.7: nh hưng ca thành phn mơi trưng đn sinh trưng ca B.subtilis 3 ln lp MT1B MT2B MT3B Mơi trưng li nuơi cy L1 0,569 0,272 0,457 Bacillus L2 0,593 0,262 0,403 subtilis L3 0,511 0,281 0,489 a b ab (OD 625nm ) TB 0,558 0,272 0,450 CV% 9,98 (Các tr s a, b, ab trên cùng mt hàng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) Kt qu bng 3.7 cho thy thành phn mơi trưng đã nh hưng đn s sinh trưng và phát trin ca chúng, th hin trong biu đ 3.1: 0.600 a 0.500 ab 0.400 0.300 b OD625nm OD625nm 0.200 0.100 0.000 MT1B MT2B MT3B Mơi trưng nuơi cy Biu đ 3.1: nh hưng ca thành phn MT đn sinh trưng ca B.subtilis
49 Qua biu đ cho thy, B. subtilis phát trin trên các mơi trưng khác nhau, nhưng khơng phi ngun nitơ nào cũng thích hp cho vi khun phát trin. Vì vy, xác đnh ngun nitơ cho nuơi cy VSV là rt cn thit. Trong trưng hp này mt đ t bào mơi trưng MT1B (0,558) cao hơn so vi 2 mơi trưng kia cĩ th do nguyên nhân là s t hp các hố cht mơi trưng MT1B thích hp cho s sinh trưng và phát trin ca B. subtilis hơn là t hp các hố cht trong mơi trưng MT2B và MT3B. Chính lí do này, đã chn đưc mơi trưng thun li giúp cho B. subtilis tăng nhanh v sinh khi. Da vào kt qu thu đưc chn MT1B là mơi trưng thích hp cho vic nuơi cy và thu sinh khi. Chúng tơi s dng mơi trưng này các nghiên cu tip theo. Nghiên cu nh hưng ca thành phn mơi trưng đn sinh trưng ca L.acidophilus đ xác đnh mơi trưng ti ưu cho s sinh trưng và phát trin ca chúng. Thí nghim đưc thc hin trên 3 mơi trưng khác nhau, nhit đ phịng 2830 oC và đt trên máy lc 150 vịng/phút, sau 48h ly dung dch nuơi cy đo OD bưc sĩng 600 nm đ xác đnh mt đ t bào, kt qu thu đưc bng 3.8. Bng 3.8: nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh trưng L.acidophilus 3 ln lp li MT1L MT2L MT3L Mơi trưng L1 0,691 0,224 0,325 nuơi cy L2 0,684 0,269 0,374 Lactobacillus L3 0,724 0,220 0,326 acidophilus TB 0,700a 0,238 b 0,342 b (OD 600nm ) CV% 6,05 (Các tr s a, b trên cùng mt hàng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) T kt qu bng 3.8 chúng ta xây dng đưc biêu đ 3.2:
50 0.800 a 0.700 0.600 0.500 0.400 b OD600nm 0.300 b OD600nm 0.200 0.100 0.000 MT1L MT2L MT3L Mơi trưng nuơi cy Biu đ 3.2: nh hưng ca MT nuơi cy đn sinh trưng ca L.acidophilus Qua biu đ 3.2 cho thy L.acidophilus phát trin trên các mơi trưng khác nhau, nhưng tt nht là mơi trưng MT1L (0,700) vi mt đ t bào cao hơn so vi 2 mơi trưng cịn li là MT2L (0,238) và MT3L (0,342). Vì th, s dng mơi trưng MT1L cho các nghiên cu sau. S. cerevisiae cũng đưc nghiên cu trên 3 mơi trưng khác nhau ngun cacbon đ tìm mơi trưng thích hp cho s sinh trưng ca chúng. Thí nghim tin hành trên 3 mơi trưng, nhit đ phịng 2830oC và tc đ lc 150 vịng/phút, thi gian 48h. Sau đĩ ly dch nuơi cy đo OD bưc sĩng 610 nm đ xác đnh mt đ t bào, kt qu đưc trình bày bng 3.9. Bng 3.9: nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh trưng ca S.cerevisiae 3 ln lp li MT1S MT2S MT3S Mơi trưng L1 0,549 0,400 0,455 nuơi cy L2 0,550 0,399 0,482 Saccharomyces L3 0,510 0,398 0,488 cerevisiae TB 0,536 a 0,399 b 0,475 ab (OD 610nm ) CV% 4,03 (Các tr s a, b, ab trên cùng mt hàng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01)
51 Kt qu bng 3.9 đưc th hin qua biu đ 3.3: OD610nm 0.6 a ab 0.5 b 0.4 0.3 OD610nm 0.2 0.1 0 MT1S MT2S MT3S Mơi trưng nuơi cy Biu đ 3.3: nh hưng ca thành phn MT đn sinh trưng ca S.cerevisiae Biu đ 3.3 cho thy S.cerevisiae đu phát trin trên các mơi trưng, nhưng mt đ t bào mơi trưng MT1S vi ngun cacbon là glucose đt cao nht (0,536). Điu này chng t ngun cacbon nh hưng đn s sinh trưng và phát trin ca nm men. Vì th chn mơi trưng MT1S là thun li cho s sinh trưng và phát trin ca S.cerevisiae . Kt qu này trùng vi kt qu nghiên cu ca Renata G. K. Leuschner (2004) là S.cerevisiae s dng ngun cacbon là glucose [53]. Nghiên cu nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh trưng ca Nitrosomonas sp. đưc tin hành trên 4 mơi trưng khác nhau nhm xem thành phn và khi lưng ca các hố cht nh hưng như th nào đn s sinh trưng ca chúng. Sau 36h, đo OD ca dung dch nuơi cy bưc sĩng 625nm đ xác đnh mt đ t bào, kt qu đưc trình bày bng 3.10.
52 Bng 3.10: nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh trưng ca Nitrosomonas sp . 3 ln lp MT1N MT1’N MT2N MT2’N Mơi trưng li nuơi cy L1 0,538 0,416 0,237 0,145 Nitrosomonas L2 0,520 0,410 0,291 0,101 sp . L3 0,541 0,383 0,248 0,129 a ab bc c (OD 625nm ) TB 0,533 0,403 0,259 0,125 CV% 7,07 (Các tr s a, ab, bc, c trên cùng mt hàng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) Kt qu bng 3.10 th hin qua biu đ 3.4: OD625nm 0.6 a 0.5 ab 0.4 0.3 bc OD OD 625nm 0.2 c 0.1 0 MT1N MT1'N MT2N MT2’N Mơi trưng nuơi cy Biu đ 3.4: nh hưng ca MT nuơi cy đn sinh trưng ca Nitrosomonas sp. Qua biu đ 3.4 cho thy Nitrosomonas sp. cĩ kh năng sinh trưng trên các mơi trưng khác nhau, nhưng mt đ t bào mơi trưng MT1N (0,533) cao hơn so vi 3 mơi trưng cịn li. Điu này chng t thành phn và khi lưng ca các hố cht trong mơi trưng đã nh hưng đn s sinh trưng ca chúng.
53 Da vào kt qu thu đưc cho thy Nitrosomonas sp. sinh trưng tt trong mơi trưng MT1N. Vì th mơi trưng này đưc dùng cho các nghiên cu tip theo. 3.2.2. nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh trưng ca các chng vi sinh probiotics Mi lồi vi sinh vt sinh trưng, phát trin theo mt quy lut nht đnh. Chính vì th, khi nghiên cu cn nm rõ quá trình này đ xác đnh các thi đim thích hp cho các cơng đon tip theo. Thí nghim đưc tin hành trên các mơi trưng ti ưu, nhit đ phịng 2830 oC, đ lc tương ng ca các chng vi các khong thi gian nuơi cy 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h và 96h. Trong khong thi gian nuơi cy, tin hành đo đ đc (OD) ca các chng bưc sĩng tương ng đ xác đnh mt đ t bào theo thi gian. Theo kt qu thu đưc bng 3.11, thi gian phát trin ti ưu ca các chng là B. subtilis (48h), L.acidophilus (48h), S.cerevisiae (48h), Nitrosomonas sp . (36h). Trưc thi đim này mt đ t bào ca các chng tăng nh và sau đĩ mt đ gim dn theo thi gian nuơi cy. B. subtilis , mt đ t bào sau 12h nuơi cy là 0,056; đn 24h mt đ ca chúng tăng đt 0,190 và 36h mt đ ca chúng đã tăng lên nhanh chĩng là 0,471; đn 48h mt đ ca chúng đã đt cc đi là 0,559; sau đĩ mt đ t bào ca chúng đã gim nh 60h cịn 0,503 và đn 72h, 96h thì mt đ bt đu gim mnh. Tương t đi vi chng L.acidophilus mt đ t bào sau 12h nuơi cy là 0,054; đn 24h mt đ tăng lên 0,194 và 36h mt đ tăng lên nhanh chĩng là 0,485 và đn 48h mt đ t bào đt cc đi 0,700; sau đĩ mt đ gim nh 60h cịn 0,400 và bt đu gim mnh đn 96h ch cịn 0,118. S.cerevisiae thì mt đ t bào cũng tăng nh lúc 12h, 24h, đn 36h mt đ tăng mnh là 0,521 và đt cc đi 48h là 0,536; sau đĩ mt đ t bào gim dn và đn 96h ch cịn 0,192. Cịn Nitrosomonas sp. Mt đ t bào sau 12h, 24h nuơi cy ln lưt là 0,080; 0,252 và nhanh chĩng đt cc đi 36h là 0,533; sau đĩ mt đ t bào gim và đn
54 96h cịn 0,034. Ta cĩ đ th đưng cong sinh trưng ca các chng vi sinh vt đưc th hin qua đ th 3.5. Bng 3.11: nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh trưng ca các chng Thi Ch s OD ca các chng gian nuơi B. subtilis L.acidophilus S.cerevisiae Nitrosomonas sp. cy 12h 0,056 c 0,054 c 0,089 c 0,080 c 24h 0,190 bc 0,194 bc 0,196 bc 0,252 abc 36h 0,471 ab 0,485 ab 0,521 a 0,533 a 48h 0,559 a 0,700 a 0,536 a 0,424 ab 60h 0,503 a 0,400 abc 0,411 ab 0,273 abc 72h 0,359 abc 0,231 bc 0,307 abc 0,152 bc 96h 0,282 abc 0,118 bc 0,192 bc 0,034 c CV% 5,70 4,42 5,10 4,37 (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) 0.800 Ch s OD ca 0.700 B. subtilis 0.600 Ch s OD ca 0.500 L.acidophilus 0.400 Ch s OD ca OD 625nm OD 0.300 S.cerevisiae 0.200 0.100 Ch s OD ca Nitrosomonas 0.000 sp. 12h 24h 36h 48h 60h 72h 96h Thi gian nuơi cy Đ th 3.5: nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh trưng ca các chng
55 Qua đ th nhn thy rng s sinh trưng và phát trin ca các chng vi sinh vt nuơi cy trong mơi trưng dch th tri qua 4 pha là: Pha tim phát (lag): Pha này đưc tính t lúc bt đu cy vi sinh vt vào bình cho đn khi chúng bt đu sinh trưng. Trong pha này s lưng VSV chưa nhiu do lúc này t bào mi bt đu tăng v trng lưng và th tích, đng thi trong pha này chúng phi tng hp ADN và các enzyme cn thit cho s phân bào. Pha tích lu (log): Trong giai đon này, VSV tăng nhanh v trng lưng đng thi ln nhanh v kích thưc, chúng tng hp mnh m nhng cht cn thit cho quá trình sinh trưng và phát trin. Pha cân bng: Trong pha này tc đ sinh trưng và trao đi cht ca VSV gim dn, s lưng t bào đt cc đi đã đi vào n đnh dn v hình thái, s lưng t bào sinh ra cân bng vi s lưng t bào cht đi. VSV chuyn sang pha cân bng bi mt s nguyên nhân như cht dinh dưng bt đu cn kit, pH thay đi, cht đc tích lu, . Pha suy vong: S lưng t bào cht vưt tri s lưng t bào mi đưc to thành nguyên nhân do cht dinh dưng cn kit, cht đc hi tích lu nhiu . Như vy, sau 36h48h mt đ t bào đt cc đi và bt đu đi vào giai đon n đnh cho nên vi mc đích thu sinh khi t bào s tin hành vào thi đim này. 3.2.3. nh hưng ca pH đn sinh trưng ca các chng vi sinh probiotics Gii hn pH thích ng ca tng loi VSV rt khác nhau. Mt s chng VSV cĩ th phát trin trong mơi trưng acid, mơi trưng trung tính hoc mơi trưng kim cho nên vic xác đnh pH thích hp đi vi các chng vi sinh vt là cn thit. Bên cnh đĩ, nng đ các ion H + và OH nh hưng trc tip đn quá trình trao đi cht ca t bào, làm nh hưng đn din tích b mt và mc đ
56 hồ tan ca mt s mui khống. Ngồi ra, pH ca mơi trưng cịn nh hưng đn các sn phm hot đng sng ca VSV và đn quá trình sinh trưng, phát trin ca chúng, cho nên xác đnh pH thích hp cho quá trình nhân nuơi VSV là rt quan trng. Đ nghiên cu nh hưng ca pH mơi trưng đn s sinh trưng và phát trin ca các chng VSV, tin hành nuơi cy vi 7 mc pH khác nhau: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 8,0; 8,5. Thí nghim đưc tin hành mơi trưng, nhit đ và tc đ lc thích hp. Sau 3648h nuơi cy, đo OD ca dch nuơi cy các bưc sĩng tương ng, kt qu đưc trình bày bng 3.12. Bng 3.12: nh hưng ca pH đn sinh trưng ca các chng Thang Ch s OD ca các chng pH B. subtilis L.acidophilus S.cerevisiae Nitrosomonas sp. 5,0 0,270 bc 0,559 ab 0,377 ab 0,308 abc 5,5 0,402 a 0,691 a 0,408 a 0,538 a 6,0 0,343 ab 0,476 abc 0,430 a 0,462 a 6,5 0,276 bc 0,385 abcd 0,375 ab 0,350 ab 7,0 0,263 bc 0,282 bcd 0,298 abc 0,277 abc 8,0 0,234 c 0,137 cd 0,196 bc 0,144 bc 8,5 0,220 c 0,093 d 0,108 c 0,058 c CV% 7,16 2,45 3,50 5,94 (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) T bng 3.12 xây dng biu đ 3.5 v nh hưng ca pH đn sinh trưng ca các chng.
57 0.800 0.700 Ch s OD ca B. subtilis 0.600 Ch s OD ca 0.500 L.acidophilus 0.400 Ch s OD ca 0.300 S.cerevisiae OD 625nm 0.200 Ch s OD ca Nitrosomonas 0.100 sp. 0.000 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 8,0 8,5 Thang pH Biu đ 3.5: nh hưng ca pH đn sinh trưng các chng Qua biu đ 3.5 cho thy pH cĩ nh hưng rõ rt đn s sinh trưng, phát trin ca các chng VSV. C th là mt đ t bào B. subtilis , S.cerevisiae , Nitrosomonas sp. Đt cc đi pH=5,5 đn pH=6,0; riêng L.acidophilus đt cc đi pH=5,0 đn 5,5 kt qu này phù hp vi nghiên cu ca Irena Rogelj (2002)[31]; ngồi khong đĩ mt đ gim dn. Kt qu này hồn tồn phù hp vi kt qu nghiên cu ca nhiu tác gi khác là các chng này sinh trưng, phát trin tt mơi trưng cĩ pH hơi acid t 5,0 đn 6,0. 3.2.4. nh hưng ca nhit đ đn sinh trưng ca các chng vi sinh probiotics Mi VSV cĩ mt ngưng nhit đ phát trin ti ưu, vì th nghiên cu nh hưng ca nhit đ đn sinh trưng và phát trin ca các chng là cn thit. Nhit đ nh hưng rõ rt đn các hot đng sng ca t bào VSV 5 thang nhit đ (20 oC, 25 oC, 30 oC, 35 oC, 40 oC) vi mơi trưng và pH ti ưu. Thí nghim đưc đo OD sau 3648h đ xác đnh mt đ t bào, kt qu đưc ghi nhn bng 3.13.
58 Bng 3.13. nh hưng ca nhit đ đn sinh trưng ca các chng Nhit đ Ch s OD ca các chng nuơi cy B. subtilis L.acidophilus S.cerevisiae Nitrosomonas sp. 20 oC 0,316 b 0,017 b 0,126 b 0,202 b 25 oC 0,370 b 0,224 ab 0,382 ab 0,253 b 30 oC 0,590 a 0,613 a 0,590 a 0,556 a 35 oC 0,405 ab 0,689 a 0,482 ab 0,479 a 40 oC 0,372 b 0,358 ab 0,251 ab 0,058 a CV% 2,84 2,93 3,72 4,04 (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) T bng 3.13 xây dng đưc biu đ 3.6 nh hưng ca nhit đ đn sinh trưng ca các chng. 0.800 Ch s OD ca 0.700 B. subtilis 0.600 Ch s OD ca 0.500 L.acidophilus 0.400 0.300 Ch s OD ca OD 625nm S.cerevisiae 0.200 0.100 Ch s OD ca Nitrosomonas 0.000 20oC 25oC 30oC 35oC 40oC Nhit đ nuơi cy Biu đ 3.6: nh hưng ca nhit đ đn sinh trưng các chng Qua kt qu thng kê và biu đ cho thy, các chng VSV sinh trưng tt nhit đ 3035 0C, ngồi gii hn này thì khơng thun li cho s sinh
59 trưng ca chúng. Kt qu này cũng gĩp phn giúp bo qun ch phm mt cách tt nht đ đm bo mt đ VSV. Irena Rogelj (2002), nghiên cu nhit đ ti ưu cho s sinh trưng ca L.acidophilus là 30 – 37 oC[31]. Renata G. K. Leuschner (2004) S.cerevisiae sinh trưng tt nhit đ 3035 oC [53]. 3.2.5. nh hưng ca đ lc đn sinh trưng ca các chng vi sinh probiotics Các chng VSV cn oxy đ cĩ th tin hành quá trình hơ hp, trao đi cht, trao đi năng lưng vi mơi trưng bên ngồi. Vì vy, hàm lưng oxy trong mơi trưng sng cĩ nh hưng ln đn s sinh trưng và phát trin ca chúng. Thí nghim này VSV đưc nuơi cy mơi trưng dch th, mơi trưng này hn ch vic s dng oxy nên khi nhân nuơi các bình nuơi cy đưc lc các tc đ khác nhau đ cung cp oxy hồ tan. Thí nghim đưc thc hin vi 5 tc đ lc ( 0, 100, 150, 200, 250 vịng/phút). Sau 3648h, tin hành đo OD đ xác đnh mt đ t bào VSV trong dch nuơi cy, kt qu đưc ghi nhn bng 3.14. Bng 3.14: nh hưng ca tc đ lc đn sinh trưng ca các chng Tc đ Ch s OD ca các chng lc (rpm) B. subtilis L.acidophilus S.cerevisiae Nitrosomonas sp. 0 0,558 b 0,700 ab 0,536 b 0,533 b 100 0,596 b 0,845 a 0,813 ab 0,669 b 150 0,672 ab 0,942 a 0,970 a 0,869 a 200 0,933 a 0,547 ab 0,823 ab 0,342 c 250 0,633 ab 0,279 b 0,798 ab 0,165 c CV% 3,21 1,69 1,47 2,53 (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01)
60 T bng 3.14 xây dng biu đ 3.7 v nh hưng ca tc đ lc đn mt đ t bào ca các chng VSV. Ta thy mt đ ca các chng VSV tăng dn theo tc đ lc và đt cc đi 200 vịng/phút ( B. subtilis ) và 150 vịng/phút (L.acidophilus , S.cerevisiae , Nitrosomonas sp.). 1.200 1.000 Ch s OD ca B. subtilis 0.800 Ch s OD ca 0.600 L.acidophilus Ch s OD ca OD OD 625nm 0.400 S.cerevisiae 0.200 Ch s OD ca 0.000 pm rpm rpm rpm rpm 0r 50 100 1 200 250 Đ lc nuơi cy Biu đ 3.7: nh hưng ca tc đ lc đn sinh trưng ca các chng Như vy các chng VSV khi đưc cung cp oxy s làm tăng kh năng trao đi gia cơ th vi mơi trưng bên ngồi giúp VSV thun li trong quá trình sinh trưng và phát trin. T đĩ dn đn sinh khi ca chúng gia tăng. Mt khác, khi nhân nuơi trong mơi trưng dch th đã hn ch s tip xúc gia VSV và oxy, nên khi lc các bình nuơi cy s làm tăng kh năng hồ tan hàm lưng oxy trong dung dch, VSV càng cĩ nhiu oxy cho quá trình hơ hp, sinh trưng và phát trin. Vì vy, tc đ lc 150200 vịng/phút thì mt đ VSV đt cao nht khi kho sát. Tuy nhiên, tc đ lc cũng cĩ mt gii hn nht đnh cho nên cn nghiên cu các tc đ lc khác cho phù hp vi mc đích và điu kin kho sát.
61 3.2.6. Xây dng qui trình to ch phm probiotics T kt qu ca các thí nghim trên và qua phân tích tho lun, đã xác đnh đưc điu kin nuơi cy thích hp cho các chng vi sinh probiotics vi mc đích thu sinh khi t bào hp ph lên bt là: Mơi trưng nuơi cy ca B. subtilis là MT1B, L.acidophilus là MT1L, S.cerevisiae (MT1S ) , Nitrosomonas sp.( MT1N). Thi gian đ thu sinh khi ca B. subtilis , L.acidophilus , S.cerevisiae là 48h, Nitrosomonas sp. Là 36h. Ph thích hp đ nuơi cy là B. subtilis , S.cerevisiae , Nitrosomonas sp. Là 5,56,0; riêng L.acidophilus là 5,05,5. Nhit đ ti ưu ca các chng là 3035 0C. Tc đ lc đ đt sinh khi ca B. subtilis là 200 vịng/phút; L.acidophilus , S.cerevisiae , Nitrosomonas sp. Là 150 vịng/phút. Trong quá trình nuơi cy đ thu đưc sinh khi t bào cao nht và tránh lãng phí, cn chn thi đim thu phù hp đ hp ph lên bt. Thu sinh khi vi sinh dng lng và hp ph lên bt vi t l 1 lít dch vi sinh + 1 kg bt mì khơ. Dch vi sinh đưc phun đu lên bt và đ khơ nhit đ 3035 0C. Sau đĩ đĩng gĩi, bo qun và ng dng cho gà đ trng. Trn ch phm vi thc ăn ca gà theo ngày. T kt qu ca các thí nghim, xây dng mt quy trình nuơi cy nhân sinh khi vi quy mơ nh (như nghiên cu trong phịng thí nghim) các chng vi sinh probiotics, đt hiu qu cao nht qua sơ đ: