Khóa luận Nghiên cứu tình trạng methyl hoá một số chỉ thị phân tử ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu tình trạng methyl hoá một số chỉ thị phân tử ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam

1. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN PHI CƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành/chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa: CNSH-CNTP Khóa học: 2016-2020 Thái Nguyên – năm 2020
2. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN PHI CƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành/chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: 48-CNSH Khoa: CNSH-CNTP Khóa học: 2016-2020 Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Dương Văn Cường 2. ThS. Vũ Hoài Nam Thái Nguyên – năm 2020
3. i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn: Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo: TS.Dương Văn Cường người đã trực tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp. Tôi xin cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Vũ Hoài Nam cùng các cán bộ, các anh chị làm việc tại Viện Khoa Học Sự Sống – Đại Học Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Xin trân trọng cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 20 tháng 06 năm 2020 Sinh Viên Nguyễn Phi Cường
4. ii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài 15 Bảng 3.2: Danh mục các trang thiết bị sử dụng trong đề tài 16 Bảng 4.1: Kết quả nồng độ DNA sau khi đo quang phổ 28
5. iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Bản đồ tỷ lệ mắc bệnh ung thư trên thế giới ước tính năm 2018 5 Hình 2.2: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo tuổi ước tính năm 2018 6 Hình 2.3: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo giới tính ước tính năm 2018 7 Hình 2.4: Biểu đồ ước tính tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong chuẩn hóa theo độ tuổi 9 Hình 2.5: Quá trình methyl hóa DNA 10 Hình 3.2.2.1: Kết quả tách DNA bằng phương pháp của Campos và cộng sự 23 Hình 3.2.2.2: Kết quả tách DNA bằng phương pháp sử dụng bộ KIT 23 Hình 3.2.2.3: Kết quả tách DNA bằng phương pháp NAOH 2N 24 Hình 3.2.2.4: Kết quả tách DNA bằng phương pháp lysis buffer 25 Hình 4.5 : Vị trí kích thước gene FLI 1 31 Hình 4.6. Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene FLI 1 32 Hình 4.7. Vị trí kích thước gene AGRN 32 Hình 4.8. Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene AGRN 33
6. iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DNA : Deoxirybonucleic Acid PCR : Polymerase Chane Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Axit CRC : Colorectal Cancer (Ung thư đại trực tràng) SNP : Sequence Number PDU Kb : Kilo base – Kilo bazo nito Ng : Nanogam
7. v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể 3 1.3. Nội dung nghiên cứu 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1.Ung thư đại trực tràng 4 2.1.1. Khái niệm ung thư đại trực tràng 4 2.1.2.Cơ chế gây ung thư 4 2.1.2.Tình hình ung thư đại trực tràng trên thế giới 5 2.1.3.Tình hình ung thư đại trực tràng tại Việt Nam 8 2.2. Methyl hóa và ung thư đại trực tràng 9 2.2.1. Methyl hóa DNA là gì 9 2.2.3. Bất thường methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng 11 2.3. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến đổi bisulfite 11 2.4. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao Illumina Infinium 450K 12 2.5. Nghiên cứu trong nước và quốc tế 13 2.5.1 Một số nghiên cứu trong nước liên quan về gene FLI 1 và gene AGRN 13
8. vi 2.5.2 Một số nghiên cứu quốc tế có liên quan về gene FLI 1 13 2.5.4 Nghiên cứu quốc tế về gene AGRN 14 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 3.1.Vật liệu 15 3.1.1.Các hóa chất, sinh phẩm 15 3.1.2.Mẫu bệnh phẩm 16 3.1.3.Trang thiết bị 16 3.2.Phương pháp 16 3.2.1.Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô cố định formaldehyde 17 3.2.2.Đánh giá chất lượng DNA tách chiết 23 3.2.3.Giới thiệu về phương pháp biến đổi bisulfite conversion 25 3.2.4.Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa 26 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4. Kết quả 28 4.1.Kết quả đo hàm lượng DNA 28 4.1.1.Phương pháp của campos và cộng sự 28 4.1.2.Sử dụng bộ KIT 28 4.1.3.Phương pháp NaOH 2N 29 4.1.4.Phương pháp Lysis buffer 29 4.2 Phân tích in silico và thiết kế mồi 31 4.4.1 Gene FLI 1 31 4.4.2. Gene AGRN 32 4.4.3. Kết quả thiết kế mồi 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 1. Kết luận 35 2. Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
9. 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ung thư đại trực tràng là một trong những dạng ung thư hàng đầu trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Trong các cơ chế phân tử liên quan đến ung thư đại trực tràng, sự methyl hóa DNA là một trong những cơ chế có ảnh hưởng lớn. Các nghiên cứu về methyl hóa ở DNA đa phần được thực hiện trên quần thể người Châu Âu và người Châu Mỹ, hay nói cách khác là người da trắng là chính và một phần là người da đen. Các nghiên cứu trên quần thể người da vàng còn hạn chế về mặt số lượng. DNA methylation là một cơ chế epigenetics và cơ chế này không giống như cơ chế di truyền, cơ chế epigenetics có sự khác biệt bởi yếu tố môi trường. Yếu tố môi trường ở đây rất rộng, nó bao gồm các yếu tố như chủng tộc, chế độ ăn uống, chế độ sinh hoạt, Trong những năm đầu của cuộc cách mạng sinh học phân tử, nghiên cứu ung thư chủ yếu tập trung vào thay đổi di truyền, bao gồm cả ung thư đại trực tràng. Cơ chế epigenetics là cơ chế rất cần thiết cho sự phát triển bình thường và duy trì các mẫu biểu hiện gen đặc hiệu của mô ở động vật có vú. Sự gián đoạn của quá trình biểu sinh có thể dẫn đến thay đổi chức năng gen và biến đổi tế bào ác tính.[1] Ở người, methyl hóa DNA là một trong những vấn đề được quan tâm và nghiên cứu chuyên sâu. Trong các tế bào bình thường, nó đảm bảo sự điều hòa biểu hiện gen và làm gen ổn định. Quá trình methyl hóa DNA có liên quan đến thay đổi histone và sự tương tác của các thay đổi biểu sinh, các thay đổi này rất quan trọng để điều chỉnh hoạt động của bộ gen bằng cách thay đổi cấu trúc chromatin. Quá trình methyl hóa bị hạn chế ở dư lượng cytosine và chủ yếu gặp trong dinucleotide cytosine-guanine (CG) (thường được viết tắt là CpGine). Dinucleotide này không được thể hiện trong toàn bộ bộ
10. 2 gen, nhưng nó xuất hiện với độ dài tăng dần trong khoảng 0,3 kb và khoảng 40% gen người có chứa một đảo CpG trong vùng promoter. Việc bổ sung cộng hóa trị của một nhóm methyl thường xảy ra ở cytosine trong các dinucleotide CpG và tập trung thành các cụm lớn gọi là đảo CpG [2]. Việc phát hiện ra ung thư đại trực tràng hiện nay được xem là điều cần thiết, nhưng để phát hiện sớm không hề dễ dàng. Đặc điểm của khối u khi mới phát sinh là kích thước còn rất nhỏ, sau đó khối u tăng kích thước và bám vào thành ruột nhưng chưa đâm thủng thành ruột. Khi ở dai đoạn này, tỷ lệ sống sót của người mắc bệnh là 90%. Khối u sẽ tiếp tục tăng kích thước, đâm thủng thành ruột nhưng chưa di căn, tỷ lệ sống sót của người mắc bệnh lúc này giảm đi còn 70%. Bản thân những người mắc ung thư đại trực tràng họ thường không thể biết được những triệu chứng ban đầu của bệnh, tỷ lệ phát hiện bệnh là 39%. Khi tế bào ung thư đã di căn đến các vùng khác của cơ thể thì tỷ lệ phát hiện bệnh là 61%, lúc này tỉ lệ sống sót của người bênh chỉ còn 12% vì phát hiện quá muộn. Vì vậy, việc phát hiện sớm bệnh và tầm quan trọng của sự thay đổi methyl hóa DNA trong khối u có một ý nghĩa rất lớn đối với con người, trong tương lai methyl hóa có thể được phát triển thành một chỉ số theo dõi phác đồ điều trị ung thư. Xuất phát từ những lý do trên, chúng em tiến hành đề tài: “NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Tìm ra những chỉ thị phân tử có mức độ methyl hóa DNA đủ lớn với tần số xuất hiện cao và đặc thù trong quần thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam.
11. 3 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Tách chiết được DNA đạt được tiêu chuẩn từ mẫu mô bệnh nhân ung thư đại trực tràng từ mẫu cố định formaldehyde để vụ cho các nội dung thí nghiệm của đề tài. - Thiết kế được một số cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa. 1.3. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde của bệnh nhân ung thư đại trực tràng. - Phần tích được các đặc điểm, cấu trúc của gene trên máy tính. - Thiết kế được cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa.
12. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Ung thư đại trực tràng 2.1.1. Khái niệm ung thư đại trực tràng Vài thập kỷ trước, do điều kiện khoa học và cơ sở vật chất trang thiết bị chưa phát triển, bệnh ung thư đại trực tràng được chẩn là một bệnh rất mới. Ngày nay, ung thư đại trực tràng được xem là căn bệnh nguy hiểm đứng thứ tư trên thế giới với gần 900 000 ca tử vong hàng năm [3]. Ung thư ruột hay ung thư đại trực tràng là tên gọi chung của ung thư đại tràng và và ung thư trực tràng, tức là ung thư phát triển từ đại tràng hay trực tràng (là những phần của ruột già), nó được tạo nên bởi sự phát triển bất thường của các tế bào và có khả năng lan rộng ra các bộ phận khác của cơ thể. Dấu hiệu và triệu chứng bao gồm xuất hiện máu trong phân, tụt cân, đau bụng giữ dội, có sự thay đổi trong nhu động ruột và cơ thể luôn luôn cảm thấy mệt mỏi. Hầu hết các nguyên nhân gây bệnh ung thư đại trực tràng là do các yếu tố về lối sống không lành mạnh và độ tuổi, với chỉ một số ít trường hợp là do rối loạn gen di truyền. Bên cạnh vấn đề về tỷ lệ dân số già và thói quen ăn uống của các nước có thu nhập bình quân đầu người cao thì các yếu tố nguy cơ gây nên bệnh có thể kể đến ở đây bao gồm chế độ ăn không tốt, bệnh béo phì, hút nhiều thuốc lá, và ít hoạt động thể chất, lười tập thể dục. Những yếu tố về chế độ ăn làm tăng nguy cơ hình thành bệnh là nhiều người ăn thịt đỏ, thịt sống, sử dụng những sản phẩm thịt để lâu quá hạn, không đảm bảo về ăn chín uống sôi. Không chỉ thế mà vấn đề về sử dụng rượu cũng rất đáng nói, vì uống rượu nhiều cũng là yếu tố nguy cơ gây nên các bệnh về đường ruột như viêm đường ruột, trong đó bao gồm bệnh Crohn và viêm loét đại tràng [4]. 2.1.2.Cơ chế gây ung thư Sự hình thành ung thư đại trực tràng bắt đầu với sự biến đổi của niêm mạc biểu mô bình thường thành biểu mô tăng sinh. Những tế bào biểu mô ruột
13. 5 tăng sinh mất tổ chức và cấu trúc của chúng và có khả năng hình thành adenomas. Adenomas sau đó có thể phát triển và xâm lấn vào vùng dưới niêm mạc và trở thành ung thư với khả năng phổ biến vào đại tràng. Chuỗi hoạt động này được gọi là chuỗi adenoma-carcinoma, từ đó có thể dẫn đến CRC. Ba cơ chế chính của sự mất ổn định di truyền: mất ổn định nhiễm sắc thể, mất ổn định kính hiển vi và kiểu hình methylator đảo CpG. Các cơ chế này có tác động đến các đường dẫn tín hiệu chính và dẫn đến mất kiểm soát sự tăng sinh tế bào, tăng trưởng tế bào không giới hạn và phát triển khối u [5]. 2.1.2.Tình hình ung thư đại trực tràng trên thế giới Theo dữ liệu của GLOBOCAN 2018, ung thư đại trực tràng (CRC) là bệnh ung thư đứng thứ tư trên thế giới và là dạng ung thư được chẩn đoán phổ biến thứ ba trên toàn cầu, bao gồm 11% trong số tất cả các chẩn đoán ung thư khác nhau. Hình 2.1: Bản đồ tỷ lệ mắc bệnh ung thư trên thế giới ước tính năm 2018 Khoảng 1.096.000 trường hợp ung thư ruột kết mới ước tính sẽ được chẩn đoán vào năm 2018, trong khi khoảng 704.000 trường hợp ung thư trực tràng mới được phát hiện. CRC là bệnh ung thư được chẩn đoán có tỷ lệ mắc nhiều
14. 6 nhất ở nam giới với 10 trong số 191 quốc gia trên toàn thế giới. Còn chẩn đoán trên phụ nữ thì không có quốc gia nào có tỉ lệ cao cả [6]. Tỷ lệ mắc bệnh CRC không chỉ xảy ra nhiều ở nam giới hơn là nữ giới mà tỷ lệ đó còn gấp 3 đến 4 lần đối với các quốc gia đang phát triển. Tỷ lệ mắc bệnh chuẩn theo tuổi trên thế giới là 100.000 ca, ở cả hai giới là 19,7%, ở nam là 23,6% và ở nữ là 16,3%. Mặc dù tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi ở nam giới là 30,1%/100.000 ở các quốc gia có chỉ số HDI (chỉ số phát triển con người) cao, nhưng ở các quốc gia có HDI thấp thì tỷ lệ này giảm xuống (thống kê tương tự ở nữ là 20,9% và 5,9%). Năm 2018, khoảng 576.000 đàn ông và 521.000 phụ nữ được chẩn đoán mắc bệnh ung thư đại trực tràng [6]. Hình 2.2: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo tuổi ước tính năm 2018 Các nước phát triển là các nước có nguy cơ mắc ung thư đại tràng và trực tràng cao nhất. Đối với ung thư ruột kết, Nam Âu, Úc / New Zealand và Bắc
15. 7 Âu là những khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất. Đối với ung thư trực tràng, các khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là Đông Âu, Úc / New Zealand và Đông Á. Bắc Mỹ cũng là một trong những nơi có tỷ lệ mắc cao nhất đối với cả hai bệnh ung thư. Quốc gia có tỷ lệ mắc CRC cao nhất trên 100,000 dân là Hungary (70,6%) ở nam và Na Uy (29,3%) ở nữ. Tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Ả Rập Saudi, Ô-man, Yemen, Bahrain, Qatar, Kuwait và Slovakia CRC cũng là bệnh ung thư được chẩn đoán nhiều nhất ở nam giới. Trong khi đó, tất cả các khu vực của Châu Phi, cũng như Nam Á thì CRC có tỷ lệ mắc thấp nhất đối với cả hai giới [6]. Hình 2.3: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo giới tính ước tính năm 2018 Ung thư trực tràng là một trong những bệnh gây tử vong nhiều nhất, với 310.000 ca tử vong, chiếm 3,2% tổng số ca tử vong do ung thư, ở độ tuổi từ 0 đến 74 tuổi, tử vong do ung thư đại tràng là 0,66% ở nam giới và 0,44% ở phụ
16. 8 nữ. Nguy cơ tương tự ung thư trực tràng là 0,46% ở nam và 0,26% ở nữ. Tỷ lệ tử vong chuẩn hóa theo độ tuổi (thế giới) ở cả hai giới là 8.9% trên 100.000 ca CRC. Dự kiến đến năm 2030 gánh nặng toàn cầu về ung thư đại trực tràng sẽ tăng lên 60%, thêm hơn 2,2 triệu trường hợp mới và 1,1 triệu ca tử vong hàng năm [7]. 2.1.3.Tình hình ung thư đại trực tràng tại Việt Nam Tổng tỷ lệ mắc ung thư của tất cả các bệnh ung thư là trên 100.000 người, được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IACR) đưa ra vào năm 2012, trong đó có 173 trường hợp đối với nam và 114,3 trường hợp đối với nữ. Những số liệu thống kê mới cho thấy tỷ lệ mắc ung thư cả hai giới ở các quốc gia là 125.000 trường hợp mới mỗi năm. Ước tính của IARC cho thấy tỷ lệ tử vong do ung thư là 148 trên 100.000 trường hợp đối với nam giới, 76.3 trên 100.000 trường hợp đối với nữ và 94.700 người chết vì ung thư mỗi năm. Năm bệnh ung thư thường gặp nhất tại Việt Nam ở cả nam và nữ là ung thư gan (17,6% trường hợp mới), ung thư phổi (17,5% trường hợp mới), ung thư dạ dày (11,4% trường hợp mới), ung thư vú (8,9% trường hợp mới) và đại trực tràng (7% tất cả các trường hợp mới). Từ những số liệu thống kê trên, sự thay đổi về tỷ lệ mắc các bệnh ung thư tại Việt Nam như sau. Chúng ta có tỷ lệ tương đối cao đối với ung thư gan và ung thư phổi, xếp sau đó là ung thư dạ dày, cuối cùng là ung thư vú và ung thư đại trực tràng. Tỷ lệ mắc bênh ung thư đại trực tràng tại Việt Nam là thấp nhất đối với các loại ung thư khác. Nguyên nhân ở đây là vì người dân Việt Nam đặc biệt là nam giới sử dụng rất nhiều thuốc lá gây ảnh hưởng rất lớn đến phổi, không những thế nhiều người dân điển hình như công nhân tiếp xúc rất nhiều với chất gây ung thư từ công việc, nghề nghiệp. Sự lão hóa của người cao tuổi, rượu bia và béo phì do lối sống không lành mạnh [8].
17. 9 Hình 2.4: Biểu đồ ước tính tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong chuẩn hóa theo độ tuổi (Thế giới) năm 2018, Việt Nam, cả hai giới, độ tuổi 0-74 2.2. Methyl hóa và ung thư đại trực tràng 2.2.1. Methyl hóa DNA là gì Di truyền học là một lĩnh vực nghiên cứu về những thay đổi có thể xuất hiện trong hoạt các động hoặc chức năng của gen do sự thay đổi trực tiếp của chuỗi DNA. Những thay đổi này gồm đột biến, xóa, chèn và dịch. Ngược lại, biểu sinh học là lĩnh vực nghiên cứu về những thay đổi có thể xuất hiện trong hoạt động hoặc có trong chức năng gen mà không liên quan đến bất kỳ thay đổi nào của trình tự DNA. Mặc dù hầu hết tất cả các tế bào trong một sinh vật sống đều chứa cùng một thông tin di truyền, nhưng không phải tất cả các gen đều được biểu hiện đồng thời bởi tất cả các loại tế bào. Xét về ý nghĩa rông hơn, thì các cơ chế biểu sinh là cầu trung gian cho các sự biểu hiện gen đa dạng trong nhiều loại tế bào và mô của các sinh vật đa bào. Trong bộ gen của động vật có vú, quá trình methyl hóa DNA là một cơ chế biểu sinh liên quan đến việc
18. 10 chuyển một nhóm methyl vào vị trí C5 của cytosine để tạo thành 5- methylcytosine. Quá trình methyl hóa DNA này có vai trò điều chỉnh biểu hiện gen bằng cách thu thập các protein liên quan đến ức chế gen hoặc ức chế sự gắn kết của các yếu tố phiên mã với DNA. Trong lịch sử, quá trình methyl hóa DNA được phát hiện ở động vật có vú ngay khi DNA được xác định là vật liệu di truyền ( Avery et al , 1944 ; McCarty và Avery, 1946 ). Năm 1948, Rollin Hotchkiss lần đầu tiên phát hiện ra cytosine đã biến đổi trong một chế phẩm của tuyến ức ở loài bò, mà cụ thể là con bê non bằng phương pháp sắc ký giấy. Quá trình methyl hóa DNA được xúc tác bởi một họ methyltransferase DNA (Dnmts) chuyển một nhóm methyl từ S - adenyl methionine (SAM) sang carbon thứ năm của cytosine để tạo thành 5mC. Dnmt3a và Dnmt3b có thể xây dựng lên một bản sao methyl hóa mới để DNA chưa được sửa đổi thực hiện sửa đổi, do đó nó được gọi là de novo Dnmt (Hình a). Mặt khác, Dnmt1 hoạt động trong quá trình sao chép DNA, mục đích là sao chép mẫu methyl hóa DNA từ chuỗi DNA mẹ lên chuỗi DNA con mới được tổng hợp. Hình 2.5: Quá trình methyl hóa DNA
19. 11 Tất cả ba Dnmts đều tham gia sâu rộng vào sự phát triển của phôi. Khi đạt thời điểm ngừng, các tế bào biểu hiện Dnmt sẽ giảm đi nhiều. Điều này cho thấy rằng mô hình methyl hóa DNA trong các tế bào postmitotic là ổn định. Tuy nhiên, các tế bào thần kinh postmitotic trong não động vật có vú trưởng thành vẫn có sự xuất hiện đáng kể của tế bào biểu hiện Dnmts, điều này làm tăng khả năng methyl hóa Dnmts và DNA có thể nó đóng một vai trò mới trong não ( Goto et al , 1994 ; Feng et al , 2005 ) [1]. 2.2.3. Bất thường methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng Methyl hóa DNA là một trong những biểu sinh học có thể điều chỉnh biểu hiện của gen. Ở người, quá trình methyl hóa DNA xảy ra ở cytosine, nó được gọi là dinucleotide CpG (liên kết C-phosphodiester-G). Phần lớn các dinucleotide CpG trong bộ gen của con người đều bị methyl hóa, tuy nhiên ở trên gen có các khu vực tập chung nhiều CpG, những khu vực đó được gọi là đảo CpG và thường không được methyl hóa trong các tế bào khỏe mạnh bình thường. Các đảo CpG được tìm thấy ở các vùng promoter của ~ 40 406060% gen ức chế khối u. Chúng thường dài khoảng 200 B20002000 bps, có hàm lượng CG>50% và tham gia vào quá trình điều hòa biểu hiện gen. Dinucleotide methyl hóa CpG thường được tìm thấy trong gen, trong centromeres, trong các yếu tố retrotransCPon và trong các trình tự LINE-1, SINE / Alu, v.v. Theo một nghĩa nào đó, quá trình methyl hóa bình thường này về cơ bản được đảo ngược như quá trình của các tế bào ung thư [9]. 2.3. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến đổi bisulfite Trong những năm qua, biến đổi bisulfite đã trở thành phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để phân tích methyl hóa DNA. Đó là cách thuận tiện và hiệu quả nhất để xây dựng lên một tấm bản đồ methyl hóa DNA cho từng cá nhân người bệnh. Là bước đầu tiên trong kỹ thuật phân tích của nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác, điều cực kỳ quan trọng là quá trình biến đổi bisulfite được
20. 12 hiểu và áp dụng rất tốt trong thực tế. Chuyển đổi bisulfite là một quá trình tương đối khắc nghiệt, nó sẽ thay đổi đáng kể tính chất hóa học và tính chất vật lý của mẫu DNA. Trong quá trình biến đổi, DNA của chúng ta sẽ chuyển từ các phân tử sợi kép lớn và ổn định sang một loạt các phân tử sợi đơn bị phân mảnh ngẫu nhiên. Ngoài ra, hầu hết các cytosine đã được chuyển đổi thành uracil. Về cơ bản, sau khi trải qua sự biến đổi lớn như vậy thì DNA của chúng ta không còn giống DNA gốc nữa, nên ta sẽ phải lưu ý thực hiện một số điều chỉnh sao cho phù hợp với mục đích tiếp theo [10]. 2.4. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao Illumina Infinium 450K Có hơn 28 triệu vị trí CpG (còn gọi là các điểm dinucleotide CpG) trong bộ gen của con người. Do sự ảnh hưởng ngày càng tăng trong nghiên cứu biểu sinh, quá trình methyl hóa DNA nói riêng, các nhà nghiên cứu khoa học họ cần một cơ sở dữ liệu tham khảo nơi có thể tìm thấy thông tin về các vị trí CpG. Thay vì sử dụng các cơ sở dữ liệu công cộng đang phát triển để cung cấp chính xác. Illumina đã phát triển một phương pháp nhất quán chỉ định vị trí CpG dựa trên thực tế hoặc trình tự tóm lược của từng vị trí CpG riêng lẻ. Phương pháp Illumina tận dụng các chuỗi bên cạnh một vị trí CpG để tạo ra một cụm vị trí CpG đặc biệt. Các số liệu này dựa trên những thông tin trình tự duy nhất và không bị ảnh hưởng bởi các phiên bản bộ gen khác. Illumina được chuẩn hóa thành thuật ngữ cũng tương đương với thuật ngữ chuỗi TOP / BOT thường được sử dụng để chỉ định chuỗi SNP. Ưu điểm của phương pháp này là nó sẽ luôn chỉ biểu thị định danh và định hướng cùng một số vị trí CpG giống nhau ngay cả khi cơ sở dữ liệu công cộng và bộ genome thay đổi. Điều này sẽ cho phép tất cả các nhà nghiên cứu khoa học dễ dàng nghiên cứu các điều tương quan đến vị trí CpG được xác định với nghiên cứu [10].
21. 13 2.5. Nghiên cứu trong nước và quốc tế 2.5.1 Một số nghiên cứu trong nước liên quan về gene FLI 1 và gene AGRN - Tuy nhiên chưa có nghiên cứu cụ thể nào xác định tính trạng methyl hóa về gene FLI 1 và gene AGRN, dưới đây là một số nghiên cứu trong nước có liên quan đến methyl hóa DNA tại Việt Nam. - Tháng 7 năm 2018, các nhà nghiên cứu Tràng Lan Vũ, Nguyễn Thu Trang, Văn Thị Hồng Đoàn và Lan Thị Thượng Võ đã nghiên cứu về methyl hóa BRCA1, RASSF1A và GSTP1 ở phụ nữ Việt Nam bị ung thư vú 11 - Tháng 3 năm 2018, các nhà nghiên cứu Phương Kim Trường, Thuận Đức Lão, Thủy Ái Huyền đã nghiên cứu Hypermethylation của Biomarker dựa trên gen DcR1 trong sàng lọc ung thư không xâm lấn của bệnh nhân ung thư cổ tử cung Việt Nam [12]. - Tháng 1 năm 2016, Thị Thượng Lan Võ, Bích Thuận Ta, Văn To Ta, Diệu Linh Vương, Quỳnh Uyên Nguyễn đã nghiên cứu về methyl hóa Promoter của GSTP1 và RASSF1A trong ung thư tuyến tiền liệt và tăng sản lành tính ở nam giới Việt Nam [13]. 2.5.2 Một số nghiên cứu quốc tế có liên quan về gene FLI 1 - Tháng 11 năm 2015, David J. Elzi, Meihua Song, Peter J. Houghton, Yidong Chen và Yuzuru Shiio đã nghiên cứu vai trò của gene FLI 1 đối với bênh ung thư xương và mô mềm ở trẻ em [14]. - Ngày 26 tháng 5 năm 2014, Nicolò Riggi, Birgit Knoechel, Shawn M. Gillespie và những người cộng sự đã nghiên cứu EWS-FLI1 sử dụng các cơ chế tái cấu trúc chromatin khác nhau để trực tiếp kích hoạt hoặc kìm nén các yếu tố tăng cường trong Ewing sarcoma [15]. - Tháng 2 năm 2015, Mara L. Lennard Richard , Danielle Brandon , Tamara K. Nowling , Dennis K. Watson , và Xian K. Zhang đã cho ra bài báo nghiên cứu Fli-1 kiểm soát phiên mã từ chất kích thích gen MCP-1, có thể cung cấp một cơ chế mới để kích hoạt chemokine và cytokine [16].
22. 14 2.5.4 Nghiên cứu quốc tế về gene AGRN - Tháng 12 năm 2016, Celine Lefebvre, Thomas Bachelot, Thomas Filleron, Marion Pedrero, Mario Campone, Jean-Charles Soria đã nghiên cứu về đột biến của ung thư vú di căn, và gene AGRN là một gen có liên quan đến căn bệnh này [17]. - Tháng 8 năm 2018, Xin Li, Xianteng Wang, Wanlu Song, Hui Xu, Rongyao Huang, Yuting Wang, Wenwei Zhao, Zhengtao Xiao, Xuerui Yang đã nghiên cứu đặc tính gây ung thư của NEAT1 trong các tế bào ung thư tuyến tiền liệt phụ thuộc vào mạch điều hòa phiên mã CDC5L-AGRN 18. - Tháng 12 năm 2019, Lei Zhang, Zhe Zhang, Zhenglun Yu đã nghiên cứu Xác định một dấu hiệu gen liên quan đến glycolysis mới để dự đoán di căn và sống sót ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi [19].
23. 15 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1.Vật liệu 3.1.1.Các hóa chất, sinh phẩm Bảng 3.1: Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài Tên hóa chất ĐVT Hãng sản xuất Agarose Gam Merck NaOH Gam Merck NaCl Gam Merck EDTA Gam Merck Ethanol Ml Merck Tris – HCL Gam Merck Tris Base, for Molecular Biology Gam Merck PCR Mastermix Pk Thermo scientific Loading dye Ml Thermo scientific Kit tách DNA Bộ Thermo scientific Nước cất, nước khử ion Ml Proteinase K Ml Thermo scientific Rnase Thermo scientific Ethidium Bronide Ml Merck PBS (Na HPO .2H O, Ml 2 4 2 NaH2PO4.H2O, NaCl) (Tris base, Acid Acetic, TAE 1X Ml EDTA) TE Ml (100nM Tris/1mM EDTA) CIAA Ml (chloroform, isoamylakihol) (0,1M NaOH, SDS 1%, Alkali Ml pH=12) 10X DreamTaq Buffer Ml Thermo scientific DreamTaq DNA Polymerase Ml Thermo scientific 10mM dNTP Mix Ml Thermo scientific (Phenol, Chloroform, Dung dịch 25:24:1 Ml Isoamylakihol) (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, Lysis Buffer Ml SDS 10%) Bộ Tissue Genomic DNA Extraction Bộ FavorPrep Mini Kit Bộ EZ DNA Methylation - Gold Bộ Zymo Research
24. 16 3.1.2.Mẫu bệnh phẩm Mẫu khối u và mô lành liền kề cố định formaldehyde của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, được lấy ở Bệnh Viện K Trung ương Việt Nam năm 2019. 3.1.3.Trang thiết bị Bảng 3.2: Danh mục các trang thiết bị sử dụng trong đề tài Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ Máy lọc nước Pall Co – UK Bể rửa sóng siêu âm Jeiotech – korea Bể ổn nhiệt Techne - OSI Máy li tâm Eppendorf – CHLB Đức Máy ảnh chụp gel Gel Logic 1500 – Kodak – USA Tủ lạnh -20ºC; -80ºC Super freezer Eco130 – Ficchtti – Italy Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany Lò vi sóng MS – 2347AR – LG VN Nồi hấp khử trùng HV – 110 – Hirayama – Japan Máy vortex Genius 3 – IKA Genmany/China Bộ điện di Scie – plas Ltd – UK Máy PCR Amplied Biosytems USA/Singapore Máy đo quang phổ Nadrop One Thermo scientific 3.2.Phương pháp Với mục đích tách chiết được DNA cố định formaldehyde để phục vụ cho các quá trình nghiên cứu về sau, và bởi vì DNA cố định formal nên DNA trong quá trình ngâm đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng, vì vậy cần phải sử dụng các phương pháp khác nhau để thực hiện tách chiết. Sự ảnh hưởng của formaldehyde đến DNA Thông thường formaldehyde được dùng để làm chất bảo quản các mẫu sinh phẩm trong phòng thí nghiệm, nó giúp kéo dài thời gian bảo quản các mẫu
25. 17 sinh phẩm rất tốt. Nhưng mặt khác nó lại gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng DNA. Cụ thể, formaldehyd sẽ phản ứng với DNA và protein, các phân tử DNA- protein được liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị, gây ra quá trình oxy hóa và phản ứng khử amin, làm biến tính DNA, ảnh hưởng nghiêm trọng đến enzyme [20]. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã thực hiện tách chiết DNA cố định formaldehyde và họ cũng chỉ tách chiết ra ở một mức độ nhất định. Vì DNA từ các mô lưu trữ cố định không phải lúc nào cũng phù hợp để phân tích do chất lượng không đủ và rất khó để tách chiết. 3.2.1.Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô cố định formaldehyde Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô bệnh nhân ung thư đại trực tràng cố định formal bằng phương pháp của Campos và cộng sự. Phương pháp này chúng em tham khảo từ phương pháp chiết xuất gan bằng Phenol-chloroform của tác giả SM Hykin, Adapted from Campos and Gilbert (2012), Kearney and Stuart (2004). Chúng em đã thay đổi một số bước trong phương pháp để phù hợp với điều kiện làm việc của phòng thí nghiệm sinh học phân tử Viện Khoa Học Sự Sống Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Protocol for Extraction of hDNA from Formalin-fixed Museum Specimens: Liver Extraction by Phenol-chloroform SM Hykin, Adapted from Campos and Gilbert (2012), Kearney and Stuart (2004) Bước 1. Dùng dao thái nhỏ khoảng 30-40 mg mẫu cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Rửa mẫu: mẫu mô được rửa 4 lần trong đệm GTE (100mM glycine, 10mM Tris – HCL pH=8, 1mM EDTA) trong 2 giờ. + Mẫu mô được rửa trong 1 phút với cồn 100%. + Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 70%. + Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 40%. + Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 20%.
26. 18 + Mẫu mô được rửa trong 10 phút với nước cất. Bước 2. Bổ sung 0,5 ml dung dịch đệm alkali. Đun 100ºC trong 40 phút (đưa vào bể ổn nhiệt) Bước 3. Thêm 500 µl dung dịch 25.24.1, đảo đều rồi để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Bước 4. Ly tâm 10000v/p trong 5 phút, sau đó thu dịch Bước 5. Thêm 500 µl dung dịch 24:1, đảo đều và để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Bước 6. Ly tâm 10000v/p trong 5 phút sau đó thu dịch. Bước 7. Thêm 1ml cồn 100%, đảo đều và ủ ở tủ -20ºC ít nhất trong 1 giờ. Bước 8. Ly tâm 12000v/p trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó loại bỏ dịch rồi để khô. Bước 9. Bổ sung 50µl TE để bảo quản trong -20ºC. Phương pháp tách DNA từ mẫu mô cố định formal bằng bộ KIT Phương pháp này được làm theo hướng dẫn có sẵn trong bộ KIT, đây là phương pháp chuẩn được thiết kế với mẫu mô cố định formaldehyde. Hóa chất: Chất tẩy rửa PBS RNase ( phải chuẩn bị vì bộ KIT không có) Bước 1. Cắt lấy mẫu mô khoảng 25mg, rửa mẫu mô 2 lần bằng PBS trong 10 phút (mỗi lần lấy 1ml) để loại bỏ bẩn, sau đó nghiền mẫu bằng micropestle (nghiền nát mẫu). Bước 2. Thêm 200µl bộ đệm FATG1 và trộn đều trong lúc nghiền. Bước 3. Thêm 20µl proteinase K ( 10mg/ml ) vào hỗn hợp, lắc đều. Bước 4. Ủ trong bể ổn nhiệt ở 60ºC từ 1-3 giờ cho đến khi mô được tan hoàn toàn, mix nhẹ bằng tay trong quá trình ủ (10 phút 1 lần). Bước 5. Thêm 4µl (100mg/ml) Rnase A, lắc đều bằng tay và để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.
27. 19 Bước 6. Thêm 200µl bộ đệm FATG 2 vào hỗn hợp mẫu, sau đó ủ trong bể ổn nhiệt ở 70ºC trong 10 phút Bước 7. Thêm 200µl cồn 100% vào hỗn hợp mẫu, lắc đều bằng tay. Bước 8. Sử dụng máy spindown để những giọt dụng dịch còn dính bên thành ống dồn hết xuống đáy. Bước 9. Đặt cột mini FATG vào trong ống eppendorf mới, chuyển hỗn hợp ở ống cũ ( bao gồm cả tủa) sang cột mini FATG. Sau đó ly tâm ở tốc độ 12000v/p trong 3 phút, ly tâm xong loại bỏ hết phần dịch. Bước 10. Thêm 400µl W1 Buffer vào cột mini FATG, ly tâm ở tốc độ tối đa trong 2 phút, sau đó loại bỏ dịch. Bước 11. Thêm 750µl Wash Buffer vào cột mini FATG, ly tâm ở tốc độ tối đa trong 1 phút. Sau đó loại bỏ dịch. Bước 12. Ly tâm ở tốc độ tối đa thêm 3 phút, sau đó để khô cột. Bước 13. Thêm 100µl Elution buffer hoặc nước có PH ( 7,5-9 ) vào màng của cột mini FATG ( đặt sang ống eppendorf mới) . Để đứng cột trong 3p, DNA từ màng sẽ rơi xuống ống ( lưu ý khi nhỏ elution buffer cần nhỏ chính xác vào màng). Bước 14. Ly tâm ở tốc độ tối đa trong 2 phút để rửa phân giải DNA. Tách chiết DNA ngâm formaldehyl bằng phương pháp NaOH2N Phương pháp này được tham khảo theo phương pháp tách chiết DNA từ móng tay của phòng nuôi cấy mô tế bào động vật thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học – Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam Rửa mẫu: mẫu mô được rửa 4 lần trong đệm GTE (100mM glycine, 10mM Tris – HCL pH=8, 1mM EDTA) trong 2 giờ. + Mẫu mô được rửa trong 1 phút với cồn 100%. + Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 70%. + Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 40%. + Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 20%.
28. 20 + Mẫu mô được rửa trong 10 phút với nước cất. Bước 1: Bổ sung 200µl NAOH 2N vào mẫu, ủ ở tº phòng qua đêm. Bước 2: Votex nhẹ bằng máy vortex cho đến khi tan hoàn toàn. Bước 3: Trung hòa dịch dến pH=6,8 kiểm tra bằng cách nhỏ 1µl dịch mẫu lên giấy pH. Sử dụng HCl 12N để điều chỉnh PH (mỗi lần nhỏ khoảng 1- 3ul) sau đó vortex ngay lập tức. Nếu pH quá thấp thì tủa sẽ hình thành, chỉnh pH với NaOH nếu cần thiết để làm tan tủa. Bước 4: Bổ sung 1V phenol/choloroform (25:24:1) vào dịch trung hòa, votex và li tâm 12000v/p trong 5 phút, chuyển dịch lớp trên sang ống dorf mới. Bước 5: Tủa AND bằng cách bổ sung 2V EtoH 95%, đảo đều và ủ ở - 20ºC trong ít nhất 1 giờ. Bước 6: Ly tâm 12000v/p trong 15-30 phút, loại dịch và để khô. Bước 7: Bổ sung 50µl TE (100mM Tris/1mM EDTA). Tách chiết DNA từ mẫu mô ngâm formal bằng phương pháp sử dụng Lysis buffer Phương pháp này được tham khảo từ phương pháp phân lập DNA nhanh chóng, hiệu quả từ Osmanthus thông qua phương pháp ly giải kiềm được điều chỉnh của tác giả Lisa Alexander (Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, Dịch vụ Nghiên cứu Nông nghiệp, Vườn ươm Quốc gia Hoa, Cây và Vườn ươm. Đơn vị nghiên cứu, Trung tâm nghiên cứu vườn ươm Otis L. Floyd, McMinnville, Tennessee, Hoa Kỳ) Protocol Rapid, Effective DNA Isolation from Osmanthus via Modified Alkaline Lysis Lisa Alexander U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, U.S. National Arboretum, Floral and Nursery Plants Research Unit, Otis L. Floyd Nursery Research Center, McMinnville, Tennessee, USA Rửa mẫu: mẫu mô được rửa 4 lần trong đệm GTE (100mM glycine, 10mM Tris – HCL pH=8, 1mM EDTA) trong 2 giờ.
29. 21 + Mẫu mô được rửa trong 1 phút với cồn 100%. + Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 70%. + Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 40%. + Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 20%. + Mẫu mô được rửa trong 10 phút với nước cất. Bước 1. Bổ sung 500μl Lysis buffer, vortex nhẹ. Bước 2. Bổ sung 2,5μl proteinase K, đảo đều, Ủ qua đêm trong bể ổn nhiệt ở 56ºC. Bước 3. Thêm 2μl Rnase vào hỗn hợp và ủ trong 60 phút ở 37ºC. Bước 4. Thêm dung dịch CIAA tỷ lệ 1:1 với mẫu, lắc đều cho dung dịch chuyển sang màu trắng đục, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. Ly tâm xong ta thu dịch ở pha trên cùng. Bước 5. Bổ sung Isopropanol hoặc ethanol 100% vào mẫu với tỷ lệ 1:1, lắc đều và ủ ở -20ºC qua đêm. Bước 6. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó loại bỏ dịch và thu cặn. Bước 8. Bổ sung 1000μl ethanol 70%, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó loại bỏ dịch và thu cặn. Để khô ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Bước 9. Bổ sung 50μl TE 1x. Điện di Các bước của phương pháp điện di thực hiện như sau: - Chuẩn bị gel Cân 1 gam agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun sôi trong lò vi sóng khoảng 3 phút cho agarose tan hoàn toàn. Để gel nguội khoảng 50ºC - 60ºC, đổ gel vào khuân gel đã cài lược và để cho đến khi gel đông lại (khoảng 30-40 phút). Đặt bản gel vào bể điện di, đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di sao cho ngập bản gel, sau đó rút lược ra khỏi bản gel. - Tra mẫu điện di
30. 22 Tỷ lệ tra: Giếng đối chứng 1μl loading buffer trộn với 5μl DNA lader, còn các giếng khác thì tra 1μl loading buffer với 5μl mẫu vào giếng. Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 100V, khi vị trí của vạch màu chạy đến 2/3 bản gel thì dừng quá trình điện di. - Nhuộm gel Bản gel được lấy ra khỏi khay điện di và nhuộm với ethidium bromide (nồng độ 30μl/l) trong 3 - 5 phút. Soi và chụp ảnh bản gel bằng máy chụp ảnh gel. Đo quang phổ kế Quang phổ kế (Spectrophotometer) là các thiết bị hoạt động dựa trên phân tích quang phổ của ánh sáng, nhằm thu được các thông tin về thành phần, tính chất hay trạng thái của những khối vật chất liên quan đến chùm ánh sáng đó. Phân tích quang phổ là phương pháp hàng đầu trong hóa phân tích. Thông thường thì quang phổ kế xác định phân bố cường độ ánh sáng theo bước sóng của ánh sáng do khối vật chất nào đó tự phát ra, hoặc phản xạ hay truyền qua ánh sáng nó. Những khối vật chất khác nhau có đặc tính phát quang hoặc hấp thụ ánh sáng với các bước sóng, hay mức năng lượng của photon, chúng thường được gọi là các vạch quang phổ. Đo cường độ ánh sáng ở các bước sóng đặc trưng cho phép xác định tỷ lệ (hay hàm lượng) của chất tương ứng trong mẫu vật cần nghiên cứu.
31. 23 3.2.2.Đánh giá chất lượng DNA tách chiết 3.2.2.1.Kết quả tách chiết DNA sử dụng phương pháp của campos và cộng sự M L U L U L U Hình 3.2.2.1: Kết quả tách DNA bằng phương pháp của Campos và cộng sự Phương pháp này được tham khảo từ một phương pháp tách chiết DNA từ phenol, trong đó có sử dụng đệm alkali. Kết của phương pháp này đạt yêu cầu về nồng độ DNA, nhưng chất lượng diện di lại kém, DNA còn nhiễm tạp chất phenol cao do phương pháp có sử dụng phenol. Phương pháp này cần được tối ưu hơn để đảm bảo về độ tinh sạch. 3.2.2.2.Kết quả phương pháp sử dụng bộ KIT M L U L U Hình 3.2.2.2: Kết quả tách DNA bằng phương pháp sử dụng bộ KIT
32. 24 Đây là một phương pháp chuẩn, được thiết kế phù hợp với mẫu mô cố định formal. Nồng độ DNA tách chiết thấp nhất so với 4 phương pháp còn lại, một số ít đạt yêu cầu. Ảnh điện di cho ra kém do DNA đứt gãy nhiều, nhưng phương pháp này lại đạt yêu cầu cao nhất về độ tinh sạch. 3.2.2.3.Kết quả phương pháp sử dụng NaOH 2N M L U L U Hình 3.2.2.3: Kết quả tách DNA bằng phương pháp NAOH 2N Kết quả tách chiết của phương pháp này cho ra nồng độ DNA cao bất thường, hình ảnh điện di và độ tinh sạch đều không đạt yêu cầu. Vì đang tách chiết DNA của mẫu mô cố định formal nên chúng tôi muốn sử dụng thử nghiệm một phương pháp khó khác, đó là phương pháp tách chiết DNA mòng tay. Kết quả cho thấy phương pháp này không phù hợp để áp dụng.
33. 25 3.2.2.4.Kết quả phương pháp 4: phương pháp lysis buffer M L U L U Hình 3.2.2.4: Kết quả tách DNA bằng phương pháp lysis buffer Phương pháp này được tham khảo và thử nghiệm từ một phương pháp tách chiết DNA thực vật, mặc dù không liên quan nhưng kết quả thực tế cho thấy nồng độ DNA đạt yêu cầu, hình ảnh điện di cũng tốt hơn những phương pháp còn lại, nhưng về độ tinh sạch chưa đạt yêu cầu. 3.2.3.Giới thiệu về phương pháp biến đổi bisulfite conversion Phương pháp này được lấy ngay trong bộ biến đổi bisulfite, phương pháp gồm các bước sau: Bước 1. Thêm 130μl CT conversion Reagent vào 20μl mẫu DNA (đã có) vào trong ống PCR. Bước 2. Đặt ống mẫu vào máy PCR và thực hiện các bước: 1. 98°C trong 10 phút 2. 64°C trong 2,5 giờ 3. 4°C trong tối đa 20 giờ Bước 3. Thêm 600μl M – Binding Buffer vào cột IC Zymo – SpinTM và đặt cột vào ống thu thập được cấp sẵn. Bước 4. Lấy mẫu (từ bước 2) cho vào cột IC Zymo - SpinTM có chứa M – binding Buffer. Đóng nắp và chộn bằng cách đảo ngược nhẹ bằng tay nhiều lần.
34. 26 Bước 5. Ly tâm 10.000 vòng trong 30 giây, sau đó loại bỏ dịch chảy qua màng. Bước 6. Thêm 100μl M – Wash Buffer vào cột, sau đó ly tâm 10.000 vòng trong 30 giây. Bước 7. Thêm 200μl đệm M – Desulphonation Bufer vào cột và để ở nhiệt độ phòng (20 - 30°C) trong 15 – 20 phút. Sau đó ly tâm 10.000 vòng trong 30 giây, xong ta thêm 200μl M – Wash Buffer và ly tâm tiếp 10.000 vòng trong 30 giây nữa. Bước 8. Đặt cột sang ống 1,5ml mới, thêm 10μl M – Elifying Buffer vào cột. Sau đó ly tâm 10.000 vòng trong 30 giây để rửa giải DNA. 3.2.4.Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa Truy xuất trình tự gene từ cơ sở dữ liệu Ensembl Cơ sở dữ liệu Ensembl là một trình duyệt quốc tế về gene mới, nhẹ và rất dễ dàng tuy cập. Trang web này được thiết kế cho phép chúng ta tìm kiếm những thông tin về gene mới nhất cho một số lượng lớn các loài, nhằm mục đích cung cấp các thông tin về các bộ gen. Ngoài việc truy cập trực tiếp vào tất cả các tệp trên trang web, chúng ta có thể duyệt các tệp có sẵn và tìm các liên kết nhanh để tải xuống các tệp chú thích gen và trình tự bộ gen. Xác định trình tự promoter của gene và khoảng cách tới vị trí CpG đích Việc dò tìm đầu 5´ là một trong những thách thức lớn nhất trong việc dò tìm gene do rất khó xác định chính xác promoter và điểm khởi sự phiên mã (transcriptional start site TSS). Hiện nay, xấp xỉ 17.000 gene người xuất hiện trên Genbank chỉ có khỏang 3000 gene là được ghi chú TSS. Hầu hết các cDNA lấy từ mRNA đều bị cắt ngắn đầu 5´ do quá trình phiên mã ngược không thể tạo được đầu 5´. Hoạt động của promoter và quá trình khởi sự phiên mã thực sự khá phức tạp. Sau khi chromatin trong khu vực chứa promoter được tái cấu trúc theo hướng duỗi thẳng và siêu acetyl hóa, phức hợp tiền khởi sự sẽ gắn lên vùng promoter lõi (nằm xấp xỉ 100 bp ở hai phía TSS). Quá trình phiên mã sau đó sẽ được điều khiển chủ yếu bởi các yếu tố phiên mã gắn lên vùng lân cận
35. 27 promoter (khoảng1 kb theo hướng thượng nguồn của TSS) và vùng intron đầu tiên. Trong trường hợp người ta có một vùng không gian DNA khá rộng lớn như genome người và việc lập bản đồ trình tự TSS chỉ cần độ phân giải thấp (khoảng xấp xỉ 2kb) đồng thời các TSS này có liên hệ với CpG thì ta có thể kết hợp hai thuộc tính CpG và promoter cho quá trình dò tìm [21]. Thiết kế mồi - Methyl Primer Express v1.0 MethPrimer là một chương trình thiết kế bisulfit chuyển đổi dựa trên Methylation PCR mồi . Hiện tại, nó có thể thiết kế mồi cho hai loại PCR bisulfite: PCR đặc hiệu methyl hóa (MSP) và PCR Bisulfite-Sequences PCR (BSP) hoặc PCR Bisulfite-Restriction. MethPrimer cũng có thể dự đoán các đảo CpG trong chuỗi DNA. Để xác định mức độ methyl hóa, ta sẽ thiết kế 2 cặp mồi cho mỗi promoter. Một cặp mồi dùng để xác định ADN bị methyl hóa và một cặp mồi dùng để xác định ADN không bị methyl hóa.
36. 28 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4. Kết quả 4.1.Kết quả đo hàm lượng DNA Bảng 4.1: Kết quả hàm lượng DNA sau khi đo quang phổ Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ Số DNA Tên phương pháp DNA trên DNA trên DNA trên mẫu dưới 1000ng/μl 500ng/μl 100ng/μl 100ng/μl Phương pháp của campos 10 4 0 6 0 và cộng sự Sử dụng bộ KIT 43 0 0 6 37 Phương pháp NaOH 2N 8 4 3 0 0 Phương pháp Lysis buffer 84 32 18 31 12 4.1.1.Phương pháp của campos và cộng sự - Nồng độ DNA không ổn định với 40% trên 1000mg/ul và 60% từ 120 – 366 - Khối lượng các mẫu là 125mg - Tỷ lệ OD 260/280 có mức ổn định từ 1.6 - 1.7 chiếm 60%. - Tỷ lệ OD 260/230 hầu hết đều < 1.8, còn lẫn nhiều tạp chất - Có một mẫu sát với chỉ tiêu về nồng độ, tỷ lệ OD chiếm 10% - 6 mẫu nhiễm phenol chiếm 60%. - Có một mẫu có chỉ số gần đạt tiêu chuẩn chiếm 10% tất cả thí nghiệm. 4.1.2.Sử dụng bộ KIT - Tổng có 43 mẫu DNA (không tính mẫu mô lợn) - Khối lượng các mẫu được cân toàn bộ trong khoảng từ 25-30 mg
37. 29 - Có 6 thí nghiệm có nồng độ DNA trên 100ng/ul chiếm 13.95% tất cả thí nghiệm bằng bộ KIT. - Có 13 thí nghiệm có tỷ lệ OD 260/280 từ 1,6-1,7 chiếm 30% , có một mẫu đạt 1,8 là mẫu lợn tươi. - Kết quả OD 260/230 không ổn định > 1.8 có 10 mẫu chiếm 23,25 %. - Hầu hết các thí nghiệm khi sử dụng bằng KIT không còn phenol trong mẫu chiếm 83%. 4.1.3.Phương pháp NaOH 2N - Tổng số mẫu : 8 mẫu (không tính mẫu mô lợn) - Khối lượng của các mẫu đều được cân 125 mg - Số mẫu có nồng độ DNA trên 1000ng/ul: 4 mẫu chiếm 50% - Số mẫu có nồng độ DNA trên 500ng/ul : 3 mẫu chiếm 37.5% - Không có nồng độ dưới 100ng/ul. - Nồng độ OD 260/280: 3 mẫu có nồng độ từ 1.76-1.78 chiếm 37.5% - Nồng độ OD 260/230 có một mẫu trên 2.0 còn lại hầu hết đều thấp hơn 1.5 - Số mẫu nhiễm tạp chất: 6 mẫu chiếm 75%. 4.1.4.Phương pháp Lysis buffer - Tổng số mẫu: 84 - Khối lượng: 4 mẫu chưa rõ khối lượng - 12 mẫu có khối lượng : 25 mg - 6 mẫu có khối lượng : từ 50 - 80mg - 71 mẫu có khối lượng 125 mg - Số mẫu có nồng độ DNA trên 1000ng/ul: 32 mẫu – chiếm 34.40% - Số mẫu có nồng độ DNA trên 500ng/ul: 18 mẫu – chiếm 19.35% - Số mẫu có nồng độ DNA trên 100ng/ul: 31 mẫu – chiếm 33.33% - Các mẫu vẫn còn tồn dư phenol : 54 mẫu - chiếm 58.06 %
38. 30 - Tỷ lệ OD 260/280 : từ 1.8 - 2.0 : 1 mẫu nhưng khi đo lại lần 2 cho kết quả khác. - Tỷ lệ OD 260/230: không có mẫu nào từ 1.8 - 2.0 TỔNG KẾT: Trong 4 phương pháp, phương pháp sử dụng bộ KIT là tối ưu nhất bởi vì phương pháp này được thiết kế phù hợp với mẫu mô cố định formaldehyde. Phương pháp sử dụng bộ KIT cho độ tinh sạch rất cao, nồng độ DNA phần lớn là kém nhưng một số mẫu cũng đạt yêu cầu. Sử dụng bộ KIT là phương pháp chuẩn để tách chiết DNA từ mẫu mô ngâm formal, kết quả tách chiết chưa đạt yêu cầu là do thao tác tách chiết của chiết và thao tác điện di của chúng tôi chưa được tốt. Phương pháp Lysis buffer là một phương pháp chúng tôi chọn để thử nghiệm, nhưng trên thực tế nó cho ra nồng độ DNA đạt yêu cầu và hình ảnh điện di tốt nhất, nhưng DNA còn bị tạp nhiễm, phương pháp này cần phải được tối ưu hơn. Phương pháp NAOH 2N là phương pháp thử nghiệm từ một phương pháp khó khác đó là phương pháp tách chiết DNA móng tay. Phương pháp này cho ra kết quả về nồng độ DNA đạt yêu cầu, nhưng còn DNA còn bị nhiễm tạp chất và điện di không hiển thị band DNA nên đây sẽ là phương pháp không phù hợp và bị loại bỏ. Phương pháp campos và cộng sự là phương pháp tách chiết DNA có sử dụng phenol, phương pháp này cho ra kết quả DNA đạt yêu cầu, nhưng DNA còn tồn dư tạp nhiễm phenol nhiều vì trong quá trình tách chiết thì phương pháp này có sử dụng phenol, hình ảnh điện di của phương pháp này còn kém. Phương pháp này cần được tối ưu tốt hơn.
39. 31 4.2 Phân tích in silico và thiết kế mồi Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa để phân biệt một cách tối ưu giữa DNA bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa. Các mồi không được methyl hóa sẽ khuếch đại DNA chuyển đổi natri bisulfite có trong DNA không được methyl hóa, trong khi đó mồi được methyl hóa sẽ khuếch đại DNA methyl hóa natri bisulphite [22]. 4.4.1 Gene FLI 1 Hình 4.5 : Vị trí kích thước gene FLI 1 Chromosome số 1 trên hệ gene, chiều dài từ 65,058,434-65,058,508 bp - Dữ liệu này được trích xuất từ cơ sở dữ liệu Ensembl geneome - Để xác định mức độ methyl hóa, ta sẽ thiết kế 2 cặp mồi cho mỗi promoter. Một cặp mồi dùng để xác định ADN bị methyl hóa và một cặp mồi dùng để xác định ADN không bị methyl hóa. Sử dụng phần mềm chuyên dụng Methyl Primer Express Software v1.0. (Applied Biosystem, Hoa kỳ). Trình tự mồi được sử dụng dựa vào trình tự nucleotid của các promoter thuộc tế bào dòng chuẩn trên ngân hàng gen. - Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene FLI 1
40. 32 Hình 4.6. Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene FLI 1 4.4.2. Gene AGRN Hình 4.7. Vị trí kích thước gene AGRN Chromosome số 1 trên hệ gene, chiều dài từ 1,047,475-1,047,838 bp - Dữ liệu này được lấy từ cơ sở dữ liệu Ensembl geneome - Sử dụng phần mềm chuyên dụng Methyl Primer Express Software v1.0. - Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene AGRN
41. 33 Hình 4.8. Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene AGRN 4.4.3. Kết quả thiết kế mồi 1. AGRN CpG M-F TTTTATTTATTTTTTTAGTTTCGCG 2. AGRN CpG M-R CGAAAATCTACTATCCCCGTC 3. AGRN CpG U-F TTTATTTATTTTTTTAGTTTTGTGG 4. AGRN CpG U-R CCAAAAATCTACTATCCCCATC 5. AGRN Promoter M-F TTTTTCGTTTGCGTTATGGTC 6. AGRN Promoter M-R GTATACTACACCGAATCCACGTT 7. AGRN Promoter U-F GTTTTTTGTTTGTGTTATGGTTGG 8. AGRN Promoter U-R ACATATACTACACCAAATCCACATT 9. FLI1 Promoter M-F AATGTGTTTGGGTATTTTCGC 10. FLI1 Promoter M-R AAATAACTTCACTTTACGAATCGAA 11. FLI1 Promoter U-F TATGAATGTGTTTGGGTATTTTTGT 12. FLI1 Promoter U-R AAATAACTTCACTTTACAAATCAAA
42. 34 13. FLI1 CpG M-F CGTTCGTATAGATTTTTAGCGTTTC 14. FLI1 CpG M-R TTACAACCTAAACCCAAACTTAACG 15. FLI1 CpG U-F TTTGTTTGTATAGATTTTTAGTGTTTT 16. FLI1 CpG U-R CAACCTAAACCCAAACTTAACA
43. 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận - Qua quá trình thí nghiệm, đã tách chiết thành công DNA cố định formaldehyde bằng bốn phương pháp trên. - Thiết kế được mồi PCR đặc hiệu methyl hóa bằng phần mềm chuyên dụng Methyl Primer Express Software v1.0. 2. Kiến nghị - Tối ưu hóa phương pháp tách chiết DNA của campos và phương pháp lysis buffer để DNA đạt được độ tinh sạch cao. - Sử dụng mồi PCR đặc hiệu methyl hóa đã được thiết kế cho các mục đích thí nghiệm tiếp theo.
44. 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Moore, L. D., Le, T. & Fan, G. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacology vol. 38 23–38 (2013). 2. Von Känel, T. & Huber, A. R. DNA methylation analysis. Swiss Med. Wkly. 143, (2013). 3. Dekker, E., Tanis, P. J., Vleugels, J. L. A., Kasi, P. M. & Wallace, M. B. Colorectal cancer. The Lancet vol. 394 1467–1480 (2019). 4. Colon Cancer Treatment (PDQ®)–Patient Version - National Cancer Institute. treatment-pdq. 5. Lucas, C., Barnich, N. & Nguyen, H. T. T. Microbiota, inflammation and colorectal cancer. International Journal of Molecular Sciences vol. 18 (2017). 6. Bray, F. et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. Cancer J. Clin. 68, 394–424 (2018). 7. Rawla, P., Sunkara, T. & Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: Incidence, mortality, survival, and risk factors. Przeglad Gastroenterologiczny vol. 14 89–103 (2019). 8. Noi, H., Phong, H., Nguyen, T., Minh, H. C. & Tho, C. CANCER CONTROL IN VIETNAM: WHERE ARE WE NOW? 9. Okugawa, Y., Grady, W. M. & Goel, A. Epigenetic Alterations in Colorectal Cancer: Emerging Biomarkers. Gastroenterology 149, 1204- 1225.e12 (2015). 10. Illumina. CpG Loci Identification. www.illumina.com/literature. (2010). 11. Vu, T. L., Nguyen, T. T., Doan, V. T. H. & Vo, L. T. T. Methylation profiles of BRCA1, RASSF1A and GSTP1 in Vietnamese women with breast cancer. Asian Pacific J. Cancer Prev. 19, 1887–1893 (2018).
45. 37 12. Truong, P. K., Lao, T. D. & LE, T. A. H. Hypermethylation of DcR1 Gene- based Biomarker in Non-invasive Cancer Screening of Vietnamese Cervical Cancer Patients. Iran. J. Public Health 47, 350–356 (2018). 13. Vo, T. T. L., Ta, B. T., Ta, V. T., Vuong, D. L. & Nguyen, Q. U. Promoter methylation profile of GSTP1 and RASSF1A in prostate cancer and benign hyperplasia in Vietnamese men. Turkish J. Med. Sci. 46, 228–235 (2016). 14. Elzi, D. J., Song, M., Houghton, P. J., Chen, Y. & Shiio, Y. The role of FLI- 1-EWS, a fusion gene reciprocal to EWS-FLI-1, in Ewing sarcoma. Genes Cancer 6, 452 (2015). 15. Riggi, N. et al. EWS-FLI1Utilizes Divergent Chromatin Remodeling Mechanisms to Directly Activate or Repress Enhancer Elements in Ewing Sarcoma. Cancer Cell 26, 668–681 (2014). 16. Lennard Richard, M. L., Nowling, T. K., Brandon, D., Watson, D. K. & Zhang, X. K. Fli-1 controls transcription from the MCP-1 gene promoter, which may provide a novel mechanism for chemokine and cytokine activation. Mol. Immunol. 63, 566–573 (2015). 17. Lefebvre, C. et al. Mutational Profile of Metastatic Breast Cancers: A Retrospective Analysis. PLoS Med. 13, (2016). 18. Li, X. et al. Oncogenic properties of NEAT1 in prostate cancer cells depend on the CDC5L–AGRN transcriptional regulation circuit. Cancer Res. 78, 4138–4149 (2018). 19. Zhang, L., Zhang, Z. & Yu, Z. Identification of a novel glycolysis-related gene signature for predicting metastasis and survival in patients with lung adenocarcinoma. J. Transl. Med. 17, (2019). 20. Gilbert, M. T. P. et al. The Isolation of Nucleic Acids from Fixed, Paraffin- Embedded Tissues-Which Methods Are Useful When? PLoS One 2, (2007).
46. 38 21. Zhang, M. Q. Computational prediction of eukaryotic protein-coding genes. Nature Reviews Genetics vol. 3 698–709 (2002). 22. Huang, Z., Bassil, C. F. & Murphy, S. K. Methylation-specific PCR. Methods Mol. Biol. 1049, 75–82 (2013).
47. 39 XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Thái Nguyên ngày tháng năm Người nhận xét phản biện Người hướng dẫn (chữ ký và ghi rõ họ tên) chữ ký và ghi rõ họ tên)