Luận án Tỷ lệ nhiễm và mang gen kháng Cephalosporin thế hệ 3 và Quinolon của các chủng Klebsiella gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập tại Bệnh viện nhi Trung Ương, 2009 - 2010

126 trang yendo 5450

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Tỷ lệ nhiễm và mang gen kháng Cephalosporin thế hệ 3 và Quinolon của các chủng Klebsiella gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập tại Bệnh viện nhi Trung Ương, 2009 - 2010", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_an_ty_le_nhiem_va_mang_gen_khang_cephalosporin_the_he_3.pdf

Nội dung text: Luận án Tỷ lệ nhiễm và mang gen kháng Cephalosporin thế hệ 3 và Quinolon của các chủng Klebsiella gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập tại Bệnh viện nhi Trung Ương, 2009 - 2010

1 BÔ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG Bùi Thị Mùi TỶ LỆ NHIỄM VÀ MANG GEN KHÁNG CEPHALOSPORIN THẾ HỆ 3 VÀ QUINOLON CỦA CÁC CHỦNG KLEBSIELLA GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG,2009 - 2010 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2014
2 BÔ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG Bùi Thị Mùi TỶ LỆ NHIỄM VÀ MANG GEN KHÁNG CEPHALOSPORIN THẾ HỆ 3 VÀ QUINOLON CỦA CÁC CHỦNG KLEBSIELLA GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG,2009 - 2010 Chuyên nghành: Vi sinh y học Mã số: 62720115 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Nguyễn Thanh Liêm 2. TS. Lê Thị Ánh Hồng HÀ NỘI - 2014
3 Lời cảm ơn Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các anh chị, bạn bè đồng nghiệp, những người thân trong gia đìng và các cơ quan có liên quan. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn hai thày hướng dẫn: 1, GS.TS. Nguyễn Thanh Liêm, Giám đốc bệnh viện Nhi Trung ương, người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu từ đầu khoá học đến nay. 2, TS. Lê Thị Ánh Hồng, Trưởng khoa vi sinh Bệnh viện đa khoa saint- paul. Cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong quá trình viết luận văn. Tôi xin chân trọng cảm ơn giáo sư Và tập thể khoa vi sinh, phòng nghiên cứu kháng thuốc của vi khuẩn- phòng xét nghiệm lâm xàng- bệnh viện several thuộc đại học tổng hợp yonsei- Hàn Quốc đã tận tình gúp đỡ tôi cơ sở thực hành, chỉ bảo tôi học, thực hành và làm nghiên cứu phục vụ cho đề tài của tôi. Tôi vô cùng biết ơn các nhà khoa học của hội đồng chấm thi đề cương, hội đồng chấm chuyên đề đã giúp đỡ và cho tôi những ý kiến quý giá để hoàn thành luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn ban Giám đốc, Phòng sau đại học, Khoa vi khuẩn- Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu cũng như hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng uỷ, ban giám đốc, phòng tổ chức cán bộ, phòng y vụ, lãnh đạo và tập thể khoa vi sinh bệnh viện Nhi Trung ương đã cho tôi cơ hội và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu.
4 Tôi xin bày tỏ sự biết ơn đến những người thân yêu trong gia đình đã động viên giúp đỡ tôi về tinh thần và vật chất để tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các bạn bè, đồng nghiệp gần xa đặc biệt là các anh chị nghiên cứu sinh cùng khoá, những người đã động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi về mọi mặt để tôi hoàn thành nhiệm vụ của mình. Lời sau cùng tôi gửi tới gia đình, đặc biệt là các con gái tôi, người luôn giành cho tôi tình cảm yêu thương chân thành nhất, người luôn sát cánh, động viên, chia sẻ và giúp tôi có đủ nghị lực vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống để làm việc, học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này./.
5 CHỮ VIẾT TẮT ADN :Deoxyribonucleic acid ATCC : American Type culture collection CLSI : Clinical and laboratory standards Institute EDTA : Ethylenediaminetetra acetic acid MIC : Minimal Inhibitory concentration NKHHCT : nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính NST : Nhiễm sắc thể PCR : polymerase chain reaction PFGE : pulsed field Gel Electrophoresis WHO : world health organization
6 ĐẶT VẤN ĐỀ Giống Klebsiella là một trong các hệ vi khuẩn có ở đường tiêu hóa, hô hấp của người. Nó có thể sống trong tự nhiên. Các loài Klebsiella spp. (K. pneumoniae, K. ozane, ) là căn nguyên của một số bệnh nhiễm khuẩn ở người (nhiễm khuẩn hô hấp, tiết niệu, nhiễm trùng huyết, ), gây bệnh chủ yếu ở trẻ nhỏ. Đặc biệt, Klebsiella spp là một trong những vi khuẩn hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Vi khuẩn này có khả năng kháng kháng sinh ngày một gia tăng, nhất là những chủng sinh men β- lactamase phổ rộng hoặc cephalosporinase [3], [40]. Trên thế giới loài Klebsiella spp là một trong những căn nguyên quan trọng gây nhiễm khuẩn ở bệnh nhi nằm điều trị tại bệnh viện đặc biệt là những trẻ sơ sinh non yếu và trẻ nhỏ. Có sự xuất hiện những chủng đa kháng kháng sinh và là nguyên nhân tử vong của nhiều bệnh nhân. Tỷ lệ nhiễm khuẩn do Klebsiella ở trong bệnh viện đặc biệt là những đơn vị hồi sức cấp cứu rất khác nhau giữa các nước từ 10,2%- 26,2% [3], [68]. Tình trạng kháng với hầu hết các kháng sinh đang là một mối đe doạ lớn đối với thầy thuốc và người bệnh. Với kháng sinh thông thường như Ampicillin, Cephazolin, Klebsiella spp. đã kháng cao 60%-100% [3]. Phát hiện gen kháng kháng sinh nhóm quinolon lan truyền qua plasmid là mốc quan trọng trong nghiên cứu về gen kháng kháng sinh của vi khuẩn này[78]. Xuất phát từ tình trạng trên đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế kháng kháng sinh được tiến hành với mục đích tìm căn nguyên của sự gia tăng tính kháng kháng sinh của Klesiella, trong đó cơ chế kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon được nghiên cứu ở nhiều nước. Ở Việt Nam, Klebsiella là căn nguyên hàng đầu gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập được chủ yếu ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ nằm điều trị tại bệnh viện, chủ yếu tại các đơn vị hồi sức cấp cứu. Tỷ lệ nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. thay đổi theo các yếu tố khác nhau: đối tượng nhiễm bệnh, lứa tuổi bệnh nhân Thêm vào đó, tỷ lệ chủng Klebsiella spp. kháng và đa kháng kháng sinh cao với ampicillin và cephalotin kháng 97,8% và 91,7% ở trẻ em [1], [4], [15], [16]. Những nghiên cứu tìm hiểu về tình trạng mang gen mã hóa sinh men β-lactamase phổ rộng gây kháng
7 cephalosporin thế hệ 3 và quinolon lan truyền qua plasmid chưa được thực hiện nhiều ở Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu: 1- Xác định tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập được ở đường hô hấp của các bệnh nhi 0 đến 6 tuổi tại Bệnh viện Nhi Trung ương năm 2009-2010. 2- Xác định tính kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella phân lập được. 3- Xác định tỷ lệ mang gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon của các chủng Klebsiella phân lập được.
8 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Các đặc điểm về giải phẫu, sinh lý và miễn dịch hệ hô hấp [14] 1.1.1. Các đặc điểm về giải phẫu Bộ máy hô hấp bao gồm từ mũi họng đến thanh quản, khí quản, phế quản, tiểu phế quản, phổi, màng phổi. Dựa vào vị trí các đoạn của bộ máy hô hấp, người ta phân chia ra đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới. Ranh giới phân chia là nắp thanh quản (đoạn trên nắp thanh quản là đường hô hấp trên, đoạn dưới nắp thanh quản là đường hô hấp dưới). - Viêm đường hô hấp trên bao gồm: viêm mũi, viêm họng, viêm amidal. - Viêm đường hô hấp dưới bao gồm: viêm thanh quản, khí quản, viêm phế quản, viêm tiểu phế quản, viêm phổi. 1.1.2. Đặc điểm sinh lý - Bộ máy hô hấp trẻ em chưa hoàn chỉnh những năm đầu đời. - Các đường dẫn khí ngắn, nhiễm trùng đường hô hấp trên dễ lan xuống đường hô hấp dưới. Do đó, bệnh lý hô hấp ở trẻ nhỏ ít khi khu trú ở đường hô hấp trên, mà dễ đưa tới viêm phổi. - Sức cản đường hô hấp rất lớn, sự giãn nở của lồng ngực kém, công thực hiện hô hấp lớn. Trong bệnh lý đường hô hấp, do niêm mạc có nhiều mạch máu nên dễ bị xung huyết, phù nề, xuất tiết càng làm hẹp đường thở sức cản tăng lên, gây rối loạn thông khí. - Thành phế quản mềm, tổ chức liên kết lỏng lẻo dễ bị biến dạng, chèn ép. - Do diện tích phế nang ít, mạng lưới mạch máu nhiều để bão hòa oxy trong máu nên trẻ dễ bị suy hô hấp khi nhu mô phổi bị tổn thương. Ở trẻ em, do đặc điểm cấu tạo của bộ máy hô hấp, việc thực hiện hô hấp có nhiều cản trở, trong khi nhu cầu về chuyển hóa rất cao, nên bình thường trẻ phải cố gắng để thở. Khi bị bệnh, khả năng hô hấp duy trì kém, lực cản trở tăng cao, làm cho trẻ dễ bị suy hô hấp. Thêm vào đó, các tổ chức lympho chưa phát triển, việc sản
9 xuất kháng thể tại chỗ và toàn thân kém, chưa có hệ thống miễn dịch đặc hiệu làm cho trẻ dễ bị mắc nhiễm trùng đường hô hấp. 1.1.3. Cơ chế miễn dịch bảo vệ đường hô hấp Vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp, chúng gặp phải hệ thống bảo vệ đường hô hấp gồm: 1.1.3.1. Hàng rào niêm mạc: Lớp màng nhầy của niêm mạc đường hô hấp ngăn cản vi sinh vật bám và xâm nhập. Các vi nhung mao đường hô hấp luôn luôn rung động, tạo ra những lớp sóng từ dưới lên trên, đẩy vi sinh vật ra ngoài nhờ phản xạ ho và hắt hơi, ngăn cản một phần vi sinh vật xâm nhập vào đường hô hấp dưới. Sự cạnh tranh giữa các vi sinh vật sống cộng sinh ở đường hô hấp trên và các vi sinh vật gây bệnh xâm nhập. Vi sinh vật sống cộng sinh, chiếm mất vị trí bám (receptor) của vi sinh vật gây bệnh, nên vi sinh vật gây bệnh không bám được vào các receptor đặc hiệu. IgA có ở niêm mạc của đường hô hấp trên, sẽ kết hợp đặc hiệu với các kháng nguyên của vi sinh vật gây bệnh, làm cho chúng không xâm nhập được vào tế bào đường hô hấp để nhân lên và gây bệnh. 1.1.3.2. Các tế bào thực bào: Đại thực bào, hệ thống võng nội mô bắt và tiêu diệt các vi sinh vật xâm nhập vào cơ thể qua con đường hô hấp. Tế bào NK (natural killer) là tế bào lympho ngoại vi, có tác dụng tiêu diệt các tế bào đích. Các tế bào lympho TC có tác dụng tiêu diệt tế bào đích như tế bào nhiễm virut, TCD8 ức chế hoạt động của các tế bào lympho khác ở dạng biệt hóa. Ngoài ra, các tế bào lympho khác như T hỗ trợ hay TCD4 với chức năng điều hòa miễn dịch, nên có vai trò rất quan trọng trong cơ thể chống lại các bệnh nhiễm trùng.
10 1.1.3.3. Các yếu tố thể dịch: Kháng thể tham gia bảo vệ, chống lại vi sinh vật gây bệnh, xâm nhập vào cơ thể qua con đường hô hấp, theo cơ chế bảo vệ đặc hiệu. Bổ thể được hoạt hóa theo con đường cổ điển (phức hợp miễn dịch) hoặc theo con đường tắt (không cần phức hợp miễn dịch), có tác dụng chống lại các bệnh nhiễm trùng. Interferon "IFN" là yếu tố chống nhiễm trùng không đặc hiệu; có tác dụng ngăn cản sự nhân lên của virut như IFN alpha và beta. Khi nắp thanh quản đóng lại là ranh giới giữa đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới. 1.2. Các căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em [8],[2]. 1.2.1. Các căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em Căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em có tới 300 loài vi khuẩn,virus khác nhau có khả năng gây bệnh. * Tác nhân virus: Đa số các trường hợpnhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em là do virus (60-70%) vì: Phần lớn các virus có ái lực với đường hô hấp, khả năng lây lan của virus dễ dàng, tỉ lệ người lành mang virus cao, khả năng miễn dịch của trẻ với virus có thể chưa có hoặc yếu. Các tác nhân virus thường gặp là: Cúm A, cúm B, Virus hô hấp hợp bào (RSV- Respiratory syncytial virus), các Adenovirus * Tác nhân vi khuẩn: nhiễm trùng hô hấp cấp tính do vi khuẩn phụ thuộc vào địa dư, lứa tuổi, trình độ văn hóa và kinh tế. + Các loại vi khuẩn thường gặp trong nhiễm trùng cộng đồng: Heamophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moracellacatarrhalis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae. + Các loại vi khuẩn thường gặp trong nhiễm trùng bệnh viện: S. aureus, P. aeruginosa, Các trực khuẩn Gram âm dễ mọc khác, Klebsiella pneumoniae, các Enterobacteriaceae khác.
11 1.2.2. Klebsiella trong NKHHCT Chi Klebsiella thuộc bộ Klebsiellae, là thành viên của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae do nhà vi sinh học người Đức - Edwin Klebs tìm ra năm 1980. Chi Klebsiella gồm các loài: K. pneumoniae, K. oytoca, K. oaenae, K. panticola, K.onithicrocytica, K.rhinosclersmatis, K.terrigena K. pneumoniae là loài quan trọng thường gặp trong nhiễm khuẩn bệnh viện. Là loài vi khuẩn thường gặp nhất gây bệnh ở những bệnh nhân nằm viện kéo dài, là căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới ở những bệnh nhân nằm viện có thiếu hụt miễn dịch như trẻ nhỏ, người có tuổi, những người bị bệnh đường hô hấp. Nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. trong cộng đồng thường liên quan tới những người miễn dịch kém gặp trong nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính (NKHHCT), nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết Những báo cáo về bùng phát nhiễm khuẩn bệnh viện do nhiễm khuẩn Klebsiella spp. kháng với nhiều kháng sinh ở trẻ nhỏ và là nguyên nhân lan truyền kháng thuốc qua plasmid [7],[40],[64],[118].  Đặc điểm sinh học - Hình thể: Klebsiella spp. là trực khuẩn gram âm to, hoặc cầu trực khuẩn, dài 1 - 2 m, rộng 0,5 - 1,5 m có thể bắt màu đậm hai đầu, có vỏ, không di động. Ở dạng khuẩn lạc R, có thể có hình trực khuẩn to, dài từ 3 - 5 m. - Nuôi cấy: Klebsiella spp. mọc dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường, lên men các loại đường, không tạo Indol không hủy gelatin, phân hủy urê chậm, tạo hơi và không tạo H2S. - Đề kháng: giống như các vi khuẩn đường ruột khác, chúng dễ bị các hoá chất khử trùng diệt nhưng có khả năng tồn tại lâu ở ngoại cảnh (nước, đất). - Kháng nguyên và phân loại: Klebsiella spp. ngoài kháng nguyên O còn có kháng nguyên K. Tính đặc hiệu kháng nguyên vỏ này do bản chất polisacarit của vỏ quyết định. Kháng nguyên K mang tính chất đặc hiệu týp (77 týp). Týp 1 và 2 hay gặp nhất, kháng nguyên O có 9 týp và ít được dùng để phân loại.  Khả năng gây bệnh:
12 Klebsiella spp. có thể gây tổn thương ở hầu hết các cơ quan của cơ thể : viêm xoang ,viêm họng , viêm màng não, viêm phúc mạc, đáng chú ý là trẻ em có thể bị viêm ruột do loài vi khuẩn này. Nó là căn nguyên quan trọng gây nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn mô mềm ở nhiễm khuẩn bệnh viện. Klebsiella spp. lan rộng và nhanh trong môi trường bệnh viện qua tay nhân viên y tế và đường tiêu hoá [19], [30],[ 92],[101].  Dịch tễ học [30],[96] Klebsiella spp. tồn tại trong tự nhiên và trong cơ thể người như hầu họng, đường tiêu hóa, các mô mềm , gây bệnh khi có cơ hội (gây bệnh ở những người suy giảm miễn dịch, có can thiệp thủ thuật y tế như đặt nội khí quản thở máy hay dùng kháng sinh kéo dài) Nhiễm khuẩn do K.pneumoniae và K. oxytoka thường gặp nhất ở người. Chúng thường lan truyền qua chăm sóc y tế và qua đường tiêu hóa, có thể lan truyền nhanh chóng và gây bùng phát dịch trong bệnh viện. Nhiễm khuẩn hô hấp do Klebsiella gây viêm, hoại tử và xuất huyết trong nhu mô. Thường gặp ở những người nghiện rượu, tiểu đường, bệnh phổi mãn tính và đặc biệt là trẻ sơ sinh và sơ sinh non yếu. Sử dụng kháng sinh rộng rãi trong các bệnh nhân nằm viện đã dẫn đến khả năng gia tăng các chủng Klebsiella mang gen kháng kháng sinh đặc biệt là các chủng có men β-lactamase phổ rộng đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh. Hầu hết dịch bùng phát do lan truyền gen kháng ở những chủng Klebsiella gây nhiễm khuẩn hô hấp, tiết niệu và mô mềm, ngoài ra các can thiệp thủ thuật và chăm sóc ở các khoa hồi sức cấp cứu làm gia tăng và lây lan các chủng Klebsiella kháng thuốc [115], [117]. -Tần xuất gây bệnh: Klebsiella có vai trò lớn trong nhiễm trùng ở trẻ em. Chiếm 8% các nhiễm trùng của bệnh viện. 14% nhiễm khuẩn huyết nguyên phát do Klebsiella là nguyên nhân đứng thứ 2 sau E.coli. Nhiễm trùng đường hô hấp và tiết niệu chiếm ưu thế.
13 Trong số 145 báo cáo bùng phát nhiễm trùng bệnh viện từ 1983- 1991 có 13 báo cáo được quy kết là do Klesiella. Các trung tâm kiểm soát dịch bệnh và phòng chống chủng Klesiella cho thấy có 3% nguyên nhân bùng phát dịch bệnh do Klesiella. Một cuộc điều tra Klesiella pneumoniae carbamenemase (KPC) ở những bệnh nhân nhiễm khuẩn đường ruột trong năm 2011 thấy sự lan truyền rộng rãi KPC trong 4 huyện liền kề ở Ấn Độ trong 1 năm. Hướng dẫn kiểm soát chăm sóc trong bệnh viện và giáo dục vô khuẩn trong các thiết bị chăm sóc sức khỏe là rất quan trọng trong kiểm soát KPC [30], [42]. + Ở quốc tế: Bùng phát nhiễm khuẩn huyết ở trẻ sơ sinh trên khắp thế giới, nhiễm trùng khác do Klesiella. cũng gặp trên toàn thế giới. Thường gặp ở các khu vực Đông Âu, Nam Á, Trung Phi và châu Mỹ la tinh. - Tuổi:+ Nhiễm khuẩn Klesiella. mắc phải ở cộng đồng là người già, trung niên với bệnh mãn tính, người nghiện rượu. + Nhiễm khuẩn bệnh viện với cả trẻ em và người lớn, xuất hiện nhiều hơn ở trẻ đẻ non và những bệnh sơ sinh nằm hồi sức cấp cứu, bệnh nhân suy giảm miễn dịch 1.3. Phương pháp chẩn đoán vi sinh trong nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính 1.3.1. Phương pháp thông thường[ 2]  Bệnh phẩm : đờm, dịch nội khí quản,dịch rửa phế quản, dịch hút đờm trên khí quản qua đường mũi  Xác định căn nguyên vi khuẩn: Bảng 1.1. Thang điểm bartlett dùng đánh giá mẫu bệnh phẩm đường hô hấp Tính chất đại thể Điểm Mẫu đờm 10 - 25 bạch cầu +1 > 25 bạch cầu +2 nhầy, mủ, mủ nhầy +1 10 - 25 tế bào vẩy -1
14 > 25 tế bào vẩy -2 Mẫu đờm hút qua mũi, nội soi phế quản 10 - 25 bạch cầu +1 > 25 bạch cầu +2 tế bào trụ +1 10 - 25 tế bào vẩy -1 > 25 tế bào vẩy -2 R ửa đờm lẫn nhiều nước bọt Ly tâm lấy cặn từ dịch nội khí quản,dịch rửa với 5ml nước muối sinh lý phế quản, dịch hút đờm trên khí quản qua Đờm đường mũi Đờm không rửa nếu không có nước bọt D0 Nhuộm Gram Điểm bartlett>2 Quan sát Kính hiển vi x Điểm bartlett≥0 100 đánh giá mẫu = thang điểm Bartllett Cấy: thạch máu, sôcôla, Maconkey Điểm bartlett=1 và môi trường chọn lọc nếu có Yêu cầu lấy lại mẫu không nuôi cấy Chọn vi khuẩn đích trên môi Định danh sơ bộ trường cấy Cấy tăng sinh (18- 24) giờ D1 Định danh Kháng sinh đồ D2 Kết quả trung cuộc *Sơ đồ 1.1. Sơ đồ nuôi cấy, phân lập và xác định căn nguyên vi khuẩn theo phương pháp thông thường
15 1.3.2. Phương pháp cấy đếm  Bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm để xác định căn nguyên gây NTHHCT ở trẻ em được lấy là bệnh phẩm họng hoặc dịch tỵ hầu cho đường hô hấp trên; Là đờm, dịch phế quản cho đường hô hấp dưới. Cách lấy và vận chuyển mẫu bệnh phẩm được thực hiện theo thường quy của Tổ chức Y tế thế giới (WHO).  Xác định căn nguyên vi khuẩn  Nuôi cấy, phân lập, xác định căn nguyên vi khuẩn: Thực hiện theo thường quy của WHO và Viện Y học Nhiệt đới thuộc đại học Nagasaki- Nhật Bản[7], [17], [59], [79], [93], [116]. * Sơ đồ nuôi cấy, phân lập và xác định căn nguyên vi khuẩn theo phương pháp cấy đếm. 1.4. Một số kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn gây bệnh với kháng sinh 1.4.1. Kháng sinh và cơ chế kháng kháng sinh 1.4.1.1. Kháng sinh  Định nghĩa
16 Kháng sinh là những chất do vi nấm hoặc vi khuẩn tạo ra, hoặc do bán tổng hợp, có khi là chất hóa học tổng hợp, mà ngay ở nồng độ thấp đã có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật một cách đặc hiệu nhưng ít độc hoặc không độc cho cơ thể [18],[31], [72], [99]. Mỗi thuốc kháng sinh chỉ gây rối loạn một phản ứng sinh học nhất định trong tế bào vi khuẩn. Nhìn vào sơ đồ cấu tạo tế bào vi khuẩn, thuốc kháng sinh có thể tác động vào các vị trí sau: vách, màng nguyên tương, ribosom trong nguyên tương và bộ máy di truyền (hình 1). Hình 1.1. Vị trí tác động của thuốc kháng sinh lên tế bào vi khuẩn [18] 1. Vách; 2. Màng tế bào vi khuẩn; 3. Ribosom trong nguyên tương; 4. Bộ máy di truyền. 1.4.1.2. Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh lên tế bào vi khuẩn [18]  Kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách Các kháng sinh với cơ chế tác động này có thể làm gẫy các cầu ngang peptid của khung glycopeptid, hoặc tác động vào giai đoạn đầu hay giai đoạn cuối của quá trình sinh tổng hợp khung glycopeptid, làm cho vi khuẩn không có vách do đó dễ bị hệ thống miễn dịch của cơ thể tiêu diệt. Các kháng sinh với cơ chế tác động này thuộc nhóm -lactam và các kháng sinh fosfomycin, vancomycin, teicoplanin cũng tác động vào giai đoạn cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp khung glycopetid.
17  Kháng sinh tác động trên màng nguyên tương Kháng sinh có tác dụng gây rối loạn tính thấm của màng nguyên tương làm thoát các thành phần trong tế bào ra ngoài, hoặc tác động lên các phân tử cấu tạo màng nguyên tương, làm cho tế bào vi khuẩn không thể tiếp tục nhân lên được nữa. Kháng sinh polimyxin, gramicidin, tyrocidin có cơ chế tác động này.  Kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp protein Kháng sinh có tác dụng gây rối loạn sự tổng hợp protein do gắn với các ribosom ở các tiểu đơn vị 30 S hoặc 50 S dẫn đến cản trở sự kéo dài của chuỗi acid amin trong quá trình tổng hợp protein. Kháng sinh tác động theo cơ chế này có các Kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid, cloramphenicol, macrolid, lincosamid, streptogramin, Tetracyclin.  Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp acid nucleic Kháng sinh có tác dụng gây rối loạn sự tổng hợp ARN hoặc ADN của tế bào vi khuẩn như rifamycin, kháng sinh thuộc nhóm quinolon, novobiocin .  Kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp acid folic Cơ chế tác động: acid folic là một coenzym đóng vai trò chủ đạo trong nhiều phản ứng chuyển hóa tạo acid amin, các purin và pyrimidin. Trong quá trình tổng hợp acid folic, tế bào vi khuẩn cần phải có acid para - aminobenzoic, acid glutamic và nhiều enzym trong đó có: dihydropteroat synthetase, dihydrofolat reductase. Một số thuốc kháng sinh đã tác động vào quá trình này làm cho các acid folic không được tạo ra, vì vậy nó đã tác động gián tiếp đến quá trình sinh tổng hợp các acid nucleic và protein của tế bào vi khuẩn như sulfamid, trimethoprim. 1.4.2.Cơ chế đề kháng kháng sinh 1.4.2.1. Định nghĩa Trong mối quan hệ giữa vi khuẩn và kháng sinh thì sự đề kháng được hiểu là khả năng chống đối của vi khuẩn đối với kháng sinh và hóa chất điều trị. 1.4.2.2. Các yếu tố làm cho vi khuẩn không chịu tác dụng của thuốc kháng sinh  Thuốc
18 - Liều lượng điều trị quá thấp hoặc thời gian điều trị quá ngắn - Chọn sai thuốc: Do thầy thuốc chọn kháng sinh điều trị không phù hợp với ổ nhiễm trùng. Cho kháng sinh điều trị không dựa trên kết quả kháng sinh đồ. - Thuốc hỏng: do mua phải thuốc hết hạn sử dụng, hoặc còn hạn nhưng bảo quản không tốt, hay chất lượng không bảo đảm nên hoạt tính kháng sinh không có. - Kết quả kháng sinh đồ được xác định trên một chủng mà nó không phải là căn nguyên chính gây nhiễm trùng. - Phối hợp hai kháng sinh có tính đối kháng nhau nên nó làm mất tác dụng của nhau.  Người bệnh - Do cơ địa của người bệnh: trong một số trường hợp như giảm bạch cầu hạt, thiếu hụt globulin miễn dịch, suy giảm miễn dịch Mặc dù kháng sinh được chọn là thích hợp và đến được ổ nhiễm khuẩn nhưng bệnh vẫn còn vì kháng sinh chỉ có tác dụng ức chế vi khuẩn nếu bệnh nhân có tình trạng miễn dịch kém sẽ không diệt được vi khuẩn. - Tuổi tác của bệnh nhân: với những bệnh nhân còn quá non (trẻ sơ sinh) hoặc quá lớn tuổi do khả năng hấp thu thuốc kém và khả năng gắn thuốc vào protein huyết tương kém nên nồng độ kháng sinh ở trong máu và trong tổ chức rất thấp sẽ làm ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị [9], [16]. 1.4.2.3.Vi khuẩn đề kháng kháng sinh Theo như định nghĩa trên thì sự đề kháng ở đây được hiểu là khả năng chống đối của vi khuẩn đối với kháng sinh và hóa chất điều trị. Khả năng đề kháng của vi khuẩn bao gồm khả năng tự nhiên (đề kháng tự nhiên) và khả năng thu được (đề kháng thu được) [70] .  Đề kháng tự nhiên - Định nghĩa: đề kháng tự nhiên là khả năng đề kháng một số kháng sinh nhất định của một loài vi khuẩn nào đó mang đặc tính di truyền bình thường của loài.
19 - Ví dụ: Escherichia coli không chịu tác dụng của erythromycin, tụ cầu không chịu tác dụng của colistin và nalidixic acid, Pseudomonas aeruginosa bền vững với penicillin G.  Đề kháng thu được - Định nghĩa: đề kháng thu được là khả năng đề kháng một hay nhiều kháng sinh do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở thành có gen đề kháng. - Những đề kháng thu được có thể là do: . Đột biến trên NST: qua các thử nghiệm sao chép đĩa của Lederberg (1952) có thể giải thích được vi khuẩn đề kháng thuốc là do đột biến. . Nhận được gen đề kháng qua các hình thức vận chuyển di truyền như: tiếp hợp khi hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau, biến nạp khi vi khuẩn bị ly giải và giải phóng ra ADN tự do hoặc tải nạp nhờ phagiơ hoặc do một thành phần di truyền di động (transposons). 1.4.2.4. Cơ chế hóa sinh và di truyền học của đề kháng thu được ở vi khuẩn  Cơ chế sinh hóa của sự đề kháng thu được [18], [50] - Làm giảm tính thấm của màng nguyên tương - Làm thay đổi đích tác động - Làm cho kháng sinh thoát ra ngoài màng tế bào vi khuẩn quá mức - Tạo ra các enzym ức chế tác động của kháng sinh:  Cơ sở di truyền học của sự đề kháng thu được  Đề kháng thu được do đột biến trên NST Đột biến thường xảy ra ở giai đoạn sao chép các bazơ purin và pyrimidin trong quá trình tổng hợp của ADN, các ADN mới được tổng hợp sẽ không còn giống với phiên bản của ADN thế hệ trước [48].  Đề kháng thu được do nhận được gen đề kháng qua các hình thức vận chuyển di truyền[12]. Biến nạp
20 Là hiện tượng một phần nhỏ ADN tự do của vi khuẩn cho vào được tế bào vi khuẩn nhận, gắn vào bộ gen của vi khuẩn nhận, quyết định tính chất mới của vi khuẩn này và tính chất này có thể di truyền. Tải nạp Tải nạp là hiện tượng chuyển gen từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận qua một phagiơ ôn hòa làm trung gian, phagiơ này gọi là phagiơ tải nạp. Tiếp hợp Tiếp hợp là hiện tượng chuyển gen từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác khi có sự tiếp xúc trực tiếp của vi khuẩn cho (được gọi là vi khuẩn đực) và vi khuẩn nhận (được gọi là vi khuẩn cái). Để có thể tiếp hợp được vi khuẩn cho phải có pili giới tính và toàn bộ hay một phần vật liệu di truyền sẽ được chuyển từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận qua cầu nối pili đó. Hình 1.2. Sự lan truyền gen kháng thuốc bằng hình thức thông qua các R-plasmid [109] Thành phần di truyền di động (transposons - gen nhảy)
21 Là một thành phần của một đơn vị sao chép hoặc là plasmid, nhiễm sắc thể hoặc là phagiơ nhờ hai chuỗi tận cùng ở hai đầu để chuyển vị trí từ một phân tử ADN này sang một phân tử ADN khác không cần có sự đồng dạng của hai phân tử ADN (nó có thể chuyển từ plasmid này sang plasmid khác, hay từ plasmid vào NST hoặc genom của một phagiơ tải nạp) [69]. - Hình 1.3. Đề kháng thu được do nhận được gene nằm trên Integron [109 ] Cơ chế lan truyền gen đề kháng Theo Wiedemann (1983) [121], gen đề kháng lan truyền trên bốn phương diện: - Trong tế bào (intracellular): qua các sự kiện tái tổ hợp kinh điển hay tái tổ hợp bất hợp pháp tức là chuyển vị trí nhờ transposon. - Giữa các tế bào (intercellular): qua các hình thức vận chuyển di truyền như: tiếp hợp, dẫn truyền, biến nạp, tải nạp. Tuy là hiện tượng ít gặp nhưng là tiền đề cho những hậu quả tiếp theo có ý nghĩa quan trọng về mặt số lượng. - Trong quần thể vi khuẩn (microbiotop): thông qua sự chọn lọc và giữ lại những cá thể đề kháng trong vi hệ đường ruột hay trên da hoặc niêm mạc của bệnh nhân khi người này dùng kháng sinh.
22 - Trong quần thể đại sinh vật (macrobiotop): có thể thành dịch do lây lan từ người này sang người khác qua các dụng cụ thăm khám, dụng cụ phẫu thuật, thức ăn, không khí bị nhiễm vi khuẩn đề kháng. Đây là điểm đặc biệt cần quan tâm ở các bệnh viện, nhằm phòng ngừa nhiễm khuẩn bệnh viện. Hình 1.4. Giới thiệu các cơ chế khác nhau của sự lan truyền ngang các gene mã hóa sự kháng thuốc của vi khuẩn [109] 1.4.2.5. Các cơ chế đề kháng kháng sinh họ vi khuẩn đường ruột với kháng sinh nhóm beta - lactam  Đề kháng tự nhiên Một số chủng thuộc họ vi khuẩn đường ruột có khả năng đề kháng tự nhiên với kháng sinh nhóm -lactam, nó mang đặc tính di truyền bình thường của loài. Nghiên cứu trên những chủng vi khuẩn họ đường ruột với các kháng sinh khác nhau trong nhóm -lactam đã cho phép người ta xác định được những kiểu cách đề kháng tự nhiên khác nhau của chúng [112].
23  Đề kháng tự nhiên do sinh ra enzym -lactamase  Đề kháng tự nhiên không do sinh ra enzym -lactamase Một số vi khuẩn đường ruột đề kháng tự nhiên với kháng sinh thuộc nhóm - lactam là do thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn đối với kháng sinh thuộc nhóm này [63], [82].  Đề kháng thu được Các chủng vi khuẩn họ đường ruột có thể đề kháng với kháng sinh nhóm - lactam theo cơ chế đề kháng thu được (do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở thành có gen đề kháng). Sự đề kháng này làm thay đổi các kiểu cách đề kháng tự nhiên của chúng. Những gen đề kháng thu được này có thể làm cho vi khuẩn sinh ra enzym -lactamaza, làm thay đổi tính thấm của màng tế bào hoặc làm thay đổi đích bám của kháng sinh lên màng tế bào vi khuẩn (làm thay đổi đích bám PBP).  Đề kháng thu được làm cho vi khuẩn sinh ra enzym -lactamase Vi khuẩn sinh ra enzym penicillinase do nhận được gen đề kháng nằm trên plasmid - Sinh ra penicillinase ở mức độ cao: những vi khuẩn họ đường ruột khi nhận được gen đề kháng nằm trên plasmid nó có thể sinh ra enzym penicillinase ở mức độ cao, những enzym này đã được xác định là các -lactamase phổ rộng ( TEM-1, TEM-2, SHV-1 ) [72]. Những chủng này sẽ kháng lại các kháng sinh: penicillin, cephalosporin thế hệ I và II (trừ cephoxitin). Các kháng sinh cephalosporin thế hệ III, các monobactam và các carbapenem thì không bị phá hủy bởi enzym này. Các enzym này bị ức chế bởi các chất ức chế -lactamase. - Sinh ra -lactamase phổ mở rộng(ESBL): một số vi khuẩn họ đường ruột khi có khả năng sinh ra các -lactamase phổ rộng và nhờ đột biến nên đã mở rộng tác dụng của các enzym này tới kháng sinh cephalosporin thế hệ III (trừ các kháng sinh: cephamycin, cefoxitin, cefotetan, lactamoxef và carbapenem là không bị phá hủy bởi enzym này) như: enzym CTX-1/ TEM-3, TEM-4, CAZ-1/TEM-5, SHV-2,
24 SHV-3 [106], [95]. Các enzym -lactamaza phổ mở rộng này thường gặp ở loài Klebsiella pneumoniae và chúng bị ức chế bởi các chất ức chế -lactamase. Ở một số loài như E. coli, E. cloacae sinh ra enzym này nhờ có gen mã hóa nằm trên plasmid [83], [86], [94]. - Sinh ra -lactamase kháng lại chất ức chế -lactamase: một số chủng đường ruột có những bước đột biến sinh ra các enzym mới đề kháng với chất ức chế -lactamase, đã tìm thấy ở E. coli theo Vedel (1992) [111]. Những chủng đường ruột sinh ra enzym penicillinase do nhận được gen đề kháng nằm trên plasmid thường cũng kháng với các kháng sinh thuộc nhóm aminosid, chloramphenicol, trimethoprim và sulfamid do những gen mã hóa sự đề kháng với các nhóm kháng sinh này cùng nằm trên một plasmid [100]. Vi khuẩn tăng cường sản xuất ra enzym penicillinase do gen đề kháng nằm trên nhiễm sắc thể Tăng cường sản xuất enzym penicillinaza ở K. oxytoca: những chủng của loài K. oxytoca kháng kháng sinh thuộc nhóm -lactam ở mức cao vì có sự tăng cường sản xuất enzym penicillinase nhờ gen mã hóa nằm trên NST theo tác giả Lambia và cộng sự năm 1986 [73]. Đề kháng thu được làm cho vi khuẩn sinh ra enzym cephalosporinase do gen mã hóa nằm trên nhiễm sắc thể Sinh ra enzym cephalosporinase nhờ gen mã hóa nằm trên NST thường gặp ở loài E. cloacae, S. marcescens, E. coli trong họ vi khuẩn đường ruột: - Tăng cường sản xuất enzym cephalosporinase: những loài này bình thường chúng kháng kháng sinh nhóm -lactam theo cơ chế đề kháng tự nhiên, do sinh ra enzym cephalosporinase cảm ứng và khi có sự đột biến ở gen điều hoà trong quá trình sinh tổng hợp enzym, nên đã tăng cường sản xuất enzym này. Cơ chế này được mô tả bởi hai tác giả Nicolas (1987) và Cole (1988) [37], [90]. - Tăng cường sản xuất enzym cephalosporinase ở loài E. coli là do hậu quả của sự khuếch đại gen hoặc do có sự thiết lập những gen điều hòa mới theo Normark (1977) và Cole (1988) [88], [37].
25 Những chủng đường ruột đề kháng kháng sinh nhóm -lactam do tăng cường sản xuất ra enzym -lactamase (penicillinase hoặc cephalosporinase) do gen đề kháng nằm trên nhiễm sắc thể thường nhạy cảm với các kháng sinh thuộc nhóm khác. Đề kháng thu được làm cho vi khuẩn sinh ra các enzym -lactamase khác - Năm 1989-1990, hai tác giả Bauernfeind và Papanicolaou đã tìm thấy ở loài K. pneumoniae sinh ra enzym -lactamase kháng lại kháng sinh cephamycin (CMY-1, MIR-1), gen mã hóa nằm trên plasmid [91]. - Enzym immipenemase cũng đã được tìm thấy ở các loài S. marcescens và E. cloacae bởi các tác giả Yang (1990), Lee và Raimondi (1991) [74], [97]. - Các Beta Lactamase mới [6] * TEM-TYPE ESBLs (Lớp A): việc thay thế amino acid ở nhiều vị trí ở TEM-1 beta-lactamase có thể được tạo ra ở phòng thí nghiệm mà không mất hoạt tính. Sự thay đổi vị trí này của ESBLs làm thay đổi hình dạng vị trí hoạt hóa của men, cho phép thâm nhập oxyimino-beta-lactam. Việc mở vị trí hoạt hóa của enzym với beta-lactam làm gia tăng tính nhạy cảm của enzymvới beta-lactamase inhibitor (vd: clavulanic acid). Sự thay đổi amino acid của men có thể gây ra các dạng ESBLs có thể đề kháng với chất ức chế, tuy nhiên sự kết hợp giữa đề kháng và hoạt tính phổ rộng của enzym có vẻ như không tương thích (ngoại lệ hiếm gặp). Trên 130 men TEM đã được tìm thấy, và sự đa dạng của chúng có lợi cho việc theo dõi sự lan tràn của các gene đề kháng. TEM-10, TEM-12, TEM-16 thường gặp nhất ở Bắc Mỹ và Nam Mỹ. * SHV-TYPE ESBLs (lớp A): SHV-1 chia 68% các amino acid của nó với TEM-1 và có cấu trúc tương tự. Cũng như TEM, SHV-type ESBLs có một hoặc nhiều sự thay thế các amino acid xung quanh vị trí hoạt hóa. Hơn 50 dạng khác nhau của SHV đã được biết. SHV-type ESBLs gặp nhiều trong các giám sát về phân lập tính đề kháng lâm sàng ở Châu Âu và Mỹ. SHV-5 và SHV-12 là 2 thành viên thường gặp nhất của họ này.
26 * CTX-TYPE ESBLs (lớp A): được nhấn mạnh về hoạt tính của nó chống lại cefotaxime lớn hơn ceftazidime. Hiện nay, có hơn 40 CTX-M đã được biết. Một vài CTX-M thủy phân ceftazidime nhanh hơn cả thủy phân cefotaxime. CTX-M-14, CTX-M-3, CTX-M-2 là thường gặp nhất. * NHỮNG ESBLs LỚP A KHÁC: Những ESBLs lớp A khác không thường gặp và được tìm thấy chủ yếu ở Pseudomonas aeruginosa và ở một số ít nơi: PER-1 được phân lập ở Thổ Nhĩ Kỳ, Pháp, và Ý; VEB-1 và VEB-2 tìm thấy ở Đông Nam Á; GES-1, GES-2 và IBC-2 được phân lập ở Nam Phi, Pháp và Hy Lạp. PER-1 cũng thường gặp ở dòng acinetobacter ở Hàn Quốc và Thổ Nhĩ Kỳ. Một số các men này cũng được tìm thấy ở Enterobacteriaceae, ngược lại các ESBLs ít gặp (như BES-1, IBC-1, SFO-1 và TLA-1) chỉ được tìm thấy ở Enterobacteriaceae. * OXA-TYPE ESBLs (lớp D): 12 ESBLs bắt nguồn từ OXA-10, OXA-1, hay OXA-2 bằng cách thay thế các amino acid. Các men này được tìm thấy chủ yếu ở P.aeruginosa ở Thổ Nhĩ Kỳ và Pháp. Hầu hết các OXA-type ESBLs có đề kháng tương đối với tính ức chế của clavulanic acid. Một số men cho thấy chủ yếu đề kháng với ceftazidime, nhưng OXA-17 cho thấy đề kháng nhiều hơn với cefotaxime và cefepime hơn là đề kháng với ceftazidime. * MEN PLASMID-MEDIATED AmpC (lớp C): AmpC beta-lactamases, sinh ra do beta-lactam, được mã hóa ở các gene trên nhiễm sắc thể ở nhiều trực khuẩn gram âm. Các đột biến làm gia tăng tình trạng đề kháng cephalosporin phổ rộng ở Enterobacter cloacae. Men AmpC ở E.coli được biểu hiện nghèo nàn và gene AmpC mất đi ở nhiễm sắc thể của Klebsiella và Salmonella, nhưng men plasmid-mediated AmpC có thể làm cho các vi khuẩn này có tính đề kháng giống nhau như các enterobacter kháng beta-lactam. Hơn 20 AmpC beta-lactamase được tìm thấy truyền qua trung gian plasmid. AmpC beta-lactamase có đặc trưng làm cho đề kháng với cephamycin cũng như với oxyimino-beta-lactam và đề kháng với chất ức chế (clavulanic acid). * CARBAPENEMASES (LỚP A, B VÀ D): carbapenemases là một nhóm khác, hiện nay ít gặp tuy nhiên rất được quan tâm, vì chúng có hoạt tính không những
27 chỉ chống lại oxyimino-cephalosporin và cephamycin mà còn với carbapenem. Plasmid-mediated IMP-type carbapenemases (hiện nay đã biết được 17 loại), được tìm thấy ở Nhật (1990s), ở cả gram âm đường ruột, pseudomonas và acinetobacter sp. Men IMP lan truyền chậm đến các quốc gia khác ở vùng Đông Nam Á; được báo cáo ở Châu Âu năm 1997, và đã được tìm thấy ở Canada và Brazil. Họ thứ 2 của carbapenemases đang phát triển là họ VIM, được báo cáo ở Ý năm 1999 và đến nay gồm 10 thành viên, phân bố rộng rãi ở Châu Âu, Nam Mỹ, và Đông Nam Á và hiện nay đã tìm thấy ở Mỹ. Một vài men lớp A, đặc biệt là men plasmid-mediated KPC, cũng có tác dụng như carbapenemases. Sau cùng, vài OXA-type beta-lactamases có hoạt tính carbapenemases, bằng cơ chế đề kháng thêm vào như thay đổi tính thấm hay bơm đẩy kháng sinh ra ngoài.  Đề kháng thu được không do sinh ra enzym -lactamase[45], [56] [62] [58],[120]. - Do làm thay đổi tính thấm qua màng tế bào: trường hợp này ít gặp, một chủng đường ruột có thể trở nên kháng với kháng sinh nhóm -lactam do đột biến trên NST làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, đề kháng kiểu này đã được Gutmann (1984), Jarlier (1986) và Ingahm (1990) mô tả. - Do làm thay đổi đích bám của kháng sinh: rất hiếm gặp ở các chủng đường ruột, cũng do đột biến trên NST đã làm thay đổi đích bám của kháng sinh penicillin (PBP) hoặc làm thay đổi đích bám của các -lactam khác. Năm 1979, Aono đã tìm thấy ở chủng E. coli đề kháng mecilliam theo cơ chế này [29]. - Có thể có những vi khuẩn mang một kiểu đề kháng phức tạp do có sự phối hợp nhiều cơ chế đề kháng trên cùng một chủng: . Sinh ra enzym -lactamase phổ mở rộng + đột biến làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. . Tăng cường sản xuất enzym cephalosporinase do đột biến gen điều hòa + sinh ra enzym penicillinase do nhận được gen đề kháng nằm trên plasmid.
28 . Tăng cường sản xuất enzym cephalosporinase do sự khuếch đại gen hoặc do có sự thiết lập những gen điều hòa mới + đột biến làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Kênh porin bị đột biến Hệ thống bơm đẩy ngăn cản kháng sinh ra thuốc vào VK ngoài Efflux System Exit Portal (OprM) Outer Membrane Porin Periplasm Linker Men Betalactamase Lipoprotein (Mex A) Cytoplasmic Membrane Hệ thống bơm đẩy kháng sinh Hình 1.5. Đề kháng thu được không do sinh ra enzym -lactamase 1.4.2.6. Đề kháng với kháng sinh Quinolon Sự đề kháng với nhóm kháng sinh này cho đến nay vẫn được hiểu là do đột biến trên NST. Sự đột biến này làm thay đổi đặc tính của enzym tác động vào quá trình sinh tổng hợp ADN (enzym ADN - gyrase) làm cho kháng sinh không tác động vào được nữa. Năm 1998, Martinez - Martinez và cộng sự [78] lần đầu tiên mô tả chủng K. pneumoniae mang gen kháng quinolon nằm trên plasmid, đồng thời các gen này còn gắn trên các Integron khác nhau. Hơn nữa, các plasmid này cũng đồng thời mang gen mã hóa enzym -lactamase phổ rộng hoặc enzyme cephalosporinase. Phát hiện này có tầm quan trọng rất lớn, bởi nó nói lên rằng gen kháng quinolon có thể được lan truyền ngang giữa các vi khuẩn.
29 1.4.2.7. Ý nghĩa sinh học Những hiểu biết về cơ chế sinh hóa và di truyền học của sự đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn đã giúp ích được rất nhiều cho các thầy thuốc lâm sàng trong công tác điều trị.  Đề kháng tự nhiên Những hiểu biết về sự đề kháng tự nhiên sẽ giúp các thầy thuốc lâm sàng tránh được những chỉ định không hợp lý như: không nên sử dụng erythromycin để điều trị nhiễm trùng do E. coli, hoặc không nên sử dụng colistin và nalidixic acid để điều trị nhiễm trùng do tụ cầu hoặc nhiễm trùng do trực khuẩn mủ xanh không nên dùng penicillin G để điều trị, cần thận trọng khi lựa chọn kháng sinh nhóm -lactam để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn họ đường ruột gây nên.  Đề kháng thu được - Sự đề kháng do đột biến trên NST đã làm xuất hiện những chủng vi khuẩn kháng kháng sinh trong chính quần thể vi khuẩn nhạy cảm, sự có mặt của kháng sinh trở thành một chất xúc tác để chọn lọc những dòng vi khuẩn đề kháng. Việc điều trị một kháng sinh đơn độc có thể đưa đến sự lựa chọn những chủng kháng đa kháng sinh, hơn thế nếu điều trị một kháng sinh không còn tác dụng đối với một chủng đa kháng (điều trị "mù") sẽ là điều kiện để chủng "ngoan cố" này gây thành dịch. Để phòng ngừa hoặc làm giảm nguy cơ xuất hiện những chủng đột biến kháng kháng sinh, bằng cách lựa chọn hai kháng sinh thuộc hai nhóm khác nhau (dựa theo nguyên tắc lựa chọn kháng sinh phối hợp) để điều trị phối hợp. Vì theo lý thuyết, một trong những đặc điểm của sự đột biến là nó mang tính độc lập, vì vậy khả năng để một tế bào vi khuẩn xuất hiện đột biến kháng cả hai kháng sinh đồng thời là rất hiếm, tần xuất này chỉ có thể là 10-14 hoặc 10-15. Chính vì thế mà đã từ lâu người ta áp dụng điều trị phối hợp hai hoặc ba kháng sinh trong điều trị lao. - Sự đề kháng do nhận được gen đề kháng thông qua các hình thức: tiếp hợp khi hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau, biến nạp khi vi khuẩn bị ly giải và giải phóng ra ADN tự do hoặc tải nạp nhờ phage hoặc do một thành phần di truyền di động (transposons):
30 . Transposons có thể là nguyên nhân hàng đầu trong việc lan truyền một số gen đề kháng nhất định vào nhiều loại vi khuẩn khác nhau [47]. Nhưng riêng khả năng chuyển vị trí chưa đủ để lan truyền được gen đề kháng mà nó còn phải gắn vào một đơn vị sao chép nào đó (plasmid, phagiơ hay NST). Khi nằm trên một vector không tự sao chép của tế bào chủ thì transposons có thể chuyển vị trí mà nhảy vào một plasmid đang tồn tại trong tế bào hay nhảy vào NST. . Hình thức tiếp hợp giữ vai trò quan trọng vì R-plasmid (là những plasmid mang đặc tính đề kháng) được tìm thấy ở rất nhiều tác nhân gây bệnh, khoảng 60- 90% vi khuẩn Gram âm đề kháng là do R-plasmid. Khả năng của một số plasmid kể cả tự truyền và không tự truyền có thể tồn tại ở nhiều loài vi khuẩn [55] [33], cũng đóng vai trò quan trọng trong sự bảo tồn và lan truyền gen đề kháng, ví dụ: những plasmid giống nhau ở nhiều loài thuộc họ Enterobacteriaceae [41]. Sự đề kháng của vi khuẩn do gen mã hóa nằm trên plasmid gặp ở hầu hết các nhóm kháng sinh khác nhau. Mà các plasmid luôn duy trì ổn định trong tế bào chủ thông qua sự truyền dọc cùng với sự phát triển của vi khuẩn và hơn thế nó có thể truyền ngang do lan truyền từ chủng này sang chủng khác. Vì vậy, tính kháng thuốc có thể được truyền dọc qua các thế hệ và truyền ngang giữa các chủng, các loài, gây khó khăn cho việc điều trị. Do nhận được R-plasmid, có những chủng vi khuẩn trở thành kháng lại một hay nhiều thuốc kháng sinh khác nhau, mặc dù trước đó chúng chưa hề tiếp xúc lần nào với những kháng sinh đó. Hiện nay chỉ có một số loại kháng sinh mà vi khuẩn đề kháng theo cơ chế đột biến là: rifamycin, polymycin, nitrofuran, quinolon và vancomycin. Chính vì thế mà trong những năm gần đây, việc sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi và lạm dụng những kháng sinh thế hệ mới của các thầy thuốc lâm sàng trong các bệnh viện cũng như các thầy thuốc điều trị tư đã làm xuất hiện ngày càng nhiều chủng vi khuẩn đột biến kháng kháng sinh và ngày càng lựa chọn nhiều chủng kháng đa kháng sinh. Đặc biệt trong môi trường khép kín của bệnh viện, việc "giao lưu" của những vi khuẩn đề kháng từ người này sang người khác được thúc
31 đẩy qua các dụng cụ thăm khám, qua các loại chất tiết khác nhau của bệnh nhân, nên môi trường bệnh viện là ổ dự trữ lớn vi khuẩn đề kháng. Như vậy, sử dụng kháng sinh để điều trị phải hết sức thận trọng để hạn chế việc xuất hiện và lan truyền vi khuẩn đa kháng kháng sinh. 1.5. Phương pháp xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh và các phương pháp xác định gen kháng thuốc của vi khuẩn 1.5.1. Phương pháp xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh 1.5.1.1. Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch Là kỹ thuật xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh với các loại kháng sinh khác nhau.  Kỹ thuật [2],[84].  Vi khuẩn đã được định danh, thuần khiết, nuôi cấy 18-24h trên môi trường không có chất ức chế, Đồng nhất vi khuẩn trong canh thang MH hoặc nước muối sinh lý 0,9% so với độ đục chuẩn McFarland 0,5, để có huyền dịch vi khuẩn ban đầu tương ứng với 108 vi khuẩn/1ml. Sau đó tiếp tục pha loãng huyền dịch này 1/100 (hoặc 1/10 tùy theo mỗi loại vi khuẩn) trong canh thang MH hoặc nước muối sinh lý để có huyền dịch vi khuẩn 106 vi khuẩn/1ml (hoặc 107, hoặc 108 vi khuẩn/1ml, tùy theo mỗi loại vi khuẩn).  Ria hoặc láng huyền dịch vi khuẩn đã đồng nhất ở trên dàn đều vi khuẩn lên bề mặt thạch, sau đó để hộp thạch khô tự nhiên hoặc phơi trong tủ ấm 370C/15-30 phút.  Đặt khoanh giấy kháng sinh, sao cho khoảng cách giữa các khoanh giấy cách nhau 2cm và cách mép hộp lồng 2cm. Sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh, cần để hộp lồng ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi cất trong tủ ấm 370C .  Đọc kết quả : - Đọc kết quả sau khi đã để tủ ấm 370C/18-24h. - Dựa vào bảng chuẩn để xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của từng loại vi khuẩn khác nhau. - Có ba mức độ nhạy cảm được qui định : nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R). Có các tiêu chuẩn riêng về môi trường, độ đục huyền dịch vi khuẩn và khí trường ủ của từng loại chủng vi khuẩn
32 1.5.1.2. Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum Inhibitory Concentration - MIC)  Kỹ thuật [2],[84]  Pha kháng sinh Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch “mẹ”) - Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho phòng thí nghiệm: Dựa trên hoạt lực của kháng sinh (được ghi trên các nhãn lọ), cần tính để pha dung dịch “mẹ” theo công thức. . Dung dịch kháng sinh “mẹ” sau khi pha xong, chia nhỏ ra các ống nghiệm, bảo quản trong lạnh âm 200C (trừ kháng sinh Acid nalidixic bảo quản ở nhiệt độ phòng). Khi đã lấy ra sử dụng, chỉ dùng trong 24h. - Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho tiêm truyền tĩnh mạch: Pha toàn bộ lọ kháng sinh đó với một lượng nước hồi chỉnh hoặc nước cất theo chỉ dẫn (có trên nhãn của lọ kháng sinh), từ đó tính được nồng độ của dung dịch mẹ. Pha các nồng độ kháng sinh từ nồng độ của dung dịch mẹ. * Nồng độ cuối cùng pha loãng 1/10 trong môi trường, được tính theo tỷ lệ trộn 2,5 ml dung dịch trung gian + 22,5 ml thạch MH (MIC bằng phương pháp pha loãng trong thạch), hoặc 0,2 ml dung dịch trung gian + 1,8 ml canh thang MH (MIC bằng phương pháp pha loãng trong canh thang).  Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn trong môi trường đặc Ngày 1: Chuẩn bị chủng và môi trường - Các chủng cần thử MIC và các chủng chuẩn quốc tế được cấy trong canh thang thường hoặc canh thang MH để có được canh khuẩn non (một số vi khuẩn có thể cấy vi khuẩn trên môi trường thạch) - Chuẩn bị thạch MH: Cân thạch theo công thức (ghi trên hộp), đun sôi cho tan hết thạch, hấp thạch ở 1210C/15’ (Đối với một số chủng cần môi trường có chất dinh dưỡng cao, cần bổ sung thêm các chất dinh dưỡng cần thiết). - Khi thạch đã nguội còn khoảng 40-500C, dùng ống đong khắc vạch đong 22,5 ml thạch cho vào bình nón đã có sẵn 2,5 ml dung dịch kháng sinh theo các nồng độ như trong bảng pha kháng sinh. Mỗi lần làm MIC cần 2 đĩa môi trường MH không có kháng sinh để làm đĩa chứng (cho thêm 2,5 ml PBS hoặc nước cất + 22,5 ml môi trường thạch MH).
33 Ngày 2: Cấy vi khuẩn trên bề mặt đĩa thạch MH có nồng độ kháng sinh khác nhau - Dùng pipet Pasteur hút khoảng 0,5 ml huyền dịch (106 vi khuẩn/ml) cho vào mỗi giếng của bàn đinh, theo sơ đồ đã ghi số của các chủng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Chủng Chủng chuẩn* chuẩn* * Tùy theo loài vi khuẩn cần xác định MIC để chọn chủng chuẩn sao cho thích hợp Dùng bộ phiên bản 32 chân đinh chấm vào giếng sau đó đặt lên đĩa thạch MH có các nồng độ kháng sinh khác nhau (nếu không có bộ cấy phiên bản, có thể dùng micropipet nhỏ 2 l/chủng lên mặt đĩa thạch theo sơ đồ). - Sau khi đặt lên các đĩa thạch, chờ cho đĩa thạch khô (các giọt nước tại các chân đường cấy thấm vào thạch (khoảng 15-20 phút) cất vào tủ ấm 370C/18h, lật úp đĩa thạch. Đối với một số chủng cần thiết phải đặt các đĩa thạch trong điều kiện có C02 Ngày 3: Đọc kết quả - Trước tiên đọc kết quả ở các đĩa thạch chứng và chủng chứng - Đọc kết quả, lần lượt đọc từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất. Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn lạc mọc. - Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu . - Ở nồng độ thấp nhất, không có vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là: nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó ( ). Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó ( ).
34 - Kết quả MIC của các chủng sẽ được xác định theo ba mức độ nhạy cảm, dựa theo bảng chuẩn: nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R).  Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn trong môi trường lỏng Ngày 1: Chuẩn bị chủng( giống như kỹ thuật trong môi trường đặc) Ngày 2: Cấy vi khuẩn trong môi trường có nồng độ kháng sinh khác nhau - Pha loãng 0,1ml (100l) canh khuẩn non (sau khi để 370C/18h sẽ có huyền dịch vi khuẩn tương đương 108 vi khuẩn/ml) trong 9,9ml canh thang MH (pha loãng 100 lần để có huyền dịch vi khuẩn tương đương 106vi khuẩn/ml), chia 1,8ml vào các ống nghiệm đường kính 12mm. (Nếu nuôi cấy qua đêm bằng môi trường thạch, lấy vi khuẩn thuần khiết từ môi trường thạch thích hợp hoà vào 3 ml dung dịch đệm PBS hoặc nước muối sinh lý 0,9% để có độ đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 – tương đương 108 vi khuẩn/ml, sau đó lại pha loãng 1/100 trong canh thang MH và chia vào các ống nghiệm như trên). - Thêm 0,2 ml nước cất hoặc nước muối sinh lý vô trùng vào 1 ống nghiệm (chứng âm). - Thêm 0,2 ml kháng sinh đã pha theo bảng pha các đậm độ kháng sinh ở trên (phần 3.2.1.2.) vào mỗi ống nghiệm, phân phối từ nồng độ kháng sinh thấp nhất đến nồng độ cao nhất. Lắc kỹ từng ống nghiệm. - Đặt vào tủ ấm 370C/18h. Ngày 3: Đọc kết quả - Lắc kỹ từng ống nghiệm trước khi đọc kết quả. - Đọc kết quả ở ống chứng âm trước để kiểm tra xem chủng vi khuẩn có phát triển tốt hay không, nếu vi khuẩn phát triển tốt mới tiếp tục đọc kết quả, nếu không mọc tốt phải làm lại thí nghiệm. - Đọc kết quả ở các chủng chứng (chủng chuẩn quốc tế), so sánh kết quả MIC của các chủng này với bảng chuẩn. - Xác định nồng độ MIC: Đọc kết quả bắt đầu từ ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp nhất. Nồng độ MIC được tính ở ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp nhất có thể ức chế được sự phát triển của vi khuẩn (bằng mắt thường nhìn thấy nồng độ vi khuẩn mọc thay đổi rõ từ đục nhiều chuyển sang đục ít) - Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu - Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó ( ).
35 - Kết quả MIC của các chủng sẽ được so sánh với nồng độ ranh giới để phân biệt 3 mức độ nhạy cảm, kháng hay ở mức độ trung gian: nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I), kháng (Resistante – viết tắt R).  Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn bằng băng giấy Etest [24], [44] Etest là một kỹ thuật phối hợp của hai kỹ thuật xác định tính nhạy cảm kháng sinh: kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch và kỹ thuật pha loãng kháng sinh trong thạch. Etest là kỹ thuật khuếch tán kháng sinh từ băng giấy trên thạch cho phép xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC). Etest cho kết quả nhanh, rất dễ thực hiện. Đặc biệt thuận lợi cho việc xác định nồng độ MIC của những vi khuẩn khó bảo quản và đòi hỏi nhiều yếu tố trong môi trường phát triển như: H. influenzae, S. pneumoniae, Campylobacter Các bước tiến hành - Chuẩn bị một đĩa thạch MH (đường kính 90mm) đã được láng huyền dịch vi khuẩn giống như các điều kiện trong kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán. - Đặt băng Etest lên đĩa thạch (sau khi lấy băng Etest từ tủ lạnh, nên để ở nhiệt độ phòng 20 phút), phần nồng độ kháng sinh cao nhất gần sát mép hộp lồng, tối đa 6 băng /hộp lồng 90mm. 0 - Đặt đĩa thạch trong tủ ấm 37 C/18-24h, các điều kiện về CO2 tùy theo loại vi khuẩn. - Đọc kết quả nồng độ MIC: dựa vào vòng ức chế vi khuẩn cắt vào băng giấy ở vị trí nào, đó sẽ là điểm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn phát triển.
36 Hình 1.6. Cách xác định kết quả MIC bằng Etest [108] Vùng vi khuẩn phát triển Vòng ức chế hình elip Kết quả MIC 1.5.2. Các kỹ thuật xác định cơ chế kháng kháng sinh 1.5.2.1. Kỹ thuật tiếp hợp trên mặt thạch Kỹ thuật này được thực hiện theo tác giả Kratz (1983). • Mục đích: xác định khả năng lan truyền các R-plasmid có chứa các gen mã hóa sự kháng kháng sinh qua tiếp xúc trực tiếp. • Nguyên lý: chủng vi khuẩn hoang dại ban đầu (chủng cho) có chứa các R- plasmid mang các gen mã hoá sự kháng kháng sinh, cho tiếp xúc với chủng chuẩn (chủng nhận) không chứa plasmid và nhạy cảm với các kháng sinh mà chủng cho đề kháng nhưng chứa gen kháng loại kháng sinh khác nằm trên nhiễm sắc thể mà vi khuẩn cho không có. Nếu có sự lan truyền R-plasmid qua tiếp hợp sẽ tạo ra các vi khuẩn thể tiếp hợp có đặc tính: chứa R-plasmid có gen mã hóa sự kháng kháng sinh. Những vi khuẩn này sẽ mọc được trên môi trường chọn lọc có hai kháng sinh: một kháng sinh vi khuẩn cho đề kháng và một kháng sinh vi khuẩn nhận đề kháng. • Phương pháp: . Chủng cho: vi khuẩn hoang dại kháng với các kháng sinh
37 . Chủng nhận: Là chủng chuẩn đã biết trước không có gen kháng trên Plasmid . Nuôi cấy chủng cho và chủng nhận trong canh thang BHI ở 370C/18h. . Cấy kiểm tra chủng cho và chủng nhận trên môi trường thạch thích hợp có một kháng sinh để kiểm tra kiểu cách kháng kháng sinh . Trộn 2 ml vi khuẩn cho và 2 ml vi khuẩn nhận (tỷ lệ 1:1). . Ly tâm 2000 vòng/phút x 15 phút, lấy cặn ( 0,1 ml) nhỏ lên đĩa thạch nuôi cấy thích hợp, sao cho không còn dung dịch lỏng trên mặt thạch. . Ủ 370C/5 h. . Hoà lại vi khuẩn trên mặt thạch vào 4 ml dung dịch đệm PBS. Lấy 0,2 ml huyền dịch này cấy lên các đĩa môi trường chọn lọc có hai kháng sinh(một vi khuẩn cho kháng và một vi khuẩn nhận kháng). . Đọc kết quả: các vi khuẩn thể tiếp hợp mọc trên môi trường chọn lọc có hai kháng sinh sẽ cho khuẩn lạc có mầu đặc chưng của vi khuẩn nhận. . Kiểm tra kiểu cách đề kháng của vi khuẩn thể tiếp hợp bằng kỹ thuật sao chép. . Kiểm tra tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn thể tiếp hợp trên môi trường sinh vật hóa học (nó phải mang đầy đủ đặc tính sinh vật hóa học của chủng nhận là E.coli): Glucose: + H2S : Lactose: + Hơi : + Ure : Indol: + Manit: + Di động: + Simmon citrat: LDC: 1.5.2.2. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) [40]. Kỹ thuật PCR được Karl Mullis người Mỹ thực hiện vào năm 1985  Phương pháp tiến hành: Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mối chu kỳ gồm 3 bước: - Bước 1: Là giai đoạn biến tính (denaturation). - Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (annealing-Ta). - Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Sau mỗi chu kỳ các chuỗi DNA mới tạo thành tiếp tục được dùng làm khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của sản phẩm PCR là những
38 đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận 5' của 2 đoạn gen mồi. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,5-3%, chạy cùng với marker để so sánh đối chiếu độ lớn của đoạn DNA cần quan tâm. *PCR đa thành phần (multiplex PCR): là phương pháp PCR sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau để nhân các đoạn DNA đặc trưng khác nhau trên một phân tử DNA hoặc trên các phân tử DNA khác nhau [40], [105]. 1.5.2.3. Phương pháp Real-Time PCR [40], [105] Ngoài 2 phương pháp như giải trình tự gen và PCR, hiện nay nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp Real-Time PCR để phát hiện các đột biến gen. Trong kỹ thuật PCR sau khi hoàn tất khuếch đại đoạn DNA đích, phải điện di sản phẩm PCR trên gel agarose để kiểm tra xem có vạch sản phẩm khuếch đại đúng kích thước hay không? Còn Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Do đặc điểm này nên người làm thí nghiệm không cần phải làm tiếp các bước thí nghiệm khác để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không. Như vậy có thể nói Real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được. Tuy vậy, kỹ thuật này đòi hỏi phải có một hệ thống thiết bị máy móc hiện đại, độ tin cậy cao thì kết quả mới chính xác. Scort và cs (2006), Mitrofanov và cs (2008), sử dụng phương pháp Real-Time PCR để phát hiện các đột biến 185delAG; 5382insC trên gen BRCA1 và 6174delT gen BRCA2 ở người Ashkenazi . Kết quả thể hiện ở hình 1.8
39 Hình 1.7. Phát hiện các đột biến 158delAG, 5382insC và 6174delT bằng Real-Time PCR (Scort và cs, 2006). 1, Số chu kỳ của phản ứng PCR; 2, Chu kỳ nhiệt các đột biến và dạng bình thường 1.5.2.4. Kỹ thuật phương pháp lai phân tử [40 ], [105]: ADN đã khuếch đại bằng PCR được mở vòng xoắn, phân tách thành sợi đơn và cắt bằng enzym giới hạn nuclease (enzym cắt đặc hiệu cho ADN);i) điện di xung trường (PFGE) để tách các đoạn ADN đã bị cắt; ii) Các đoạn ADN được chuyển sang màng lai nitrocellulose; iii) Các đoạn ADN trên màng được lai với mẫu dò đặc hiệu dựa theo nguyên lý bổ xung ADN; iv) Cố định và phát hiện sự có mặt của phân tử lai ADN- mẫu dò được đánh dấu bằng biotin với mối liên kết chắc chắn với avadin. Avadin hỗn hợp với phosphatase kiềm dưới tác dụng của chất nền sinh mầu tạo ra mầu tím của sản phẩm.
40 Hình 1.8. Kỹ thuật Southern Blot 1.5.2.5. Kỹ thuật giải trình tự gen Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gen đã được phát minh như: Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (Alan Maxam và Walter Gilbert) và giải trình tự gen bằng enzyme hay phương pháp Dideoxy (Frederick Sanger 1977). Nguyên lý chung của hai phương pháp là đều tạo ra các đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau và có xác suất xuất hiện như nhau trong phản ứng. Sau đó các trình tự này được phân tích bằng điện di trên gel polyacrilamid và kết quả được đọc trên bản phóng xạ tự ghi hoặc nhờ máy dò tự động. Máy giải trình tự gen tự động được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng dideoxynucleotid (dNTP). Với các máy thế hệ sau này người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại dNTP. Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên 1 hàng chứ không phải trên 4 hàng như trước đây. Đối với phương pháp này, mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử dNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang, máy sẽ nhận diện được các nucleotid, từ đó biết được trình tự của DNA đích [17]. Phương pháp này giúp phát hiện chính xác các đột biến xuất hiện ở gen BRCA1 và BRCA2.
41 Hình 1.9. Hình ảnh minh hoạ giải trình tự một đoạn DNA (Nguồn: Sanger cequencing read display.gif) 1.6. Nhiễm khuẩn hô hấp và tình hình kháng kháng sinh do Klebsiella 1.6.1. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của Klebsiella spp. ở nước ngoài Nhiễm khuẩn hô hấp do Klebsiella spp. ở trong cộng đồng là hiếm gặp, thường gặp ở những người có miễn dịch kém như trẻ nhỏ, người già, người mắc bệnh mãn tính [29]. Nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. gặp chủ yếu ở trẻ sơ sinh và sơ sinh non yếu. Tỷ lệ chủng kháng và đa kháng kháng sinh cao, nhất là chủng sinh men β- lactamase phổ rộng và KPC. Đặc biệt là những chủng Klebsiella spp. mang gen NDM-1 gây đề kháng các loại kháng sinh hiện có và làm cho Klebsiella spp. trở thành siêu vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh [112], [113], [114]. Tỷ lệ nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. khác nhau ở các nước. Tại Châu Âu, tỷ lệ Klebsiella spp. gây nhiễm khuẩn ở các bệnh viện từ 3% -17%; ở Thổ Nhĩ Kỳ 26,2% [85], [ 98], [119]. Các chủng Klebsiella spp. gây nhiễm khuẩn bệnh viện đề kháng cao với các kháng sinh ngoại trừ imipenem (IPM) và ciprofloxacin (CIP) [83], tỉ lệ kháng với các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin và quinolon ở cộng đồng là 4% và 21%, tỉ lệ này cao gấp hai lần đối với những chủng phân lập được từ nhiễm trùng bệnh viện. Các chủng phân lập được từ nhiễm trùng bệnh viện đã kháng 60%-100% đối với ampicillin (AM) và cephazolin, xuất hiện chủng kháng với nhiều loại kháng sinh, với IPM và CIP kháng 0%-12% [119]. Các chủng sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBLs) là yếu tố lan tràn và bùng phát nhiễm khuẩn
42 bệnh viện đồng thời tăng tỉ lệ chủng kháng đa kháng kháng sinh. Tỉ lệ chủng có men ESBLs phân lập ở bệnh nhân viêm phổi nhiễm trùng bệnh viện là 88,9% còn phân lập từ những bệnh nhân viêm phổi không phải do nhiễm trùng bệnh viện là 11,1% [30]. Những báo cáo mới nhất về cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolon của các nhà nghiên cứu cho thấy vai trò chủ yếu là do đột biến trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Năm 1998, Martinez - Martinez và cộng sự [75], lần đầu tiên mô tả chủng Klebsiella pneumoniae kháng nhóm kháng sinh quinolon theo cơ chế lan truyền gen P.M.G 252 trên plasmid. Sự kháng kháng sinh nhóm quinolon được xác định bởi gen qnr nằm trên các Integron khác nhau. Phát hiện này có tầm quan trọng rất lớn bởi nó nói lên rằng gen kháng quinolon có thể lan truyền ngang giữa các vi khuẩn với nhau. Thêm vào đó các integron này đồng thời mang gen kháng kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ ba (do enzym -lactmase phổ rộng hoặc do enzyme cephalosporinase). Các kháng sinh nhóm quinolon tác động chính lên protein của tế bào vi khuẩn là onr (thuộc nhóm nhân 5 cạnh, protein McbG và MfpA các protein này tham gia tạo dây xoắn AND của vi khuẩn và được gọi là DNA gyrase). Gen mã hóa cho enzym này chính là qnr. Sự đột biến ở gen này sẽ làm cho vi khuẩn kháng lại được các kháng sinh nhóm quinolon [52], [61]. Các gen kháng quinolon nằm trên plasdmid- qnrA được phát hiện lần đầu tiên năm 1998 ở Mỹ, sau đó qnrB, qnrS lần lượt được phát hiện và thấy chúng được phân bố rộng khắp trên toàn cầu. Trên hình ảnh phân bố gen qnr trên thế giới (hình 1.12) Việt Nam nằm trong khu vực có lưu hành gen qnr chủ yếu là qnrA và qnrS. Tỷ lệ mang gen kháng qnr khác nhau giữa các nước và các khu vực: từ 4% đến 55% tập trung cao ở các nước Đông Nam Á, đặc biệt là Hàn Quốc và Trung Quốc từ 20,3 đến 55%.
43 Hình 1.10. Sự phân bố gen qnr[Jacob-2009] Sự kháng kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 (C3G) liên quan đến sự kháng quinolon theo cơ chế plasmid luôn được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Chủng gây bệnh đề kháng với C3G hầu hết tìm thấy ở các bệnh viện [109],[35], [96], [6], [38]. Cũng giống như quinolon, chủng kháng C3G thay đổi tùy theo vùng địa lý. Những thay đổi quan trọng được báo cáo ở châu Á - Thái Bình Dương [109], [6]. Ở Châu Phi số liệu không nhiều, tỷ lệ kháng khoảng 40% [35], [61]. Đa số chủng mang gen qnr đều kèm theo mang enzym ESBL (SHV-5, SHV-7, CTX-M, Veb-1, Oxa-30) hoặc một -lactamase plasmid type AmpC (Fox-5) [46], [51], [39], [60],[61], [102],[107]. Đặc biệt các chủng mang gen kháng CTX-M một gen mã hóa enzym phân hủy Cefotaxime kháng sinh đang được sử dụng nhiều trong điều trị và có những loại CTX-M phân hủy ceptazidime nhanh và mạnh hơn Cefotaxime đã xuất hiện khắp các nước.
44 Hình 1.11. Hình ảnh phân bố gen CTX-M[109] 1.6.2. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của Klebsiella spp. ở trong nước: Nhiễm trùng đường hô hấp là một bệnh chiếm tỷ lệ cao trong các nhóm bệnh ở trẻ em 53,3% (nghiên cứu cơ cấu bệnh tật trong 3 năm 2005-2008 của bệnh viện Thanh Nhàn). Nhiễm khuẩn hô hấp cấp ở trẻ em ở các bệnh viện có tỷ lệ cao : Sain-Paul 36,8%, khoa Nhi - Bệnh viện Bạch Mai 41,35%, Bệnh viện Đaklak 35,5% [22]. Klebsiella là vi khuẩn hàng đầu gây nhiễm khuẩn đường hô hấp ở trẻ em nằm viện, nhất là trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Tỷ lệ nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn tiết niệu trẻ em ở bệnh viện 27,62% - 42,12% [1], [ 4]. Các chủng Klebsiella spp. thu được ở bệnh viện nhi kháng lại kháng sinh ngày một tăng cao [5],[11]. Các kháng sinh thông thường như Ampicilline và Cephalothine kháng 97,8% và 91,7%, nhóm quinolon (31,9%) và C3G khá cao ở nhiễm khuẩn bệnh viện ở trẻ em (42,4 - 57,2%) [1]. Những nhiễm khuẩn chung ở người lớn tỷ lệ kháng C3G từ 36,8 - 37,2% và quinolon 31,8% [16].
45 Tỷ lệ chủng sinh β-lactamases ở Klebsiella khác nhau tuỳ từng bệnh viện. Bệnh viện Chợ Rẫy 61%; Bệnh viện Việt Đức là 39,3%; Bệnh viện Nhi Trung ương 22,68% [19]. Tỷ lệ kháng C3G cao (36,8% - 57,2%) và quinolon (31,8% - 31,9%) [1], [4], [19]. Cho đến nay, ở Việt Nam có nghiên cứu của Cao Thị Bảo Vân và cộng sự với công bố kết quả nghiên cứu sự phân bố gen kháng β- lactam của các chủng thuộc họ Enterobacterriacea phân lập ở Việt nam cho thấy tỷ lệ CTX- M(25,5%); SHV (38,1%) ; TEM (76,3%) [21].
46 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu: Tất cả các chủng Klebsiella phân lập được từ bệnh phẩm đường hô hấp của các bệnh nhi từ 0 đến 6 tuổi nằm điều trị tại khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh và khoa Hô hấp bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 7/2009 đến tháng 7/2010. Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp này được thu thập từ hai nhóm : + Nhóm từ những bệnh nhi được chẩn đoán là nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính ngay khi nhập viện (như viêm phế quản phổi, viêm phổi, viêm tiểu phế quản phổi ) - gọi là nhóm NKHHCT + Nhóm thu thập từ những bệnh nhi được chẩn đoán những bệnh khác ngoài nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính khi nhập viện, mà NKHHCT là bệnh đi kèm hoặc xuất hiện sau thời gian nằm điều trị - gọi là nhóm NKHHCT kết hợp + Nhóm bệnh nhi nặng xin về và nhóm tử vong gọi chung là nhóm tử vong. - Tiêu chuẩn lựa chọn các chủng Klebsiella vào nghiên cứu gen kháng C3G và Quinolon: Tất cả các chủng Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng được xác định theo tiêu chuẩn của CLSI đảm bảo không cùng trên một phòng bệnh trong cùng một ngày nuôi cấy. 2.2. Thiết kế nghiên cứu: Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang. 2.2.1. Cỡ mẫu: Lượng chủng K. pneumoniae có sinh men β-lactamase phổ rộng theo công thức sau: p(1-p) n = Z²(1-α/2) x d² Trong đó: Z(1-α/2) = 1,96, với độ tin cậy 95%. p = 2,4. p là tỷ lệ mang gen qnr ở các chủng Klebsiella có sinh men β- lactamase phổ rộng trong nghiên cứu tại Trung Quốc năm 2008 [28].
47 d = 0,1: là sai số lựa chọn. n : số mẫu phân lập được Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng. Theo công thức tính cỡ mẫu n= 93. Trên thực tế, nghiên cứu đã phân tích trên 107 mẫu Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng. 2.2.2. Chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện cho đến khi phân lập đủ cỡ mẫu Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng cần nghiên cứu 2.3. Các biến số và chỉ số nghiên cứu: - Tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập được ở đường hô hấp của đối tượng nghiên cứu theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp - Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella phân lập được theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp. - Tỷ lệ mang gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon (CTX- M, SHV,TEM, qnr) của các chủng Klebsiella phân lập được theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp. 2.4. Vật liệu và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 2.4.1. Địa điểm thực hiện: Các kỹ thuật xét nghiệm được thực hiện tại: - Khoa Vi sinh, Bệnh viện Nhi Trung ương - Phòng nghiên cứu kháng kháng sinh - Khoa vi sinh thuộc labo lâm sàng bệnh viện Serveral của Đại học tổng hợp Yonsei - Hàn quốc. 2.4.2. Vật liệu nghiên cứu: Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ dùng để thu thập bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập, định danh và xác định tính nhạy cảm kháng sinh, nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn Môi trường vận chuyển bệnh phẩm: Dung dịch NaCl 0,9% vô trùng đóng sẵn 4,5ml. Tăm bông mềm. Máy hút dịch hoặc bơm tiêm 10ml. - Ống nghiệm có nút bông vô khuẩn. Nồi cách thủy, tủ sấy khô, nồi hấp ướt.
48 Môi trường chocolate, thạch máu, bộ nhuộm gram, thuốc thử oxydase; card định danh cho máy. Cân chính xác đến gram, tủ lạnh 4-80C, tủ đông lạnh - 800C. 0 Tủ ấm 37 C, tủ ấm CO2. Card định danh các loại và card định danh trực khuẩn Gram âm GN test kit code 21341 (Hãng Bio-Merieux). Que cấy định lượng 10µl, đèn cồn; ống nghiệm chuyên dùng cho máy định danh, lam kính; Các loại khoanh giấy kháng sinh của hãng Biorad: Ampicilline (AM), Cephalothine(CF), Cefuroxime(CXM), Amoxicilline/Acidclavulanic(AMC), Cefotaxime (CTX), Ceftazidime (CAZ), cefoxitine (FOX), Cefepime(FEP), Co- trimoxazone(SXT), Gentamicin(GM), Amikacin(AK), Tobramycin(TM), Ciprofloxacin(CIP) và Immipenem (IPM). Các loại bột kháng sinh: Cefoxitin, Cefoperazon Astreonam Ceftazidime, Ceftazidime/Acid clavulanic, Cefotaxime, Cefotaxime/Acid clavulanic, Piperacilline, Piperacillie/Acid clavulanic, Imipenem, Cefepime( của hãng Bioneer) Máy voltex, máy đo độ đục chuẩn của vi khuẩn. Máy định danh Vitek 2  Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ dùng để xác định vi khuẩn sinh enzyme β-lactamase phổ rộng (ESBL) * Dụng cụ: - Hộp lồng tròn đường kính 90mm. - Dụng cụ đặt khoanh giấy kháng sinh pince kẹp không có mấu. - Thước đo vòng ức chế * Hóa chất và sinh phẩm + Môi trường: Thạch Mueller - Hinton (MH). + Các chủng vi khuẩn chuẩn quốc tế - Staphylococcus aureus ATCC 29213 - Escherichia coli ATCC 25922
49 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - Các chủng Klebsiella pneumoniae chắc chắn có gen CTX,SHV,TEM và qnR càn tìm của phòng xét nghiệm nghiên cứu kháng thuốc thuộc bệnh viện Serveral - Hàn Quốc  Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ dùng trong kỹ thuật PCR *Sinh phẩm - Cặp mồi chẩn đoán gen: TEM, SHV,CTX-M-3, CTX-M-9, qnrA, qnrB, qnrS (Hãng Bioneer - Hàn Quốc): Bảng 2.1. Thông tin các mồi dùng cho nghiên cứu Kích thước Gen nằm trên Mồi Trình tự nucleotide (5'->3') phân tử plasmid PCR (bp) F ATAAAATTCTTGAAGACGAAA TEM 1078 Nhóm R GACAGTTACCAATGCTTAATC gen mã F TGGTTATGCGTTATATTCGC SHV 866 hóa sự R GGTTAGCGTTGCCAGTGCT kháng F CCCATGGTTAAAAAATCACT CTX-M-3 889 nhóm R CCGTTTCCGCTATTACAAAC C3G F ATGGTGACAAAGAGAGTGCA CTX-M-9 868 R CCCTTCGGCGATGATTCTC F AGAGGATTTCTCACGCCAGG ự qnr A 577 R TGCCAGGCACAGATCTTGAC F GGMATHGAAATTCGCCACTG qnr B 263 R TTTGCYGYYCGCCAGTCGAA F GCAAGTTCATTGAACAGGGT qurS 425 Nhóm gen Nhóm mã hóa s R TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG kháng nhóm Quinolon Ghi chú: F- Mồi xuôi; R: Mồi ngược - PreMix - Thang ADN chuẩn
50 * Hóa chất - Thạch agarose dùng trong điện di gen( tự pha) - Ethidium bromide dùng để nhuộm gen - TAE (Tri Acetate EDTA) * Dụng cụ máy móc phục vụ kỹ thuật PCR - Máy ly tâm lạnh( Clinispin, Đức) - Máy điều nhiệt tự động (Eppendorf, Đức) - Bộ điện di ngang (Fisher scientific,USA) - Máy chụp ảnh gel (GelDoc-lt imager, USA)  Sinh phẩm, hóa chất,dụng cụ dùng trong kỹ thuật Southern Blot * Sinh phẩm: - Môi trường TM,CHO hoặc canh thang BHI (tự pha) - Enzym S1 (Của hãng Sigma) - Lyzozyme, proteinase K (Của hãng Sigma) - Dung dịch ly giải vi khuẩn và một số dung dịch khác (Của hãng Sigma) * Hóa chất: - Thạch incert agarose (cambrex Biocience, Rockland Inc. USA) - Thạch gold agarose (cambrex Biocience, Rockland Inc. USA) - Ethidium bromide dùng để nhuộm các đoạn ADN - Dung dịch EDTA - Dung dịch pett IV (tự pha với hóa chất gốc) - Dung dịch ES(tự pha với hóa chất gốc). - Dung dịch Tris- HCL 1M (Invitrogen.) - Dung dịch BSA 1% - Màng lai nitrocellulose - Một số hóa chất khác * Dụng cụ, máy móc phục vụ cho kỹ thuật Southern Blot - Dàn máy PFGE (CHEF - DRR II (Bio- rad)
51 - Máy chuyển ADN lên màng lai (Prehybridization) - Máy Hybridization 2.4.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 2.4.3.1. Lấy bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập Mẫu bệnh phẩm để xác định căn nguyên gây NKHHCT trẻ em được lấy từ dịch tỵ hầu, dịch hút nội khí quản hoặc dịch rửa phế quản. Cách lấy bệnh phẩm được thực hiện theo thường quy của Tổ chức Y tế thế giới (WHO). * Cách lấy bệnh phẩm tỵ hầu: Bệnh nhân được bế ngồi trong lòng người lớn ở tư thế khám họng ( mặt nhìn ra phía trước, đầu hơi ngả ra phía sau). Dùng loại tăm bông có cán được làm bằng kim loại mềm, không gỉ vào qua lỗ mũi một đoạn bằng chiều dài 1/2 từ cánh mũi đến dái tai cùng bên. Xoay tròn tăm bông vài lần rồi nhẹ nhàng kéo ra đưa vào tuýp có môi trường vận chuyển . Cắt đoạn trên của tăm bông, phần không chạm vào tuýp và đậy chặt nắp. Dán nhãn trên tuýp đựng mẫu bệnh phẩm. Hoàn thành các mẫu theo yêu cầu của phòng thí nghiệm. * Cách lấy bệnh phẩm đường hô hấp dưới: Bệnh nhân được lấy dịch nội khí quản qua sonde vô trùng sau khi được đặt nội khí quản hoặc dịch rửa phế quản qua nội soi phế quản. Dán nhãn trên ống đựng mẫu bệnh phẩm. Hoàn thành các mẫu theo yêu cầu của phòng thí nghiệm. * Vận chuyển mẫu bệnh phẩm: Chuyển đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt để giảm tối đa sự phát triển của vi khuẩn hội sinh . 2.4.3.2. Nuôi cấy, phân lập, xác định căn nguyên vi khuẩn: Thực hiện theo thường quy của WHO và Viện Y học Nhiệt đới thuộc đại học Nagasaki- Nhật Bản [7], [17], [59], [79], [93], [116]. *Xử lý bệnh phẩm:
52 Bệnh phẩm được đưa vào ống nghiệm vô trùng chứa 1ml canh thang BHI. Dùng máy lắc trộn đều, rồi loại bỏ tăm bông. Lúc này, dung dịch bệnh phẩm đã được pha loãng 100 lần (vì bệnh phẩm lấy được bằng tăm bông tương đương 0,01 ml pha trong 1ml canh thang BHI). * Sơ đồ2.1. Sơ đồ nuôi cấy, phân lập và xác định căn nguyên vi khuẩn. *Kỹ thuật cấy đếm: dùng máy lắc trộn đều ống số 1, sau đó lấy 0,5 ml hỗn dịch trộn với 4,5 ml NaCl 0,9% ở ống số 2. Tiếp tục làm như vậy cho đến ống số 6. Tại ống số 6, sau khi đã trộn đều hỗn dịch thì bỏ đi 0,5 ml. Như vậy, bệnh phẩm đã được pha loãng thành 6 độ: 10-2; 10-3; 10-4; 10-5; 10-6; 10-7. Từ các nồng độ pha loãng trên, dùng que cấy chuẩn lấy 1 ăng đầy (tương đương 0,01 ml hỗn dịch) cấy lên 1/6 đĩa thạch TM,CHO được đánh số tương ứng, với lưu ý cấy từ nồng độ loãng nhất đến nồng độ đặc nhất. Chờ se mặt thạch, lật 0 ngược đĩa thạch, để vào tủ ấm 35 - 37 C trong khí thường có 5% CO2, sau 24 giờ đọc kết quả.
53 Nếu sau 24 giờ, chưa thấy vi khuẩn mọc thì tiếp tục để trong điều kiện như trên, thêm 24 giờ nữa. Sau 48 giờ nuôi cấy, không thấy vi khuẩn mọc thì bệnh phẩm đó được kết luận là âm tính. Nếu có vi khuẩn mọc thì tiến hành đếm và tính số lượng khuẩn lạc như sau: o Số lượng khuẩn lạc = n x 102 x nồng độ pha loãng. o Ví dụ: ở vùng 5 số khuẩn lạc đếm được là 7, thì số lượng khuẩn lạc ở vùng 5 = 7 x102 x 106. Ở đây x102 vì: 1 ăng chuẩn tương đương 0,01 ml. Số lượng khuẩn lạc lại được tính cho 1ml bệnh phẩm. Nếu ở một nồng độ lại có 2 hoặc 3 loại khuẩn lạc mọc thì cách tính số lưọng khuẩn lạc như trên (số lượng khuẩn lạc được tính cho 2 hoặc 3 loại vi khuẩn/1ml). Theo Oishi Nagatake và cộng sự để khẳng định căn nguyên gây NTHHCT ở trẻ nhỏ có biểu hiện lâm sàng, kết quả nuôi cấy vi khuẩn phải lớn hơn hoặc bằng 106 CFU/1ml. * Đối với bệnh phẩm có lớn hơn hoặc bằng 106 CFU/1ml, tiến hành nhuộm Gram và thử oxydase (âm tính) => đưa và máy định danh để có chẩn đoán xác định là Klebsiella pneumoniae. * Định danh vi khuẩn bằng máy VITEK 2: Trên thạch dinh dưỡng hay thạch máu, khuẩn lạc vi khuẩn cần định danh đã được nuôi cấy thuần nhất sau 18 - 24 giờ. Tiến hành nhuộm gram, soi và xác định hình thể vi khuẩn: - Nếu là cầu trùng gram dương tiến hành thử nghiệm catalase + Catalase dương tính => sử dụng card định danh tụ cầu + Catalase âm tính =>làm thử nghiệm optochin * Optochin dương tính => sử dụng card định danh phế cầu * Optochin âm tính => sử dụng card định danh liên cầu - Nếu là nấm => sử dụng card định danh nấm
54 - Nếu là khuẩn lạc hơi xám, chỉ mọc trên chocolate còn trên thạch máu không mọc hoặc mọc yếu, nhuộm Gram soi thấy hình ảnh trực khuẩn gram âm đa hình thái nghĩ tới Heamophilus sử dụng card NH định danh cho Heamophilus. - Nếu là trực khuẩn gram âm sử dụng card định danh GN test kit code 21341, dựa trên 54 tính chất sinh vật hóa học cho xác định các trực khuẩn gram âm. 54 tính chất sinh vật hóa học sau để khẳng định là chủng vi khuẩn Klebsiella spp. APPA - dGLU + BAap - dTAG - NAGA - CMT - ADO + GGT + ProA - dTRE + AGAL + BGUR - PyrA + OFF + LIP - CIT + PHOS + O129R + dCEL + BGLU + PLE + MNT + GlyA - GGAA + BGAL + dMAL + TyrA - 5KG - ODC - IMLTa - H2S - dMAN + URE - ILATk + LDC + ELLM - BNAG - dMNE + dSOR + AGLU - IHISA - ILATa - AGLTp - BXYL + SAC + SUCT + BXYL IARL - 2.4.3.3. Kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán trên thạch + Nguyên lý: Các loại kháng sinh khác nhau đã được tẩm trong các khoanh giấy, sẽ khuếch tán trong thạch và kìm hãm sự phát triển của chủng vi khuẩn trên bề mặt thạch, tạo thành các vòng ức chế. Dựa vào đường kính vòng ức chế để đánh giá mức độ nhạy cảm của chủng vi khuẩn với kháng sinh tương ứng. + Mục đích : Xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh với các loại kháng sinh khác nhau. * Kỹ thuật [26], [25], [43], [71], [84], [90]. - Chuẩn bị môi trường: Môi trường MH (có thể cho thêm chất bổ sung tùy loại vi khuẩn) được chuẩn bị trong hộp lồng với độ dày 4-5mm, lưu ý khi đổ môi trường cần đặt trên một mặt phẳng, để đảm bảo độ dầy của thạch đồng đều. Môi trường đã được chuẩn
55 bị có thể bảo quản trong túi nylon kín, giữ ở 4-80C, sử dụng trong 2 tuần. Trước khi sử dụng, nên phơi trong tủ ấm 370C/15phút. - Chuẩn bị chủng: Vi khuẩn đã được định danh, thuần khiết, nuôi cấy 18-24h trên môi trường không có chất ức chế (tùy loại vi khuẩn sẽ cần môi trường thích hợp để phát triển tốt, xem phần 2.3.), lấy vi khuẩn hòa trong canh thang MH, nước muối sinh lý 0,9% NaCl hoặc dùng đệm PBS pH 7,2 tùy loại vi khuẩn so với độ đục chuẩn McFarland 0,5 để có huyền dịch vi khuẩn ban đầu tương ứng với 108 vi khuẩn/1ml. Sau đó tiếp tục pha loãng huyền dịch này 1/100 (hoặc 1/10 tùy theo mỗi loại vi khuẩn) trong canh thang MH hoặc nước muối sinh lý để có huyền dịch vi khuẩn 106 vi khuẩn/1ml (hoặc 107, hoặc 108 vi khuẩn/1ml, tùy theo mỗi loại vi khuẩn). Có thể tạo huyền dịch vi khuẩn bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang MH ở 370C/3-5h có lắc (nồng độ vi khuẩn này tương đương với độ đục chuẩn Mc-Farland 0,5 là 108 vi khuẩn/1ml). * Tiêu chuẩn để đánh giá một huyền dịch vi khuẩn pha đạt chuẩn được dựa trên hình ảnh kháng sinh đồ, các khuẩn lạc đứng cạnh nhau, không chồng dày lên nhau. - Cấy vi khuẩn: Láng huyền dịch vi khuẩn 106 vi khuẩn/1ml (hoặc 107, hoặc 108 vi khuẩn/1ml, tùy theo loại vi khuẩn) lên bề mặt thạch, dùng pipette Pasteur loại bỏ huyền dịch vi khuẩn còn thừa ra khỏi đĩa thạch. Hoặc dùng tăm bông dàn đều vi khuẩn lên bề mặt thạch, sau đó để hộp thạch khô tự nhiên hoặc phơi trong tủ ấm 35- 370C/15-30 phút. - Đặt khoanh giấy kháng sinh: Dùng dụng cụ đặt khoanh giấy hoặc dùng pince kẹp để đặt khoanh giấy kháng sinh, sao cho khoảng cách giữa các khoanh giấy cách nhau 2cm và cách mép hộp lồng 2cm, hộp lồng tròn đường kính 90mm đặt tối đa 7 khoanh giấy (6 khoanh xung quanh và 1 khoanh ở giữa), hộp lồng vuông cạnh 120mm đặt tối đa 16 khoanh giấy (bốn hàng x 4 khoanh/hàng). Sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh, cần để hộp lồng ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi cất trong tủ ấm 35-370C (Để lật ngược nắp
56 hộp lồng xuống dưới, tránh hiện tượng hơi nước tích tụ rơi từ nắp hộp xuống mặt thạch đã láng vi khuẩn, làm ảnh hưởng đến kết quả). - Đọc kết quả : - Đọc kết quả sau khi đã để tủ ấm 35-370C/18-24h. - Dựa vào bảng chuẩn để xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của từng loại vi khuẩn khác nhau. - Có ba mức độ nhạy cảm được qui định: nhạy cảm(Susceptible -viết tắtS) ,trung gian (Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R). - Các chủng chuẩn được tiến hành song song với các mẫu bệnh phẩm để kiểm tra chất lượng kỹ thuật Hình 2.1. Kháng sinh đồ trên hộp lồng vuông cạnh 120mm 2.5.3.4. Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch để xác định khả năng sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBL) của vi khuẩn (CLSI) Mục đích: Xác định xem các chủng Klebsiella spp. phân lập tại Bệnh viện Nhi trung ương có sinh men β-lactamase phổ rộng không. Nguyên lý: Nếu các chủng vi khuẩn được thử có sinh ra men β-lactamase phổ rộng, nó sẽ phân huỷ kháng sinh cefotaxim và ceftazidim, làm cho vòng vô khuẩn của các kháng sinh này giảm xuống tới mức nhạy cảm vừa (Intermidiated – I) hoặc kháng (Resistance – R). Kháng sinh augmentin (phối hợp của hai kháng sinh: amoxicillin và acid clavulanic), có chất ức chế men β-lactamase phổ rộng là axid clavulanic, nên kháng sinh amoxicillin không bị phá huỷ và có vòng vô khuẩn ở mức nhạy cảm (Sensitive – S). Đồng thời ở vùng giáp ranh giữa các kháng sinh
57 augmentin (AMC) với cefotaxim (CTX), augmentin (AMC) với ceftazidim (CAZ), do men  - lactamase phổ rộng của vi khuẩn ở 2 vùng này bị ức chế bởi chất ức chế axid clavulanic từ khoanh giấy kháng sinh augmentin nên cefotaxim và ceftazidim không bị phá huỷ, vi khuẩn bị tiêu diệt, làm xuất hiện sự mở rộng vòng vô khuẩn ở đây. Được gọi là hình ảnh hiệp đồng (hình ảnh nút chai sâm panh) Kháng sinh: 4 khoanh giấy kháng sinh được lựa chọn để phát hiện sự sinh men  - lactamaza phổ rộng của vi khuẩn được thử là: - Aztreonam (ATM - thuộc họ monobactam). - Cefotaxim (CTX) và Ceftazidim (CAZ) là hai cephalosporin thế hệ III, bị phá huỷ bởi men β-lactamase phổ rộng. - Augmentin (AMC) là một kháng sinh phối hợp giữa amoxicillin với một chất ức chế  - lactamase là axid clavulanic. Các bước tiến hành: Tiến hành các bước tương tự ở phương pháp khoanh giấy khuếch tán. Đầu tiên, pha canh khuẩn có nồng độ 108 vi khuẩn/ml, sau đó pha loãng thành nồng độ 106 vi khuẩn/ml. Láng canh khuẩn này lên bề mặt thạch, hút canh khuẩn thừa bỏ đi, để khô mặt thạch. Dùng kim tiêm sạch đặt 4 khoanh giấy lên bề mặt thạch theo sơ đồ hình 4 ATM AMC CTX CAZ Sơ đồ 2.2. Đặt khoanh giấy kháng sinh xác định men  - lactamase phổ rộng.
58 Ghi chú: AMC - augmentin,ATM - Aztreonam, CTX - cefotaxim, CAZ – ceftazidim. Sau khi để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho kháng sinh khuếch tán đều, cho vào tủ ấm 35-370C/18 giờ với tư thế đảo ngược đĩa thạch. Đánh giá kết quả   - lactamase phổ rộng dương tính (có sinh men β-lactamase phổ rộng) trong trường hợp chủng vi khuẩn nhạy cảm với AMC nhưng kháng CTX, CAZ, ATM và có hình ảnh hiệp đồng ở vùng giáp ranh giữa các khoanh giấy AMC với CTX, AMC với ATM hoặc AMC với CAZ. Nghĩa là: - Vi khuẩn sinh men β-lactamase phổ rộng bị ức chế bởi chất ức chế là axid clavulanic, nên nhạy cảm với AMC. - Men β-lactamase này có phổ mở rộng nên đã tác động đến các cephalosporin thế hệ III, vì thế CTX, CAZ và ATM đều bị kháng hoặc giảm tính nhạy cảm ( R hoặc I). - Nhưng riêng vùng giáp ranh giữa các khoanh giấy AMC với CTX hoặc AMC với CAZ hoặc AMC với ATM do có sự ức chế bởi chất ức chế là axid clavulanic nên men β-lactamase phổ rộng không tác động vào các cephalosporin thế hệ III, vi khuẩn bị diệt tạo hình ảnh mở rộng của vòng vô khuẩn. Được gọi là hình ảnh hiệp đồng (hình ảnh nút chai sâm panh)  Còn lại các trường hợp khác đều đọc là men β-lactamase phổ rộng âm tính (không sinh men β-lactamase phổ rộng ). 2.4.3.5. Xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) - Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng).
59 - Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn và bằng mắt thường đã có thể xác định được điều này. - Kỹ thuật [43], [77],[84], [87]. + Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch “mẹ”) +Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho phòng thí nghiệm: Dựa trên hoạt lực của kháng sinh (được ghi trên các nhãn lọ), cần tính để pha dung dịch “mẹ” theo công thức sau: Ví dụ: Kháng sinh chloramphenicol có hoạt lực 99,13%, nếu cần pha 10 ml dung dịch kháng sinh “mẹ” có nồng độ 1600 g/ml, sẽ phải cân Xg kháng sinh: 10 ml x 1600 Xg kháng sinh = = 16.140,421 g/ml = 0,016140 g/ ml 99,13 Kháng sinh bột sau khi được cân, sẽ pha với dung dịch đệm thích hợp, tùy mỗi loại kháng sinh khác nhau sẽ có những dung môi và dung dịch đệm khác nhau (phụ thuộc từng hãng sản xuất loại kháng sinh). Nhiều loại kháng sinh có thể hoà tan và được pha loãng trong nước cất. Một số khác cần phải hoà tan trong các dung môi đặc biệt, sau đó mới được pha loãng trong nước cất. Dung dịch kháng sinh “mẹ” sau khi pha xong, chia nhỏ ra các ống nghiệm, bảo quản trong lạnh âm 200C (trừ kháng sinh Acid nalidixic bảo quản ở nhiệt độ phòng). Khi đã lấy ra sử dụng, chỉ dùng trong 24h. + Pha các nồng độ kháng sinh Dung dịch Nồng độ Nồng độ Dung dịch “mẹ” đệm PBS * Độ pha trung gian cuối cùng (hoặc nước cất) (g/ml) (g/ml) 2,5 ml (1280 g/ml) - - 1280 128 2 ml 2ml 1/2 640 64 1 ml 3 ml 1/4 320 32 0,5 ml 3,5 ml 1/8 160 16 0,5 ml 7,5 ml 1/16 80 8 2ml (80 g/ml) 2 ml 1/2 40 4 1 ml 3ml 1/4 20 2 0,5 ml 3,5 ml 1/8 10 1 0,5 7,5 ml 1/16 5 0,5
60 2ml (5 g/ml) 2 ml 1/2 2,5 0,25 1 ml 3ml 1/4 1,25 0,125 0,5 ml 3,5 ml 1/8 0,64 0,064 0,5 ml 7,5 ml 1/16 0,32 0,032 2ml (0,32 g/ml) 2 ml 1/2 0,16 0,016 1 ml 3ml 1/4 0,08 0,008 Ghi chú: * PBS: Dung dịch đệm phosphat dùng để pha loãng kháng sinh. Nồng độ cuối cùng pha loãng 1/10 trong môi trường, được tính theo tỷ lệ trộn 2,5 ml dung dịch trung gian + 22,5 ml thạch MH. - Các bước tiến hành Ngày 1: Chuẩn bị chủng và môi trường - Các chủng cần thử MIC và các chủng chuẩn quốc tế được cấy trong canh thang thường hoặc canh thang MH để có được canh khuẩn non, theo tỷ lệ sau: trực khuẩn Gram âm: cấy 0,1 ml; - Chuẩn bị thạch MH: Cân thạch theo công thức (ghi trên hộp), đun sôi cho tan hết thạch, hấp thạch ở 1210C/15’. - Khi thạch đã nguội còn khoảng 40-500C, dùng ống đong khắc vạch đong 22,5 ml thạch cho vào bình nón đã có sẵn 2,5 ml dung dịch kháng sinh theo các nồng độ như trong bảng pha kháng sinh, lắc kỹ và đổ vào hộp lồng, khi thạch đã đông cứng, bảo quản trong tủ lạnh 4 - 80C (có thể bảo quản được trong 2 tuần). Mỗi lần làm MIC cần 2 đĩa môi trường MH không có kháng sinh để làm đĩa chứng (cho thêm 2,5 ml PBS hoặc nước cất + 22,5 ml môi trường thạch MH). Ngày 2: Cấy vi khuẩn trên bề mặt đĩa thạch MH có nồng độ kháng sinh khác nhau - Cấy vi khuẩn thuần khiết từ canh khuẩn non (canh khuẩn đã cấy qua đêm 18h-tương đương 108 vi khuẩn/ml) hoặc lấy một số khuẩn lạc từ môi trường thạch thích hợp hoà vào 3 ml dung dịch đệm PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) để có độ đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 – tương đương 108 vi khuẩn/ml. Tiếp tục pha loãng 1/100 để có nồng độ 106vi khuẩn/ml bằng cách dùng micropipet hút 20 l cho vào 2 ml đệm PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%).
61 - Dùng pipet Pasteur hút khoảng 0,5 ml huyền dịch (106 vi khuẩn/ml) cho vào mỗi giếng của bàn đinh, theo sơ đồ đã ghi số của các chủng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Chủng Chủng chuẩn* chuẩn* * Chủng chuẩn là E.coli ATCC 25922. - Dùng bộ phiên bản 32 chân đinh chấm vào giếng sau đó đặt lên đĩa thạch MH có các nồng độ kháng sinh khác nhau. - Sau khi đặt lên các đĩa thạch, chờ cho đĩa thạch khô (các giọt nước tại các chân đường cấy thấm vào thạch (khoảng 15-20 phút) cất vào tủ ấm 35-370C/18h, lật úp đĩa thạch. Ngày 3: Đọc kết quả - Trước tiên đọc kết quả ở các đĩa thạch chứng không có kháng sinh để kiểm tra sự thuần khiết của chủng vi khuẩn và đảm bảo vi khuẩn không bị chết trước và trong khi tiến hành, nếu các chủng đảm bảo thuần khiết và phát triển tốt mới đọc tiếp. - Đọc kết quả ở các chủng chứng (chủng chuẩn quốc tế), so sánh kết quả MIC của các chủng này với bảng chuẩn (Theo Viện chuẩn thức vi sinh lâm sàng Mỹ-CLSI ), nếu những kết quả này nằm trong giới hạn, sai số cho phép là một bậc nhỏ hơn hoặc một bậc lớn hơn, điều đó nói lên rằng các điều kiện của thí nghiệm đã đạt được chuẩn thức - Đọc kết quả, lần lượt đọc từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất. Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn lạc mọc.
62 - Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu. - Ở nồng độ thấp nhất, không có vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là: nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó ( ). Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó ( ). - Kết quả MIC của các chủng sẽ được xác định theo ba mức độ nhạy cảm, dựa theo bảng chuẩn (CLSI): nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R). 2.4.3.6. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật PCR được Karl Mullis người Mỹ thực hiện vào năm 1985 [104]. Từ đó đến nay kỹ thuật này được sử dụng rất phổ biến và ứng dụng rất nhiều trong các thí nghiệm về sinh học phân tử. - Nguyên tắc của phản ứng PCR. Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA polymerase chịu nhiệt (Taq-polymerase) với nguyên liệu là 4 loại deoxyribonucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Enzym DNA - polymerase xúc tác tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn. Phản ứng đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn. Taq-polymerase là một loại DNA - polymerase (tách chiết từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus), còn mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp với một đầu của mạch khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành đoạn mới. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng để làm khuôn cho các phản ứng tiếp theo. Sau mỗi chu kỳ, số lượng phân tử DNA tăng gấp đôi, vậy sau n chu kỳ số lượng sản phẩm PCR là 2n, đủ số lượng để tách ra, giải mã hoặc tách dòng. - Các bước tiến hành Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mối chu kỳ gồm 3 bước: - Bước 1: Là giai đoạn biến tính (denaturation). Thành phần phản ứng PCR nói chung gồm những thành phần cơ bản sau: Dung dịch đệm PCR, dNTP, mồi xuôi và ngược,
63 Taq-polymerase và DNA khuôn. Trong giai đoạn này DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 940C-950C với thời gian 30-60 giây. - Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (annealing-Ta). Nhiệt độ lúc này phải hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này trong khoảng 40-700C tuỳ thuộc nhiệt độ tối ưu cho bắt cặp của các mồi sử dụng và được kéo dài 30-60 giây. - Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extended). Nhiệt độ được tăng lên 720C để các enzym polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian tuỳ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 phút đến nhiều phút . Sau mỗi chu kỳ các chuỗi DNA mới tạo thành tiếp tục được dùng làm khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của sản phẩm PCR là những đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận 5' của 2 đoạn gen mồi. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,2% chạy cùng với marker để so sánh đối chiếu độ lớn của đoạn DNA cần quan tâm. 30 - 40 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước. Bước 1: Biến tính 940C trong 1 phút Bước 2: Bắt cặp 0 54 C trong 45 giây Mồi xuôi và mồi ngược (Nguồn: Vierrstraete, 1999 Bước 3: Kéo dài 720C trong 2 phút ) Hình 2.2. Hình ảnh các bước phản ứng PCR
64 - Các bước tiến hành PCR với các gen nghiên cứu trong đề tài Tách ADN từ vi khuẩn bằng nhiệt: một khuẩn lạc vi khuẩn được nuôi cấy sau 24 giờ làm đồng nhất với 200 µl nước cất và ủ 1000C trong 5 phút, ly tâm 1200 vòng trong 5 phút, phần dịch trong chứa ADN vi khuẩn được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR. Thành phần PCR: Sử dụng PCR PreMix (Bioneer, Hàn Quốc) bao gồm 1pmol mồi mỗi loại, ADN vi khuẩn 1,5 µl, thêm H2O đến thể tích 20 µl. PCR được tiến hành trên máy điều nhiệt Thermalcycler (Eppendorf, Đức) với các bước sau: biến tính toàn bộ 950C trong 5 phút; phản ứng lặp lại 30 chu kỳ các bước biến tính cục bộ 950C trong 30 giây, bám mồi 500C (đối với gen kháng kháng sinh nhóm Quinolon và CTX-M) hoặc 560C (đối với gen SHV; TEM) trong 45 giây; tổng hợp ở 720C trong 1 phút; hoàn thành phản ứng tổng hợp ở 720C trong 10 phút và giữ mẫu ở 15oC. Kết quả PCR được kiểm tra bằng điện di gel agarose 1,2% với chất nhuộm Ethidium bromide và soi dưới ánh sáng tử ngoại. Thông tin các mồi dùng để xác định sự có mặt của gen kháng kháng sinh nhóm Quinolon và β-lactamase phổ rộng nằm trên plasmid (Bảng 1). ADN chuẩn của hãng Bioneer Hàn Quốc. Chủng chứng dương Klebsiella đã chắc chắn có gen qnr, CTX-M, SHV, TEM . 2.4.3.7. Kỹ thuật Southern Blot [121]: ADN đã khuếch đại bằng PCR được mở vòng xoắn, phân tách thành sợi đơn và cắt bằng enzym giới hạn nuclease S1(enzym cắt đặc hiệu cho ADN plasmid); điện di xung trường (PFGE) để tách các đoạn ADN đã bị cắt; ii) Các đoạn ADN được chuyển sang màng lai nitrocellulose; iii) Các đoạn ADN trên màng được lai với mẫu dò đặc hiệu dựa theo nguyên lý bổ xung ADN; iv) Cố định và phát hiện sự có mặt của phân tử lai ADN- mẫu dò được đánh dấu bằng biotin với mối liên kết chắc chắn với avadin. Avadin hỗn hợp với phosphatase kiềm dưới tác dụng của chất nền sinh mầu tạo ra mầu tím của sản phẩm.
65 Hình 2.3. Kỹ thuật Southern Blot 2.5. Phân tích và xử lý số liệu: - Các số liệu thu thập được sẽ được các nghiên cứu viên kiểm tra để phát hiện những sai sót và làm sạch (xử lý thô). - Số liệu sau khi được xử lý thô được mã hóa và nhập vào máy tính bằng phần mềm Epidata 3.1. Chương trình nhập số liệu được xây dựng riêng cho nghiên cứu này bao gồm tệp CHECK nhằm hạn chế tối đa những sai số. - Số liệu nghiên cứu và kết quả được xử lý bằng phần mềm SPSS. Thống kê phân tích được thực hiện thông qua các test như khi bình phương so sánh các tỷ lệ, Mann-Whitney test đối với so sánh 2 nhóm và Kruska Wallis test đối với so sánh 3 nhóm về các đặc điểm của nhóm NKHHCT và nhóm NKHHCT kết hợp. Mức p<0,05 được sử dụng nhằm xác định ý nghĩa thống kê. 2.6. Đạo đức trong nghiên cứu: - Nghiên cứu đã được thông qua hội đồng y đức bệnh viện và hội đồng xét duyệt đề cương nghiên cứu sinh chấp thuận về mặt y đức. - Các kỹ thuật thực hiện trong nghiên cứu không gây tổn hại đến sức khỏe của đối tượng nghiên cứu. - Nghiên cứu được thực hiện với mong muốn góp phần phát hiện căn nguyên tình trạng kháng kháng sinh ở bệnh nhi NKHHCT tại Bệnh viện nhi Trung ương mà
66 không nhằm bất cứ mục đích hưởng lợi nào gây tổn hại đến đối tượng nghiên cứu, cộng đồng và xã hội.
67 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tỷ lệ và sự phân bố tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập từ bệnh nhi NKHHCT 0 đến 6 tuổi với một số yếu tố liên quan 3.1.1. Sự phân bố mẫu bệnh phẩm nhiễm khuẩn hô hấp theo nhóm bệnh và theo khoa lâm sàng Từ tháng 7/2009 đến tháng 7/2010, có tổng số 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp được nuôi cấy xác định tác nhân gây nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính ở các khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh và khoa Hô hấp đã được đưa vào nghiên cứu. Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp này thu thập từ bệnh nhi 0 đến 6 tuổi được phân tích chung và xem xét ở hai nhóm: NKHHCT và NKHHCT kết hợp. Bảng 3.1: Sự phân bố của các mẫu bệnh phẩm theo Khoa và theo nhóm bệnh Số mẫu bệnh phẩm Số mẫu bệnh phẩm Tổng số TT Khoa thuộc nhóm thuộc nhóm chung NKHHCT NKHHCT kết hợp 1 Hô hấp 936 0 936 2 Sơ sinh 570 223 793 3 Hồi sức cấp cứu 403 570 973 4 Hồi sức ngoại 0 865 865 Tổng 1.909 1.658 3.567 Như vậy, trong 3.567 mẫu bệnh phẩm đã có 1.909 mẫu bệnh phẩm thu thập được ở nhóm NKHHCT và 1.658 mẫu bệnh phẩm thu thập được ở nhóm NKHHCT kết hợp từ bệnh nhi 0 đến 6 tuổi được thử nghiệm và phân tích trong nghiên cứu này. 3.1.2. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính Từ tháng 7/2009 - 7/2010 có 1.181 mẫu bệnh phẩm phân lập được vi khuẩn trong 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp ở bệnh nhi sơ sinh đến 6 tuổi, tại các
68 khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh và khoa Hô hấp bệnh viện Nhi Trung ương, cho thấy tỷ lệ nuôi cấy dương tính với các vi khuẩn gây bệnh là 33,1%. Trong đó, 87 mẫu có 2 loài chiếm 7,4%. Biểu đồ 3.1.Tỷ lệ nuôi cấy dương tính (n=3.567) 3.1.3. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính ở hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp phân bố ở các khoa Với 1909 mẫu bệnh phẩm nhóm NKHHCT và 1658 mẫubệnh phẩm NKHHCT kết hợp đã nuôi cấy tìm căn nguyên vi khuẩn gây bệnh. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính và sự phân bố theo các khoa được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2: Tỷ lệ nuôi cấy dương tính ở hai nhóm bệnh Tỷ lệ nuôi cấy Tỷ lệ nuôi cấy dương tính thuộc dương tính thuộc nhóm NKHHCT NKHHCT kết hợp Khoa p P Mẫu Mẫu n (+) % n (+) % tính tính Hô p1- 936 351 37,5 0 - - hấp(1) 2 0,05 Hồi sức 0 - - 865 218 25,2 ngoại(4) Tổng 1.909 714 37,4 1.658 467 28,1 Qua bảng 3.2. ta thấy, tỷ lệ nuôi cấy dương tính chung là 37,4% ở nhóm NKHHCT và 28,1 % ở nhóm NKHHCT kết hợp. Cao nhất ở khoa sơ sinh (48,8%
69 và 54,7%), sau đó là khoa hô hấp (37,5%) và thấp nhất là khoa HSCC (21,1% và 22,2%), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,001. 3.1.4. Sự phân bố của các loài vi khuẩn phân lập được Trong 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp nuôi cấy đã có 1.181 mẫu bệnh phẩm tìm thấy vi khuẩn và nấm gây bệnh, sự phân bố của các loài vi khuẩn này đã được phân tích như sau: Bảng 3.3. Phân bố các loài vi khuẩn phân lập được (n=1181) Loài VK Số lượng Tỷ lệ % Klebsiella pneumoniae 267 22,61 Acinetobacter. spp 235 19,90 P. aeruginosa 217 18,37 E. coli 95 8,04 Enterobacter spp 41 3,47 H. influenzae 63 5,33 S.aureus 90 7,62 S. pneumoniae 60 5,08 Streptococcus spp. 52 4,40 Candida 76 6,44 Các chủng khác 63 5,33 Nhận xét: Qua bảng ta thấy đứng đầu là Klebsiella pneumoniae (22,6%) sau đó là Acinetobacter spp. (19,9%), P. aeruginosa(18,4%). Các căn nguyên thường gặp ở cộng đồng không cao là S. pneumoniae (5,1%), H. influenzae (5,3%).
70 3.1.5. Sự phân bố của các loài vi khuẩn phân lập được theo nhóm bệnh Sự phân bố của các loài vi khuẩn này theo các nhóm bệnh đã được phân tích như sau: Bảng 3.4. Sự phân bố của các loài vi khuẩn phân lập được ở hai nhóm bệnh Nhóm Nhóm NKHHCT p NKHHCT kết hợp TT Loài vi khuẩn (n=714) (n=467) Tỷ lệ n n Tỷ lệ % % 1 Klebsiella pneumoniae 172 24,1 95 20,3 >0,05 2 Acinetobacter. spp 96 13,4 139 29,8 0,05 4 E. coli 65 9,1 30 6,4 >0,05 5 Enterobacter spp 17 2,4 24 5,1 0,05 8 S. pneumoniae 48 6,7 12 2,6 0,05 10 Candida 56 7,8 20 4,3 0,05 Tỷ lệ phân lập được Klebsiella pneumoniae là cao nhất (24,1%) ở nhóm NKHHCT và Acinetobacter spp.(29,8%) ở nhóm NKHHCT kết hợp, sau đó là P. aeruginosa (17,4%) ở nhóm NKHHCT và Klebsiella pneumonia (20,3%) ở nhóm NKHHCT kết hợp. Các cầu trùng gram dương có tỷ lệ từ 5,0% đến 7,8%.
71 Biểu đồ 3.2. Sự phân bố của các loài vi khuẩn phân lập được ở hai nhóm (n=1.181) Biểu đồ 3.2. cho thấy, tỷ lệ phân lập được các trực khuẩn gram âm là nổi trội ở cả 2 nhóm. Tỷ lệ Klebsiella pneumonia ở nhóm NKHHCT cao hơn nhóm NKHHCT kết hợp. Tỷ lệ P.aeruginosa và Acinetobacter ở NKHHCT kết hợp cao hơn nhóm NKHHCT đặc biệt Acinetobacter là cao hơn hẳn. 3.1.6. Tỷ lệ phần trăm mẫu bệnh phẩm nuôi cấy dương tính với 2 loài vi khuẩn gây bệnh Bằng kỹ thuật cấy đếm xác định căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp đã cho phép tính được tổng số vi khuẩn của mỗi loài trong 1ml bệnh phẩm và nếu số lượng vi khuẩn có ≥ 105 vi khuẩn trong 1 ml bệnh phẩm được xem xét là căn nguyên gây bệnh. Vì vậy, trong nghiên cứu này đã tìm thấy một tỷ lệ
72 không nhỏ các mẫu bệnh phẩm phân lập được hai loại vi khuẩn gây bệnh đều có số lượng vi khuẩn ≥ 105 vi khuẩn. Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính 2 loài vi khuẩn/ 1 bệnh phẩm(n=1.181) Không có sự khác biệt về tỷ lệ nuôi cấy dương tính 2 loài/ 1 bệnh phẩm thu được ở bệnh nhân NKHHCT và NKHHCT kết hợp với p>0,05 3.1.7. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn gram âm và gram dương Biểu đồ 3.4. Phân bố tỷ lệ các vi khuẩn gram âm và gram dương(n=1181) Nghiên cứu cho thấy chủ yếu các căn nguyên vi khuẩn phân lập được là trực khuẩn gram âm chiếm 80,8%. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê, với p< 0,5. 3.1.8. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn gram âm và gram dương trong hai nhóm bệnh Kết quả nghiên cứu phân tích theo hướng phân lập được vi khuẩn Gram dương và âm như sau: