Khóa luận Tìm kiếm một số hợp chất thiên nhiên có tác dụng hạ đường huyết hướng điều trị tiểu đường tuýp 2 sử dụng phương pháp in silico

Nội dung text: Khóa luận Tìm kiếm một số hợp chất thiên nhiên có tác dụng hạ đường huyết hướng điều trị tiểu đường tuýp 2 sử dụng phương pháp in silico

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC SINH VIÊN: PHẠM THỊ THU UYÊN ĐỀ TÀI TÌM KIẾM HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT HƢỚNG ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƢỜNG TUÝP 2 SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SILICO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2020
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC Người thực hiệLn:ờ iPH cảmẠ Mơn THỊ THU UYÊN Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới người thầy của tôi – TS. Phạm Thế Hải, người thầy đã ân cần quan tâm, động viên, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi từ những bước đi chập chững đầu tiên trên con đường nghiên cứu khoa học và trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận. ĐỀ TÀI Tôi xin chân thành cảm ơn Ths. Hà Thị Thanh Hương công tác tại Khoa Y Dược, Trường Đại học Quốc gia Hà Nội, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trìnhTÌM nhận vàKI thẾựcM hiệ nH đềỢ tài.P CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ TÁC DỤTôiNG cũng H xinẠ đư ĐƢợc cảỜm NGơn cô LêHUY Thị ThuẾ THư HƢờng đãỚ dNGẫn dắ t ĐItôi trongỀU nhTRữngỊ bước đi đầu tiên thực hiện khóa luận của mình. TIỂTôiU xinĐƢ cảỜm ơnNG ngư ờTUÝPi bạn trong 2 nhóm SỬ nghiên DỤ NGcứu c ủPHƢƠNGa mình, em Lại Đ ứPHÁPc Anh đã hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua.IN SILICO Tôi cũng vô cùng biết ơn và xin được chân thành cảm ơn, các thầy cô ở bộ môn DượcKHÓA liệu và LUdượẬcN h ọTcỐ cTổ truyNGHIền, ỆcácP ĐthẠầIy HcôỌ ởC Phòng NGÀNH đào DƢtạo Ợ&C CTHSSV, SĨ cũng như các thầy cô trong Hội đồng chấm Khóa luận tốt nghiệp đã hết sức nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Khóa:Cuối cùng, QH tôi- 2015Y xin dành sự biết ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ tôi và tất cả những người thân trong gia đình đã luôn ở bên yêu thương, ủng hộ để tôi có được ngày hôm nay!Ngư ời hướng dẫn: TS. PHẠM THẾ HẢI ThS. HÀ THỊ THANHHà Nộ HƢƠNGi, ngày 10, tháng 5, năm 2020 Phạm Thị Thu Uyên HÀ NỘI - 2020
3. Lời cảm ơn Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới người thầy của tôi – TS. Phạm Thế Hải, người thầy đã ân cần quan tâm, động viên, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi từ những bước đi chập chững đầu tiên trên con đường nghiên cứu khoa học và trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn Ths. Hà Thị Thanh Hương công tác tại Khoa Y Dược, Trường Đại học Quốc gia Hà Nội, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình nhận và thực hiện đề tài. Tôi cũng xin được cảm ơn cô Lê Thị Thu Hường đã dẫn dắt tôi trong những bước đi đầu tiên thực hiện khóa luận của mình. Tôi xin cảm ơn người bạn trong nhóm nghiên cứu của mình, em Lại Đức Anh đã hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi cũng vô cùng biết ơn và xin được chân thành cảm ơn, các thầy cô ở bộ môn Dược liệu và dược học cổ truyền, các thầy cô ở Phòng đào tạo & CTHSSV, cũng như các thầy cô trong Hội đồng chấm Khóa luận tốt nghiệp đã hết sức nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Cuối cùng, tôi xin dành sự biết ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ tôi và tất cả những người thân trong gia đình đã luôn ở bên yêu thương, ủng hộ để tôi có được ngày hôm nay! Hà Nội, ngày 10, tháng 6, năm 2020 Phạm Thị Thu Uyên i
4. DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ALX Alloxan CSDL Cơ sở dữ liệu CVD Bệnh tim mạch DPP4 Dipeptidyl peptidase-4 ĐTĐ Đái tháo đường IC50 Nồng độ ức chế 50% IDF Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới GIP Peptide insulinotropic phụ thuộc glucose GLP-1 Peptide giống glucagon 1 GLUT2 Vận chuyển glucose loại 2 HbA1c Huyết sắc tố glycosyl hóa LADA Latent Autoimmune Diabetes of Adulthood PPARγ Thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator γ (Peroxisome proliferator- activated receptors gamma) QSAR Mô hình liên quan giữa cấu trúc và tác dụng RMSD Root mean square deviation (Độ lệch căn quân phương) ROS Loại oxy phản ứng ii
5. SGLT2 Protein đồng vận chuyển glucose 2 ( Sodium-glucose cotransporter-2) SMILES Simplified Molecular Input Line Entry Specification STZ Streptozotocin TrS Tập huấn luyện (Training set) TS Tập kiểm tra (Test set) TSPT Tham số phân tử TZD Thiazolidinedione iii
6. MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ vii ĐẶT VẤN ĐỀ viii CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1 1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường 1 1.1.1. Khái niệm 1 1.1.2. Phân loại 1 1.1.3. Các liệu pháp hiện tại cho ĐTĐ tuýp 2 4 1.2. Mô hình in silico trong nghiên cứu phát triển thuốc mới 8 1.3. Đại cương về QSAR 10 1.4. Kỹ thuật Protein docking. 12 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên liệu 14 2.1.1. Dữ liệu các chất có hoạt tính dùng để xây dựng mô hình QSAR 14 2.1.2. Dữ liệu các chất có hoạt tính dùng để xây dựng mô hình phân biệt 15 2.1.3. Cơ sở dữ liệu dùng để sàng lọc hoạt tính 15 2.1.4. Cấu trúc tinh thể của các protein dùng trong nghiên cứu Docking 15 2.2. Thiết bị, phần mềm 16 2.3. Nội dung nghiên cứu 17 2.4. Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1. Xây dựng mô hình QSAR dự đoán hoạt tính trên các đích ĐTĐ tuýp 2 đã chọn. 18 2.4.2. Sàng lọc in silico các hợp chất thiên nhiên hướng tác dụng trên đích ĐTĐ tuýp 2: PPARγ và SGLT2 22 2.4.3. Mô phỏng protein docking 23 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1. Kết quả nghiên cứu 25 3.1.1. Kết quả xây dựng hai mô hình QSAR trên phần mềm MobyDigs cho phép tìm kiếm các hợp chất có tác dụng sinh học trên từng đích phân tử là PPARγ và SGLT2 hướng điều trị ĐTĐ tuýp 2. 25 3.1.2. Kết quả sàng lọc được một số hợp chất thiên nhiên có tác dụng điều trị tiểu đường tuýp 2 sử dụng hai mô hình QSAR đã xây dựng. 25 iv
7. 3.1.3. Kết quả kiểm tra tác dụng của các hợp chất đã sàng lọc qua mô hình in vivo 27 3.2. Bàn luận 28 3.2.1. Đánh giá kết quả xây dựng hai mô hình QSAR trên phần mềm MobyDigs cho phép tìm kiếm các hợp chất có tác dụng sinh học trên từng đích phân tử là PPARγ và SGLT2 hướng điều trị ĐTĐ tuýp 2 28 3.2.2. Về các hợp chất đã sàng lọc theo hai mô hình QSAR đã xây dựng. 33 3.2.3. Đánh giá lại tác dụng của các hợp chất đã sàng lọc qua mô hình máy tính in vivo 35 KẾT LUẬN 39 KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 v
8. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các liệu pháp điều trị ĐTĐ hiện đang được phép sử dụng 5 Bảng 2.1. Các phần mềm tính tham số phân tử thông dụng 19 Bảng 3.1. Các hợp chất có tác dựng đồng thời trên 2 đích phân tử là PPARγ và SGLT2. . 26 Bảng 3.2. Các hợp chất được dự đoán là có hoạt tính in vivo 28 Bảng 3.3. Kết quả đánh giá nội và đánh ngoại mô hình QSAR 30 Bảng 3.4: Bảng ý nghĩa các của các tham số phân tử trong mô hình QSAR trên đích PPARγ 31 Bảng 3.5: Bảng ý nghĩa các của các tham số phân tử trong mô hình QSAR trên đích SGLT2 32 Bảng 3.6. Giá trị Score của các hợp chất trong Docking trên 2 đích phân tử 33 Bảng 3.7. Kết quả Docking của 4 hợp chất đã sàng lọc được trên đích PPARγ 35 Bảng 3.8. Kết quả Docking của 4 hợp chất đã sàng lọc được trên đích SGLT2 36 Bảng 3.9. Một số thông tin về các hợp chất thu được sau quá trình sàng lọc. 37 vi
9. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Quá trình nghiên cứu phát triển thuốc 9 Hình 2.1. Cấu trúc khung các chất chủ vận PPARγ trong cơ sở dữ liệu 14 Hình 2.2. Cấu trúc 3D của thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator-γ 15 Hình 2.3. Cấu trúc 3D của Protein đồng vận chuyển natri - glucose 2 16 Hình 2.4. Quá trình nghiên cứu đề tài tìm kiếm hợp chất hợp chất thiên nhiên có tác dụng trên các đích điều trị ĐTĐ tuýp 2 (PPARγ và SGLT2) theo mô hình in silico và in vivo 18 Hình 3.1. Khả năng kích thích thực tế so với số liệu tính toán của tập dữ liệu các chất kích hoạt PPARγ 29 Hình 3.2. Khả năng ức chế thực tế so với số liệu tính toán của tập dữ liệu các chất ức chế SGLT2 29 vii
10. ĐẶT VẤN ĐỀ Thống kê từ liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (International Diabetes Federation) năm 2015 cho thấy, ước tính có khoảng 415 triệu người (nằm trong độ tuổi từ 20-79) mắc bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) và hơn 5 triệu ca tử vong trên tổng số 111 nước được nghiên cứu [38]. Khoảng 75% những người mắc và chết do tiểu đường đến từ các nước có thu nhập thấp và trung bình. Trong đó bệnh đái tháo đường tuýp 2 chiếm hơn 90% các trường hợp mắc. Số ca mắc và tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường đều tăng đều đặn trong vài thập kỷ qua. Các liệu pháp ngăn ngừa và điều trị hiện tại mặc dù có hiệu quả, tuy nhiên cũng còn nhiều hạn chế như: sử dụng Biguanide sẽ gây ra các vấn đề về tiêu hóa, Sulfonylureas gây hạ đường huyết, tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch Mặt khác chi phí trực tiếp cần thiết cho việc theo dõi lâu dài bệnh tiểu đường và các biến chứng của nó là một gánh nặng đáng kể đối với các nền kinh tế quốc gia. Người ta ước tính rằng 12% chi phí chăm sóc sức khỏe toàn cầu được chi cho bệnh tiểu đường và tỷ lệ mắc trên toàn thế giới dự kiến sẽ tăng từ 8.8% trong năm 2015 lên 10,4% vào năm 2040. Gánh nặng kinh tế toàn cầu của căn bệnh này có thể được dự kiến sẽ tăng vọt [38]. Do đó, cần phải đầu tư vào nghiên cứu các liệu pháp mới trong điều trị và quản lý bệnh tiểu đường. Nhiều nhóm thuốc hướng điều trị ĐTĐ tuýp 2 đã được phát triển và được đưa vào sử dụng rộng rãi như: insulin, nhóm thuốc biguanid, thiazolidinedione (TZD), sulfonylurea, meglitinide, chất ức chế α-glucosidase hay dipeptidyl peptidase-4 (DPP4), các chất đồng vận thụ thể GLP-1 và các chất tương tự amylin. Chúng hoạt động chủ yếu theo 2 cơ chế là giảm hấp thu glucose đường ruột và kích thích tế bào β đảo tuỵ. Trong các thuốc mới phát triển, nhiều hoạt chất được tìm thấy thông qua quá trình thiết kế và sàng lọc hợp lý với sự hỗ trợ của các mô hình máy tính (in silico), đặc biệt là các mô hình liên quan định lượng giữa cấu trúc và tác dụng (QSAR). Các mô hình in silico có lợi thế so với các mô hình thực nghiệm truyền thống về thời gian và chi phí vận hành. Hiện nay các mô hình in silico đã trở thành một phần không thể tách rời trong các dự án nghiên cứu và phát triển thuốc mới, chúng được sử dụng trong giai đoạn sàng lọc các thư viện hoá học lớn nhằm tìm kiếm hợp chất tiềm năng cho các nghiên cứu thực nghiệm [29]. Nghiên cứu khoa học về thực vật là một chiến lược thay thế hiệu quả để tìm ra các tác nhân trị liệu mới. Ví dụ, 1,1-dimethylbiguanide, hoạt chất trong thuốc metformin trị đái tháo đường nổi tiếng, có nguồn gốc từ guanidine - một hợp chất hạ huyết áp được phát hiện từ cây lilac của Pháp, Galega officinalis [5]. Một số loại viii
11. thuốc thông thường được kê đơn cũng được phát hiện từ thực vật. Các ví dụ phổ biến bao gồm morphine giảm đau từ Papaver somniferum (thuốc phiện), thuốc chống viêm aspirin từ Salix alba (cây liễu trắng) và thuốc chống sốt rét, quinine từ Cinchona succirubra [17]. Vì vậy nghiên cứu khoa học về cây thuốc dựa trên bằng chứng để khám phá các sản phẩm tự nhiên hoạt tính sinh học với các ứng dụng điều trị là một con đường đầy hứa hẹn để thiết lập các liệu pháp mới cho bệnh này. Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên dược liệu vô cùng dồi dào và phong phú, đây là một nguồn quan trọng và đầy hứa hẹn để xác định các hợp chất chống đái tháo đường mới. Hàng ngàn hoạt chất đã được xác định và phân lập từ các cây dược liệu là nguyên liệu vô cùng quý giá cho các nghiên cứu sàng lọc tìm kiếm các hợp chất dẫn đường có tác dụng tốt trong kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2. Từ những phân tích nêu trên, nhằm góp phần tìm kiếm các chất có hoạt tính tốt phù hợp phát triển thành thuốc điều trị ĐTĐ tuýp 2, tôi tiến hành đề tài “Tìm kiếm một số hợp chất thiên nhiên có tác dụng hạ đường huyết hướng điều trị tiểu đường tuýp 2 sử dụng phương pháp in silico” với mục tiêu chính như sau: 1. Xây dựng hai mô hình QSAR cho phép tìm kiếm các hợp chất có tác dụng sinh học trên từng đích phân tử là PPARγ và SGLT2 hướng điều trị ĐTĐ tuýp 2. 2. Sàng lọc được một số hợp chất thiên nhiên có tác dụng điều trị tiểu đường tuýp 2 sử dụng hai mô hình QSAR đã xây dựng. 3. Kiểm tra hoạt tính sinh học của các hợp chất đã sàng lọc qua mô hình in vivo. ix
12. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đƣờng 1.1.1. Khái niệm Theo Bộ Y tế Việt Nam năm 2017, Đái tháo đường (ĐTĐ) được định nghĩa là “bệnh rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếm khuyết về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai. Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrate, protide, lipide, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh”[1]. Theo số liệu của Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF-International Diabetes Federation), năm 2015, trong 111 nước được điều tra có đến 415 triệu người (20-79 tuổi) mắc ĐTĐ, và ước tính đến năm 2040 con số này sẽ tăng lên 642 triệu, tức là cứ 10 người có 1 người bị ĐTĐ. Mặt khác, cùng với việc sử dụng thực phẩm không khoa học, an toàn, thiếu vận động ở trẻ nhỏ, bệnh ĐTĐ tuýp 2 đang có xu hướng tăng ở cả trẻ em, trở thành một trong những vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng. Bệnh ĐTĐ gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, điển hình như các bệnh tim mạch (tăng huyết áp, xơ vữa động mạch, ), mắt (đục thủy tinh thể), thận (suy thận), và cắt cụt chi [1]. Tại Việt Nam, năm 2012, tỷ lệ hiện mắc ĐTĐ trên toàn quốc ở người trưởng thành là 5.42%, tỷ lệ ĐTĐ chưa được chẩn đoán trong cộng đồng là 63.6%. Theo kết quả điều tra STEPwise về các yếu tố nguy cơ của bệnh không lây nhiễm do Bộ Y tế thực hiện năm 2015 ở nhóm từ 18-69 tuổi cho thấy tỷ lệ ĐTĐ toàn quốc là 4,1%, tiền ĐTĐ là 3,6% [1]. 1.1.2. Phân loại a) Đái tháo đường tuýp 1 (do phá hủy tế bào beta tụy, dẫn đến thiếu insulin tuyệt đối) [1]. Đái tháo đường tuýp 1 chiếm 5 - 10% của tất cả các trường hợp đái tháo đường do tế bào beta bị tàn phá nên bệnh nhân không còn hoặc còn rất ít insulin. Trong đó, 95% là do cơ chế tự miễn (tuýp 1A), 5% vô căn (tuýp 1B). Bệnh nhân bị giảm lượng insulin, tăng glucagon trong máu, nếu không điều trị sẽ bị nhiễm toan ceton. Bệnh ĐTĐ tuýp 1 có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi nhưng chủ yếu xuất hiện từ sớm (trẻ em, thiếu niên). Bệnh nhân cần bổ sung insulin để ổn định đường huyết. Người lớn 1
13. tuổi có thể bị ĐTĐ tự miễn diễn tiến chậm (LADA - Latent Autoimmune Diabetes of Adulthood), ban đầu bệnh nhân còn đủ insulin nên chưa bị nhiễm toan ceton và có thể điều trị bằng thuốc viên nhưng tình trạng thiếu insulin sẽ nặng dần theo thời gian [1]. Dấu ấn di truyền của ĐTĐ tuýp 1: Mẹ bị ĐTĐ tuýp 1 nguy cơ con bị là 3%, nguy cơ tăng đến 6% nếu cha bị ĐTĐ. Tỉ lệ cùng mắc ĐTĐ tuýp 1 ở hai trẻ sinh đôi cùng trứng là 25-50% [1]. Yếu tố môi trường của ĐTĐ tuýp 1: rubella bẩm sinh, virus quai bị, thuốc diệt chuột Vacor, hydrogen cyanide ở rễ cây sắn có liên quan đến ĐTĐ tuýp 1 [1]. b) Đái tháo đường tuýp 2 (do giảm chức năng của tế bào β tuyến tụy tiến triển trên nền tảng đề kháng insulin) [1]. Đái tháo đường tuýp 2 trước kia được gọi là ĐTĐ của người lớn tuổi hay ĐTĐ không phụ thuộc insulin, là dạng phổ biến nhất của bệnh ĐTĐ (chiếm 90-95% trong tất cả các trường hợp) và do đó là trọng tâm chính của nghiên cứu bệnh tiểu đường. Kháng insulin và sự suy giảm liên tục của tế bào β đảo tụy là trung tâm của căn nguyên của ĐTĐ tuýp 2 [22]. Tuy nhiên thường ở giai đoạn đầu hoặc có khi suốt cuộc sống bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2 không cần bổ sung insulin để sống sót. Bệnh nhân không có sự phá hủy tế bào β do tự miễn, không có kháng thể tự miễn trong máu. Do tình trạng kháng insulin, trong giai đoạn đầu tế bào β sẽ bù trừ và tăng tiết insulin trong máu, nếu tình trạng này kéo dài hoặc nặng dần, tế bào β sẽ không tiết đủ insulin và ĐTĐ tuýp 2 lâm sàng sẽ xuất hiện. Sự kháng insulin cũng có thể cải thiện khi giảm cân, hoặc dùng một số thuốc nhưng không bao giờ hoàn toàn trở lại bình thường [1]. Tăng đường huyết (mức đường huyết lúc đói ≥ 7,0 mmol/L, hoặc mức đường huyết ngẫu nhiên ≥ 11,1 mmol / L) là đặc điểm bất thường về sinh lý của bệnh tiểu đường. Do đó, việc đo mức đường huyết được sử dụng để sàng lọc, chẩn đoán và theo dõi bệnh tiểu đường [1],[7]. Có bốn loại xét nghiệm có sẵn: (1) đường huyết lúc đói; (2) xét nghiệm dung nạp glucose đường uống; (3) xét nghiệm glucose ngẫu nhiên; và (4) HbA1c, hoặc xét nghiệm hemoglobin glycated. Hầu đa bệnh nhân có triệu chứng béo phì hoặc thừa cân và/hoặc béo phì vùng bụng với vòng eo to. Nồng độ đường huyết cao kéo dài (như trong trường hợp bệnh tiểu đường) gây tổn hại cho nhiều hệ thống cơ quan. Do đó, ĐTĐ tuýp 2 có liên quan đến các biến chứng nặng nề lâu dài góp phần gây ra tỷ lệ mắc bệnh và tử vong 2
14. cao. Ví dụ, tổn thương mạch máu và thần kinh do tăng đường huyết mãn tính thúc đẩy sự tiến triển của bệnh tim mạch (CVD), và có thể dẫn đến mất thị lực và suy thận [52]. Bệnh võng mạc do tiểu đường là nguyên nhân chính gây mù có thể phòng ngừa được, trong khi bệnh thận do tiểu đường là nguyên nhân chính gây ra bệnh thận [60]. Do đó, việc kiểm soát tăng đường huyết ở mức thích hợp là mục tiêu chính của điều trị bệnh tiểu đường và nhằm mục đích giảm thiểu sự phát triển của các biến chứng mãn tính. Nguy cơ ĐTĐ tuýp 2 gia tăng với tuổi, béo phì và ít vận động. ĐTĐ tuýp 2 cũng thường xuất hiện ở phụ nữ có tiền sử ĐTĐ thai kỳ, những người có tăng huyết áp, rối loạn lipid máu và ở một số sắc tộc nhạy cảm như Mỹ da đen, Mỹ bản địa, người Mỹ gốc La tinh, Mỹ gốc Á, dân châu Mỹ La tinh, người gốc Nam Á, một số đảo vùng Thái Bình Dương. Yếu tố di truyền cũng ảnh hưởng mạnh trong bệnh ĐTĐ tuýp 2, tỉ lệ cùng bị ĐTĐ của hai người sinh đôi cùng trứng là 90%, hầu hết người ĐTĐ típ 2 đều có thân nhân bị ĐTĐ. Có thể bệnh do ảnh hưởng của nhiều gen chi phối. Nếu phát hiện một gen cụ thể gây tăng glucose huyết, bệnh nhân sẽ được xếp vào thể bệnh chuyên biệt của ĐTĐ [1]. Yếu tố môi trường: Bệnh tiểu đường tuýp 2 là kết quả của sự tương tác giữa khuynh hướng di truyền và các yếu tố rủi ro môi trường có thể thay đổi và không thể sửa đổi như béo phì, chế độ ăn uống kém và ít vận động [1]. c) Đái tháo đường thai kỳ (là ĐTĐ được chẩn đoán trong 3 tháng giữa hoặc 3 tháng cuối của thai kỳ và không có bằng chứng về ĐTĐ tuýp 1, tuýp 2 trước đó) [1]. ĐTĐ thai kỳ là tình trạng rối loạn đường huyết ở bất kỳ mức độ nào được chẩn đoán trong 3 tháng giữa hoặc 3 tháng cuối của thời kỳ mang thai và không có bằng chứng về ĐTĐ tuýp 1 hay tuýp 2 trước đó. Sau thời gian sinh phần lớn glucose máu trở về bình thường, chỉ có một số ít tiến triển thành ĐTĐ tuýp 2. Thai phụ sẽ được chẩn đoán là ĐTĐ chưa được chẩn đoán hoặc chưa được phát hiện nếu có thai 3 tháng đầu được phát hiện tăng glucose huyết và dùng tiêu chí chẩn đoán như ở người không có thai. ĐTĐ thai kỳ có xu hướng gặp ở phụ nữ thừa cân, béo phì, nhiều tuổi hay phụ nữ sinh đẻ nhiều lần. d) Thể bệnh chuyên biệt của ĐTĐ do các nguyên nhân khác, như [1]: 3
15. - Sự khiếm khuyết trên nhiễm sắc thể thường, di truyền theo gen trội tại tế bào beta (ĐTĐ đơn gen thể MODY). - Khiếm khuyết trên nhiễm sắc thể thường, di truyền theo gen lặn tại tế bào beta. - Khiếm khuyết gen liên quan đến hoạt tính insulin. - Bệnh lý của tụy. - Bệnh lý nội tiết. - Do thuốc, hóa chất. - Các hội chứng bất thường nhiễm sắc thể khác (Hội chứng Down, Klinefelter, Turner, ) 1.1.3. Các liệu pháp hiện tại cho ĐTĐ tuýp 2 Một số liệu pháp dược phẩm hiện đang có sẵn để điều trị ĐTĐ tuýp 2 (Bảng 1.1) với các phương thức hoạt động khác nhau. Ví dụ, sulfonylureas và meglitinide là các chất tiết insulin; tức là chúng kích thích tiết insulin bằng cách kích tích tế bào β của tuyến tụy [30]. Biguanide và thiazolidinediones là thuốc gây nhạy cảm với insulin (còn được gọi là insulinomimetic) [32]. Acarbose ức chế α - glucosidase trong lòng của ruột non và làm chậm quá trình tiêu hóa và hấp thu carbohydrate trong chế độ ăn uống, do đó làm giảm chứng tăng đường huyết sau ăn [14]. Một loại liệu pháp chống đái tháo đường mới hơn dựa trên hoạt tính hạ đường huyết của hormone incretin peptide giống glucagon-1 (GLP-1) và peptide ức chế phụ thuộc glucose (GIP). GLP-1 và GIP điều chỉnh sự thèm ăn và cảm giác no, ức chế bài tiết glucagon và thúc đẩy sản xuất insulin. Chúng được sản xuất bởi các tế bào enteroendocrine trong đường tiêu hóa và bị thoái hóa nhanh chóng bởi dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4). Do đó các chất tương tự và chất chủ vận thụ thể của GLP-1 và GIP, và các chất ức chế DPP-4 có tác dụng điều trị chống lại ĐTĐ tuýp 2 [10, 15, 47]. Các chất ức chế đồng vận chuyển glucose (SGLT) là một nhóm thuốc uống mới khác để điều trị bệnh tiểu đường [23]. Các protein SGLT-2 trong ống lượn gần thận chịu trách nhiệm cho sự tái hấp thu glucose từ dịch lọc của cầu thận vào dòng máu [23]. Ức chế chọn lọc SGLT-2 tạo điều kiện cho glucose loại bỏ trong nước tiểu bằng cách ức chế tái hấp thu glucose ở thận [23, 44, 59]. Protein SGLT-1 là chất 4
16. vận chuyển glucose liên quan đến sự hấp thụ glucose ở ruột non và ức chế protein SGLT-1 làm chậm sự hấp thu glucose ở ruột và làm giảm mức đường huyết sau ăn. Các chất ức chế SGLT-1 vẫn đang trong giai đoạn nghiên cứu, tuy nhiên, một chất ức chế SGLT-1/2 kép, sotagliflozin, ức chế cả SGLT-1 và SGLT-2 đã cho thấy hiệu quả trong việc kiểm soát nồng độ glucose trong máu và thể hiện một phương pháp điều trị đầy hứa hẹn cho cả ĐTĐ tuýp 1 và ĐTĐ tuýp 2 [12, 36]. Bảng 1.1. Các liệu pháp điều trị ĐTĐ hiện đang được phép sử dụng Nhóm thuốc Đích tác Cơ chế tác Tác dụng Một số hoạt TL dụng dụng không chất TK mong muốn Insulin Thụ thể Điều hoà Hạ đường Insulin [34, insulin thiếu hụt / huyết, tăng glargine, 45] nhạy cảm cân, dị ứng Insulin lispro insulin Sulfonylurea Kênh K+ Kích thích Hạ đường Tolbutamide, [30] nhạy cảm tăng tiết huyết, tăng glipizide, ATP insulin cân, tăng glyburide, tuyến tụy nguy cơ mắc glimepiride bệnh CVD Meglitinide Kênh K Kích thích Hạ đường Repaglinide, [30] nhậy cảm tăng tiết huyết, tăng nateglinide ATP insulin cân tuyến tụy Biguanide Tăng độ nhạy Giảm sản Rối loạn tiêu Metformin [30] insulin xuất glucose hóa, nhiễm Giảm sản tại gan toan lactic, lượng glucose nguy cơ hạ của gan đường huyết trong liệu pháp phối hợp, 5
17. Thiazolidined PPARγ Tăng độ Nhiễm độc Pioglitazone, [30, ione nhạy insulin gan, tăng rosiglitazone 39, cân, phù, 46] thiếu máu, Chất chủ vận PPAR α và γ Giảm Viêm dạ Saroglitazar PPAR kép α triglyceride, dày, suy và γ tăng nhạy nhược, sốt cảm insulin Ức chế α- α- Giảm hấp Rối loạn tiêu Acarbose, [56] glucosidase glucosidase thu hóa miglitol carbohydrat e ở chế độ ăn uống Thuốc bắt GLP-1 Trì hoãn Rối loạn tiêu Exenatide, [16, chước việc làm hóa, buồn liraglutide 37] Incretin / chất rỗng dạ dày nôn, đau chủ vận bụng, sụt GLP-1 cân Chất ức chế Dipeptidyl Tăng nồng Tăng nguy Vildagliptin, [16, Dipeptidyl độ incretin cơ nhiễm sitagliptin, 37] peptidase-IV GLP-1 trong trùng, đau saxagliptin peptidase-IV (DPP4) máu đầu Ức chế kênh SGLT2 Ức chế tái Nhiễm toan Canagliflozi, [23, đồng vận hấp thu ceton dapagliflozin, 44, chuyển natri glucose, empagliflozin 59] – glucose thúc đẩy bài (SGLT2) tiết glucose trong nước tiểu 6
18. Hiện nay, các chất tiết insulin và metformin là nhóm thuốc được kê đơn rộng rãi nhất trong các liệu pháp chống tiểu đường. Metformin là thuốc ĐTĐ tuýp 2 phổ biến nhất và được kê đơn là liệu pháp đầu tay cho bệnh nhân tiểu đường thừa cân hoặc béo phì [9, 20]. Metformin làm tăng độ nhạy insulin bằng cách tăng cường sự hấp thu và sử dụng glucose của cơ bắp và cũng ngăn chặn sự phát sinh glucone ở gan [20, 33]. Ở những bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ tuýp 2 tiến triển, thuốc uống có thể không kiểm soát đầy đủ các triệu chứng tăng đường huyết và tiểu đường. Những bệnh nhân như vậy được cho sử dụng liệu pháp thay thế insulin. Sử dụng insulin thường thông qua dụng cụ tiêm bút insulin. Bơm insulin cũng là một lựa chọn; tuy nhiên, theo truyền thống nó chỉ được sử dụng bởi các bệnh nhân ĐTĐ tuýp 1 [20]. Điều trị bằng insulin được khuyến nghị khi 2 tháng 3 tháng điều trị bằng miệng với thuốc chống tiểu đường không đạt được mức HbA1c ≤ 7% [51]. Mặc dù các liệu pháp thông thường cho ĐTĐ tuýp 2 có thể hỗ trợ điều chỉnh lượng đường trong máu và kiểm soát các triệu chứng của bệnh tiểu đường, nhưng chúng không phải không có tác dụng phụ không mong muốn. Ví dụ, liệu pháp insulin và các chất tiết insulin có thể làm giảm mức đường huyết dẫn đến hạ đường huyết [30]. Sulfonylureas và thiazolidinediones có thể thúc đẩy tăng cân, trong khi biguanide và thuốc ức chế α -glucosidase thường gây ra tác dụng bất lợi cho đường tiêu hóa (Bảng 1.1). Do đó, việc tìm kiếm các liệu pháp thay thế hiệu quả với các tác dụng phụ ít gây hại hơn ngày càng là yêu cầu cấp thiết. 1.1.3.1. Thuốc ức chế kênh đồng vận chuyển Natri-glucose 2 (SGLT2 - Sodium Glucose Transporter 2) Sự phát minh ra thuốc ức chế kênh SGLT2 vào năm 2012, đã được nhìn nhận là một trong “10 bước tiến của y học năm 2012” do 1700 nhà khoa học đến từ các các lĩnh vực khác nhau bầu chọn, được tổ chức bởi viện trường danh tiếng Cleveland Clinic của Hoa Kỳ. Glucose được lọc qua cầu thận sau đó được tái hấp thu chủ yếu ở ống thận gần dưới tác dụng của các kênh đồng vận chuyển Natri-glucose (Sodium Glucose coTransporters - SGLT). Bình thường tại thận có hai kênh tái hấp thu glucose: SGLT1 và SGLT2. SGLT2 có ái lực thấp, khả năng vận chuyển cao, biểu lộ chính tại ống lượn gần, chiếm 90% khả năng tái hấp thu glucose tại ống thận. Do đó ức chế tác dụng kênh này ở bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2 sẽ làm tăng thải glucose qua đường tiểu và giúp giảm đường huyết [1]. 7
19. Vì cơ chế tác động trên ống thận không cần có sự hiện diện của insulin, do đó thuốc tác dụng trên SGLT2 có nguy cơ hạ đường huyết thấp và có hiệu quả giảm đường huyết trên các bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2 cả ở giai đoạn sớm và mắc bệnh lâu năm. Hiện nay tại Việt Nam chỉ lưu hành thuốc Dapagliflozin. Thuốc ức chế kênh SGLT2, ức chế sự hấp thu glucose tại ống thận, giảm đường huyết, giảm cân, và giảm huyết áp. Hiện tại thuốc ức chế kênh SGLT2 (Dapagliflozin, Empagliflozin, Canagliflozin) đã được chấp thuận bởi FDA và được lưu hành tại Hoa Kì. Các nghiên cứu ngẫu nhiên, mù đôi, giả dược, có đối chứng trên những bệnh nhân đái tháo đường típ 2 cho thấy tính hiệu quả và an toàn của thuốc ức chế kênh SGLT2 ở bệnh nhân Đông Á. Vì vậy đây là một đích phân tử đầy tiềm năng để thiết kế các thuốc điều trị ĐTĐ tuýp 2. 1.1.3.2. Kích hoạt thụ thể Peroxisome proliferator gamma (PPARγ) PPARγ (thụ thể gamma hoạt hóa bởi chất tăng sinh peroxisom) thuộc nhóm các yếu tố dịch mã, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa nồng độ glucose và lipid. Nó tồn tại ở 3 thể : PPAR-γ1, PPAR-γ2, và PPAR-γ3 [68]. Hoạt hóa PPARγ cải thiện tình trạng kháng insulin thông qua phân tử nhận dạng dẫn xuất từ mô mỡ hoặc cytokine của mô mỡ [69]. Giảm nồng độ cytokine mô mỡ bao gồm : TNF-α, IL-6, leptin, rexixtin và adiponectin liên quan tác dụng của thiazolinedion (TZD). Về cơ chế, chất liên kết TZD của PPARγ tạo sự biệt hóa tận cùng vả thúc đẩy biểu hiện PPARγ lạc chỗ trong các fibroblasts tân sinh tế bào mỡ khi có sự hiện hiện các chất đồng vận PPARγ. Một số mô hình QSAR đã được phát triển và ứng dụng hiệu quả trong sàng lọc tìm kiếm chất hoạt hóa PPARγ. Ví dụ như Khanna và cộng sự công bố nghiên cứu về sàng lọc hợp chất hoạt hóa đồng thời PPARα và PPARγ [66]. Hay Gee và nhóm nghiên cứu kết hợp QSAR và docking trong sàng lọc thư viện ZINC tìm kiếm chất hoạt hóa PPARγ [65], Tuy nhiên số lượng hợp chất sàng lọc còn khá hạn chế, các hợp chất tự nhiên hầu như chưa được nghiên cứu bằng các mô hình in silico đã phát triển. 1.2. Mô hình in silico trong nghiên cứu phát triển thuốc mới Phát triển thuốc mới là một quá trình rất phức tạp, tốn nhiều thời gian và tiền bạc (hàng tỷ đô la cho một loại thuốc mới) mà tỷ lệ thành công trong việc có được 8
20. từ một hợp chất dẫn đường ban đầu để thương mại hóa là rất thấp (< 2% của hợp chất mới đc nghiên cứu có thể có đặc tính sinh học phù hợp để làm thuốc). Theo nghiên cứu năm 2016 của DiMasi và cộng sự - Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc, Đại học Tufts Hoa Kỳ, trung bình cần hơn 2,5 tỷ đô với thời gian từ 10-15 năm cho mỗi dự án (nếu thành công) đưa một thuốc ra ngoài thị trường. Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc bao gồm nhiều khâu (Hình 1.1): xác định bệnh, xác định đích tác dụng của thuốc, thiết lập quy trình thử nghiệm, tìm kiếm hợp chất dẫn đường, xây dựng mối qua hệ giữa hợp chất và tác dụng, xác định pharmacophore, tối ưu hóa dược lực học và dược động học, sàng lọc in vitro (cơ quan phân lập, tế bào), nghiên cứu in vivo (nghiên cứu dược lý của hợp chất, mô hình hiệu quả điều trị bệnh, nghiên cứu sớm về độ an toàn và độc tính), các nghiên cứu tiền lâm sàng (độc tính), tiến hành bào chế, phát triển sản xuất, đăng kí giấy tờ pháp lí và thử nghiệm lâm sàng. Hình 1.1. Quá trình nghiên cứu phát triển thuốc Trong các nghiên cứu hiện nay, vấn đề thiết kế thuốc hiệu quả nhất đã được giải quyết bằng cách sử dụng kỹ thuật thiết kế thuốc dựa trên sự hỗ trợ của máy tính [8]. Trong quá trình đó máy tính được ứng dụng vào nhiều khâu, từ việc tìm kiếm các hợp chất hóa học có tác dụng sinh học, đến tối ưu hóa cấu trúc các hợp chất này nhằm tăng hoạt tính sinh học, giảm độc tính, tăng các tính chất dược động học của thuốc, đến các khâu nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng. Chúng được gọi chung là các phương pháp “in silico” nhằm phân biệt với các phương pháp còn lại như in 9
21. vivo, in situ và in vitro. So với các phương pháp thực nghiệm truyền thống các phương pháp in silico có ưu thế giúp thiết kế những phân tử thuốc mới với những ưu thế vượt trội như giải thích bản chất phân tử của các tương tác thuốc, rút ngắn thời gian thực hiện. Ngoài ra chúng cho phép dự đoán hoạt tính sinh học sử dụng các mô hình toán học, nghiên cứu dự đoán cơ chế tác dụng, cơ chế gây độc của các hợp chất. Các phương pháp này giúp tiết kiệm đáng kể cả thời gian và tiền bạc trong việc phát triển một thuốc mới. Các phương pháp in silico đã giúp ích nhiều cho việc phát hiện các hợp chất mới có hoạt tính sinh học ngay cả trước khi chúng được tổng hợp hay phân lập thông qua quá trình sàng lọc ảo (virtual screening) [8]. 1.3. Đại cƣơng về QSAR Các mô hình liên quan định lượng cấu trúc và tác dụng (Quantitative Structure Activity Relationships), viết tắt là QSAR, là một kỹ thuật dự đoán hoạt động, độ phản ứng và tính chất của một tập hợp phân tử chưa biết dựa trên phân tích phương trình kết nối các cấu trúc của phân tử với hoạt động và tính chất đo được tương ứng của chúng. QSAR được xây dựng trên nguyên lý cơ bản là cấu trúc của mỗi phân tử chứa các yếu tố quyết định đặc tính sinh học, vật lý, hóa lý của nó. Các hợp chất có cấu trúc giống nhau thường có hoạt tính tương tự nhau [3, 42]. Những đặc điểm hóa học này có thể là các thông số được xác định theo lý thuyết hoặc từ thực nghiệm (ví dụ: các loại đặc tính lý hóa của hợp chất như nhiệt độ bay hơi, khối lượng mol phân tử ). Do đó, bất kỳ yếu tố nào có chứa thông tin hóa học quan trọng đều có thể được sử dụng với vai trò là các biến dự báo hay các tham số mô tả. Như vậy, các đặc tính lý hóa như là nhiệt độ nóng chảy, thời gian bán hủy, sức căng bề mặt, đặc trưng cho một hợp chất đều chứa đựng thông tin liên quan có thể dùng để giải thích các đáp ứng liên quan đến hợp chất đó. Nói một cách toán học, mô hình QSAR có thể biểu diễn mối tương quan định lượng giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học của chúng thông qua hàm số: Y f (x) Trong đó: - Y là biến đáp ứng sinh học hoặc hóa học thường xác định được từ thực nghiệm và thể hiện bằng các giá trị như nồng độ ức chế 50% đối tượng đích (IC50), nồng độ phần trăm ức chế (I%), nồng độ 50% tác dụng tối đa (EC50) 10
22. - Các biến X1, X2, Xn là các đại lượng được sử dụng để mô tả cấu trúc phân tử hợp chất gọi là các tham số phân tử (molecular descriptor, TSPT).[3] Để xây dựng được hàm f(x), cần sử dụng các kỹ thuật thống kê (statistical) hoặc/và học máy (machine learning). Một số kỹ thuật thường được dùng trong xây dựng mô hình QSAR như phân tích hồi quy đa biến tuyến tính (Multiple Linear Regression), bình phương tối thiểu từng phần (Partial Least Squares), phân tích thành phần chính (Principal Component Analysis) [7]. Kỹ thuật học máy là một lĩnh vực của trí tuệ nhân tạo, liên quan đến việc nghiên cứu và xây dựng các kĩ thuật cho phép các hệ thống "học" tự động từ dữ liệu để giải quyết những vấn đề cụ thể. Trong thiết kế mô hình QSAR, phương pháp học máy thường được dùng là: mạng nơron nhân tạo (Artificial Neural Network), cây quyết định (Decision Tree), [6] Các bước để xây dựng mô hình QSAR [55] gồm: 1) Xây dựng cơ sở dữ liệu (CSDL); 2) Tính toán TSPT đặc trưng cho cấu trúc bằng sử dụng các phần mềm giúp biểu diễn và tính toán; 3) Xây dựng mô hình QSAR: Sử dụng các phương pháp xác suất thống kê và các kỹ thuật của trí tuệ nhân tạo để xây dựng mối liên hệ giữa các tham số phân tử (TSPT) và các giá trị đại lượng biểu diễn hoạt tính; 4) Đánh giá mô hình; 5) Giải thích các kết quả và sử dụng mô hình trong quá trình sàng lọc ảo (nếu có thể). Xây dựng cơ sở dữ liệu: CSDL thường là cấu trúc của các hợp chất hoá học đã được chứng minh hoạt tính sinh học in vitro. Để hạn chế các yếu tố gây sai số cho mô hình, CSDL thường sẽ được làm sạch dựa trên sự tương đồng về cấu trúc, về protocol, Các giá trị sinh học được hiệu chỉnh, mang tính đại diện và có ý nghĩa thống kê. Tính toán tham số mô tả phân tử đặc trưng cho cấu trúc: Đây là quá trình chuyển đổi toán học và lôgic chuyển đổi thông tin cấu trúc hóa học mã hóa thành dạng số giúp máy tính có thể “hiểu” được. Thiết kế tập huấn luyện và tập kiểm tra: CSDL được chia thành tập huấn luyện (TS-Training set) chiếm khoảng 70-80 %, được sử dụng để xây dựng mô hình và 11
23. tập kiểm tra (PS-Prediction set) để đánh giá khả năng dự đoán của các mô hình đã xây dựng được. Xây dựng mô hình QSAR: Sử dụng các phương pháp xác suất thống kê và các kỹ thuật của trí tuệ nhân tạo để xây dựng mối liên hệ giữa các tham số phân tử và giá trị đại lượng biểu diễn hoạt tính. Đánh giá mô hình: Đánh giá mô hình là giai đoạn quan trọng liên quan đến khả năng ứng dụng của mô hình. Mô hình cần có độ khớp, độ ổn định thông qua đánh giá nội trên tập TS và khả năng dự đoán tốt thông qua đánh giá ngoại trên tập PS dựa trên các thông số thống kê. Để đánh giá mô hình QSAR, các kĩ thuật hay được sử dụng đó là: đánh giá nội hay đánh giá chéo; đánh giá ngẫu nhiên Y; đánh giá bằng cách chia tệp dữ liệu thành các hợp chất để huấn luyện hay kiểm tra và đánh giá ngoại bằng cách áp dụng mô hình trên tập dữ liệu ngoại [21]. 1.4. Kỹ thuật Protein docking. Docking phân tử là một phương pháp mới để sàng lọc các chất ức chế enzyme và chất chủ vận thụ thể trong nghiên cứu bệnh tiểu đường. Phần mềm chuyên dụng sử dụng các mô hình phân tử ba chiều, độ phân giải cao của protein mục tiêu (ví dụ như thụ thể hoặc enzyme) làm khuôn mẫu để dự đoán các phối tử mới có thể liên kết và có khả năng điều chỉnh hoạt động của nó [50]. Cấu trúc khuôn mẫu có được thông qua mô hình tương đồng hoặc tinh thể học. Trong docking phân tử, mục tiêu phân tử hoạt động theo các hướng khác nhau và mức độ tự do hình thành liên tiếp nhanh chóng cho phép phần mềm sàng lọc cơ sở dữ liệu hỗn hợp theo cách thông lượng cao. Các chức năng chấm điểm tích hợp dự đoán hoạt động sinh học dựa trên sự tương tác giữa phối tử và protein mục tiêu có tính đến các yếu tố như hình dạng phối tử, khả năng tương thích tĩnh điện với mục tiêu, hiệu ứng hòa tan, năng lượng liên kết và hiệu ứng entanpy và entropy; tất cả đều là những yếu tố quyết định quan trọng của sự tương tác phối tử - thụ thể thành công [27]. Docking thực chất là một bài toán tối ưu, dùng để tìm vị trí và cấu hình phù hợp nhất của một cơ chất gắn kết lên protein. Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu chính của docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do của toàn hệ là thấp nhất, tương đương với cấu hình bền nhất sau khi tạo thành liên kết giữa phối tử và protein. Để tìm cấu hình phù hợp nhất, cần liên hệ cấu hình không gian với các trị số đánh giá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng thuật toán tìm kiếm. Quá trình docking bao gồm ba bước chính: 12
24. 1) Chuẩn bị cấu tử ; 2) Chuẩn bị protein ; 3) Mô phỏng docking. Chuẩn bị cấu tử: Cấu trúc các cấu tử có thể lấy từ các thư viện sẵn có như Pubchem, Zinc, cũng có thể được vẽ trên phần mềm ChemDraw, Chemsketch, Sau khi xây dựng được cấu trúc 3D, sử dụng phần mềm MOE để xử lí cấu tử theo các bước: chỉnh sửa điện tích cho phù hợp, tối giản hóa năng lượng, gắn trường lực cho phân tử, xây dựng file dbpqt. Chuẩn bị protein: Thường sử dụng các cấu trúc 3D của protein đã có sẵn trên ngân hàng dữ liệu protein (protein data bank). Trường hợp chưa có sẵn, chúng ta có thể xây dựng cấu trúc 3D theo phương pháp mô phỏng tính tương đồng (Homology modeling). Về cơ bản của phương pháp mô phỏng tương đồng là sắp xếp chuỗi amino acid của protein thu được bởi quá trình giải mã gen lên khung cấu trúc bậc 3 của protein có độ phân giải cao nhưng thiếu thông tin của toàn bộ amino acid. Sau khi có cấu trúc 3D, sử dùng các phần mềm để chuẩn bị protein cho chương trình mô phỏng docking. Các bước chuẩn bị thường gồm: loại nước và các cấu tử (nếu có), thêm hydro, gắn trường lực, phân tích vùng có khả năng tương tác, xây dựng file dbqpt. Mô phỏng docking: Trước khi tiến hành mô phỏng, cần sử dụng phần mềm để tìm kiếm túi tương tác trên protein để đánh giá khả năng liên kết của phối tử tại vị trí đó. Vị trí của vùng tìm kiếm thông thường sẽ được đặt ở trung tâm hoạt động của protein. Khi quá trình docking được tiến hành, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm cấu dạng phù hợp nhất của phối tử, tương ứng với năng lượng của toàn hệ thấp nhất. Cấu dạng này cùng với các tương tác sẽ được phân tích bởi các phần mềm chuyên dụng như: MOE, Discovery studio. 13
25. CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Dữ liệu các chất có hoạt tính dùng để xây dựng mô hình QSAR - Chất ức chế SGLT2 Gồm 110 hợp chất có hoạt tính ức chế SGLT2 được thu thập trực tiếp từ nghiên cứu của Chunlei Tang và cộng sự [54] (Phụ lục 1). Hoạt tính in vitro được biểu thị bằng nồng độ ức chế 50% (IC50) chất chủ vận. - Chất hoạt hóa PPARγ Cấu trúc hóa học cũng như hoạt tính hoạt hóa PPARγ của 88 hợp chất được thu thập trực tiếp từ nghiên cứu của Al-Najjar và cộng sự [64] (Phụ lục 2). Cấu trúc khung của các hợp chất này được thể hiện ở Hình 2.1. Hoạt tính in vitro được biểu thị bằng nồng độ của chất thử có khả năng ức chế 50% lượng chất chủ vận được đánh dấu huỳnh quang ở trạng thái kích thích PPARγ. Các thành phần dữ liệu đều chia thành tập huấn luyện và tập kiểm tra: Trong đó tập kiểm tra chiếm 20% được chọn một cách ngẫu nhiên. Hình 2.1. Cấu trúc khung các chất chủ vận PPARγ trong cơ sở dữ liệu 14
26. 2.1.2. Dữ liệu các chất có hoạt tính dùng để xây dựng mô hình phân biệt CSDL bao gồm 82 hợp chất kèm thông tin liên quan đã được xác định cấu trúc và tác dụng được tổng hợp từ các bài báo trong nước và quốc tế cho thấy tác dụng điều trị bênh tiểu đường trên các mô hình động vật (Phụ lục 3). 2.1.3. Cơ sở dữ liệu dùng để sàng lọc hoạt tính Cơ sở dữ liệu: Các hợp chất từ tự nhiên đã được phân lập và xác định cấu trúc trong các nghiên cứu trước đây được tổng hợp trên ngân hàng dữ liệu ChemBl. Thư viện dữ liệu hóa học sử dụng trong nghiên cứu bao gồm 758 hợp chất thiên nhiên với các thông tin liên quan. 2.1.4. Cấu trúc tinh thể của các protein dùng trong nghiên cứu Docking Cấu trúc 3D của protein được tải về từ ngân hàng dữ liệu protein (protein data bank) đồng thời được xử lý trước khi ứng dụng trong sàng lọc (Hình 2.2 và Hình 2.3). Hình 2.2. Cấu trúc 3D của thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator-γ 15
27. Hình 2.3. Cấu trúc 3D của Protein đồng vận chuyển Natri - glucose 2 2.2. Thiết bị, phần mềm Thiết bị: Sử dụng các phần mềm trên máy tính Asus Vivobook S14 – Hệ điều hành Windows 10. Phần mềm: Danh sách các phần mềm sử dụng bao gồm: - Phần mềm lưu trữ, hiệu chỉnh số liệu: Microsoft Excel 2010 - Phần mềm xây dựng cấu trúc hóa học: ChemDraw Professional bản 16.0. - Phần mềm tính toán tham số phân tử: Dragon 6.0 - Phần mềm xây dựng và tối ưu hóa mô hình QSAR: Statistica 12.0.5, và QSAR - MobyDigs. - Phần mềm mô phỏng Docking: gói ICM Pro bản 3.8-6 (Molsoft L.L.C.), phần mềm Autodock vina 1.1.2. - Phần mềm phân tích và biểu diễn tương tác: MGLtools 1.5.7, MOE bản 2009.10. 16
28. - Phần mềm nghiên cứu đặc điểm hóa lý và dược động học và độc tính (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion and Toxicity, ADMET): Volsurf bản 1.0.4, Toxtree bản 3.1.0 các công cụ trực tuyến như AdmetSAR phiên bản 2.0 và SwissADME. 2.3. Nội dung nghiên cứu 1. Xây dựng thư viện dữ liệu các hợp chất và tính toán các tham số phân tử. 2. Xây dựng mô hình QSAR của các hợp chất có tác dụng ức chế SGLT2 và mô hình QSAR của các hợp chất có tác dụng hoạt hóa PPARγ. 3. Xây dựng mô hình QSAR thể hiện mối tương quan giữa cấu trúc và tác dụng in vivo. 4. Tiến hành sàng lọc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học đồng thời trên cả hai đích SGLT2 và PPARγ. 5. Nghiên cứu Docking để đánh giá mức độ tương tác với trung tâm hoạt động trên đích tác dụng của các chất đã sàng lọc. 6. Kiểm tra các chất đã sàng lọc trên mô hình QSAR thể hiện mối tương quan giữa cấu trúc và tác dụng in vivo để tìm kiếm được các hợp chất tự nhiên ở Việt Nam có khả năng cao có tác dụng điều trị bệnh ĐTĐ tuýp 2 trên mô hình in vivo. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu này sử sụng phương pháp sàng lọc ảo qua hệ thống phễu lọc được xây dựng dựa trên tác dụng sinh học của các hợp chất đối với từng đích phân tử. Bao gồm các bước: - Xây dựng mô hình QSAR dự đoán hoạt tính trên các đích ĐTĐ tuýp 2 đã chọn. - Sàng lọc in silico các hợp chất thiên nhiên hướng tác dụng trên đích ĐTĐ tuýp 2: PPARγ và SGLT2 - Mô phỏng protein docking để đánh giá khả năng liên kết trong không gian của các cấu tử với đích tác dụng - Kiểm tra các chất đã sàng lọc trên mô hình QSAR xây dựng dựa trên các chất có tác dụng in vivo nhằm phân biệt các chất có hoạt tính hoặc không có hoạt tính in vivo. 17
29. Hình 2.4. Quá trình nghiên cứu đề tài tìm kiếm hợp chất hợp chất thiên nhiên có tác dụng trên các đích điều trị ĐTĐ tuýp 2 (PPARγ và SGLT2) theo mô hình in silico và in vivo. 2.4.1. Xây dựng mô hình QSAR dự đoán hoạt tính trên các đích ĐTĐ tuýp 2 đã chọn. Quy trình này tương tự cho các đích khác nhau, bao gồm: 1) Cơ chế ức chế SGLT2 ; 2) Cơ chế kích hoạt PPARγ ; 3) Có tác dụng trên các mô hình in vivo. Các bước tiến hành như sau: - Bước 1. Thu thập dữ liệu độc tính tế bào. Trong bước này, các CSDL được thu thập từ các công bố thực nghiệm. Số liệu được xử lý để phân thành nhóm có và không có hoạt tính (biến Y), phục vụ trong công tác xây dựng mô hình QSAR. Để hạn chế các yếu tố gây sai số cho mô hình, cơ sở dữ liệu thường sẽ được làm sạch dựa trên sự tương đồng về cấu trúc, về protocol, Sử dụng phần mềm Chemdraw Professional 16.0 để vẽ lại các công thức 2D và 3D. 18
30. - Bước 2. Tính toán tham số phân tử đặc trưng cho cấu trúc các chất trong cơ sở dữ liệu: Số lượng tham số phân tử mà phần mềm tính toán càng nhiều thì càng mô tả chính xác cấu trúc của hợp chất [2]. Bảng 2.1. Các phần mềm tính tham số phân tử thông dụng STT Tên phần Loại tham số tính đƣợc Số lƣợng mềm tham số 1 ADAPT Tham số cấu trúc hình học, hình học >260 tô pô, tham số điện tử, tham số lí hoá 2 ADMET Tham số điện tử, tham số hàm lượng 297 Predictor tử, tham số hình học tô pô 3 MOE Tham số hình học topo, tính chất vật >300 lý 4 Dragon Tham số cấu tạo cơ bản, tham số cấu 5270 trúc hình học và hình học tô pô Để tính toán được dãy tham số phân tử của các hợp chất trong dữ liệu, các hợp chất phải được tổng hợp thành CSDL với công thức được viết dưới dạng SMILES. Sau đó sử dụng phần mềm Dragon 6.0 tính toán các tham số phân tử của các hợp chất. Phần mềm Dragon 6.0 cho phép tính toán 5270 tham số phân tử. - Bước 3. Xây dựng mô hình QSAR trên từng đích phân tử với dạng tổng quát : Yi = ao + a1X1 + a2X2 + + anXn (1) Trong đó: 19
31. Xi là các TSPT được lựa chọn vào mô hình; Yi là IC50 của các hợp chất; ai là các hệ số tương ứng của từng TSPT được tính nhờ phần mềm MobyDigs bằng cách sử dụng các phương pháp xác xuất thống kê và các kỹ thuật của trí tuệ nhân tạo để xây dựng mối liên hệ giữa các tham số phân tử và giá trị đại lượng biểu diễn hoạt tính. CSDL được chia thành tập huấn luyện (TrS – training set) và tập kiểm tra (TS – test set). Trong đó TrS, chiếm 80% CSDL, được sử dụng cho việc huấn luyện mô hình. Tập TrS cho phép phát hiện mối quan hệ có khả năng dự đoán. Còn tập TS bao gồm các phân tử mà mô hình chưa bao giờ gặp giúp đánh giá khả năng ngoại suy của các các mô hình xây dựng được. Sử dụng phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến (Multiple Linear Regression - MLR) để xây dựng mô hình. Các mô hình MLR được xây dựng bằng phương pháp thuật giải di truyền trên phần mềm Mobydigs. - Bước 4. Đánh giá các mô hình xây dựng được. Các mô hình đã xây dựng được đánh giá dựa trên các tiêu chí [67], bao gồm: 1. Có đích cụ thể: Đích là những giá trị thực nghiệm về hoạt tính sinh học thu được tư cơ sở dữ liệu. Nếu toàn bộ CSDL đều sử dụng một protocol để xác định giá trị của đích, thì mô hình xây dựng được có độ tin cậy cao, có thể dùng để dự đoán hoạt tính các hợp chất mới (nếu thực nghiệm dùng theo quy trình này). Còn nếu CSDL sử dụng nhiều protocol khác nhau thì mô hình sẽ không có độ tin cậy cao [2]. 2. Thuật toán rõ ràng [2] Các thuật toán sử dụng để xây dựng mô hình cần được mô tả rõ ràng, có khả năng ứng dụng để xây dựng các mô hình khác. Cần xem xét các yếu tố sau khi đánh giá thuật toán: Dữ liệu về cấu trúc, hoạt tính sinh học đầy đủ, rõ ràng. Thuật toán tính toán các tham số phân tử rõ ràng. Mô tả về tập huấn luyện và tập quan sát, cách xác định giá trị ngoại lai (outlier). Mô tả thuật toán xây dựng mô hình. 20
32. Mô tả các thông số thống kê đánh giá mô hình. 3. Miền cấu trúc ứng dụng xác định [2] Miền cấu trúc ứng dụng là khoảng không gian cấu trúc được xác định bởi các hợp chất trong tập huấn luyện để xây dựng mô hình. Những hợp chất thuộc tấp huấn luyện nếu có cấu trúc nằm ngoài miền cấu trúc ứng dụng sẽ ảnh hưởng đến độ chính xác của mô hình. Những hợp chất thuộc tập dự đoán, nếu cấu có cấu trúc nằm ngoài miền này sẽ cho kết quả dự đoán không chính xác. 4. Có thước đo phù hợp để đánh giá độ chính xác, độ bền vững, khả năng dự 2 2 2 đoán. Các thông số được đánh giá gồm: R , Q , Q ext. Độ khớp hay độ tuyến tính được đánh giá thông qua giá hệ số xác định R2, R2 càng cao thì mức độ khớp (tuyến tính) của mô hình với các giá trị thực nghiệm càng tốt. R2 > 0,6 thì mô hình mới có ý nghĩa. Công thức tính hệ số xác định như sau: 2 n ^ (y i yi ) R 2 1 i 1 (2) n (yi y) i 1 ^ Trong đó n là số các quan sát của tập huấn luyện; yi, y , lần lượt là giá trị thực tế, giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i; y là giá trị thực tế trung bình của biến phụ thuộc. Độ ổn định được đánh giá thông qua hệ số tương quan chéo Q2, Q2 được đánh giá dựa trên phương pháp tham số chéo (cross validation leave one out) bằng cách lần lượt loại 1 quan sát ra khỏi tập huấn luyện, giữ nguyên các biến đã lựa chọn và tính toán lại các thông số của mô hình. Q2 càng gần 1, tính tổng quát hóa của mô hình càng cao, mô hình càng ổn định. Thông thường, yêu cầu Q2 > 0,5 thì mô hình mới bền vững. Công thức hệ số tương quan chéo tính như sau: 2 n ^ (y i yi / i ) Q 2 1 i 1 (3) n (yi y) i 1 21
33. Trong đó n là số các quan sát tập huấn luyện; yi, là giá trị thực tế của quan sát ^ thứ i; yi /i giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i sử dụng mô hình đã loại biến i; y là giá trị thực tế trung bình của biến phụ thuộc. Khả năng dự đoán ngoại 2 2 Khả năng dự đoán ngoại được đánh giá thông qua giá trị Q ext, Q ext càng lớn mô hình cho thấy độ tuyến tính của tập kiễm tra và do vậy chứng tỏ khả năng dự đoán của mô hình cao. 2 n ^ (y i yi ) Q 2 1 i 1 (4) ext n (yi y) i 1 ^ Trong đó n là số các quan sát tấp kiểm tra; yi, y , lần lượt là giá trị thực tế, giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i; là giá trị thực tế trung bình của biến phụ thuộc. 5. Giải thích cơ chế tác dụng nếu có thể. Mô hình cần được giải thích về vai trò của các biến trong mô hình, qua đó giúp định hướng thiết kế các hợp chất mới. Tuy nhiên việc giải thích các biến này nhiều khi gặp phải khó khăn vì cơ chế của chúng phức tạp đòi hỏi những hiểu biết chuyên sâu về hóa lượng tử. Bên cạnh đó có nhiều biến chưa có các tài liệu tham khảo, do đó chưa đủ cơ sở để giải thích. - Bước 5. Diễn giải và áp dụng mô hình xây dựng được. Các tham số phân tử được phân tích để tìm các yếu tố cấu trúc đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính trên đích. Sau khi đánh giá và giải thích, mô hình được áp dụng để biểu diễn mối quan hệ giữa cấu trúc củacác hợp chất với hoạt tính sinh học của chúng. 2.4.2. Sàng lọc in silico các hợp chất thiên nhiên hƣớng tác dụng trên đích ĐTĐ tuýp 2: PPARγ và SGLT2 Hệ thống sàng lọc ảo bao gồm hai phễu lọc (hai mô hình QSAR của đích PPARγ và SGLT2) cho phép sàng lọc được những cơ sở dữ liệu lớn (các hợp chất tự nhiên) để thu được một tập hợp nhỏ các hợp chất có tác dụng in vitro điều trị 22
34. ĐTĐ tuýp 2 trên các mục tiêu phân tử đã xác định (thường ít hơn 100), trong đó có ít nhất một số hợp chất có hoạt tính in vivo. Các bước tiến hành: - Tính toán các tham số phân tử đặc trưng cho cấu trúc phân tử của các hợp chất cho từng phễu lọc. - Sau đó, các hợp chất được dự đoán tác dụng đối với ĐTĐ tuýp 2 theo các cơ chế đã lựa chọn bằng cách sử dụng các mô hình QSAR xây dựng được. Các hợp chất được xác định là có tác dụng đối với ĐTĐ tuýp 2 sẽ được giữ lại và tiến hành nghiên cứu xác định đích phân tử và sau đó sẽ nghiên cứu Docking để đánh giá mức độ tương tác với trung tâm hoạt động của đích tác dụng của chúng. Cấu trúc của các hợp chất hoá học được tải trực tiếp từ cơ sở dữ liệu Pubchem và Chemspider dưới dạng tệp .sdf (Spatial Data File). Với một số cấu trúc hoá học yêu cầu xây dựng bằng phần mềm ChemDraw Pro bản 16.0, tệp biểu diễn cấu trúc được lưu dưới dạng MDL Molfile. Các tệp cấu trúc này là đầu vào (input) cho các phần mềm tính toán tham số phân tử. Các thông số hóa lý liên quan đến đặc tính “giống thuốc” (drug-likeness) bao gồm khối lượng phân tử MW (molecular weight), logP (hệ số phân bố dầu – nước), logS (hệ số tan), TPSA (Topological polar surface area – Diện tích bề mặt phân cực), số nguyên tố đóng vai trò cho (donor) và nhận (acceptor) trong liên kết hydro (nHBond), số liên kết linh động được tính toán và so sánh với các quy tắc giống thuốc của Lipinski, sinh khả dụng của Veber và chất dẫn đường của Oprea, Việc tính toán được tính thông qua cấu dạng SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry Specification) - là dạng cấu trúc phân tử số hóa dưới dạng ký tự ASCII. SMILES được sử dụng khá rộng rãi trong danh pháp hóa học và định dạng cấu trúc dữ liệu trên máy tính. 2.4.3. Mô phỏng protein docking Sau khi quy trình dock được thẩm định bởi kết quả re-dock SAHA, dùng quy trình này để mô phỏng protein docking các hợp chất trong CSDL. Cấu trúc các cấu tử được lấy từ hệ thống dữ liệu Pubchem. Sau đó xây dựng cấu trúc 3D, sử dụng các phần mềm để chuẩn bị cấu tử cho chương trình mô phỏng docking, các bước chuẩn bị gồm: gắn hydro, gắn trường lực, xây dựng file pdbqt. Cấu trúc 3D của PPARγ và SGLT2 được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein (protein 23
35. data bank) sau đó cũng được loại nước và các cấu tử, thêm hydro, gắn trường lực và xây dựng file pdbqt. Khi vị trí và kích thước của vùng tìm kiếm được cài đặt, phần mềm Discovery studio Visualizer sẽ tự động tìm kiếm và đưa ra cấu dạng phù hợp với năng lượng thấp nhất. Cấu dạng phù hợp của từng hợp chất sẽ được tổng hợp để đánh giá lại qua mô hình QSAR của các hợp chất có tác dụng in vivo. 2.4.4. Kiểm tra các chất đã Docking trên mô hình QSAR của các chất có tác dụng in vivo Mục đích của việc kiểm tra này là để xác định có bao nhiêu chất có khả năng cao có tác dụng trên cả hai đích điều trị ĐTĐ tuýp 2 theo mô hình động vật. Bằng cách tiến hành đưa các TSPT phù hợp vào mô hình QSAR phân biệt đã xây dựng ta có thể kiểm tra được khả năng hoạt động của các hợp chất này trên mô hình động vật. 24
36. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu 3.1.1. Kết quả xây dựng hai mô hình QSAR trên phần mềm MobyDigs cho phép tìm kiếm các hợp chất có tác dụng sinh học trên từng đích phân tử là PPARγ và SGLT2 hƣớng điều trị ĐTĐ tuýp 2. Cài đặt các thông số với mỗi mô hình: - Y : là giá trị IC50 (nM) - Y transform là log(1+Y) - Các tham số phân tử còn lại là X - Số Population: 10 - Traning set/Test set: 80/20 - Số biến tối đa: 8 Ta thu được: - Mô hình QSAR trên đích PPARγ xây dựng được gồm 8 biến như sau: log (1+Y) = 12.61522 - 8.30244 * SM1_Dz + 0.01569 * ATSC7s + 0.85071 * GATS7s`-1.20491 * SpMax3_Bh(p) + 1.19759 * Eig11_EA(dm) + 0.01856* T(N F) + 0.93152 * B07[N-F] - 0.30527 * F08[O-F] - Mô hình QSAR trên đích SGLT2 xây dựng được gồm 8 biến như sau: log (1+Y) = -3.20292 + 2.2232 * Eig09_EA(bo) - 2.98868 * Eig14_AEA(ed) + 0.73813 * C-015 + 0.56294 * NaaaC + 0.35631 * B08[O-O] + 0.89393 * B10[N-S] + 0.17541 * F03[C-N] + 0.10138 * F03[C-O]. 3.1.2. Kết quả sàng lọc đƣợc một số hợp chất thiên nhiên có tác dụng điều trị tiểu đƣờng tuýp 2 sử dụng hai mô hình QSAR đã xây dựng. Sau khi sàng lọc 758 hợp chất qua hai mô hình QSAR đã xây dựng ta thu được 21 hợp chất cùng cho tác dụng sinh học tốt trên hai đích phân tử PPARγ và SGLT2. 25
37. Bảng 3.1. Các hợp chất có tác dựng đồng thời trên 2 đích phân tử là PPARγ và SGLT2. 5,7- 7-Hydroxyflavanone Dihydroxyflavon Bidwillol A Eriosematin A e 7-hydroxy-3- (4- (S) -2- (4- 4 ', 5- hydroxybenzyl) Hydroxy-3- (3- Dihydroxyflavone Alpinetin chroman metylbut-2-en-1- yl) phenyl) chroman-7-ol 5,7- 7-Hydroxyflavone Dihydroxyflavanone Pinocembrin Demethylvestit 26
38. Hydrangenol 7,3'-Dihydroxy-4'- Kazinol U 7,4'- methoxyflavan Dihydroxyflavon e Equol Liquiritigenin Dihydrodaidzein Sanggenone D Sanggenon C 3.1.3. Kết quả kiểm tra tác dụng của các hợp chất đã sàng lọc qua mô hình in vivo Qua kiểm tra 21 hợp chất tự nhiên đã sàng lọc trên mô hình phân biệt các hợp chất có tác dụng in vivo thu được 4 hợp chất được dự đoán là có hoạt tính in vivo gồm: 7-Hydroxyflavanone; 4',5-Dihydroxyflavone; 7-Hydroxyflavone và Dihydrodaidzein. Bảng 3.2. 27
39. Bảng 3.2. Các hợp chất được dự đoán là có hoạt tính in vivo Tên hợp chất Score-PPAR Score- Công thức 2D SGLT2 7-Hydroxyflavanone -28.3045 -13.782391 4',5- -23.50946 -19.971991 Dihydroxyflavone 7-Hydroxyflavone -21.28129 -15.393044 Dihydrodaidzein -15.20011 -17.221327 3.2. Bàn luận 3.2.1. Đánh giá kết quả xây dựng hai mô hình QSAR trên phần mềm MobyDigs cho phép tìm kiếm các hợp chất có tác dụng sinh học trên từng đích phân tử là PPARγ và SGLT2 hƣớng điều trị ĐTĐ tuýp 2. 28
40. Tiêu chí 1: Toàn bộ cơ sở dữ liệu đều sử dụng đích xác định là nồng độ ức chế 50% (IC50) và được tiến hành theo cùng một điều kiện thí nghiệm trên phần mềm MobyDigs. Tiêu chí 2: Các phương pháp xây dựng mô hình trong nghiên cứu đã được nêu ở phần 2.4. Do tính rõ ràng và đúng đắn của phương pháp mà các mô hình có thể được sử dụng lặp lại để phát hiện các hợp chất mới có tác dụng sinh học trên 2 đích PPARγ và SGLT2. Tiêu chí 3: Xác định miền ứng dụng của mô hình: Các hợp chất trong tập huấn luyện và tập kiểm tra đều nằm trong miền ứng dụng của mô hình. Do đó có thể thấy mô hình cho dự đoán tốt. Tiêu chí 4: Kết quả các đánh giá về độ chính xác, độ bền vững và khả năng đánh giá ngoại của mô hình. Hình 3.1. Khả năng kích thích thực tế so với số liệu tính toán của tập dữ liệu các chất kích hoạt PPARγ (Ghi chú: màu xanh là phần của tập huấn luyện, màu đỏ là phần của tập kiểm tra) 29
41. Hình 3.2. Khả năng ức chế thực tế so với số liệu tính toán của tập dữ liệu các chất ức chế SGLT2 (Ghi chú: màu xanh là phần của tập huấn luyện, màu đỏ là phần của tập kiểm tra) Bảng 3.3. Kết quả đánh giá nội và đánh ngoại mô hình QSAR 2 2 2 Thông số R Q Q ext PPARγ 0,9927 0,68 0,64 SGLT2 0.968 0.67 0.65 Ta có R2 ~ 1,0 chứng tỏ độ chính xác của mô hình cao, Q2 > 0.5 cho thấy mô hình có độ ổn định tốt. Khả năng dự đoán ngoại > 0.6 cho thấy mô hình có khả năng dự đoán hoạt tính tốt. Như vậy mô hình thoả mãn các tiêu chí đánh giá nội và ngoại về độ chính xác, độ ổn định và khả năng dự đoán tốt. Cả hai mô hình đều có: - R2 > 0.6: mô hình có độ chính xác cao. - Q2 > 0.5: thể hiện mô hình bền vững có khả năng dự đoán các thí nghiệm trong tương lai tốt. 2 - Q ext > 0.6 cho thấy mô hình có khả năng dự đoán ngoại tốt. 30
42. Như vậy mô hình thoả mãn các tiêu chí đánh giá nội và ngoại về độ chính xác, độ ổn định và khả năng dự đoán tốt, có thể ứng dụng vào dự đoán hoạt tính sinh học của các hợp chất thiết kế. Tiêu chí 5: Giải thích cơ chế của mô hình. Ý nghĩa của các tham số phân tử trong 2 mô hình QSAR thể hiện ở Bảng 3.4 và Bảng 3.5. Bảng 3.4: Bảng ý nghĩa các của các tham số phân tử trong mô hình QSAR trên đích PPARγ TSPT Miêu tả Block SM1_Dz(Z) Mô men phổ của bậc 1 từ ma trận Mô tả dựa trên Barysz có trọng số bằng số nguyên ma trận 2D tử ATSC7s Trung tâm tự tương quan Broto- Mô tả dựa trên Moreau của độ trễ 7 trọng số theo ma trận 2D trạng thái I GATS7s Tương quan tự động của độ trễ 7 Mô tả dựa trên trọng số theo trạng thái I ma trận 2D SpMax3_Bh(p) Giá trị lớn nhất n. 3 của ma trận Giá trị Burden có trọng số phân cực eigenvalues Eig11_EA(dm) Giá trị riêng n. 11 từ giá trị cạnh kề Chỉ số cạnh kề trọng số kể từ thời điểm lưỡng cực. T(N F) Tổng khoảng cách tôpô giữa N F Cặp nguyên tử 2D B07[N-F] Sự hiện diện / vắng mặt của N - F ở Cặp nguyên tử khoảng cách tôpô 7 2D 31
43. F08[O-F] Tần số O - F ở khoảng cách tôpô 8 Cặp nguyên tử 2D Bảng 3.5: Bảng ý nghĩa các của các tham số phân tử trong mô hình QSAR trên đích SGLT2 TSPT Miêu tả Block Eig09_EA(bo) Giá trị riêng n. 9 từ giá trị cạnh kề Chỉ số cạnh kề trọng số theo thứ tự từ trài sang Eig14_AEA(ed) giá trị riêng n. 14 từ thời điểm tăng Chỉ số cạnh kề cường trọng số theo mức độ cạnh C-015 = CH2 Các mảnh trung tâm nguyên tử NaaaC Số nguyên tử loại aaaC Chỉ số nhà nước điện tử B08[O-O] Sự hiện diện / vắng mặt của O - O ở Cặp nguyên tử khoảng cách tôpô 8 2D B10[N-S] Sự hiện diện / vắng mặt của N - S ở Cặp nguyên tử khoảng cách tôpô 10 2D F03[C-N] Tần số C - N ở khoảng cách tôpô 3 Cặp nguyên tử 2D F03[C-O] Tần số C - O ở khoảng cách tôpô 3 Cặp nguyên tử 2D 32
44. Cả hai mô hình QSAR đều có sự tham gia của 8 biến, đa số trong đó là tham số phân tử 2D. Điều này chứng tỏ rằng thông tin cấu trúc 2D của các cấu tử là quan trọng, quyết định hoạt tính sinh học trên đích PPARγ và SGLT2 Các tham số có hệ số dương cho thấy khả năng tăng cường ức chế của chúng ở mô hình QSAR trên đích SGLT2 và giảm khả năng ức chế trên đích PPARγ và ngược lại. Ví dụ như B10[N-S] nhận 2 giá trị là 1 hoặc 0 nếu có mặt hoặc không có mặt khoảng cách giữa 2 nguyên tử Nitơ và lưu huỳnh là 10 liên kết (C-C). Hệ số B10[N-S] mang dấu ( ) do đó nếu giá trị này bằng 0 sẽ làm tăng hoạt tính ức chế trên SGLT2. Như vậy mô hình thỏa mãn các tiêu chí đánh giá của OECD, do đó có thể ứng dụng mô hình này để ứng dụng vào dự đoán hoạt tính sinh học của các hợp chất thiết kế. 3.2.2. Về các hợp chất đã sàng lọc theo hai mô hình QSAR đã xây dựng. Sau khi sàng lọc 758 hợp chất qua hai mô hình QSAR ta thu được 21 hợp chất đồng thời cho tác dụng sinh học tốt trên hai đích phân tử SGLT2 và PPARγ. Các hợp chất này được kiểm tra khả năng tương thích với đích phân tử bằng phương pháp Docking. Bảng 3.6 cho thấy giá trị Score tốt nhất của 21 chất này. Giá trị Score càng nhỏ cho thấy hợp chất liên kết với đích phân tử càng tốt (Giá trị Score tỷ lệ thuận với mức năng lượng). Bảng 3.6. Giá trị Score của các hợp chất trong Docking trên 2 đích phân tử STT Tên hợp chất Score_PPARγ Score_SGLT2 1 7-Hydroxyflavanone -28.304497 -13.782391 2 Bidwillol A -26.602739 -18.380028 3 Eriosematin A -24.655264 -16.340944 4 5,7-Dihydroxyflavone -24.191191 -17.371319 5 4 ', 5-Dihydroxyflavone -23.509462 -19.971991 33
45. 6 Alpinetin -21.740055 -16.575804 7 7-hydroxy-3- (4- -21.654575 -15.959196 hydroxybenzyl) chroman 8 (S) -2- (4-Hydroxy-3- (3- -21.549046 -15.284402 metylbut-2-en-1-yl) phenyl) chroman-7-ol 9 5,7-Dihydroxyflavanone -21.394835 -15.549281 10 7-Hydroxyflavone -21.281286 -15.393044 11 Pinocembrin -20.828037 -15.559644 12 Demethylvestit -20.539910 -15.696916 13 Hydrangenol -19.050920 -14.720184 14 7,3'-Dihydroxy-4'- -18.971605 -15.281397 methoxyflavan 15 Kazinol U -18.850159 -13.896033 16 7,4'-Dihydroxyflavone -17.567076 -18.333696 17 Equol -15.793626 -14.496695 18 Liquiritigenin -15.516144 -17.611387 19 Dihydrodaidzein -15.200110 -17.221327 20 Sanggenone D -13.047223 -4.739414 34
46. 21 Sanggenon C -11.740144 -5.450112 3.2.3. Đánh giá lại tác dụng của các hợp chất đã sàng lọc qua mô hình máy tính in vivo Qua kết quả Docking có thể nhận thấy 7-Hydroxyflavanone có khả năng liên kết với protein PPARγ tốt nhất và 4 ', 5-Dihydroxyflavone có khả năng gắn trên đích SGLT2 tốt nhất. Bảng 3.7. Kết quả Docking của 4 hợp chất đã sàng lọc được trên đích PPARγ 7-Hydroxyflavanone - PPARγ 4',5-Dihydroxyflavone - PPARγ 35
47. 7-Hydroxyflavone - PPARγ Dihydrodaidzein - PPARγ Bảng 3.8. Kết quả Docking của 4 hợp chất đã sàng lọc được trên đích SGLT2 7-Hydroxyflavanone - SGLT2 4',5-Dihydroxyflavone - SGLT2 7-Hydroxyflavone -SGLT2 Dihydrodaidzein - SGLT2 Một số thông tin về các hợp chất trong các tài liệu y văn: 36
48. Bảng 3.9. Một số thông tin về các hợp chất thu được sau quá trình sàng lọc. Tên hợp chất Dược liệu Các hoạt tính đã được nghiên cứu TLTK chứa hợp chất 7- Zuccagnia Điều trị nhiễm trùng đường hô [61] Hydroxyflavanone puncata hấp mới. Cav. (Fabace ae) Spatholobus Ức chế proteasome 20S [49] Suberectus 4',5- Dracaena 4 ', 5-Dihydroxyflavone là chất ức [40, 43] Dihydroxyflavone cochinchinen chế men đậu nành LOX-1 và men sis α-Glucosidase, với Ki là 102,6 M đối với LOX-1 đậu nành và IC50 là 66 μM đối với men α- glucosidase. 7-Hydroxyflavone Acacia 7-Hydroxyflavone là chất ức chế [58, 63] farnesiana mạnh CYP1A1 với giá trị Ki là 0,015 M và thể hiện tính chọn lọc cao hơn gấp 6 lần đối với CYP1A1 so với CYP1A2. Nó cũng có đặc tính chống oxy hóa, chống viêm và chống tăng sinh tuyệt vời, nó có thể đóng vai trò là chất bảo vệ tiềm năng trong điều trị bệnh nhân nhiễm EV71 mạn tính.7-Hydroxyflavone có thể bảo vệ các tế bào thận khỏi độc tế bào liên quan đến NIC thông qua ERK / Nrf2 / Đường dẫn HO-1; nó cũng có thể ức chế viêm do LPS 37
49. gây ra thông qua việc làm giảm sản xuất NO, PGE2, TNF-α và IL- 6. Dihydrodaidzein Glycine max Dihydrodaidzein là một chất [18, 19, chuyển hóa estrogen hoạt động 28, 53] của daidzein. Nó có liên quan đến nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ thấp hơn ở người, có tác dụng giãn mạch trên vòng động mạch chủ chuột bị cô lập ở mức 1 μg / ml. Nó kích thích sự tăng trưởng phụ thuộc thụ thể estrogen của các tế bào MCF-7 ung thư vú ở nồng độ micromol. Dihydrodaidzein được sản xuất bởi sự chuyển hóa của daidzein ở vi khuẩn đại tràng và có thể được chuyển hóa thành các hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau, bao gồm cả solol. Từ các thông tin trên cho thấy, các nghiên cứu về khả năng điều trị ĐTĐ của 4 hợp chất này còn rất ít (chỉ có Dihydrodaidzein đã có một số nghiên cứu). Đặc biệt các tac dụng trên hai đích SGLT2 và PPARγ chưa từng được nghiên cứu. Bên cạnh đó, các dược liệu chứa các hợp chất khá phổ biến, tiềm năng phát triển nguồn dược liệu lớn. Đây là một kết quả mới mà tử khóa luận này có thể phát triển tiếp. 38
50. KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và có một số kết luận chính như sau: 1. Đã xây dựng một quy trình sàng lọc theo phương pháp in silico cho phép tìm kiếm các hợp chất có tác dụng trên đồng thời đích PPARγ và SGLT2. Quy trình sàng lọc gồm 6 bước như sau: - Xây dựng thư viện dữ liệu các hợp chất và tính toán các tham số phân tử. - Xây dựng mô hình QSAR của các hợp chất có tác dụng ức chế SGLT2 và mô hình QSAR của các hợp chất có tác dụng hoạt hóa PPARγ. - Xây dựng mô hình QSAR thể hiện mối tương quan giữa cấu trúc và tác dụng in vivo. - Tiến hành sàng lọc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học đồng thời trên cả hai đích SGLT2 và PPARγ. - Nghiên cứu Docking để đánh giá mức độ tương tác với trung tâm hoạt động trên đích tác dụng của các chất đã sàng lọc. - Đánh giá lại các chất đã sàng lọc trên mô hình QSAR thể hiện mối tương quan giữa cấu trúc và tác dụng in vivo để tìm kiếm được các hợp chất tự nhiên có khả năng cao có tác dụng điều trị bệnh ĐTĐ tuýp 2 trên mô hình in vivo. 2. Đã sàng lọc được 4 hợp chất tiềm năng từ cơ sở dữ liệu hợp chất thiên nhiên, gợi ý cho quá trình nghiên cứu thực nghiệm và phát triển thuốc trong tương lai. KIẾN NGHỊ Bên cạnh những kết quả đạt được, để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu của khóa luận đồng thời tăng tính ứng dụng của nghiên cứu, em xin đưa ra các đề xuất sau: 1. Phát triển phương pháp để ứng dụng vào các mô hình bệnh tật phức tạp khác. 2. Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm hoạt tính trên đích của các hợp chất đã sàng lọc được trên mô hình in vivo thực tế. 39
51. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bộ Y Tế ( 2017), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường típ 2, BYT. 2. Hoàng Văn Quân (2017), Kết hợp phương pháp protein docking và qsar trong xây dựng mô hình tương quan định lượng cấu trúc - hoạt tính ức chế enzym histone deacetylase ii (hdac2) của một số dẫn xuất acid hydroxamic đã tổng hợp, Hoàng Văn Quân, ĐH Dược Hà Nội. 4. Antuna-Puente B, B Feve, S Fellahi and J-P Bastard (2008), "Adipokines: the missing link between insulin resistance and obesity", Diabetes & metabolism, 34(1), 2-11. 5. Bailey CJ and C Day (2004), "Metformin: its botanical background", Practical Diabetes International, 21(3), 115-117. 6. Baskin Igor I., Vladimir A. Palyulin and Nikolai S. Zefirov (2008), "Neural networks in building QSAR models", Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 458,137-158. 7. Berk Richard A (2003), "The formalities of multiple regression", Regression Analysis: A Constructive Critique 103-110. 8. Bibi Shabana, Saima Kalsoom and Hamid Rashid (2013), "In Silico Approach for Lead Identification and Optimization Of Antidiabetic Compounds", IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences (IOSR-JPBS), 3, 36-46. 9. Briones Rowena M, Ajit K Sarmah and Lokesh P Padhye (2016), "A global perspective on the use, occurrence, fate and effects of anti-diabetic drug metformin in natural and engineered ecosystems", Environmental Pollution, 219, 1007-1020. 10. Campbell R Keith and John R White (2008), "More Choces Than Ever Before", The Diabetes Educator, 34(3), 518-534. 11. Cantarelli Elisa, Antonio Citro, Simona Marzorati, Raffaella Melzi, Marina Scavini and Lorenzo Piemonti (2013), "Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes)", Islets, 5(2), 79-86. 12. Cefalo Chiara Maria Assunta, Francesca Cinti, Simona Moffa, Flavia Impronta,
52. Gian Pio Sorice, Teresa Mezza, Alfredo Pontecorvi and Andrea Giaccari (2019), "Sotagliflozin, the first dual SGLT inhibitor: current outlook and perspectives", Cardiovascular diabetology, 18(1), 20. 13. Chatzigeorgiou Antonios, Antonios Halapas, Konstantinos Kalafatakis and Elli Kamper (2009), "The use of animal models in the study of diabetes mellitus", In Vivo, 23(2), 245-258. 14. Chiasson Jean-Louis, Robert G Josse, Ramon Gomis, Markolf Hanefeld, Avraham Karasik, Markku Laakso and STOP-NIDDM Trial Research Group (2002), "Acarbose for prevention of type 2 diabetes mellitus: the STOP- NIDDM randomised trial", The Lancet, 359(9323), 2072-2077. 15. Davidson Jaime A, Erika B Parente and Jorge L Gross (2008), "Incretin mimetics and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors: innovative treatment therapies for type 2 diabetes", Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia, 52(6), 1039-1049. 16. Diamant Michaela and Robert J Heine (2003), "Thiazolidinediones in type 2 diabetes mellitus", Drugs, 63(13), 1373-1406. 17. Dias DA Urban S, Roessner U (2012), " A Historical Overview of Natural Products in Drug Discovery. ", Metabolites, 2(2), 303-336. 18. Ding M., A. A. Franke, B. A. Rosner, E. Giovannucci, R. M. van Dam, S. S. Tworoger, F. B. Hu and Q. Sun (2015), "Urinary isoflavonoids and risk of type 2 diabetes: a prospective investigation in US women", Br J Nutr, 114(10), 1694-1701. 19. Ding M., A. Pan, J. E. Manson, W. C. Willett, V. Malik, B. Rosner, E. Giovannucci, F. B. Hu and Q. Sun (2016), "Consumption of soy foods and isoflavones and risk of type 2 diabetes: a pooled analysis of three US cohorts", Eur J Clin Nutr, 70(12), 1381-1387. 20. Draznin Boris and Sol Epstein (2011), Oxford American handbook of endocrinology and diabetes, Oxford University Press, 21. E.M. de Haas and et al. (2011), "Internal and external validation of the long- term QSARs for neutral organics to fish from ECOSAR", SAR and QSAR in Environmental Research, 22, 545–559.
53. 22. Haffner Steven M. (1998), "Epidemiology of Type 2 Diabetes: Risk Factors", Diabetes Care, 21(Supplement 3), C3-C6. 23. Hsia Daniel S, Owen Grove and William T Cefalu (2017), "An update on SGLT2 inhibitors for the treatment of diabetes mellitus", Current opinion in endocrinology, diabetes, and obesity, 24(1), 73. 25. Kawano Kazuya, Tsukasa Hirashima, Shigehito Mori, Yuichi Saitoh, Masao Kurosumi and Takashi Natori (1992), "Spontaneous long-term hyperglycemic rat with diabetic complications: Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) strain", Diabetes, 41(11), 1422-1428. 26. King Aileen JF (2012), "The use of animal models in diabetes research", British journal of pharmacology, 166(3), 877-894. 27. Kitchen Douglas B, Hélène Decornez, John R Furr and Jürgen Bajorath (2004), "Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications", Nature reviews Drug discovery, 3(11), 935-949. 28. Kobayashi S., M. Shinohara, T. Nagai and Y. Konishi (2013), "Transport mechanisms for soy isoflavones and microbial metabolites dihydrogenistein and dihydrodaidzein across monolayers and membranes", Biosci Biotechnol Biochem, 77(11), 2210-2217. 29. Lankatillake Chintha, Tien Huynh and Daniel A. Dias (2019), "Understanding glycaemic control and current approaches for screening antidiabetic natural products from evidence-based medicinal plants", Plant Methods, 15(1), 105. 31. Lenzen Sigurd (2008), "The mechanisms of alloxan-and streptozotocin-induced diabetes", Diabetologia, 51(2), 216-226. 32. Loke Yoon K, Sonal Singh and Curt D Furberg (2009), "Long-term use of thiazolidinediones and fractures in type 2 diabetes: a meta-analysis", Cmaj, 180(1), 32-39. 33. Madiraju Anila K, Yang Qiu, Rachel J Perry, Yasmeen Rahimi, Xian-Man Zhang, Dongyan Zhang, João-Paulo G Camporez, Gary W Cline, Gina M Butrico and Bruce E Kemp (2018), "Metformin inhibits gluconeogenesis via a redox-dependent mechanism in vivo", Nature medicine, 24(9), 1384-1394. 34. Mayer John P, Faming Zhang and Richard D DiMarchi (2007), "Insulin
54. structure and function", Peptide Science: Original Research on Biomolecules, 88(5), 687-713. 35. Melzi R, F Sanvito, A Mercalli, K Andralojc, E Bonifacio and L Piemonti (2008), "Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization", Cell transplantation, 17(12), 1361-1370. 36. Musso Giovanni, Roberto Gambino, Maurizio Cassader and Elena Paschetta (2019), "Efficacy and safety of dual SGLT 1/2 inhibitor sotagliflozin in type 1 diabetes: meta-analysis of randomised controlled trials", bmj, 365, l1328. 37. Nanjan MJ, Manal Mohammed, BR Prashantha Kumar and MJN Chandrasekar (2018), "Thiazolidinediones as antidiabetic agents: A critical review", Bioorganic chemistry, 77, 548-567. 38. Ogurtsova K., J. D. da Rocha Fernandes, Y. Huang, U. Linnenkamp, L. Guariguata, N. H. Cho, D. Cavan, J. E. Shaw and L. E. Makaroff (2017), "IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040", Diabetes Research and Clinical Practice, 128, 40-50. 39. Pataky Mark W, Carmen S Yu, Yilin Nie, Edward B Arias, Manak Singh, Christopher L Mendias, Robert J Ploutz-Snyder and Gregory D Cartee (2019), "Skeletal muscle fiber type-selective effects of acute exercise on insulin- stimulated glucose uptake in insulin-resistant, high-fat-fed rats", American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 316(5), E695-E706. 40. Proença C., M. Freitas, D. Ribeiro, E. F. T. Oliveira, J. L. C. Sousa, S. M. Tomé, M. J. Ramos, A. M. S. Silva, P. A. Fernandes and E. Fernandes (2017), "α-Glucosidase inhibition by flavonoids: an in vitro and in silico structure- activity relationship study", J Enzyme Inhib Med Chem, 32(1), 1216-1228. 41. Radenković Miroslav, Marko Stojanović and Milica Prostran (2016), "Experimental diabetes induced by alloxan and streptozotocin: The current state of the art", Journal of pharmacological and toxicological methods, 78, 13-31. 42. Ramakrishnan Parthasarathi Alok Dhawan (2018), In Vitro Toxicology, 43. Ribeiro D., M. Freitas, S. M. Tomé, A. M. Silva, G. Porto, E. J. Cabrita, M. M. Marques and E. Fernandes (2014), "Inhibition of LOX by flavonoids: a structure-activity relationship study", Eur J Med Chem, 72, 137-145.
55. 44. Rieg Timo and Volker Vallon (2018), "Development of SGLT1 and SGLT2 inhibitors", Diabetologia, 61(10), 2079-2086. 45. Saltiel Alan R and C Ronald Kahn (2001), "Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism", Nature, 414(6865), 799-806. 46. Samuel Varman T and Gerald I Shulman (2012), "Mechanisms for insulin resistance: common threads and missing links", Cell, 148(5), 852-871. 47. Seino Yutaka, Mitsuo Fukushima and Daisuke Yabe (2010), "GIP and GLP‐1, the two incretin hormones: similarities and differences", Journal of diabetes investigation, 1(1‐2), 8-23. 48. Shafrir Eleazar (2007), Animal models of diabetes: frontiers in research, Animal Models of Diabetes: Frontiers in Research, 289. 49. Shim S. H. (2011), "20S proteasome inhibitory activity of flavonoids isolated from Spatholobus suberectus", Phytother Res, 25(4), 615-618. 50. Shoichet Brian K, Susan L McGovern, Binqing Wei and John J Irwin (2002), "Lead discovery using molecular docking", Current opinion in chemical biology, 6(4), 439-446. 51. Swinnen Sanne G, Joost B Hoekstra and J Hans DeVries (2009), "Insulin therapy for type 2 diabetes", Diabetes Care, 32(suppl 2), S253-S259. 52. T Reinehr (2013), "Type 2 diabetes mellitus in children and adolescents", World J Diabetes, 4(6), 270-281. 53. Tamura M., S. Hori and H. Nakagawa (2011), "Dihydrodaidzein-producing Clostridium-like intestinal bacterium, strain TM-40, affects in vitro metabolism of daidzein by fecal microbiota of human male equol producer and non- producers", Biosci Microflora, 30(3), 65-71. 54. Tang Chunlei, Xiaoyun Zhu, Dandan Huang, Xin Zan, Baowei Yang, Ying Li, Xiaoyong Du, Hai Qian and Wenlong Huang (2012), "A specific pharmacophore model of sodium-dependent glucose co-transporter 2 (SGLT2) inhibitors", Journal of Molecular Modeling, 18(6), 2795-2804. 55. Todeschini R and Consonni V. (2000), Handbook of Molecular Descriptors 1st, Federal Republic of Germany.
56. 56. Tremblay Mark Stephen, Rachel Christine Colley, Travis John Saunders, Genevieve Nissa Healy and Neville Owen (2010), "Physiological and health implications of a sedentary lifestyle", Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism, 35(6), 725-740. 57. Vaag Allan and Søren S Lund (2007), "Non-obese patients with type 2 diabetes and prediabetic subjects: distinct phenotypes requiring special diabetes treatment and (or) prevention?", Applied physiology, nutrition, and metabolism, 32(5), 912-920. 58. Wang J., H. Su, T. Zhang, J. Du, S. Cui, F. Yang and Q. Jin (2014), "Inhibition of Enterovirus 71 replication by 7-hydroxyflavone and diisopropyl-flavon7-yl Phosphate", PLoS One, 9(3), e92565. 59. Wanner Christoph and Nikolaus Marx (2018), "SGLT2 inhibitors: the future for treatment of type 2 diabetes mellitus and other chronic diseases", Diabetologia, 61(10), 2134-2139. 60. WHO WHO (2016), "Global report on diabetes", World Health Organization, 61. Zampini I. C., J. Villena, S. Salva, M. Herrera, M. I. Isla and S. Alvarez (2012), "Potentiality of standardized extract and isolated flavonoids from Zuccagnia punctata for the treatment of respiratory infections by Streptococcus pneumoniae: in vitro and in vivo studies", J Ethnopharmacol, 140(2), 287-292. 62. Zhang Rui, Yang Yao, Yingping Wang and Guixing Ren (2011), "Antidiabetic activity of isoquercetin in diabetic KK-A y mice", Nutrition & Metabolism, 8(1), 85. 63. Zhang T., J. Du, L. Liu, X. Chen, F. Yang and Q. Jin (2012), "Inhibitory effects and underlying mechanism of 7-hydroxyflavone phosphate ester in HeLa cells", PLoS One, 7(5), e36652. 64. Al-Najjar Belal O., Habibah A. Wahab, Tengku Sifzizul Tengku Muhammad, Alexander Chong Shu-Chien, Nur Adelina Ahmad Noruddin and Mutasem O. Taha (2011), "Discovery of new nanomolar peroxisome proliferator-activated receptor γ activators via elaborate ligand-based modeling", Eur J Med Chem, 46(6), 2513-2529. 65. Gee Veronica M. W., Fiona S. L. Wong, Lalitha Ramachandran, Gautam Sethi, Alan Prem Kumar and Chun Wei Yap (2014), "Identification of novel
57. peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPARγ) agonists using molecular modeling method", J Comput Aided Mol Des, 28(11), 1143-1151. 66. Khanna Smriti, M. E. Sobhia and Prasad V. Bharatam (2005), "Additivity of Molecular Fields: CoMFA Study on Dual Activators of PPARα and PPARγ", J Med Chem, 48(8), 3015-3025. 67. Kirchner LA (1997), "The prediction of skin permeability by using physicochemical data", ATLA, 25(359-370. 68. Qingqing Wang, Imam Mustapha Umar, Yida Zhang and Wang Fudi (2017), "Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma (PPARγ) as a Target for Concurrent Management of Diabetes and Obesity-Related Cancer", Curr Pharm Des, 23(25), 3677-3688. 69. Rangwala Shamina M., Ben Rhoades, Jennifer S. Shapiro, A. Sophie Rich, Jason K. Kim, Gerald I. Shulman, Klaus H. Kaestner and Mitchell A. Lazar (2003), "Genetic Modulation of PPARγ Phosphorylation Regulates Insulin Sensitivity", Developmental Cell, 5(4), 657-663.