›

Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây dấu dầu lá nhẵn

pdf 222 trang yendo 4590
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây dấu dầu lá nhẵn", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_va_hoat_tinh_sinh_hoc.pdf

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây dấu dầu lá nhẵn

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC TRƯƠNG THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.) LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC HÀ NỘI, 2014
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC TRƯƠNG THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl. LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hoá học hữu cơ Mã số: 62.44.27.01 Hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Phan Văn Kiệm 2. GS. TS. Nguyễn Văn Tuyến HÀ NỘI, 2014
  3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Phan Văn Kiệm và GS.TS. Nguyễn Văn Tuyến. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Trương Thị Thu Hiền i
  4. LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển và Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS. TS. Phan Văn Kiệm và GS. TS. Nguyễn Văn Tuyến - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển và Ban lãnh đạo Viện Hóa học cùng tập thể cán bộ của hai Viện đã quan tâm giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển, đặc biệt là TS. Hoàng Lê Tuấn Anh, TS. Nguyễn Xuân Nhiệm, TS. Phạm Hải Yến, TS. Nguyễn Văn Thanh và CN. Đan Thị Thúy Hằng về sự ủng hộ to lớn, những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Phòng Hợp chất tự nhiên, Đại học Osaka, Nhật Bản đã giúp đỡ tôi trong việc sàng lọc và thử hoạt tính kháng lao. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các đồng nghiệp tại Bộ môn Độc học và phóng xạ quân sự - Học viện Quân Y và Ban Giám đốc Học viện Quân y đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Trương Thị Thu Hiền ii
  5. MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI TETRADIUM 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật chi Tetradium 3 1.1.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetradium 4 1.1.2.1. Các hợp chất alkaloid 7 1.1.2.2. Các hợp chất triterpenoid 10 1.1.2.3. Các hợp chất limonoid 11 1.1.2.4. Các hợp chất flavonoid 13 1.1.2.5. Các hợp chất coumarin 14 1.1.2.6. Các hợp chất benzenoid 15 1.1.2.7. Các hợp chất sterol 16 1.1.2.8. Các hợp chất khác 16 Kết luận 17 1.1.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Tetradium 18 1.1.3.1. Tác dụng kháng ung thư 18 1.1.3.2. Tác dụng với hệ tim mạch 19 1.1.3.3. Tác dụng đối với hệ thần kinh 21 1.1.3.4. Tác dụng kháng viêm, giảm đau 21 1.1.3.5. Các tác dụng khác 22 Kết luận 26 1.2. Giới thiệu về cây dấu dầu lá nhẵn 27 1.2.1. Đặc điểm thực vật 27 1.2.2. Công dụng chữa bệnh 27 1.2.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 28 1.2.4. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 29 Kết luận 29 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Mâu thực vật 30 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 30 iii
  6. 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa hoc 31 2.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 32 CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 39 3.1. Phân lập các hợp chất từ cây dấu dầu lá nhẵn 39 3.1.1. Phân lập các hợp chất từ mẫu lá của cây dấu dầu lá nhẵn 39 3.1.2. Phân lập các hợp chất từ mẫu vỏ thân của cây dấu dầu lá nhẵn 41 3.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ cây dấu dầu lá nhẵn 44 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 4.1. Phân lập các hợp chất từ cây dấu dầu lá nhẵn 50 4.2 Xác định cấu trúc các hợp chất 51 4.2.1. Hợp chất TG1 (chất mới): Tetraglabrifolioside 51 4.2.2. Hợp chất TG2: 6-Acetonyl-N-methyldihydrodecarine 58 4.2.3. Hợp chất TG3: 6-Acetonyldihydrochelerythrine 64 4.2.4. Hợp chất TG4: Decarine 66 4.2.5. Hợp chất TG5: Iwamide 68 4.2.6. Hợp chất TG6: Rutaecarpine 72 4.2.7. Hợp chất TG7: 12α-Hydroxyevodol 74 4.2.8. Hợp chất TG8: Rutaevine 79 4.2.9. Hợp chất TG9: Lupeol 83 4.2.10. Hợp chất TG10: Friedelan-3-one 85 4.2.11. Hợp chất TG11: Phellamurin 90 4.2.12. Hợp chất TG12: Epimedoside C 95 4.2.13. Hợp chất TG13: Astragalin 97 4.2.14. Hợp chất TG14: Nicotiflorin 98 4.2.15. Hợp chất TG15: Trifoline 104 4.2.16. Hợp chất TG16: Quercetin 105 4.2.17. Hợp chất TG17: α-Tocopherol 106 4.2.18. Hợp chất TG18: (2E,4E) N-Isobutyltetradeca-2,4-dienamide 110 4.2.19. Hợp chất TG19: (2E,4E)-N-Isobutyldeca-2,4-dienamide 115 4.2.20. Hợp chất TG20: (2E,4E,8E)-N-Isobutyltetradeca-2,4,8-trienamide 117 4.2.21. Hợp chất TG21: Syringin 119 4.2.22. Hợp chất TG22: Saikolignannisode A 120 4.2.23. Hợp chất TG23: Picraquassioside D 122 iv
  7. 4.2.24. Hợp chất TG24: Stigmatsterol 123 4.2.25. Hợp chất TG25: Daucosterol 125 4.2.26. Hợp chất TG26: 5-Hydroxymethylfurfural 127 Kết luận: 128 4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học 131 4.3.1. Kết quả kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào in vitro 131 4.3.2. Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng lao 132 4.3.3. Kết quả kiểm tra hoạt tính chống oxi hóa 133 4.3.4. Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 134 Kết luận: 135 KẾT LUẬN 137 KIẾN NGHỊ 138 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 139 TÀI LIỆU THAM KHẢO 140 PHỤ LỤC I Phụ lục 1. Phổ khối lượng phân giải cao và phổ NMR của TG3. II Phụ lục 2. Phổ NMR của TG4. V Phụ lục 3. Phổ khối lượng phân giải cao và phổ NMR của TG6. VIII Phụ lục. Phổ NMR của TG9. XII Phụ lục 5. Phổ NMR của TG12. XV Phụ lục 6. Phổ khối lượng và phổ NMR của TG13. XVIII Phụ lục 7. Phổ khối lượng và phổ NMR của TG15. XXII Phụ lục 8. Phổ NMR của TG16. XXVI Phụ lục 9. Phổ khối lượng phân giải cao và phổ NMR của TG19. XXVII Phụ lục 10. Phổ khối lượng phân giải cao và phổ NMR của TG20. XXXI Phụ lục 11. Phổ khối lượng phân giải cao và phổ NMR của TG21. XXXIV Phụ lục 12. Phổ NMR của TG22. XXXVII Phụ lục 13. Phổ NMR của TG23. XLI Phụ lục 14. Phổ khối lượng và phổ NMR của TG24. XLIV Phụ lục 15. Phổ khối lượng phân giải cao và phổ NMR của TG25. XLVI Phụ lục 16. Phổ khối lượng phân giải cao và phổ NMR của TG26. XLIX Phụ lục 17. Kết quả xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. LII v
  8. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy cacbon 13 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy proton 5-HT 5-hydroxytryptamine (hay 5-hydroxytryptamine Serotonin) c.c Column chromatography Sắc kí cột CCR CC chemokine receptor Thụ thể CC chemokine CGRP Calcitonin gene related peptide Đối kháng thụ thể peptid liên hệ đến gen calcitonin COX Cyclooxygenase Enzyme hình thành các chất trung gian sinh học prostanoid DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1,1- diphenyl -2-picrylhydrazyl EC50 Effective concentration at 50% Nồng độ gây ra tác động sinh học cho 50% đối tượng thử nghiệm ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Phổ khối lượng ion hóa phun mù Spectra điện tử Fl Fibril sarcoma of Uteus Ung thư màng tử cung Gal Galactopyranoside GI50 Grow inhibitory at 50% Khả năng ức chế tăng trưởng 50 % Glc Glucopyranoside HeLa Henrietta lacks Ung thư cổ tử cung HepG2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan người HMBC Heteronuclear mutiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Connectivity nhiều liên kết HR-ESI-MS High Resolution Electronspray Phổ khối lượng phân giải cao Ionization Mass Spectrum phun mù điện tử HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HSQC Heteronuclear Single-Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 Coherence liên kết IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm ID50 Inhibitory dose at 50% Liều ức chế tối thiểu 50% iNOS Inducible nitric oxide synthase Một enzyme tạo ra nitric oxide từ amino L-arginine acid KB Human epidemoid carcinoma Ung thư biểu mô người vi
  9. KH Ký hiệu LNCaP Human prostatic carcinoma Ung thư tiền liệt tuyến người LU Human Lung Carcinoma Ung thư phổi người MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu, hay nồng độ kiềm khuẩn tối thiểu NOS Nitric oxide synthases Các enzyme tổng hợp nitric oxide OD Optical density Mật độ quang học Rha Rhamnopyranoside ROS Reactive oxygen species Các gốc tự do ôxy hóa RD Rhabdo sarcoma Ung thư màng tim RP18 Reserve phase C-18 Silica gel pha đảo RP-18 PGE2 Prostaglandin E2 Có tác dụng giãn mạch trực tiếp, giãn cơ trơn TCA Trichloracetic acid Trichloracetic acid TGF-β Transforming growth factor β Yếu tố chuyển dạng tăng trưởng β kiểm soát sự tăng sinh, biệt hóa tế bào TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane TNF-α Tumor necrosis factor α Yếu tố hoại tử khối u α TPH Enzyme tryptophan hydroxylase Enzyme thủy phân tryptophan SC Scavenging capacity Khả năng bẫy các gốc tự do SW480 Human colon adenocarcinoma cell Ung thư tuyến đại tràng ở người line Xyl Xylopyranoside UCP-1 Uncoupling protein-1 Protein tách cặp -1 vii
  10. DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Các hợp chất alkaloid được phân lập từ một số loài của chi Tetradium 7 Bảng 2. Các hợp chất triterpenoid phân lập từ một số loài của chi Tetradium 10 Bảng 3. Các hợp chất limonoid được phân lập từ một số loài của chi Tetradium 12 Bảng 4. Các hợp chất flavonoid được phân lập từ một số loài của chi Tetradium 13 Bảng 5. Các hợp chất coumarin được phân lập từ một số loài của chi Tetradium 14 Bảng 6. Các hợp chất benzenoid được phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn 15 Bảng 7. Các các hợp chất sterol được phân lập từ một số loài của chi Tetradium 16 Bảng 8. Số liệu phổ NMR của TG1 và hợp chất tham khảo 53 Bảng 9. Số liệu phổ NMR của TG2 và hợp chất tham khảo 59 Bảng 10. Số liệu phổ NMR của TG3 và hợp chất tham khảo 66 Bảng 11. Số liệu phổ NMR của TG4 và hợp chất tham khảo 67 Bảng 12. Số liệu phổ NMR của TG5 và hợp chất tham khảo 69 Bảng 13. Số liệu phổ NMR của TG6 và hợp chất tham khảo 73 Bảng 14. Số liệu phổ NMR của TG7 và hợp chất tham khảo 75 Bảng 15. Số liệu phổ NMR của TG8 và hợp chất tham khảo 83 Bảng 16. Số liệu phổ NMR của TG9 và hợp chất tham khảo 84 Bảng 17. Số liệu phổ NMR của TG10 và hợp chất tham khảo 86 Bảng 18. Số liệu phổ NMR của TG11 và hợp chất tham khảo 91 Bảng 19. Số liệu phổ NMR của TG12 và hợp chất tham khảo 96 Bảng 20. Số liệu phổ NMR của TG13 và hợp chất tham khảo 98 Bảng 21. Số liệu phổ NMR của TG14 và hợp chất tham khảo 99 Bảng 22. Số liệu phổ NMR của TG15 và hợp chất tham khảo 105 Bảng 23. Số liệu phổ NMR của TG16 và hợp chất tham khảo 106 Bảng 24. Số liệu phổ NMR của TG17 và hợp chất tham khảo 107 Bảng 25. Số liệu phổ NMR của TG18 và hợp chất tham khảo. 111 Bảng 26. Số liệu phổ NMR của TG19 và hợp chất tham khảo 116 Bảng 27. Số liệu phổ NMR của TG20 và hợp chất tham khảo 118 Bảng 28. Số liệu phổ NMR của TG21 và hợp chất tham khảo 120 viii
  11. Bảng 29. Số liệu phổ NMR của TG22 và hợp chất tham khảo 121 Bảng 30. Số liệu phổ NMR của TG23 và hợp chất tham khảo 123 Bảng 31. Số liệu phổ NMR của TG24 và hợp chất tham khảo 124 Bảng 32. Số liệu phổ NMR của TG25 và hợp chất tham khảo 126 Bảng 33. Số liệu phổ NMR của TG26 và hợp chất tham khảo 127 Bảng 34. Thống kê hợp chất phân lập được từ các bộ phận cây dấu dầu lá nhẵn 130 Bảng 35. Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào in vitro 131 Bảng 36. Hoạt tính kháng lao trên chủng M. bovis và M. smegmatis 133 Bảng 37. Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa 134 ix
  12. DANH MỤC HÌNH Hình 1. Mẫu thực vật và mẫu tiêu bản khô của cây dấu dầu lá nhẵn. 30 Hình 2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu lá cây dấu dầu lá nhẵn. 40 Hình 3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu vỏ cây dấu dầu lá nhẵn 43 Hình 4. Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của hợp chất TG1 51 Hình 5. Phổ HR-ESI-MS của TG1. 51 1 Hình 6. Phổ H-NMR của TG1. 54 1 Hình 7. Phổ H-NMR giãn (a) của TG1. 54 1 Hình 8. Phổ H-NMR giãn (b) của TG1. 55 13 Hình 9. Phổ C-NMR của TG1. 55 Hình 10. Phổ DEPT của TG1. 56 Hình 11. Phổ HSQC của TG1 56 Hình 12. Phổ HMBC của TG1. 57 Hình 13. Sắc kí đồ của các dẫn xuất TMS của D-glucose, L-Glucose và TG1. 57 Hình 14. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG2. 58 Hình 15. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TG2. 60 1 Hình 16. Phổ H-NMR của TG2. 61 1 Hình 17. Phổ H-NMR giãn của TG2. 61 13 Hình 18. Phổ C-NMR của TG2. 62 Hình 19. Phổ DEPT của TG2. 62 Hình 20. Phổ HSQC của TG2 63 Hình 21. Phổ HMBC của TG2. 63 Hình 22. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG3. 64 Hình 23. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG4. 66 Hình 24. Cấu trúc hoá học và các tương tác HMBC chính của TG5. 68 1 Hình 25. Phổ H-NMR của TG5. 69 1 Hình 26. Phổ H-NMR giãn của TG5. 70 13 Hình 27. Phổ C-NMR của TG5. 70 Hình 28. Phổ DEPT của TG5. 71 Hình 29. Phổ HSQC của TG5 71 Hình 30. Phổ HMBC của TG5. 72 x
  13. Hình 31. Cấu trúc hoá học và các tương tác HMBC chính của TG6. 72 Hình 32. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG7. 74 1 Hình 33. Phổ H-NMR của TG7. 76 1 Hình 34. Phổ H-NMR giãn của TG7. 77 13 Hình 35. Phổ C-NMR của TG7. 77 Hình 36. Phổ DEPT của TG7. 78 Hình 37. Phổ HSQC của TG7 78 Hình 38. Phổ HMBC của TG7. 79 Hình 39. Cấu trúc hoá học và các tương tác HMBC chính của TG8. 79 1 Hình 40. Phổ H-NMR của TG8. 80 13 Hình 41. Phổ C-NMR của TG8. 80 Hình 42. Phổ 1H-NMR giãn của TG8. 81 Hình 43. Phổ HSQC của TG8 81 Hình 44. Phổ HMBC của TG8. 82 Hình 45. Cấu trúc hóa học của hợp chất TG9. 83 Hình 46. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG10. 85 1 Hình 47. Phổ H-NMR của TG10. 87 1 Hình 48. Phổ H-NMR giãn của TG10. 87 13 Hình 49. Phổ C-NMR của TG10. 88 Hình 50. Phổ DEPT của TG10. 88 Hình 51. Phổ HSQC của TG10. 89 Hình 52. Phổ HMBC của TG10. 89 Hình 53. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG11. 90 Hình 54. Phổ 1H-NMR của TG11. 92 Hình 55. Phổ 1H-NMR giãn của TG11. 92 13 Hình 56. Phổ C-NMR của TG11. 93 Hình 57. Phổ DEPT của TG11. 93 Hình 58. Phổ HSQC của TG11. 94 Hình 59. Phổ HMBC của TG11. 94 Hình 60. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG12. 95 Hình 61. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG13. 97 Hình 62. Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của TG14. 98 xi
  14. 1 Hình 63. Phổ H-NMR của TG14. 100 1 Hình 64. Phổ giãn H-NMR của TG14 (a). 101 1 Hình 65. Phổ giãn H-NMR của TG14 (b) 101 13 Hình 66. Phổ C-NMR của TG14. 102 Hình 67. Phổ DEPT của TG14. 102 Hình 68. Phổ HSQC của TG14. 103 Hình 69. Phổ HMBC của TG14. 103 Hình 70. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG15. 104 Hình 71. Cấu trúc hóa học của TG16. 105 Hình 72. Cấu trúc hóa học của hợp chất TG17. 106 1 Hình 73. Phổ H-NMR của TG17. 108 Hình 74. Phổ 1H-NMR giãn của TG17. 108 13 Hình 75. Phổ C-NMR của TG17. 109 Hình 76. Phổ DEPT của TG17. 109 Hình 77. Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của TG18. 110 Hình 78. Phổ HR-ESI-MS của TG18. 112 1 Hình 79. Phổ H-NMR của TG18. 112 1 Hình 80. Phổ H-NMR giãn của TG18. 113 13 Hình 81. Phổ C-NMR của TG18. 113 Hình 82. Phổ DEPT của TG18. 114 Hình 83. Phổ HSQC của TG18. 114 Hình 84. Phổ HMBC của TG18. 115 Hình 85. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG19. 115 Hình 86. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG20. 117 Hình 87. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG21. 119 Hình 88. Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của TG22. 120 Hình 89. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG23. 122 Hình 90. Cấu trúc hóa học của hợp chất TG24. 123 Hình 91. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG25. 125 Hình 92. Cấu trúc hóa học của TG26 127 Hình 93. Các hợp chất được phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn. 129 Hình 94. Kết quả thử hoạt tính các hợp chất phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn. 136 xii
  15. MỞ ĐẦU Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Không chỉ các nước phương đông mà các nước phương tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Theo thống kê, ở các nước có nền công nghiệp phát triển, một phần tư số thuốc kê trong các đơn đều có chứa hoạt chất có nguồn gốc từ thảo mộc. Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học tốt đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh. Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp. Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng và phong phú. Theo ước tính, nước ta có khoảng gần 13000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4000 loài được sử dụng làm thuốc. Việc sử dụng nguồn tài nguyên đó để phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ cho con người đã có một quá trình lịch sử hàng nghìn năm và ngày càng trở nên quan trọng. Ngoài sự đa dạng về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị to lớn ở chỗ chúng được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa nhiều loại bệnh khác nhau. Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức độc vị hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc quý giá. Ngoài ra, hàng trăm cây thuốc đã được khoa học y - dược hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng. Cây dấu dầu lá nhẵn (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.) là một cây thuốc thuộc họ Cam quýt (Rutaceae) thường được sử dụng trị một số bệnh như: trị tổn thương do ngã, gãy xương, thấp khớp. Thân và lá cây dùng để trị viêm thận, phù thũng, dùng ngoài chữa chấn thương, ngứa, eczema. Lá cây được dùng nấu nước tắm cho bà đẻ hoặc nấu nước đặc để rửa vết thương, tắm ghẻ lở. Lá cây còn được giã chưng với giấm để đắp chống sưng, tắc tia sữa. Quả và vỏ được dùng sắc uống để lợi tiểu hoặc đại tiểu, chữa kiết lị, táo bón và thấp khớp Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này đã chỉ ra sự có mặt của các lớp chất alkaloid, 1
  16. triterpenoid, benzenoid và coumarin Nhiều hợp chất trong số đó đã thể hiện nhiều hoạt tính tốt như evomeliaefolin, rutaevinexic acid, isolimonexic acid. Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây dấu dầu lá nhẵn (Tetradium glabrifolium), chúng tôi lựa chọn đề tài: ‘‘Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây dấu dầu lá nhẵn Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.”. Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hoá học chủ yếu của cây dấu dầu lá nhẵn nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng và góp phần giải thích được tác dụng chữa bệnh của vị thuốc này. Nội dung luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất từ lá và vỏ thân cây dấu dầu lá nhẵn bằng các phương pháp sắc ký; 2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý và hóa học; 3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính kháng lao, hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính kháng vi sinh vật của các hợp chất phân lập được. 2
  17. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI TETRADIUM 1.1.1. Đặc điểm thực vật chi Tetradium Họ Cam quýt (Rutaceae) hay còn gọi là họ Cửu lý hương là một họ thực vật trong bộ Bồ Hòn (Sapindales) với khoảng 161 chi với hơn 2070 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và ôn đới ấm, đặc biệt là Nam Phi, châu Úc và châu Á [1]. Chi Tetradium là một chi trong họ Cam quýt (Rutaceae), phân bố từ vùng núi Himalaya đến vùng nhiệt đới Đông Nam Á. Trong các tài liệu cũ, các loài của chi Tetradium thường bị xếp vào chi Euodia (nhiều tài liệu viết là Evodia), nhưng bắt đầu từ năm 1981, chi Euodia đã được chia thành 3 chi: Tetradium, Euodia và Melicope [1, 2]. Theo phân loại thực vật học, chi Tetradium bao gồm 12 loài, nhưng trong số này mới chỉ có 8 loài được chấp nhận tên: - Tetradium austrosinense (Handel-Mazzetti) T. G. Hartley, 1981; - Tetradium calcicolum (Chun ex C. C. Huang) T. G. Hartley, 1981; - Tetradium daniellii (Bennett) T. G. Hartley, 1981; - Tetradium fraxinifolium (Hooker) T. G. Hartley, 1981; - Tetradium glabrifolium (Champion ex Bentham) T. G. Hartley, 1981; - Tetradium ruticarpum (A. Jussieu) T. G. Hartley, 1981; - Tetradium sambucinum (Blume) T.G. Hartley, 1981; - Tetradium trichotomum (Loureiro) Fl. Cochinch, 1790. Các loài trong chi Tetradium thường có thân bụi hoặc thân gỗ, lá dài khoảng 14-38 cm hình lông chim hoặc hình elip, không có răng cưa, sáng bóng màu xanh đậm ở trên, nhạt màu và có lông bên dưới. Hoa gồm các bông nhỏ, đơn tính, trong các cụm, màu trắng với bao phấn màu vàng. Cánh hoa màu xanh lá cây, vàng hoặc trắng. Chùm hoa từ 8-16 cm, phân nhánh ở cuối các cành nhỏ. Hoa có mùi thơm và xuất hiện vào giữa đến cuối mùa hè, dễ nhận thấy, rất hấp dẫn với ong. Trái cây màu hồng hoặc gần như màu đen, có mỏ trong cụm lớn và sặc sỡ. Hạt màu đen sáng bóng, quả chín vào cuối mùa hè và tồn tại qua mùa đông [1, 2]. 3
  18. 1.1.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetradium Hiện nay, theo thống kê, trong 8 loài được công nhận tên của chi Tetradium, mới có 5 loài đã được công bố về thành phần hóa học, bao gồm: T. daniellii, T. glabrifolium, T. ruticarpum, T. sambucinum và T. trichotomum. Các nghiên cứu về thành phần hóa học về chi Tetradium cho thấy sự có mặt của nhiều lớp chất, như: alkaloid, triterpenoid, flavonoid, coumarin, benzenoid, amide, tannin, sterol Năm 1988, các nhà khoa học Nhật Bản đã phân lập từ loài Evodia rutaecarpa (tên khác của loài T. ruticarpum) hai mươi hợp chất trong đó có chín hợp chất mới gồm bốn limonoid: 12α-hydroxylimonin (73), 12α-hydroxyevodol (65), 6α-acetoxy-5-epilimonin (70) và 6β-acetoxy-5-epilimonin (71); năm quinolone alkaloid: 1-methyl-2-[(Z)-6′-undecyl]-4(1H)-quinolone (37), 1-methyl-2- [(Z)-6′-pentadecenyI]-4(1H)-quinolone (38), 1-methyl-2-[(Z)-10′-pentadecenyl] -4(1H)- quinolone (40), 1-methyl-2-[(4′Z,7′Z)-4,7-tridecadienyl]-4(1H)-quinolone (41), 1- methyl-2-[(6′Z,9′Z)-6,9-pentadecadienyl]-4(1H)-quinolone (42) và bảy limonoid đã biết là: evodol (66), rutaevine (67), rutaevine acetate(68), graucin A (69), limonin (72), obacunone (78) và jangomolide (79); bốn hợp chất quinolone alkaloid đã biết: 1-methy1-2-undecyl-4(1H)-quinolone (28), dihydroevocarpine (31), 1-methyl-2- pentadecyl-4(1H)-quinolone (33) và evocarpine (39) [3]. Năm 1990, Abdul Quader và đồng nghiệp tại Khoa Dược, Đại học Strathclyde, Vương quốc Anh đã phân lập từ thân cây và vỏ cây T. trichotomum hai alkaloid là: α-allocryptopine (6), dictamnine (17) và ba limonoid là: calodendrolide (56), limonexic acid (64) và limonin (72) [4]. Năm 1991, Miyake và cộng sự tại Viện nghiên cứu Sinh học nông nghiệp Wakayama, Momoyama, Nhật Bản đã phân lập được ba hợp chất limonoid mới từ quả loài T. rutacarpum, gồm: limonin 17β-D-glucopyranoside (74), limonin diosphenol 17-O-β-D-glucopyranoside (75), 6β-hydroxy-5-epilimonin 17-O-β-D- glucopyranoside (76) và ba hợp chất limonoid đã biết là: limonin diosphenol (62), rutaevine (67) và limonin (72) [5]. Năm 2002, nhóm nghiên cứu của GS. Trần Văn Sung và cộng sự tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập được 3 hợp 4
  19. chất alkaloid từ cây Tứ chẻ ba (T. trichotomum) là: rutaecarpine (7), evodiamine (10) và nauclefin (13) [6]. Năm 2003, Stevenson và các đồng nghiệp thuộc Trung tâm Nghiên cứu quốc tế Jealott's Hill, Vương quốc Anh đã phân lập từ phần dịch chiết quả sấy khô của loài T. daniellii một furanocoumarin mới là 5-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7- dienyloxy) psoralen (97) và sáu hợp chất furanocoumarin đã biết là xanthotoxin (94), bergapten (95), isopimpinellin (96), 5-(7-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,5- dienyloxy) psoralen (98), 5-geranyloxypsoralen (99) và 8-geranyloxypsoralen (100). Các hợp chất này đều thể hiện hoạt tính tốt ngăn chặn sự phát triển ấu trùng Spodoptera littoralis và Heliothis virescens [7]. Năm 2006, nhóm nghiên cứu của Komala Ismiarni tại trường Đại học Putra, Malaysia đã nghiên cứu thành phần hóa học lá loài T. sambucinum, đã phân lập được bốn hợp chất, bao gồm: decarine (1), rutaecarpine (7), aurantiamide acetate (15) và umbelliferone (7-hydroxycoumarin) (92) [8]. Năm 2007, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phân lập từ dịch chiết quả của loài T. ruticarpum sáu hợp chất quinolone alkaloid gồm: 1-methyl-2-nonyl-4(1H)- quinolone (27), 1-methyl-2-undecyl-4(1H)-quinolone (29), dihydroevocarpine (31), 1-methyl-2-[(Z)-6′-undecenyl]-4(1H)-quinolone (37), evocarpine (39) và 1-methyl- 2-[(6′Z,9′Z)-6′,9′-pentadecadienyl]-4(1H)-quinolone (42) [9]. Vào năm 2010, Tzu-Ying Wang và đồng nghiệp tại Đại học Y khoa Đài Trung, Đài Loan đã phân lập từ quả của loài T. ruticarpum một quinolone alkaloid mới là: 1-[(6′Z,9′Z)- 6′,9′-pentadecadienyl]-4(1H)-quinolin (42) và mười một hợp chất đã biết gồm sáu hợp chất alkaloid: rutaecarpine (7), evodiamine (10), 14- formyldihydrorutaecarpine (11), skimmianine (20), dihydroevocarpine (31) và evocarpine (39); một hợp chất limoloid là evodol (66); bốn hợp chất sterol là: β- sitosterol (121), stigmasterol (123), 3β-hydroxystigmast-5-en-7-one (124) và 3β- hydroxystigmasta-5,22-dien-7-one (125) [10]. Năm 2012, một nhóm các nhà khoa học thuộc Khoa Thuốc tự nhiên và Mô phỏng sinh học, Khoa Dược, Đại học Bắc Kinh, Trung Quốc đã phân lập từ quả của loài T. ruticarpum được mười bảy hợp chất, trong đó có ba quinolone alkaloid mới 5
  20. là 1-methyl-2-[7′-hydroxy-(E)-9′-tridecenyl]-4(1H)-quinolone (43), 1-methyl-2- [(Z)-4′-nonenyl]-4(1H)-quinolone (34) và 1-methyl-2-[(1′E,5′Z)-1′,5′-undecadienyl] -4(1H)-quinolone (45); một hợp chất mới phân lập từ tự nhiên là 1-methyl-2-[(E)- 1′-undecenyl]-4(1H)-quinolone (46) cùng với mười ba hợp chất quinolone alkaloid đã biết là: 1-methyl-2-nonyl-4(1H)-quinolone (27), 1-methyl-2-decyl-4(1H)- quinolone (28), 1-methyl-2-undecyl-4(1H)-quinolone (29), 1-methyl-2-dodecyl- 4(1H)-quinolone (30), dihydroevocarpine (31), 1-methyl-2-tetradecyl-4(1H)- quinolone (32), 1-methyl-2-pentadecyl-4(1H)-quinolone (33), 1-methyl-2-[(Z)-6′- undecenyl-4(1H)-quinolone (37), 1-methyl-2-[(Z)-6′-pentadecenyl]-4(1H)-quinolone (38), evocarpine (39), 1-methyl-2-[(Z)-10′-pentadecenyl]-4(1H)-quinolone (40), 1- methyl-2-[(4′Z,7′Z)- 4′,7′-tridecadienyl]-4(1H)-quinolone (41), 1-methyl-2- [(6′Z,9′Z)- 6′,9′-pentadecadienyl]-4(1H)-quinolone (42). Tuy nhiên, 43 là một hợp chất không ổn định trong môi trường tự nhiên nên biến đổi thành một hợp chất nhân tạo mới là 1-methyl-2-[7′-cacbonyl-(E)-9′-tridecenyl]-4(1H)-quinolone (44) [11]. Gần đây nhất, năm 2013, các nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu dịch chiết từ quả loài T. ruticarpum được thu thập ở tỉnh Chiết Giang (Trung Quốc), đã phân lập được hai mươi alkaloid trong đó có chín hợp chất mới, gồm năm quinolone alkaloid mới là euocarpine A-E (47-51) và bốn hợp chất mới là: 1- methyl- 2-ethyl-4(1H)-quinolone (23), 1-methyl-2-octyl-4(1H)- quinolone (26), 1- methyl-2-[(Z)-5′-dodecenyl]-4(1H)-quinolone (35), 1-methyl-2-[(Z)-5′-pentadecenyl] -4(1H)-quinolone (36), cùng mười hợp chất đã biết là: 1-methyl-2-pentyl-4-(1H)- quinolone (24), 1-methyl- 2-heptyl-4(1H)-quinolone (25), 1-methyl-2-nonyl-4(1H)- quinolone (27), 1-methyl-2-decyl-4(1H)-quinolone (28), 1-methyl-2-undecyl- 4(1H)-quinolone (29), 1-methyl-2-dodecyl-4-(1H)-quinolone (30), dihydroevocarpine (31), 1-methyl-2-tetradecy-4-(1H)-quinolone (32), 1-methyl-2-pentadecenyl-4(1H)- quinolone (33), evocarpine (39) và 1-methyl-2-[(6′Z, 9′Z)-6′, 9′-pentadecadienyl]- 4(1H)-quinolone (42) [12]. Dựa theo việc phân loại các lớp hợp chất tự nhiên, 135 hợp chất được phân lập từ các loài thuộc chi Tetradium được thống kê theo các lớp chất sau đây: 6
  21. 1.1.2.1. Các hợp chất alkaloid Các công bố nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetradium cho thấy, hầu hết các loài của chi này đều chứa các hợp chất alkaloid. Cho đến hiện tại, tổng cộng có 53 hợp chất alkaloid được phân lập từ chi này (Bảng 1). Bảng 1. Các hợp chất alkaloid được phân lập từ một số loài của chi Tetradium KH Tên chất Loài TLTK T. glabrifolium, 1 Decarine [8, 109] T. sambucinum 2 Norchelerythrine T. glabrifolium [109] 3 Bocconoline T. glabrifolium [109] 4 6-Acetonyl-5,6-dihydrochelerythrine T. glabrifolium [109] 5 Oxychelerythrine T. glabrifolium [109] 6 α-Allocryptopine T. trichotomum [4] T. glabrifolium, T. trichotomum, 7 Rutaecarpine [6, 8, 10, 58, 109] T. sambucinum, T. ruticarpum 8 1-Hydroxyrutaecarpine T. glabrifolium [110] 9 Hortiacine T. glabrifolium [109] T. trichotomum, 10 Evodiamine [5, 10, 58] T. ruticarpum 11 14-Formyldihydrorutaecarpine T. ruticarpum [10] 12 Hydroxyevodiamine (rhetsinine) T. ruticarpum [58, 86] 13 Nauclefin T. trichotomum [6] 14 Dehydroevodiamine T. ruticarpum [58, 86] 15 Aurantiamide acetate T. sambucinum [8] 16 Arnottianamide T.glabrifolium [109, 110] T. glabrifolium, 17 Dictamnine [4, 109] T. trichotomum 18 Robustine T. glabrifolium [109] 19 γ-Fagarine T. glabrifolium [109] T. glabrifolium, 20 Skimmianine [10, 109] T. ruticarpum 21 Methyl-β-carboline-1-carboxylate T. glabrifolium [111] 22 Strychnocarpin T. glabrifolium [111] 7
  22. 23 1-Methyl-2-ethyl-4(1H)-quinolone T. ruticarpum [12] 24 1-Methyl-2-pentyl-4(1H)-quinolone T. ruticarpum [12] 25 1-Methyl-2- heptyl-4(1H)- quinolone T. ruticarpum [12] 26 1-Methyl-2-octyl-4(1H)- quinolone T. ruticarpum [12] 27 1-Methyl-2-nonyl-4(1H)-quinolone T. ruticarpum [9, 11, 12] 28 1-Methyl-2-decyl-4(1H)-quinolone T. ruticarpum [11, 12] 29 1-Methyl-2- undecyl-4(1H)-quinolone T. ruticarpum [3, 9, 11, 12] 30 1-Methyl-2-dodecyl-4(1H)-quinolone T. ruticarpum [11, 12] 31 Dihydroevocarpine T. ruticarpum [3, 9, 10, 11, 12] 32 1-Methyl-2-tetradecyl-4(1H)-quinolone T. ruticarpum [11, 12] 1-Methyl-2-pentadecenyl-4(1H)- 33 T. ruticarpum [3, 11, 12] quinolone 1-Methyl-2-[(Z)-4′-nonenyl]-4(1H)- 34 T. ruticarpum [11] quinolone 1-Methyl- 2-[(Z)-5′-dodecenyl]-4(1H)- 35 T. ruticarpum [12] quinolone 1-Methyl-2-[(Z)-5′-pentadecenyl]- 36 T. ruticarpum [12] 4(1H)-quinolone 1-Methyl-2-[(Z)-6′-undecenyl-4(1H)- 37 T. ruticarpum [3, 9, 11] quinolone 1-Methyl-2-[(Z)-6′-pentadecenyl]- 38 T. ruticarpum [3, 11] 4(1H)-quinolone 1-Methyl-2-[(Z)-8′-tridecenyl]-4(1H)- 39 T. ruticarpum [3, 9, 10, 11, 12] quinolinone (evocarpine) 1-Methyl-2-[(Z)-10′-pentadecenyl]- 40 T. ruticarpum [3, 11] 4(1H)-quinolone 1-Methyl-2-[(4′Z,7′Z)- 4′,7′- 41 T. ruticarpum [3, 11] tridecadienyl]-4(1H)- quinolone 1-Methyl-2-[(6′Z, 9′Z)- 6′,9′- 42 T. ruticarpum [3, 9, 10, 11, 12] pentadecadienyl] -4(1H)-quinolone 1-Methyl-2-[7′-hydroxy-(E)-9′- 43 T. ruticarpum [11] tridecenyl]-4(1H)-quinolone 1-Methyl-2- [7′-cacbonyl -(E)- 9′ - 44 T. ruticarpum [11] tridecenyl ]-4(1H)-quinolone 1-Methyl-2-[(1′E,5′Z)- undecadienyl]- 45 T. ruticarpum [11] 4(1H)-quinolone 1-Methyl-2-[(E)-1′-undecenyl]-4(1H)- 46 T. ruticarpum [11] quinolone 47 Euocarpine A T. ruticarpum [12] 48 Euocarpine B T. ruticarpum [12] 8
  23. 49 Euocarpine C T. ruticarpum [12] 50 Euocarpine D T. ruticarpum [12] 51 Euocarpine E T. ruticarpum [12] T. glabrifolium, 52 4-Methoxy-1-methyl-2-quinolone [9, 109] T. ruticarpum 53 Evomeliaefolin T. glabrifolium [109] O O O O O O O N N R H3CO CH3 R1 R2 N OCH3 H3CO H3CO CH3 R R1 R2 OCH3 1 OH 3 H CH2OH 2 OCH3 6 4 H CH2COCH3 R1 5 = O - R1 O N O N O N N H N N H N N H 2 R N R2 13 R1 R2 R1 R2 7 H H 10 H CH3 8 H OH 11 H CHO 9 OCH3 H 12 OH CH3 O H3CO H3C O N H N O O N H H3CO H N+ N N OCOCH3 OH H3C H O O 14 15 16 R2 1 R N O OCH N N 3 CH3 1 2 R R N N H H 17 H H COOCH3 O 18 H OH 21 22 19 H OCH3 20 OCH3 OCH3 9
  24. R R 1' 10' 11' O 27 1' 40 4' 5' 7' 8' 28 41 6' 9' 10' 29 1' 42 1' N R 30 7' 9' 43 CH 1' 3 31 1' OH 9' 44 7' 32 O R 1' 45 1' 33 5' 6' 4' 5' 1' 23 1' 34 46 1' 24 35 5' 7' 5' 6' 47 1' 25 36 O O 5' 6' 48 7' 1' 26 37 6' 6' 8' 7' 9' 38 1' 6' 7' 49 8' O O 8' 9' 1' 39 50 8' 10' OH OCH3 OCH3 OH O N C9H19 N H3CO N O O H CH3 CH OCH3 51 52 3 53 1.1.2.2. Các hợp chất triterpenoid Theo các nghiên cứu, đã có tám hợp chất triterpenoid được phân lập từ hai loài T. glabrifolium và T. trichotomum của chi Tetradium [4, 109, 111] Bảng 2. Bảng 2. Các hợp chất triterpenoid được phân lập từ một số loài của chi Tetradium KH Tên chất Loài TLTK 54 Squalene T. glabrifolium [111] 55 Atractylenolide III T. glabrifolium [109] 56 Calodendrolide T. trichotomum [4] 57 β-Amyrin acetate T. glabrifolium [111] 58 Lupeol T. glabrifolium [109] 59 Taraxeron T. glabrifolium [111] 60 epi-Taraxerol T. glabrifolium [111] 61 Taraxerol T. glabrifolium [111] 10
  25. O OH O O O H O O 54 55 56 R1 R2 R1 R2 H3CCOO HO 59 =O - 60 H OH 57 58 61 OH H 1.1.2.3. Các hợp chất limonoid Limonoid là các hợp chất tetranortriterpenoid gây ra vị đắng, cay trong hạt trái cây các loài trong họ Cam quýt. Các hợp chất này có các hoạt tính sinh học đặc trưng như: kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, chống ung thư, kháng virus thêm vào đó chúng có tác dụng trừ sâu, diệt và kiểm soát sự tăng trưởng côn trùng. Hiện nay, đã có hàng trăm limonoid được phân lập từ các loài khác nhau, nhưng chủ yếu là các loài trong họ Cam quýt và họ Xoan. Các hợp chất limonoid có khung hoặc được dẫn xuất từ khung 4,4,8-trimethyl-17-furanyl steroid. Tất cả các limonoid được phân lập từ họ Cam quýt đều có một vòng furan gắn với khung chính tại C-17 và các nhóm thế có chứa oxitại C-3, C-4, C-7 và C-16 [13]. Theo các công trình công bố, đã có mười tám hợp chất limonoid được phân lập từ các loài của chi Tetradium [3, 4, 5, 109, 110, 111]: HO O O O O O HO O O R O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O OH OH R 65 OH 62 63 64 66 H 11
  26. Bảng 3. Các hợp chất limonoid được phân lập từ một số loài của chi Tetradium KH Tên chất Loài TLTK 62 Limonin diosphenol T. rutacarpum [5] 63 Limonexic acid T. trichotomum [4] 64 Isolimonexic acid T. glabrifolium [110] 65 12α-Hydroxyevodol T. glabrifolium [3], [109] 66 Evodol T. glabrifolium [3], [109] T. glabrifolium [3], [5], [58], 67 Rutaevine T. rutacarpum [109] 68 Rutaevine acetate T. rutacarpum [3] 69 Graucin A T. glabrifolium [3], [109] 70 6α-Acetoxy-5-epilimonin T. rutacarpum [3] 71 6β-Acetoxy-5-epilimonin T. glabrifolium [3], [109] T.glabrifolium, [3], [4], [5], 72 Limonin T. trichotomum, [109], [110] T. rutacarpum 73 12α-Hydroxylimonin T. rutacarpum [3] 74 Limonin 17-O-β-D- glucopyranoside T. rutacarpum [5] Limonin diosphenol 17-β-D- 75 T. rutacarpum [5] glucopyranoside 6β-Hydroxy-5-epilimonin 17β-D- 76 T. rutacarpum [110] glucopyranoside 77 Rutaevinexic acid (limonoic acid) T. glabrifolium [110] 78 Obacunone T. rutacarpum [3] 79 Jangomolide T. rutacarpum [3] O O O O 1 R1 O R O O O O OGlc O O O O OGlc O O O COOH COOH O O O O O O O O 2 R O O O 2 O R OH 1 2 1 2 R R R R 74 75 α− 67 H OH 70 H OCOCH3 68 H OCOCH3 71 H β−OCOCH3 69 OH OH 72 H H 73 OH H 12
  27. O O O O O O O O OGlc O OH O O O COOH COOH O O O O O O O O O O O OH O O O OH O 79 76 77 78 1.1.2.4. Các hợp chất flavonoid Các nghiên cứu về thành phần hóa học trong chi Tetradium cho thấy, có chín hợp chất flavonoid được phân lập từ hai loài T.glabrifolium và T. rutacarpum: OH OGlc OH OH HO O HO O 2 R HO O OR1 OH O OH O O OH O R1 R2 OH O 81 Xyl H 80 HO OH 82 Gal OH 83 OH OH OR HO O HO O GlcO O R O → OGlc(1 6)Rha OH O OH O O OH O R OH R 84 H HOH2C 87 Glc OH 85 OH 86 88 H Bảng 4. Các hợp chất flavonoid được phân lập từ một số loài của chi Tetradium KH Tên chất Loài TLTK 80 Liquiritin T. glabrifolium [111] 81 Kaempferol-3-O-β-D-xylopyranoside T. glabrifolium [111] 82 Hyperoside (hyperin) T. rutacarpum [58] 83 Quercetin-3-O-α-L-arabinopyranoside T. rutacarpum [58] 84 Nicotiflorin T. glabrifolium [111] 85 Rutin T. glabrifolium [111] 86 Juglanin T. glabrifolium [111] 87 Evodioside B T. glabrifolium [111] 88 Epimedoside C T. glabrifolium [111] 13
  28. 1.1.2.5. Các hợp chất coumarin Coumarin là một lớp chất thiên nhiên có tác dụng dược lý cao, thể hiện nhiều hoạt tính hữu ích, như: kháng nấm, chống khối u, chống đông máu, kháng virut HIV, trị bệnh cao huyết áp, chống loãng xương thường phân lập được trong các loài thuộc họ Đậu (Fabaceae), Hoa tán (Apiaceae), Cam quýt (Rutaceae) Các hợp chất coumarin được tìm thấy trong hầu hết các loài của chi Tetradium. Theo các tài liệu đã thông báo [7, 8, 109, 111] có mười hai hợp chất coumarin đã được phân lập: 1 2 3 R R R R1 89 H Glc H 90 OCH3 Glc H 91 OCH3 H Glc R2O O O 92 H H H R3 93 OCH3 H H R1 1 2 A R R ( ) O 94 H OCH3 OH OH (B) 95 OCH3 H O 96 OCH3 OCH3 O C 97 (A) H O O ( ) O 98 (B) H D R2 ( ) 99 (C) H O 100 H (D) Bảng 5. Các hợp chất coumarin được phân lập từ một số loài của chi Tetradium KH Tên chất Loài TLTK 89 Skimmin T. glabrifolium [111] 90 Isofraxoside T. glabrifolium [111] 91 Fraxin T. glabrifolium [111] Umbelliferone T. glabrifolium; 92 [8, 109, 111] (7-hydroxycoumarin) T. sambucinum 93 Scopoletin T. glabrifolium [111] 94 Xanthotoxin T. daniellii [7] 95 Bergapten T. daniellii [7] 96 Isopimpinellin T. daniellii [7] 5-(6-Hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7- [7] 97 T. daniellii dienyloxy) psoralen 5-(7-Hydroxy-3,7-dimethylocta-2,5- [7] 98 T. daniellii dienyloxy)psoralen 99 5-Geranyloxypsoralen T. daniellii [7] 100 8-Geranyloxypsoralen T. daniellii [7] 14
  29. 1.1.2.6. Các hợp chất benzenoid Theo thống kê từ các tài liệu đã công bố, có hai mươi hợp chất benzenoid trong chi Tetradium đều phân lập từ loài T.glabrifolium [109, 111]: Bảng 6. Các hợp chất benzenoid được phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn KH Hợp chất TLTK KH Hợp chất TLTK 101 p-Hydroxybenzaldehyde [109, 111 Methylglallate [111] 111] 102 p-Hydroxybenzoic acid [109, 112 Methyl-p- [109] 111] hydroxycinnamate 103 Protocatechuic acid [111] 113 trans-4'-Hydroxy-3'- [109] methoxycinnamaldehyde 104 Methylparaben [109] 114 Evofolin C [109] 105 Methylsyringat [109] 115 Evofolin A [109] 106 Syringaldehyde [109] 116 Evofolin B [109] 107 Vanillin [109] 117 ω-Hydroxypropioguaiacone [109] 108 3,4,5-Trimethoxybenzyl [109] 118 2'-Hydroxy-4'- [109] alcohol methoxyacetophenone 109 Methylvanillate [109] 119 β-Glucogallin [111] 110 Gallic acid [111] 120 Methylchlorogenate [111] 2 OR O O CH2OH CH R1 R3 3 (A) OCH3 (C) (F) CH O 3 O OH OH (E) OCH3 (B) H (D) OH CH3 R4 1 2 3 4 1 2 3 4 R R R R R R R R 101 H H H CHO 109 OCH3 H H COOCH3 102 H H H COOH 110 OH H OH COOH 103 OH H H COOH 111 OH H OH COOCH3 104 H H H COOCH3 112 H H H (A) 105 OCH3 H OCH3 COOCH3 113 OCH3 H H (B) 106 OCH3 OCH3 OCH3 CHO 114 H (C) H (D) 107 H H OCH3 CHO 115 OCH3 H H (E) 108 OCH3 CH3 OCH3 CH2OH 116 OCH3 H H (F) 15
  30. OH HO OCH3 OCH3 OH HO OH OH OH GlcO HO HO OH COOCH3 O O O O H3C O OH 117 118 119 120 1.1.2.7. Các hợp chất sterol Có năm hợp chất sterol được phân lập được từ chi Tetradium [10, 109] gồm: RO HO HO O HO O R 121 H 123 124 125 122 Glc Bảng 7. Các các hợp chất sterol được phân lập từ một số loài của chi Tetradium KH Tên chất Loài TLTK T. glabrifolium, 121 β-Sitosterol [10, 109] T. ruticarpum 122 Sitosteryl glucoside T. glabrifolium [109] 123 Stigmasterol T. ruticarpum [10] 124 3β-Hydroxystigmast-5-en-7-one T. ruticarpum [10] 125 3β-Hydroxystigmasta-5,22- dien-7-one T. ruticarpum [10] 1.1.2.8. Các hợp chất khác Ngoài ra, theo hai công trình của Wu và cộng sự (ĐH Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan) từ loài T. glabrifolium còn phân lập được năm hợp chất amide: hortiamide (126), cis-N-p-coumaroyltyramin (127), trans-N-p-coumaroyltyramin (128), cis-N-feruloyltyramin (129), trans-N-feruloyltyramin (130) [109]; hai hợp chất tanin: corilagen (131), ellagic acid (132) [111]; một hợp chất đường: myo inositol (133) [111]; một hợp chất lignan: (-)-matairesinol (134) [109] và một hợp chất nucleosid: adenosine (135) [111]: 16
  31. OH OH O HO O O NH O NH NH 127 126 OH 128 HO OCH3 HO HO O H O OCH3 N N H H H H H OH 129 HO 130 O HO OH O O O O OH HO O OH HO O HO OH O OH O OH HO O HO O 131 132 NH HO OH 2 H3CO N OH O N OH HO HO N N O OH O OH OH OH OCH3 OH OH OH 133 134 135 Kết luận: Theo các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetradium trong các loài đã được công bố về thành phần hóa học (T. daniellii, T. glabrifolium, T. ruticarpum, T. sambucinum và T. trichotomum) đã phân lập được 135 hợp chất, cho thấy sự có mặt rất đa dạng của các lớp chất trong tự nhiên (12 lớp chất), gồm: 53 alkaloid, 8 triterpenoid, 18 limonoid, 9 flavonoid, 12 coumarin, 20 benzenoid, 5 amide, 2 tannin, 5 sterol, 1 đường, 1 hợp chất lignan và 1 hợp chất nucleoside. 17
  32. 1.1.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Tetradium 1.1.3.1. Tác dụng kháng ung thư Trong các lớp chất phân lập được từ chi Tetradium, các hợp chất limonoid có rất nhiều hoạt tính thú vị. Gần đây, nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh được rằng các limonoid thể hiện hoạt tính với các mức độ khác nhau trên nhiều loại tế bào ung thư như: ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư vòm họng, ung thư da, ung thư vú và ung thư dạ dày [14, 15, 16, 17, 18]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng, các hợp chất limonoid làm tăng hoạt độ enzyme glutathione S-transferace và quinine reductase là các enzyme có tác dụng chuyển hóa và loại trừ tác hại của nhiều tác nhân hóa học độc hại, xúc tác cho quá trình liên kết giữa glutathione với nhiều hợp chất có khả năng gây ung thư có ái lực điện tử trong tự nhiên. Hàm lượng các enzyme này tăng tương quan với khả năng ức chế ung thư gây ra do các tác nhân hóa học [19, 20]. Trong các công trình nghiên cứu về bệnh ung thư vòm họng trên chuột hamster, Miler và các cộng sự cũng đã chứng minh được rằng limonin (72) hoạt động như một tác nhân bẫy, bắt và ngăn chặn các hợp chất benzo[a]pyrene và chất gây đột biến khác trước khi chúng gắn với các tế bào trong cơ thể động vật thí nghiệm. Limonin (72) ức chế mạnh 7, 12-dimethylbenzo[a]anfliracene là một tác nhân gây ra ung thư vòm họng và có tác dụng ngăn sự hình thành ung thư mặt trước của dạ dày và ung thư đại tràng trên chuột thực nghiệm. Các nghiên cứu chỉ ra rằng hệ vòng trong nhân và nhóm furan có trong limonoid là yếu tố quan trọng trong hoạt tính chống ung thư [21, 22, 23]. Nhóm nghiên cứu của Jie Yang chứng minh evodiamine (10) có tác dụng ức chế in vitro bộ chuyển đổi tín hiệu và kích hoạt phiên mã 3 (STAT3) và khối u của các tế bào ung thư biểu mô gan người HepG2 bằng cách ngăn chặn phương thức tín hiệu STAT3 liên quan đến sự tồn tại, phát triển, hình thành và ức chế miễn dịch của các tế bào ung thư biểu mô tế bào gan trên mô hình động vật thực nghiệm [24]. Hợp chất rutaecarpine (7) là một trong những alkaloid góp phần thể hiện nhiều hoạt tính quan trọng của các loài trong chi Tetradium. Các nghiên cứu của nhóm nghiên cứu Yang và cộng sự đã xác định khả năng ức chế sự phát triển các 18
  33. dòng tế bào ung thư (GI50) của hợp chất 7. Cụ thể dòng tế bào ruột kết HT-29 (31,6 μM), ung thư phổi A-549/ATCC (14,5 μM), ung thư buồng trứng OVCAR-4 (18,9 μM) ung thư vú HS-578T (22,6 μM) [25, 26]. Decarine (1) được phân lập từ loài T. sambucinum thể hiện hoạt tính độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa (IC50 là 14,6 µg/mL) [8]. Năm 2012, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được mười bảy hợp chất quinolone alkaloid từ loài T. ruticarpum là: 27-34, 37-43, 45, 46. Các hợp chất này được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên bốn dòng tế bào ung thư người là ung thư bạch cầu HL-60, ung thư dạ dày N-87, ung thư phổi H-460 và ung thư gan HepG2. Kết quả cho thấy các hợp chất này đều có hoạt tính gây độc tế bào trên cả bốn dòng tế bào thử nghiệm ở mức độ độ trung bình (IC50 từ 14 µM và 22 µM) [11]. 1.1.3.2. Tác dụng với hệ tim mạch Một số alkaloid phân lập được từ chi Tetradium có nhiều tác dụng tích cực đến hệ tim mạch. Trong một nghiên cứu của Chiou và cộng sự về tác động giãn cơ trơn động mạch chủ của ba quinazoline alkaloid phân lập từ loài T. ruticarpum đã chứng minh là rutaecarpine (7), evodiamine (10) và dehydroevodiamine (14) có tác dụng giãn mạch trên động mạch chủ của chuột thực nghiệm [27]. Nhiều nghiên cứu trên chuột thực nghiệm đã chứng minh rutaecarpine (7) có tác dụng giãn mạch [28, 29], cải thiện chức năng của hệ tim mạch và ức chế của nhịp xoang tim nhanh khi sử dụng kháng nguyên gây sốc phản vệ chấn thương tim [30], ức chế sự co mạch gây ra do sốc phản vệ [31], gây giãn mạch các đoạn động mạch mạc treo nuôi cấy của chuột thí nghiệm khi sử dụng tác nhân phenylephrine gây co mạch [32]. Tác dụng hạ huyết áp của rutaecarpine trên chuột cao huyết áp theo cơ chế kích thích sự tổng hợp và phóng thích CGRP-là một chất bảo vệ nội sinh trong bệnh tăng huyết áp [33, 34]. Tác động bảo vệ hệ tim mạch do thiếu máu cục bộ gây ra chấn thương cơ tim của rutaecarpine là do sự kích hoạt thụ thể vanilloid để phóng thích CGRP trên chuột thực nghiệm có mức huyết áp bình thường [35] hoặc huyết áp cao tự phát [36]. Rutaecarpine cũng có tác dụng hạ huyết 19
  34. áp và giảm phì đại động mạch mạc treo trong chứng tăng huyết áp thận trên chuột thí nghiệm [37, 51]. Tác dụng chống tạo huyết khối của rutaecarpine do ức chế tập kết tiểu cầu gây ra các nút tắc mạch [38, 39]. Tác dụng chống huyết khối của rutaecarpine thể hiện tương đương với thuốc chống huyết khối aspirin. Khi tiêm tĩnh mạch, rutaecarpine kéo dài đáng kể thời gian trễ sự hình thành nút tắc tiểu cầu trong các tĩnh mạch nhỏ mạc treo. Thời gian trễ kéo dài gấp khoảng 1,5 lần so với nhóm đối chứng và gấp gần hai lần so với thuốc aspirin [40, 41]. Trên mô hình động vật thực nghiệm, rutaecarpine có hiệu quả trong việc giảm tỷ lệ tử vong do tắc mạch cấp tính ở phổi do huyết khối gây ra. Những kết quả này cho thấy rutaecarpine (7) có tác dụng chống tập kết tiểu cầu và có thể là một tác nhân trị liệu tiềm năng cho huyết khối động mạch [40, 41]. Rang và cộng sự đã nghiên cứu và kết luận về cơ chế chống sốc phản vệ tim và chống thiếu máu cục bộ cơ tim ở chuột lang của hợp chất evodiamine (10) là do kích thích sự phóng thích CGRP [42]. Evodiamine (10) cũng được nhóm nghiên cứu của Chious chứng minh là có tác dụng giãn cơ không phụ thuộc nội mạc và đã được thử nghiệm như một tác nhân có tiềm năng để điều trị rối loạn chức năng cương cứng ở động vật thực nghiệm [43]. Trong nghiên cứu tiếp theo, nhóm nghiên cứu của Chiou cũng đã chứng minh tác dụng giãn mạch của dehydroevodiamine (14) là do tác động vào nội mạc và phong bế thụ cảm thể 1α-adrenoceptor, kích hoạt kênh K+ và phong bế kênh Ca2+ [44]. Trong y học cổ truyền, loài T. ruticarpum đã được sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc hàng trăm năm nay để điều trị bệnh cao huyết áp [45]. Từ một phân đoạn dịch chiết của methanol từ quả của loài T. ruticarpum các nhà khoa học Hàn Quốc đã phân lập được các quinolone alkaloid là: 39, 41 và 42 là các tác nhân có tác dụng chẹn các thụ thể angiotensin II, vì vậy các quinolone alkaloid này là những thành phần chính của dịch chiết có tác dụng điều chỉnh huyết áp [46]. 20
  35. 1.1.3.3. Tác dụng đối với hệ thần kinh Trong các nghiên cứu nhằm mục đích phát triển các loại thuốc chống thiếu máu não mới từ các sản phẩm tự nhiên, Yamahara và cộng sự đã được chứng minh dịch chiết từ quả của loài T. ruticarpum có tác dụng tốt trong mô hình thiếu oximáu não do kali cyanua gây ra ở chuột thực nghiệm. Phân tích sâu hơn các thành phần hoạt tính đã chỉ ra rằng rutaecarpine (7) và evodiamine (10) là hai hợp chất chính có tác động này [47, 48]. Trong một nghiên cứu sàng lọc về cây thuốc, Kim và các cộng sự (Hàn Quốc) tìm ra T. ruticarpum có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh và và ngăn ngừa các mảnh đầu cacbon của β-amyloid là tiền chất protein gây độc thần kinh nên có thể hữu ích trong việc điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh và bệnh Alzheimer [49]. Năm 1996, Park và cộng sự tại khoa Dược, Đại học Seoul, Hàn Quốc đã phát hiện khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase và tác dụng cải thiện trí nhớ của dehydroevodiamine (14) từ loài T. rutaecarpa. Tác dụng của dehydroevodiamine được chứng minh mạnh hơn tacrine là loại thuốc điều trị bệnh Alzheimer được chấp thuận bởi FDA [50]. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh, dehydroevodiamine (14) còn có tác dụng bảo vệ thần kinh và chống mất trí nhớ do có tác động đến sự phóng thích và hấp thu glutamate trên các tế bào não do đó có vai trò quan trọng trong trí nhớ và học tập [51, 52, 53]. Sáu hợp chất quinolone alkaloid, 27, 29, 31, 37, 39 và 42 được phân lập từ loài T. ruticarpum đã thể hiện hoạt tính ức chế enzyme monoamine oxidase B là một flavoenzyme có tác dụng trong việc điều trị bệnh Alzheimer và bệnh Parkinson với các giá trị IC50 lần lượt là 9,2 μM, 55,2 μM, 33,2 μM, 67,1 μM và 15,2 μM [9]. 1.1.3.4. Tác dụng kháng viêm, giảm đau Viêm là một phản ứng của cơ thể nhằm bảo vệ cơ thể sống khỏi các tác nhân gây hại cho cơ thể như: hóa học, vật lý, sinh vật, các yếu tố độc hại của môi trường, thiếu máu cục bộ hoặc một tương tác của các kháng nguyên - kháng thể [54]. Năm 2009, Liu và nhóm nghiên cứu thuộc trường Dược, Trường đại họcY, Đại học Quốc gia Đài Loan đã chứng minh được tác dụng và cơ chế kháng viêm của hai hợp chất rutaecarpine (7) và evodiamine (10) phân lập từ loài T. ruticarpum 21
  36. là do ức chế quá trình tổng hợp PGE2. Thêm vào đó, cơ chế kháng viên của evodiamine còn do ức chế cả enzyme COX-2, iNOS và yếu tố NF- κB [55, 56]. Hợp chất evodiamine (10) làm giảm nồng độ cơ bản và nồng độ phóng thích angiotensin II của aldosterone trong tế bào glomerulosa thượng thận và giảm hoạt độ của enzyme 11β -hydroxylase [57]. Hai hợp chất chính là rutaecarpine (7) và evodiamine (10) có tác dụng kích thích phóng thích CGRP [58]. Evodiamine (10) cũng có tác dụng ức chế sự đau của thần kinh cảm giác nội tạng gây ra bởi acetic acid [59] và ức chế kênh thụ thể chuyển tiếp vanilloid loại 1 lớn hơn khoảng 3-19 lần so với capsaicin trên chuột thực nghiệm [60] và có tác dụng tương đương với capsaicin trên phế quản và tâm nhĩ cô lập của chuột lang [61]. Rutaecarpine (7) bảo vệ và chống viêm loét niêm mạc dạ dày gây ra bởi acetylsalicylic acid và stress [62] và bảo vệ niêm mạc dạ dày chống lại tổn thương do uống rượu [63] đều có liên quan đến sự kích thích phóng thích CGRP nội sinh thông qua hoạt hóa thụ thể vanilloid loại 1. Nhiều nghiên cứu khác cũng đã chứng minh được rằng rutaecarpine (7) [64], evodiamine (10) [65] và limonin (72) [64] có tác dụng kháng viêm giảm đau trên mô hình động vật thực nghiệm. Thang thuốc nổi tiếng có tên Wuzhuyu (Trung Quốc) bao gồm quả của loài T. rutacarpum, gừng, nhân sâm và táo được sử dụng để điều trị chứng đau nửa đầu. Tác dụng chữa chứng đau nửa đầu của đơn thuốc đông y này là do kích thích tryptophan hydroxylase 2, một enzyme kiểm soát tốc độ sinh tổng hợp 5-HT trong não và xúc tác cho quá trình tổng hợp và giải phóng 5-HT trong não [66]. Aurantiamide acetate (15) có tác dụng giảm đau của chuột thực nghiệm trên mô hình đĩa nóng làm tăng thời gian trong quá trình phản ứng kích thích nhiệt ở chuột. Hợp chất này cũng ức chế các cytokine gây viêm, TNF-α và Interleukin-2 nên có tác dụng giảm đau khi tiêm dưới da ở mô hình chuột bị viêm khớp chân [67]. 1.1.3.5. Các tác dụng khác + Tác dụng dưỡng da Năm 2012, Jérôme Grousson và cộng sự đã tìm ra dịch chiết từ quả của loài T. ruticarpum có tác dụng thúc đẩy quá trình tuần hoàn vi mạch máu làm cho tăng 22
  37. độ sáng của da. Nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết từ trái cây. T. ruticarpum làm giãn mạch máu do kích thích vi tuần hoàn ở da bằng cách điều chỉnh nồng độ phóng thích nitric oxide ngoại bào trên da của các tình nguyện viên [68]. Dịch chiết của loài T. ruticarpum có tác dụng chống tia cực tím B trên da [69]. Hỗn hợp gồm rutaecarpine (7), evodiamine (10) và dehydroevodiamine (14) đã được chứng minh có tác dụng ngăn tia cực tím gây ra sự phóng thích PGE2 từ các tế bào sừng và ban đỏ trên da người [70]. Rutaecarpine (7) ức chế tia cực tím A gây ra các loại phản ứng oxi hóa và ngăn chặn UVA trên tế bào sừng HaCaT của người [71]. Rutaecarpine và evodiamine cũng có tác dụng điều trị viêm da dị ứng và viêm mũi do ức chế globulin miễn dịch E trên chuột thí nghiệm [72]. + Tác dụng điều nhiệt cơ thể Trong số các hợp chất alkaloid chính được phân lập từ quả của loài T. ruticarpum, hợp chất evodiamine (10) ngăn chặn tác dụng hạ nhiệt độ cơ thể chuột thực nghiệm do hợp chất gây sốt ngoại sinh chlorpromazine gây ra [73]. Khi tiêm dehydroevodiamine (14) hoặc evodiamine (10) vào màng bụng chuột thí nghiệm, các hợp chất này đã làm giảm nhiệt độ cơ thể chuột. Thêm vào đó, cả hai hợp chất 10 và 14 có tác dụng giảm sốt khi tiêm ở vùng dưới đồi của chuột thực nghiệm, gây sốt bởi chlorpromazine [74]. + Tác dụng chống béo phì Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tác dụng chống béo phì của evodiamine (10) và rutaecarpine (7). Evodiamine có các tác dụng chống tạo mỡ [75, 76, 77]. Shi và cộng sự đã tìm ra cơ chế tác dụng là do giảm hoạt độ của neuropeptide Y và tăng mức độ lưu hành của leptin [78, 79], tương tự như capsaicin do tác động đến UCP-1 là một protein trong ty thể của các mô mỡ nâu, có tác dụng đốt cháy năng lượng (tức là đốt mỡ trắng), dẫn đến giảm trọng lượng hay giảm lượng mỡ trong cơ thể [80, 81]. + Tác dụng chống bệnh tiểu đường Bak và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng tiểu đường của evodiamine (10); evodiamine phối hợp với thuốc rosiglitazone; một loại thuốc trị bệnh tiểu đường nhưng tác dụng phụ như tăng nguy cơ nhồi máu cơ tim, tạo mỡ trong cơ thể, 23
  38. tăng cân và nhiễm độc gan. Khi sử dụng phối hợp, evodiamine giảm các tác dụng phụ của rosiglitazone mà không làm ảnh hưởng tới tác dụng chính của thuốc. Tuy nhiên, hợp chất 10 cũng có tác dụng giảm lượng đường và nồng độ insulin huyết tương và có tác dụng cải thiện sức đề kháng insulin tương đương với thuốc rosiglitazone [82]. Hydroxyevodiamine (12) được phân lập từ T. ruticarpum có khả năng ức chế hoạt tính enzyme aldose reductase [83]. Hợp chất skimmin (89) cũng được chứng minh giảm đáng kể hàm lượng ure máu, làm tăng bài tiết albumin niệu và creatinine huyết thanh trên chuột. Điều trị bằng skimmin (89) có thể cải thiện đáng kể chức năng thận và ngăn chặn sự lắng đọng IgG cũng như sự phát triển của tổn thương thận trên chuột thực nghiệm viêm cầu thận màng [84, 85]. Umbelliferone (92) và glibenclamid làm giảm hàm lượng insulin và đường huyết trên chuột thực nghiệm mắc bệnh tiểu đường. Ngoài ra, umbelliferone (92) có tác dụng bảo vệ thành phần màng tế bào acid béo của gan và thận và có tác dụng hỗ trợ chống oxi hóa và chống tăng lipid huyết [86]. + Tác dụng kháng vi sinh vật Trong nghiên cứu sàng lọc 300 mẫu chiết xuất từ thảo dược, Zheng và cộng sự đã phát hiện dịch chiết của loài T. ruticarpum được xếp loại thứ tám trên mười mẫu thể hiện hiệu quả tác dụng ức chế kháng nguyên bề mặt viêm gan B [87]. Ngoài ra, các hợp chất quinolone alkaloid 10, 29, 31, 33, 41 và 42 phân lập từ loài T. ruticarpum được phát hiện có khả năng ức chế quá trình hô hấp và tiêu diệt vi khuẩn Helicobacter pylori gây bệnh dạ dày [88, 89, 90]. Cũng từ dịch chiết của loài này, Thuille và cộng sự tìm thấy khả năng diệt tụ cầu khuẩn gram dương, Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans [91]. Năm hợp chất quinolone alkaloid: 29, 37, 39, 41, 42 từ loài T. ruticarpum có hoạt tính kháng lao, trên cả ba chủng lao thử nghiệm là: Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium smegmatis và Mycobacterium phlei. Hợp chất evocarpine (39) có hoạt tính mạnh nhất với giá trị MIC là 2 µg/mL trên cả ba chủng lao. Trên chủng lao M. fortuitum, hoạt tính của evocarpine mạnh gấp tám lần so với ethambutol và 24
  39. tương đương với isoniazid. Trên chủng lao M. smegmatis, hợp chất 39 có hoạt tính lớn gấp hai lần so với isoniazid, nhưng tác dụng kém ethambutol hai lần [92, 93]. + Tác dụng đối với hệ tiêu hóa Dịch chiết của T. ruticarpum có tác dụng ức chế sự co thắt đường ruột và điều trị bệnh tiêu chảy gây ra do dầu thầu dầu trên chuột thực nghiệm [94] và bảo vệ các tổn thương trong dạ dày chuột do ethanol gây ra [95, 96]. Evodiamine (10) ức chế quá trình co bóp thắt trong hệ tiêu hóa ở chuột thực nghiệm theo cơ chế liên quan đến sự phóng thích cholecystokinin và kích hoạt thụ thể cholecystokinin 1 [97]. Tác dụng chống nôn của dịch chiết ethanol của thang thuốc Wuzhuyu là do ức chế 5-HT và thụ thể histamin [98]. Khi điều trị bằng skimmianine (20) đã làm giảm số cơn đau trên chuộc thực nghiệm bị gây đau quặn bằng acetic acid so với nhóm đối chứng. Ngoài ra, skimmianine (20) là tác nhân ức chế sự vận chuyển thức ăn trong hệ tiêu hóa [99]. + Chống dị ứng Umbelliferone (92) được phát hiện đã làm giảm đáng kể bạch cầu ái toan trong dịch rửa phế quản và làm giảm lượng chất nhầy tiết ra từ chuột thực nghiệm bị viêm phổi [100]. + Hoạt tính kháng HIV Alkaloid, decarine (1) đã thể hiện hoạt tính kháng HIV trên các tế bào H9 (IC50: 22,6 µg/mL, EC50 <0,1 µg/mL). Nghiên cứu về mối liện giữa cấu trúc-hoạt tính đã chỉ ra nhóm thế 8-OH của decarine có vai trò quan trọng trong việc xuất hiện hoạt tính kháng HIV. Ngoài ra một số hợp chất khác như skimmianine (20) và isopimpinellin (59) cũng có hoạt tính này với giá trị EC50 lần lượt là 7,41 và 0,67 µg/mL [101]. + Tác dụng chống say rượu Dịch chiết từ quả của loài T. ruticarpum có tác dụng giảm nồng độ cồn trong máu do tác dụng đến các enzyme alcohol dehydrogenase (ADH), aldehyde dehydrogenase (ALDH), Cu–Zn superoxide dismutase (Cu–Zn SOD), glutathione peroxidase type 5 (GPX5) và catalase (CAT). Tác dụng chống say rượu của T. 25
  40. ruticarpum có tác dụng tương tự thuốc chống say khác đã được thương mại trên thị trường [102]. + Tác dụng co tử cung King và cộng sự đã thử nghiệm và chứng minh được hai alkaloid phân lập từ dịch chiết của quả của loài T. ruticarpum là: rutaecarpine (7) và dehydroevodiamine (14) có tác dụng gây co tử cung in vitro trên tử cung chuột cô lập. Sự có mặt của rutaecarpine (7) trong quả của T. ruticarpum là thành phần quan trọng trong các đơn thuốc y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị rối loạn sinh sản nữ [103, 104]. + Tác dụng chống côn trùng Một số limonoid và các dẫn xuất của limonin như limonin (72) và limonin diosphenol (62) có tác dụng kiểm soát côn trùng bọ cánh cứng Colorado (Leptinotarsa decemlineata) trên khoai tây và ấu trùng Spodoptera frugiperda [105]. Ngoài tác dụng kiểm soát côn trùng gây hại, các limonoid cũng được sử dụng trong kiểm soát ấu trùng của muỗi rất hiệu quả, điển hình như hợp chất calodendrolide (56) [106]. Trong bảy furanocoumarin từ trái cây sấy khô của loài T.daniellii có bốn hợp chất là: 94, 95, 96 và 99 thể hiện hoạt tính diệt hai loài ấu trùng bướm đêm Spodoptera littoralis và Heliothis virescens [7]. Kết luận: Các hợp chất phân lập được từ chi Tetradium đã thể hiện nhiều hoạt tính đa dạng và hữu ích như: hoạt tính kháng ung thư (phổi, đại tràng, vòm họng và da và các tế bào ung thư vú và ung thư dạ dày ), tác dụng đối với hệ tim mạch, hệ thần kinh, tác dụng kháng viêm giảm đau, dưỡng da, trị bệnh tiểu đường, kháng HIV, giảm béo và tác dụng điều nhiệt Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thể hiện các hoạt tính và tác dụng này trong các loài của chi Tetradium phần lớn đều thuộc lớp chất alkaloid như: decarine (1), rutaecarpine (7), evodiamine (10), dehydro- evodiamine (15) và một số hợp chất quinolone alkaloid ; hoặc lớp chất limonoid như: limonin (68), skimmin (84), umbelliferone (87) 26
  41. 1.2. GIỚI THIỆU VỀ CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN 1.2.1. Đặc điểm thực vật Tên khoa học: Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.). Tên đồng nghĩa: Ampacus meliaefolia (Hance ex Walp.) Kuntze; Boymia glabrifolia Champion ex Bentham; Evodia ailanthifolia Pierre; Evodia fargesii Dode; Evodia glabrifolia (Champ. ex Benth.) C. C. Huang; Evodia glauca Miq.; Evodia meliaefolia (Hance ex Walp.) Benth.; Evodia poilanei Guillaumin; Evodia yunnanensis C. C. Huang; Euodia taiwanensis T. Yamaz.; Megabotrya meliaefolia Hance ex Walp.; Tetradium glabrifolium var. glaucum (Miq.) T.; Tên Việt Nam: Dấu dầu lá nhẵn Chi: Tetradium Họ: Cam quýt (Rutaceae) Đặc điểm mô tả: Là cây đại mộc, có thể cao đến 20 mét, vỏ ít nứt, cành non có lông. Cành lá dài 14-38 cm có từ 5-19 lá phụ. Lá bản rộng, hình trứng hoặc hình lưỡi mác, đáy bất đối xứng, bìa nguyên, không lông, gân phụ, kích thước lá 1,7-6 × 4-15cm, cuống phụ 3-5mm; cuống có lông. Hoa nở thành chùm, kích thước từ 9-19cm. Mỗi bông hoa có bốn hoặc 5 cánh, dày khoảng 0,5 mm. Cánh hoa mầu xanh lá cây, vàng hoặc trắng, khi khô chuyển sang mầu trắng đục đến mầu nâu. Quả có ba nang, chứa lớp thịt xốp bao bên ngoài một lớp vỏ mỏng khi chín có mầu đen bóng, trong quả mỗi nang có 1 hạt tròn, mầu đen, kích thước từ 2,5 – 4 mm. Hoa nở từ tháng 6 đến tháng 9. Quả xuất hiện từ tháng 9 đến tháng 12 [107]. Phân bố: Vùng Đông Á (Nhật Bản, Trung Quốc, Đông bắc Ấn Độ, Việt Nam, Philippin, Inđônêxia, Malaysia, Myanma và Thái Lan, Lào, Campuchia) [107]. 1.2.2. Công dụng chữa bệnh Trong y học cổ truyền, cây dấu dầu lá nhẵn được sử dụng nhiều làm thuốc trị tổn thương do ngã, gãy xương, thấp khớp. Thân và lá cây dùng để trị viêm thận, phù thũng, dùng ngoài chữa chấn thương, ngứa, eczema. Lá cây còn được dùng nấu nước tắm cho bà đẻ hoặc nấu nước đặc để rửa vết thương, tắm ghẻ lở và giã chưng với giấm hay làm nóng đắp sưng vú. Quả và vỏ được dùng sắc uống để lợi tiểu hoặc đại tiểu tiện, chữa kiết lị, táo bón và thấp khớp [108]. 27
  42. Ở Trung Quốc, lá cây dấu dầu lá nhẵn còn được dùng để chữa trị các bệnh lở loét tứ chi mãn tính và bệnh đau dạ dày [109]. 1.2.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Nghiên cứu hóa học đầu tiên về cây dấu dầu lá nhẵn được công bố năm 1987 do nhóm nghiên cứu của Kwok tại khoa Dược trường đại học Strathclyde, Scotland. Công trình đã công bố cấu trúc sáu hợp chất từ thân, vỏ và rễ cây dấu dầu lá nhẵn, đó là các hợp chất: 1-hydroxyrutaecarpine (8), arnottianamide (16), isolimonexic acid (64), rutaevine (67), limonin (72) và rutaevinexic acid (77) [110]. Năm 1995, nhóm của Wu (ĐH Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan) đã nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây dấu dầu lá nhẵn và phân lập được 29 hợp chất, bao gồm: ba alkaloid, rutaecarpine (7), methyl-β-carboline-1-carboxylate (21), strychnocarpine (22); năm triterpenoid, squalene (54), β-amyrin acetate (57), taraxerone (59), epi- taraxerol (60) và taraxerol (61); năm flavonoid, liquiritin (80), kaempferol-3-O-β- D-xylopyranoside (81), nicotitlorin (84), rutin (85) và juglanin (86); năm coumarin, skimmin (89), isofraxoside (90), fraxin (91), umbelliferone (92) và scopoletin (93); bảy benzenoid là: p-hydroxy benzaldehyde (101), p-hydroxybenzoic acid (102), protocatechuic acid (103), gallic acid (110), methylgallate (111), β-glucogallin (114) và methylchlorogenate (120); hai tannin, corilagen (131) và ellagic acid (132); một saccaride, myo-inositol (133) và một nucleoside, adenoside (135) [111]. Cũng trong năm 1995, nhóm của Wu đã tiếp tục công bố cấu trúc của bốn sáu hợp chất được phân lập từ lõi thân cây dấu dầu lá nhẵn, trong đó có 3 hợp chất mới là evomeliaefolin (53), evofolin A (115), evofolin B (116) và 43 hợp chất đã biết gồm: decarine (1), norchelerythrine (2), bocconoline (3), 6-acetoneyl-5,6- dihydrochelerythrine (4), oxychelerythrine (5), rutaecarpine (7), hortiacine (9), arnottianamide (16), dictamnine (17), robustine (18), γ-fagarine (19), skimmianine (20), 4-methoxy-1-methyl-2-quinolone (52), atractylenolide III (55), lupeol (58), 12α- hydroxyevodol (65), evodol (66), rutaevine (67), graucin A (69), 6β-acetoxy-5- epilimonin (71), limonin (72), umbelliferone (92), p-hydroxy-benzaldehyde (101), p- hydroxybenzoic acid (102), methylparaben (104), methylsyringate (105), 28
  43. syringaldehyde (106), vanillin (107), 3,4,5-trimethoxybenzylalcohol (108), methylvanillate (109), methyl-p-hydroxycinnamate (112), trans-4'-hydroxy-3'- methoxycinnamaldehyde (113), evofolin C (114), ω-hydroxypropioguaiacone (117), 2'-hydroxy-4'-methoxyacetophenone (118), β-sitosterol (121), sitosterylglucoside (122), hortiamide (126), cis-N-p-coumaroyltyramine (127), trans-N- coumaroyltyramine (128), cis-N-feruloyltyramine (129) trans-N-feruloyltyramine (130) và (-)-matariesinol (134) [109]. 1.2.4. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Trong tài liệu cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Đỗ Huy Bích và các cộng sự cây dấu dầu lá nhẵn ở Việt Nam được sử dụng như một vị thuốc nam có rất nhiều công dụng chữa bệnh [108]. Kết luận: Mặc dù cây dấu dầu lá nhẵn đã được sử dụng trong y học cổ truyền, nhưng hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về loài này. Việc nghiên cứu thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học sẽ góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học cũng như các kinh nghiệm sử dụng cây thuốc này trong dân gian và đặc thù loài tại Việt Nam để định hướng cho những nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. 29
  44. CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. MẪU THỰC VẬT Mẫu vỏ thân và mẫu lá của cây dấu dầu lá nhẵn được thu hái vào tháng 6 năm 2011 tại Tây Thiên, Tam Đảo, Vĩnh Phúc. Tên khoa học được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định. Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu lá cây dấu dầu lá nhẵn Mẫu tiêu bản thực vật khô Hình 1. Mẫu thực vật và mẫu tiêu bản khô của cây dấu dầu lá nhẵn. 2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch sulforic acid 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu. 30
  45. 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (105875, Merck), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch sulforic acid 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp. 2.2.3. Sắc ký cột (CC) Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường với kích thước hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh); pha đảo sử dụng loại YMC có cỡ hạt là 30-50 µm (Fujisilica Chemical Ltd.); nhựa trao đổi ion sử dụng loại Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.). 2.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC Để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sử dụng kết hợp xác định các thông số vật lý bằng các phương pháp phổ hiện đại [112, 113] đồng thời kết hợp phân tích, tra cứu tài liệu tham khảo. Các thiết bị và phương pháp sử dụng gồm: 2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3.2. Độ quay cực ([α]D) Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3.3. Phổ khối lượng (MS) Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS được đo trên máy Agilent 1200 TRAP, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy FT-ICR-Mass spectrophotometer tại Viện Hóa học. 31
  46. 2.3.4. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) Phổ NMR đo trên máy Bruckker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội là TMS), tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm: • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC. Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi DMSO-d6, CD3OD, CDCl3. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo nguyên tắc dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử. 2.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC 2.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro Các hợp chất phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn được thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên 6 dòng tến bào ung thư, được thử nghiệm tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguyên liệu • Nguyên liệu: Các dòng tế bào: KB (Human epidemoid carcinoma - ung thư biểu mô), Fl (Fibril sarcoma of uteus - Ung thư màng tử cung), RD (Rhabdo sarcoma -Ung thư màng tim), LU (Human Lung carcinoma - Ung thư phổi ở người), SW480 (Human colon adenocarcinoma cell line - Ung thư tuyến đại tràng ở người), LNCaP (Human prostatic carcinoma -ung thư tiền liệt tuyến người). Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) có bổ sung L-glutamine, sodium piruvat, sodium bicacbonat; fetal bovine serum; Hóa chất khác: DMSO, trichloroacetic acid, phosphate buffered saline, sulforhodamine B, acetic acid, tris base, trypsin. Chất đối chứng dương tính: Ellipticine. 0 Thiết bị: Tủ ấm CO2, tủ lạnh sâu - 84 C, tủ lạnh thường, máy li tâm, máy đọc Elisa; Box Laminar PII, bình nitơ lỏng, cân phân tích, máy đo pH, buồng đếm tế 32
  47. bào, kính hiển vi soi ngược, bình nuôi cấy tế bào, các typ dùng 1 lần (phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu tip cho micropipet ) Phương pháp Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro • Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) cùng với 2 mM L- glutamine, 1,0 mM sodium pyruvate và fetal bovine serum 10%. • Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ 1:3 và nuôi trong tủ ấm CO2 ở o điều kiện 37 C, 5% CO2. Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) Nguyên lý của phương pháp Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991) [114] nhằm xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B. Giá trị OD tỉ lệ thuận với lượng sulforhodamine B gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau: Chất thử được pha trong DMSO 10%, sau đó đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có dải nồng độ 0,8; 4; 20 và 100 µg/mL. Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm. Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp trong 180 µl môi trường và để phát triển trong vòng từ 3-5 ngày. Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180µL) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng trichloracetic acid. Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng trichloracetic acid trong 30 phút, được nhuộm bằng sulforhodamine B trong 1 33
  48. giờ ở 37 oC. Đổ bỏ sulforhodamine B và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, sử dụng 10 mM tris base để hòa tan lượng sulforhodamine B đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA (Bio- Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm sulforhodamine B qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau: [OD (chất thử) – OD (ngày 0)] × 100 % sống sót = OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0) % ức chế = 100% - % sống sót Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 0,08, 0,4, 2, 10 µg/mL. DMSO 10% được sử dụng như đối chứng âm. 2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng lao Hoạt tính kháng lao được thử nghiệm tại Phòng Hợp chất tự nhiên, Đại học Osaka, Nhật bản. Các hợp chất được phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn được thử hoạt tính kháng lao trên chủng vi khuẩn Mycobacterium bovis (BCG) và Mycobacterium smegmatis bằng phương pháp MABA (microplate alamar blue assay: phép thử vi lượng sử dụng thuốc nhuộm xanh Alamar) [115]. Nguyên tắc của phương pháp: Dựa vào quá trình phát triển của vi khuẩn Lao làm diễn ra quá trình oxi hóa khử làm thuốc thử Alamar blue phát huỳnh quang. Đo ở bước sóng kích thích 530 nm và bước sóng phát xạ 590 nm. Đọc kết quả sau 7 ngày. Giá trị MIC của chất thử hoạt tính được xác định là nồng độ thấp nhất không gây phát huỳnh quang tương Phương pháp tiến hành: Chủng vi khuẩn lao được phát triển trong môi trường Middlebrook 7H9 đã được bổ xung thêm 0,2% glycerol (v/v), 0,05% tween-80 và dịch nuôi 10% (v/v) 34
  49. (gồm: oleic acid, albumin, dextrose, catalase). Môi trường nuôi cấy này được ly tâm với tốc độ 3150 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC được rửa lại 2 lần, hòa lại trong đệm phosphat saline. Dịch tế bào được lọc qua màng lọc, kích thước 8 µm, sau đó được lưu giữ ở -80oC. Mẫu thử được hòa tan trong DMSO ở nồng độ 10 mg/mL, sau đó pha loãng thành dãy các nồng độ dùng cho thí nghiệm từ 2 -128 µM. Mẫu thử được pha loãng 2 lần trong môi trường Middlebrook 7H12, sau đó đưa 100 µl mẫu vào các giếng trong đĩa 96 giếng sau đó thêm 100 µl dịch có chứa chủng vi khuẩn lao. Đĩa được ủ trong 7 ngày ở 370C với áp suất thường. Ngày thứ 7 thêm 12,5 µl tween-80 20% và 20 µl thuốc thử Alamar blue vào mỗi giếng. Ủ tiếp ở 370C trong 16-24 giờ. Mức độ huỳnh quang của mỗi giếng được đọc ở bước sóng kích thích 530 nm và bước sóng phát xạ 590 nm. Giá trị MIC được xác định là nồng độ thấp nhất không gây phát huỳnh quang tương quan đến 90% so với giếng điều khiển không có vi sinh vật. 2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa Hoạt tính chống oxi hóa được thử nghiệm tại: Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp diệt gốc tự do DPPH. Nguyên tắc của phương pháp: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm [116]. Phương pháp tiến hành: Phương pháp sàng lọc sơ bộ khả năng bẫy gốc tự do trên phiến 96 giếng. Tiến hành như sau: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: Tạo dung dịch có các gốc tự do: DPPH được pha 300 µM trong ethanol. 35
  50. Mẫu đối chứng dương tính 5 mM acscorbic acid Tiến hành thí nghiệm: Trộn mẫu và DPPH trên phiến 96 giếng. Dãy thí nghiệm: 10 µl mẫu +190 µl DPPH trong ethanol. Dãy đối chứng âm tính: 10 µl DMSO 10% +190 µl DPPH trong ethanol. Dãy mẫu trắng (Blank): 10 µl mẫu +190 µl ethanol. Dãy đối chứng dương tính: 10 µl mẫu +190 µl DPPH trong ethanol. Phiến được bọc kín để tránh ánh sáng và ủ trong tủ ấm 37oC trong 2 giờ. Đọc kết quả trên máy Elisa bước sóng 515 nm * Tính kết quả - Tính giá trị khả năng bẫy các gốc tự do - SC%: Giá trị trung bình của SC% được đưa vào chương trình Microsoft Office Excel để xử lý số liệu tìm ra % trung bình độ lệch chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức: OD thí nghiệm - OD mẫu trắng SC% = [100 - × 100] ± σ OD chứng âm tính Độ lệch tiêu chuẩn σ tính theo công thức của Ducan như sau: 2 Σ (xi - x ) σ = n - 1 Giá trị hoạt động SC% >50% mẫu được coi là có biểu hiện hoạt tính sẽ được chọn ra để tìm giá trị IC50. Tìm giá trị ức chế EC50 Pha mẫu theo 5 thang nồng độ, giá trị IC50 được đưa vào chương trình Table Curve, thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử tính ra nồng độ của chất thử nghiệm mà ở đó 50% các gốc tự do được tạo bởi DPPH được trung hoà bởi chất thử theo công thức: 1 =a + b.ln X Y Trong đó: Y: Nồng độ chất thử; X: Giá trị SC (%). 36
  51. 2.4.4. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập được từ cây dấu dầu lá nhẵn, được tiến hành theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck [117] trên các phiến vi lượng 96 giếng, tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. * Nguyên liệu: Mẫu thử được chuẩn bị theo một quy trình được xây dựng thống nhất tại Viện Công nghệ sinh học. Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm: Vi khuẩn Gr (+): Staphylococcus aureus; Bacillus subtillis; Lactobacillus fermentum. Vi khuẩn Gr (-):Salmonella enterica; Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa. Nấm mốc: Aspergillus niger; Fusarium oxysporum. Nấm men: Candida albicans; Saccharomyces cerevisiae. Kháng sinh kiểm định: Ampicilin đối với vi khuẩn Gr (+); tetracylin đối với vi khuẩn Gr (-); nystatin đối với nấm sợi và nấm men. Cách pha kháng sinh: Kháng sinh pha trong DMSO với nồng độ: ampixilin: 50mM, tetracylin: 10mM, nystatin: 0,04mM Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth đối với nấm men và nấm mốc; Trypcase Soya Broth đối với vi khuẩn. Môi trường thí nghiệm: Eugon broth đối với vi khuẩn và Myco phil đối với nấm. Phương pháp tiến hành: - Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được tiến hành trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) [117], đang được áp dụng tại trường đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. 37
  52. Bước1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính Chuẩn bị vi sinh vật: Nấm được duy trì trong môi trường dinh dưỡng đã nêu ở phần nguyên liệu và phương pháp. Các chủng kiểm định được hoạt hoá trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể đặc biệt (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm). Sau đó được pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland. Chuẩn bị mẫu thử: - Hoà tan các chiết phẩm trong dung dịch DMSO bằng máy Vortex với nồng độ 4-10 mg/ml. - Từ dung dịch gốc nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng, mỗi giếng 10 µl mẫu. - Nhỏ vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn 190 µl vi sinh vật đã hoạt hoá. Đối chứng dương: Kháng sinh + vi sinh vật kiểm định. Đối chứng âm: chỉ có vi sinh vật kiểm định. - Để trong tủ ấm 37oC/24 giờ đối với vi khuẩn và 300C/48 giờ đối với nấm. - Đọc kết quả: Mẫu dương tính khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt, không có vi sinh vật phát triển, giống như hình ảnh ở các giếng chứng âm tính. Mẫu dương tính ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử bước 2 để tính giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các hợp chất có hoạt tính: Các bước tiến hành như bước 1: các mẫu dương tính ở bước 1 được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5-10) thang nồng độ để tính giá trị ức chế tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn. 38
  53. CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN 3.1.1. Phân lập các hợp chất từ mẫu lá của cây dấu dầu lá nhẵn Mẫu lá cây dấu dầu lá nhẵn được phơi khô, nghiền thành bột (3,5 kg), sau đó chiết trong methanol (3×5 lít) bằng thiết bị chiết siêu âm (50oC, 3 h). Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi ở áp suất giảm thu được 210,0 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được hòa tan vào 3 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane và ethyl acetate (mỗi loại 3× 3 lít). Các dịch chiết n- hexane, ethyl acetate được cất thu hồi dung môi thu được các cặn dịch tương ứng n- hexan (L-H, 62,0 g) và (L-E, 78,0 g) và lớp nước (L-N, 70,0 g). Cặn chiết ethyl acetate (78,0 g) được hòa tan với một lượng tối thiểu ethyl acetat sau đó tẩm với 90,0 g silica gel. Tiến hành phân tách bằng cột nhồi silica gel pha thường, sau đó rửa giải bằng chloroform/methanol (25/1 → 1/1) thu được sáu phân đoạn chính L-E1 (15,0 g), L-E2 (11,0 g), L-E3 (5,0 g), L-E4 (4,5 g), L-E5 (5,0 g), L-E6 (7,0 g). L-E3 (5,0 g) được phân tách bằng bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp chloroform/acetone/ nước (1/3/0,1), thu được ba phân đoạn L- E3A (0,8 g), L-E3B (1,2 g) và L-E3C (0,9 g). L-E3B tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường sử dụng hệ dung môi chloroform/methanol (3/1), thu được hợp chất TG14 (20 mg). L-E4 (4,5 g) được phân tách bằng bằng cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp chloroform/acetone/nước (1/3/0,1), thu được ba phân đoạn L-E4A (1,0 g), L-E4B (1,1 g), L-E4C (0,8 g). L-E4B được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường sử dụng hệ dung môi rửa giải chloroform/methanol (3/1), thu được hợp chất TG22 (7 mg). L-E5 phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải chloroform/ethyl acetate (3/1), thu được hợp chất TG8 (10 mg). 39
  54. Hình 2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu lá cây dấu dầu lá nhẵn. 40
  55. Lớp nước (L-N, 70,0 g) cho qua cột sắc ký trao đổi ion với chất hấp phụ là Diaion HP-20 với hệ dung môi tăng dần nồng độ methanol trong nước (0, 25, 50, 75 và 100 %) thu được năm phân đoạn L-N1 (8,0 g), L-N2 (8,2 g), L-N3 (10,0 g), L- N4 (15,0 g) và L-N5 (7,0g). L-N3 được phân tách bởi sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải gradien bằng hệ dung môi chloroform/methanol (20/1 → 1/1) thu được năm phân đoạn L- N3A (2,3 g), L-N3B (2,1 g), L-N3C (2,0 g), L-N3D (1,9 g) và L-N3E (2,0 g). Tiếp tục phân tách L-N3C (2,0 g) bằng sắc ký cột silica gel pha thường và hệ dung môi chloroform/methanol (3/1), thu được ba phân đoạn L-N3C1 (0,8 g), L-N3C2 (0,8 g) và L-N3C3 (0,8 g). Ba phân đoạn này lần lượt chạy sắc ký cột silica gel pha đảo bằng hệ dung môi methanol/ nước (1/1), thu được các hợp chất TG1 (10 mg), TG21 (20 mg) và TG23 (20 mg). L-N4 (15,0 g) được hòa tan trong một lượng tối thiểu dung môi methanol sau đó tẩm với 30,0 g silica gel, cô quay dưới áp suất thấp thu được bột mẫu. Bột này được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi chloroform/methanol (20/1 → 1/1) thu được năm phân đoạn L-N4A (2,0 g), L-N4B (3,2 g), L-N4C (2,0 g), L-N4D (2,5 g), L-N4E (3,0 g). L-N4C được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi chloroform/methanol (3/1) thu được các hợp chất TG13 (30 mg), TG15 (10 mg). Các hợp chất TG11 (8 mg) và TG12 (60 mg) được tinh chế từ L-N4D (2,5 g) bằng cách sử dụng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải chloroform/methanol/nước (4/1/0,1). Hợp chất TG16 (20 mg) được tinh chế từ L-N5 (7,0 g) bằng cột sắc ký silica gel pha thường, sử dụng hệ dung môi chloroform/methanol (45/1). 3.1.2. Phân lập các hợp chất từ mẫu vỏ thân của cây dấu dầu lá nhẵn Vỏ cây dấu dầu lá nhẵn được phơi khô, nghiền nhỏ thu được 2,4 kg bột. Bột này được ngâm chiết trong methanol (3 lít× 3 lần) và sử dụng thiết bị chiết siêu âm (50oC, 3 h). Các phần dịch chiết được gom lại lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi thu được 287,0 g cặn chiết methanol. Cặn chiết được hòa tan vào 3 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane, ethyl acetate (3 ×3 lít). Các dịch 41
  56. chiết n-hexane, ethyl acetate được cất thu hồi dung môi thu được các cặn dịch tương ứng n-hexane (V-H, 91,0 g), ethyl acetate (V-E, 132,0 g) và lớp nước (V-N). Cặn chiết ethyl acetate (52,0 g) được hòa tan với một lượng tối thiểu ethyl acetate sau đó được tẩm vào 200,0 g silica gel. Tiến hành phân tách bằng cột silica gel pha thường và rửa giải với gradient hệ dung môi n-hexane/acetone (từ 50/1 → 1/1) thu được 4 phân đoạn chính là V-E1 (33,0 g), V-E2 (8,2 g), V-E 3 (8,0 g), V-E 4 (37,0 g). V-E1 (33,0 g) được hòa tan với một lượng tối thiểu ethyl acetate sau đó tẩm vào 70,0 g silica gel, cất thu hồi dung môi cho đến khi thu được hỗn hợp bột khô tơi. Tiến hành phân tách bằng cột silica gel pha thường sau đó rửa giải với gradient hệ dung môi n-hexane/acetone ( 8/1 → 10/1) thu được 4 phân đoạn chính là V-E1A (15,0 g), V-E1B (3,0 g), V-E1C (2,1 g), V-E1D (18,0 g). V-E1A được phân tách trên cột nhồi silicagel pha thường với hệ dung môi n- hexane/ethyl acetate (1/1) thu được ba phân đoạn V-E1A1 (2,0 g), V-E1A2 (3,7 g), V-E1A3 (2,0 g). V-E1A2 tiếp tục được phân tách trên cột silicagel pha đảo (YMC RP 18) với hệ dung môi acetone/nước (5/1) thu được hợp chất TG17 (10 mg). V- E1A3 được phân tách trên cột nhồi silicagel pha đảo với hệ dung môi acetone/nước (3/1) thu được hợp chất TG9 (9 mg). V-E1D được phân tách trên cột silicagel pha thường với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate (6/1) thu được bốn phân đoạn V- E1D1 (1,0 g), V-E1D2 (4,6 g), V-E1D3 (1,8 g), V-E1D4 (2,0 g). Sau đó, từ V- E1D2 tiếp tục được phân tách trên cột nhồi silicagel pha đảo với hệ dung môi methanol/acetone/nước (3/1/1) thu được hợp chất TG18 (11 mg), TG19 (13 mg), TG20 (10 mg). V-E1D3 được phân tách trên cột nhồi silicagel pha đảo với hệ dung môi acetone/methanol/nước (1/8/2), thu được hợp chất TG3 (9 mg), TG6 (11 mg). V-E2 (8,2 g) được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là n-hexane/acetone/ethyl acetate (30/1/1) thu được hợp chất TG10 (13 mg) và TG24 (8 mg). 42
  57. Hình 3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu vỏ cây dấu dầu lá nhẵn. 43
  58. V-E4 được phân tách trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải chloroform/methanol (30/1) thu được bốn phân đoạn V-E4A (11,0 g), V-E4B (6,3 g), V-E4C (2,8 g), và V-E4D (3,2 g). Từ V-E4A tiếp tục phân tách trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi n-hexane/acetone (4/1) thu được ba phân đoạn V- E4A1 (2,0 g), V-E4A2 (3,6 g), V-E4A3 (1,6 g). V-E4A2 được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là n-hexane/ethyl acetate (2/1) thu được hợp chất TG2 (11 mg) và TG4 (8 mg). V-E4B được phân tách trên cột nhồi silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexane/ethyl acetate (2/1) thu được bốn phân đoạn V-E4B1 (2,5 g), V-E4B2 (2,6 g), V-E4B3 (2,4 g) và V-E4B4 (2,0 g). V-E4B1 được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là chloroform/acetone (15/1) thu được hợp chất TG25 (10 mg). Lớp nước (V-N) được cho chạy qua cột sắc ký trao đổi ion với chất hấp phụ là diaion HP-20 và hệ dung môi rửa giải tăng dần nồng độ methanol trong nước (0, 25, 50, 75 và 100%) thu được bốn phân đoạn V-N1, V-N2 (21 g), V-N3 (12 g), V- N4 (15 g) V-N5 (8 g). V-N2 phân tách trên cột silicagel pha thường với hệ dung môi chloroform/methanol (15/1) thu được hợp chất TG26 (7 mg). Phân đoạn V-N4 (31 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane/acetone (2/1) thu được hai hợp chất TG5 (15 mg) và TG7 (7 mg). 3.2. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ LIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN 3.2.1. Hợp chất TG1 (hợp chất mới): Tetraglabrifolioside Chất bột màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 192-194oC. Độ quay cực: [ ] = +32,1 (c = 0,3, MeOH). 25 – HR-ESI-MS: m/z훼 379,1609 ([M–H] ). Tính toán lý thuyết cho công thức C16H27O10: 379,1604. CTPT: C16H28O10; KLPT M = 380. 1 13 Số liệu phổ H- NMR và C-NMR (CD3OD): xem bảng 8. 3.2.2. Hợp chất TG2: 6-Acetonyl-N-methyldihydrodecarine Chất bột vô định hình, màu nâu. 44
  59. Nhiệt độ nóng chảy: 187-189oC. Độ quay cực: [ ] = -9,3 (c = 0,02, CHCl3). 25 + HR-ESI-MS: m/z훼 392,1493 ([M+H] ). Tính toán lý thuyết cho công thức C23H22NO5: 392,1498. CTPT: C23H21NO5; KLPT M = 391. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 9. 3.2.3. Hợp chất TG3: 6-Acetonyldihydrochelerythrine Chất bột vô định hình, màu nâu. Nhiệt độ nóng chảy: 192-195oC. Độ quay cực: [ ] = -128,2 (c = 0,02, CHCl3). 25 + HR-ESI-MS: m/z훼 406,1654 ([M+H] ). Tính toán lý thuyết cho công thức C24H24NO5: 406,1654. CTPT: C24H23NO5; KLPT M = 405. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem bảng 10. 3.2.4. Hợp chất TG4: Decarine Chất ở dạng tinh thể hình kim, màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy: 243-244oC. CTPT: C19H13NO4; KLPT M = 319. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 11. 3.2.5. Hợp chất TG5: Iwamide Chất bột vô định hình, màu nâu. Nhiệt độ nóng chảy: 271-273oC. CTPT: C20H17NO6; KLPT M = 367. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 12. 3.2.6. Hợp chất TG6: Rutaecarpine Chất bột dạng vô định hình, màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy: 260-261oC. HR-ESI-MS: 288,1107 ([M+H]+). Tính toán lý thuyết cho công thức C18H14N3O (288,1131). CTPT: C18H13N3O; KLPT M = 287. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem bảng 13. 45
  60. 3.2.7. Hợp chất TG7: 12α-Hydroxyevodol Chất bột dạng vô định hình mầu vàng nhạt. Nhiệt độ nóng chảy: 283-284oC. Độ quay cực: [ ] = -113,7 (c = 0,5, MeOH). 25 CTPT: C26H28O훼10 ; KLPT M = 500. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 14. 3.2.8. Hợp chất TG8: Rutaevine Chất ở dạng tinh thể mầu không mầu. Nhiệt độ nóng chảy: 300-301oC. Độ quay cực: [ ] = -149,6 (c = 0,005, CHCl3). 25 CTPT: C26H30O훼9; M = 486. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem bảng 15. 3.2.9. Hợp chất TG9: Lupeol Chất ở dạng tinh thể mầu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 215-216oC. Độ quay cực: [ ] = +26,4 (c =0,5 CHCl3). 25 CTPT: C30H50O;훼 KLPT M= 426. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem bảng 16. 3.2.10. Hợp chất TG10: Friedelan-3-one Chất ở dạng tinh thể mầu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 267-268oC. Độ quay cực: [ ] = +29,5 (c =0,1 CHCl3). 25 CTPT: C30H50O;훼 KLPT M=426. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem bảng 17. 3.2.11. Hợp chất TG11: Phellamurin Chất rắn, mầu vàng. Nhiệt độ nóng chảy 204-205oC. Độ quay cực: [ ] = -21,4 (c =0,2 MeOH). 25 CTPT: C26H28O훼11 ; KLPT M =518. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 18. 46
  61. 3.2.12. Hợp chất TG12: Epimedoside C Chất ở dạng tinh thể hình kim màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy: 289oC. Độ quay cực: [ ] = -92,4 (c =0,05, MeOH). 25 CTPT: C26H28O훼11 ; KLPT M=516. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 19. 3.2.13. Hợp chất TG13: Astragalin Chất tinh thể hình kim, mầu vàng. Nhiệt độ nóng chảy 178-179oC. Độ quay cực: [ ] = +16,9 (c =0,65, MeOH) 25 + ESI-MS: m/z 477훼 [M+H] và 471 [M+Na] CTPT: C21H20O11; KLPT M =448; 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 20. 3.2.14. Hợp chất TG14: Nicotiflorin Chất ở dạng tinh thể hình kim màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy: 190-192oC. Độ quay cực [ ] = +20,2 (c = 0,5, MeOH); 25 CTPT: C27H30O훼 15 ; KLPT M =594; 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 21. 3.2.15. Hợp chất TG15: Trifoline Chất ở dạng tinh thể hình kim màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy: 229-231oC. Độ quay cực: [ ] = +17,6 (c =0,5, MeOH). 25 CTPT: C21H20O훼11 ; KLPT M=448. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 22. 3.2.16. Hợp chất TG16: Quercetin Chất ở dạng tinh thể hình kim màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy: 313-314oC. CTPT: C15H10O7; KLPT M= 302. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CD3OD): xem bảng 23. 47
  62. 3.2.17. Hợp chất TG17: α-Tocopherol Chất ở dạng dầu, mầu vàng. o Độ quay cực [ ] = +26,4 (c= 0,5, CHCl3). 25 CTPT: C29H50O훼 2 ; KLPT M =430; 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem bảng 24. 3.2.18. Hợp chất TG18: N-Isobutyl-2E,4E-tetradecadienamide Chất ở dạng dầu, không màu. HR- ESI-MS: m/z 280,2640 [M+H]+. Tính toán lý thuyết cho công thức C18H34NO: 280,2640. CTPT: C18H33NO; KLPT M = 279. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem bảng 25. 3.2.19. Hợp chất TG19: N-Isobutyl-2E,4E-decadienamide Chất bột mầu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 87-88oC. CTPT: C14H25NO; KLPT M = 223. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CD3OD): xem bảng 26. 3.2.20. Hợp chất TG20: N-Isobutyl-2E,4E,8E-tetradecatrienamide Chất ở dạng dầu, không màu; HR ESI-MS: m/z 278,2483 [M+H]+. Tính toán lý thuyết cho công thức C18H32NO: 278,2483. CTPT: C18H31NO; M = 277. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem bảng 27. 3.2.21. Hợp chất TG21: Syringin Tinh thể màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 191-192oC. Độ quay cực [ ] = −20,2o (c= 0,5, MeOH). 25 CTPT: C17H24O훼 9 ; KLPT M= 372. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CD3OD): xem bảng 28. 3.2.22. Hợp chất TG22: Saikolignannisode A Chất bột màu vàng nhạt. Nhiệt độ nóng chảy: 110-112oC. 48
  63. Độ quay cực [ ] = +25,3 (c = 0,5, MeOH); 25 CTPT: C26H34O훼 11 ; KLPT M= 522. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CD3OD): xem bảng 29. 3.2.23. Hợp chất TG23: Picraquassioside D Chất bột màu trắng. Độ quay cực [ ] = −70,4 (c =0,5, MeOH). 25 + ESI-MS: m/z 303훼 [M+H] . CTPT: C13H18O8 và M= 302. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CD3OD): xem bảng 30. 3.2.24. Hợp chất TG24: Stigmatsterol Chất ở dạng tinh thể hình kim mầu trắng. Độ quay cực: [ ] = -54,2 (c = 1,9 CHCl3). 25 o Nhiệt độ nóng 훼chả y: 170 C. + ESI-MS: m/z: 395,3 [M -H2O+H] . Tính toán lý thuyết cho công thức: C29H48O. CTPT: C29H48O, KLPT M= 412,00. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem bảng 31. 3.2.25. Hợp chất TG25: Daucosterol Chất bột mầu trắng. Độ quay cực: [ ] = -41,2 (c = 1,9 CHCl3). 25 o Nhiệt độ nóng 훼chả y: 283-284 C. + ESI-MS: m/z: 397,3 [M -C6H12O6+H] . Tính toán lý thuyết cho công thức: C35H60O6. CTPT: C35H60O6; M = 576. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 32. 3.2.26. Hợp chất TG26: 5-Hydroxymethylfurfural Chất ở dạng dầu mầu vàng. CTPT: C6H6O3; KLPT M = 126. 1 13 Số liệu phổ H-NMR và C-NMR (CD3OD): xem bảng 33. 49
  64. CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN Nhằm xác định thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây dấu dầu lá nhẵn, chúng tôi tiến hành các nghiên cứu hóa học và xác định hoạt tính sinh học của các chất phân lập được. Để phân lập các hợp chất từ cây dấu dầu lá nhẵn, đầu tiên áp dụng phương pháp chiết lỏng-rắn. Sử dụng dung môi chiết có độ phân cực trung bình là methanol với mục đích khảo sát cả các hợp chất có độ phân cực ít đến khá phân cực. Trong quá trình chiết, kết hợp sử dụng nhiệt độ và siêu âm nhằm rút ngắn thời gian chiết và tăng hiệu suất chiết. Các phân đoạn thô thu được bằng cách sử dụng phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng với việc sử dụng các dung môi không tan vào nhau và phân bố chất vào các pha khác nhau. Dung môi chiết được tăng dần độ phân cực từ ít phân cực đến phân cực nhiều: chloroform → ethyl acetate → nước. Quá trình làm giầu chất được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng trước khi tiến hành phân tách bằng các loại sắc ký cột với các loại chất hấp phụ khác nhau. Việc phân lập các hợp chất sử dụng các chất phấp phụ khác nhau nhằm tăng khả năng tách. Đối với những hỗn hợp khó có khả năng tách trên sắc ký pha thường, sử dụng silica gel pha đảo với chiều dài mạch chất hấp phụ khác nhau (RP-8 hoặc RP-18) nhằm tăng thêm khả năng tách. Trong quá trình tách, kiểm tra và lựa chọn hệ dung môi kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng và trên cột được giống nhau và lựa chọn chiều dài cột, đường kính cột phù hợp với khối lượng chất cần tách cũng như Rf của từng chất trong hỗn hợp. Các dịch chiết phân đoạn của mỗi phân đoạn được xác định sơ bộ thành phần hóa học bằng sắc ký lớp mỏng. Trên cơ sở kết quả kiểm tra sắc ký bản mỏng của dịch chiết phân đoạn ethyl acetate có nhiều vết cho thấy thành phần hóa học chính của cây dấu dầu lá nhẵn. Kiểm tra so sánh chloroform, nhận thấy các vết trên sắc ký lớp mỏng giống với các vết trên dịch ethyl acetate. Vì vậy các dịch chiết của phân đoạn chloroform không được nghiên cứu sâu hơn. Chính vì vậy, việc phân lập các hợp chất tập trung vào phần phân đoạn ethyl acetate và phần nước. 50
  65. 4.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT 4.2.1. Hợp chất TG1 (chất mới): Tetraglabrifolioside 6'' O OH O O 6'' O OH OH COOH COOH 1'' 3 5'' 1'' 3'' 5'' O O OH O ' ' 6' 6' 5' O O 5' O HO HO O HO O O HO 1 HO HO 1' 2 2' 1' OH OH OH 4 HO TG1a TG1 Hình 4. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG1 và cấu trúc hóa học của hợp chất tham khảo TG1a. Hình 5. Phổ HR-ESI-MS của TG1. Hợp chất TG1 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử được xác định là C16H28O10. Dựa trên phổ khối lượng phân giải cao HR ESI MS (Hình 5) xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 379,1609 ([M–H]–) (tính toán lý thuyết cho công C16H27O10: 379,1604). 1 Trên phổ H-NMR của TG1 xuất hiện tín hiệu của một proton anome tại δH 4,34 (d, J = 8,0 Hz), một nhóm methyl bậc 3 tại δH 1,36 (s), một nhóm methyl bậc 2 tại δH 1,21 (d, J = 6,5 Hz) và một nhóm methyl bậc một tại δH 0,96 (t, J = 7,5 Hz). Phổ 13C-NMR (Hình 9) và DEPT (Hình 10) của TG1 cho thấy sự xuất hiện của hai nhóm cacbonyl tại δC 172,63 (C-1′′) và 178,50 (C-5′′), một cacbon bậc bốn tại 51
  66. 70,88 (C-3′′), 6 nhóm oxymethine tại δC 71,74 (C-4′), 75,05 (C-5′), 75,26 ′ (C-2), 77,92 (C-3′), 79,07 (C-2) và 103,93 (C-1′); bốn nhóm methylen tại δC 30,25 (C-3), 46,99 (C-2′′), 47,26 (C-4′′) và 64,73 (C-6′); ba nhóm methyl tại δC 9,98 (C-4), 21,48 (C-1) và 27,81 (C-6′′). Các tín hiệu cacbon tại δC 103,93 (C-1′), 75,26 (C-2′), 77,92 (C-3′), 71,74 (C-4′), 75,05 (C-5′) và 64,73 (C-6′) cùng với hằng số tương tác của proton JH-1′-H-2′ = 8,0 Hz lớn, gợi ý sự có mặt của một đơn vị đường β-D- glucopyranoside. Để xác định chính xác phần đường, hợp chất TG1 được thủy phân trong môi trường acid để thu phần đường; sau đó thực hiện phản ứng với trimethylsilylimidazole. Cô quay sản phẩm phản ứng và rồi chiết phân lớp bằng n- hexane/nước thu được phân lớp n-hexane. Lớp n-hexane này được phân tích trên máy GC với điều kiện: cột SPB-1 (0,25 mm × 30 m); detector FID, nhiệt độ cột 210 °C, nhiệt độ buồng bơm 270 °C, nhiệt độ buồng bơm 300 °C, khí mang heli (tốc độ dòng 2 mL/phút) đã thu được một pic tín hiệu tại thời gian lưu 14,11 phút. Tiến hành tương tự cho các mẫu chuẩn D-glucose và L-glucose thu được thời gian lưu của persilylated D-glucose và L-glucose lần lượt là 14,11 và 14,26 phút. Bằng các so sánh thời gian lưu, chúng tôi đã xác định được chính xác phần đường trong hợp chất TG1 là D-glucose. Trên phổ HMBC (Hình 12) thấy có tương tác giữa δH 1,36 (s) với C-3′′ (δC 70,88)/C-2′′ (δC 46,99)/C-4′′ (47,26); proton của nhóm methylen tại δH 2,64 (d, J = 15,0 Hz)/2,68 (d, J = 15,0 Hz) với C-3′′ (δC 70,88)/C- 1′′ (δC 172,63); proton của nhóm methylen tại δH 2,48 (d, J = 15,0 Hz)/2,59 (d, J = 15,0 Hz) với C-3′′ (δC 70,88)/C-4′′ (δC 178,50) khẳng định sự tồn tại của một nhánh 3-hydroxy-3-methylglutaric acid [118]. Các tín hiệu còn lại trên phổ đặc trưng cho nhóm 2-butyl với các tín hiệu của hai nhóm methyl tại C-1 (δC 21,48)/δH 1,21 (d, J = 6,5 Hz) và C-4 (δC 9,98)/δH 0,96 (t, J = 7,5Hz); một nhóm methylen tại δC 30,25 (C-3)/δH 1,50 (m) và 1,62 (m) và một nhóm oxymethine tại C-2 (δC 79,07)/δH 3,74 (m) và được khẳng định thêm bằng các tương tác trên phổ HMBC. Tương tác HMBC giữa proton anome H-1′ (δH 4,34) và C-2 (δC 79,07); giữa H-2 (δH 3,74) và C-1′ (δC 103,93) cho phép khẳng định nhóm 2-butyl liên kết với C-1 của đường qua cầu oxy. Vị trí este hóa của nhánh glutaric acid tại C-6′ được khẳng định bởi tương tác giữa các proton H-6′ (δH 4,21 và 4,45) và cacbonyl C-1′′ (δC 172,63). 52
  67. Từ các bằng chứng phổ nêu trên, hợp chất TG1 được xác định là 2-butyl-O-β- D-glucopyranosyl(1→6)-3-hydroxyl-3-methylglutaric acid. Cấu hình tương đối của TG1, được xác định trên cơ sở sự phù hợp về giá trị độ dịch chuyển hóa học 1H- và 13C-NMR cũng như giá trị hằng số tương tác của các proton của TG1 với các số liệu tại các vị trí tương đồng đã được công bố của hợp chất 1-[(2R)-4-(4- hydroxyphenyl)-2-butanol-2-O-β-D-glucopyranosyl]-3-hydroxyl-3-methyl-glutaric acid (TG1a) [119] là hợp chất có cấu trúc tương tự TG1 chỉ khác ở chỗ thay gốc 2- butanol bằng gốc (2R)-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanol. Như vậy, TG1 được xác định là (2R*,3S*)-2-butyl-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-3-hydroxyl-3-methylglutaric acid, một hợp chất mới lần đầu phân lập từ thiên nhiên và được đặt tên là tetraglabrifolioside. Bảng 8. Số liệu phổ NMR của TG1 và hợp chất tham khảo TG1a TG1 # C δC δC DEPT δH (J = Hz) HMBC (H → C) 1 21,48 CH3 1,21 (d, 6,5) 2, 3 2 79,07 CH 3,74 (m) 1′, 4, 3 1,50 (m) 3 30,25 CH 1, 2, 4 2 1,62 (m) 4 9,98 CH3 0,96 (t, 7,5) 2, 3 1′ 103,0 103,93 CH 4,34 (d, 8,0) 2′, 3′ 2′ 75,9 75,26 CH 3,18 (t, 8,5) 1′, 3′, 4′ 3′ 78,6 77,92 CH 3,36* 2′, 4′, 5′ 4′ 72,4 71,74 CH 3,33* 2′, 3′, 5′, 6′ 5′ 75,9 75,05 CH 3,47 (m) 1′, 3′, 5′, 6′ 4,21 (dd, 6,0, 11,5) 1′′, 4′, 5′ 6′ 65,5 64,73 CH 2 4,45 (dd, 1,5, 11,5) 1′′, 4′, 5′ 1′′ 173,6 172,63 C - 2,64 (d, 15,0) 2′′ 48,0 46,99 CH 1′′, 3′′, 4′′, 6′′ 2 2,68 (d, 15,0) 3′′ 71,7 70,88 C 2,48 (d, 15,0) 2′′, 3′′, 5′′, 6′′ 4′′ 48,7 47,26 CH 2 2,59 (d, 15,0) 2′′, 3′′, 5′′, 6′′ 5′′ 180,9 178,50 C - 6′′ 28,7 27,81 CH3 1,36 (s) 2′′, 3′′, 4′′ # δC của 1-[(2R)-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanol-2-O-β-D-glucopyranosyl]-3-hydroxyl-3- methylglutaric acid [119], * tín hiệu chập 53