›

Khóa luận Xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền gen CYP2C9*3 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông Acenocoumarol ở người bệnh sau thay van tim

pdf 51 trang thiennha21 18/04/2022 7710
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền gen CYP2C9*3 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông Acenocoumarol ở người bệnh sau thay van tim", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_xay_dung_quy_trinh_phan_tich_da_hinh_di_truyen_gen.pdf

Nội dung text: Khóa luận Xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền gen CYP2C9*3 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông Acenocoumarol ở người bệnh sau thay van tim

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NGA XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Ở NGƯỜI BỆNH SAU THAY VAN TIM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA Hà Nội - 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NGA XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Ở NGƯỜI BỆNH SAU THAY VAN TIM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: ThS. Phạm Thị Hồng Nhung Hà Nội - 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Bác sĩ đa khoa của tôi không chỉ là kết quả cho sự cố gắng của bản thân mà còn do nhận được sự giúp đỡ, động viên của cô thầy, bạn bè và người thân. Qua trang viết này tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập – nghiên cứu vừa qua. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn tới ThS. Phạm Thị Hồng Nhung – người đã tận tình chỉ bảo, đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Đỗ Thị Lệ Hằng đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại phòng thí nghiệm. Các cô không chỉ trang bị cho tôi kiến thức khoa học, các kỹ năng phòng thí nghiệm mà còn truyền cho tôi niềm cảm hứng, lòng đam mê với nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Khoa Y Dược và Bộ môn Y Dược học cơ sở đã hết lòng quan tâm, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ kinh phí cho đề tài mã số QG.17.29 do PGS.TS. Phạm Trung Kiên chủ trì và nghiên cứu của của tôi là một phần trong đó. Tôi xin cảm ơn tập thể nhân viên Bệnh viện Tim Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất. Tôi cũng xin gửi lời tri ân tới các người bệnh đã tham gia vào nhóm nghiên cứu của đề tài. Xin gửi lời cảm ơn tốt đẹp tới nhóm sinh viên nghiên cứu thuộc bộ môn Y Dược học cơ sở đã luôn hỗ trợ kịp thời và giúp đỡ tôi khi tôi gặp khó khăn trong quá trình thực hành nghiên cứu. Bên cạnh đó, xin cảm ơn Quỹ học bổng PDG Trust đã luôn tin tưởng và đồng hành cùng tôi trong thời gian làm khóa luận nghiên cứu bậc đại học. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ sự yêu thương đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn là điểm tựa để tôi yên tâm hoàn thành tốt nhất khóa luận này. Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2019 Tác giả @ School ofNguyễn Medicine Thị Nga and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BMI Body Mass Index (Chỉ số khối cơ thể) Bp Base pair (Cặp bazơ nitơ) CYP Cytochrome P450 DNA Deoxyribo Nucleic Acid (Axit Deoxynucleic) dNTP Deoxynucleotit triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine tetra-acetic) INR International normalized ratio (Thời gian prothrombin đo với tỷ lệ chuẩn hóa quốc tế) OD Optical density (Mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PCR-CTPP Polymerase Chain Reaction with confronting two-pair primers ( Phản ứng chuỗi polymerase với hai cặp mồi kép) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) SNP Single nucleotit polymorphism (Đa hình đơn nucleotit) VKORC1 Vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1 (Phức hợp reductase vitamin K epoxide, tiểu đơn vị 1) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị 5 Bảng 3.1 Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số 20 Bảng 3.2 Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen 22 CYP2C9*3 Bảng 3.3 Kết quả tần số alen và tần số kiểu gen CYP2C9*3 23 Bảng 4.1 Mối liên quan giữa đa hình di truyền gen CYP2C9 *3 tới chỉ 27 định liều Acenocoumarol và nguy cơ chảy máu của một số nhóm nghiên cứu Hà Lan Bảng 4.2 Các biến trong thuật toán tính liều acenocoumarol ở nhóm 27 nghiên cứu người Tây Ban Nha Bảng 4.3 So sánh liều trung bình mg/tuần qua phân tích từ các thuật 28 toán của các nhóm nghiên cứu khác nhau @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Các giai đoạn của quá trình đông máu 3 Hình 1.2 Cơ chế tác động của chống đông kháng Vitamin K tại gan 6 Hình 1.3 Phương pháp giải trình tự tự động 12 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 15 Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số 10 người bệnh trong nhóm 20 nghiên cứu. Hình 3.2 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối 21 ưu nhiệt độ gắn mồi nhân dòng alen CYP2C9*3 Hình 3.3 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối 21 ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA nhân dòng alen CYP2C9*3 Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CYP2C9*3 trên gel 22 agarose 1,5 % Hình 3.5 Kiểu gen CYP2C9*3 xác định thông qua giải trình tự 23 Hình 4.1 Tần số alen C của CYP2C9*3 trên một số quần thể người. Tần 24 số alen C ở các quần thể khác được lấy từ tài liệu số Hình 4.2 Nguyên lý của phương pháp PCR-CTPP. 25 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1.Khái quát quá trình đông máu và bệnh lý van tim 3 1.1.1 Quá trình đông máu 3 1.1.2. Bệnh lý van tim 4 1.2.Thuốc chống đông kháng vitamin K 4 1.3.Dược động học và dược di truyền Acenocoumarol 7 1.3.1 Dược động học Acenocoumarol 7 1.3.2. Dược di truyền của Acenocoumarol 8 1.4.Tổng quan về đa hình CYP2C9*3 9 1.4.1. Enzym CYP2C9 9 1.4.2. Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3 10 1.4.3. Tổng quan phương pháp nghiên cứu 10 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh 14 2.1.2. Các tiêu chuẩn loại trừ 14 2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14 2.2. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 14 2.2.1. Hóa chất 14 2.2.2. Thiết bị 14 2.3. Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1. Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm 15 2.3.2. Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit 16 2.3.3. Khuếch đại đoạn gen đích chứa CYP2C9*3 17 2.3.4. Kiểm tra chất lượng DNA 17 2.3.5. Giải trình tự DNA 18 2.3.6. Phân tích kết quả và xử lý số liệu 18 2.4. Đạo đức nghiên cứu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20 3.1. Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng DNA 20 3.2. Khuếch đại đoạn gen chứa CYP2C9*3 20 3.2.1. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi với enzym Phusion Polymerase 21 3.2.2. Tối ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA 21 3.3. Giải trình tự vùng gen chứa CYP2C9*3 23 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 24 4.1. So sánh tần số CYP2C9*3 ở các quần thể khác nhau 24 4.2. Các phương pháp phân tích CYP2C9*3 được sử dụng hiện nay 25 4.3. Ứng dụng tính liều điều trị acenocoumarol 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lý van tim là một trong các bệnh phổ biến trên thế giới cũng như tại Việt Nam, là nguyên nhân hàng đầu gây suy tim và đe dọa tính mạng của người bệnh. Nguyên nhân chủ yếu gây bệnh van tim là do di chứng của tổn thương van tim trong bệnh thấp tim [10]. Từ khi có kỹ thuật sửa và thay van tim, cuộc sống của người bệnh mắc bệnh van tim đã được cải thiện đáng kể, mang lại cho họ cuộc sống gần như bình thường. Tuy nhiên, trong quá trình hoạt động các van tim nhân tạo thường sinh ra các cục máu đông dễ gây tắc mạch, huyết khối. Do vậy, ngay sau khi thay van tim người bệnh phải sử dụng thuốc chống đông. Tại Việt Nam, thuốc chống đông kháng vitamin K đã được đưa vào sử dụng hơn 25 năm nay với biệt dược chính là Sintrom (Acenoucomarol) có hiệu quả trong phòng và điều trị huyết khối đã được chứng minh. Tuy nhiên trong quá trình sử dụng thuốc chống đông kháng vitamin K tỷ lệ gặp biến chứng khá cao, khoảng điều trị hẹp, tác dụng của thuốc chịu ảnh hưởng nhiều bởi nhiều yếu tố (chế độ ăn, các thuốc khác như aspirin, kháng sinh cephalosporin ) nên việc xác định liều lượng điều trị phù hợp gặp nhiều khó khăn. Nếu liều dùng thuốc sử dụng thấp thì không đạt hiệu quả điều trị nhưng nếu quá liều sẽ gây biến chứng chảy máu thậm chí gây tử vong. Hiện nay các thầy thuốc lâm sàng điều chỉnh liều thuốc chống đông kháng vitamin K chủ yếu dựa vào xét nghiệm INR (Thời gian Prothrombin đo với tỉ lệ chuẩn hóa quốc tế- International Normalized Ratio) của người bệnh. INR yêu cầu phải theo dõi hàng ngày để điều chỉnh liều, điều đó gây khó khăn việc này đòi hỏi phải theo dõi INR hàng ngày để điều chỉnh liều, gây nên những khó khăn về thời gian và kinh tế cho người bệnh tiến hành xét nghiệm. Qua quá trình theo dõi điều trị, có sự khác nhau về kết quả điều trị người bệnh trong cùng một nhóm tuân thủ điều trị như nhau. Vậy điều gì ảnh hưởng tới kết quả INR ở những người bệnh cùng độ tuổi, cùng giới tính, cùng phác đồ là câu hỏi vẫn chưa có lời giải thích đầy đủ. Kiểu gen thu được từ dự án giải trình tự bộ gen người năm 2000 đã mở ra một kỷ nguyên mới cho ngành khoa học sức khỏe. Y học cá nhân hóa dựa vào kiểu gen đang trở thành một phương pháp điều trị mới trong thực hành lâm sàng. Hơn 30 gen đã được tìm thấy tham gia vào các hoạt động trao đổi chất của thuốc chống đông máu họ Coumarin dạng uống, trong đó nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng đa hình di truyền CYP2C9*3 (c.1075 A > C) là một trong các yếu tố di truyền quan trọng ảnh hưởng đến sự đáp ứng thuốc chống đông kháng vitamin K. Một số nghiên cứu cho thấy người bệnh mang kiểu gen @ đồng School hợp đột biếnof MedicineCC, và dị hợp ACand cần Pharmacy, VNU 1
  10. giảm liều chống đông so với người bệnh đồng hợp kiểu dại AA [25, 42]. Do đó, việc xác định được kiểu gen này đóng một vai trò quan trọng trong tiên lượng đáp ứng thuốc điều trị ở từng người bệnh. Trong bối cảnh của Việt Nam hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về mặt di truyền học liên quan tới việc chỉ định liều acenocoumarol sử dụng cho người bệnh. Chính vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu: “Xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền gen CYP2C9*3 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông Acenocoumarol ở người bệnh sau thay van tim” với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau: Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng được quy trình tối ưu để xác định đa hình di truyền CYP2C9*3 trên mẫu máu người bệnh sau thay van tim. - Áp dụng được quy trình đã tối ưu để đánh giá mức độ đa hình di truyền CYP2C9*3 trên 100 người bệnh sau thay van tim tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu - Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen chứa đa hình CYP2C9*3. - Giải trình tự và xác định kiểu gen của các đa hình CYP2C9*3. - Áp dụng quy trình phân tích gen để khảo sát tần số kiểu gen và tần số alen trên 100 người bệnh sau thay van tim ở Việt Nam. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát quá trình đông máu và bệnh lý van tim 1.1.1 Quá trình đông máu Bình thường máu lưu thông trong lòng mạch ở trạng thái lỏng, không đông nhờ có sự cân bằng giữa hệ thống đông cầm máu và ức chế đông máu. Khi xảy ra tổn thương mạch máu, hệ thống đông cầm máu được khởi động nhằm tạo cục máu đông khu trú tại chỗ tổn thương, làm ngừng chảy máu. Sau khi hoàn thành chức năng cầm máu, cục máu đông sẽ được tiêu đi, trả lại sự lưu thông bình thường cho lòng mạch. Toàn bộ quá trình cần có sự tham gia của các thành phần: thành mạch, tiểu cầu, các yếu tố đông máu, các chất ức chế đông máu, hệ thống tiêu sợi huyết. Quá trình đông cầm máu gồm các giai đoạn: cầm máu nguyên phát (tạo nút cầm máu tạm thời), đông máu huyết tương (tạo nút cầm máu vĩnh viễn), tiêu cục máu đông [6]. Cầm máu nguyên phát diễn ra ngay tức khắc, có hai yếu tố quan trọng là tiểu cầu (kết hợp thành nút chặn tiểu cầu) và thành mạch (hiện tượng co mạch). Tiểu cầu kết dính vào nơi thành mạch bị tổn thương trực tiếp hay thông qua yếu tố Von-Willebrand. Cầm máu thứ phát (đông máu huyết tương) diễn ra chậm, vài phút tới vài giờ. Sau khi ra khỏi lòng mạch 2-4 phút, máu bắt đầu đông lại. Máu đông lại là do sự chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan dưới xúc tác của thrombin. Các fibrin trùng ngưng với nhau tạo thành mạng lưới giam giữ các tế bào máu và huyết tương tạo thành cục máu đông. Sơ đồ thể hiện ở Hình 1.1. Yếu tố nội sinh Yếu tố ngoại sinh Các yếu tố đông máu được hoạt hóa kết hợp với Ca2+ Thrombokinase Prothrombin Thrombin Fibrinogen Fibrin Hình 1.1 Các giai đoạn của quá trình đông máu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  12. 1.1.2. Bệnh lý van tim Bệnh lý van tim là tình trạng van tim bị bệnh lý hoặc bị tổn thương và có thể ảnh hưởng đến dòng máu chảy qua tim. Có hai loại bệnh van tim chính. Hẹp van: nghĩa là việc mở van bị giới hạn và van không mở ra hoàn toàn. Vì vậy, làm hạn chế lưu lượng máu chảy qua van. Hở van: nghĩa là van không đóng đúng cách và có dòng máu phụt ngược qua van bị hở. Đôi khi còn được gọi là thiểu năng van, hoặc rò van. Bất kỳ van tim nào cũng có thể bị ảnh hưởng bởi những vấn đề này. Tuy nhiên, van hai lá và van động mạch chủ thường gặp hơn [4]. Hầu hết các vấn đề về van tim có thể được điều trị bằng thuốc, can thiệp hay phẫu thuật sửa chữa, thay thế. Tùy vào nguyên nhân gây hở van, mức độ nặng của bệnh mà bác sĩ đưa ra khuyến cáo phù hợp cho người bệnh. Các thuốc điều trị hẹp, hở van tim đã chứng minh có thể kiểm soát hoặc làm giảm các triệu chứng, giảm gánh nặng cho tim và làm chậm tiến triển của bệnh. Các thuốc thường dùng gồm thuốc lợi tiểu: giúp giảm gánh nặng cho tim; thuốc ức chế men chuyển hạ huyết áp và giảm gánh nặng cho tim; chẹn beta giao cảm: giảm nhịp tim, kiểm soát nhịp tim và hạ huyết áp; các thuốc trợ tim giúp ổn định nhịp tim và giúp tăng sức bóp cơ tim; thuốc chống đông: ngăn ngừa nguy cơ hình thành cục máu đông, đặc biệt sau phẫu thuật van tim hoặc thay van bằng vật liệu tổng hợp. Phẫu thuật tim hở hay can thiệp tim qua da, sẽ được bác sỹ quyết định dựa trên mức độ tổn thương van. Can thiệp qua da được áp dụng với các trường hợp van bị lỗi hoặc khuyết tật van tim bẩm sinh. Sửa chữa van tim đơn giản hơn thay van tim vì tổn thương ít hơn, chi phí điều trị thấp hơn và hạn chế được nguy cơ bị nhiễm trùng sau phẫu thuật. Thay thế van tim: khi không còn khả năng sửa chữa, tiến hành thay van tim bằng van tim cơ học hoặc van tim sinh học. Van sinh học được làm từ mô tim động vật, mô tim của người hiến tặng hoặc sử dụng mô của chính người bệnh. Van sinh học không cần sử dụng thuốc chống đông suốt đời. Van cơ học được làm bằng vật liệu tổng hợp, thiết kế để hoạt động được nhiều năm tuy nhiên van cơ học đã được nghiên cứu và chứng minh tăng nguy cơ tạo cục máu đông do đó cần sử dụng thuốc chống đông suốt đời. 1.2. Thuốc chống đông kháng vitamin K Sau thay phẫu thuật thay van tim biến chứng hay gặp nhất là do sử dụng các thuốc chống đông máu. Có thể nói thay van tim là thay một “bệnh van tim” bằng một “bệnh van tim nhân tạo”, do van tim @ nhân School tạo khi hoạtof độngMedicine sẽ hình thành and nên Pharmacy, VNU 4
  13. các cục máu đông có nguy cơ gây tắc mạch và huyết khối. Do vậy, tất cả người bệnh sau thay van tim đều phải sử dụng thuốc chống đông nhằm ngăn ngừa hình thành các cục máu đông, tránh nguy cơ gây tắc mạch và/hoặc huyết khối. Thuốc kháng vitamin K đường uống đã được sử dụng từ rất lâu (từ những năm 1940), có một số nhóm thuốc kháng vitamin K như warfarin, acenocoumarol Các thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị tại Việt Nam được trình bày ở Bảng 1.1. Bảng 1.1 Các thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị Hoạt chất Biệt dược Dạng bào chế Liều dùng DẪN XUẤT COUMARIN Viên nén 4mg, Người lớn: Liều khởi đầu 4mg/ngày Sintrom vạch chia ¼ Trẻ em: 0,05 đến 0,14mg/kg/ngày Acenocoumarol Mini- Người lớn: Liều khởi đầu 4mg/ngày Viên nén 1mg sintrom Trẻ em: 0,05 đến 0,14mg/kg/ngày Viên nén 2mg có Người lớn: Liều khởi đầu 5mg/ngày Coumadine vạch chia Trẻ em: 0,09 đến 0,32mg/kg/ngày Warfarin Viên nén 5mg có Người lớn: Liều khởi đầu 5mg/ngày Coumadine vạch chia Trẻ em: 0,09 đến 0,32mg/kg/ngày DẪN XUẤT INDANEDION Viên nén 20mg, Người lớn: Liều khởi đầu 20mg/ngày Fluindion Previscan vạch chia ¼ Trẻ em: 0,37 đến 1,4mg/kg/ngày Thuốc chống đông kháng vitamin K có khoảng an toàn rất hẹp, nếu dùng liều thấp thì không đạt hiệu quả kháng đông, nhưng nếu quá liều sẽ gây biến chứng chảy máu đe dọa tính mạng người bệnh. Do vậy, khi dùng thuốc chống đông kháng vitamin K cần phải nêu rõ các thông tin @ sau School (1) thuốc cụ of thể Medicine được dùng (warfarin, and Pharmacy, VNU 5
  14. acenocoumarol, phenprocoumon), (2) khoảng INR đích đối với từng van, (3) INR trung bình đạt được, (4) phương pháp kiểm soát kháng đông (bác sĩ hoặc điều dưỡng kiểm soát, hoặc người bệnh tự điều chỉnh ở nhà), và (5) thời gian điều trị. Nếu người bệnh bị huyết khối van, thuyên tắc hoặc biến cố chảy máu thì phải nêu rõ INR vào thời điểm xảy ra biến cố. Có nhiều loại thuốc chống đông, nhưng tại Việt Nam hiện nay được dùng nhiều nhất là thuốc kháng vitamin K do giá thành hợp lý và nằm trong danh mục được bảo hiểm y tế chi trả. Cơ chế chống đông được miêu tả như Hình 1.2 Vitamin K oxide Reductase Thuốc kháng vitamin K Vitamin K bị khử Vitamin K bị oxy hóa Yếu tố (II), (VII), (IX), (X) Yếu tố (II), (VII), (IX), (X) hoạt hóa Carboxylase Hình 1.2 Cơ chế tác động của chống đông kháng Vitamin K tại gan Chống đông kháng vitamin K tác động bằng làm giảm chức năng carboxyl hóa của vitamin K nhằm biến đổi các tiền chất thành các yếu tố đông máu gồm: yếu tố prothrombin (yếu tố II), proconvertin (yếu tố VII), yếu tố anti hemophilia B (yếu tố IX), và yếu tố Stuart-Prower (yếu tố X), sau cùng thành yếu tố đông máu bất hoạt. Trong quá trình chuyển đổi, vitamin K bị oxy hóa thành expoxid vitamin K. Như vậy các kháng vitamin K có tác dụng chống đông máu gián tiếp bằng cách ngăn cản tổng hợp các dạng hoạt động của nhiều yếu tố đông máu kể trên. Đã có nhiều nghiên cứu và hướng dẫn việc sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim. Bourguigon T. và cộng sự theo dõi 505 người bệnh thay van tim cơ học trong thời gian 8 năm thấy biến chứng gặp nhiều nhất là tắc mạch và chảy máu có liên quan đến hoạt động của van [14]. Abhijit Trailokya và cộng sự khuyến cáo liều acenocoumarol 4-8 mg/ngày từ ngày @ thứ School hai và duy of trì mứcMedicine INR từ 3 đến and 4 là Pharmacy, VNU 6
  15. an toàn và hiệu quả [9]. Nghiên cứu của Alec Vahanian và cộng sự đã đưa ra được những chỉ định rất cụ thể về sử dụng thuốc chống đông sau mổ thay van và đề xuất mức INR cho người bệnh thay van tim cơ học từ 2,5 đến 4 [10]. Nghiên cứu của Nashimura và cộng sự trên 650 người bệnh thay van tim thấy 0,62 % có tắc mạch và 0,95 % chảy máu, dùng thuốc chống đông kháng vitamin K liều 1-2,5 mg/ngày có thể hạn chế được tắc mạch [16]. Isthyak Ashmed Mir nghiên cứu trên 127 người bệnh sử dụng acenocoumarol sau thay van tim cho thấy nếu người bệnh duy trì được mức INR từ 2,5-3,5 sẽ giảm tối đa nguy cơ tắc mạch và chảy máu [27]. Elbardissi và cộng sự nghiên cứu 861 người bệnh thay van động mạch chủ thấy rằng nếu sử dụng sớm thuốc chống đông thì hầu hết không thấy tai biến huyết khối tắc mạch sau thay van [22]. 1.3. Dược động học và dược di truyền Acenocoumarol 1.3.1 Dược động học Acenocoumarol Việc hoàn thành dự án bộ gen người năm 2000 đã mở ra một kỷ nguyên mới cho ngành khoa học sức khỏe. Y học cá nhân hóa dựa vào bằng chứng đang nổi lên như một phương pháp điều trị mới trong thực hành lâm sàng trong thời gian gần đây. Thuốc chống đông kháng vitamin K như warfarin, acenocoumarol và phenprocoumon là thuốc thường được kê đơn nhất cho việc quản lý các vấn đề liên quan đến đông máu ở người bệnh rung nhĩ, thay van tim, vùng sâu, huyết khối tĩnh mạch, phổi thuyên tắc và với những người bệnh đã trải qua phẫu thuật chỉnh hình [17, 40, 25, 18]. Nếu như tại Mỹ, hơn 2 triệu người bệnh được cho warfarin đơn liều để ngăn ngừa huyết khối tắc mạch [31], thì ở Việt Nam, acenocoumarol (Sintrom) được sử dụng rộng rãi để điều trị hơn warfarin. Cấu trúc hoá học của acenocoumarol được đặc trưng bởi nhóm nitro ở vị trí para của vòng phenyl và tồn tại ở hai dạng đồng phân R (+) và S (-), trong đó R (+) acenocoumarol có tác dụng chống đông mạnh hơn so với S (-) acenocoumarol. Cơ chế chống đông acenocoumarol cũng giống như nhóm thuốc chống đông kháng Vitamin K khác đã trình bày ở Hình 1.2 Acenocoumarol được hấp thu nhanh chóng qua đường tiêu hóa và đạt nồng độ tối đa (Cmax) 0,3 (± 0,05) mcg/mL trong 2-3 giờ. Acenocoumarol trong huyết tương đa phần ở dạng liên kết với protein, chỉ 1,52 % tồn tại ở trạng thái tự do. Sau khi uống, nồng độ thuốc trung bình đạt được trong huyết tương và thời gian bán thải của Acenocoumarol lần lượt là 3,9 (± 0,7) mcg mL/giờ và 10,9 (± 1,5) giờ. Thời @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  16. gian để đạt được hiệu quả tối ưu trong việc làm tăng thời gian prothrombin là từ 24- 30 giờ [27]. Acenocoumarol là thuốc có thời gian bán thải ngắn, do vậy nó được đào thải ra ngoài một cách nhanh chóng. Năm 1982 Tổ chức Y tế Thế giới đưa ra khái niệm INR (International Normalized Ratio). Định nghĩa INR như sau: INR = (PT người bệnh / trung bình PT bình thường)ISI, trong đó ISI (International Sensitivity Index) là độ nhạy của lô thromboplastin được dùng so với thromboplastin chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới có ISI = 1 (ISI của mỗi lô thromboplastin do nhà sản xuất cung cấp). Hiện nay INR được xem là xét nghiệm chuẩn để đánh giá mức độ chống đông bằng thuốc kháng vitamin K. Vì không thể có được một giá trị INR cố định trong suốt quá trình điều trị dài hạn, các hướng dẫn điều trị đưa ra một khoảng INR cần đạt đối với từng bệnh lý (ví dụ đối với người có van 2 lá cơ học khoảng INR cần đạt là 2,5-3,5). Liều thuốc kháng vitamin K được điều chỉnh để đạt INR trong khoảng này. Duy trì INR trong một khoảng là một công việc khó khăn. INR có thể dao động (dù liều thuốc kháng vitamin K không thay đổi) do những thay đổi của lượng vitamin K trong khẩu phần ăn (các loại thức ăn chứa nhiều vitamin K gồm bắp cải, bông cải, cải xoăn, rau diếp, gan bò, gan lợn), do thay đổi của chức năng gan, do tương tác thuốc hoặc do người bệnh không tuân thủ điều trị. Trên thực tế, để duy trì INR ổn định trong một khoảng đích cần thực hiện xét nghiệm này một cách định kỳ, ít nhất 1 lần/tháng và mỗi khi có phối hợp thêm một thuốc có tương tác với thuốc kháng vitamin K 1.3.2. Dược di truyền của Acenocoumarol Nghiên cứu trong nhiều năm trở lại đây, di truyền học là một trong các yếu tố quan trọng đóng vai trò tiên lượng và thay đổi liều điều trị để đạt được khoảng INR mong muốn [12, 44]. Hơn 30 gen đã được tìm thấy có tham gia vào các hoạt động và sự trao đổi chất của thuốc chống đông đường uống, trong đó CYP2C9 (một trong những gen mã hóa cho họ enzym chuyển hóa thuốc cytochrome P450) và VKORC1 (gen mã hóa cho tiểu phần 1 của enzym khử vitamin K 2,3 epoxide thành dạng hoạt động) là hai gen quan trọng nhất ảnh hưởng tới đáp ứng thuốc chống đông Acenocoumarol [36, 28, 43]. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng khoảng 30% của phương sai liều phụ thuộc vào đa hình đơn nucleotit (SNP) trên gen VKORC1 và khoảng 12% phụ thuộc vào SNP trên gen CYP2C9 [19, 38]. Một nghiên cứu của hiệp hội genome mở rộng cũng chỉ ra rằng VKORC1, CYP2C9 @ vàSchool CYP4F2 làof các Medicine yếu tố di truyền and chủ Pharmacy, VNU 8
  17. yếu chịu trách nhiệm cho sự biến thiên liều của chống đông đường uống ở người bệnh da trắng và trong đó các SNPs của gen VKORC1 và gen CYP2C9 có vai trò quan trọng nhất [38]. Xét về phương sai liều, VKORC1 được chứng minh có ảnh hưởng lớn hơn CYP2C9 trong một số nghiên cứu gần đây [28, 17]. Tuy nhiên, liều lượng thuốc điều trị cho một cá thể được xác định bằng sự tương tác của các yếu tố di truyền và môi trường. Vì vậy, trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã nỗ lực để phát triển các thuật toán hướng dẫn liều điều trị dựa trên các yếu tố di truyền cũng như lâm sàng [13]. Điều này cho thấy dược di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc hướng dẫn liều điều trị cho các thuốc thuộc họ coumarin. Đa số các công bố hiện nay nghiên cứu nhiều về dược di truyền của warfarin, trong khi đó những hiểu biết về dược di truyền với thuốc acenocoumarol còn rất hạn chế. Năm 2016, Kalpana S.R và cộng sự đã chỉ ra mối liên hệ giữa đa hình di truyền gen của VKORC1, CYP2C9 với liều acenocoumarol sử dụng cho người bệnh [28]. Tác giả Van Schie và cộng sự công bố chi tiết về các thuật toán tiên lượng liều sử dụng cho acenocoumarol và phenprocoumon có sự khác biệt đáng kể so với thuật toán tiên lượng liều sử dụng cho warfarin [43]. Đây là một nghiên cứu trong chuỗi nghiên cứu về gen mã hóa cho enzym ảnh hưởng đến xác định liều thuốc chống đông. 1.4. Tổng quan về đa hình CYP2C9*3 1.4.1. Enzym CYP2C9 Cytochrom P450 (CYP) là siêu họ enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa phần lớn các thuốc được sử dụng trên lâm sàng hiện nay như: thuốc chống ngưng tập tiểu cầu (clopidogrel), chống động kinh (phenytoin) trong đó CYP2C9 là enzym đóng vai trò quan trọng trong oxy hóa các hợp chất nội và ngoại sinh, đồng thời là enzym tham gia chuyển hóa thuốc acenocoumarol. Hàng trăm loại thuốc điều trị được chuyển hóa bởi CYP2C9 tại gan, bao gồm cả các loại thuốc có chỉ định điều trị hẹp như acenocoumarol, warfarin và phenytoin và các loại thuốc khác như tolbutamide, losartan, glipizide, cũng như một số loại thuốc chống viêm không steroid. Ngoài ra CYP2C9 tham gia chuyển hóa các hợp chất nội sinh quan trọng như 5 -hydroxytryptamine thành epoxygenase hoạt động, các axit béo không bão hòa thành một loạt các sản phẩm có hoạt tính sinh học. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  18. Gen CYP2C9 là một trong nhiều gen CYP2C nằm trong một khu vực có kích thước khoảng 500 kb ở vị trí số 23 trên cánh dài nhiễm sắc thể số 10 (10q23.33). CYP2C9 có tính đa hình cao. Hơn 50 nucleotit polymorphisms (SNPs) đã được tìm thấy trên vùng mã hóa của gen CYP2C9 [21]. Một số SNP đã được chứng minh là có liên quan tới việc làm giảm hoạt tính khử của enzym so với dạng kiểu dại. 1.4.2. Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3 Đa hình đơn nucleotit (Single nucleotit polymorphism – SNP) là những vị trí nằm trong hệ gen của người, mà ở những cá thể khác nhau lại xuất hiện một loại nucleotit khác nhau (A, T, G hoặc C). Mỗi vị trí được coi là một SNP chỉ khi tần số ít nhất xuất hiện một alen phải lớn hơn hoặc bằng 1 %. Mặc dù về lý thuyết, có thể xuất hiện 1 trong 4 loại nucleotit, song thông thường SNP lại chỉ xuất hiện 2 loại alen [45]. Nguyên nhân là do SNP bắt nguồn từ một đột biến điểm xảy ra trong hệ gen, chuyển một nucleotit này sang một nucleotit khác. Nếu đột biến được xảy ra trong tế bào sinh sản của cơ thể, thì sẽ có các thế hệ sau ra đời mang đột biến này, và qua nhiều thế hệ sẽ hình thành SNP trong quần thể. Nhiều SNP có thể giúp dự đoán đáp ứng của từng cá nhân với các loại thuốc điều trị, tính nhạy cảm với các yếu tố môi trường và nguy cơ mắc một số bệnh, cũng như theo dõi các bệnh lý di truyền theo gia đình [43]. Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3 (c.1075 A > C) hay rs1057910 là đột biến đồng hoán A thay thế bằng C. Đột biến này làm khung đọc mARN bị ngắn hơn bình thường và tạo ra dạng enzym không có hoạt tính. Alen CYP2C9*3 là dạng alen đột biến CYP2C9 phổ biến nhất. Tại vị trí đa hình này tạo ra 3 trường hợp kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại AA, dị hợp tử AC và đồng hợp tử kiểu đột biến CC. 1.4.3. Tổng quan phương pháp nghiên cứu Tách DNA tổng số Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số. Nguyên lý của kit này dựa trên sự hấp thụ chọn lọc của các acid nucleic vào màng silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải phóng DNA; DNA liên kết với màng silica-gel; loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer; và thu DNA. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  19. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Nguyên lý của kỹ thuật PCR là dùng enzym polymerase để tổng hợp nên hai phân tử DNA mới từ 1 phân tử DNA khuôn ban đầu sau mỗi chu kỳ. Thành phần chính của phản ứng gồm có DNA khuôn, cặp mồi, dung dịch đệm, 4 loại deoxyrinucleotit triphosphate (dA, dT, dG, dC), DNA polymerase. Chu trình nhiệt gồm 3 giai đoạn chính. Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95 °C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép. Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống tới nhiệt độ gắn mồi, tạo điều kiện cho tự bắt cặp của mồi vào sợi DNA khuôn. Nhiệt độ này phụ thuộc vào thành phần và số lượng nucleotit của cặp mồi. Giai đoạn kéo dài: Tại 72 oC, DNA polymerase sẽ hoạt động tổng hợp lên mạch polynucleotit mới dựa vào mạch khuôn và sử dụng 4 loại deoxynucleotit triphosphate [21, 43]. Sau n chu kỳ, từ một phân tử DNA ban đầu sẽ tổng hợp được 2n phân tử DNA mới. Đánh giá chất lượng DNA bằng đo hấp thụ quang và điện di Sản phẩm DNA sau quy trình tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp đo hấp thụ quang. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định. Để tính nồng độ DNA cần xác định giá trị mật độ đo quang ở bước sóng 260 nm (OD260). Trong đó, 1 đơn vị OD260 tương ứng dung dịch có nồng độ 50 ng/ml DNA sợi đôi [1]. Trong khi đó, protein hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 280 nm (OD280) do có cấu trúc vòng thơm của axit amin tryptophan. Độ tinh sạch của dịch chiết DNA được xác định thông qua tỉ số OD260/OD280 hay còn kí hiệu là OD260/280. Nếu tỉ số này trong khoảng 1,8 - 2,2, dung dịch DNA được coi là có độ tinh sạch cao, ít tạp nhiễm. Nếu OD260/280 > 2,2 thì dung dịch DNA đã bị biến tính hoặc phân hủy. Nếu OD260/280 < 1,8 thì dung dịch DNA có lẫn nhiều tạp chất [3]. Chất lượng DNA còn có thể kiểm tra bằng phương pháp điện di. Nguyên lý của điện di dựa trên nguyên tắc hoạt động nhờ vào sức kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của giá thể. Dung dịch đệm là môi trường dẫn điện và tạo điện trường. Dưới tác động của điện trường, các phân tử khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ xoắn và hình dạng phân tử (mạch thẳng hay vòng) sẽ di chuyển qua giá thể (gel agarose hay gel polyacrylamide) với tốc độ khác nhau. Sau khi điện di kết thúc, các phân tử có thể quan sát được nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang (như ethidium bromide). Độ sáng, số lượng băng, hình dạng băng (thẳng gọn hay không) là các yếu tố giúp đánh giá chất lượng DNA. Cuối cùng, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  20. kích thước băng điện di của mẫu có thể ước lượng thông qua so sánh vị trí của băng DNA với các băng đã biết kích thước trên thang chuẩn DNA [1]. Xác định kiểu gen của từng SNP bằng phương pháp giải trình tự Giải trình tự của gen là phương pháp giúp phát hiện trình tự sắp xếp của bốn loại nucleotit trên phân tử DNA. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự DNA hiện nay đều dựa trên phương pháp Sanger: bổ sung các dideoxynucleotit (ddNTP) lần lượt tương ứng với mỗi loại nucleotit A – T – G – C, tức là các nucleotit đã mất cả 2 nhóm OH ở vị trí C2 và C3 của phân tử đường pentose. Khi ddNTP được gắn vào mạch, do thiếu nhóm C3’- OH nên sự tổng hợp mạch đơn sẽ dừng lại tại đó và tạo ra các đoạn DNA khác nhau (mô tả trong Hình 1.3) [1]. Hình 1.3 Phương pháp giải trình tự tự động Trong phương pháp Sanger, phản ứng được chia làm 4 ống nghiệm tách biệt, trong mỗi ống gồm một hỗn hợp 4 loại dNTP thông thường, một trong những loại dNTP này được đánh dấu phóng xạ để phát hiện mạch mới đang tổng hợp. Ngoài ra, mỗi loại ddNTP sẽ được thêm vào lần lượt mỗi ống với nồng độ bằng 1/10 loại tương ứng. Khi tổng hợp mạch mới, dNTP sẽ tham gia, cùng với đó là ddNTP mỗi loại, nhưng với nồng độ thấp, làm kết thúc quá trình sao chép. Do đó hình thành hỗn hợp nhiều phân tử DNA được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’ @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  21. nhưng khác nhau về chiều dài và nucleotit kết thúc ở đầu 3’. Sản phẩm này sẽ được phân tách trên gel polyacrylamide và đọc trình tự theo thứ tự băng xuất hiện. Máy giải trình tự gen tự động hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến. Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại. Máy bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu. Các vạch điện di trong mao quản sẽ đi qua một chùm tia sáng laser. Hệ thống nhận diện tín hiệu màu sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotit A, T, C, G. Ưu điểm của giải trình tự tự động là khả năng tự động hóa phần lớn các bước, tốc độ đọc và mức độ chính xác rất cao. Tuy nhiên hạn chế là không đọc được các trình tự quá ngắn, sai số tăng lên khi đoạn DNA dài hơn 1000 bp, hoặc các đoạn DNA mang nhiều trình tự lặp có xu hướng bị nén lại khi chạy qua cột chứa gel nên có các pic ở các vùng lặp đó lồng vào nhau, khó xác định trình tự chính xác [21, 43]. Hiện nay tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về dược di truyền liên quan tới các gen chuyển hóa acenocoumarol. Từ những dữ liệu ở trên, trong khuôn khổ đề tài này, tôi chọn CYP2C9*3 (1075 A > C) là đối tượng nghiên cứu chính đồng thời chọn phương pháp giải trình tự bằng máy tự động để xác định đa hình di truyền CYP2C9*3 trên người bệnh thay van tim sử dụng acenocoumarol. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  22. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh 100 Người bệnh mắc bệnh van tim có chỉ định thay van tim cơ học tại Bệnh viện Tim Hà Nội tham gia cung cấp mẫu. Tiêu chuẩn chọn người bệnh theo Khuyến cáo của Hội Tim mạch học Việt Nam [2]. 2.1.2. Các tiêu chuẩn loại trừ Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng; Huyết động không ổn định; Tai biến mạch não dưới 3 tháng; Mới phẫu thuật dưới 1 tuần; Chống chỉ định dùng thuốc chống ngưng tập tiểu cầu; Nguy cơ cao chảy máu; Suy thận, suy gan giai đoạn cuối; Không đồng ý tham gia nghiên cứu. 2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 6/2018. Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.2. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 2.2.1. Hóa chất E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega – Biotek); Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck); Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate (hãng Affymetrix); Nước khử ion (hãng Omega Bio-tek); 6X DNA loading dye (Thermo Scientific); Cặp mồi được đặt tổng hợp tại công ty Phusa Biochem (Việt Nam); dNTPMix 2mM mỗi loại (hãng Thermo Scientific); Phusion DNA Polymerase (hãng Thermo Scientific); DNA marker 100bp-4kb (Lonza); Lamda/HindIII DNA Ladder (hãng Thermo Scientific). 2.2.2. Thiết bị Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Máy lắc VELP Scientifica (Châu Âu); Tủ lạnh sâu Panasonic (Nhật Bản); Máy quang phổ NP 80 Nanophotometer (Implen, Đức); Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ); Máy soi gel Cole-Parmer (Mỹ); Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  23. 2.3. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ thể hiện trong Hình 2.1. Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.3.1. Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm Về lượng mẫu: 2 ml máu lấy từ tĩnh mạch được chia đều vào 3 ống chuyên dụng chứa sẵn EDTA chống đông (tối thiểu 300 µL máu/ống). Mỗi ống máu đủ cho 1 lần tách DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu và có thể lặp lại việc tách DNA tổng số đến khi xác định được kiểu gen của người bệnh. Cách bảo quản: Mẫu máu được giữ lạnh ở -20 đến -300C cho đến khi được sử dụng. Nếu không có tủ lạnh -200C, mẫu cần được giữ ở ngăn đá tủ lạnh dân dụng hoặc trong đá không quá 1 ngày và không được giã đông trước khi tách DNA hoặc chuyển đến nơi có tủ -200C để bảo quản. Kí hiệu mẫu: Ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin: mã người bệnh, tên, tuổi, ngày lấy mẫu. Thông tin về mẫu máu của người bệnh phải được lưu trong sổ @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  24. với các thông tin: tên, tuổi, mã người bệnh, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA. 2.3.2. Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit Các bước thao tác được tiến hành như sau: Bước 1. Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất về nhiệt độ phòng. Bước 2. Lắc đều ống máu. Chuyển 250µL mẫu vào ống ly tâm vô trùng Bước 3. Thêm 25 µL OB Protease Solutionvà 250 µL BL Buffer, vortex 10 giây Bước 4. Ủ 65 oC trong 10 phút. Sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15 giây Bước 5. Thêm 260 µL Ethanol 100%. Vortex trong 20 giây Bước 6. Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 15 giây để đảm bảo mẫu không dính trên thành và nắp ống Bước 7. Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 mL Bước 8. Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µL) Bước 9. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 10. Bỏ dịch lọc và Collection Tube Bước 11. Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2mL mới Bước 12. Thêm 500 µL HBC Buffer Bước 13. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 14. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube Bước 15. Thêm 700 µL DNA Wash Buffer Bước 16. Ly tâm trong 1 phút ở 14.000 vòng/phút Bước 17. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube Bước 18. Lặp lại các bước 14-16 cho bước rửa thứ 2 với DNA Wash Buffer Bước 19. Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 vòng/p trong 2 phút để làm khô cột Bước 20. Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2mL mới Bước 21. Thêm 100 µL Elution Buffer (đã làm ấm đến 65 oC). Ủ ở 65 oC trong 5 phút @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  25. Bước 22. Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 23. Thêm 50 µL Elution Buffer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Bước 24. Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 25. Thu và bảo quản DNA ở -20 oC 2.3.3. Khuếch đại đoạn gen đích chứa CYP2C9*3 Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tôi tiến hành xác định nhiệt độ gắn mồi, nồng độ hoạt động tối ưu của các thành phần trong phản ứng PCR sử dụng Phusion polymerase (Thermo Scientific). Đoạn mồi tự thiết kế được đặt tổng hợp tại Công ty Phusa Biochem (Việt Nam) có trình tự lần lượt là: mồi xuôi 5’ GCA TCT GTA ACC ATC CTC TC 3’ và mồi ngược 5’ GTG TCA AGA TTC AGT TCT TTC C 3’. Dựa trên trình tự DNA tham chiếu trên Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia- Mỹ (National Center for Biotechnology Information - NCBI), đoạn DNA nhân dòng có độ dài lý thuyết được xác định là 719 bp. 2.3.4. Kiểm tra chất lượng DNA DNA tổng số và sản phẩm PCR sẽ được đánh giá chất lượng thông qua hai phương pháp được mô tả bên dưới. Đánh giá chất lượng DNA thông qua phương pháp đo quang Bước 1. Khởi động máy, chọn chế độ đo nồng độ DNA. Bước 2. Đo mẫu trắng: lấy 2 µL Elution buffer dùng để pha loãng DNA làm dung dịch đo mẫu trắng. Bước 3. Đo mẫu DNA: lấy 2 µL mỗi mẫu DNA để đo, máy sẽ tự động tính toán nồng độ DNA và độ tinh sạch dựa vào giá trị OD260 và OD280 thu được. Đánh giá chất lượng DNA thông qua điện di trên gel agarose Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5 %: Cho 1,5 g agarose pha trong 100 ml đệm TAE 1X. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội đến 50 – 60 oC thì đổ vào khay điện di có cài sẵn răng lược để tạo các giếng tra mẫu. Sau khoảng 30 phút, gel đã đông lại, gỡ lược ra và đặt bản gel vào bể điện di, phần giếng nằm gần phía cực âm của máy. Đổ đệm TAE 1X vào bể điện di ngập cách mặt gel 1 – 2 mm. Bước 2: Tra mẫu DNA: 5 µL mẫu DNA được trộn với 1 µL 6X DNA loading dye đã nhuộm Ethidim Bromua trước@ School khi tra vào of giếng Medicine. 5 µL thang and chuẩn Pharmacy, VNU 17
  26. DNA được tra vào mỗi giếng: Lamda/HindIII DNa Ladder với DNA tổng số và DNA marker 100bp-4kb (Lonza) với sản phẩm PCR. Bước 3: Chạy điện di với hiệu điện thế 100 V trong 40 phút. Bước 4: Quan sát kết quả: Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra khỏi khuôn, soi dưới ánh sáng tử ngoại trong hệ thống phân tích kết quả Gel-DocIt. Các mẫu có chất lượng tốt là các mẫu cho băng điện di sáng, rõ. 2.3.5. Giải trình tự DNA Do trình tự điểm đột biến của CYP2C9*3 không có trình tự nhận biết cho enzym cắt giới hạn. Vì vậy tôi sử dụng phương pháp giải trình tự gen để xác định kiểu gen CYP2C9*3. 25 µL sản phẩm PCR được tinh sạch bằng E.Z.N.A.® Cycle- Pure Kit (Omega-biotek) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm sau khi tinh sạch được gửi đi hãng First Base (Malaysia) để giải trình tự Sanger. Kết quả giải trình tự gen được kiểm tra bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9, qua đó xác định kiểu gen của từng người bệnh. Kết quả giải trình tự gen tốt cần đảm bảo những yêu cầu: bốn loại nucleotit được phân biệt bởi các màu khác nhau (ví dụ: màu đen là Guanine (G), màu xanh nước biển là Cytosine (C), màu xanh lá cây là Adenine (A) và màu đỏ là Thymine (T). Tín hiệu huỳnh quang của các nucleotit là các đỉnh màu đơn, rõ ràng, không có tín hiệu nhiễu (hoặc có tín hiệu nhiễu nhưng nền nhiễu thấp). 2.3.6. Phân tích kết quả và xử lý số liệu Dựa trên kiểu gen của từng người bệnh được xác định thông qua giải trình tự, đa hình của CYP2C9*3 được phân tích và xác định tính dựa trên hai thông số: tần số kiểu gen và tần số alen. Trong nghiên cứu này, locut có 2 alen A và C có tần số tương ứng là pA và qC. x, y, z là tần số từng kiểu gen. Ta có: xAA + yAC + zCC = 1 Vậy tần số alen A, C được tính như sau: pA = x + ; qC = z + 2 2 Quần thể được coi là đạt trạng thái cân bằng theo định luật Hardy-Weinberg khi thỏa mãn: p2AA + 2pqAC + q2CC = 1. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  27. Để kiểm tra quần thể trong nghiên cứu có đạt trạng thái cân bằng Hardy- Weinberg hay không, tôi sử dụng phép thử χ2. Tần số kiểu gen thu được từ thực nghiệm được coi là không có sự ý nghĩa khác biệt có ý nghĩa thống kê với tần số kiểu gen lý thuyết (đạt cân bằng Hardy-Weinberg) nếu giá trị p > 0,05. 2.4. Đạo đức nghiên cứu Người bệnh trước khi tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ về mục đích và mục tiêu nghiên cứu, cũng như lợi ích của nghiên cứu và những ảnh hưởng bất lợi của nghiên cứu tới người bệnh. Các thông tin của người bệnh được đảm bảo bí mật tuyệt đối và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  28. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng DNA 100 mẫu máu toàn phần được lấy từ tĩnh mạch của người bệnh sau phẫu thuật thay van tim có điều trị chống đông bằng thuốc acenocoumarol tại Bệnh viện Tim Hà Nội đã được tách chiết DNA tổng số thành công. Kết quả điện di DNA tổng số 10 người bệnh đầu tiên quan sát ở Hình 3.1 cho thấy các băng DNA tổng số đều lên sáng rõ. Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số 10 người bệnh trong nhóm nghiên cứu. Làn 1-10: DNA tổng số của 10 người bệnh. Làn M: Lamda/HindIII DNA ladder Kết quả đo quang phổ hấp thụ ở các bước sóng 260 nm và 280 nm để đánh giá chất lượng 100 mẫu thu được trình bày ở Bảng 3.1. Mỗi mẫu được đo 2 lần và lấy giá trị trung bình. Nồng độ DNA thu hồi dao động trong khoảng từ 41,15 đến 133,90 ng/µL, trung bình 111,0 ± 47,7 ng/µL. Mẫu có độ tinh sạch cao, với 90/100 mẫu có chỉ số OD nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,2. Tỉ số OD260/280 trung bình là 2,02 ± 0,01, chứng tỏ các mẫu này tương đối sạch. Như vậy DNA được tách chiết đạt yêu cầu cho phản ứng khuếch đại DNA bằng PCR tiếp theo. Bảng 3.1 Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số Chỉ số Giá trị trung bình ± sai số SE Nồng độ DNA (ng/µL) 111,0 ± 47,7 OD260/280 2,02 ± 0,01 3.2. Khuếch đại đoạn gen chứa CYP2C9*3 Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định cho CYP2C9, nhiệt độ gắn mồi, nồng độ DNA sử dụng và và nồng độ hoạt động của mồi được tiến hành tối ưu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  29. 3.2.1. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi với enzym Phusion Polymerase 10 nhiệt độ dao động quanh nhiệt độ gắn mồi được hãng khuyến cáo được thử nghiệm. Kết quả điện di trình bày ở Hình 3.2. Ở dải nhiệt độ từ 50,8-56,6 oC xuất hiện các băng điện di không đặc hiệu. Ở nhiệt độ 67,2 - 69,0 oC băng điện di giảm độ sáng hoặc không lên băng. Trong dải nhiệt độ 58,8 - 65,5 oC băng điện di lên đặc hiệu và sáng rõ nhất. Do đó, tôi chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng nhân dòng đoạn gen chứa CYP2C9*3 trong dải 58,8 - 65,5 oC. Dải nhiệt độ gắn mồi rộng cho phép có thể chạy ghép nhiều phản ứng nhân dòng các gen khác nhau nhưng cho chu trình nhiệt trùng nhau. Hình 3.2 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi nhân dòng alen CYP2C9*3. Làn M: DNA marker 100bp-4kb. Làn (-): đối chứng âm. Làn (+): đối chứng dương. 3.2.2. Tối ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA Hình 3.3 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối ưu nồng độ mồi (A)và nồng độ DNA (B) nhân dòng alen CYP2C9*3. Làn M: DNA marker 100bp-4kb. Làn ĐC (-): đối chứng âm. Thực hiện PCR ở các nồng độ DNA lần lượt là: 5, 10, 50, 100 và 200 ng/μl cho kết quả điện di như ở Hình 3.3. N@ồng School độ DNA choof lênMedicine băng kích thước and rõ Pharmacy, VNU 21
  30. trong khoảng từ 5-200 ng/µL, không có băng phụ xuất hiện, chứng tỏ phương pháp có độ nhạy cao, có thể nhân dòng đoạn gen với nồng độ DNA rất thấp. Tiếp tục PCR ở các nồng độ mồi lần lượt là: 0,5; 0,7; 0,9 µM. Hình 3.3 cũng cho thấy nồng độ mồi 0,5 µM, các băng điện di xuất hiện khá rõ nét ở kích thước tương ứng 719 bp như lý thuyết và không có băng phụ. Như vậy, nồng độ DNA của phản ứng nhân dòng CYP2C9*3 tối ưu trong khoảng 5-200 ng/μl, nồng độ hoạt động của mồi tối ưu là 0,5 µM. Phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa CYP2C9*3 có thành phần và điều kiện phản ứng sau khi tối ưu được trình bày trong Bảng 3.2. Bảng 3.2. Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen CYP2C9*3 Nồng độ Thể tích phản Thành phần Điều kiện phản ứng hoạt động ứng (30 µl) DNA khuôn 100 ng/µl 1,5 - Biến tính: dNTP mix 2 mM 0,2 mM 3,0 98 0C – 3 phút. 5X HF buffer 1 X 6,0 - 35 chu kỳ: Mồi F 10 mM 0,5 µM 1,5 + 98 0C – 10 giây; Mồi R 10 mM 0,5 µM 1,5 + 63 0C – 30 giây; Phusion polymerase 2 u/µl 0,02 u/µl 0,3 + 72 0C – 30 giây - Kết thúc: Nước khử ion 16,2 72 0C – 2 phút. Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CYP2C9*3 trên gel agarose 1,5 %. Làn M: DNA marker 100bp-4kb, Làn 1-3: sản phẩm PCR của 3 mẫu người bệnh, Làn 4: Đối chứng âm. Áp dụng quy trình trên, 100 người bệnh tham gia nghiên cứu đều được nhân dòng thành công đoạn gen chứa đa hình CYP2C9*3, kết quả sản phẩm thu được ổn định, đặc hiệu với 1 băng sáng rõ như ví@ dụ Schooltrong Hình of 3.4. Medicine Tất cả các thí nghiệmand Pharmacy, VNU 22
  31. đều có đối chứng âm không lên, chứng tỏ phản ứng PCR không bị nhiễm trong quá trình thao tác. 3.3. Giải trình tự vùng gen chứa CYP2C9*3 Kết quả giải trình tự trong nghiên cứu được trình bày trong Hình 3.5. Trong nhóm người bệnh tham gia nghiên cứu, người bệnh mang kiểu gen đồng hợp đột biến CC chưa thấy xuất hiện. Kết quả tần số alen và tần số kiểu gen thể hiện ở Bảng 3.3. Kiểu AA AC CC gen (đồng hợp tử kiểu dại) (dị hợp tử) (đồng hợp tử đột biến) Hình Chưa xuất ảnh hiện trong 100 mẫu Hình 3.5. Kiểu gen CYP2C9*3 xác định thông qua giải trình tự Bảng 3.3. Kết quả tần số alen và tần số kiểu gen CYP2C9*3 SNP Tần số kiểu gen (%) Tần số alen CYP2C9*3 CC AC AA A C Giá trị p (n = 100) 0 4 % 96 % 0,98 0,02 0,84 Kết quả xác định và phân tích kiểu gen của CYP2C9*3 (n = 100) cho thấy: kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại AA chiếm tỉ lệ 96 % và chỉ có 4 % người bệnh mang kiểu gen dị hợp tử AC. Từ đó, tôi tính được tần số xuất hiện của alen C là 0,02, alen A là 0,98. Kiểm định với X2 = 0,0416, giá trị p = 0,84. Như vậy, tần số các alen thu được trong nghiên cứu này phù hợp theo định luật Hardy-Weinberg, chứng tỏ cấu trúc di truyền của các alen này có thể đã trở nên ổn định trong nhóm mẫu nghiên cứu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  32. CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 4.1. So sánh tần số CYP2C9*3 ở các quần thể khác nhau Theo kết quả của dự án 1000 genome giai đoạn 3 đã được công bố [49], tần số alen C tại các quần thể được báo cáo và thể hiện trong Hình 4.1. Nghiên cứu này 0,02 Tp Hồ Chí Minh 0,035 Đông Á 0,034 Nam Á 0,109 Châu Âu 0,073 Châu Phi 0,002 Châu Mỹ 0,037 0,000.00 0.020,02 0.040,04 0,060.06 0.08 0,08 0.100,10 0,120.12 Hình 4.1. Tần số alen C của CYP2C9*3 trên một số quần thể người. Tần số alen C ở các quần thể khác được lấy từ tài liệu số 48 Quan sát biểu đồ phân bố alen C ở một số quần thể người nhận thấy: nếu như tần số alen C xuất hiện rất ít ở các quần thể người Châu Phi (0,2%) thì ở quần thể người Châu Âu con số đó chiếm hơn 7 %, còn với khu vực Nam Á tần số này tăng tới hơn 10 %. Tần số ở khu vực Đông Á tương đồng gần nhất với kết quả nghiên cứu của tôi, điều này có thể giải thích do dự gần gũi về mặt địa lý. Nghiên cứu của tôi trên nhóm người bệnh cho tần số alen C là 2 %, ở quần thể người bình thường tại Tp. Hồ Chí Minh tần số alen C là 3,5 % [49]. Tuy nhiên sự khác nhau giữa nhóm bệnh và nhóm bình thường này là không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Điều này được giải thích rằng đột biến CYP2C9*3 không phải đột biến gây bệnh, mà là đột biến liên quan đến chuyển hóa thuốc, do đó giữa 2 nhóm sẽ không có sự khác nhau có ý nghĩa. Kết quả nghiên cứu cho thấy alen A chiếm tỉ lệ rất lớn trong quần thể với 98 %. Kiểu gen chuyển hóa bình thường AA 96 %, chuyển hóa chậm AC 4 %, và không xuất hiện kiểu gen CC cho thấy khả năng đáp ứng thuốc chống đông kháng vitamin K ở người Việt Nam là tương đối @ tốt. School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  33. 4.2. Các phương pháp phân tích CYP2C9*3 được sử dụng hiện nay Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định kiểu gen của đa hình di truyền đã được nghiên cứu và chứng minh hiệu quả như: giải trình tự gen, kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (RFLP), PCR định lượng (Realtim PCR) Tuy nhiên, giải trình tự gen vẫn là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất, đặc biệt là với các gen mới, cần hiểu thêm thông tin di truyền về các đột biến trong đó. Ưu điểm của phương pháp giải trình tự gen: kỹ thuật ngày càng phổ biến, chi phí ngày càng hạ. Có thể nói hiện nay giải trình tự vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định các đột biến điểm tại Việt Nam. Hình 4.2 Nguyên lý của phương pháp PCR-CTPP. a: độ dài của alen X; b: độ dài của alen Y; c = a + b - (d - 1): độ dài giữa mồi 1F và 2R; d: tổng chiều dài của 2 mồi 2F và 1R [41]. Ngoài giải trình tự, một số phương pháp phân tích CYP2C9*3 khác đã được các nhóm nghiên cứu khác nhau trên thế giới thực hiện. Nghiên cứu của Tamura và cộng sự tại Nhật Bản (2014) thực hiện phân tích đa hình CYP2C9*3 bằng phương pháp phản ứng chuỗi polymerase với các cặp mồi kép (PCR-CPTT). Nguyên lý của phương pháp này là nhân dòng gen dựa trên 4 đoạn mồi (2 cặp mồi) là F1 và R1 cho alen X, F2 và R2 cho alen Y . Phản ứng PCR khuếch đại tạo ra 3 đoạn DNA có kích thước khác nhau nằm giữa F1 và R1, giữa F2 và R2 và giữa F1 và R2. Nguyên lý của phương pháp thể hiện ở Hình 4.2. Chu trình nhiệt họ sử dụng là biến tính: 95 ºC – 10 phút – 1 chu kỳ; 30 chu kỳ: 95 ºC – 1 phút, 62 ºC – 10 giây, 72 ºC – 1 phút; kết thúc: 72 độ C – 5 phút – 1 chu kỳ. Kết quả điện di xác định 3 kiểu gen như sau: kiểu gen *1/*1 (hay AA) cho 2 băng là 125@ vàSchool 287 bp, kiểu of genMedicine *1/*3 (hay AC) and cho Pharmacy, VNU 25
  34. 3 băng là 125, 200 và 287 bp, kiểu gen *3/*3 (hay CC) cho 2 băng là 200 và 287 bp. Tuy nhiên đây là kỹ thuật yêu cầu kỹ thuật viên có trình độ thao tác cao nếu không phản ứng PCR không ổn định, kết quả sẽ không chính xác. Ngoài ra Realtime PCR (hay còn gọi là PCR định lượng – qPCR) là kỹ thuật mới dựa trên phản ứng PCR cũng ngày càng được sử dụng nhiều. Người thực hiện sẽ theo dõi sự khuếch đại của một phân tử DNA đích sau từng chu kỳ nhiệt của phản ứng, không phải ở cuối phản ứng như PCR thông thường. Realtime PCR có cùng nguyên lý với phương pháp PCR nhưng có sử dụng chất phát huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang được phát hiện ngay trong bước bắt cặp mồi và kéo dài chuỗi DNA [7]. Một số nhóm nghiên cứu sử dụng qPCR để xác định kiểu gen CYP2C9*3 có thể kể đến như nghiên cứu của Sangviroon (Đại học Chulalongkorn, Thái Lan) sử dụng qPCR với đầu dò phát huỳnh quang fluorogen [37]. Một nhóm nghiên cứu khác tại Mỹ cũng sử dụng qPCR phân tích 75 người bệnh trẻ tuổi để phát hiện kiểu gen CYP2C9*3 [34]. Hay nghiên cứu của Chen Jiyang sử dụng qPCR xác định kiểu gen trên nhóm 257 người bệnh Trung Quốc [20, 50]. Tuy nhiên, việc đầu tư ban đầu cho hệ thống máy Realtime PCR và các hóa chất tiêu hao có chi phí khá cao, phương pháp này lại cần kỹ thuật viên với kiến thức và kỹ năng phân tích kết quả phức tạp hơn. 4.3. Ứng dụng tính liều điều trị acenocoumarol Nghiên cứu của nhóm nghiên cứu dược lý học thuộc Hiệp hội dược sĩ Hoàng gia Hà Lan (The Royal Dutch Association for the Advancement of Pharmacy – Pharmacogenetics Working Group) đã đưa ra một số khuyến cáo về liều thuốc chống đông kháng vitamin K trên kiểu gen CYP2C9. Thông tin cụ thể được tóm tắt trong Bảng 4.1. Theo Schalekamp và cộng sự, nhóm người bệnh sự hiện diện của một alen CYP2C9* 3 thì cần giảm 20 % liều điều trị acenocoumarol ban đầu. Mức độ giảm liều cao hơn hẳn so với alen *2 (chỉ 1%) cho thấy ảnh hướng của alen *3 cao hơn *2 trong chỉ định liều dùng thuốc. Kết quả của nghiên cứu này cũng tương đồng với nghiên cứu của Visser và cộng sự, người bệnh chỉ mang 1 alen *3 nên giảm 20% liều ban đầu, chỉ mang 1 alen *2 thì nên giảm 13%, số lượng alen *2 và *3 càng tăng thì mức độ giảm liều càng mạnh, giảm liều cao nhất tới 40% khi người bệnh mang cả hai alen *2, *3. Một nghiên cứu khác của Visser cũng cho thấy tăng nguy cơ chảy máu ở người bệnh mang alen *2 và *3 gấp trung bình 1,83 lần so với người bệnh không mang 2 alen này. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  35. Bảng 4.1 Mối liên quan giữa đa hình di truyền gen CYP2C9 *3 tới chỉ định liều Acenocoumarol và nguy cơ chảy máu của một số nhóm nghiên cứu Hà Lan Số người Tài liệu tham khảo Mối liên quan tham gia Schalekamp, 2004 [39] 231 Giảm liều khi mang 1 alen: *2: 1 %, *3: 20 % Giảm liều: *1*2: 13 %, *1*3: 20 %, Visser, 2004 [46] 1124 *2*2: 28 %, *2*3: 40 % Nguy cơ chảy máu tăng 1,83 khi mang alen Visser, 2004 [47] 996 *2 và *3 Bảng 4.2 Các biến trong thuật toán tính liều acenocoumarol ở nhóm nghiên cứu người Tây Ban Nha [13] BIẾN PHÉP TOÁN Tuổi tác -0,294 BMI 0,240 Sử dụng thuốc cảm ứng hoạt hoá enzym CYP2C9 0,119 Tình trạng amiodarone -0,142 CYP2C9 * 1 / * 3 -0,257 CYP2C9 * 2 / * 2 hoặc * 2 / * 3 hoặc * 3 / * 3 -0,253 VKORC1 (kiểu gen AG) -0,150 VKORC1 (kiểu gen AA) -0,533 CYP4F2 (kiểu gen AA) 0,999 APOE (kiểu gen TT) 0,125 Một thuật toán định lượng liều acenocoumarol nghiên cứu trên nhóm 147 người bệnh người Tây Ban Nha [13] cũng đã được công bố. Với các biến và ảnh hưởng của chúng mô tả ở Bảng 4.2, bác sĩ sẽ đưa ra liều khởi đầu dựa trên khuyến cáo của đơn vị y tế, sau đó tiến hành tính@ liềuSchool cho từng of người Medicine bệnh dựa trênand tác Pharmacy, VNU 27
  36. đông của các biến ở cột 2. Nghiên cứu này cũng cho thấy, CYP2C9*3 có ảnh hưởng đến định liều acenocoumarol. Bệnh cạnh đó, một sô các biến khác cũng cần quan tâm nghiên cứu đó là tuổi tác, cân nặng và chiều cao (qua đó tính được chỉ số BMI), tình trạng sử dụng thuốc cảm ứng hoạt hóa enzym CYP2C9, tình trạng amiodarone, sự có mặt của alen CYP2C9 * 1 và * 2, kiểu gen VKORC1, kiểu gen CYP4F2, kiểu gen APOE. Xem xét trong nhóm người bệnh có các đặc điểm lâm sàng tương đồng, thuật toán dự đoán chính xác liều ổn định thực sự trong 59,8 % trường hợp, cao hơn so với mức 37,6 % trường hợp nếu chỉ dựa vào đặc điểm lâm sàng Tương tự, một thuật toán chi tiết hơn được xây dưng cho nhóm 100 người bệnh Bắc Ấn Độ [35] cũng dựa trên các yếu tố ảnh hưởng đến liều thuốc và mức độ của chúng, thuật toán tính liều chi tiết như sau: Liều lượng (mg/ngày) = 3,082 - 0,013 x (tình trạng hút thuốc, 1 cho người hút thuốc và 0 cho người không hút thuốc) - 0,433 x (giới tính, 1 cho nam và 0 cho nữ) - 0,004 x (tuổi theo năm) + chỉ định x (0,327 cho người bệnh thay van đôi và - 0,092 cho người bệnh thay van động mạch chủ) + 0,026 x (chiều cao tính bằng cm) + 0,151 x (trọng lượng tính bằng kg) – 7,660 x (diện tích bề mặt cơ thể tính bằng cm2) – 0,862 x (VKORC1 AG) – 2,257 x (VKORC1 AA) – 0,049 x (CYP2C9 * 1 / * 2 ) – 0,456 x (CYP2C9 * 1 / * 3) + 0,449 x (CYP4F2 AG) + 0,230 x (CYP4F2 AA) + 0,245 x (GGCX CG) + 1,055 x (GGCX GG). Bảng 4.3 So sánh liều trung bình mg/tuần qua phân tích từ các thuật toán của các nhóm nghiên cứu khác nhau THUẬT TOÁN LIỀU TRUNG BÌNH (mg/tuần) Liều điều trị khuyến cáo 21,31 ± 8,35 Nghiên cứu Bắc Ấn Độ [35] 21,16 ± 4,82 Nhóm nghiên cứu Thổ Nhĩ Kỳ [33] 27,16 ± 1,19 Nhóm nghiên cứu Trung Quốc [48] 27,87 ± 4,94 Thuật toán dược động học của Ấn Độ giải thích được lý do phải thay đổi liều ở người bệnh (chiếm 41,4 %, p < 0,001). Khi so sánh kết quả liều dự đoán với liều điều trị thực tế tại bệnh viện trong khu vực, họ xác nhận rằng khả năng dự đoán của liều điều trị trong thuật toán này tốt hơn các thuật toán đã được thiết lập dựa trên các biến tương tự mà các nhóm nghiên @ cứu School khác đã làm of nămMedicine 2008, chi tiết and theo Pharmacy, VNU 28
  37. Bảng 4.3. Điều này có thể giải thích do số lượng biến của họ nhiều hơn, mức độ ảnh hưởng của từng yếu tố được xem xét kỹ lưỡng, phân loại cẩn thận hơn. Khi tiến hành so sánh giữa các thuật toán được đưa ra ở trên, tôi nhận thấy có nhiều yếu tố khác nhau như chiều cao, cân nặng, kiểu gen ảnh hưởng tới liều điều trị acenocoumarol. Kết quả dự báo bằng các thuật toán dược động học cho thấy có khả năng dự đoán liều nhanh và tốt hơn chỉ dựa vào đặc điểm lâm sàng hay chỉ số cận lâm sàng của người bệnh. Nghiên cứu về các thuật toán dược động học dự đoán liều chính là cơ sở của y học cá thể hóa, đem lại chất lượng điều trị tốt nhất cho từng người bệnh. Tuy nhiên, tôi cũng nhận thấy mức độ ảnh hưởng của từng biến đến liều điều trị acenocoumarol có sự khác nhau giữa các nhóm. Chính vì vậy, tôi mạnh dạn đề xuất tiến hành nghiên cứu xác lập thuật toán phù hợp cho người bệnh Việt Nam, tiến tới định liều thuốc cho từng người bệnh trong tương lai. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  38. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Dựa vào những kết quả đạt được, tôi đưa ra một số kết luận như sau: - Quy trình phân tích kiểu gen CYP2C9*3 sử dụng mẫu máu toàn phần đã được xây dựng thành công. - Áp dụng thành công quy trình phân tích gen CYP2C9*3 trên 100 người bệnh sử dụng chống đông acenocoumarol sau thay van tim tại Bệnh viện Tim Hà Nội. Số lượng kiểu gen AA, AC lần lượt là 96% và 4%. Tần số đột biến C là 0,02. KIẾN NGHỊ Hướng tới y học cá thể hóa điều trị, cung cấp cho người bệnh chất lượng điều trị cao hơn, hạn chế biến chứng có thể xảy ra, tôi có một số kiến nghị như sau: - Mở rộng nghiên cứu xác định kiểu gen CYP2C9*3 với cỡ mẫu lớn hơn và tiến hành các nghiên cứu xác định mức độ ảnh hưởng của kiểu gen này tới sự chuyển hóa của acenocoumarol. - Tiến hành phân tích thêm tác động của các yếu tố khác như chiều cao, cân nặng, độ tuổi, các gen mới nhằm xây dựng được thuật toán giúp định lượng liều acenocoumarol cho người bệnh Việt Nam. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  39. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), "Phân tích gen và sản phẩm của gen", Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 2. Hội Tim mạch (2008), Khuyến cáo 2008 của Hội tim mạch Việt Nam về chẩn đoán điều trị các bệnh van tim. 3. Lê Thị Nhiên (2016), “ Nghiên cứu tính đa hình di truyền CYP2C19 ở người bệnh đặt Stent động mạch vành qua da”, Luận văn Thạc sĩ Dược học Đại học Dược Hà Nội. 4. Nguyễn Lân Việt (2003), Thực hành bệnh tim mạch, Nhà xuất bản Y học 5. Phạm Hùng Vân (2009), "Real-time PCR Các vấn đề cơ bản", PCR và realtime PCR. Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y học, 34-69. 6. Phạm Thị Minh Đức (2011), “ Sinh lý máu”, Sinh lý học, NXB Y học. 7. Tạ Thành Văn (2010), "Realtime PCR và PCR định lượng", PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, NXB Y học, 33-66. 8. Võ Thị Thương Lan (2007), "Phản ứng PCR", Một số vấn đề của sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 86-88. TIẾNG ANH 9. Abhijit Trailokya, JS Hiremath, JPS Sawhney và các cộng sự. (2016), “Acenocoumarol; A Review of Anticoagulant Efficacy and Safety”, Journal of The Association of Physiccian of India, 64. 10. Alec Vahanican, Ottavio Alfrieri, Felicita Andreotti và các cộng sự. (2012), “Guideline onthe management of valvular heart disease”, European Heart Journal, 33, tr. 2451-2496. 11. Ansell J, Hirsh J, Hylek E và các cộng sự. (2008), “ Pharmacology and management of the vitamin K antagonists: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines (8th Edition)”, Chest 133, tr. 160S– 98S. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  40. 12. Arant TW Sullivan PW, Ellis SL, Ulrich H (2006), “The cost effectiveness of anticoagulation management services for patients with atrial fibrillation and at high risk of stroke in the US”, Pharmacoeconomics 24, tr. 1021– 1033. 13. Borobia, A. M., Lubomirov, R., Ramírez, E., Lorenzo, A., Campos, A., Muñoz-Romo, R., & Carcas, A. J. (2012). “An acenocoumarol dosing algorithm using clinical and pharmacogenetic data in Spanish patients with thromboembolic disease”. PloS one, 7(7), e41360. 14. Bourguignon T., Bergöend E., Mirza A và các cộng sự. (2011), “Risk factors for valve-related complications after mechanical heart valve replacement in 505 patients with long-term follow up”, J Heart Valve Dis, 20(6), tr. 673-80. 15. Budnitz DS, Pollock DA, Weidenbach KN và các cộng sự. (2006), “National surveillance of emergency department visits for outpatient adverse drug events” JAMA, 2006( 296), tr. 1858–66. 16. C Nashimura A., atherin M. Otto, Paul Soraja và các cộng sự. (2014), “Guideline for the Management of Patients With Valvular Heart Disease”, Journal of the Ameriacan College of Cardilogy, 63(22). 17. Camm AJ và cộng sự (2012), “An update of the 2010 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation”, Euro Heart 33, tr. 2719–47. 18. Cannegieter SC, Rosendaal FR và Briet E (1994), “ Thromboembolic and bleeding complications in patients with mechanical heart valve prostheses”, Circulation 89, tr. 635–41. 19. Connock M, Stevens C, Fry-Smith A và các cộng sự. (2007), “Clinical effectiveness and cost-effectiveness of different models of managing long- term oral anticoagulation therapy: a systematic review and economic modelling”. Health Technol Assess 11. 20. Chen Jiyang, Cai Yun, Chen Shuyun, & Li Pengyu. (2011). “Study on the relationship between CYP2C9 gene polymorphism and warfarin application dose”. 21. Drittij MJ Thijssen HH, Vervoort LM, de Vries-Hanje JC (2001), “Altered pharmacokinetics of R- and S-acenocoumarol in a subject heterozygous for CYP2C9*3”, Clin Pharmacol Ther, 70, tr. 292–8. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  41. 22. ElBardissi AW, Wiegmann DA, Dearani JA và các cộng sự. (2007), “Application of the human factors analysis and classification system methodology to the cardiovascular surgery operating room”, Ann Thorac Surg, 83(4), tr. 1412-8; discussion 1418-9. 23. Halfon P, Bourlière M, Pénaranda G, và cộng sự. (2006), "Real-Time PCR Assays for Hepatitis C Virus (HCV) RNA Quantitation Are Adequate for Clinical Management of Patients with Chronic HCV Infection", Journal of Clinical Microbiology. 44(7), 2507-2511. 24. Hart RG, Pearce LA và Aguilar MI (2007), “Meta-analysis: antithrombotic therapy to prevent stroke in patients who have nonvalvular atrial fibrillation”, Ann Intern Med, 146, tr. 857–67. 25. Hermida, J., Zarza, J., Alberca, I., Montes, R., López, M. L., Molina, E., & Rocha, E. (2002). “Differential effects of 2C9* 3 and 2C9* 2 variants of cytochrome P-450 CYP2C9 on sensitivity to acenocoumarol”. Blood, 99(11), 4237-4239. 26. Ishtyak Ahmed Mir (2015), “Role of Acenocoumarol In Prothestic Heart Valves”, Journal Of Intenational Medicine and Dentistry, 2(3), tr. 180-185. 27. JS Hiremath Abhijit Trailokya, JPS Sawhney và cộng sự (2016), “Acenocoumarol: A Review of Anticoagulant Efficacy and Safety”, Journal of The Association of Physiccian of India, 64. 28. Kalpana S.R., Bharath G., Manjunath C.N., và cộng sự. (2016). “Influence of VKORC1 and CYP2C9 Polymorphisms on Daily Acenocoumarol Dose Requirement in South Indian Patients With Mechanical Heart Valves”. Clin Appl Thromb, 1-7. 29. Leendertse AJ, Egberts AC, Stoker LJ và các cộng sự. (2008), “ Frequency of and risk factors for preventable medication-related hospital admissions in the Netherlands”, Arch Intern Med 168, tr. 1890–6. 30. Makeeva, O., Stepanov, V., Puzyrev, V., Goldstein, D. B., & Grossman, I. (2008). “Global pharmacogenetics: genetic substructure of Eurasian populations and its effect on variants of drug-metabolizing enzyms”, Pharmacogenomics, 9. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  42. 31. Mok CK, Boey J, Wang R và các cộng sự. (1985), “Warfarin versus dipyridamoleaspirin and pentoxifylline-aspirin for the prevention of prosthetic heart valve thromboembolism: a prospective randomized clinical trial”, Circulation 72, tr. 1059–63. 32. Oleastro M, Ménard A, Santos A, và cộng sự. (2003), "Real-Time PCR Assay for Rapid and Accurate Detection of Point Mutations Conferring Resistance to Clarithromycin in Helicobacter pylori", Journal of Clinical Microbiology. 41(1), 397-402. 33. Ozgon, G. O., Langaee, T. Y., Feng, H., Buyru, N., Ulutin, T., Hatemi, A. C., & Johnson, J. A. (2008). “VKORC1 and CYP2C9 polymorphisms are associated with warfarin dose requirements in Turkish patients”. European journal of clinical pharmacology, 64(9), 889-894. 34. Phabphal, K., Geater, A., Limapichart, K., Sathirapanya, P., & Setthawatcharawanich, S. (2013). “Role of CYP2C9 polymorphism in phenytoin-related metabolic abnormalities and subclinical atherosclerosis in young adult epileptic patients”. Seizure, 22(2), 103-108. 35. Rathore, S. S., Agarwal, S. K., Pande, S., Singh, S. K., Mittal, T., & Mittal, B. (2012). “Therapeutic dosing of acenocoumarol: proposal of a population specific pharmacogenetic dosing algorithm and its validation in north Indians”. PLoS One, 7(5), e37844. 36. S.R. Kalpana, R. Christopher, G. Bharath và các cộng sự. (2015), “Association of VKORC1 gene polymorphism (1639G>A and 1173C>T) and acenocoumarol maintenance dosage in patients with mechanical heart valve”, Indian Heart Journal, 67(1), tr. S9-S1. 37. Sangviroon, A., Panomvana, D., Tassaneeyakul, W., & Namchaisiri, J. (2010). “Pharmacokinetic and pharmacodynamic variation associated with VKORC1 and CYP2C9 polymorphisms in Thai patients taking warfarin”. Drug metabolism and pharmacokinetics, 25(6), 531-538. 38. Schalekamp T và De Boer A (2010), “Pharmacogenetics of oral anticoagulant therapy”, Curr Pharm Des 16, tr. 187–203. 39. Schalekamp T, van Geest-Daalderop JH, de Vries-Goldschmeding và các cộng sự. (2004), “Acenocoumarol stabilization is delayed in CYP2C9 carriers”, Clin Pharmacol Ther 75, @ tr. School394–402. of Medicine and Pharmacy, VNU
  43. 40. Sun JC, Davidson MJ, Lamy A và các cộng sự. (2009), “Antithrombotic management of patients with prosthetic heart valves: current evidence and future trends”, Lancet, 374: , tr. 565–76. 41. Tamura, T., Katsuda, N., & Hamajima, N. (2014). “A PCR method for VKORC1 G-1639A and CYP2C9 A1075C genotyping useful to warfarin therapy among Japanese”. SpringerPlus, 3(1), 499. 42. Tatarūnas, V., Lesauskaitė, V., Veikutienė, A., Jakuška, P., & Benetis, R. (2011). “The influence of CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphisms on optimal warfarin doses after heart valve replacement”. Medicina, 47(1), 4. 43. Van Schie RM, Wessels JA, Le Cessie S và các cộng sự. (2011), “Loading and maintenance dose algorithms for phenprocoumon and acenocoumarol using patient characteristics and pharmacogenetic data”. Euro Heart J 32, tr. 1909–17. 44. Verhoef TI, Redekop WK, Buikema MM và các cộng sự. (2012), “Long- term anticoagulant effects of the CYP2C9 and VKORC1 genotypes in acenocoumarol users”, J Thromb Haemost 10, tr. 606–14. 45. Vignal A, Milan D, SanCristobal M, và cộng sự. (2002), "A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics", Genetics, selection, evolution: GSE. 34(3), 275-305. 46. Visser L. E., van Schaik R. H. et al (2004), "The risk of bleeding complications in patients with cytochrome P450 CYP2C9*2 or CYP2C9*3 alleles on acenocoumarol or phenprocoumon", Thromb Haemost, 92(1). 47. Visser L. E., van Vliet M., van Schaik R. H. et al (2004). "Allelic variants of cytochrome P450 2C9 modify the interaction between nonsteroidal anti- inflammatory drugs and coumarin anticoagulants", Clin Pharmacol Ther, 77(6), pp. 479-85. 48. Wen, M. S., Lee, M. T. M., Chen, J. J., Chuang, H. P., Lu, L. S., Chen, C. H., & Kuan, P. L. (2008). “Prospective study of warfarin dosage requirements based on CYP2C9 and VKORC1 genotypes”. Clinical Pharmacology & Therapeutics, 84(1), 83-89. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  44. WEBSITE 49. Website truy cập ngày 27/04/2019 50. Website truy cập ngày 09/05/2019. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  45. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Danh sách người bệnh tham gia nghiên cứu bệnh viện Tim Hà Nội Mã số Tuổi theo Giới STT Họ và tên Mã bệnh án nghiên cứu năm tính 1 Dương Thị L Đt 01 PT163 52 Nữ 2 Trương Việt Q Đt 02 PT1039 63 Nam 3 Đỗ Thị M Đt 03 PT610 55 Nữ 4 Đỗ Thị M Đt 04 PT1688 60 Nữ 5 Nguyễn Thị L Đt 05 PT 668 59 Nữ 6 Đinh Thị V Đt 06 PT641 58 Nữ 7 Đỗ Thị H Đt 07 PT499 52 Nữ 8 Nguyễn Văn T Đt 08 PT1222 62 Nam 9 Nguyễn Thị T Đt 09 PT126 46 Nữ 10 Nguyễn Văn D Đt 10 PT1480 54 Nam 11 Nguyễn Thị Tường V Đt 11 PT1275 47 Nữ 12 Phan Thị C Đt 12 PT941 56 Nữ 13 Đặng Thị T Đt 16 PT95/15 57 Nam 14 Nguyễn Thị T Đt 17 PT33/15 52 Nữ 15 Nguyễn Văn L Đt 18 PT460 53 Nam 16 Nguyễn Thị H Đt 19 PT401/15 46 Nữ 17 Nguyễn Văn T Đt 21 PT1298 55 Nam 18 Vũ Thị H Đt 22 PT1390 54 Nữ @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  46. 19 Nguyễn Thị H Đt 23 PT518 32 Nữ 20 Nguyễn Thạc Q Đt 24 PT747/15 51 Nam 21 Nguyễn Thị H Đt 25 PT137 62 Nữ 22 Nguyễn Thị D Đt 26 PT1090 65 Nữ 23 Trịnh Thị H Đt 27 PT1011 52 Nữ 24 Nguyễn Văn D Đt 28 PT343 41 Nam 25 Nguyễn Công L Đt 31 PT1405 35 Nam 26 Nguyễn Thị N Đt 32 PT295/16 54 Nữ 27 Hoàng Thị M Đt 33 PT1912 49 Nữ 28 Đặng Văn H Đt 34 PT969 53 Nam 29 Hà Văn M Đt 35 PT1198/16 37 Nam 30 Trần Thị H Đt 36 PT17 39 Nữ 31 Nguyễn Văn N Đt 38 PT419 50 Nam 32 Nguyễn Thị L Đt 39 PT 748 62 Nữ 33 Vũ Thị D Đt 40 PT635 49 Nữ 34 Vũ Thị T Đt 42 PT1923 42 Nữ 35 Phạm Thị T Đt 44 PT1127 60 Nữ 36 Ngô Thị L Đt 46 PT1683 56 Nữ 37 Vương Thị V Đt 48 ST100 60 Nữ 38 Nguyễn Thị N Đt 49 PT1485 60 Nữ 39 Đặng Văn L Đt 51 PT167 39 Nam 40 Nguyễn Ngọc C Đt 52 PT786 53 Nam @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  47. 41 Đỗ Thị V Đt 53 PT915 33 Nữ 42 Phạm Văn T Đt 58 ST953 31 Nam 43 Nguyễn Huy L Đt 64 PT1173 38 Nam 44 Nguyễn Thị B Đt 65 PT699 62 Nữ 45 Đỗ Minh Đ Đt 67 PT960 58 Nam 46 Lê Văn S Đt 68 PT1048 52 Nam 47 Trịnh Thị K Đt 69 PT882 60 Nữ 48 Phạm Khắc X Đt 71 PT368 62 Nam 49 Đặng Thanh B Đt 72 PT676 37 Nam 50 Nguyễn Văn H Đt 73 NT1501 59 Nam 51 Nguyễn Gia Q Đt 74 PT8152/15 65 Nữ 52 Đỗ Thị V Đt 75 PT573 42 Nữ 53 Đặng Thị V Đt 78 PT1244/16 53 Nữ 54 Phùng Thị T Đt 79 PT144 43 Nữ 55 Nguyễn Văn H Đt 80 PT1228 64 Nam 56 Hoàng Thị C Đt 82 ST1610 52 Nữ 57 Dương Văn B Đt 84 PT203 61 Nam 58 Nguyễn Thị V Đt 85 PT860/16 62 Nữ 59 Đỗ Trọng T Đt 86 PT1060 59 Nam 60 Trịnh Thị H Đt 87 PT311 54 Nữ 61 Phùng Thế H Đt 88 PT1098/16 59 Nam 62 Nguyễn Thị C Đt 89 PT127 54 Nữ @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  48. 63 Nguyễn Văn D Đt 90 PT1162/17 42 Nam 64 Phạm Văn T Đt 92 PT257 36 Nam 65 Nguyễn Thị H Đt 93 PT684 38 Nữ 66 Đinh Thị V Đt 94 PT880 47 Nữ 67 Bùi Đức C Đt 95 PT928 46 Nam 68 Nguyễn Thị K Đt 96 PT1412 63 Nữ 69 Nguyễn Thị H Đt 97 PT245 44 Nữ 70 Phùng Thị Đ Đt 98 PT1066 53 Nữ 71 Nguyễn Thị Ư Đt 99 PT525 62 Nữ 72 Phan Thị Q Đt 100 PT270 34 Nữ 73 Nguyễn Đức T Đt 101 PT461 54 Nam 74 Nguyễn Thành C Đt 102 PT26 45 Nam 75 Bùi Khánh T Đt 103 PT202 52 Nam 76 Nguyễn Văn N Đt 104 PT253 47 Nam 77 Nguyễn Thị S Đt 105 PT1630 58 Nữ 78 Phạm Đắc T Đt 107 PT1062 50 Nam 79 Nguyễn Thị N Đt 109 PT776 56 Nữ 80 Đỗ Thị H Đt 110 PT1626 45 Nữ 81 Nguyễn Văn C Đt 113 PT1623 45 Nam 82 Triệu Thị S Đt 114 PT1382 47 Nữ 83 Vũ Đình S Đt 115 PT76 50 Nam 84 Nguyễn Thị N Đt 117 PT1041 56 Nữ @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  49. 85 Dương Thị L Đt 118 PT515 41 Nữ 86 Trần Quốc B Đt 123 PT249/15 66 Nam 87 Phạm Văn L Đt 124 PT193 57 Nam 88 Phùng Thị T Đt 126 PT874 49 Nữ 89 Phạm Thị K Đt 127 PT865 56 Nữ 90 Trần Thị L Đt 128 PT38 48 Nữ 91 Nguyễn Văn Đ Đt 129 PT29 52 Nam 92 Hoàng Thế Q Đt 130 ST897 32 Nam 93 Nguyễn Thị N Đt 132 PTVT1091 47 Nữ 94 Kiều Duy T Đt 136 PTVT 584 52 Nam 95 Đặng Văn C Đt 140 PTVT1080 63 Nam 96 Vi Thị N Đt 141 PTVT1704 57 Nữ 97 Đinh Đăng C Đt 145 PTVT241 44 Nam 98 Đinh Thị H Đt 146 PTVT887 35 Nữ 99 Phạm Thị H Đt 147 PTVT308 42 Nữ 100 Triệu Hồng L Đt 148 PTVT1650 61 Nam Xác nhận của Chủ nhiệm đề tài PGS. TS. Phạm Trung Kiên @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  50. Phụ lục 2. Giá trị đo hấp thụ quang của các mẫu DNA tổng số Mẫu Nồng độ (ng/μl) OD260/280 Mẫu Nồng độ (ng/μl) OD260/280 ĐT 01 78.85 1.957 51 49.45 2.181 ĐT 02 63.35 1.931 ĐT 52 41.80 1.922 ĐT 03 80.15 1.964 ĐT 53 46.25 2.024 ĐT 04 72.10 1.970 ĐT 54 45.55 1.993 ĐT 05 64.40 2.051 ĐT 55 45.15 1.980 ĐT 06 89.65 1.960 ĐT 56 48.25 2.006 ĐT 07 99.55 1.807 ĐT 57 65.65 1.934 ĐT 08 48.60 1.808 ĐT 58 53.95 2.017 ĐT 09 54.00 1.983 ĐT 59 64.65 1.827 ĐT 10 41.15 1.892 ĐT 60 54.65 1.925 ĐT 11 61.50 2.026 ĐT 61 46.10 1.921 ĐT 12 62.25 1.853 ĐT 62 42.50 1.959 ĐT 13 76.65 1.919 ĐT 63 48.85 2.097 ĐT 14 53.85 2.021 ĐT 64 45.75 2.209 ĐT 15 58.85 1.985 ĐT 65 52.85 2.052 ĐT 16 50.90 1.950 ĐT 66 71.60 2.375 ĐT 17 73.40 1.984 ĐT 67 54.10 2.386 ĐT 18 56.15 2.052 ĐT 68 57.50 2.223 ĐT 19 96.15 1.985 ĐT 69 59.45 2.424 ĐT 20 66.90 2.018 ĐT 70 43.65 2.250 ĐT 21 69.20 1.838 ĐT 71 46.25 2.102 ĐT 22 63.20 1.904 ĐT 72 75.85 2.066 ĐT 23 114.95 1.874 ĐT 73 55.20 2.095 ĐT 24 73.65 1.872 ĐT 74 43.10 2.096 ĐT 25 48.90 1.970 ĐT 75 61.90 1.910 ĐT 26 63.55 1.903 ĐT 76 45.80 2.031 ĐT 27 41.75 2.016 ĐT 77 53.60 1.785 ĐT 28 93.65 1.862 ĐT 78 48.80 2.148 ĐT 29 61.45 1.792 ĐT 79 58.15 2.125 ĐT 30 133.90 1.843 ĐT 80 63.25 2.196 ĐT 31 57.55 1.927 ĐT 81 43.65 2.172 ĐT 32 95.85 1.861 ĐT 82 57.75 2.172 ĐT 33 43.00 2.275 ĐT 83 44.85 2.169 ĐT 34 59.65 2.138 ĐT 84 46.30 2.020 ĐT 35 62.50 2.155 ĐT 85 45.45 2.135 ĐT 36 48.25 2.271 ĐT 86 46.00 2.162 ĐT 37 76.70 2.067 ĐT 87 41.60 2.002 ĐT 38 71.85 2.074 ĐT 88 50.70 2.079 ĐT 39 101.15 1.940 ĐT 89 45.60 2.027 ĐT 40 69.10 2.107 ĐT 90 53.20 2.022 ĐT 41 50.00 1.873 ĐT 91 41.85 2.105 ĐT 42 106.5 1.873 ĐT 92 65.50 2.115 ĐT 43 44.20 1.832 ĐT 93 56.50 2.181 ĐT 44 88.20 1.964 ĐT 94 55.75 2.185 ĐT 45 57.95 1.879 ĐT 95 48.90 1.962 ĐT 46 42.80 1.860 ĐT 96 50.65 1.985 ĐT 47 73.90 1.803 ĐT 97 57.25 2.035 ĐT 48 63.55 2.021 ĐT 98 51.30 2.015 ĐT 49 46.00 1.970 ĐT 99 43.40 2.136 ĐT 50 42.60 1.921 @ SchoolĐT100 of Medicine45.56 1.925and Pharmacy, VNU
  51. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU