Luận văn Nghiên cứu bổ sung Chitosan Oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang cao sản Nhật Bản (Ipomoea batatas L.)

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu bổ sung Chitosan Oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang cao sản Nhật Bản (Ipomoea batatas L.)

1. B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN NGUYN TH TRƯƠNG HUYN TÊN Đ TÀI NGHIÊN CU B SUNG CHITOSAN OLIGOMER TRONG NUƠI CY MƠ KHOAI LANG CAO SN NHT BN (IPOMOEA BATATAS L.) LUN VĂN THC SĨ SINH HC Buơn Ma Thut, năm 2009
2. B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN . NGUYN TH TRƯƠNG HUYN TÊN Đ TÀI NGHIÊN CU B SUNG CHITOSAN OLIGOMER TRONG NUƠI CY MƠ KHOAI LANG CAO SN NHT BN (IPOMOEA BATATAS L.) Chuyên ngành: Sinh hc Thc nghim Mã s: 60 42 30 LUN VĂN THC SĨ SINH HC NGƯI HƯNG DN KHOA HC: PGS.TS. NGUYN ANH DŨNG Buơn Ma Thut, năm 2009
3. i LI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: đây là cơng trình nghiên cu ca riêng tơi, các s liu và kt qu nghiên cu nêu trong lun văn là trung thc, đưc các đng tác gi cho phép s dng và chưa tng đưc cơng b trong bt kỳ mt cơng trình nào khác. HC VIÊN NGUYN TH TRƯƠNG HUYN NGƯI HƯNG DN CH TCH HI ĐNG
4. ii LI CM ƠN! Đ hồn thành lun văn này, tơi xin chân thành cm ơn: Ngưi thy hưng dn: PGS.TS. Nguyn Anh Dũng đã tn tình hưng dn ch bo và giúp đ cho tơi trong sut thi gian hc tp và thc hin lun văn. TS. Phan Văn Tân đã to điu kin thun li và ch bo cho tơi trong thi gian hc tp và thc hin lun văn ti b mơn sinh hc thc vt. ThS. Nguyn Đình S đã tn tình hưng dn và ch bo cho tơi trong sut thi gian thc hin lun văn. Tt c các thy cơ giáo Khoa Sau đi hc, Khoa KHKT&CN Trưng Đi hc Tây Nguyên. Ban Giám Hiu, tồn th các anh ch và các bn đng nghip Trưng THCS Đồn Kt đã luơn to điu kin thun li và nhit tình giúp đ cho tơi trong sut thi gian cơng tác và hc tp. Tt c các anh, ch và các bn trong lp cao hc Sinh hc thc nghim khĩa 1 đã luơn đng viên và giúp đ cho tơi trong sut thi gian hc tp và thc hin lun văn. Ch Tuyn, em Ngc, em Bình B mơn Sinh hc thc vt đã to điu kin thun li, đng viên và nhit tình giúp đ cho tơi trong sut thi gian thc hin đ tài này. Cui cùng xin gi lịng bit ơn đn tt c nhng ngưi thân trong gia đình đã luơn bên cnh đng viên và to mi điu kin thun li nht đ tơi hc tp và làm vic trong sut thi gian qua Xin chân thành cm ơn! NGUYN TH TRƯƠNG HUYN
5. iii MC LC Trang Các ch vit tt i Danh mc nh ii Danh mc bng iv Danh mc hình v M ĐU 1 CHƯƠNG I: TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1. Tng quan v cây khoai lang 3 1.1.1 Đc đim sinh hc 3 1.1.2 Tình hình nghiên cu và sn xut cây khoai lang 7 1.1.3. Nghiên cu ngồi nưc v cây khoai lang 8 1.1.4Nghiên cu trong nưc v cây khoai lang 9 1.2. Tng quan v nuơi cy mơ t bào thc vt 12 1.2.1 Sơ lưc lch s nuơi cy mơ t bào thc vt 12 1.2.2 ng dng ca phương pháp nuơi cy mơ 14 1.2.3 Các phương pháp nuơi cy mơ t bào thc vt 15 1.2.4 Các bưc nhân ging invitro 15 1.2.5. Kh trùng mu nuơi cy 15 1.2.6. Mu cy 17 1.2.7. Mơi trưng nuơi cy t bào thc vt 18 1.2.8. Các cht điu hịa sinh trưng thc vt 19 1.3. Ý nghĩa ca phương pháp nuơi cy mơ t bào thc vt 25 1.4 S phát sinh hình thái 26 1.5. Tng quan tình hình nghiên cu nuơi cy mơ Vit Nam 28
6. iv 1.6. Tng quan v Chitosan 29 1.6.1. Cơng thc cu to 29 1.6.2. Tình hình nghiên cu và ng dng chitosan 31 CHƯƠNG 2 : NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 40 2.1. Ni dung nghiên cu 40 2.2. Phương pháp nghiên cu 40 2.2.1. Vt liu, hĩa cht 40 2.2.2. Phương pháp nghiên cu 41 2.2.2.1. Nghiên cu nh hưng ca các hĩa cht kh trùng đn sc sng ca mơ nuơi cy 41 2.2.2.2. Nghiên cu thành phn mơi trưng đn s hình thành protocorm 44 2.2.2.3. Nghiên cu nh hưng ca nng đ và loi cht điu hịa sinh trưng thc vt lên s bt chi và tăng trưng chi t đt thân khoai lang in vitro 46 2.2.2.4 Nghiên cu nh hưng ca nng đ và loi cht điu hịa sinh trưng thc vt lên s to r và tăng trưng chi cây khoai lang in vitro 48 2.2.2.5 Nghiên cu nh hưng ca nng đ chitosan oligomer đn sinh trưng và kh năng kháng bnh ca khoai lang nuơi cy mơ 50 2.2.2.6 X lý s liu thng kê 52 CHƯƠNG III: KT QU VÀ THO LUN 53 3.1. nh hưng ca các hĩa cht kh trùng đn sc sng ca chi mm t c khoai lang 53 3.1.1. nh hưng ca cht kh trùng HgCl 2 đn sc sng ca chi mm t c khoai lang 53
7. v 3.1.2. nh hưng ca cht kh trùng Natri hypochloride các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm t c khoai lang 57 3.1.3 nh hưng ca cht kh trùng hydro peroxyde các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm t c khoai lang 69 3.2. nh hưng ca thành phn mơi trưng đn hình thành protocorm 62 3.3. nh hưng ca nng đ, t l cht kích thích sinh trưng đn hình thành chi và r cây con trong in vitro 65 3.3.1. nh hưng ca N 6 benzyladenine (BA) và Kinetin các nng đ và t l khác nhau đn s hình thành chi và tăng trưng chi cây khoai lang 65 3.3.2. nh hưng ca NAA và IBA các nng đ và t l khác nhau đn s hình thành r cây khoai lang 69 3.4. nh hưng ca nng đ chitosan oligomer đn sinh trưng và kh năng kháng bnh ca khoai lang nuơi cy mơ 75 CHƯƠNG IV: KT LUN VÀ Đ NGH 81 KT LUN 81 Đ NGH 81 TÀI LIU THAM KHO 82 PH LC
8. vi CÁC CH VIT TT ABA Acid abscisic BA N6 – benzyladenine cs cng s CV Coefficient of Variation GA 3 Gibberellin MS Murashige và Skoog NAA Napthalen acetic acid IAA Idol – 3 – acetic acid IBA Indol – 3 – btyric acid TDZ Thidiazuron JA Jasmonic acid
9. vii DANH MC BNG Trang Bng 3.1. nh hưng ca cht kh trùng HgCl 2 các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm thu nhn t c khoai lang sau 3 tun nuơi cy 55 Bng 3.2 nh hưng ca cht kh trùng Natri hypochloride các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm thu nhn t c khoai lang sau 3 tun nuơi cy 59 Bng 3.3 nh hưng ca cht kh trùng hydro peroxyde các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm thu nhn t c khoai lang sau 3 tun nuơi cy 61 Bng 3.4 . nh hưng ca thành phn mơi trưng đn hình thành protocorm sau 40 ngày nuơi cy 64 Bng 3.5 nh hưng ca BA và Kinetin lên s bt chi và tăng trưng chi t đt thân cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuơi cy 67 Bng 3.6 nh hưng ca IBA và NAA lên s hình thành r t chi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuơi cy 72 Bng 3.7 nh hưng ca nng đ chitosan oligomer đn sinh trưng ca khoai lang nuơi cy mơ sau 30 ngày nuơi cy 77
10. viii DANH MC HÌNH Trang Hình 1.1 Cơ ch di chuyn hu cc ca auxin 19 Hình 1.2. Cu trúc ca auxin t nhiên và auxin tng hp 19 Hình1. 3. Cu trúc ca mt s dng cytokinin 20 Hình 1.4. Cu trúc ca khung gibbane và s chuyn đi GA 4 thành các GA khác 21 Hình 1.5. Cu trúc ca ABA 22 Hình 1.6. Cu trúc ca ethylen 22 Hình 1.7. Cu trúc ca TDZ 23 Hình 1.8. Chitin (cĩ 410 nghìn gc Nacetylglucosamine) 31 Hình 1.9. Chitosan (cĩ 14 nghìn gc glucosamine) 31 Hình 1.10. Olygoglucosamine (cĩ 2 vài chc gc glucosamine) 31 Hình 1.11. Cơ ch hot đng ca Chitosan 39 Hình 3.1. nh hưng ca cht kh trùng HgCl 2 đn sc sng ca chi mm t c khoai lang sau 3 tun nuơi cy các nng đ 0.1% (A), 0.3% (B), 0.5% (C) 56 Hình 3.2. nh hưng ca cht kh trùng Natri hypochloride các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm t c khoai lang sau 3 tun nuơi cy 60 Hình 3.3. nh hưng ca cht kh trùng hydro peroxyde các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm t c khoai lang sau 3 tun nuơi cy 62 Hình 3.4. S lá ca cây khoai lang khi BA và Kinetin thay đi các nng đ và t l khác nhau sau 30 ngày nuơi cy 68
11. ix Hình 3.5. Chiu cao chi ca cây khoai lang khi BA và Kinetin thay đi các nng đ và t l khác nhau sau 30 ngày nuơi cy 68 Hình 3.6. Chiu cao chi ca cây khoai lang khi IBA và NAA thay đi các nng đ và t l khác nhau sau 30 ngày nuơi cy 72 Hình 3.7. S r ca cây khoai lang khi IBA và NAA thay đi các nng đ và t l khác nhau sau 30 ngày nuơi cy 73 Hình 3.8. nh hưng ca IBA và NAA lên chiu cao chi, s r và chiu dài r t chi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuơi cy 73 Hình 3.9. nh hưng ca nng đ chitosan oligomer đn chiu cao chi ca khoai lang nuơi cy mơ sau 30 ngày 78 Hình 3.10. nh hưng ca nng đ chitosan oligomer đn khi lưng chi tươi và khi lưng chi khơ ca khoai lang nuơi cy mơ sau 30 ngày. 78
12. 1 M ĐU Khoai lang ( Ipomoea batatas L. (Lam) là cây lương thc quan trng đưc trng nhiu nưc Châu Á, Châu Phi và Châu M la tinh. Khoai lang khơng nhng ch cĩ cơng dng làm lương thc cho ngưi, thc ăn cho gia súc mà cịn là sn phm ca các mt hàng cơng nghip thc phm. Ngưi ta cĩ th ch bin rưu, cn, xiro t khoai lang. Tinh bt khoai lang cịn dùng trong cơng nghip giy và h si. Mt s nưc trên th gii dùng khoai lang ch bin axit xitoric, dextrin, ly tinh bt dùng trong y hc. Khoai lang cha nhiu men amilaza bin tinh bt thành đưng mch nha nên là ngun nguyên liu tt cho cơng nghip sn xut loi men này. Theo thng kê 2006 ca S Nơng Nghip – PTNT Đăk Nơng và Đăk Lăk, khoai lang cao sn xut khu đang phát trin mnh vi din tích tnh Đăk Nơng là 4500 ha, Đăk Lăk là trên 3000 ha. Trong thi kỳ đu, năng sut khoai lang đt t 2025 tn/ha, giá bán cho sut khu là 5 triu đng /tn, đem li thu nhp cao cho nơng dân. Tuy nhiên, sau 5 năm phát trin năng sut khoai lang suy gim gn 4050%, ch cịn 1215 tn/ha, làm gim thu nhp ca ngưi nơng dân và sn sut khơng bn vng c v kinh t và mơi trưng. Chitosan và chitosan oligomer là các cht hot hĩa mt s gen thc vt, bng cách tác đng trên promoter ca trên 20 gen h thng đ kháng ca thc vt đ tăng cưng tng hp enzyme chitanase, β 1,3glucanase, RNAse, proteinase inhibitor, tăng cưng tng hp lignin và kháng sinh thc vt phytoalexin. Chính vì vy, Chitosan và chitosan oligomer làm tăng sc đ kháng ca cây vi các tác nhân gây bnh như nm, vi khun và virus [41]. Chitosan và chitosan oligomer làm tăng kh năng kháng bnh r st (Phakopspora foiae ) ca đu tương (N.A. Dung, 2002) [30]. Suwalee (2002) cơng b phun chitosan cho ngơ vi nng đ 100 ppm cĩ kh năng hn ch 70% bnh bc lá[64]. Ngồi ra cịn nhiu cơng b khng đnh kh năng kháng
13. 2 nm bnh ca chitosan đi vi thc vt, như kháng nm pythium, Sclerotium, Fusarium (Hirano, 1996 ; N.A. Dung, 2004, R.D. Park, 2002). Chitosan oligomer cịn đưc coi là nhĩm điu hịa sinh trưng thc vt th h mi [68]. Chitosan oligomer cĩ tác dng kích thích tăng trưng, tăng hàm lưng dip lc, tăng s lưng nt sn c đnh đm và tăng năng sut ca lc [33]. Chitosan oligomer làm tăng cưng đ quang hp ca lúa, lc trong thy canh [42]. Chitosan oligomer làm tăng chiu dài r, kích thưc cây con trong nuơi cy mơ [50]. Vi mc đích ng dng cơng ngh sinh hc trong vic phát trin nơng nghip bn vng, va tăng năng sut cây trng, ging khơng b thối hố, khơng sâu bnh, gim t l nhim trong nuơi cy mơ. Chúng tơi đ sut nghiên cu đ tài: ‘‘Nghiên cu b sung Chitosan oligomer trong nuơi cy mơ khoai lang cao sn Nht Bn ( Ipomoea batatas L.). ’’ Mc tiêu ca đ tài : • Xây dng quy trình nhân ging khoai lang cao sn bng cơng ngh nuơi cy mơ t bào trong invitro . • Đánh giá hot tính kích thích tăng trưng khi b sung chitosan oligomer trong nuơi cy mơ khoai lang.
14. 3 CHƯƠNG I: TNG QUAN TÀI LIU 1.1 Tng quan v cây khoai lang 1.1.1 Đc đim sinh hc V trí phân loi: Gii (regnum): Plantae Ngành (division): Magnoliophyta Lp (class): Magnoliopsida B (ordo): Solonales H(familia): Convolvulaceae Chi (genu): Ipomoea Lồi (species): Ipomoea batatas L. Khoai lang trên th gii ch yu đưc phân b các vùng nhit đi, á nhit đi châu Á, châu Phi và châu M la tinh. Cĩ ngun gc t khu vc nhit đi Châu M, đưc con ngưi trng cách đây khong 5000 năm. Nĩ đưc ph bin rt sm trong khu vc này, bao gm c khu vc Cariber, đã đưc bit ti trưc khi cĩ s thám him ca ngưi phương tây ti Polinesia. Ngày nay khoai lang đưc trng khp trong các khu vc nhit đi và ơn đi m vi lưng nưc đ đ h tr s phát trin ca cây. Nưc ta nm trong khu vc nhit đi giĩ mùa, nĩng, m, nhit đ cao, mưa nhiu, lưng mưa phân b tương đi đu nên rt thun li cho cây khoai lang sinh trưng và phát trin, do đĩ cĩ th trng quanh năm. Khoai lang ( Ipomoea batatas ) là mt lồi cây nơng nghip vi r c ln, cha nhiu tinh bt, cĩ v ngt, đưc gi là c khoai lang và nĩ là mt ngun cung cp rau c quan trng, đưc s dng trong vai trị ca c rau ln lương thc. Các lá non và thân non đưc s dng như cũng đưc s dng như
15. 4 mt loi rau. Khoai lang cĩ h hàng xa vi khoai tây ( Solanum tuberosum ) cĩ ngun gc Nam M. Là cây thân tho dng dây leo sng lâu năm, cĩ các lá mc so le hình trái tim hay lá x thùy hình chân vt, các hoa cĩ tràng hp và kích thưc trung bình. R c ăn đưc, hình dng thuơn dài và thon, lp v nhn nhi cĩ màu đ, tía, nâu hay trng, bên trong c cĩ màu vàng, trng, cam, hay tím. Khoai lang cĩ khi lưng đưng bt (cacbonhydrat), vitamin A và năng lưng cao hơn so vi lúa mì, lúa nưc, sn. Khoai lang đưc s dng c và lá đ làm thc ăn gia súc, ch bin bt, rưu cn, bánh ko và gn đây đang đưc nghiên cu đ làm màng ph sinh hc ( bioplastic). Do đc đim tính đa dng ca ging khoai lang, hơn na trong quá trình trng trt do chn lc t nhiên, chn lc nhân to nên đã hình thành nhiu loi hình, nhiu ging khác nhau. Khoai lang khơng chu đưc sương giá, phát trin tt nht nhit đ trung bình khong 24 °C (75 °F). Khoai lang ít khi ra hoa nu khong thi gian ban ngày vưt quá 11 gi. Chúng đưc nhân ging ch yu bng các đon thân (dây khoai lang) hay r hoc bng các r bt đnh mc ra t các r c trong khi lưu gi bo qun. Trong các điu kin ti ưu vi 8590 % đ m tương đi 1316 °C (5561 °F), c khoai lang cĩ th gi đưc trong vịng 6 tháng. Nhit đ thp hoc cao hơn đu nhanh chĩng làm hng c. Khoai lang phát trin tt trong nhiu điu kin v đt, nưc và phân bĩn. Nĩ cũng cĩ rt ít k thù t nhiên nên thuc tr dch hi là ít khi phi dùng ti. Do nĩ đưc nhân ging bng các đon thân nên khoai lang là tương đi d trng. Do thân phát trin nhanh che lp và kìm hãm s phát trin ca c di nên vic dit tr c cũng tiêu tn ít thi gian hơn. Trong khu vc nhit đi, khoai lang cĩ th đ ngồi đng và thu hoch khi cn thit cịn ti khu vc ơn đi thì nĩ thưng đưc thu hoch trưc khi sương giá bt đu. Khoai lang
16. 5 cĩ kh năng thích ng vi nhiu loi đt khác nhau, nhưng sinh trưng tt nht trên các loi đt thống khí như đt tht nh và đt pha cát. Thi gian sinh trưng ca cây khoai lang ngn ngày nhưng li cho năng sut cao, do đĩ cn phi bĩn nhiu phân và đ dng cn thit. Vì vy, nĩi chung điu kin khí hu, thi tit nưc ta cho phép trng khoai lang quanh năm, nhưng cũng cn lưu ý ti nhng đc đim riêng ca tng vùng khí hu khác nhau đ b trí thi v cho thích hp.
17. 6 nh 1.1. Cánh đng trng khoai lang nh 1.2. C khoai lang cao sn Nht Bn ( Benniazuma )
18. 7 1.1.2 Tình hình nghiên cu và sn xut cây khoai lang + K thut nhân ging thơng thưng: Khoai lang đưc nhân ging vơ tính bng chi c ging và hom ging ca dây sau khi thu hoch c t v trưc. Ngồi các yu t v đt đai, thi v, phân bĩn, k thut canh tác, đc đim ging thì đ dài và cht lưng hom ging và cách trng nh hưng rt ln đn năng sut c. Malaysia, ngưi ta trng hom 6 mt vi đ sâu 2 mt. Georgia thưng trng hom khoai lang dài 30 – 40cm vi 2 – 3 mt dưi đt cho năng sut cao hơn hom ging ngn 20 – 25cm. Trung tâm nghiên cu và phát trin rau Châu Á (AVRDC) khuyn cáo trng hom ging dài 30cm vi 3 mt dưi đt. Trung Quc, hom ging 7 mt đưc s dng ph bin trong sn xut. Vit Nam, phn ln các qui trình hưng dn đu cho rng: hom ging ct dài 25 – 30cm đon 1 và đon 2 ca nhng dây mp mnh khơng sâu bnh. Trng nơng ni lin theo chiu dc lung, mi mét dài trng 5 hom vi khong cách t 18 – 22cm, lp đt sâu 5 – 6cm. Cơng ty thc phm Đà Lt – Nht Bn (DJF), đơn v trc tip nhp ging và thu mua khoai lang nht đã hưng dn cách trng khoai lang nht như sau: trng cây cách cây 25cm, hàng cách hàng 1m, mt đ 25000 cây/ha. Hom đưc ct xong đem v rãi nơi thống mát t 1 đn 2 ngày trưc khi trng s giúp hom nhanh ra r, ny chi hơn. Theo kinh nghim trng khoai lang ging Nht Bn xã Đăc Bup So, huyn Tuy Đc, tnh ĐăkNơng thì trưc ht là cách đt ging, bao gi cũng lp đt ph ht, ch đ ngn nhơ lên 3 5cm, nu đ ngn nhơ lên quá cao thì hom d b táp nng và d b sâu đc thân dn đn suy dinh dưng.
19. 8 Tuy nhiên, phương pháp này tn cơng, vưn ươm ln và ph thuc vào điu kin bo qun, cây thiu sc đ kháng vi virus gây bnh. Vì vy đ sn xut ra khi lưng ln cây ging sch bnh cĩ th mong ch nuơi cy mơ. Trên th gii và trong nưc đã cĩ nhng báo cáo v nghiên cu tái sinh cây khoai lang in vitro qua con đưng phát sinh phơi soma và con đưng phát sinh cơ quan. 1.1.3. Nghiên cu ngồi nưc v cây khoai lang Đ to ging cho năng sut cao, phm cht tt, sch bnh, trên th gii đã nghiên cu nhân ging khoai lang bng k thut nuơi cy mơ. Tuy nhiên nhng nghiên cu v nuơi cy mơ khoai lang trên th gii cịn r t hn ch. Hwang, Robert (1983) nghiên cu nuơi cy mơ khoai lang bng k thut nuơi cy mơ r s dng mơi trưng MS vi nng đ khống và inositol cao. S dng chĩp ngn, chi nách, mu lá hoc mu cung lá non. Đưc đem kh trùng b mt bng Clorox 10% (0,52% NaOCl), ra nh 2 ln vi nưc ct [49]. Kuo, Shen (1985) nghiên cu nhân ging khoai lang sch virus s dng mơ lá và đnh sinh trưng. Mu mơ nuơi cy đưc kim tra virus bng k thut ELISA[24]. Daniel (1993) đã xây dng h thng nhân ging cho nhng lồi cĩ sinh khi ln như cây khoai lang bng phương pháp to phơi soma t đnh ngn 1 2 lá mm trên mơi trưng cĩ b sung 2,4D cho thy s hình thành phơi khi cy chuyn phơi calli hoc khi t bào sang mơi trưng cĩ 2,4 D mi và phơi cĩ lá mm cĩ kh năng hình thành cây mi [28]. Makoto (1993) đã nghiên cu s hình thành c khoai lang in vitro t mơ r cây khoai lang in vitro. Sau 67 nuơi cy đưng kính ca r ln nht ln hơn 2mm dưi tác dng ca cht điu hịa sinh trưng thc vt JA trong
20. 9 mơi trưng đc và BA trong mơi trưng lng, phn r phình to ra cĩ màu đ, màu t nhiên ca cây trng này[53]. Podobo (1995) nghiên cu nhân ging khoai lang t lá theo quy trình gm 2 bưc: nuơi cy mơ lá trên mơi trưng MS và sau đĩ chuyn sang mơi trưng MS b sung zeatin riboside. Kt qu cho thy rng mơ lá ca các ging khoai lang đưc cy trên mơi trưng MS cĩ b sung 0,2mg/l 1 2,4 D thì cĩ 19/27 ging cĩ biu hin s tái sinh chi, 8 ging khơng cĩ phn ng. Trong đĩ, ging cĩ t l tái sinh chi cao nht là PI 3188463 (78,6%) và khi chuyn sang mơi trưng MS b sung 0.2mg/l 1 zeatin riboside thì ging này cũng cĩ t l tái sinh chi cao nht (33,3%).[20] Isabirye (2007) nghiên cu s thối hĩa ca đt trng sn và khoai lang nhng khu vc nghèo, đu tư thp Uganda. Các tác gi ưc tính lưng dinh dưng mt đi cho 1 ha khoai lang là 45 kg N/ha/năm, 8 kg P/ha/năm và 55 kg K/ha/năm[51]. Ankumah (2003) nghiên cu hiu qu ca bĩn N đn năng sut và hiu qu s dng N ca 4 ging khoai lang [37]. Vit Nam, Vin cây lương thc đưa ra qui trình thâm canh các ging khoai lang cao sn là 20 tn phân hu cơ, 120 kg N, 900 kg super lân, 450 kg Kali[58]. 1.1.4 Nghiên cu trong nưc v cây khoai lang Khoai lang là cây lương thc ngn ngày quan trng ca Vit Nam, là cây trng ly c cĩ thi gian sinh trưng ngn khong 90 – 110 ngày, chu hn, chu đt xu, đu tư thp, ít chăm sĩc, ít sâu bnh, nên đưc nơng dân ưa trng. Vi các ging cao sn, thâm canh chăm sĩc tt, khoai lang cĩ th cho năng sut cao 20 – 25 tn/ha và tim năng năng sut ca khoai lang cĩ th đt 40 – 50 tn/ha. Vì vy cây khoai lang là cây xĩa đĩi gim nghèo cho nhiu nơng dân nhiu đa phương, trong đĩ cĩ Tây Nguyên trong nhng năm gn đây.
21. 10 Theo thng kê ca FAO (2007) ca Vit Nam năm 2005 là 205.000 ha vi năng sut là 7,56 tn/ha và sn lưng đt trên 1,5 tn. Theo đánh giá ca FAO, năng sut trung bình khoai lang ca nưc ta khá thp bi nhiu nguyên nhân [39]: Do chưa cĩ cơ cu ging khoai lang tt, cĩ năng sut cao, chu thâm canh và phù hp vi tng vùng. Ging sau nhiu năm trng b thối hĩa. Nơng dân cĩ tâm lý trng khoai khơng đu t ư thâm canh. Đăk Nơng là tnh đi đu trong trng và xut khu khoai lang cao sn Nht Bn. T năm 2004, Sau khi ging khoai lang nht bn (Benniazuma) đưc du nhp vào đa bàn tnh Đăk Nơng đn nay, din tích gieo trng khoai lang ca tnh Đăk Nơng ngày càng đưc m rng. Tng din tích khoai lang năm 2004 là 1,917 ha, sn lưng 9,251 tn, năm 2005 là 2,333 ha, sn lưng 21,668 tn (khoai lang Nht Bn Benniazuma chim 80% din tích và sn lưng). Năm 2006 ưc thc hin đưc 4.138 ha, sn lưng 42,795 tn. Trong đĩ tp trung ch yu các huyn (huyn Đăk Song din tích: 2,933 ha, sn lưng: 30,994 tn; huyn Đăk R’Lp din tích: 706 ha, sn lưng: 7,296 tn; huynKrơng Nơ din tích: 127 ha, sn lưng: 1,365 tn) khoai lang nht bn Benniazuma chim 95% din tích và sn lưng. Khác vi cây khoai lang truyn thng, sn phm ch phc v nhu cu ni đa và làm thc ăn gia súc. Cây khoai lang Nht Bn (Benniazuma) là cây hàng hĩa đem li hiu qu kinh t cao. Nu đu tư thâm canh trên mt đơn v din tích cĩ th đt đưc (v hè thu: 32.000.000đ/ha; v thu đơng: 30.000.000đ/ha và v đơng xuân cĩ tưi nưc: 45.000.000đ/ha).
22. 11 Đnh hưng phát trin din tích, sn lưng cây khoai lang ca Đak Nơng Hng mc Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009 Năm 2010 Din tích (ha) 4.300 4.600 4.800 5.000 Sn lưng (tn) 43.000 46.000 48.000 50.000 Trong nhng năm gn đây, Vin Cây lương thc, Vin Khoa hc Nơng nghip Vit Nam lai to mt s ging khoai lang cĩ năng sut cao như KB1, KB4 và TV1, năng sut cĩ th đt t 20 – 25 tn/ha. Tuy nhiên nơng dân thưng t đ ging bng dây hoc c trong nhiu năm lin, ging b thối hĩa và tích lũy nhiu bnh cho v sau. Do đĩ, ging tt, sch bnh là yu t quyt đnh đ cho năng sut cao, phm cht tt và hiu qu canh tác khoai lang. Nguyn Du Sanh, Nguyn Thanh Dũng(2004) đã nghiên cu các thay đi v cu trúc và sinh lý trong quá trình to c cây khoai lang t các đon thân dài 30 – 40cm trên hai ging trng Hưng Lc (HL4) và ging đa phương (Go) làm cơ s cho vic tăng năng sut ca các cây trng ly c [13]. Nguyn Th Lý Anh, Nguyn Th Hng Nhung, Nguyn Quang Thch (2004) đã xây dng đưc qui trình tái sinh in vitro mt s ging khoai lang Vit Nam ( ging Chiêm Dâu, Nơng nghip 31 và Lim)[2]. Nguyn Hu H, Nguyn Văn Uyn (2005) đã nghiên cu tái sinh in vitro các ging khoai lang Keganesengan, Kokei 14 và Satsuma Hikari t mơ lá qua kiu tái sinh chi bt đnh và tái sinh theo con đưng sinh phơi soma qua nuơi cy to mơ so t đnh sinh trưng. Khong 1 tun đn 1 tháng thy mt s chi tái sinh t mơ so, xut hin thưng vùng gân chính v trí gc lá. Ngồi ra, tác gi cịn nhn thy h r trên mơi trưng MS khơng cht sinh trưng sau 3 đn 4 tun nuơi cy đã tái sinh chi trên mt s r to, đơi khi hình thành t r nh [5].
23. 12 1.2. Tng quan v nuơi cy mơ t bào thc vt 1.2.1 Sơ lưc lch s nuơi cy mơ t bào thc vt T bào thc vt cĩ tính tồn th (totipotency), t bào đơn hoc protoplast thc vt đu cĩ kh năng tái sinh cây hồn chnh. Đây là điu kin quan trng đ ng dng trong nuơi cy mơ thc vt. S phát sinh hình thái (morphogenesis) hoc kh năng tái sinh cây hồn chnh t mt t bào, mt cm t bào (mơ so), mt mnh lá, đã đưc thc hin trên hàng trăm lồi thc vt, hu ht tp trung vào các cây trng quan trng. Ý tưng nuơi cy mơ ca sinh vt ra ngồi cơ th, trong ng nghim (in vitro) đã đưc Haberlandt th nghim t năm 1902 nhưng do ơng đã s dng các t bào ca cây mt lá mm nên đã tht bi. Năm 1919, A. Carrel nuơi cy thành cơng mơ đng vt, nhưng cho đn năm 1934 mơ thc vt mi đưc nuơi cy. Năm 1934, White đã thành cơng trong vic phát hin ra s sng vơ hn ca các t bào r cà chua đưc nuơi cy mơ. Năm 1941, Van Overbeck đã chng minh tác dng tt ca nưc da trong nuơi cy phơi cây h cà. Sau đĩ Steward và Milles (1952) cũng xác nhn tm quan trng ca nưc da trong nuơi cy mơ so và phát sinh phơi cà rt. Năm 1951, Skoog và Miler phát hin ra các hp cht cĩ kh năng điu khin s nhân chi. Năm 1954, Skoog phát hin ch phm thy phân ca tinh dch cá b cĩ tác dng kích thích sinh trưng rt rõ rt trong nuơi cy các mnh mơ thân cây thuc lá. Năm 1957, Skoog và Miller đã chng minh s bit hĩa ca r, chi trong nghiên cu nuơi cy mơ ty thuc lá ph thuc vào nng đ tương đi ca auxin/cytokinin và t đĩ đưa ra quan nim điu khin hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan thc vt.
24. 13 Năm 1962, Murashige và Skoog đã thành cơng trong vic ci tin mơi trưng nuơi cy, đánh du mt bưc tin quan trng trong kĩ thut nuơi cy mơ. Mơi trưng ca h đã đưc dùng làm mơi trưng cơ bn cho vic nuơi cy nhiu loi cây và cho đn nay vn cịn đưc s dng rng rãi. Năm 19601964, Morel cho rng cĩ th nhân ging vơ tính lan bng nuơi cy đnh sinh trưng và lan là cây nuơi cy mơ đu tiên đưc thương mi hĩa. T đĩ đn nay nhiu loi cây khác nhau đã đưc nuơi cy thành cơng và đưa vào thương mi hĩa. Năm 1964, Ball là ngưi đu tiên tìm ra mm r t vic nuơi cy chi ngn. Ơng đã thành cơng trong vic chuyn mơ nuơi cy thành cây con cây sen cn và cây White lupin t mơi trưng nuơi cy ti thiu. Năm 1966, Guha và cng s đã to đưc cây đơn bi t nuơi cy túi phn ca cây cà đc dưc ( Datura inoxia ). Năm 1978, Melchers và cng s đã lai to thành cơng protoplast ca cà chua vi protoplast ca khoai tây, m ra mt trin vng mi trong lai xa thc vt. Tuy nhiên, vic nhân ging cây in vitro vn chưa hồn thin. Sau đĩ, nhiu nhà nghiên cu đã khám phá ra nhng thành phn quan trng, cn thit cho s phát trin ca t bào đưc nuơi cy [19]. K thut nuơi cy mơ t bào thc vt là mt cơng c cn thit trong nhiu lĩnh vc nghiên cu cơ bn và ng dng ca ngành sinh hc, nơng nghip và y dưc hc Ngày nay phương pháp nuơi cy mơ thc vt đã hưng v nhng ng dng thc tin, vì nĩ liên h mt thit vi cây trng. Nh tin b ca khoa hc k thut nhng ngành cĩ liên quan, ngành nuơi cy mơ thc vt đã đưc trang b hin đi và tr nên quan trng trong nghiên cu khoa hc và thc tin sn sut. Các nhà thc vt hc đã áp dng phương pháp này vi mc đích sau:
25. 14 Đi vi lĩnh vc ci tin cây trng: Vi nhân ging; lp thư vin DNA; bo tn in vitro; to các bin d soma; lai t bào soma; chn ging chng chu sâu bnh; lai xa Đi vi nghiên cu di truyn hc: • To ra mt qun th ln và đng nht trong mt thi gian ngn, vn gi nguyên tính trng di truyn ca cơ th m. • To các ging mi cĩ năng sut và phm cht cao bng phương pháp chuyn gen. • To đưc nhiu cây con t mơ và cơ quan ca cây (thân, phin lá, hoa, ht phn, ) mà ngồi thiên nhiên khơng thc hin đưc. • Làm sch ngun virus cho cây bng cách ly mơ phân sinh ngn. 1.2.2 ng dng ca phương pháp nuơi cy mơ Phương pháp nuơi cy mơ thc vt đã đưc ng dng vào các mc đích sau: • To qun th ln và đng nht v di truyn trong khong thi gian ngn, vi din tích và khơng gian nh trong phịng thí nghim, cĩ th kim sốt đưc các điu kin lý hĩa nh hưng đn sinh trưng ca cây. • To đưc nhiu cây con t các mơ và cơ quan ca cây (lĩng, thân, phin lá, hoa, ht phn, nỗn, chi, phát hoa) mà ngồi t nhiên khơng thc hiên đưc. • Làm sch ngun virus gây bnh cho cây bng cách nuơi cy đnh sinh trưng. • Ci tin các ging cây trng bng cơng ngh sinh hc và nhân nhanh các ging chn đưc.
26. 15 1.2.3 Các phương pháp nuơi cy mơ t bào thc vt Nuơi cy mơ so. Nuơi cy đnh sinh trưng. Nuơi cy t bào đơn. Nuơi cy protoplast – chuyn gen. Nuơi cy ht phân đơn bi. Nuơi cy phơi. 1.2.4 Các bưc nhân ging invitro Nhân ging vơ tính thc vt trong in vitro thưng tri qua các bưc sau: Kh trùng mơ cy Nuơi cy đnh sinh trưng To th nhân ging invitro Nhân ging invitro Tái sinh cây hồn chnh in vitro Chuyn cây in vitro ra vưn ươm 1.2.5. Kh trùng mu nuơi cy Mt trong nhng bưc quan trng đu tiên quyt đnh đn s thành cơng hay tht bi trong nhân ging in vitro cây đu dịng nĩi chung và cây khoai lang nĩi riêng là vic kh trùng mu cy đ đưa chúng vào nuơi cy trong điu kin vơ trùng. Phương pháp ph bin trong vơ trùng mu cy hin nay là s dng các hĩa cht cĩ kh năng tiêu dit vi sinh vt. Hiu qu dit nm, khun ca các cht này ph thuc vào thi gian, nng đ x lý và kh năng xâm nhp ca chúng vào các ngõ ngách trên b mt mu cy. Đ tăng tính linh đng ca hĩa cht dit khun, ngưi ta thưng s dng thêm các cht làm gim sc căng b mt như: Tween 20, Tween 80, Fotoflo, Teepol hoc cĩ th x lý phi hp vi cn 70%. Mt hĩa cht đưc la chn cho quá trình vơ trùng mu cy phi bo đm hai thuc tính: cĩ kh năng dit vi sinh
27. 16 vt tt và khơng hoc cĩ mc đ đc thp đi vi mu thc vt. Trong các loi hĩa cht trên, NaOCl, H 2O2 và Ca(OCl) 2 hay đưc dùng hơn vì chúng cĩ mc đ đc tính thp đi vi mu và khơng cĩ biu hin c ch sinh trưng[19]. Theo Lê Th Thu V và cng s (1999), khi x lý các c hoa loa kèn bng HgCl 2 nng đ 0,1% cho thy thi gian x lý 10 phút, s mu đưa vào đt 100%[16]. Nguyn Th Anh, Trn Văn Minh (2007), khi nhân ging cây Pơmu nhn thy khi kh trùng mu chi đnh và chi bên bng Natri hypochloride 10% trong 12 phút thu đưc t l mu sng cao nht (50,63%) [1]. Tuy nhiên, đi vi mt s loi cây cn phi x lý kt hp hai loi cht kh trùng thì mi đem li hiu qu kh trùng cao. Huỳnh Th Hu Trang và cng s (2007), nuơi cy phân sinh mơ chi hoa hu trng đã kh trùng bng dung dch sodium hypochloride (dưi dng thương phm là Clorox) vi t l 1:1 trong 30 phút sau đĩ ra li 3 ln bng nưc ct kh trùng và kh trùng li bng dung dch thu ngân clorua 0,1% trong 10 phút [15] Dương Lan Oanh và cng s (2007), nghiên cu v s nhân chi và phát trin r ca cây da cnh đã x lý, mu bng Clorox 10% trong 10 phút sau đĩ ra li bng nưc ct vơ trùng và kh trùng mu li bng thu ngân clorua 0,2% cho thy thi gian x lý 8 phút s mu sng đt t l cao nht (85%)[12]. Khưu Hồng Minh và cng s (2007), nghiên cu vi nhân ging cây Trai Nam b cho thy khi s dng riêng r canxi hypochloride đ vơ trùng mu Trai thc sinh thì nng đ 25% trong 30 phút cho t l mu sng cao nht là 4,4%. Nhưng khi s dng nng canxi hypochloride 25% trong 30 phút kt hp vi HgCl 2 0,05% trong 15 phút thì t l mu sng vơ trùng tăng lên 6,2%[11].
28. 17 Khoai lang là cây thân tho dng dây leo hoc bị trên mt đt, c nm trong đt và đưc trng trong vùng sinh thái rng ln, do đĩ s la chn mu đ kim sốt và x lý mm bnh là ht sc khĩ khăn. Hwang, Robert (1983) đã tin hành kh trùng bng Clorox 10% (0,52% NaOCl) vi mu là chĩp ngn, chi nách, mu lá hoc mu cung lá non[49]. 1.2.6. Mu cy Mu dùng cho nuơi cy mơ t bào thc vt cĩ th là hu ht các cơ quan hay b phn ca cây như chi ngn, chi bên, phin lá, cung lá, thân, các cu trúc ca phơi (lá mm, tr mm), các cơ quan d tr (c, căn hành ). tùy theo s tip xúc vi mơi trưng mà các mu thc vt cĩ cha ít hay nhiu mm bnh (vi khun, nm). Các cu trúc thc vt đưc bao kín (lá mm, phơi, mơ tht trong qu ) thưng khơng cha hoc cĩ rt ít vi sinh vt, ngưc li, các mơ và cơ quan thc vt tip xúc vi đt, nưc như r, c, thân thưng cĩ lưng vi sinh vt rt cao và khĩ loi b hồn tồn. Kuo, Shen (1985) nghiên cu nhân ging khoai lang sch virus s dng mơ lá và đnh sinh trưng[24]. Belarmino (1993), Nguyn Hu H, Nguyn Văn Uyn (2005) nhn thy rng trong mơi trưng MS cĩ 2mg/l NAA và 0.1mg/l BA, mu cy t lá hình thành mơ so rt nhanh (t vài ngày đn 1 tun) v trí vt ct, sau đĩ mơ so này đưc cy chuyn sang mơi trưng MS khơng cht sinh trưng, khong 1 tun đn 1 tháng thy mt s chi tái sinh t mơ so, xut hin thưng vùng gân chính v trí gc lá. Ngồi ra, tác gi cịn nhn thy h r trên mơi trưng MS khơng cht sinh trưng sau 3 đn 4 tun nuơi cy đã tái sinh chi trên mt s r to, đơi khi hình thành t r nh[5],[22]. Các ging khác nhau, v trí mu các loi mu cy khác nhau s phn ng và cho kt qu khác nhau trên cùng mt điu kin nuơi cy. Podobo và cng s (1995) nhn thy rng mơ lá ca các ging khoai lang
29. 18 đưc cy trên mơi trưng MS cĩ b sung 0.2mg/l 1 2,4 D thì cĩ 19/27 ging cĩ biu hin s tái sinh chi, 8 ging khơng cĩ phn ng. Trong đĩ, ging cĩ t l tái sinh chi cao nht là PI 3188463 (78.6%) và khi chuyn sang mơi trưng MS b sung 0.2mg/l 1 zeatin riboside thì ging này cũng cĩ t l tái sinh chi cao nht (33.3%). Cũng theo Podobo và cng s (1995) mu t các v trí lá khác nhau (lá th nht đn lá th 6 t ngn xung), kt qu là mu lá v trí th 3 cĩ kh năng tái sinh chi cao nht (91.67%) so vi các v trí khác. Các lá càng già thì t l tái sinh càng thp [20]. 1.2.7. Mơi trưng nuơi cy t bào thc vt Cơng thc mơi trưng ca Murashige và Skoog (1962, MS) là thích hp cho phn ln các trưng hp nuơi cy in vitro. Mơi trương gm các nhĩm cht căn bn sau: • Các cht vơ cơ đa lưng: N (NO 3 và NH 4), P, K, S, Ca, và Mg. • Các nguyên t vi lưng: Fe, Mn, Zn, Br, Cu, Co và Mo. • Các vitamin: nhiu loi (nicotinic acid, biotin, ) mà quan trng nht là thiamine (vitamin B1) dưi dng thiamine – HCL • Ngun carbon: sucrose hoc glucose. • Các cht điu hịa tăng trưng thc vt: các auxin và cytokinin, kích thích s phân bào, kim sốt s phân bào, kim sốt s bit hĩa t bào và phát sinh hình thái. Các auxin thưng dùng: 2,4D (2,4 Dichlorophenoxyaceticacid), IAA (indoleaceticacid), IBA (indole 3 butyric acid). Các cytokinin cĩ BAP (6benzylaminopurine), zea (zeatin), Ngồi ra cịn cĩ GA (gibberillic acid) và ABA (abscisic acid). • Agar s dng cho mơi trưng đc. H thng chiu sáng hp lý cn cho s phát trin ca t bào thc vt[7].
30. 19 Thành phn mơi trưng nuơi cy mơ t bào thay đi tùy theo lồi thc vt, loi t bào, mơ và cơ quan đưc nuơi cy. Nhiu yu t ca mơi trưng đã đưc nhiu tác gi trong và ngồi nưc nghiên cu như mơi trưng khống cơ bn, nng đ và các loi đưng, cht điu hịa sinh trưng thc vt . Theo Belarmino (1993), mơi trưng MS + 2mg/l NAA + 0.1mg/l BA tương đi thích hp đi vi nhiu ging khoai lang trong vic to mơ so lá và to điu kin cho vic tái sinh khi mơ lá đưc chuyn sang mơi trưng khơng cĩ cht điu hịa sinh trưng thc vt [22] . Mơi trưng cho t l tái sinh chi cao nht ging khoai lang Chiêm dâu là mơi trưng MS cĩ b sung 1ppm/l BA + 0.5ppm/l NAA và ging khoai lang NN31 là mơi trưng MS cĩ b sung 1ppm/lBA + 0.1ppm/l IAA, chi đưc hình thành là chi đơn và tái sinh t mơ so [2]). A. Porobo Dessai và cs (1995) báo cáo rng ging khoai lang PI 318846.3 cĩ kh năng tái sinh cây luơn cao nht (80%) khi nuơi cy trên mơi trưng MS + 2,4 D (0,2mg/l) trong 3 ngày và sau đĩ chuyn sang mơi trưng MS + zeatin riboside (0,2mg/l)[20] 1.2 .8. Các cht điu hịa sinh trưng thc vt Hormon thc vt là nhng hp cht hu cơ do thc vt sn xut di chuyn t nơi tng hp đn nơi tác dng, điu khin s sinh trưng hay mt quá trình sinh lý ca thc vt vi mt liu lưng rt nh (Davies, 1995)[17]. Cht điu hịa sinh trưng thc vt bao gm hormon thc vt và các hp cht hu cơ do con ngưi hoc vi sinh vt tng hp cĩ tác dng điu hịa s sinh trưng thc vt. Các cht điu hịa sinh trưng thc vt khơng phi là cht dinh dưng, các vitamin hay nhng nguyên t thit yu cho thc vt [17]. Hin nay các cht điu hịa sinh trưng thc vt đưc chia thành 5 nhĩm chính: auxin, gibberillin, cytokinin, acid abscisic và ethylen.
31. 20 + Auxin Auxin là nhĩm cht điu hịa sinh trưng thc vt đưc khám phá đu tiên (1880) bi các thí nghim ca Darwin và Francis, con trai ca ơng v hiu ng ánh sáng trên s cong ca dip tiêu cây yn mch (Avena sativa) và s phát hin ca Went (1982) v vai trị kích thích s kéo dài t bào ca auxin (Bùi Trang Vit,2000). Mưi năm sau, cu trúc ca auxin đưc xác đnh đĩ là indoleacetic acid (IAA) [63] Auxin cĩ vai trị quan trng trong s phân chia, m rng và kéo dài t bào, điu này liên quan ti s giãn n ca vách t bào, tính ưu tính ngn, hưng đng, lão suy, rng, đu và tăng trưng, tính cái ca hoa, điu khin s hình thành r, tăng hơ hp t bào và mơ nuơi cy, cĩ vai trị quan trng trong s hình thành phơi (bao gm c phơi hp t và phơi sooma). Auxin cịn làm tăng hot tính ca các enzim, nh hưng mnh đn trao đi cht ca nitrogen, tăng kh năng tip nhn và s dng đưng trong mơi trưng [17] Auxin đưc hình thành ch yu ngn thân, lá non, ht đang phát trin. Sau đĩ auxin di chuyn xung r kích thích hình thành r bt đnh. Trong thc vt bc cao, auxin di chuyn hu cc t t bào này qua t bào khác, t đnh chi xung dưi gc thân (hình 1.1) Hình 1.1. Cơ ch di chuyn hu cc ca auxin
32. 21 S di chuyn hu cc này đĩng vai trị quan trng trong s sinh phơi (bao gm c phơi hp t và phơi soma) [25]. Trong r, s di chuyn ca auxin phc tp hơn. Khi s dng đng v phĩng x, Mitchell và cs, (1975) và Tsurumi và cs, (1978) nhn thy rng s di chuyn ca auxin là cĩ tính hưng ngn trong mch chính ca r (di chuyn t gc r đn ngn r) tuy nhiên cũng cĩ bng chng cho thy auxin cĩ th di chuyn hưng gc gn ngn r và vùng kéo dài r [54]. Cu trúc ca mt s dng auxin: IAA, NAA, 2,4D (hình 1.2) Hình 1.2: Cu trúc ca auxin t nhiên (IAA) và auxin tng hp (NAA, 2,4D) (Smith,1997) S hình thành và phát trin r bt đnh ph thuc vào s di chuyn và nng đ ca auxin. S dng auxin trong nuơi cy in vitro như là mt ngh thut, nng đ thp, auxin kích thích s to r bt đnh nhưng nng đ cao li kích thích hình thành mơ so. + Cytokinin Cytokinin cĩ vai trị tác đng đn tt c các giai đon sinh trưng và phát trin ca thc vt, t s kích thích phân chia t bào, s phát sinh cũng như tăng trưng chi, thúc đy s hình thành các chi nách bng cách c ch ưu tính ngn, c ch s hình thành r đn s hình thành hoa và trái. Cytokinin là chm s phân hy dip lc t, do đĩ làm chm s lão hĩa ca lá, làm tăng quá trình chuyn hĩa acid nucleic và protein, điu chnh nng đ Ca 2+ trong t
33. 22 bào (Smith, 1997; Bùi trang Vt, 2000). Cytokinin đưc tng hp ch yu ngn r, ht đang phát trin. Mt s dng cytokinin thưng gp: zeatin, BA, kinetin (hình 1.3) Hình1. 3. Cu trúc ca mt s dng cytokinin (Smith, 1997). + Gibberellin Gibberellin là mt nhĩm cht ln. Hin nay các nhà khoa hc đã xác đnh đưc trên 90 cht cĩ hot tính gibberellin, và tt c các cht đĩ đu đưc tách chit t thc vt hoc t vi sinh vt nh phn ng tng hp (Mai Trn Ngc ting, 2002). Gibberellin đĩng vai trị quan trng trong s kéo dài thân và cung hoa ca cây dài ngày, là hormon quan trng trong s ra hoa, kích thích s ny mm, đu và tăng trưng trái, tính đc ca hoa, giúp s phân hĩa các t bào tưng tng thành libe và mc. mc phân t, gibberellin làm cho Ca 2+ di chuyn nhanh vào cht trong sut ca t bào và làm rng t bào bng cách nh hưng trên vách, nhưng khơng nh hưng trên bơm proton như tác đng ca auxin. Các gibberellin khác nhau là Ax hay GA x đưc đánh s theo th t khám phá. Cu trúc ca mt s gibberellin thưng gp (hình1. 4).
34. 23 Khung gibbane Hình 1.4. Cu trúc ca khung gibbane và s chuyn đi GA 4 thành các GA khác (Smith, 1997) + Acid abscisic Acid abscisic (ABA) là cht đưc ly trích đu tiên trên cây bơng. Tính cht ca ABA là cn s ny mm, kéo dài s ng ca chi và ht, làm chm s kéo dài lĩng, liên quan ti s sinh phơi và trưng thành ca ht, kích thích s lão suy và rng ca nhiu loi trái và lá. ABA cĩ vai trị quan trng trong s đĩng m ca khí khu. Khi nng đ ABA cao, khí khu trong lá đĩng li. Thơng qua cơ ch này, ABA giúp cho cây t bo v khi gp điu kin khơ hn ca mơi trưng. Acid abscisic là mt sesquiterpen (hình 1.5), đưc tng hp r, lá non, ht. ABA đưc vn chuyn c trong mch mc và libe tùy v trí nĩ sinh ra. Hình 1.5. Cu trúc ca ABA (Smith, 1997)
35. 24 + Ethylen Ethylen là mt cht khí cĩ cu trúc đơn gin (CH 2=CH 2) (hình1.6), cĩ vai trị trong s g miên trng ca ht, tăng trưng và phân hĩa (chi và r), to r bt đnh, rng lá và trái, tính cái ca hoa, lão suy (hoa, trái), chín trái. Ethylen đưc tng hp trong trái chín, mơ lão suy và nhng mơ chu “stress”, do đĩ, ethylen đưc xem như là mt hormon vt thương, giúp cho cây gim bt s nhim trùng. Hình 1.6. Cu trúc ca ethylen (Smith, 1997). + Thidiazuron (TDZ) Thidiazuron (NphenylN’1,2,3thidiazol5ylurea) là mt cht hĩa hc đưc tng hp, tan nhiu trong ethanol, là mt ng c viên đ tr thành mt trong nhng cht điu hịa sinh trưng thc vt. TDZ đã đưc s dng rng rãi trong nuơi cy mơ thc vt bi nĩ th hin đng thi tính cht mnh ca auxin và cytokinin (Murthy và cs, 1998) dù cu trúc ca nĩ khác hn vi cu trúc ca auxin và cytokinin [56](hình 1.7) Hình 1.7. Cu trúc ca TDZ Trong điu kin in vitro, nhiu cơng trình nghiên cu đã đưc cơng b v vai trị ca TDZ trong s phát sinh hình thái bao gm s to mơ so, s phát sinh chi, s to phơi soma.
36. 25 To mơ so: thơng thưng, khi cm ng t bào to mơ so, chúng ta thưng s dng auxin như NAA hay 2,4D. TDZ vi hàm lưng thp cũng cĩ kh năng to đưc mơ so (Capelle và cs, 1983) và khi mơ so thưng cĩ nhng nt nh màu xanh [56]. To chi: TDZ đã đưc s dng đ nghiên cu s to chi trên nhiu đi tưng khác nhau, t nhng cây ăn trái nhit đi cho ti nhng cây to c. Kerns và cs (1986), Fellman và cs (1987), Fiola và cs (1990) và Malik và cs (1992a, 1992b) đã kt lun rng s to chi trên mơi trưng cĩ b sung DTZ vi hàm lưng thp thì hiu qu hơn so vi các cytokinin khác. Đc bit, s tác đng ca chúng trên s to chi nhng lồi thân g là hiu qu nht (Briggs và cs, 1988; Baker và cs, 1993). To phơi soma: cm ng s to phơi soma thưng s dng phi hp đng thi hai loi cht điu hịa là auxin và cytokinin vi t l khác nhau, trong khi TDZ vi mt mình nĩ cĩ th to đưc phơi soma (Saxena và cs, 1992; Visser và cs, 1992; Gill và cs, 1993). Trên nhiu loi cây khác nhau, nhiu tác gi đã s dng TDZ trong mơi trưng đ cm ng s to phơi soma như thuc lá (Gill và cs, 1993), đu xanh (Murthy và cs, 1995), cây phong l (Visser và cs, 1992), neem (Murthy và cs, 1998), cacao (Li và cs, 1998). 1.3. Ý nghĩa ca phương pháp nuơi cy mơ t bào thc vt Nuơi cy mơ t bào thc vt ngày nay cĩ ý nghĩa quan trng trong cơng ngh sinh hc. Khi tin hành các k thut chuyn gen đ to các ging cây trng mi, chúng ta đu cn đn k thut nuơi cy mơ t bào thc vt vì phương pháp này cĩ nhng ưu đim đáng k: Nhân ging vi h s nhân cao trong thi gian ngn. To ra các dịng cây con hồn tồn đng nht v mt di truyn. Cĩ th thc hin bt kỳ đa đim nào.
37. 26 Khơng ph thuc vào thi v, thi tit và khơng địi hi phi cĩ mt din tích ln mà vn cĩ hiu sut cao. Cĩ th phc tráng và nhân ging mt s cây trng quý bng phương pháp nuơi cy đnh sinh trưng to cây sch bnh. D dàng hc hi và trao đi cơng ngh vi các nưc tiên tin trên th gii. Bo qun ging d dàng bng cách to ra th phơi hoc bo qun lnh [8]. 1. 4. S phát sinh hình thái + Đnh nghĩa Phát sinh hình thái thc vt là thut ng dùng đ ch nhng thay đi ca cơ quan, mơ hay mc t bào thc vt (Bùi Trang Vit, 2000), bao gm s phát sinh chi bt đnh, phát sinh r bt đnh, to phơi soma, v.v. Phát sinh hình thái là mt trong nhng vn đ căn bn và phc tp nht ca sinh hc. Nhiu nhà sinh hc thc vt cho rng khơng th ch mơ t hình thái và cu trúc thc vt mà cn tìm hiu ngun gc phát sinh và các yu t liên quan trong các bin đi hình thái và cu trúc đĩ. Do đĩ, khơng cĩ mt k thut hay phương pháp riêng r nào cĩ th chng minh đưc tt c mi khía cnh ca nĩ. Nhng k thut t nhiu lĩnh vc khác nhau như mơ hc, gii phu hc, sinh lý hc, t bào hc và di truyn hc đu cĩ th giúp ta tìm hiu hin tưng phát sinh hình thái. Trong s các phương pháp thc nghim, hai phương pháp thưng đưc dùng nht là: Ct b mt vùng lân cn ca mơ phân sinh và theo dõi các bin đi phát trin sau đĩ. Nuơi cy in vitro trong điu kin vơ trùng và cĩ kim sốt các phn tách ri ca mt cơ th thc vt. Trong phương pháp này, nên áp dng các
38. 27 cht điu hịa sinh trưng thc vt ngoi sinh vì mu cy cĩ kích thưc nh, rt khĩ tin hành nghiên cu sinh lý hc. Trong phát sinh cơ quan, chi thưng đưc cm ng và tăng trưng trưc, r đưc to ra sau. Cũng cĩ thí nghim to r trưc, sau đĩ mi hình thành chi như trên cây Malus pumila, s to r và chi đưc cm ng bi Agrobacterium rhizogenes (James và cs, 1988).Vi nhng cây thân g cng, chi thưng đưc cm ng trc tip t b lá. + S phát sinh chi bt đnh Bng phương pháp nuơi cy in vitro, nghiên cu s to chi nhm nhân nhanh đ to mt s lưng chi ln vi nhng đc tính đng nht và ging vi cây m. S to chi in vitro cĩ th t nuơi cy cơ quan, mơ hay t bào trên mơi trưng cĩ hàm lưng cytokinin kt hp vi auxin. T l v hàm lưng ca hai loi hormon này là rt quan trng. Nng đ cytokinin cao hơn auxin thì mu cĩ khuynh hưng to chi, ngưc li, nu nng đ auxin cao hơn cytokinin thì mu cĩ khuynh hưng to r. Trong s to chi, hoc là chi đưc to trc tip hoc thơng qua mơ so. Các t bào ca mơ cy đưc cm ng bi mơi trưng đ phn bit hĩa tr v trng thái sinh mơ. Nhng t bào sinh mơ đưc cm ng đ cĩ kh năng bit hĩa tr li to mt cơ quan chi mi đưc gi là chi bt đnh. Chi thưng đưc cm ng và to thành vùng ngoi vi (vùng nhu mơ v) nên thưng đưc xem là cĩ ngun gc ngoi sinh. + S phát sinh r bt đnh S to r trên nhánh cây hoc chi in vitro gi là s to r bt đnh, gm ít nht là hai giai đon cĩ th phân bit đưc dưi kính hin vi (Mai Trn Ngc ting và cs, 1980): Giai đon to sơ khi r t vài t bào ca tng phát sinh libemc hoc chu luân, giai đon này đưc khi phát bi auxin nng đ cao. Auxin
39. 28 kích thích rt mnh s phân chia t bào tưng tng, đng thi giúp s phân hĩa ca các mơ dn. Giai đon kéo dài sơ khi r đưc kích thích bi auxin nng đ thp. Điu quan trng là nng đ ca auxin kích thích giai đon to sơ khi r nhưng cĩ th c ch giai đon kéo dài r và ngưc li [17]. Auxin t nhiên khơng bn (b oxi hĩa trong vài ngày dưi ánh sáng), nên trong thc t ngưi ta thưng dùng các auxin tng hp ít b phân hy như: indole3butyric acid (IBA), anpha–naphtalenacetic acid (NAA), 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4 – D). Tùy vào mc đích và đi tưng nghiên cu mà chúng ta s dng các loi auxin vi nng đ khác nhau. 1.5 . Tng quan tình hình nghiên cu nuơi cy mơ Vit Nam Cơng ngh nuơi cy mơ t bào thc vt du nhp vào nưc ta t năm 1960 min Nam và đu nhng năm 1970 min Bc, nhưng thc s phát trin t năm 1980. Lĩnh vc áp dng rng rãi cơng ngh nuơi cy mơ t bào thc vt là lĩnh vc nhân ging, bo qun ngun gen cây trng. Nhiu tnh thành trong c nưc đã xây dng nhiu phịng thí nghim nghiên cu cơng ngh cao đ phát trin lĩnh vc nuơi cây mơ này và đã mang li nhiu thành tu ni bc: Ngưi ta cĩ th sn xut ging trong phịng thí nghim đ đưa ra sn xut nhanh chĩng hơn nhiu phương pháp c đin, nh vy mà mt ngưi cĩ th sn xut ra 130.000 cây Hng/năm t mt gc Hng. min Bc, nhân bn vơ tính thc vt đưc ng dng hu ht các nơng, lâm sn, bo tn thành cơng các loi g quý như: Vù hương – loi g tit tinh du dùng trong dưc, m phm, cây Đăng ly g, Chè Vang – mt loi chè rt khĩ trng. K thut này giúp lai to thành cơng ging lúa chu hn DR1, nhân bn nhiu loi khoai tây, mía
40. 29 T năm 2001 đn nay, S Khoa Hc – Cơng ngh Lng Sơn, hàng năm cung cp hàng vn cây ging Bch Đàn Europhylla. Trung tâm ng dng và chuyn giao tin b cơng ngh tnh Vĩnh phúc ng dng thành cơng cơng ngh nuơi cy mơ t bào thc vt đ nhân ging cây Lơ hi, mt lồi dưc liu quý đa phương. Vit Nam cĩ th tr thành quc gia sn xut phong lan ln trong khu vc. Ch vi 3 ngưi, phịng nuơi cy mơ – trung tâm ging và k thut cây trng Phú Yên cĩ th to 500.000 cây lan cy mơ theo yêu cu ca khách hàng. Hin nay 100% nơng dân Đà Lt s sng cây ging t nuơi cy mơ. Năm 2002, ThS. Lê Th Kim Đào và cs ti Trung tâm ng dng khoa hc k thut Bình Đnh đã nhân ging thành cơng 4 loi cây Trm Hương, bch đàn Urophylla, cây Hơng, Gii xanh bng phương pháp nuơi cy mơ cho cht lưng cây ging tt và hiu qu kinh t cao. Năm 2008, cơng ngh nuơi cy mơ đã cĩ nhng bưc đt phá mi: nhân ging thành cơng ging sâm Ngc Linh quý him, t mt s t bào gc ca sâm Ngc Linh bng cơng ngh sinh khi t bào, nhĩm nghiên cu hc vin Quân y đã thành cơng trong vic nuơi cy thành s lưng ln, tồn b quy trình ch mt 10 đn 20 ngày, trong khi bình thưng phi mt khong 6 năm sâm mi cho thu hoch. Đã khơi phc nhiu lồi lan rng quý him khi nguy cơ tuyt chng, đc bit là lồi lan Hài Hng – lồi lan duy nht cĩ hương thơm trên th gii 1. 6. Tng quan v Chitosan 1.6.1. Cơng thc cu to Chitin là mt polymer sinh hc cĩ trong thành phn cu to nên v ca các lồi giáp xác như : tơm, cua v các lồi cơn trùng, thành t bào si nm. Chitin là mt polymer đưc cu to t gc Nacetyl – Glucosamine. Chitin là mt polymer bn, khĩ tan, khĩ tương tác hĩa hc. Khi deacetyl hĩa chitin
41. 30 trong NaOH đm đc s thu nhn đưc sn phm chitosan (polyglucosamine) [50]. Chitosan d tan trong acid hu cơ như acid lactic, acetic. Khi phân hy chitosan bng các tác nhân khác nhau như acid HCL, enzyme chitosanse, cellulase hoc bc x maga s to nên các sn phm cĩ chiu dài mch ngn hơn gi là chitosan oligomer. Cơng thc hĩa hc ca các hp cht trên như sau: CH 2OH CH 2OH CH 2OH NH NH NH C O C O C O CH 3 CH 3 CH 3 Hình 1.8. Chitin (cĩ 410 nghìn gc Nacetylglucosamine) CH 2OH CH 2OH CH 2OH NH 2 NH 2 NH 2 Hình 1.9. Chitosan (cĩ 14 nghìn gc glucosamine)
42. 31 CH 2OH CH 2OH NH 2 NH 2 Hình 1.10. Olygoglucosamine (cĩ 2 vài chc gc glucosamine) 1.6.2. Tình hình nghiên cu và ng dng chitosan Chitin, chitosan và chitosan oligomer đu là các sn phm cĩ ngun gc t nhiên, khơng đc, cĩ kh năng phân hy sinh hc và khơng gây ơ nhim mơi trưng. Đưc ng dng rng rãi trong cơng nghip, y dưc hc, nơng nghip và bo v mơi trưng. 1.6.2.1. Trong cơng nghip Chitin, chitosan đưc ng dng khá rng rãi trong cơng nghip, như dùng đ sn xut tơ cao cp trong cơng nghip dt, sn phm bn đp, thống mát. Chitin, chitosan cịn đưc s dng trong cơng nghip in, sn xut mc in, giy cao cp. Nh kh năng t phân hu sinh hc, chitin, chitosan đang đưc chú ý đ sn xut bao bì, bao gĩi t hy đ gim ơ nhim do các polymer tng hp như túi nilon, PE, PP. Ngồi ra, trong cơng ngh sinh hc, chitin, chitosan cịn đưc s dng làm vt liu c đnh enzyme, t bào s dng trong các qui trình cơng ngh sn xut t đng, liên tc (Hirano, 1996 , Nguyen Anh Dzung, 1998, 1999). Chitosan cịn đưc ng dng trong cơng nghip thc phm như bo qun các sn phm thc phm đ hn ch mc, nhim khun.
43. 32 1.6.2.2. Trong y dưc hc Hin nay, chitosan, chitosan oligomer và glucosamine đưc nghiên cu và s dng rng rãi trong y hc. Chitosan đưc s dng như là thc phm dinh dưng (health food). Chitosan cĩ tác dng làm gim cholesterol trong máu, tăng cưng h thng min dch và cĩ tác dng hp th lipid và gim béo [43]. Chitosan cịn đưc s dng làm màng cha bng, màng ph vt thương (wound dressing), ch phu thut t hoi, làm m phm. Chitosan oligomer cĩ tác dng làm tăng hot tính lysozyme t 4,4 U/ml lên 9,2 U/ml sau 5 ngày ung [43]. Chitosan oligomer cịn cĩ tác dng điu hồ h thng min dch ca cơ th, chng khi u (Theo Newletter, 11/2000). 1.6.2.3. Trong Nơng nghip Chitin, chitosan và chitosan oligomer đang đưc nghiên cu và tng bưc đưa vào ng dng trong sn xut nơng nghip. + S dng bĩn vào đt Khi bĩn vào đt, chitin và chitosan s phân hy hồn tồn trong đt sau 12 tháng, cĩ tác dng làm tăng vi sinh vt cĩ li cho đt như x khun Actinomyces (2,4 .105 lên 2,0. 109), nm mc Aspergillus (2,4.105 lên 7,4. 107) sau 2 tun bĩn vào đt. Đc bit, nm gây bnh Fusarium oxysporum gim thiu đáng k t 103 xung c ch hồn tồn (Hirano, 1996). Nguyn Anh Dũng (2005) khi s dng chitosan oligomer tưi cho tiêu KTCB cho thy sau 3 tháng, 3 ln tưi vi nng đ 0.010.05%, s lưng x khun, nm mc tăng rõ rt, trong khi đĩ s lưng Fusarium gây b nh gim đáng k. + Bo qun nơng sn thc phm Ghaouth 1996 nghiên cu cho thy chitosan cĩ kh năng c ch các loi nm gây hi sau thu hoch rau qu như Rhizopus, Colletotrichum, chitosan bo qun dâu tươi và các loi trái cây khác lâu hơn do hn ch nm
44. 33 gây hư thi và c ch hơ hp. Fajado (1994) cho thy chitosan c ch nm mc sinh đc t A. flavus trên lc, đu tương. S dng chitosan đ bo qun trái cây cũng rt đưc chú ý. Chitosan đã đưc s dng đ bo qun xồi, cam, dâu tây (Piyabutr, 2002, Varaporn, 2002, Chucheep, 2002). S dng chitosan bao trái cây (coating) cĩ th kéo dài thi gian bo qun 15 ngày nhit đ phịng so v i đi chng. + Kích thích tăng trưng thc vt Hin nay chitosan oligomer đưc xp vào nhĩm điu hịa sinh trưng th h mi [68], đang đưc nghiên cu s dng trong nuơi cy mơ thc vt cho phong lan [46]. Theo Zubay (2000) thì ngồi 5 nhĩm điu hịa sinh trưng thc vt c đin đã đưc xác đnh và s dng là: auxin, gibberellin, cytokinin, ethylen và absicic thì cịn cĩ mt nhĩm điu hịa sinh trưng mi là oligosaccharins. Oligosaccharins là các oligosaccharide cha vài chc đơn v. Oligosaccharins là nhng tín hiu phân t (molecular signals) hot hĩa và điu hịa mt s h thng gen c a thc vt. Hadwiger (2002), chng minh rng chitosan oligomer là tín hiu phân t hot hĩa trên 20 loi gen khác nhau ca thc vt. Ngồi ra, nhiu kt qu nghiên cu cũng cho thy oligoalginate, chitosan oligomer cĩ th kích thích sinh trưng ca thc vt gián tip, trc tip qua tăng hàm lưng dip lc t trong lá, kích thưc lc lp tăng, tăng cưng đ quang hp ca cây[41]. Chavagrit (2002), th nghim chitosan chiu x đ kích thích sinh trưng cho phong lan sau 30 ngày sinh khi r và cây tăng t 2060% so vi đi chng nng đ thích hp nht là 50 ppm. Sasitorn (2002) phun chitosan cho rau ci đ tăng năng sut t 1331%. Hirano (1996), khi s dng chitosan oligomer x lý c ging khoai tây làm tăng năng sut khoai tây lên 50% so vi đi chng. Kume, Nagasawa
45. 34 (2000) khi b sung chitosan olygomer vào dung dch thy canh làm tăng quang hp, chiu dài r, sinh khi ca lc, lúa. Khyn Lay Nge, Steven (2006) nghiên cu s dng chitosan oligomer như là cht kích thích sinh trưng thay th các cht kích thích sinh trưng truyn thng trong nuơi cy mơ phong lan. Nng đ chitosan oligomer s dng ti ưu cho to protocorm là 15 ppm và to cây con là 20 ppm. Khi lưng phân t ti thích t 1, 10 kDa. Nguyen Anh Dung (2004) thí nghim trên đu tương cho thy làm sinh trưng, nt sn và năng sut lên 36% so vi đi chng khi s lý ht ging vi chitosan oligomer. Nguyen Anh Dung (2001) nghiên cu phun chitosan oligomer cho rau ci xanh, vi nng đ 25 ppm làm tăng năng sưt t 2030% so vi đi chng. Cơ ch tác đng ca chitosan, chitosan oligomer đã đưc làm sáng t bng k thut sinh hc phân t. Hadwiger (2002) đã chng minh chitosan oligomer là tín hiu phân t hot hố và tăng cưng hot đng ca hàng lot gen trong h thng đ kháng ca thc vt và các gen liên quan đn trao đi cht như chitinase, chitosanase, glucanase, tăng cưng tng hp phytoalexin, proteinase inhibitor, tăng cưng tng hp xenlulose, lignin, Tình hình nghiên cu ng dng chitin, chitosan và nht là chitosan oligomer cịn khá mi m. Nguyn Quc Hin (1999) cĩ nghiên cu thu nhn các oligoalginate tách ra t rong bin đ s dng trong nơng nghip. Sau đĩ, Nguyn Quc Hin, Phm Th L Hà (1999) cũng nghiên cu ch to chitosan oligomer bng k thut bc x gamma. Tuy nhiên, phương pháp này cịn cĩ nhiu nhưc đim so vi phương pháp enzyme là giá thành cao, các phân đon oligomer cĩ khi lưng phân t khơng tp trung, vì vy hot tính sinh hc thưng thp. Lê Quang Luân (2002) cũng nghiên cu s dng chitosan oligomer đưc ct bng bc x gama trong nuơi cy mơ thc vt. Kt qu cho thy,
46. 35 chitosan chiu x gama vi liu 100 kGy cĩ hiu ng kích thích sinh trưng ca 4 loi cây nuơi cy mơ là: dâu tây, Limonium latifolium, Eustoma grandiflorum and Chrysanthemum morifolium. Limpanavech (2008), chng minh rng chitosan oligomer vi mc đ deacetyl hĩa 80% đã làm tăng kích thưc ca lc lp và bĩ mch (vascular bundle) cây hoa lan Dendrobium, nng đ thích hp là 1050 ppm. Tác gi cũng chng minh rng phun chitosan oligomer làm cho cây ra hoa sm hơn, s lưng cm hoa/cây, s hoa/cum hoa cũng tăng lên so vi đi chng. Nguyn Anh Dũng (2002, 2004), nghiên cu phun chitosan oligomer (dp=816) lên cây đu tương và lc. Kt qu cho thy nng đ phun 30 ppm làm tăng hàm lưng dip lc trong lá đu tương và lc lên t 17 32%[30],[32]. Nguyn Anh Dũng (2007), cũng nghiên cu nh hưng ca chitosan, chitosan oligomer đn hàm lưng dip lc khi phun lên lá cà phê. Kt qu cho thy, đi vi chitosan thì nng đ thích hp là 80 ppm, và 50 ppm vi chitosan oligomer[36]. Nge (2006), cũng nghiên cu s dng chitosan oligomer trong nuơi cy mơ hoa lan Dendrobium thay th các cht kích thích sinh trưng truyn thng. Tác gi kho sát nng đ chitosan oligomer, khi lưng phân t và ngun chitosan oligomer sn xut t nm và t v tơm. Kt qu thy chitosan oligomer cĩ khi lưng phân t 110 kDa cĩ hot tính kích thích sinh trưng mnh nht, làm tăng khi lưng ca protocorm ca mơ hĩa lan lên nhiu ln[46]. nh hưng ca nng đ chitosan oligomer đn khi lưng ca protocorm, kt qu ca tác gi cho thy nng đ thích hp ca chitosan oligomer 10 kDa là t 1015ppm và ngun chitosan oligomer t nm cĩ hot
47. 36 tính mnh kích thích sinh trưng hơn t v tơm. nh hưng ca nng đ chitosan oligomer 10kDa t nm đn s lưng, khi lưng chi lan, kt qu cho thy nng đ thích hp là 20ppm. Nguyn Quc Hin và Nagasawa (2000), nghiên cu nh hưng ca oligoalginate (ct bng bc x gamma) đn quang hp, sinh trưng ca lúa mì, đu lc, lúa bng cách b sung vào dung dch thy canh. Kt qu cho thy, oligoalginate, chitosan oligomer làm tăng cưng đ quang hp ca các loi cây thí nghim lên 3040%, sinh khi, chiu dài r ca các loi cây này đu tăng mnh so vi đi chng[4]. Vi các thí nghim trên đng rung, nhiu nghiên cu cũng cho thy chitosan oligomer cĩ tác dng tăng hàm lưng dip lc trong lá, kích thích tăng trưng và tăng năng su t cây trng. Chibu (2001), nghiên cu hiu ng kích thích sinh trưng ca chitosan 100 kDa trên mt s cây trng và nhiu cách như tưi vào đt, phun lên lá. Kt qu cho thy lá ca các loi cây trng như xà lách, cà chua, lúa cn xanh đm, năng sut tăng mnh so vi đi chng và nng đ s dng t 0.10.5% tùy loi cây trng[27]. Nguyn Anh Dũng cũng nghiên cu th nghim hiu lc ca chitosan oligomer trên nhiu loi cây trng trên các thí nghim đng rung như trên cây đu tương (2002), đu lc (2004), trên cây lúa (2006), cây bơng vi (năm 2005, 2007), cây cà phê (2007). Nguyn Anh Dũng (2002), nghiên cu x lý ht ging (coating seed) đu tương đã làm tăng năng sut đu tương lên 36%. Kt qu nghiên cu trên cây lc (2004) cho thy nng đ thích hp là 40ppm cĩ tác dng kích thích tăng trưng chiu cao cây, sinh khi, và s cành h u hiu[3].
48. 37 So sánh hiu qu kích thích tăng trưng và năng sut lc ca chitosan oligomer vi mt s loi phân bĩn lá khác trên th trưng cho thy chitosan oligomer hiu qu cao hơn nhiu. Th nghim chitosan oligomer vi nng đ 3040 ppm trên cây lúa đưc thc hin ti Vin lúa đng bng sơng Cu Long cho kt qu kh quan, chitosan oligomer làm tăng năng sut lúa xp x 20% và hiu qu cao hơn mt s phân bĩn lá khác. Kt qu nghiên cu này cho thy năng sut tăng là do ch yu tăng s ht chc/bơng và % ht chc. Nitar (2004), cũng nghiên cu th nghim trên cây lúa cho kt qu tương t. Tác gi x lý ht ging vi nng đ 30ppm, và phun tip 2 ln/v đã làm tăng năng sut lúa ti 40% Myanmar[57]. Nguyn Anh Dũng (2006) nghiên cu th nghim chitosan oligomer trên cây lúa ti huyn Ea Kar, tnh Đak Lak cho kt qu nng đ phun 40 ppm làm gia tăng năng sut 12.35% so vi đi chng và đt hiu qu cao hơn so vi hai ch phm Grow và AC. Đc đim ca ơ thí nghim phun chitosan oligomer là lá lúa vn cịn gi màu xanh khi lúa đã chín. Vì vy kh năng quang hp, tích lũy cht khơ thí nghim phun chitosan oligomer mnh hơn, vì vy cho t l ht chc my cao hơn[35]. Thí nghim phun chitosan oligomer trên cây bơng vi ti Trung tâm Nghiên cu bơng Tây Nguyên ca Nguyn Anh Dũng và Phm Xuân Hưng (2007) cũng cho kt qu rt kh quan. Kt qu cho thy chitosan oligomer cĩ tác dng kích thích sinh trưng chiu cao cây. S khác bit v chiu cao cây cơng thc cĩ phun chitosan oligomer vi đi chng là cĩ ý nghĩa thng kê. nh hưng ca chitosan đn các ch tiêu cu thành năng sut cho thy chitosan oligomer cĩ tác dng làm tăng s qu/bơng và s qu/m 2. Riêng khi lưng ca qu thì khơng cĩ s khác bit cĩ ý nghĩa thng kê. Năng sut thc thu ca thí nghim phun chitosan oligomer tăng so vi đi chng chăm sĩc
49. 38 theo qui trình ca cơng ty t 1540%[37]. Sarathchandra (2004), nghiên cu x lý ht và phun lên lá cho cây kê. Thi gian ngâm ht là 39 h. Kt qu chitosan làm tăng t l ny mm ca ht kê và sc sng ca cây con cũng như các ch tiêu sinh trưng khác như chiu cao cây, chiu dài bơng, s ht trên bơng và khi lưng 1000 ht[61]. Uddin (2004), nghiên cu phun chitosan và mt s đưng monosaccharide lên hoa Cát tưng Lisianthus ( Eustoma grandiflorum). Kt qu cho thy chitosan làm tăng s n hoa và tăng hàm lưng anthocyan, nh vy màu sc ca hoa đm đà hơn[67]. Ngồi ra cịn nhiu nghiên cu khác ca Sasitorn (2002) phun chitosan cho rau ci tăng năng sut t 1331%. Nguyn Quc Hin (1998, 2000) phun oligoalginate cho hoa cúc, trà, mía, lúa làm tăng năng sut t 1015%. + Thuc BVTV sinh hc Chitosan và chitosan olygomer cĩ hot tính kích thích tăng trưng thc vt, tăng s lưng vi sinh vt cĩ li và hn ch các nm gây hi trong đt, hot hĩa tăng cưng h thng đ kháng ca thc vt. Cơ ch hot đng ca chitosan theo sơ đ ca Gueddari (2004) như sau: Chitosan Cơ ch trc tip Cơ ch gián tip Cây trng Tăng vsv đi kháng Nhn bit phân t Kích thích cơ ch Cm ng h thng kháng ch đng đ kháng Hot tính kháng Vi sinh vt Vi sinh v t gây bnh Chitinase Hình 1.11: Cơ ch hot đng ca Chitosan
50. 39 Suwalee (2002), th nghim phun chitosan cho cây ngơ đ tr bnh bc lá, kt qu cho thy nu s dng nng đ 80 ppm thì chitosan hiu qu hơn và an tồn hơn so vi các loi thuc BVTV trên th trưng[64]. Nguyn Anh Dũng (2004) nghiên cu s dng chitosan oligomer và chitosan oligomer ci bin đ kháng nm Fusarium, vi khun gây bnh héo xanh cho lc Pseudomnas solanacerum và tuyn trùng ký sinh Meloidogine incognita , s lưng tuyn trùng ký sinh gim t 68 ln sau khi tưi chitosan oligomer 3 tháng. Rabea (2008) cũng nghiên cu tng hp alkyl và arylchitosan s dng làm thuc tr nm và tr sâu[59]. Tĩm li, trên th gii trong nhng năm gn đây đã cĩ nhiu nghiên cu ng dng ca chitosan, chitosan oligomer trong nơng nghip như kích thích sinh trưng, kháng bnh cho cây trng. Tuy nhiên, phn ln các nghiên cu cịn qui mơ phịng thí nghim, ít cĩ các nghiên cu thc t trên đng rung. Đc bit là các nghiên cu trên đng rung vi các loi cây cơng nghip ngn ngày như bơng vi, lc và đu tương.
51. 40 CHƯƠNG II: NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 2.1. Ni dung nghiên cu + Nghiên cu nh hưng ca các hĩa cht kh trùng đn sc sng ca mơ cy + Nghiên cu nh hưng thành phn mơi trưng đn hình thành protocorm. + Nghiên cu nh hưng ca nng đ, t l auxin/cytokinin đn hình thành chi, r cây con trong invitro. + Nghiên cu nh hưng ca nng đ chitosan oligomer đn sinh trung ca khoai lang nuơi cy mơ. 2.2. Phương pháp nghiên cu 2.2.1. Vt liu, hĩa cht C khoai lang thuc ging khoai lang cao sn Nht Bn mua ch Tân Thành, thành ph Buơn Ma Thut. C khoai lang đưc ra sch dưi vịi nưc chy, chúng trên lp bơng gịn m trong r nha sch. C khoai lang đưc tưi m 1 ln/ngày cho đn khi chi mm phát trin đ tiêu chun đ ra ca thí nghim. Chi mm ly t c khoai lang khong 1,5 – 2 cm đưc ra sch dưi vịi nưc chy khong 30 phút, lc cn 70 o trong 1 phút, ngâm chúng vào dung dch nưc ty javel vi nng đ 30% (v/v) trong 20 phút sau đĩ đưc ra li bng nưc ct vơ trùng trong t cy 3 ln. Chi mm sau khi kh trùng đưc cy vào bình tam giác (V = 330 ml) cha 65 ml mơi trưng MS (Murashige và Skoog, 1962) cĩ b sung saccharose 30g/l, agar 7,5g/l. Bình cha mu đưc đt trong phịng nuơi cây ca phịng thí nghim b mơn sinh hc thc vt – trưng Đi hc Tây Nguyên cĩ thi gian chiu sáng là 10 gi/ngày, nhit đ phịng 25 ± 2 oC, đ m phịng 60 ± 5% .
52. 41 Chi non vơ trùng đưc đưa vào nuơi in vitro là ngun nguyên liu cho các thí nghim tip theo. Chitosan oligomer sn xut t v tơm cua cĩ khi lưng phân t 10.000Da Các hĩa cht nuơi ct mơ thc vt như NAA, IBA, các vitamin, NaNO 3, K 2HPO 4, MgSO 4, CaCl 2, NaHClO 3, H 2O2, là hĩa cht tinh khit. 2. 2.2. Phương pháp nghiên cu 2.2.2.1. Nghiên cu nh hưng ca các hĩa cht kh trùng đn sc sng ca mơ nuơi cy Thí nghim 2 yu t: thi gian kh trùng và nng đ cht kh trùng vi 3 ln lp li. Nghiên cu th nghim 3 loi cht kh trùng thơng dng trong nuơi cy mơ là 3 cht kh trùng là hydro peroxyde, Natri hypochloride và thu ngân clorua. Chi mm phát trin t c khoai lang trong điu kin phịng thí nghim đưc dùng làm ngun nguyên liu ban đu đ thu nhn mu. Chi mm cĩ kích thưc t 1,52 cm đưc ra sch dưi vịi nưc chy khong 30 phút, lc cn 70 o trong 1 phút, ngâm chúng vào các dung dch kh trùng vi nng đ và thi gian theo yêu cu ca thí nghim. Sau đĩ ra sch li bng nưc ct vơ trùng trong t cy 3 ln. Mu đưc cy vào bình tam giác cĩ cha 65 ml mơi trưng. (nh 2.1;2.2) Mơi trưng nuơi cy là mơi trưng MS (Murashige và Skoog, 1962) cĩ b sung saccharose (cơng ty đưng Biên Hịa, Đng Nai) 30g/l, agar (Cơng ty TNHH Hi Long, Ho Phịng) 7,5g/l. pH ca mơi trưng đưc điu chnh v 5.8 bng KOH 1N và HCl 1N, sau đĩ mơi trưng đưc hp kh trùng 121 oC trong thi gian 20 phút. Bình tam giác cha mu đưc nuơi trong phịng nuơi cây dưi thi gian chiu sáng là 10 gi/ngày, nhit đ phịng 25 ± 2 oC, đ m phịng 60 ± 5%.
53. 42 B trí thí nghim: + Nghiên cu nh hưng ca hydro peroxyde các nng đ và thi gian kh trùng đn sc sng ca chi mm khoai lang. Nghim thc Nng đ hydro Thi gian kh trùng peroxyde % (v/v) (phút) N10 T10 10 10 N10 T15 10 15 N10 T20 10 20 N20T10 20 10 N20T20 20 20 N20T30 20 30 N30 T10 30 10 N30 T20 30 20 N30 T30 30 30 + Nghiên cu nh hưng ca Natri hypochloride các nng đ và thi gian kh trùng đn sc sng ca chi mm khoai lang. Nghim thc Nng đ Natri Thi gian kh trùng hypochloride % (v/v) (phút) N10 T10 10 10 N10 T20 10 20 N10 T30 10 30 N20 T10 20 10 N20 T20 20 20 N20 T30 20 30 N30 T10 30 10 N30 T20 30 20 N30 T30 30 30
54. 43 + Nghiên cu nh hưng ca thu ngân clorua các nng đ và thi gian kh trùng đn sc sng ca chi mm khoai lang. Nghim thc Nng đ HgCl 2 % (v/v) Thi gian kh trùng (phút) N0.1 T5 0.1 5 N0.1 T10 0.1 10 N0.1 T15 0.1 15 N0.3 T5 0.3 5 N0.3 T10 0.3 10 N0.3 T15 0.3 15 N0.5 T5 0.5 5 N0.5 T10 0.5 10 N0.5 T15 0.5 15 Mi thí nghim gm 9 nghim thc đưc b trí hồn tồn ngu nhiên vi 2 yu t. Mi nghim thc cĩ 3 bình tam giác, mi bình cy 3 mu, đưc lp li 3 ln. Ch tiêu theo dõi: • T l mu khơng nhim trên tng s mu cy ban đu • S mu phát trin tt và cĩ kh năng to chi. nh 2.1 Chi mm t c khoai lang đưc thu nhn đ ly mu kh trùng
55. 44 nh 2.2 Mu chi mm t c khoai lang sau khi kh trùng đưc cy vào mơi trưngMS 2. 2.2.2. Nghiên cu thành phn mơi trưng đn s hình thành protocorm Mu cy là mơ so t gc cây khoai lang cy trong mơi trưng MS cĩ b sung saccharose 30g/l, agar 7,5g/l, BA 1mg/l, Kinetin 1mg/l đưc 30 ngày. Mi mơ so t gc cây đưc ct ra làm 6 phn bng nhau. Mu đưc cy trong bình tam giác cĩ cha 65ml mơi trưng (nh 2.3; 2.4). Bình tam giác cha mu đưc nuơi trong ti phịng thí nghim vi nhit đ phịng 25 ± 2 oC, đ m phịng 60 ± 5% . Thí nghim s dng 5 loi mơi trưng nuơi cy ci bin trên cơ s mơi trưng MS: ½ MS; 2/3 MS; MS; MS + 200mg/l KH 2PO 4; MS + 100ml/l nưc da. Tt c 5 loi mơi trưng này đu cĩ b sung saccharose 30g/l, agar 7,5g/l, cht điu hịa sinh trưng thc vt NAA 5mg/l và Kinetin các nng
56. 45 đ 5mg/l; 10mg/l; 15mg/l. pH ca mơi trưng đưc điu chnh v 5.8 bng KOH 1N và HCl 1N, sau đĩ mơi trưng đưc hp kh trùng 121 oC trong thi gian 20 phút. B trí thí nghim: NT Mơi trưng NAA (mg/l) Kinetin (mg/l) 1 MS 5 5 2 MS 5 10 3 MS 5 15 4 ½ MS 5 5 5 ½ MS 5 10 6 ½ MS 5 15 7 2/3 MS 5 5 8 2/3 MS 5 10 9 2/3 MS 5 15 10 MS + 200mg/l KH 2PO 4 5 5 11 MS + 200mg/l KH 2PO 4 5 10 12 MS + 200mg/l KH 2PO 4 5 15 13 MS + 100ml/l nưc da 5 5 14 MS + 100ml/l nưc da 5 10 15 MS + 100ml/l nưc da 5 15 Thí nghim gm 15 nghim thc đưc b trí hồn tồn ngu nhiên vi 3 yu t. Mi nghim thc cĩ 4 bình tam giác vi 6 mu/bình, đưc lp li 3 ln. Ch tiêu theo dõi: • Thi gian hình thành protocorm (ngày) • T l hình thành protocorm (%)
57. 46 nh 2.3. Mơ so t gc thân cây khoai lang nh2.4. Mi mơ so đưc ct 30 ngày tui đưc chn đ thu nhn mu thành 6 phn và cy vào bình tam giác 2.2.2.3. Nghiên cu nh hưng ca nng đ và loi cht điu hịa sinh trưng thc vt lên s bt chi và tăng trưng chi t đt thân khoai lang in vitro Đt thân cây khoai lang sau 30 ngày nuơi cy (mi đt thân dài 1cm) đưc s dng trong thí nghim (nh 2.5; 2.6). Mu đưc cy trên 65 ml mơi trưng cha trong bình tam giác. Mơi trưng nuơi cy là mơi trưng MS cĩ b sung saccharose 30g/l, agar 7,5g/l, cht điu hịa sinh trưng thc vt: BA vi nng đ thay đi : 0; 1; 2mg/l Kinetin vi nng đ thay đi là: 0; 1; 2mg/l pH ca mơi trưng đưc điu chnh v 5.8 bng KOH 1N và HCl 1N, sau đĩ mơi trưng đưc hp kh trùng 121 oC trong thi gian 20 phút. Bình tam giác cha mu đưc nuơi trong phịng nuơi cây dưi thi gian chiu sáng là 10 gi/ngày, nhit đ phịng 25 ± 2 oC, đ m phịng 60 ± 5%.
58. 47 B trí thí nghim: Nghim thc Nng đ BA (mg/l) Nng đ KN (mg/l) B0K0 0 0 B0K1 0 1 B0K2 0 2 B1K0 1 0 B1K1 1 1 B1K2 1 2 B2K0 2 0 B2K1 2 1 B2K2 2 2 Thí nghim gm 9 nghim thc đưc b trí hồn tồn ngu nhiên vi 2 yu t, mi nghim thc cĩ 4 bình, vi 4 mu/bình, đưc lp li 3 ln. Ch tiêu theo dõi sau 30 ngày nuơi cy: % mu bt chi Chiu cao chi (mm) S lá Khi lưng chi tươi (g) Khi lưng chi khơ (g) S r Chiu dài r (mm) Khi lưng r tươi (g) Khi lưng r khơ (g)
59. 48 Đt thân Đt thân Đt thân Đt thân nh 2.5 Cây khoai lang in vitro 30 ngày nh 2.6 Các đt thân đưc thu tui và các v trí đt thân đưc chn đ nhn và cy vào bình tam giác thu nhn mu cy 2.2.2.4. Nghiên cu nh hưng ca nng đ và loi cht điu hịa sinh trưng thc vt lên s to r và tăng trưng chi cây khoai lang in vitro Chi ngn t cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuơi cy (chi cĩ 2 lá tht) đưc s dng trong thí nghim (nh 2.7; 2.8). Mu đưc cy trên 65 ml mơi trưng cha trong bình tam giác. Mơi trưng nuơi cy là mơi trưng MS cĩ b sung saccharose 30g/l, agar 7,5g/l, cht điu hịa sinh trưng thc vt:
60. 49 IBA vi nng đ thay đi: 0; 1; 2 mg/l NAA vi nng đ thay đi : 0; 1 mg/l pH ca mơi trưng đưc điu chnh v 5.8 bng KOH 1N và HCl 1N, sau đĩ mơi trưng đưc hp kh trùng 121 oC trong thi gian 20 phút. Bình tam giác cha mu đưc nuơi trong phịng nuơi cây dưi thi gian chiu sáng là 10 gi/ngày, nhit đ phịng 25 ± 2 oC, đ m phịng 60 ± 5%. B trí thí nghim: Nghim thc Nng đ IBA (mg/l) Nng đ NAA (mg/l) I0N0 0 0 I0N1 0 1 I1N0 1 0 I1N1 1 1 I2N2 2 0 I2N1 2 1 Thí nghim gm 6 nghim thc đưc b trí hồn tồn ngu nhiên vi 2 yu t. Mi nghim thc cĩ 4 bình, vi 3 mu/bình, đưc lp li 3 ln. Ch tiêu theo dõi sau 30 ngày nuơi cy: % ra r S r Chiu dài r (mm) Khi lưng r tươi (g) Khi lưng r khơ (g) S lá Chiu cao chi (mm).
61. 50 nh 2.7. Chi ngn cây khoai nh 2.8. Các chi ngn đưc cy lang 30 ngày tui đưc chn làm vào bình tam giác mu cy 2.2.2.5. Nghiên cu nh hưng ca nng đ chitosan oligomer đn sinh trưng ca khoai lang nuơi cy mơ Đt thân t cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuơi cy đưc s dng trong thí nghim (nh 2.9; 2.10). Mu đưc cy trên 65 ml mơi trưng cha trong bình tam giác. Thí nghim s dng mơi trưng ti ưu t ni dung 2.3 (2mg/l BA + 1mg/l Kinetin) cĩ b sung 5 nng đ chitosan khác nhau: 0; 10; 20; 30; 50 ppm. pH ca mơi trưng đưc điu chnh v 5.8 bng KOH 1N và HCl 1N, sau đĩ mơi trưng đưc hp kh trùng 121 oC trong th i gian 20 phút. Bình tam giác cha mu đưc nuơi trong phịng nuơi cây dưi thi gian chiu sáng là 10 gi/ngày, nhit đ phịng 25 ± 2 oC, đ m phịng 60 ± 5%. B trí thí nghim:
62. 51 NT BA (mg/l) Kinetin (mg/l) Chitosan oligomer ppm/l C0 2 1 0 C10 2 1 10 C20 2 1 20 C30 2 1 30 C50 2 1 50 Thí nghim gm 5 nghim thc đưc b trí hồn tồn ngu nhiên vi 1 yu t. Mi nghim thc cĩ 4 bình, vi 4 mu/bình, đưc lp li 3 ln. Ch tiêu theo dõi sau 30 ngày nuơi cy: % mu bt chi Chiu cao chi (mm) S lá Khi lưng chi tươi (g) Khi lưng chi khơ (g) S r Chiu dài r (mm) Khi lưng r tươi (g) Khi lưng r khơ (g). Đt thân Đt thân Đt thân Đt thân nh 2.9 Cây khoai lang in vitro 30 ngày nh 2.10 Các đt thân đưc thu tui và các v trí đt thân đưc chn đ nhn và cy vào bình tam giác thu nhn mu cy
63. 52 2.2.2.6. X lý s liu thng kê Phn mm thng kê MSTACTC (Đi hc Michigan, M) đưc s dng đ phân tích các s liu thu nhn đưc trên tt c các thí nghim.
64. 53 CHƯƠNG III: KT QU VÀ THO LUN 3. 1. nh hưng ca các hĩa cht kh trùng đn sc sng ca chi mm t c khoai lang 3.1.1. nh hưng ca cht kh trùng thu ngân clorua đn sc sng ca chi mm t c khoai lang Chi mm t c khoai lang sau khi x lý bng thu ngân clorua các mc nng đ 0,1%; 0,3%; 0,5% trong thi gian 5; 10; 15 phút đưc cy trên mơi trưng MS. Sau thi gian 3 tun cho thy s phn ng rõ rt ca mu đi vi cht kh trùng thu ngân clorua các nng đ và thi gian khác nhau. T l mu nhim, t l mu sng bt chi và mu cht là nhng ch tiêu đánh giá kh năng kh trùng ca thu ngân clorua lên chi mm t c khoai lang(bng 3.1). Kt qu hình 1 (A,B,C) cho thy mc thi gian 5 phút, t l sng sĩt ca mu t l thun vi nng đ x lý. Nng đ x lý càng cao thì t l mu sng càng cao và t l mu nhim gim xung, nng đ thu ngân clorua 0,5% trong 5 phút s mu đưa vào đt 100%. Tuy nhiên, khi tăng thi gian x lý lên 10 phút thì t l mu sng bt chi li t l nghch vi nng đ x lý. Nng đ x lý càng cao thì t l sng sĩt ca mu càng gim. nng đ thu ngân clorua 0,1% trong 10 phút cho thy t l mu sng đt 100% (100%; 50%; 20% tương ng vi nng đ x lý 0,1%; 0,3%; 0,5% trong 10 phút), đng thi t l mu b cht li tăng lên khi tăng nng đ x lý (80% mu cht nng đ 0,5%). mc thi gian 15 phút khi tăng nng đ thu ngân clorua lên 0.3% thì t l mu sng bt chi cao nht là 60% nhưng khi tăng nng đ thu ngân clorua lên 0,5% sau 1 tun thì mu cht hồn tồn. hình 1C cho thy nng đ thu ngân clorua 0,5% vi
65. 54 các mc thi gian khác nhau thì khơng cĩ mu nào b nhim nhưng t l mu sng sĩt gim dn, t l mu cht tăng dn khi tăng thi gian x lý (bng 3.1). Trong hai nghim thc N 0,1T10 và N 0,5T5 cho thy t l mu sng bt chi đu đt 100% sau 3 tun nuơi cy. Tuy nhiên, kh năng tăng trưng ca chi li khác nhau trong hai nghim thc này. nghim thc N 0,1T10 sau 10 ngày chi ra r và đưc 1 lá tht, sau 21 ngày chi đưc 4 lá tht (nh 3.1). cịn nghim thc N 0,5T5 sau 15 ngày ch cĩ khong 30% mu bt chi mi ra đưc 1 lá tht, các mu cịn li cĩ bt chi nhưng phát trin rt chm và sau 21 ngày kh năng phát trin ca chi trong nghim thc này khơng thay đi nhiu. Bng 3.1 . nh hưng ca cht kh trùng thu ngân clorua các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm thu nhn t c khoai lang sau 3 tun nuơi cy % mu nhim Nghim thc % mu % mu % mu % tng % mu nhim nm nhim nm nhim s mu bt chi và khun khun nhim a c a b N0,1T5 3,3 23,3 13,3 40 60 b d c a N0,1 T10 0 0 0 0 100 b d c c N0,1 T15 0 0 0 0 50 a c ab b N0,3 T5 0 23,3 13,3 37 63,3 b b b c N0,3 T10 0 0 30 30 50 b a a b N0,3 T15 0 0 40 40 60 b d c a N0,5 T5 0 0 0 0 100 b d c d N0,5 T10 0 0 0 0 20 b d c e N0,5 T15 0 0 0 0 0 ANOVA z Nng đ NS Thi gian NS NS Nng đ x Thi gian NS CV (%) 51,9 8,0 5,3 3,9 1,7 z , NS: khác bit cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01 hoc khơng cĩ s khác bit. a, b, c : các tr s trên cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Duncan ’s Multiple Range Test.
66. 55 0.1% 120 (%) 100 80 60 40 20 0 5 10 15 A Thi gian x lý (phút) 0.3% 70 (%) 60 50 40 30 20 10 0 5 10 15 B Thi gian x lý (phút) 0.5% (%) % nm + khun 120 100 % nm 80 % khun 60 % Tng nhim 40 % Mu bt chi 20 % cht 0 5 10 15 C Thi gian x lý (phút) Hình 3.1. nh hưng ca cht kh trùng thu ngân clorua đn sc sng ca chi mm t c khoai lang sau 3 tun nuơi cy các nng đ 0.1% (A), 0.3% (B), 0.5% (C)
67. 56 Hu ht các mơ hay cơ quan thc vt đu cĩ th đưc s dng đ nuơi cy nhưng mc đ thành cơng ph thuc vào h thng mơi trưng s dng, lồi thc vt nuơi cy và s kh trùng mu cy thành cơng đ thu đưc mt lưng ln mu cy vơ trùng và vn cịn kh năng tăng trưng [10]. Khoai lang là mt lồi cây thân tho, cĩ thân bị trên mt đt, c nm trong đt cho nên vic kh trùng mu tương đi khĩ khăn. Trong thí nghim này, mu đưc chn là chi mm t c khoai lang. Tác nhân vơ trùng ngồi dit nm khun cịn nh hưng đn mơ cy, vì vy vic la chn hĩa cht phi căn c vào mc đ nhim, s mn cm ca mu, nng đ x lý và thi gian x lý thích hp. Đi vi cht kh trùng là thu ngân clorua, kt qu thu nhn đưc khi so sánh trên 3 nng đ 3 mc thi gian kh trùng khác nhau đã chng minh điu đĩ. T l mu sng và bt chi 100% khi mu đưc x lý nng đ thu ngân clorua 0,1% trong 10 phút. Kt qu này cũng tương t vi hoa loa kèn (Lê Thi Thu V và cs, 1999)[16]. Khi tăng nng đ lên 0,3% và 0,5% và thi gian x lý lên 15 phút thì t l mu b nhim gim đi nhưng t l mu cht tăng lên. Gia hai nghim thc thu ngân clorua 0.1% trong 10 phút và thu ngân clorua 0,5% trong 5 phút cho t l mu sng khơng nhim là ging nhau (100%) sau 3 tun nuơi cy .Tuy nhiên, kh năng tăng trưng ca chi trong hai nghim thc này là khác nhau. nghim thc thu ngân clorua 0,1% trong 10 phút sau 10 ngày nuơi cy chi ra r và đưc 1 lá tht, sau 21 ngày chi đưc 3 lá tht cịn nghim thc thu ngân clorua 0.5% trong 5 phút sau 15 ngày nuơi cy ch cĩ khong 30% mu bt chi mi ra đưc mt lá tht, các mu cịn li cĩ bt chi nhưng chi phát trin rt chm và sau 21 ngày kh năng phát trin ca chi trong nghim thc này khơng thay đi nhiu. Điu đĩ cho thy vic x lý thu ngân clorua nng đ cao đi vi mu chi mm t c khoai lang đã làm bin đi mt s cu trúc trong t bào như phá hy vách
68. 57 t bào phn v và phn mu tip xúc vi hĩa cht làm ngăn cn vic hp th cht dinh dưng ca t bào dn ti c ch s sinh trưng và gim t l sng sĩt ca mu cy. 3.1.2. nh hưng ca cht kh trùng Natri hypochloride các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm t c khoai lang Mu sau khi đưc kh trùng và cy vào mơi trưng, nu khơng b nhim sau mt tun s thích nghi vi mơi trưng và bt đu phát trin tr li. S phn ng ca chúng là khác nhau khi đưc x lý các nng đ và thi gian khác nhau. Kt qu thng kê bng 3.2 cho thy s khác bit rt cĩ ý nghĩa trên các ch tiêu t l mu nhim và t l mu bt chi. Đi vi các mu đưc x lý nng đ Natri hypochloride cao hay thi gian x lý lâu thì chi kém phát trin hoc gn như khơng phát trin đưc và t l mu b cht cao do phn mơ bên ngồi b tn thương, cĩ màu trng đc. Hình 3.2 cho thy s mu nhim t l nghch vi nng đ x lý. Khi tăng nng đ x lý lên càng cao thì t l mu b nhim càng thp. nng đ natri hypochloride thp và thi gian x lý ngn (N10T10 ) thì t l mu cy b nhim cao nht (83,3%), trong đĩ ti 36,7% s mu b nhim c nm và vi khun (bng 3.2). nghim thc N 20 T30 cĩ t l mu sng và bt chi cao nht(76,7%). Khi tăng nng đ x lý lên 30% thì t l mu nhim gim xung cịn 20% nhưng s mu cht tăng lên theo các mc thi gian (30%, 33,3%, 43,3% tương ng vi thi gian x lý 10; 20; 30 phút) chng t mu cy rt mn cm vi cht kh trùng (hình 3.2)
69. 58 Bng 3.2 nh hưng ca cht kh trùng Natri hypochloride các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm thu nhn t c khoai lang sau 3 tun nuơi cy % mu nhim % mu % mu % mu % tng % mu Nghim thc nhim nhim nhim s mu bt nm và nm khun nhim chi khun N10T10 36,7 26,7 20b c 83,3a 16,7f N10T20 30 30 23,3b 83,3a 16,7f N10T30 26,7 23,3 23,3b 73,3b 26,7f N20T10 10 13,3 36,7a 60 c 40 cd N20T20 10 6,7 36,7a 50 d 50 b N20T30 3,3 6,7 13,3de 23,3e 76,7a N30T10 3,3 3,3 16,7cd 23,3e 46,7bc N30T20 6,7 6,7 10 e 23,3e 43,3bcd N30T30 3,3 3,3 13,3de 20 e 36,7d ANOVA z Nng đ Thi gian NS NS * Nng đ x Thi gian NS NS CV (%) 36,5 42,4 24,3 9,0 11,5 z , *, NS: khác bit cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01, 0,05 hoc khơng cĩ s khác bit. a, b, c : các tr s trên cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Duncan ’s Multiple Range Test.
70. 59 90 (%) % tng nhim 80 % mu bt chi % mu cht 70 60 50 40 30 20 10 0 N10T10 N10T20 N10T30 N20T10 N20T20 N20T30 N30T10 N30T20 N30T30 Nghim thc Hình 3.2 nh hưng ca cht kh trùng Natri hypochloride các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm t c khoai lang sau 3 tun nuơi cy 3.1.3 nh hưng ca cht kh trùng hydro peroxyde các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm t c khoai lang. Chi mm t c khoai lang sau khi x lý bng hydro peroxyde các nng đ và thi gian khác nhau đưc cy trên mơi trưng MS. Sau 3 tun cho thy s phn ng rõ rt ca mu đi vi cht kh trùng hydro peroxyde. S khác bit rt cĩ ý nghĩa đưc th hin trên tt c các ch tiêu theo dõi. Kt qu bng 3.3 cho thy nng đ 30% trong 10 phút, s mu sng và bt chi cao nht là 50%. nng đ 30% khi tăng thi gian lên 20 phút và 30 phút thì t l mu sng và bt chi gim xung (26,7% và 20%), s mu nhim cũng gim xung nhưng xut hin mu cht cĩ màu nâu đen. nng đ 10% và 20% trong 10 phút s mu b nhim là 100% trong tt c các nghim thc (bng 3.3, hình 3.3). Vy kh trùng mu chi mm t c khoai lang bng hydro peroxyde nng đ 30% trong 10 phút là tt nht.
71. 60 Bng 3.3 nh hưng ca cht kh trùng hydro peroxyde các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm thu nhn t c khoai lang sau 3 tun nuơi cy % mu nhim % mu % % mu % tng Nghim thc nhim mu nhim s mu % mu bt nm và nhim khun nhim chi khun nm d a a a d N10 T10 0 40 60 100 0 b b ab a d N10 T15 13,3 30 56,6 100 0 d a a a d N10 T20 0 40 60 100 0 a b c a d N20 T10 36,6 30 33,3 100 0 cd e b b ab N20 T20 3,3 3,3 53,3 60 40 bcd c de bc a N20 T30 6,6 23,3 23,3 53,3 46,7 bc d de cd a N30 T10 10 16,6 23,3 50 50 bc c e bc bc N30 T20 10 23,3 20 53,3 26,7 cd d d d c N30 T30 3,3 13,3 26,6 43,3 20 ANOVA z Nng đ * Thi gian NS NS NS Nng đ x Thi gian * * CV (%) 7,8 3,6 2,2 1,4 4,8 z , *, NS: khác bit cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01, 0,05 hoc khơng cĩ s khác bit. a, b, c : các tr s trên cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Duncan ’s Multiple Range Test.
72. 61 % 120 %mu nhim % mu bt chi 100 80 60 40 20 0 N10T10 N10T15 N10T20 N20T10 N20T20 N20T30 N30T10 N30T20 N30T30 nghim thc Hình 3.3 nh hưng ca cht kh trùng hydro peroxyde các nng đ và thi gian khác nhau đn sc sng ca chi mm t c khoai lang sau 3 tun nuơi cy nh 3.1 Chi đưc hình nh 3.2 Chi đưc hình nh 3.3 Chi đưc hình thành và phát trin nng thành và phát trin nng thành và phát trin nng đ thu ngân clorua 0,1% đ natri hypochliride đ Hydro peroxyde 30% trong 10 phút sau 3 tun 20% trong 30 phút sau 3 trong 10 phút sau 3 tun nuơi cy tun nuơi cy nuơi cy
73. 62 3.2. nh hưng ca thành phn mơi trưng đn hình thành protocorm Mu cy là mơ so t gc cây khoai lang in vitro 30 ngày tui. Mu sau khi cy vào các thành phn mơi trưng khác nhau đu cĩ phn ng và biu hin khác nhau tùy tng loi mơi trưng. Kt qu bng 3.4 cho thy các nghim thc 6, 9, 12, 15 đu cĩ 17% mu to protocorm. Trên mơi trưng MS cĩ b sung 200mg/l KH 2PO 4 + NAA 5mg/l + Kinetin 15mg/l (NT 12) mu bt đu to protocorm sau 4 ngày nuơi cy, nghim thc 6 và 15 mu bt đu to protocorm sau 7 ngày nuơi cy và nghim thc 9 mu bt đu to protocorm sau 10 ngày nuơi cy nhưng hình thái chi rt nh và phát trin chm. Sau 40 ngày nuơi cy chi đt 0.4cm và sau 70 ngày nuơi cy chi vn khơng phát trin thêm (bng 3.4, nh 3.4;3.5; 3.6; 3.7). S phn ng ging nhau ca các mu to protocorm các nghim thc trên là do tác đng ca cùng mt nng đ NAA 5mg/l và Kinetin 15mg/l. Trên 5 mơi trưng khác nhau, khi b sung mt lưng cht điu hịa sinh trưng thc vt như nhau thì các mơi trưng MS ci tin hình thành protocorm tt hơn trên mơi trưng MS. ngày th 70, đa s các mu đu to r, các mơi trưng cĩ b sung NAA 5mg/l + Kinetin 5mg/l mơ so phát trin ln lên cĩ màu vàng nht, r to và dài khong 4cm cĩ màu trng. Các mơi trưng cĩ b sung NAA 5mg/l + Kinetin 10mg/l hu như các mu đu hĩa nâu và cht.
74. 63 Bng 3.4 . nh hưng ca thành phn mơi trưng đn hình thành protocorm sau 40 ngày nuơi cy NT Mơi trưng NAA Kinetin Thi gian T l hình (mg/l) (mg/l) hình thành thành protocorm protocorm (ngày) (%) 1 MS 5 5 0 2 MS 5 10 0 3 MS 5 15 0 4 ½ MS 5 5 0 5 ½ MS 5 10 0 6 ½ MS 5 15 7 17 7 2/3 MS 5 5 0 8 2/3 MS 5 10 0 9 2/3 MS 5 15 10 17 10 MS + 200mg/l KH 2PO 4 5 5 0 11 MS + 200mg/l KH 2PO 4 5 10 0 12 MS + 200mg/l KH 2PO 4 5 15 4 17 13 MS + 100ml/l nưc da 5 5 0 14 MS + 100ml/l nưc da 5 10 0 15 MS + 100ml/l nưc da 5 15 7 17 Do hn ch v thi gian, kt qu thí nghim v to protocorm cịn hn ch. Chúng tơi đ ngh các nghiên cu sau tip tc nghiên cu đ hồn thin qui trình nuơi cy mơ khoai lang cao sn.
75. 64 nh 3.4 Protocorm hình thành nh 3.5 Protocorm hình thành trên mơi trưng ½ MS +NAA trên mơi trưng 2/3 MS + NAA 5mg/l + Kinetin 15mg/l 5mg/l + Kinetin 15mg/l nh 3.6 Protocorm hình thành nh 3.7 Protocorm hình thành trên mơi trưng MS + 200mg/l trên mơi trưng MS + 100ml/l KH 2PO 4 NAA 5mg/l + Kinetin nưc da NAA 5mg/l + Kinetin 15mg/l 15mg/l
76. 65 3.3. nh hưng ca nng đ, t l cht kích thích sinh trưng đn hình thành chi và r cây con trong in vitro 3.3.1. nh hưng ca N 6 benzyladenine (BA) và Kinetin các nng đ và t l khác nhau đn s hình thành chi và tăng trưng chi cây khoai lang Trên cây khoai lang in vitro 30 ngày tui, các đt thân đưc chn đ ly mu. S phn ng ca chúng là khác nhau khi đưc nuơi cy trên mơi trưng MS cĩ s thay đi nng đ BA và Kinetin. Kt qu phân tích thng kê ngày th 30 cho thy rng vi các ch tiêu khi lưng chi tươi, khi lưng chi khơ, s r, chiu dài r, khi lưng r tươi, khi lưng r khơ thì khơng cĩ s khác bit trên tt c các nghim thc đưc kho sát nhưng s khác bit rt cĩ ý nghĩa trên các ch tiêu s lá và chiu cao chi (bng 3.5). Theo quan sát thy sau 10 ngày nuơi cy thì 100% mu cy đu bt chi trên tt c các nghim thc. Trong quá trình phát sinh hình thái, s bt chi ch xut hin mt vùng nht đnh là nách lá cĩ s xut hin ca chi ng và mi đt thân ch to đưc mt chi. Nhưng mu cy cĩ s phn ng khác bit rõ rt vi s thay đi ca nng đ BA và kinetin th hin qua s lá trên chi. Nu mơi trưng MS khơng b sung cht điu hịa sinh trưng thì s lá trung bình trên cây là rt thp (3,8 lá/cây). Nu mơi trưng cĩ b sung cht điu hịa sinh trưng (BA 1mg/l và Kinetin 1mg/l) thì cĩ s lá trung bình trên cây là cao nht (5,3 lá/cây) (bng 3.5, hình 3.4). V ch tiêu chiu cao chi cũng cho kt qu tương t, trên mơi trưng khơng b sung cht điu hịa sinh trưng thc vt thì chiu cao chi trung bình là thp nht (9mm). Trên mơi trưng cĩ b sung cht điu hịa sinh trưng thc vt vi BA 2mg/l và kinetin 1mg/l thì chiu cao chi tăng lên rt rõ rt (56mm), trong khi đĩ s lá trung bình nghim thc này là 4,8 lá/cây. Nhưng khi tăng nng đ cht điu hịa sinh trưng thc vt lên vi BA 2mg/l và kinetin 2mg/l thì chiu cao chi li gim xung (44,7mm) và s lá trung
77. 66 bình nghim thc này ch là 4 lá/cây (bng 3.5, hình 3.4). Trong khi đĩ ch tiêu v khi lưng chi tươi và khi lưng chi khơ khơng cĩ s khác bit trên tt c các nghim thc đưc kho sát. nghim thc B 0K2 cĩ khi lưng chi tươi và khi lưng chi khơ cao nht (0,62g; 0,043g), mc dù cĩ chiu cao chi thp hơn trong nghim thc B 2K1 nhưng thân các cây trong nghim thc này mp đu hơn (bng 3.5). Bng 3.5 nh hưng ca BA và Kinetin lên s bt chi và tăng trưng chi t đt thân cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuơi cy NT % Ch i R mu S lá Chiu Khi Khi S r Chiu Khi Khi bt cao chi lưng lưng dài r lưng lưng chi (mm) chi chi (mm) r tươi r khơ tươi khơ (g) (g) (g) (g) c e B0K0 100 3,8 9,0 0,41 0,030 1,8 251 ,9 0,12 0,010 a d B0K1 100 5,1 21,6 0,55 0,039 2,5 309,0 0,15 0,011 ab c B0K2 100 4,9 38,6 0,62 0,043 3,9 321,7 0,18 0,013 abc c B1K0 100 4,8 37,1 0,55 0,040 3,2 379,4 0,25 0,025 a b B1K1 100 5,3 45,9 0,47 0,036 5,2 164,7 0,08 0,007 ab b B1K2 100 5,0 46,5 0,48 0,036 4,4 90,7 0,07 0,006 abc c B2K0 100 4,8 39,9 0,37 0,029 3,3 154,8 0,05 0,005 abc a B2K1 100 4,8 56,0 0,50 0,037 4,0 58,8 0,02 0,002 bc b B2K2 100 4,0 44,7 0,36 0,034 4,3 66,2 0,04 0,003 ANOVA BA * * NS NS NS * KINETIN NS NS NS BA x K * NS NS NS NS NS NS CV (%) 7,9 18,7 19,7 17,3 22,1 21 28,2 67,4 z , *, NS: khác bit cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01, 0,05 hoc khơng cĩ s khác bit. a, b, c : các tr s trên cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Duncan ’s Multiple Range Test.
78. 67 6 s lá s 5 4 3 2 1 0 B0K0 B0K1 B0K2 B1K0 B1K1 B1K2 B2K0 B2K1 B2K2 Nghim thc Hình 3.4 S lá ca cây khoai lang khi BA và Kinetin thay đi các nng đ và t l khác nhau sau 30 ngày nuơi cy 60 mm 50 40 30 20 10 0 B0K0 B0K1 B0K2 B1K0 B1K1 B1K2 B2K0 B2K1 B2K2 Nghim thc Hình 3.5 Chiu cao chi ca cây khoai lang khi BA và Kinetin thay đi các nng đ và t l khác nhau sau 30 ngày nuơi cy Sau 10 ngày nuơi cy, nhn thy tt c các nghim thc đu cĩ s hình thành chi t các đon thân mang chi nách (1cm). Trong quá trình phát sinh hình thái, s bt chi ch xut hin vùng nách lá nơi cĩ chi ng. Điu này cĩ th do hai nguyên nhân: (i) v mt cu to, chi ng
79. 68 là nhng chi nách trong trng thái ngh, khơng hot đng trong thi gian dài, nĩ cĩ th là chi sinh dưng hoc chi hoa vì vy khi gp điu kin thun li chúng s nhanh chĩng phát trin. (ii) Cytokinin kích thích s phát trin ca chi và khi phát s phát sinh chi nng đ thích hp. Do đĩ khi mu đưc cy vào mơi trưng thì chi ng lp tc đưc kích thích phát sinh chi. Sau 30 ngày nuơi cy, nhng mơi trưng hoc ch cĩ b sung kinetin hoc ch cĩ BA thì chiu cao chi cĩ tăng hơn so vi đi chng nhưng li thp hơn khi cĩ s kt hp gia hai loi Cytokinin. Trong mơi trưng cha BA 2mg/l + Kinetin 1mg/l li cĩ chiu cao chi ln nht (56mm) trong khi đĩ cĩ s lá là 4,8 lá/cây khơng cĩ s khác bit so vi nghim thc B 1K1. Điu này đúng vi nhn đnh rng mt s lồi thc vt, khi áp dng phi hp vài loi Cytokinin vi nhau s làm tăng hiu qu tăng sinh chi như Corylus avelana (Anderson, 1984), Cucumisnelo (Kathal và cs, 1988),[10]. Trên nhng đi tưng khác như nuơi cy chi Gynura sarmentosa (Cailloux, 1978) cũng đã kt lun rng BA, Kinetin, 2ip đu kích thích s to chi khi s dng riêng r, nhưng mi cht đu gây ra s bt bình thưng mt vài chi, chi đưc to ra khe mnh và tăng trưng nhanh khi phi hp c 3 cht cùng lúc. Như vy nng đ BA cĩ nh hưng ln trong quá trình to chi và tăng trưng chi. BA thuc nhĩm Cytokinin nên hàm lưng Cytokinin ngoi sinh cao s dn đn hàm lưng Cytokinin ni sinh cao. Cĩ th mu cy đã hp thu Cytokinin t ngồi mơi trưng hoc s hin din ca Cytokinin đã kích thích s tng hp các Cytokinin ni sinh. Theo Mai Trn Ngc Ting (1989), Salisburg (1991) các Cytokinin trong mơi trưng nuơi cy giúp phá v miêng trng, thúc đy s phát trin ca chi, kích thích s phân chia, phân hĩa và gia tăng kích thưc t bào. Ngồi ra cịn cĩ tác dng trong vic huy đng ngun dinh dưng t mơi trưng và thc đy quá trình tng hp prơtêin nên các đt thân kéo dài ra, trong khi các
80. 69 ch tiêu khác cĩ s khác bit khơng ln [8]. Tuy nhiên, nu tăng nng đ Cytokinin lên (BA 2mg/l + Kinetin 2mg/l) thì chiu cao chi gim đi và chi phát trin chm, cĩ l nng đ Kinetin cao đã c ch s tăng trưng ca chi. Các ch tiêu v r trong thí nghim này khơng cĩ s khác bit, nhưng các mơi trưng khơng b sung cht điu hịa sinh trưng thc vt hoc ch b sung mt trong hai cht thì s r cũng thp hơn khi b sung vào mơi trưng c hai loi cht điu hịa sinh trưng thc vt (B 1K1 cĩ s r cao nht là 5.2 r/cây). Nu tăng nng đ Cytokinin lên B 2K1 hoc B 2K2 thì s r gim xung (4 r/cây). Kt qu này đúng vi kt lun ca Narayanaswamy (1994), Dương Cơng Kiên (2006) là nng đ cao ca Cytokinin kìm hãm s hình thành và phát trin ca r [8] a b nh 3.8 Cây khoai lang hình thành và phát trin t đt thân sau 30 ngày nuơi cy (a) Cây trên mơi trưng MS khơng b sung cht điu hịa sinh trưng thc vt (b) Cây trên mơi trưng MS cĩ b sung BA 2mg/l và Kinetin 1 mg/l 3.3.2. nh hưng ca NAA và IBA các nng đ và t l khác nhau đn s hình thành r cây khoai lang Chi ngn (3 lá tht) ca cây khoai lang in vitro 30 ngày tui đưc chn đ ly mu. Sau 10 ngày nuơi cy mu chi đã to r trên tt c các mơi
81. 70 trưng nhưng cĩ s thay đi v s lưng, chiu dài r và hình thái r. Kt qu phân tích thng kê ngày th 30 cho thy s khác bit rt cĩ ý nghĩa trên các ch tiêu s r, chiu dài r và chiu cao chi. nghim thc I 0N0 khơng b sung cht điu hịa sinh trưng thc vt cây ra r chm nht, sau 30 ngày ch to đưc 6,5 r nhưng li cĩ chiu dài r dài nht (189,1 mm/r dài nht), hình thái r dài, nh, mng và cĩ màu trng (bng 3.6, hình 3.7, nh 3.9) Trên mơi trưng MS cĩ b sung NAA và IBA vi nng đ và t l khác nhau thì cây cĩ s lưng r và chiu dài r cũng rt khác nhau. nghim thc I 2N1, sau 30 ngày nuơi cy cĩ s r trung bình cao nht (21 r) nhưng chiu dài r li ngn nht (30,7 mm/r dài nht), các r mc trong mơi trưng to, ngn nhưng các r mc trên b mt mơi trưng li dài hơn, mng hơn. Mc dù chiu dài r nghim thc này thp hơn trong mơi trưng khơng b sung cht điu hịa sinh trưng thc vt nhưng chiu dài r tng cây tương đi đng đu nhau (t 25 – 40 mm). Tuy nhiên khi xét v ch tiêu chiu cao chi và s lá thì thy rng nghim thc I 1N0 cĩ s lá cao nht (6,1 lá/cây) và chiu cao chi cao nht (56,4 mm) trong khi đĩ s r khơng cĩ s khác bit so vi nghim thc I 2N1 (20 r/cây ) và cĩ chiu dài r là 50 mm/ r dài nht. Như vy khi tăng nng đ auxin lên cao thì cĩ tác dng to nhiu r nhưng li kìm hãm s kéo dài ca r và s tăng trưng ca chi (bng 3.6, hình 3.8). Các ch tiêu khi lưng r tươi và khi lưng r khơ khơng cĩ s khác bit trên tt c các nghim thc đưc kho sát (bng 3.6).
82. 71 Bng 3.6 nh hưng ca IBA và NAA lên s hình thành r t chi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuơi cy Chi R Nghim S lá Chiu % ra S r Chiu Khi Khi thc cao chi r dài r/ r lưng r lưng r (mm) dài nht tươi (g) khơ (g) (mm) I0N0 5,8 30,9c 100 6,5b 189,1a 0,16 0,021 I0N1 5,8 43,9b 100 16,3a 71,9b 0,27 0,030 I1N0 6,1 56,4a 100 20,0a 50,0bcd 0,33 0,026 I1N1 5,0 37,1bc 100 19,0a 62,2bc 0,42 0,036 I2N0 5,1 42,1b 100 17,3a 31,9cd 0,25 0,021 I2N1 3,3 39,9b 100 21,0a 30,7d 0,28 0,021 ANOVA z IBA NS NS NS * NAA NS NS * * * IBA x NAA NS * * * NS NS CV (%) 20,3 15,3 18,6 24 17,2 15,9 z , *, NS: khác bit cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01;0,05 hoc khơng cĩ s khác bit. a, b, c : các tr s trên cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD. 60 mm 50 40 30 20 10 0 I0N0 I0N1 I1N0 I1NI I2N0 I2N1 Nghim thc Hình 3.6 Chiu cao chi ca cây khoai lang khi IBA và NAA thay đi các nng đ và t l khác nhau sau 30 ngày nuơi cy
83. 72 25 S r S 20 15 10 5 0 I0N0 I0N1 I1N0 I1NI I2N0 I2N1 Nghim thc Hình 3.7 S r ca cây khoai lang khi IBA và NAA thay đi các nng đ và t l khác nhau sau 30 ngày nuơi cy 200 chiu cao chi (mm) 180 s r chiu dài r (mm) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 I0N0 I0N1 I1N0 I1NI I2N0 I2N1 Hình 3.8 nh hưng ca IBA và NAA lên chiu cao chi, s r và chiu dài r t chi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuơi cy