Khóa luận Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)

Nội dung text: Khóa luận Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)

1. HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC DƯƠNG THỊ PHƯỢNG ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC DƯƠNG THỊ PHƯỢNG ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG ThS. NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH Hà Nội - 2018 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ vô cùng quý báu của các thầy cô giáo của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với gia đình và bạn bè. Thời điểm hoàn thành khóa luận cũng là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn của mình là TS. Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - người thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn của mình tới ThS. Nguyễn Thị Hoàng Anh vì đã luôn dành thời gian hướng dẫn và động viên tôi trong quá trình hoàn thiện khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong Khoa Y Dược đặc biệt là Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2013.Y, đặc biệt là các bạn Thùy, Phương, Chuyên đã luôn đồng hành với tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thành viên trong nhóm nghiên cứu của tôi là chị Thủy và chị Huệ vì đã luôn giúp đỡ và nhiệt tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Lời cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình đã nuôi dạy, khích lệ và sát cánh, giúp tôi có thêm động lực cố gắng để có kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 30 tháng 4 năm 2018 Sinh viên Dương Thị Phượng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
4. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril BuOH Buthanol DAD Detector mảng điốt (Diode array detector) Dd Dung dịch EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performace liquid chromatography) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) MeOH Methanol RSD Độ lệch chuẩn tương đối SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng Sti Stipuleanosid R2 SVD Sâm vũ diệp TB Trung bình TT Thứ tự UV Ultra violete VIS Visible @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
5. DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1. Chương trình dung môi. 18 Bảng 2. Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết. 19 Bảng 3. Tính thích hợp hệ thống 23 Bảng 4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2 24 Bảng 5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 26 Bảng 6. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 27 Bảng 7. Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp 28 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
6. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 2 Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp 4 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2 5 Hình 1.4. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng 7 Hình 2.1. Mẫu rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa 10 Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016 Hình 2.2. Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập được 11 Hình 3.1. Sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun 17 H2SO4 10% /EtOH Hình 3.2. Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 bằng HPLC 19 Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu trắng 21 Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 21 Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch thử 22 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 24 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 2 1.1.1. Tên khoa học 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật 2 1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái 2 1.1.4. Thành phần hóa học 3 1.1.5. Tác dụng dược lý 4 1.1.6. Công dụng 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 5 1.2.1. Công thức hóa học 5 1.2.2. Tính chất lý hóa 5 1.2.3. Tác dụng sinh học 6 1.2.4. Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC 6 1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 6 1.3.1. Nguyên tắc của HPLC 6 1.3.2. Một số thông số đặc trưng 7 1.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích HPLC 9 1.3.4. Tổng quan các nghiên cứu định lượng thành phần hóa học của Sâm vũ diệp bằng HPLC 9 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 10 2.1.1. Nguyên liệu sâm vũ diệp 10 2.1.2. Chất tinh khiết stipuleanosid R2 10 2.1.3. Dung môi, hóa chất 11 2.1.4. Máy móc, dụng cụ 11 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.3.1. Phương pháp chiết xuất các hợp chất 12 2.3.2. Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong cao rễ SVD bằng HPLC 13 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
8. 2.3.3. Định lượng stipuleanosid R2 trong cao sâm vũ diệp và dược liệu sâm vũ diệp 16 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 16 CHƯƠNG 3 – KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN 17 3.1. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA STIPULEANOSID R2 PHÂN LẬP ĐƯỢC 17 3.1.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 17 3.1.2. Phương pháp HPLC 17 3.1.3. Phương pháp đo độ nóng chảy 20 3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 BẰNG HPLC 20 3.2.1. Chương trình sắc ký 20 3.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng 20 3.3. ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP 27 3.4. BÀN LUẬN 28 3.4.1. Về xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC 28 3.4.2. Về định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu và cao sâm vũ diệp 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
9. ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae), còn gọi là Trúc tiết nhân sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất là một vị thuốc quý phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta [3,22]. Gần đây sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang, Lào Cai. Về mặt y học, sâm vũ diệp được sử dụng làm thuốc bổ và là thành phần trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc vùng núi Tây Bắc [3,22]. Theo như các tài liệu đã được công bố về sâm vũ diệp cho thấy các saponin là thành phần hoạt chất chính mang lại tác dụng dược lý và giá trị sử dụng của dược liệu quý này trong y học. Do vậy, việc tập trung nghiên cứu thành phần saponin trong SVD cũng như định lượng được các thành phần đó có ý nghĩa rất quan trọng trong việc ứng dụng dược liệu SVD trong thực tiễn. Qua quá trình tra cứu tài liệu, chúng tôi thấy rằng ở trong nước ta có rất ít nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và tác dụng dược lý của sâm vũ diệp để phát triển sử dụng dược liệu quý thuộc chi sâm Panax này. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu về thành phần hóa học của thân rễ cây SVD thu hái ở Sapa, Lào Cai với các hợp chất saponin phân lập được từ phân đoạn buthanol và đã xác định được stipuleanosid R2 là thành phần saponin chính có trong thân rễ SVD [24]. Tiếp nối nghiên cứu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu sâm vũ diệp phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu trên thị trường và tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin của SVD sau này. Mục tiêu đề tài: 1. Xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2. Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao sâm vũ diệp và dược liệu sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc. Đề tài này là một phần trong đề tài cấp Nhà nước thuộc Chương trình Tây Bắc “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)”, mã số: KHCN- TB.07C/13-18. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
10. CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1. Tên khoa học SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem. [3,21], SVD thuộc chi Sâm (Panax. L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật Sâm vũ diệp là cây thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm [3,21]. Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại. Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dương lịch. Lá kép chân vịt, gồm 2 - 3 cái mọc vòng. Lá chét 5 - 7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy không đều, mép có răng cưa, có lông. Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)[3,21] 1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái Sâm vũ diệp là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở nước ta. Trong tự nhiên, SVD phân bố ở dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc nước ta [3,21,22]. Gần đây sâm vũ diệp đã được nghiên cứu và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang, Lào Cai. Hiện nay vùng phân bố của SVD đang bị thu hẹp dần và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Do vậy SVD là loài dược liệu quý hiếm cần được bảo tồn và gìn giữ để phát triển trong tương lai. Sâm vũ diệp thường mọc rải rác hay tập trung dưới tán rừng ẩm, gần như quanh năm có sương mù. Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
11. thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh). Chồi này sinh trưởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa. Quả xanh quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ. Do quả chín đúng vào thời kì có lượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của sâm vũ diệp. Cách xác định tuổi của cây dựa vào những vết sẹo thân được hình thành sau khi quả chín [3]. 1.1.4. Thành phần hóa học Theo các tài liệu đã nghiên cứu cho thấy Saponin được xem là thành phần hoạt chất chính trong các loài thuộc chi Panax L Các nhà khoa học đã chiết tách và xác định được gần 300 saponin từ các loài thuộc chi này [31]. Các kết quả nghiên cứu trước đây của SVD cũng chỉ ra rằng saponin là thành phần chính của lá và rễ cây sâm vũ diệp, trong đó bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [11,23]. Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố phân lập được 13 saponin khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [37]. Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự vào năm 2002 cho thấy kết quả định tính sơ bộ trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin [21]. Năm 2003, đã xác định thành phần saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro. Ngoài ra còn có các saponin triterpen nhóm dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [22]. Gần đây vào năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập và xác định được một nhóm gồm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2) là thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn (Việt Nam), trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C (1-3) [33]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
12. Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp [33] 1.1.5. Tác dụng dược lý Tính vị, công năng: Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [3]. Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD cho thấy khi thử trên động vật thí nghiệm, SVD có độc tính cấp rất thấp, tăng cường chức năng sinh lý, ảnh hưởng tốt đến hệ thần kinh trung ương, tăng sức dẻo dai của cơ thể, tăng sức đề kháng, tác dụng tán huyết [3]. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã chỉ ra rằng SVD có tác dụng chống stress [25], chống trầm cảm, có tác dụng bảo vệ gan và kích thích tăng miễn dịch [12-15]. 1.1.6. Công dụng Sâm vũ diệp được biết đến như một vị thuốc quý có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ [25], chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu, nhất là đối với phụ nữ sau khi sinh. Sâm vũ diệp còn được dùng để cầm máu, tán ứ, tiêu sưng. Dùng ngoài, rễ phơi khô, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết thương mau lành. Rễ cây sâm vũ diệp còn được ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm dùng rất tốt cho sức khỏe đặc biệt là chức năng sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao rồi dùng để pha với nước hoặc rượu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
13. để uống cũng có tác dụng như rễ. Ở Trung Quốc, sâm vũ diệp còn được dùng làm thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ huyết, đòn ngã tổn thương [7,22]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 1.2.1. Công thức hóa học Hình 1.3. Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2 [41] Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b- heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2- yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]- 3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2- carboxylic acid [40]. Công thức phân tử: C53H84O23 [41]. Phân tử lượng: 1089.232 g/mol [42]. 1.2.2. Tính chất lý hóa Chất bột màu trắng. Độ tan: 0,57 g/L [42]. Điểm nóng chảy 210 - 2150C [41]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
14. 1.2.3. Tác dụng sinh học Stipuleanosid R2 là thành phần saponin trong dược liệu, được biết đến như là thành phần có hoạt tính và quyết định các tác dụng sinh học của các loài dược liệu như: sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis [36], Aralia elata [34] Trong một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng stipuleanosid R2 có tác dụng gây độc tế bào ung thư [30]; ức chế sự gia tăng các tế bào ung thư bạch cầu đặc biệt là đối với dòng tế bào K562 và U937 [29]; có tác dụng chống oxy hóa [38]; hạ đường huyết, điều hòa miễn dịch và hạ lipid máu [37]. 1.2.4. Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC Theo như tài liệu chúng tôi tìm hiểu được tính đến thời điểm hiên tại: Trên thế giới vẫn chưa có các nghiên cứu công bố về định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu bằng phương pháp HPLC mà chủ yếu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập chất này trong các dược liệu. Do đó việc xây dựng được phương pháp định lượng stipuleanosid R2 là rất cần thiết trong việc ứng dụng dược liệu trong thực tiễn. 1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 1.3.1. Nguyên tắc của HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một một phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn hợp phân tích; dựa trên cơ sở là sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao. Trong đó: pha động là chất lỏng; pha tĩnh là một chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay dựa trên phân bố theo kích cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động dẫn tới thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ khác nhau và từ đó giúp phân tách được các chất. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bằng detector. Detector sẽ giúp phát hiện và đo nồng độ các chất phân tích. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng như: detector UV-Vis, detector huỳnh quang (FLD), detector diode array (DAD), detector điện hoá, Trong đề tài này chúng tôi sử dụng detector DAD. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
15. Nếu thực hiện quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ thu được kết quả là một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc ký đồ [4,5,8,20,27,28]. 1.3.2. Một số thông số đặc trưng [2,3,5,9,10,15] Hình 1.4. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng [9] a) Thời gian lưu t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký. tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó. tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0. (Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định). b) Hệ số dung lượng k’ Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức: ' tR t R- t 0 t R k'= = = -1 t0 t 0 t 0 Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân bằng. Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
16. mẫu do đó làm giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài. Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất. c) Hệ số bất đối AF (tailing factor) Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ: AF W1/20 2a Trong đó: - W1/20: là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic. - a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. Yêu cầu trong phép định lượng: 0,9 < AF < 2. Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối. d) Hệ số chọn lọc ' k B ttR,B0- ’ ’ α== (k B k A) ' k A ttR,A0- Yêu cầu: α nằm trong khoảng 1,05 đến 2. α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng. e) Độ phân giải (resolution) Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức: ' 2 tR,B tR,A 1,18 tR,B tR,A N α 1 B k RS ' WB WA W1/2B W1/2A 4 α 1 kB - RS = 1,5: độ phân giải cơ bản đạt được, khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen phủ nhau 0,3%. - Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%. - RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
17. 1.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích HPLC a) Yêu cầu chung Các quy trình phân tích HPLC cần phải thẩm định là các quy trình chưa được công bố trong tiêu chuẩn Dược điển các nước. Nội dung về thẩm định phương pháp được hướng dẫn trong các tài liệu về phân tích và được quy định trong các Dược điển. b) Nội dung thẩm định Thông số đặc trưng của kỹ thuật HPLC cần đánh giá khi thẩm định phương pháp định lượng dược chất chính, đa lượng bao gồm: tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng. 1.3.4. Tổng quan các nghiên cứu định lượng thành phần hóa học của Sâm vũ diệp bằng HPLC Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự đã định lượng hàm lượng saponin tổng số của thân rễ và rễ củ của Sâm vũ diệp theo phương pháp trọng lượng của Namba là 5,86% [17]. Năm 2017, Nhóm nghiên cứu của Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội: Nguyễn Thị Huệ đã tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic và saponin toàn phần trong dược liệu sâm vũ diệp bằng phương pháp HPLC - DAD. Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng acid oleanolic trong cao sâm vũ diệp và rễ sâm vũ diệp lần lượt là: 0,034% và 0,0066% tương đương với 340 μg/g và 66 μg/g; hàm lượng saponin trong cao sâm vũ diệp và dược liệu SVD lần lượt là 0,364% và 0,0698% tương đương 3640 µg/g 698 μg/g [11]. Nhận xét: Đây là những kết quả bước đầu về định lượng thành phần hóa học của SVD và xác định hàm lượng saponin tổng số. Tính thời điểm hiện tại, chưa có nhiều kết quả công bố phân tích và định lượng các thành phần saponin cụ thể có trong sâm vũ diệp. Trong nghiên cứu này chúng tôi phân tích định lượng thành phần saponin trong SVD bằng phương pháp HPLC, hiện đang là phương pháp được Dược điển các nước công nhận đạt yêu cầu về tính tiên tiến so với phương pháp quang phổ hay phương pháp khối lượng của phần lớn các chuyên luận dược liệu hiện nay. Phương pháp HPLC với ưu điểm là độ chính xác cao sẽ đáp ứng được yêu cầu phân tích từng thành phần riêng lẻ có trong mẫu, đặc biệt là đối với các mẫu phức tạp như cao chiết từ dược liệu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
18. CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu sâm vũ diệp Mẫu nghiên cứu trong đề tài là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được trồng ở Sa Pa, Lào Cai và thu hái vào ngày 15/7/2016. Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học bởi ThS. Nguyễn Quỳnh Nga và CN. Phan Văn Trường, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Mẫu tiêu bản (PB-150716) được lưu giữ Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu. Mô tả mẫu nghiên cứu: Thân rễ sâm vũ diệp có nhiều đốt và những vết sẹo, cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm. Thể chất cứng chắc, giòn, dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nhạt. Mùi thơm nhẹ, vị đắng, hơi ngọt. Cách xử lí mẫu: thân rễ SVD thu hái tại Sa Pa được rửa sạch, cắt miếng mỏng, sấy khô ở 500C, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo, thoáng mát làm nguyên liệu nghiên cứu. Hình 2.1. Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016 2.1.2. Chất tinh khiết stipuleanosid R2 Trong đề này chúng tôi sử dụng chất stipuleanosid R2 được phân lập từ dược liệu sâm vũ diệp trong một nghiên cứu trước của cùng nhóm nghiên cứu với chúng tôi [24]. Stipuleanosid R2 phân lập được sẽ được tiến hành đánh giá độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn để sử dụng làm chất chuẩn trong phương pháp định lượng nồng độ chất này có trong SVD bằng HPLC. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
19. Hình 2.2. Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập được 2.1.3. Dung môi, hóa chất Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC. - Dung môi dùng cho chiết xuất và phân lập: Ethanol 70%, methanol (MeOH), ether, ethylacetat (EtOAc), n-butanol (BuOH). - Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, Acetonitril, Acid acetic) của Merck, Đức; nước cất hai lần dùng cho phân tích HPLC đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV. 2.1.4. Máy móc, dụng cụ Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị, dụng cụ đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà Nội: - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động. - Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức). - Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001 g, Precisa - Thụy Sĩ). - Cân xác định độ ẩm Prescisa HA 60. - Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000 ml. - Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc). - Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
20. - Bếp điện, bếp đun cách thủy. - Đèn ửt ngoại. - Cột sắc ký các loại kích cỡ. - Màng lọc 0,45 µm. - Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, bình cầu dung tích 50 - 2000 ml, ống nghiệm, pipet chính xác. - Tủ hút. 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD bằng HPLC với chất chuẩn là stipuleanosid R2 tinh khiết được phân lập từ SVD. 2. Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD thu hái ở Sa Pa, Lào Cai bằng phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định ở trên. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp chiết xuất các hợp chất Các nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp đều cho thấy sâm vũ diệp có chứa thành phần chính là saponin, tham khảo các tài liệu về chiết xuất saponin và sapogenin trong dược liệu để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp nhất với mẫu nghiên cứu là thân rễ SVD [23]. - Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70%. - Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng - lỏng. Quy trình chiết xuất được thực hiện như sau: 1. Thân rễ SVD sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết hồi lưu bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ 700C, chiết 3 lần. 2. Tiến hành lọc loại bã dược liệu, các dịch chiết ethanol thu được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng ethanol. 3. Cao ethanol này đem phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetate và n-butanol lặp lại 3 lần theo tỷ lệ 1:1. Các phân đoạn ether, ethyl acetat, n-butanol đem cất quay chân không dưới áp @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
21. suất giảm để thu hồi dung môi, sấy dưới áp suất giảm thu được 3 cắn tương ứng với từng phân đoạn. 4. Cao butanol thu được trong quá trình chiết xuất sẽ được sử dụng để định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 có trong sâm vũ diệp. 2.3.2. Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong cao rễ SVD bằng HPLC a) Lựa chọn điều kiện sắc ký Tham khảo một số tài liệu và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành khảo sát về bước sóng, tỷ lệ dung môi, thành phần pha động, tốc độ dòng, thể tích bơm mẫu nhằm mục đích lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu nhất để đảm bảo điều kiện phân tích stipuleanosid R2 có trong thân rễ SVD đạt kết quả chính xác nhất. b) Thẩm định stipuleanosid R2 phân lập được từ SVD đủ tiêu chuẩn làm chất chuẩn trong quy trình định lượng * Yêu cầu của chất sử dụng làm chất chuẩn [35]: - Nguyên liệu được sử dụng thiết lập chất chuẩn phải có độ tinh khiết cao (đối với hợp chất hóa dược > 95%), được lựa chọn từ các lô nguyên liệu sản xuất thuốc có chất lượng cao, có tính đồng nhất và được cung cấp từ các nguồn đáng tin cậy (các nhà sản xuất gốc). - Việc đánh giá mức độ phù hợp của một nguyên liệu dự kiến thiết lập chuẩn phải được tiến hành rất cẩn thận, phải cân nhắc tất cả số liệu thu được từ các phép thử và nên áp dụng nhiều phương pháp phân tích khác nhau để đánh giá so sánh. * Phương pháp thẩm định: Độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được được kiểm tra dựa vào ba phương pháp sau: 1. Sắc ký lớp mỏng: Sti phân lập được sẽ tiến hành sắc ký trên silicagel RP- 18 F254S (Merk). Phát hiện chất bằng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong Ethanol 96 %, phun đều lên bản mỏng, sấy khô ở 1200C rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi xuất hiện màu. Quan sát vết xuất hiện ở ánh sáng thường. Yêu cầu: Sau khi phun thuốc thử trên sắc ký đồ phải xuất hiện một pic duy nhất màu hồng tím của stipuleanosid R2. 2. HPLC Phương pháp đánh giá độ tinh khiết thông qua tổng tạp dựa theo phương pháp chuẩn hóa diện tích khi tiến hành định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
22. Tiến hành định lượng 01 dung dịch stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần bằng HPLC. Dựa vào kết quả sắc ký đồ tính lượng tạp bằng phương pháp phần trăm diện tích pic. Yêu cầu: độ tinh khiết > 95%. 3. Đo độ nóng chảy: Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của stipuleanosid R2 phân lập được từ SVD. Yêu cầu: stipuleanosid R2 phân lập được phải có nhiệt độ nóng chảy nằm trong khoảng 210 - 2150C [41]. c) Thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong SVD [4,5,40] * Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Phương pháp HPLC được coi là có tính đặc hiệu đối với chất cần phân tích nếu: - Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. - Sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. * Kiểm tra tính thích hợp hệ thống Tính thích hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý. Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu: RSD ≤ 5,0 %. * Độ tuyến tính Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích pic hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Độ tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax+b với hệ số tương quan tuyến tính R2. Trong đó: y là đáp ứng của pic (diện tích pic hay chiều cao) và x là nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
23. Đường chuẩn phải thỏa mãn các yêu cầu sau: - Đường chuẩn phải có ít nhất 5 mức nồng độ. - Nồng độ thấp nhất và cao nhất của đường chuẩn phải bao phủ khoảng xác định của phương pháp. - Các mẫu chuẩn có thể được chuẩn bị bằng cách pha loãng một mẫu chuẩn ban đầu hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau. Yêu cầu: R2 > 0,998. * Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) LOD là lượng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện được về mặt định tính. LOQ là lượng thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử để có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chính xác thích hợp. Tiến hành: Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N). Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được bằng sắc ký. Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng và mẫu thử. Thiết lập tỷ số S/N. LOD: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà tại đó có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3/1). LOQ: Là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu đường nền (S/N =10/1). * Độ lặp lại Độ lặp lại của phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu ) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích. Tiến hành: Pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình. Độ lặp lại được biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu: RSD ≤ 5,0%. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
24. * Độ đúng Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực. Tiến hành: Pha dung dịch thử và dung dịch chuẩn theo quy trình chuẩn bị mẫu. Thêm vào mẫu thử những lượng chất chuẩn khác nhau (lượng chất chuẩn thêm vào không nên quá 40% lượng hoạt chất đã có sẵn và tổng lượng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính) rồi tiến hành định lượng để xác định hàm lượng của các chất trong mẫu thử và mẫu thử có thêm chất chuẩn dựa trên phương trình đường chuẩn, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm được so với lượng chất chuẩn thêm vào. Yêu cầu: Độ thu hồi nằm trong khoảng từ 95,0% đến 105,0%. 2.3.3. Định lượng stipuleanosid R2 trong cao sâm vũ diệp và dược liệu sâm vũ diệp Áp dụng phương pháp HPLC đã được thẩm định ở trên để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 có trong cao SVD và trong dược liệu SVD. 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 với một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả. 1 n - Giá trị trung bình: x xi n i 1 2  xi x i 1 - Độ lệch chuẩn: S n 1 S - Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): RSD 100 x @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
25. CHƯƠNG 3 – KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN 3.1. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA STIPULEANOSID R2 PHÂN LẬP ĐƯỢC 3.1.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng - Cách tiến hành: Stipuleanosid R2 phân lập được đã được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM silicagel RP-18 F254S trên bản mỏng, triển khai với hệ dung môi Methanol:H2O = 2:1. Kết quả thu được sắc ký đồ như hình 3.1. Hình 3.1. Sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun H2SO4 10%/EtOH - Nhận xét: Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, SKĐ của stipuleanosid R2 xuất hiện duy nhất vết màu hồng khá đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng cho các dẫn xuất triterpen. Vì vậy sơ bộ kết luận stipuleanosid R2 phân lập được là chất tinh khiết. 3.1.2. Phương pháp HPLC a) Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký Trên cơ sở phân tích tài liệu tham khảo và khảo sát về thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, chúng tôi đã xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau [19]: - Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm). - Detector DAD phát hiện ở bước sóng: 203 nm. - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. - Thể thích bơm mẫu: 20 µl. - Nhiệt độ: 250C. - Dung môi pha mẫu: Methanol. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
26. - Pha động: Acetonitril (kênh A): Acid acetic 0,5%/H2O (kênh B) với chương trình dung môi như bảng 1. Bảng 1. Chương trình dung môi. Thời gian (phút) Acetonitril (%) Acid acetic 0,5% (%) Kiểu rửa giải 0-5 20 80 Đẳng dòng 5-15 20→40 80→60 gradient 15-20 40 60 Đẳng dòng 20-30 40→100 60→0 gradient 30-35 100 0 Đẳng dòng 35-40 100→20 0→80 gradient 40-45 20 80 Đẳng dòng Với điều kiện sắc ký như trên, các thành phần saponin trong mẫu thử chuẩn bị từ dịch chiết n-butanol SVD đều được tách tương đối tốt, pic cân đối. Như vậy có thể dùng các điều kiện sắc ký đã lựa chọn để phân tích định lượng stipuleanosid R2 có trong sâm vũ diệp. b) Xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được từ SVD bằng phương pháp HPLC * Cách tiến hành: - Pha mẫu stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 1,0 mg Sti phân lập được, sau đó pha thành dung dịch gốc tương ứng với nồng độ 1,0 mg/mL (1000 ppm) trong methanol, sau đó siêu âm 10 phút rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm, pha loãng thành dung dịch có nồng độ 500 ppm. - Tiến hành phân tích 01 dung dịch stipuleanosid R2 lặp lại 6 lần để kiểm tra tính thích hợp của hệ thống HPLC đã lựa chọn và từ đó cũng xác định được độ tinh khiết của stipuleanosid R2 đã phân lập được. * Kết quả: Thẩm định độ tinh khiết thông qua tổng tạp theo phương pháp chuẩn hóa diện tích. Tính kết quả bằng phương pháp phần trăm diện tích pic (bỏ qua pic của pha động và pic có S/N < 2/1). Kết quả xác định độ tinh khiết bằng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
27. phương pháp HPLC được ghi nhận ở bảng 2 và hình 3.2. Bảng 2. Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết. % Diện tích pic chính % Tổng diện tích pic tạp TT (mAU*s) (mAU*s) 1 96,183 3,817 2 96,034 3,966 3 96,537 3,463 4 96,489 3,511 5 95,987 4,013 6 96,746 3,254 Trung bình 96,329 3,671 RSD (%) 0,32 Hình 3.2. Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 bằng HPLC * Nhận xét: Kết quả SKĐ của chất stipuleanosid R2 phân lập được cho thấy xuất hiện 2 pic: - Tại thời gian lưu tR= 15,539: xuất hiện 1 pic chính là pic của stipuleanosid R2 chiếm 96,183% tổng diện tích pic trên SKĐ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
28. - Tại thời gian lưu tR= 16,173 có 1 pic phụ chiếm 3,817% trên tổng diện tích pic trên SKĐ. Độ lệch chuẩn tương đối về diện tích của pic stipuleanosid R2 đo được giữa các lần tiêm cùng nồng độ là 0.32% ( 95%). 3.1.3. Phương pháp đo độ nóng chảy Kết quả đo độ nóng chảy của stipuleanosid R2 phân lập được là 2140C. Nhận xét: nhiệt độ nóng chảy đo được trùng khớp với nhiệt độ nóng chảy của stipuleanosid R2 tinh khiết. Đây được coi như là một căn cứ để xác định được stipuleanosid R2 phân lập được là chất tinh khiết. Kết luận: Dựa vào kết quả xác định độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng, HPLC và đo độ nóng chảy của stipuleanosid R2, chúng tôi xác định được stipuleanosid R2 phân lập được có độ tinh khiết đạt yêu cầu và được sử dụng như là chất chuẩn trong quy trình định lượng nồng độ chất này có trong các mẫu SVD. 3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 BẰNG HPLC 3.2.1. Chương trình sắc ký Thực hiện chương trình sắc ký đã lựa chọn ở mục 3.1.2. 3.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng a) Chuẩn bị mẫu Dung dịch mẫu trắng: Dung dịch MeOH. Dung dịch mẫu thử: Dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 0,1 g cao BuOH của sâm vũ diệp hòa tan trong MeOH cho vào bình định mức 10 ml. Siêu âm ở nhiệt độ phòng. Lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45 μm thu được dung dịch thử dùng để triển khai sắc ký. Dung dịch chuẩn: Dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 1,0 mg stipuleanosid R2 hòa tan trong MeOH và pha loãng cùng dung môi để tạo thành dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 μg/ml. Siêu âm ở nhiệt độ phòng. Lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45 μm thu được dung dịch chuẩn. Pha loãng dung dịch chuẩn @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
29. gốc bằng MeOH với các hệ số pha loãng khác nhau để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn. b) Tính đặc hiệu * Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu - Mẫu trắng: Dung dịch MeOH. - Mẫu chuẩn: Stipuleanosid R2 phân lập được từ sâm vũ diệp pha trong MeOH. - Mẫu thử: Cao BuOH của thân rễ SVD hòa tan trong MeOH. Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn stipuleanosid R2 và mẫu thử theo các điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Ghi lại sắc ký đồ và xác định thời gian lưu của pic stipuleanosid R2 trong sắc ký đồ của các mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn. * Kết quả: Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
30. Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch thử Kết quả cho thấy: Tín hiệu pic của Sti xuất hiện tại thời gian lưu tR= 15,565. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử cho 1 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn và tín hiệu này tách ra khỏi các tín hiệu pic khác xuất hiện trên sắc ký đồ; trong khi đó sắc ký đồ của dung môi pha mẫu (mẫu trắng) không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Điều đó cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao và phù hợp cho phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD. c) Tính thích hợp hệ thống * Cách tiến hành: Thực hiện phân tích 01 dung dịch chuẩn của stipuleanosid R2 có nồng độ 150 µg/ml lặp lại 06 lần với điều kiện sắc ký đã lựa chọn (mục 3.1.2). Sau đó tiến hành sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng. * Kết quả: Độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu, diện tích pic và hệ số bất đối lần lượt là 0,16%; 3,01% và 1,33% đều thấp hơn 5% (Bảng 3). Điều đó cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho phép phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
31. Bảng 3. Tính thích hợp hệ thống Thời gian lưu TT Diện tích pic (mAU*s) Hệ số bất đối (phút) 1 15,707 424,728 0,90 2 15,698 421,771 0,89 3 15,674 449,195 0,92 4 15,658 419,380 0,90 5 15,680 418,038 0,92 6 15,729 440,903 0,91 TB 15,691 429,003 0,91 RSD (%) 0,16 3,01 1,33 d) Độ tuyến tính * Cách tiến hành: Chuẩn bị các dãy dung dịch chuẩn: Pha loãng dung dịch chuẩn gốc 1000 μg/ml bằng MeOH với các hệ số pha loãng khác nhau để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ: 15,625 - 37,5 - 75 - 150 - 200 - 300 - 400 μg/ml. Lọc qua màng lọc có kích cỡ 0,45 μm được dung dịch dùng để triển khai sắc ký. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần) ghi lại sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu. * Kết quả: Tương quan tuyến tính giữa diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch theo phương trình y = 2,6081x + 49,1185 với hệ số tương quan R2 = 0,9988 (Bảng 4 và Hình 3.6). Trong khoảng nồng độ khảo sát 15,625 – 400 µg/ml có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ stipuleanosid R2 với hệ số tương quan rất cao (R2 = 0,9988). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
32. Bảng 4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2 TT Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU*s) 1 15,625 90,65283 2 37,5 154,6339 3 75 239,247 4 150 418,038 5 200 589,441 6 300 836,676 7 400 1087,77 Đồ thị đường chuẩn của stipuleanosid R2 1200 ) 1000 y = 2.6081x + 49.1185 800 R² = 0.9988 600 400 200 0 Diện Diện pic tích (mAU*s 0 100 200 300 400 500 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 e) Giới hạn phát hiệu (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) * Cách xác định LOD của phương pháp: tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 và phân tích HPLC đến khi tín hiệu của stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ có tỉ lệ S/N (tín hiệu/ nhiễu) đạt khoảng từ 2-3, trong đó S là chiều cao pic stipuleanosid R2, N là chiều cao tín hiệu nhiễu trên nền lớn nhất. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp định lượng. Sau khi khảo sát ở các điều kiện sắc ký đã chọn, ở nồng độ 1,953 µg/mL có tỷ số nhiễu đường nền S/N =3,03 và khi pha loãng ở nồng độ thấp hơn thì thấy không còn đáp ứng nên đây được coi là giới hạn LOD của hệ thống. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
33. Giới hạn định lượng (LOQ): Giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện theo công thức LOQ = 3,3 x LOD. * Kết quả thẩm định xác định được phương pháp có giới hạn phát hiện là LOD = 1,953 µg/ml và giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,445 µg/ml. Kết quả cho thấy phương pháp đã xây dựng có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp hơn nhiều so với nồng độ định lượng, do đó phù hợp để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD. f) Độ lặp lại * Cách tiến hành: - Tiến hành định lượng 6 mẫu thử độc lập, mỗi mẫu tiêm 3 lần. - Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử bằng cách sử dụng đường chuẩn ở phần xác định khoảng tuyến tính. Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của các lần định lượng. Kết quả khảo sát độ lặp lại được đánh giá thông qua RSD. Kết quả được trình bày trong bảng 5. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
34. Bảng 5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp Khối lượng Nồng độ cao Diện tích pic Hàm lượng Thí nghiệm (g) (mg/ml) (mAU*s) (%) 1 0,0968 9,68 660,082 2,42 2 0,0921 9,21 644,829 2,48 3 0,1308 13,08 743,029 2,51 4 0,1135 11,35 780,286 2,47 5 0,1245 12,45 880,372 2,56 6 0,0926 9,26 638,403 2,44 Trung bình 2,477 RSD (%) 2,02 * Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng trung bình của Sti trong cao SVD là 2,477% và độ lệch chuẩn tương đối RSD là 2.02 % (< 5%). Như vậy, phương pháp có độ lặp lại tốt và có thể ứng dụng trong phân tích stipuleanosid R2 trong SVD. g) Độ đúng * Cách tiến hành: - Dung dịch thử: Hòa tan 6 mẫu cao SVD trong MeOH. Xác định được lượng stipuleanosid R2 có sẵn trong mỗi mẫu thử. - Dung dịch thử thêm chuẩn: Thêm vào mỗi mẫu cao dược liệu 50 µg Sti chuẩn. Tiến hành chạy sắc ký 6 mẫu thử thêm chuẩn. Dựa vào đường chuẩn đã xây dựng được sẽ tính được lượng Sti trong các mẫu. Từ đó sẽ xác định được độ thu hồi của phương pháp. Kết quả được trình bày trong bảng 6. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
35. Bảng 6. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp Lượng có sẵn Lượng thêm vào Diện tích pic Lượng tìm Độ thu hồi TT (µg) (µg) (mAU*s) lại (µg) (%) 1 241,51 50 804,877 48,24 96,48 2 230,00 50 774,514 48,13 96,25 3 262,23 50 864,312 50,33 100,67 4 279,30 50 912,763 51,84 103,68 5 309,35 50 983,826 49,04 98,07 6 228,05 50 777,744 52,32 104,64 Trung bình 99,93 RSD (%) 3,18 * Kết quả: khi thêm các lượng stipuleanosid R2 chuẩn vào các mẫu thử khác nhau, phương pháp đều cho độ thu hồi nằm trong khoảng yêu cầu là từ 95% đến 105% và RSD < 5%. Kết quả này chứng tỏ phương pháp xây dựng có độ thu hồi tốt, phù hợp với định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp. 3.3. ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP Kết quả thẩm định phương pháp HPLC đã xây dựng cho thấy phương pháp hoàn toàn phù hợp được sử dụng để định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 có trong dược liệu sâm vũ diệp. * Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu phân tích stipuleanosid R2 bằng cách cân 6 mẫu cao sâm vũ diệp, hòa tan bằng MeOH. Siêu âm và lọc qua màng lọc kích thước 0,45 μm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC. - Tiến hành sắc ký. Xác định thời gian lưu, diện tích pic tương ứng với thời gian lưu của Sti trên sắc ký đồ thu được. - Áp dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính thu được và phương pháp nội suy để xác định được hàm lượng Sti có trong mẫu cao BuOH của SVD và trong dược liệu sử dụng trong đề tài. Kết quả định lượng thu được ở bảng 7. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
36. Bảng 7. Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp Diện tích pic Hàm lượng Khối Hàm lượng stipuleanosid stipuleanosid R2 STT lượng cao stipuleanosid R2 R2 trong dược liệu (g) trong cao (%) (mAU.s) khô (%) 1 0,0968 660,082 2,42 0,114 2 0,0921 644,829 2,48 0,116 3 0,1060 743,029 2,51 0,118 4 0,1135 780,286 2,47 0,116 5 0,1245 880,372 2,56 0,120 6 0,0926 638,403 2,44 0,115 Trung bình 2,477 0,117 RSD (%) 2.02 1.70 * Kết quả trình bày ở bảng 7 cho thấy hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao BuOH của sâm vũ diệp là 2,477% và trong dược liệu sâm vũ diệp là 0,117%. 3.4. BÀN LUẬN 3.4.1. Về xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC Với điều kiện phòng thí nghiệm cũng như những trang thiết bị hiện có của Khoa Y Dược, chúng tôi tham khảo các tài liệu đã được công bố và xây dựng phương pháp phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp bằng phương pháp HPLC như sau: * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm). - Detector DAD phát hiện ở bước sóng: 203 nm. - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. - Thể thích bơm mẫu: 20 µl. - Nhiệt độ: 250C. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
37. - Dung môi pha mẫu: Methanol. - Pha động: Acetonitril (A) - Acid acetic 0,5%/H2O (B) theo chương trình dung môi trong 45 phút: (0-5 phút: 20% A; 5-15 phút: 20→40% A; 15-20 phút: 40% A; 20-30 phút: 40→100% A; 30-35 phút: 100% A; 35-40 phút: 100→20%A; 40-45 phút: 20% A). * Đường chuẩn: y = 2,6081x + 49,1185; R2 = 0,9988; khoảng nồng độ 15,625 – 400 µg/ml. * Độ lặp lại: RSD = 2,02 %; n= 6. * Độ đúng: Độ thu hồi nằm trong khoảng từ 96,25% đến 104,64%, RSD = 3,18 %; n=6. * Giới hạn phát hiện: 1,953 µg/ml. * Giới hạn định lượng: 6,445 µg/ml. Kết quả cho thấy phân tích stipuleanosid R2 bằng HPLC với điều kiện sắc như trên cho độ tin cậy cao. Đây là phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong SVD bằng HPLC đầu tiên được xây dựng và kết quả thẩm định đã đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp phân tích. Do vậy, phương pháp này có thể được ứng dụng để phân tích stipuleanosid R2 trong sâm vũ diệp và các loài dược liệu khác. 3.4.2. Về định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu và cao sâm vũ diệp Các hợp chất saponin khung oleanan là thành phần chính và được coi là đặc trưng của sâm vũ diệp. Ở nước ta hiện nay, sâm vũ diệp bước đầu trồng thử nghiệm ở Sa Pa, Hà Giang, đang được nghiên cứu về thành phần hóa học, từ đó nghiên cứu tác dụng dược lý của sâm vũ diệp. Thành phần stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp ở nước ta chưa được nghiên cứu và phân tích cụ thể, trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa. Áp dụng phương pháp phân tích HPLC đã khảo sát ở trên, chúng tôi tiến hành định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp thu được kết quả như sau: Hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao BuOH sâm vũ diệp và thân rễ sâm vũ diệp lần lượt là: 2,477% và 0,117% tương đương với 24,77 mg/g và 1,17 mg/g. Kết quả phân tích HPLC cho thấy chất stipuleanosid R2 có hàm lượng cao và là hàm lượng stipuleanosid R2 lần đầu tiên được định lượng trong dược liệu sâm vũ diệp. Kết quả đóng góp cơ sở khoa học đầy đủ hơn về thành phần hóa học của dược liệu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
38. sâm vũ diệp được trồng ở Việt Nam hiện nay, đồng thời định hướng cho các nghiên cứu về tác dụng dược lý của thành phần trong sâm vũ diệp và ứng dụng cho việc sử dụng dược liệu sâm vũ diệp trong tương lai. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
39. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài đã thực hiện được các mục tiêu nghiên cứu đã đề ra như sau: 1. Xây dựng được phương pháp định lượng stipuleanpsid R2 và thẩm định được phương pháp HPLC về các mặt: tính thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ đặc hiệu, độ chính xác. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp phân tích. 2. Định lượng được thành phần stipuleanosid R2 trong sâm vũ diệp bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - DAD. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng stipuleanosid R2 trong mẫu cao BuOH của thân rễ sâm vũ diệp là 2,477% tương đương với 24,77 mg/g và trong dược liệu SVD là 0,117% tương đương với 1,17 mg/g. KIẾN NGHỊ Với những kết quả đầy tiềm năng và hứa hẹn mà đề tài đã thực hiện được, tôi xin phép được kiến nghị đề tài cần tiếp tục: 1. Thiết lập thêm điều kiện cho chất chuẩn stipuleanosid R2 sử dụng trong đề tài để có thể cho kết quả xác định hàm lượng chất này trong dược liệu SVD được chính xác và ổn định hơn. 2. Áp dụng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC trong dược liệu SVD và các loài Panax khác có chứa chất này. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
40. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TIẾNG VIỆT [1] Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, Hà Nội. [2] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007) Thực vật học tập 1, NXBY học, Hà Nội. [3] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, tr. 711 - 714. [4] Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích - Phụ lục 7 - Thông tư 22/2009 TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc. [5] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr. 107-113, 216-250. [6] Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, tr. 79-82, 84-110. [7] Nguyễn Thượng Dong, TS. Trần Công Luận, TS. Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 263-266. [8] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr. 8-99, 162-196, 234-242 [9] Đỗ Thị Hà, Lê Thị Loan (2016), "Xây dựng phương pháp định lượng tanshinon IIA trong dược liệu đan sâm trồng ở Việt Nam bằng HPLC – DAD", Tạp chí dược liệu, 21(1+2), tr. 50-54 [10] Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐH Quốc Gia Hà Nội. [11] Nguyễn Thị Huệ (2017), Phân tích acid oleanolic và saponin tổng số trong rễ cây sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐH Quốc Gia Hà Nội. [12] Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích và Đoàn Thị Ngọc Hạnh (2005), "Nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam và đinh lăng trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr. 196-200 [13] Nguyễn Thị Thu Hương và Bùi Thị Kim Cúc (2006), Nghiên cứu phát triển dược liệu và Đông dược ở Việt Nam, Tác dụng bảo vệ gan của sâm Việt Nam @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
41. trong tổn thương gan thực nghiệm bằng ethanol, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 288-295. [14] Nguyễn Thị Thu Hương và Trần Mỹ Tiên, (2001), "Nghiên cứu tác dụng chống stress và chống trầm cảm của sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv. Araliaceae) và hoạt chất chính majonosid-R2", Tạp chí Dược liệu, 6(1), tr. 25-27. [15] Nguyễn Thị Thu Hương và và cộng sự (2001), Công trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch của sâm Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 464-466. [16] Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội, tr. 808 – 809. [17] Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên, Nguyễn Tập (2009), “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)”, Tạp chí dược liệu, 14(1), tr. 17-23. [18] Trần Công Luận (2002), Phân tích thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng), Đề tài cấp Bộ. [19] Nguyễn Thị Bích Ngọc (2014), Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC, Khóa luận tốt nghiệp- Trường ĐH Dược Hà Nội [20] Thái Phan Quỳnh Như (2001), Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương - Bộ y tế. [21] Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 10(3), tr. 71-76. [22] Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2006), “Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 11(5), tr. 177-180. [23] Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học tập 1, NXB Y học – Bộ Y tế, tr. 191-213. [24] Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Huệ, Đặng Thị Thùy, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Dương Thị Phượng, Phạm Thị Tuyết Nhung, Hà Vân Oanh, Dương Thị Ly Hương, Nguyễn Hữu Tùng (2018), “Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) thu hái ở Sa Pa, Lào Cai”, Tạp chí Dược liệu, 2(23), tr. 82-88. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
42. [25] Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động để nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 11(5), tr. 202-206. [26] Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2005), "Nghiên cứu một số tác dụng dược lý của lá sâm Việt Nam - Tác dụng chống stress và tác dụng chống oxy hóa", Tạp chí Dược liệu, 10(1), tr. 27-32. [27] Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn hoá phân tích (2006), Hoá phân tích II, tr. 17, 99-146, 173-222. [28] Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr. 199 – 222, 493 – 685. B. TIẾNG ANH [29] Y. Fan, D. Y. Guo, Q. Song, and T. Li (2013), "Effect of total saponin of aralia taibaiensis on proliferation of leukemia cells", "Zhong Yao Cai", 36(4), pp. 604-607. [30] C. Liang, Y. Ding, H. T. Nguyen, J. A. Kim, H. J. Boo, H. K. Kang, et al. (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", "Bioorg Med Chem Lett", 20(23), pp. 7110-7115. [31] Zhitao Liang, Zhihong Jiang, David Wangfun Fong, ZhongzhenZhao (2009), “Determination of acid oleanolic and ursolic acid in Oldenlandia diffusa and its substitute using high performance liquid chromatography”, Journal of food and drug analysis, 17(2), pp. 69-77. [32] B. Mutschlechner, S. Schwaiger, T. V. A. Tran, and H. Stuppner (2018), "Development of a selective HPLC-DAD/ELSD method for the qualitative and quantitative assessment of commercially available Eurycoma longifolia products and plant extracts", "Fitoterapia", 124,pp. 188-192. [33] H. T. Nguyen, H. Q. Tran, T. T. Nguyen, V. M. Chau, K. A. Bui, Q. L. Pham, et al. (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", "Chem Pharm Bull (Tokyo)", 59(11), pp. 1417-1420. [34] Y. Satoh, S. Sakai, M. Katsumata, M. Nagasao, M. Miyakoshi, Y. Ida, et al. (1994), "Oleanolic acid saponins from root-bark of Aralia elata", "Phytochemistry", 36(1), pp. 147-152. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
43. [35] M. Schwarz, B. Klier, and H. Sievers (2009), "Herbal reference standards", "Planta Med", 75(7), pp. 689-703. [36] H. F. Tang, Y. H. Yi, Z. Z. Wang, Y. P. Jiang, and Y. Q. Li (1997), "Oleanolic acid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis", "Yao Xue Xue Bao", 32(9), pp. 685-90. [37] D. Q. Wang, J. Fan, B. S. Feng, S. R. Li, X. B. Wang, C. R. Yang, et al. (1989), "[Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var. bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng]", "Yao Xue Xue Bao", 24(8), pp. 593-599. [38] Y. Weng, L. Yu, J. Cui, Y. R. Zhu, C. Guo, G. Wei, et al. (2014), "Antihyperglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of total saponins extracted from Aralia taibaiensis in experimental type 2 diabetic rats", "J Ethnopharmacol", 152(3), pp. 553-560. [39] M. Xi, C. Hai, H. Tang, A. Wen, H. Chen, R. Liu, et al. (2010), "Antioxidant and antiglycation properties of triterpenoid saponins from Aralia taibaiensis traditionally used for treating diabetes mellitus", "Redox Rep", 15(1), pp. 20- 28. [40] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva. C. Trang web [41] [42] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
44. PHỤ LỤC Phụ lục 01. Phiếu kết quả giám định mẫu Phụ lục 02. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Phụ lục 03. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Phụ lục 04. Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) Phụ lục 05. Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
45. Phụ lục 01. Phiếu kết quả giám định mẫu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
46. Phụ lục 02. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 15,625 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 37,5 µg/ml @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
47. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 75 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 150 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 200 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 300 µg/ml @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
48. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 400 µg/ml @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
49. Phụ lục 03 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Kiểm tra tính thích hợp hệ thống @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
50. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
51. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
52. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
53. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
54. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
55. PHỤ LỤC 04. Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
56. PHỤ LỤC 05. Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
57. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU