›

Khóa luận Nghiên cứu tác dụng điều trị viêm đại tràng từ cao chiết cây dâu (Morus Alba L.)

pdf 46 trang thiennha21 18/04/2022 5131
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu tác dụng điều trị viêm đại tràng từ cao chiết cây dâu (Morus Alba L.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfnghien_cuu_tac_dung_dieu_tri_viem_dai_trang_tu_cao_chiet_cay.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu tác dụng điều trị viêm đại tràng từ cao chiết cây dâu (Morus Alba L.)

  1. x ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI H ỌC Y DƯỢC BÙI TRÀ MY NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ VIÊM ĐẠI TRÀNG TỪ CAO CHIẾT CÂY DÂU (Morus Alba L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÙI TRÀ MY NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ VIÊM ĐẠI TRÀNG TỪ CAO CHIẾT CÂY DÂU (Morus Alba L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH2016.Y Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Bùi Thanh Tùng 2. ThS. Phan Hồng Minh Hà Nội – 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu này, bản thân em đã nhận được rất nhiều sự hỗ trợ và quan tâm từ gia đình, bạn bè và thầy cô. Nghiên cứu được hoàn thành dựa trên sự tham khảo kinh nghiệm của các anh chị khóa trước, các nghiên cứu, bài báo liên quan, các tổ chức ở Việt Nam và trên thế giới. Đặc biệt hơn là sự hỗ trợ, tạo điều kiện về vật chất cũng như chuyên môn của các cán bộ giảng viên trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội. Lời đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn hai thầy cô đã hướng dẫn em khóa luận này PGS.TS Bùi Thanh Tùng và Th.S Phan Hồng Minh cũng như toàn thể thầy cô trong bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng. Thầy cô là những người đã hướng dẫn trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và giúp em có thể hoàn thành được đề tài nghiên cứu này. Em cũng xin trân trọng cảm ơn tất cả các thầy cô giáo công tác trong trường đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Trong quá trình thực hiện nghiên cứu này, không tránh khỏi những thiếu sót, em kính mong các thầy cô, các chuyên gia và những người quan tâm đến đề tài có thể đóng góp ý, đưa ra ý kiến để đề tài của em có thể hoàn thiện hơn. Một lần nữa, em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2021 Sinh viên Bùi Trà My
  4. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1. Bệnh viêm đại tràng. 2 1.2 Triệu chứng 2 1.3 Phân loại 3 1.4 Yếu tố nguy cơ của bệnh viêm đại tràng. 4 1.5 Cơ chế bệnh sinh 5 1.6 Biến chứng của bệnh viêm đại tràng 6 1.7 Các phương pháp điều trị 6 2. Các dạng mô hình gây viêm đại tràng. 9 3. Tổng quan về Stress oxy hóa và phương pháp định lượng MDA 10 3.1 Stress oxy hóa và bệnh viêm đại tràng 10 3.2 Phương pháp định lượng MDA. 12 4. Sơ lược về phương pháp sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ 13 5. Cây dâu (Morus alba L.) 14 5.1 Vị trí phân loại: 14 5.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của cây dâu. 14 5.3 Thành phần hóa học của lá cây dâu: 15 5.4 Tác dụng dược lý. 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 19 1. Đối tượng nghiên cứu. 19 1.1 Mẫu nghiên cứu. 19 1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu. 19 1.3 Động vật thí nghiệm. 19 1.4 Hóa chất. 20
  5. 1.5 Thiết bị sử dụng: 20 2. Phương pháp nghiên cứu: 20 2.1 Xác định thành phần các chất có trong cao lá dâu. 20 2.2 Xây dựng mô hình chuột viêm đại tràng 21 2.3 Đánh giá tác dụng điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu: 21 2.4 Phương pháp xử lý số liệu: 22 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 1. Kết quả. 23 1.1 Kết quả cao chiết lá dâu. 23 1.2 Kết quả điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu. 26 2. Bàn luận: 29 2.1 Về cao chiết lá dâu: 29 2.2 Về khả năng điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu: 29 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT. 32 1. Kết luận: 32 2. Đề xuất: 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT SCFA Acid béo chuỗi ngắn 5-ASA Acid 5-aminosalicylic TNF-α Yếu tố hoại tử u alpha IL Interleukin MHC Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu ROS Oxy phản ứng RNS Nitơ phản ứng GC Sắc ký khí GC- MS/MS Sắc ký khí ghép hai lần khối phổ MDA Malondialdehyde PUFA Acid béo chưa no có nhiều liên kết đôi HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao TBA Thiobarbituric acid HDL Lipoprotein tỉ trọng cao LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp EtOH Ethanol BHT Butylated hydroxytoluene NIST Viện Tiên chuẩn và Công nghệ Quốc gia Mỹ
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên các hình Trang Hình 1 Phân loại Viêm đại tràng 3 Hình 2 Sử dụng thuốc cho nhóm bệnh nhân viêm đại 7 tràng từ nhẹ đến trung bình Hình 3 Sử dụng thuốc ở nhóm bệnh nhân viêm đại 8 tràng từ trung bình đến nặng Hình 4 Cấu trúc hóa học của cysteamin 10 Hình 5 Cấu trúc hóa học của Malondialdehyde 11 Hình 6 Hình thái cây dâu 14 Hình 7 Các flavonoid được phân lập từ lá dâu 15 Hình 8 Hình ảnh lá dâu 19 Hình 9 Sắc kí đồ GC - MS / MS của chiết xuất 24 ethanol của lá dâu. Hình 10 Hình ảnh đại diện cho đại tràng của các 27 nhóm nghiên cứu Hình 11 Kết quả định lượng MDA 28
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1 Các chất chính được xác định trong chiết xuất 25 ethanol của lá dâu bởi GC – MS / MS
  9. MỞ ĐẦU Trong xã hội hiện đại, bệnh lý về đường tiêu hoá đang là một vấn đề đáng báo động trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Trong đó, bệnh lý viêm đại tràng ngày càng phổ biến và có sự gia tăng về tỉ lệ cũng như mức độ ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống người bệnh. Các biến chứng của bệnh viêm đại tràng có thể gặp như: tắc ruột, thủng tuột và ung thư đại tràng [17, 46]. Mặc dù đã các thuốc điều trị như thuốc nhóm 5-ASA, thuốc corticosteroid, thuốc sinh học ức chế miễn dịch, nhưng tác dụng phụ của các thuốc này trên gan, thận là rất lớn. Vì vậy cho nên việc nghiên cứu để tìm ra các thuốc tối ưu hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng không mong muốn vẫn đang được tiến hành. Tại Việt Nam, các bệnh nhân mắc các bệnh mãn tính có xu hướng sử dụng các loại thuốc Đông Y hoặc các thuốc Y học cổ truyền có nguồn gốc tự nhiên do ít tác dụng phụ, chi phí thấp để giảm bớt gánh nặng về kinh tế khi sử dụng thuốc tân dược. Việt Nam là một trong những nước được khí hậu ưu ái, có thảm thực vật phong phú, đặc biệt là những loài cây có khả chữa bệnh. Cây dâu (Morus alba L.) là loài cây phổ biến ở nước ta, được trồng ở hầu khắp các vùng để lấy lá nuôi tằm và sử dụng một số bộ phận như lá, rễ, thân, để làm thuốc [1]. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng, lá cây dâu có hoạt tính chống oxy hóa, điều trị viêm đại tràng. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng điều trị viêm đại tràng của lá dâu còn rất ít. Do đó, đề tài: « Nghiên cứu tác dụng điều trị viêm đại tràng từ cao chiết cây dâu (Morus alba l.)» được thực hiện nhằm các mục tiêu sau: 1. Xác định sơ bộ được các chất có trong lá dâu (Morus alba L.). 2. Đánh giá tác dụng điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu trên mô hình chuột viêm đại tràng bởi cysteamin. 1
  10. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Bệnh viêm đại tràng. 1.1 Khái niệm Theo Hiệp hội Tiêu hóa Hoa Kỳ năm 2020 (American Gastroenterological Association – AGA): “Viêm đại tràng là một dạng bệnh viêm ruột, ảnh hưởng đến đại tràng và trực tràng, có thể gây đau bụng dữ dội, co rút, tiêu chảy và chảy máu.”[8] Tạp chí The Lancet năm 2017, “Viêm đại tràng là một rối loạn mãn tính của niêm mạc đại tràng, bắt đầu ở trực tràng và thường kéo dài liên tục qua một phần hoặc toàn bộ đại tràng, với triệu chứng đặc trưng là tiêu chảy ra máu.”[46] Như vậy, viêm đại tràng là một dạng bệnh viêm ruột mãn tính xuất hiện ở trực tràng và đại tràng, thường gây ra tình trạng tiêu chảy ra máu 1.2 Triệu chứng Các triệu chứng của viêm loét đại tràng có thể bao gồm từ nhẹ đến nặng và khác nhau ở mỗi người. Các triệu chứng này có thể thay đổi theo thời gian, giai đoạn thuyên giảm, bệnh nhân cảm thấy sức khỏe tốt và không có triệu chứng, xen kẽ giữa những đợt bùng phát. Viêm đại tràng là một dạng bệnh diễn biến tùy thuộc vào cá nhân từng người. Một số người có thể duy trì tình trạng sức khỏe tốt trong nhiều năm, trong khi một số khác lại bùng phát thường xuyên [17]. Các triệu chứng của bện nhân có thể thay đổi theo quy mô và mức độ ruột bị viêm, nhưng các triệu chứng phổ biến nhất khi bệnh bùng phát bao gồm [17]: - Tiêu chảy: thường kèm theo máu và chất nhày, bệnh nhân có nhu cầu khẩn cấp vào nhà vệ sinh. - Đau quặn bụng: có thể rất nghiêm trọng, thường xảy ra trường khi bệnh nhân đại tiện. - Mệt mỏi: điều này có thể do thiếu máu hoặc mất ngủ khi bệnh nhân phải thức dậy vào ban đêm do đau bụng và tiêu chảy gây ra. - Thiếu máu: bệnh nhân có thể bị giảm số lượng hồng cầu nếu bị mất máu nhiều hoặc ăn không ngon, gây ra cảm giác mệt mỏi cho bệnh nhân. 2
  11. 1.3 Phân loại Viêm đại tràng thường được phân loại theo mức độ ảnh hưởng của bệnh đến đại tràng. Viêm đại tràng được chia thành 3 loại chính, gồm: viêm niêm mạc trực tràng, viêm đại tràng phía bên trái và viêm toàn bộ đại tràng [17]. Hình 1: Phân loại Viêm đại tràng - Viêm niêm mạc trực tràng: trong viêm niêm mạc trực tràng, chỉ có phần trực tràng bị viêm, các phần còn lại của đại tràng không bị ảnh hưởng và vẫn có thể hoạt động bình thường. Đối với những bệnh nhân dạng này, triệu chứng chính là phân có máu tươi hoặc chất nhày lẫn máu. Bện nhân có thể bị tiêu chảy, phân bình thường hoặc thậm chí là táo bón, đôi khi cảm thấy cần đi vệ sinh gấp. Do phần trực tràng bị viêm nên nhạy cảm hơn, một số bệnh nhân cảm thấy họ muốn đi vệ sinh nhưng trên thực tế thì ruột của họ là rỗng, không thể cho ra bất cứ thứ gì [17]. - Viêm đại tràng phía bên trái: tình trạng viêm xảy ra ở vùng trực tràng và đại tràng xuống. Các triệu chứng bao gồm tiêu chảy kèm theo máu và chất nhày, đau bụng phía bên trái, đi ngoài gấp và mót rặn [17]. - Viêm toàn bộ đại tràng: trong loại này, tình trạng viêm ảnh hưởng đến hầu hết đại tràng, có thể gây tiêu chảy thường xuyên, kèm theo máu, chất nhày và đôi khi có mủ. Bệnh nhân có thể bị đau bụng dữ dội, co rút, sốt và hụt cân. Trong các đợt phát bệnh nhẹ hơn, triệu chứng chính gồm tiêu chảy hoặc phân lỏng hơn, không có máu [17]. 3
  12. 1.4 Yếu tố nguy cơ của bệnh viêm đại tràng. 1.4.1 Vị trí địa lý, tuổi tác, giới tính Viêm đại tràng phổ biến hơn cả ở hai khu vực Bắc Mỹ và Bắc Âu, và tỉ lệ mắc và lưu hành bệnh thấp nhất ở các nước Nam bán cầu và các nước phía Đông [46]. Thời điểm khởi phát viêm đại tràng cao nhất là từ trên 30 tuổi đến 40 tuổi [16]. Các nghiên cứu cũng đã ghi nhận không rằng giới tính không phải là yếu tố nguy cơ của bệnh viêm đại tràng [16, 27]. 1.4.2 Yếu tố di truyền Đối với viêm đại tràng, tiền sử gia đình là yếu tố quan trọng để đánh giá nguy cơ mắc bệnh. Nguy cơ mắc viêm đại tràng đặc biệt cao khi trong những gia đình có người mắc bệnh: 8 - 14% bệnh nhân có họ hàng gần mắc viêm đại tràng [36]. Ngoài ra, người Do Thái có tỉ lệ mắc viêm loét đại tràng cao hơn từ 3 đến 5 lần so với các dân tộc khác [9]. Điều này cũng chỉ ra cho chúng ta thấy rằng yếu tố di truyền cũng là một trong những yếu tố nguy cơ của viêm loét đại tràng. 1.4.3 Nhân tố môi trường Tỉ lệ mắc viêm đại tràng là cao hơn ở các nước phát triển so với các nước đang phát triển và ở thành thị so với nông thôn. Người ta giải thích nguyên nhân là do ở các nước đang phát triển, việc tiếp cận với các dịch vụ y tế và lưu trữ hồ sơ là tốt hơn so với các nước kém phát triển. Hơn nữa, điều kiện vệ sinh được cải thiện đã làm giảm tiếp xúc với các nhiễm khuẩn đường ruột từ khi còn nhỏ, do đó mà hạn chế sự hoàn thiện của hệ thống miễn dịch niêm mạc. Từ đó, có thể dẫn đến những phản ứng miễn dịch không phù hợp khi tiếp xúc với vi sinh vật lây nhiễm xảy ra sau này [46]. Các loại thuốc, chẳng hạn như thuốc tránh thai, liệu pháp thay thế hormone và thuốc chống viêm không steroid đều có liên quan đến việc tăng nguy cơ viêm loét đại tràng, trong khi kháng sinh thì không [46]. Việc cho con bú được cho là làm giảm nguy cơ dẫn đến viêm đại tràng. Dữ liệu được tổng hợp từ 11 nghiên cứu tiền cứu ở châu Âu không tìm thấy mối liên hệ giữa căng thẳng và khởi phát viêm loét đại tràng [25]. 4
  13. 1.5 Cơ chế bệnh sinh Viêm đại tràng là một bệnh đa yếu tố, có thể liên quan đến di truyền, rối loạn chức năng tế bào biểu mô, hệ vi sinh vật đường ruột, hệ thống miễn dịch bị suy yếu. Các nghiên cứu liên kết trên toàn bộ hệ gen đã xác định được 200 locus nguy cơ đối với bệnh viêm ruột, với hầu hết các gen ghóp phần gây ra cả viêm đại tràng và bệnh Crohn [26, 33]. Các locus liên quan đến tăng tính nhạy cảm với viêm loét đại tràng bao gồm kháng nguyên bạch cầu người và các gen liên quan đến chức năng rào cản, chẳng hạn như HNF4A và CDH1 [11, 26]. Tuy nhiên, di truyền chỉ giải thích được 7,5% phương sai của bệnh, ít có khả năng dự đoán về kiểu hình và hiện đang được sử dụng hạn chế trên lâm sàng [11, 26]. Trong các bệnh viêm đại tràng, hệ vi sinh vật của bệnh nhân thường kém đa dạng và kém ổn định hơn đáng kể theo thời gian [40]. Sự suy giảm của các vi khuẩn bảo vệ cơ thể như họ vi khuẩn sản xuất các acid béo chuỗi ngắn (SCFA) Ruminococcaceae và Lachnospiraceae cùng với sự gia tăng của các vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli và họ Fusobacteriaceae đã được ghi nhận [20]. Tác động chính của chứng loạn khuẩn là có thể làm giảm sức khỏe biểu mô, tăng thêm tình trạng rối loạn chức năng biểu mô và tính nhạy cảm bẩm sinh với viêm đại tràng trên bệnh nhân [40]. Với việc quan sát mô học tình trạng viêm dưới biểu mô, nhiều nghiên cứu đã coi tình trạng suy giảm biểu mô là một yếu tố gây viêm đại tràng [40]. Nguyên nhân dẫn đến sự suy giảm này là do sự thay đổi các chất tiết, chẳng hạn như các peptide kháng khuẩn và chất nhày; hoặc các khiếm khuyết mô học, chẳng hạn như do các mối nối chặt chẽ của biểu mô bị gián đoạn và quá trình tái tạo mô xảy ra lỗi [40]. Khi các rối loạn sinh học xảy ra làm mất khả năng sản xuất SCFA, chất cần thiết cho việc cung cấp năng lượng biểu mô và sản xuất chất nhày, thì nguy cơ mắc viêm đại tràng là rất cao [40]. Trong một số nghiên cứu, sử dụng các chất làm tăng khả năng vận chuyển SCFA đã được chứng minh là có một số tác dụng trong việc điều trị bệnh viêm loét đại tràng [14, 24, 47]. Trong viêm đại tràng hoạt động, môi trường viêm thúc đẩy thời gian tồn tại các tế bào bạch cầu trung tính, những tế bào phản ứng đầu tiên của hệ miễn dịch vốn chỉ tồn tại trong thời gian ngắn [40]. Thời gian sống sót của bạch cầu trung tính tăng lên đồng nghĩa với việc làm tăng hoạt động gây viêm và tổn thương mô 5
  14. của nó thông qua việc giải phóng các protease nền, các cytokin gây viêm và các chất oxy hóa như oxy phản ứng và nitơ phản ứng [40]. Việc tăng cường sản xuất các chất oxy hóa, chất trung gian gây viêm này đã góp phần tích cực vào quá trình khiến bệnh khởi phát và kéo dài phản ứng viêm trong viêm đại tràng. 1.6 Biến chứng của bệnh viêm đại tràng Trong một số trường hợp, viêm đại tràng có thể gây ra thêm những vấn đề về đường ruột. Các biến chứng có thể xảy ra bao gồm: tắc ruột, thủng ruột, Toxic Megacolon, tạo thành lỗ rò và ung thư đại tràng [17]. Tình trạng viêm nhiễm trên ruột có thể dẫn đến đến việc ruột bị thu hẹp lại, hậu quả là phân khó đi qua đại tràng, gây tắc ruột. Trong trường hợp tình trạng viêm lan rộng và nghiêm trọng, các khí trong hệ tiêu hóa có thể bị kẹt lại, khiến đại tràng sưng lên, gây sốt cao cũng như đau và căng ở bụng. Tình trạng này gọi là Toxic Megacolon, khả năng xảy ra là 1/40 bệnh nhân. Toxic Megacolon cần phải nhanh chóng điều trị nếu không rất có thể bệnh nhân cần phải phẫu thuật. Khi tình trạng viêm diễn ra mạnh hoặc tắc nghẽn nghiêm trọng thì tình trạng thủng ruột có thể xảy ra, đây là một dạng cấp cứu y tế hiếm gặp. Ở những người mắc viêm đại trạng, đặc biệt là trên những bệnh nhân đã từng phẫu thuật, trong một vài trường hợp hiếm hoi có thể phát triển thành lỗ rò kết nối các phần ruột với nhau, với âm đạo và bàng quang [17]. Đặc biệt, đối với những bệnh nhân đã mắc viêm đại tràng nhiều năm thì nguy cơ mắc ung thư là cao hơn bình thường. Nguy cơ này tăng lên theo mức độ bị ảnh hưởng của đại tràng do viêm, và càng nghiêm trong hơn trong trường hợp viêm đại tràng lan tỏa [17]. Nghiên cứu cho thấy, kể từ khi được chẩn đoán, nguy cơ tích lũy để phát triển thành ung thư của bệnh nhân viêm đại tràng là 2% sau 10 năm, 8% sau 20 năm và 18% sau 30 năm [21]. 1.7 Các phương pháp điều trị Mục tiêu chính của việc điều trị là ngăn chặn, thuyên giảm và làm giảm tình trạng tiến triển bệnh, tránh dẫn tới tàn tật, cắt bỏ hoặc ung thư đại trạng [17, 46]. Việc lựa chọn thuốc điều trị dựa trên mức độ lan rộng và mức độ nghiêm trọng của bệnh [46]. Các thuốc được sử dụng trong điều trị viêm loét đại tràng hiện nay là thuốc nhóm 5-ASA như sulfasalazine, olsalazine ; thuốc chống viêm corticosteroid như prednisolon, dexamethason, betamethason ; hoặc thuốc sinh 6
  15. học ức chế miễn dịch như azathioprine, vedolizumab, Nên cân nhắc sử dụng sớm các thuốc sinh học ở những bệnh nhân nhập viện với tình trạng viêm đại tràng nặng cấp tính. Sau khi thuyên giảm, có thể tiếp tục duy trì liệu pháp hoặc thêm thuốc khác để có thể duy trì được hiệu quả. Dưới đây là gợi ý điều trị trên 2 nhóm bệnh nhân bị viêm đại tràng từ nhẹ đến trung bình và nhóm từ trung bình đến nặng [46]. Hình 2: Sử dụng thuốc cho nhóm bệnh nhân viêm đại tràng từ nhẹ đến trung bình. 7
  16. Hình 3: Sử dụng thuốc ở nhóm bệnh nhân viêm đại tràng từ trung bình đến nặng 8
  17. 2. Các dạng mô hình gây viêm đại tràng. Hiện nay, có đến hơn 20 loại mô hình gây bệnh viêm ruột nói chung và viêm đại tràng nói riêng đã được đưa vào thử nghiệm. Mặc dù bản chất của các mô hình là khác nhau nhưng đểu thể hiện được các đặc điểm chính của bệnh, bao gồm: những thay đổi về hình thái, tình trạng viêm nhiễm, các dấu hiệu và triệu chứng, sinh lý bệnh. Những đặc điểm này đều tương tự với diễn biến của viêm đại tràng trên người [28]. Các mô hình gây viêm đại tràng được chia thành 5 loại lớn [28]: - Mô hình loại gen (gen knockout): Các nghiên cứu báo cáo rằng tình trạng tổn thương thành đại tràng ở những con chuột có gen IL-2 bị gián đoạn; bị loại bỏ gen IL-10; đột biến thụ thể tế bào T; hoặc bị loại bỏ vùng TNF - 3’UTR; hoặc thiếu hụt yếu tố Trefoil [28]. - Mô hình chuột chuyển gen: Trong nhóm này, các loại chuột được sử dụng là chuột chuyển gen IL-7, gen STAT-4 và gen HLB-27 [28]. - Mô hình viêm đại tràng tự phát: Ở giống chuột C3H/HejBir, viêm ruột chỉ giới hạn ở các tổn thương ở hồi tràng và phần bên phải của đại tràng. Nó xảy ra một cách tự phát ở tuần thứ 3 và thứ 4, sau đó biến mất sau 10-12 tuần [28]. - Mô hình viêm đại tràng cảm ứng: Các mô hình nghiên cứu nhóm này sử dụng các chất hóa học như Acid acetic, Iodoacetamide, Indomethacin, Oxazolone, DSS, Cysteamin Các chất này tác động trực tiếp đến thành đại tràng, gây tổn thương và dẫn đến viêm đại tràng [28]. - Mô hình chuyển các thành phần khác: Hai mô hình được ứng dụng trong dạng này bao gồm: mô hình chuyển protein sốc nhiệt (hsp) 60 đặc hiệu với tế bào T CD8 và mô hình chuyển kháng nguyên CD45RB [28]. - Ngoài ra còn có một số mô hình ít được sử dụng. Những con chuột sẽ biểu hiện các đặc điểm tương tự viêm đại tràng ở người khi tiêm vi sinh vật được phân lập từ phân của những con chuột cùng loài; hoặc cho uống Citrobacter Rodentium; hoặc chiếu tia gamma vào những con chuột bị thiếu hụt MHC lớp 2 [28]. Trong số các loại mô hình kể trên, mô hình viêm đại tràng cảm ứng do sử dụng các chất hóa học là loại mô hình được ứng dụng nhiều ở Việt Nam và trên thế giới. Đây là loại mô hình đơn giản, thao tác dễ dàng và dễ thực hiện, tính ứng 9
  18. dụng cao trong ứng dụng thử các thuốc điều trị viêm đại tràng. Cysteamin hiện nay cũng là một dạng chất được sử dụng để tạo mô hình viêm đại tràng trên chuột. Cysteamin hay còn gọi là β-mercaptoethylamine, có công thức hóa học là HSCH2CH2NH2 là một sản phẩn phân hủy của amino acid cystein. Cysteamin được sử dụng trong cơ thể để tạo thành co-enzyme A nhờ sự kết hợp với pantothenate (vitamin B5) và adenosine triphosphate [12, 34]. Chất này đã được cáp phép 20 năm dể điều trị các bệnh xơ nang [12]. Hình 4: Cấu trúc hóa học của cysteamin Sau khi uống, cysteamin gây độc tế bào, làm tổn thương tới niêm mạc đại tràng [44]. Cysteamin ức chế biểu hiện và hoạt động của thụ thể hoạt hóa tân sinh peroxisome gamma (PPARγ) [41]. PPARγ có thuộc tính kháng các phản ứng viêm trên các tế bào đơn nhân, làm giảm các cytokine gây viêm (TNF-α, IL-1, IL-6) thông qua ức chế hoạt động của các yếu tố sao chép tiền viêm [39]. Như vậy, việc dùng cysteamin sẽ làm tổn thương đại tràng, giảm khả năng chống oxy hóa của tế bào biểu mô ruột, khuếch đại phản ứng viêm, gây viêm đại tràng. Trong nghiên cứu của Sikiric và cộng sự đã chỉ ra rằng, khi sử dụng cysteamin ở liều 200 mg/kg và 400mg/kg thể trọng trên chuột đã làm tổn thương phần niêm mạc đại tràng. Các tổn thương này đã có thể quan sát được sau 30 phút kể từ khi sử dụng thuốc [44]. 3. Tổng quan về Stress oxy hóa và phương pháp định lượng MDA. 3.1 Stress oxy hóa và bệnh viêm đại tràng Stress oxy hóa liên quan mật thiết đến viêm đại tràng. Stress oxy hóa được định nghĩa là sự mất cân bằng giữa chất oxy hóa (ROS, RNS) và chất chống oxy hóa, dẫn đến phá vỡ tín hiệu oxy hóa khử, rối loạn chức năng tế bào và hậu quả là phát sinh bệnh tật [43]. ROS thường dùng để chỉ các dạng được tạo ra bởi quá trình khử oxy cũng như các sản phẩm thứ cấp của chúng, bao gồm: các gốc tự do •− • • như anion superoxide (O2 ), hydroxyl radical (HO ), peroxyl (RO2 ), alcoxyl • • (RO ) và hydroperoxyl (HO2 ); và các dạng không gốc như H2O2 và hydrochlorous acid (HOCl). RNS bao gồm: các gốc tự do như nitric oxide (NO•), nitrogen 10
  19. dioxide (NO2•); dạng anion như peroxynitrite (ONOO–); nitryl chloride (NO2Cl) và alkyl peroxynitrites (ONOOR) [37]. Đường tiêu hóa là nguồn sản xuất ROS chính [13]. Mặc dù có hàng rào biểu mô bảo vệ, tuy nhiên, các chất và mầm bệnh từ thức ăn có thể gây viêm bằng cách hoạt hóa biểu mô, bạch cầu đa nhân trung tính và đại thực bào tạo ra các cytokine gây viêm và các chất trung gian khác góp phần thêm vào stress oxy hóa [13]. Khi chức năng của hàng rào biểu mô bị rối loạn kéo theo là sự tăng thấm của các tế bào biểu mô đường tiêu hóa, bạch cầu trung tính và đại thực bào có biểu hiện tăng xâm nhập vào niêm mạc ruột, giải phóng 1 lượng lớn ROS và RNS [37]. Việc tăng cường sản xuất các chất oxy hóa này dẫn đến phá hủy DNA, protein, lipid góp phần vào sự khởi phát và tiến triển của viêm đại tràng. Chúng khuếch đại quá trình viêm, tăng lượng cytokine như TNF-α, IL-6, IL-1 có trong trong tế bào biểu mô [37]. Như vậy, các ROS và RNS chính là nguyên nhân gây ra sự peroxy hóa lipid ở mô ruột, gây hoại tử, áp xe và loét biểu mô ruột. Sự peroxy hóa lipid hay nói cách khác là phản ứng của oxy với lipid không bão hòa, tạo ra một lượng lớn các sản phẩm oxy hóa. Sản phẩm chính của quá trình là sự hình thành nên gốc lipid hydroperoxid. Các sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxy hóa lipid là các loại aldehyde như Malondialdehyde, propanal, hexanal và 4-hydroxymonenal [2]. Hình 5: Cấu trúc hóa học của MDA Malondialdehyde (MDA) là sản phẩm thứ cấp của trình peroxy hóa lipid. MDA được hình thành chủ yếu trong quá trình peroxy hóa hóa lipid cả các lipid có chứa các gốc PUFA, tuy nhiên cơ chế chi tiết của quá trình này vẫn chưa được rõ ràng. Có hai giải thiết chính về cơ chế hình thành MDA. Cơ chế thứ nhất, MDA được hình thành từ các gốc tự do peroxyl của các PUFA (có từ 3 nối đôi liên hợp 11
  20. trở lên) bằng quá trình đóng vòng đơn giữa các nguyên tử oxy của các peroxide. Cơ chế thứ hai cho rằng MDA được hình thành từ các gốc tự do dị vòng chứa gốc -O-O- của các PUFA bằng quá trình đóng vòng đôi. Ngoài ra còn 1 lượng nhỏ MDA có thể được hình thành từ sự oxy hóa acid arachidonic và quá trình thoái hóa oxy phụ thuộc sắt của amino acid, carbonhydrate, đường pentose và hexose[2]. Các sản phẩm peroxy hóa lipid đều được coi là chỉ thị sinh học tiềm năng của quá trình này. Các chỉ thị sinh học thường được sử dụng là MDA, 4- hydroxymonenal và IsoProstanes, Oxysterols. Trong đó MDA là chỉ thị sinh học phổ biến nhất của quá trình peroxy hóa lipid, giúp đánh giá được mức độ nghiêm trọng của stress oxy hóa trong viêm [2]. 3.2 Phương pháp định lượng MDA. Định lượng MDA dùng để đánh giá mức độ oxy hóa trong các mô sinh học, có thể sử dụng 2 phương pháp: định lượng trực tiếp và gián tiếp [2].  Định lượng trực tiếp Các phép phân tích định lượng trực tiếp MDA đều dựa trên nguyên lý kết hợp HPLC với đo quang phổ tử ngoại [2]. - Ưu điểm: Độ nhạy và độ đặc hiệu cao [2]. - Nhược điểm: Đòi hỏi thiết bị HPLC có detector có đội nhạy cao. Thời gian tiến hành dài, tùy vào mỗi loại mẫu, thời gian có thể rất khác nhau. MDA có thể liên kết với các thành phần trong mẫu nên cần phải phá hủy các liên kết này trước khi tiến hành chạy HPLC. Đồng thời, phải xác định chính xác được lượng MDA liên kết để có thể tính đúng được MDA tổng số và lượng MDA tự do[2].  Định lượng gián tiếp Nguyên tắc định lượng gián tiếp là dựa trên các dẫn xuất có khả năng phát huỳnh quang, các dẫn xuất màu hoặc hấp thụ tia tử ngoại hay các sản phẩm khí [2]. - Ưu điểm: thực hiện dễ dàng, có thể thực hiện được nhiều mẫu với tốc độ nhanh chóng [2]. - Nhược điểm: Độ chính xác không cao bằng phương pháp xác định trực tiếp [2]. Trong số các phương pháp định lượng gián tiếp, test TBA là phương thức được sử dụng để định lượng MDA thông qua phức MDA (TBA)2. Phương pháp 12
  21. này đánh giá chính xác lượng MDA hơn nhiều so với việc dùng dải bước sóng tử ngoại do không chỉ riêng MDA mà rất nhiều các andehyde khác có khối lượng phân tử nhỏ cũng hấp thụ ở dải bước sóng này. Phức MDA (TBA)2 khá bền, hấp thụ cực đại ở bước sóng khả kiến 532nm [2]. Tuy nhiên phương pháp sử dụng TBA cũng gây ra rất nhiều nhiễu, do phản ứng phụ của TBA với các hợp chất nội sinh ở nhiệt độ cao và pH thấp [23]. Hiện nay, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chất 2-aryl-1-methylindole sẽ phản ứng với MDA để tạo ra màu ổn định có độ hấp thụ cực đại ở vùng 580-620 nm. Trong đó, 1-metyl-2-phenylindole là thuốc thử tối ưu, nhanh chóng phản ứng với MDA tạo ra phức màu bền có cực đại hấp thụ ở 586 nm [23]. 4. Sơ lược về phương pháp sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ Sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ (GC – MS / MS) là một hệ thống phân tích sắc kí khí kết hợp với khối phổ song song. Mẫu được làm bay hơi và đi qua một cột mao quản chứa pha tĩnh. Các hợp chất trong mẫu được khí trơ đẩy ra một cách lần lượt theo thời gian [4]. Khi ra khỏi cột phân tích, các chất phân tích đi vào khối phổ kế song song (MS/MS) bao gồm hai máy phân tích khối lượng được ngăn cách bằng một ô va chạm. Các mảnh được chọn trong máy phân tích đầu tiên được phản ứng với khí trơ trong ô va chạm, dẫn đến phân mảnh tiếp tục. Các ion sản phẩm con này sau đó được phân giải trong ba tứ cực để phân tích. Các ion được phân tích dựa trên tỷ lệ khối lượng và điện tích (m/z) khác nhau của chúng [4]. Phương pháp phân tích sắc ký khí ghép nối hai lần khối phổ GC – MS/MS là phương pháp phân tích có độ nhạy cao. Độ chọn lọc cao của detector MS/MS cho phép giảm nhẹ việc chuẩn bị mẫu, phép tích phân peak dễ dàng và nhanh hơn, từ đó đơn giản hóa việc xử lý dữ liệu, loại bỏ nhiễu, tăng hiệu quả phân tích cho GC, đưa ra kết quả tin cậy hơn. Độ nhạy cao khiến MS/MS có thể phân tích được những mẫu mà GS-MS không làm được, nền mẫu càng phức tạp càng thể hiện tính năng vượt trội so với GS-MS, đồng thời cho phép phân tích lượng mẫu bơm ít hơn vào cột, chu kỳ phân tích nhanh hơn. Đây cũng chính là những lý do vì sao GC – MS/MS là phương pháp phân tích phù hợp với những mẫu phân tích phức tạp như mẫu cao dược liệu [4]. 13
  22. 5. Cây dâu (Morus alba L.) 5.1 Vị trí phân loại: Theo tài liệu [6], trong giới thực vật, cây dâu tằm có vị trí phân loại như sau: Giới: Plantae Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Bộ: Gai (Urticales) Họ: Dâu tằm (Moraceae) Chi: Morus Loài: alba 5.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của cây dâu. 5.2.1 Đặc điểm thực vật. Cây có thể cao tới 15m nhưng thường do hái lá nên chỉ cao 2-3m. Lá mọc so le, hình bầu dục, nguyên hoặc chia thành 3 thùy, có lá kèm, đầu lá nhọn hay hơi tù, phía cuống hơi tròn hoặc hơi bằng, mép có răng cưa to. Từ cuống lá tỏa ra 3 gân rõ rệt. Hoa đơn tính, khác gốc, hoa đực mọc thành bông, có 4 đài, 4 nhị (có khi 3), hoa cái cũng mọc thành bông hay thành khối hình cầu, có 4 lá đài. Quả bế bao bọc trong các lá đài, mọng nước thành một phức quả (quả kép) màu đỏ, sau đen sẫm, quả có thể ăn được và làm thuốc [1]. Hình 6: Hình thái cây dâu 14
  23. 5.2.2. Phân bố: Cây dâu tằm có nguồn gốc Trung Quốc, đã được di thực vào Việt Nam từ lâu, hiện nay được trồng ở khắp nơi để lấy lá nuôi tằm, một số bộ phận được khai thác dùng làm thuốc như lá, vỏ rễ, quả dâu, [1] 5.3 Thành phần hóa học của lá cây dâu: Ba flavonoid bao gồm quercetin 3-(6-malonylglucoside), rutin, và isoquercitrin đã được xác định là 3 hợp chất chống oxy hóa chính trong dịch chiết từ lá dâu tằm M. alba. Hàm lượng của chúng tương ứng với 9.0, 5.7, 1.9 mg/g trọng lượng khô [29]. Yang Yang và các cộng sự đã tìm thấy được 4 dẫn xuất 2-arylbenzofuran mới là moracins V - Y, cùng với 2 hợp chất đã biết moracin N và moracin P, được phân lập từ dịch chiết lá dâu tằm trong etanol [49]. Từ chiết xuất lá dâu trong butanol, 2 prenylflavanes mới và một glygside cùng với 6 hợp chất đã biết bao gồm isoquercitrin, astragalin, scopolin, skimmin, roseoside II, và benzyl D- glucopyranoside đã được phân lập [19]. Từ dịch chiết ethanol của lá M. alba, morachalcones B và C đã được phân lập [50]. Chúng là các chalcone hiếm với cấu trúc vòng furan 5 cạnh có nguyên tử O. Hình 7: Các flavonoid được phân lập từ lá dâu Năm 2010, ghi nhận được 1 hợp chất flavonoid mới và 10 hợp chất đã biết từ dịch chết lá dâu tằm M. alba trong methanol [18]. Trong đó, 3′-geranyl-3- prenyl-2′, 4′, 5, 7-tetrahydroxyflavone là flavonoid mới đã được đề cập tới ở trên và 10 hợp chất đã biết bao gồm: 3′, 8-diprenyl-4′, 5, 7-trihydroxyflavone, 15
  24. kuwanon S, 8-geranylapigenin, kaempferol, morusin, atalantoflavone, cyclomulberrin, sanggenon J, sanggenon K, và cyclomorusin. 5.4 Tác dụng dược lý.  Theo các tài liệu y học hiện đại - Chống oxy hóa: Quả dâu chín chứa nhiều anthocyanin, một chất chống oxy hóa tuyệt vời với khả năng loại bỏ gốc tự do mạnh hơn vitamin C. Tuy nhiên, có nghiên cứu đã chỉ ra rằng, dịch chiết lá trong methanol của M. alba cho giá trị chống oxy hóa còn cao hơn đáng kể so với quả. Cụ thể, hoạt tính chống oxy hóa cao nhất ở lá dâu đang trưởng thành, sau đó lá non và lá trưởng thảnh, cuối cùng mới là quả chín [15]. - Hoạt tính kháng nấm. Chiết xuất từ lá của M. alba có hoạt tính kháng nấm. Ở nồng độ 20, 40, 60, 80 mg/ml, chiết xuất từ lá trong methanol, cloroform và petroleum ether ức chế mạnh Candida albicans và Aspergillus niger với vùng ức chế rộng 12-28 mm [7]. - Khả năng làm trắng da. Mulberroside F được phân lập từ dịch chiết lá methanol của M. alba thể hiện hoạt tính chống tyrosinase, enzyme quan trọng trong việc hình thành melanin, gấp 4,5 lần mạnh hơn axit kojic, ức chế sự hình thành hắc tố trong tế bào [31]. Bên cạnh đó, norartocarpetin, euchrenone, và quercetin được phân lập từ dịch chiết lá ethanol cũng thể hiện khả năng chống tyrosinase mạnh hơn đáng kể so với acid kojic [51]. - Hoạt động độc tế bào. Hai flavonoid quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside và quercetin-3-7-di- O-β-D-glucopyranoside được phân lập từ dịch chiết lá M. alba trong methanol đã được chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển tế bào HL-60 ở bệnh nhân ung thư bạch cầu, với khả năng ức chế lần lượt là 51% và 57% ở nồng độ 2×10-4 mol/L [30]. Các flavonoid được phân lập từ dịch chết methanol của lá dâu tằm thể hiện hoạt tích gây độ tế bào chống lại cái tế bào ung thư HeLa, MCF-7, và Hep-3B ở người [18]. Morachalcones B và C được phân lập từ lá M. alba gây độc trên tế bào ung thư HCT-8 và BGC-823 [50]. Dịch chiết lá trong methanol của dâu tằm 16
  25. cũng thể hiện tác dụng ức chế rõ rệt đối với sự gia tăng của tế bào ung thư biểu mô tế bào gan người HepG2 [22]. - Chống tiểu đường. Nhiều báo cáo chỉ ra rằng, lá dâu tằm M. alba có tác dụng điều trị đáng kể trên các mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường. Việc sử dụng dịch chiết lá dâu 1 liều duy nhất ở 3,75g/kg thể trọng làm giảm nồng độ đỉnh glucose trong máu chuột Wistar và Goto-Kakizaki [38]. Đối với các nghiên cứu về tác dụng dài ngày của dịch chiết lá, thu được kết quả là nồng độ glucose máu giảm đáng kể, lượng triglyceride, cholesteron và ure máu được đưa về mức kiểm soát, khôi phục số lượng tế bào β đảo tụy bị suy giảm [35, 42, 45]. Cơ chế được cho là thông qua sự ức chế enzyme α -glucosidase và vận chuyển glucose. - Chống xơ vữa động mạch. Trong lá dâu chứa nhiều hợp chất chống oxy hóa với khả năng loại bỏ các gốc tự do mạnh mẽ và ức chế quá trình oxy hóa lipoprotein, giúp ngăn ngừa xơ vừa động mạch [15]. - Chống béo phì Khi sử dụng chiết xuất lá dâu với mức liều 100, 250, và 500 μg/ml trong 32 ngày liên tục, quan sát thấy sự giảm trọng lượng cơ thể và lượng mỡ, sự điều chỉnh tích tụ lipid trong gan ở chuột béo phì. Ngoài ra, cũng ghi nhận được sự giảm nồng độ của triacylglycerol, cholesterol và acid béo tự do trong huyết thanh, cùng với việc tăng tỉ lệ HDL/LDL [15].  Theo các tài liệu y học cổ truyền: Theo tài liệu y học cổ truyền, lá dâu tằm hay còn gọi là tang diệp là vị thuốc có tính hàn, vị ngọt, đắng, quy vào các kinh: can, phế, thận. Sử dụng tang diệp giúp [5]: - Giải cảm nhiệt, dùng đối với bệnh nhân cảm nhiệt, biểu hiện miệng khát, sốt cao, đau đầu, ho khan, có thể dùng với các vị khác trong bài tang cúc ẩm như: tang diệp 2g, liên kiều 12g, bạc hà 4g, cam thảo 4g, hạnh nhân 12g, cát cánh 8g, lô căn 20g, sắc uống. - Thanh can sáng mắt: dùng khi kinh can bị phong nhiệt, mắt đỏ sưng đau, biêm màng kết mạc, hoa mắt, chảy nhiều nước mắt. - Làm hạ huyết áp. 17
  26. - Làm hạ đường huyết, dùng trong bệnh tiêu khát (đái đường), phối hợp với sinh địa, tri mẫu, hoài sơn, cát căn. - Y học cổ truyền dùng lá dâu làm thuốc chữa đường hô hấp trên, ho khan, chóng mặt, nhức đầu, viêm mắt, mờ mắt. Ngày dùng 6-18g. 18
  27. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 1. Đối tượng nghiên cứu. 1.1 Mẫu nghiên cứu. Lá dâu được thu hái vào tháng 8 năm 2020 tại Hà Nam, được rửa sạch, sấy khô ở 50 độ C và bảo quản. Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội Hình 8: Hình ảnh lá dâu 1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu. Lá dâu sau khi được thu hoạch sẽ được làm sạch, sấy khô đến độ ẩm dưới 13%. 500 g lá dâu sẽ được cắt nhỏ, tiến hành chiết xuất bằng ethanol (EtOH) 30% với tỉ lệ nguyên liệu: dung môi là 100g:1L, chiết lặp lại 2 lần, gộp dịch chiết và loại dung môi bằng phương pháp cô để thu được cao đặc lá dâu. 1.3 Động vật thí nghiệm. Chuột nhắt trắng, chủng Swiss có trọng lượng trung bình 20 ± 5,0 g, khỏe mạnh, được mua từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Động vật được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại phòng thí nghiệm 3 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu. 19
  28. 1.4 Hóa chất. Bao gồm: 1-methyl-2-phenylindole; butylated hydroxytoluene; HCl 37%; 1,1,3,3-tetramethoxypropane (99%, Sigma-Aldrich); Tris-HCl (Sigma); cồn 30 độ; Methanol; sulfasalazine (500 mg, Pfizer). Các hóa chất được sử dụng đều có độ tinh khiết cao. 1.5 Thiết bị sử dụng: - Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV – VIS, Mỹ - Hệ sắc ký khí khối phổ GC-MS/MS 7000D Triple Quad, Agilent - Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal - Cân phân tích AY 220 của hãng Shimadzu, Nhật Bản - Máy khuấy từ của hãng Shimadzu, Nhật Bản. - Máy li tâm của hãng Shimadzu, Nhật Bản. - Cuvet (1 ml), Eppendorf 1,5 ml (50 chiếc/túi) - Micro pipet một đầu kênh 2-20 μL, 10-100 μL, 100-1000 μL. - Các dụng cụ khác sử dụng trong thực nghiệm: ống nghiệm, đầu côn, pipet, bình định mức, đũa thủy tinh, bếp từ, bình cầu, các loại cốc có mỏ dung tích 25 – 500ml . 2. Phương pháp nghiên cứu: 2.1 Xác định thành phần các chất có trong cao lá dâu. - Phương pháp: GC-MS/MS. - Cách tiến hành: Mẫu được chiết được pha trong dung môi Methanol bằng sóng siêu âm, được lọc qua màng lọc PTFE 0,45um và đem phân tích định tính bằng phương pháp GC-MS/MS. Sử dụng hệ sắc ký khí khối phổ GC-MS/MS 7000D Triple Quad của hãng Agilent. Điều kiện chạy sắc ký khối phổ như sau: + Sắc ký: Sử dụng cột DB-5ms: 30m x 250um x 0.25um; Chương trình nhiệt độ: 50oC - 2 phút; Tăng 10oC/phút tới 250oC; Tổng thời gian chạy là 30 phút + Khối phổ: Nguồn ion hóa: EI; Nhiệt độ nguồn: 230oC; Năng lượng ion hóa: 70 eV; Dải quét từ 100-350 nm - Cách đánh giá kết quả: 20
  29. Kết quả sau chạy được định tính trên dữ liệu của thư viện NIST 14 để xác định chất. 2.2 Xây dựng mô hình chuột viêm đại tràng Chuột nghiên cứu sau khi được mua về sẽ được nuôi 3 ngày để thích nghi trước khi tiến hành thí nghiệm. Nghiên cứu tiến hành trong 7 ngày, ngày đầu tiên của nghiên cứu, chuột được gây mô hình bằng cysteamin. Mô hình được thực hiện bằng cách cho chuột uống cysteamin liều 200 mg/kg thể trọng vào lúc 9h sáng và 13h chiều (uống 2 lần, mỗi lần cách nhau 4 tiếng). Chuột được nhịn ăn 1 ngày trước khi cho uống cysteamin. Nhóm chứng sinh lý thay thế cysteamin bằng nước muối sinh lý NaCl 0,9%. 2.3 Đánh giá tác dụng điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu:  Chuột nhắt bị phân ngẫu nhiên thành 5 nhóm, mỗi nhóm 5 con và được điều trị theo chương trình: - Nhóm 1: Nhóm chứng sinh lý - Nhóm 2: Nhóm bệnh lý (gây tổn thương đại tràng ngày đầu tiên với liều cysteamin 200mg/kg thể trọng) - Nhóm 3: Nhóm chứng thuốc (gây tổn thương đại tràng ngày đầu tiên với liều cysteamin 200mg/kg thể trọng + uống sufasalazine liều 222 mg/kg thể trọng) - Nhóm 4: Nhóm cao lá dâu 100 mg/kg thể trọng (gây tổn thương đại tràng ngày đầu tiên với liều cysteamin 200mg/kg thể trọng + uống cao lá dâu liều 100mg/kg thể trọng) - Nhóm 5: Nhóm cao lá dâu 200 mg/kg thể trọng (gây tổn thương đại tràng ngày đầu tiên với liều cysteamin 200mg/kg thể trọng + uống cao lá dâu liều 200mg/kg thể trọng)  Cách pha mẫu: Cao chiết ethanol của lá dâu được hòa tan với nước với liều thích hợp (liều 1: 0,1 g/20ml và liều 2: 0,2g/20ml) sau đó cho chuột uống dựa vào cân nặng của chuột (0,2 ml/10g).  Các nhóm chuột được điều trị trong 7 ngày. Trọng lượng được xác định vào lúc 9 giờ sáng các ngày. Sau khi cho uống thuốc xong, chuột được cho ăn và uống nước bình thường. Sau 7 ngày, tất cả các chuột bị giết và tách phần đại tràng. Mở 21
  30. đại tràng, rửa sạch bằng nước muối sinh lý, sau đó đem đi tiến hành các bước chuẩn bị để định lượng MDA. Chuẩn bị mẫu ruột: - Lấy 250 g đoạn ruột bị viêm, rửa sạch bằng nước muối sinh lý - Nghiền đồng thể ở nhiệt độ thấp trong đệm Tris-HCl với tỷ lệ thể tích mẫu: đệm = 1:9, thu dịch nghiền - Thêm 10 µl BHT 0.5M - Ly tâm 3000 vòng/phút ở 4 độ C, hút lấy dịch trong.  Quy trình định lượng MDA: Phương pháp đo quang MDA sử dụng 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMOP) là chất chuẩn để dựng đường chuẩn trong tính toán. Mẫu thử trong phần bước 1 của quy trình sẽ là TMOP nếu đang trong quá trình xây dựng đường chuẩn; hoặc là phần dịch trong hút được trong bước chuẩn bị mẫu ruột nếu đang trong quá trình đo độ peroxy hóa lipid ở ruột chuột. Quy trình chung bao gồm các bước : - Bước 1: Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng gồm: 0.64 ml 1-methyl-2- phenylindole 10.3 mM, 200 µl mẫu thử, 10 µL BHT µg/mL - Bước 2: Vortex 15 giây - Bước 3: Thêm 0.15mL HCl 37% - Bước 4: Ủ hỗn hợp ở 45 độ C trong 45 phút - Bước 5: Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút - Bước 6: Hút lấy phần dịch trong và đem đi đo quang ở bước sóng 586 nm 2.4 Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu nghiên cứu được lưu trữ và xử lý thống kê sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2016. 22
  31. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả. 1.1 Kết quả cao chiết lá dâu.  Quá trình chiết: Tiến hành chiết lá dâu theo quy trình. Lá dâu sau khi được thu hoạch sẽ được làm sạch, sấy khô đến độ ẩm dưới 13%. 500 g lá dâu sẽ được cắt nhỏ, tiến hành chiết xuất bằng EtOH 30% với tỉ lệ nguyên liệu: dung môi là 100g:1L, chiết lặp lại 2 lần, gộp dịch chiết và loại dung môi bằng phương pháp cô để thu được 101,5g cao đặc lá dâu. Hiệu suất quá trình chiết: 20,3%. Hàm ẩm cao chiết: 6,54%.  Xác định các thành phần có trong cao chiết: Cao chiết được đem đi xác định thành phần bằng phương pháp phân tích sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ GC – MS/MS, thu được sắc kí đồ như hình 9. Kết quả sau chạy được định tính trên dữ liệu của thư viện NIST 14 để xác định chất. Các hợp chất được tìm thấy trong cao chiết bao gồm: Phenol, 2,5-bis(1- methylethyl)-, acetate; 6-Methyl-3-[3-oxo-3-phenylprop-1-en-1-yl]chromen-4- one; isophthalic acid, 3,5-difluorophenyl octyl ester; 4H-Benzo[def]carbazole, Anthranoid: Anthracene, 9,10-dihydro-9-(1-methylpropyl)-; 1H-1,2,3-Triazole, 4-methyl-5-(5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)-. 23
  32. Hình 9: Sắc kí đồ GC - MS / MS của chiết xuất ethanol của lá dâu. 24
  33. Pic Thời Độ tin Công Phân sắc gian Tên hợp chất cậy thức tử khối kí lưu (tR) (%) phân tử (g/mol) 1H-1,2,3-Triazole, 4-methyl-5- 1 11,94 68,75 C7H9N5 163 (5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)- 2 12.32 4H-Benzo[def]carbazole 60,34 C14H9N 191 1H-1,2,3-Triazole, 4-methyl-5- 3 13.12 68,52 C7H9N5 163 (5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)- Anthracene, 9,10-dihydro-9- 4 14,76 66,84 C18H20 236 (1-methylpropyl)- C11H13N 5 15,16 7-Methoxy-2,3-dimethylindole 68,87 175 O Anthracene, 9,10-dihydro-9- 6 16,23 61,72 C18H20 236 (1-methylpropyl)- Phenol, 2,5-bis(1- 7 16,79 63,92 C14H20O2 220 methylethyl)-, acetate 8 17,32 Dibenz[b,f]][1,4]oxazepine 81,52 C13H9NO 175 6-Methyl-3-[3-oxo-3- 9 18,70 phenylprop-1-en-1- 61,14 C19H14O3 290 yl]chromen-4-one Isophthalic acid, 3,5- C22H24F2 10 27,54 66,25 390 difluorophenyl octyl ester O4 Bảng 1: Các chất chính được xác định trong chiết xuất ethanol của lá dâu bởi GC – MS / MS 25
  34. 1.2 Kết quả điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu.  Đánh giá đại thể: Sau 7 ngày, tất cả các chuột bị giết và tách phần đại tràng, mở đại tràng, rửa sạch bằng nước muối sinh lý. Hình 10 là hình ảnh đại diện cho đại tràng của các nhóm nghiên cứu. - Nhóm chứng sinh lý: không quan sát thấy vết loét, đại tràng bình thường. - Nhóm bệnh lý: quan sát thấy rõ ổ loét - Nhóm chứng thuốc: không loét, không suất huyết, ruột hơi phù nề. - Nhóm cao lá dâu 1 (sử dụng cao chiết lá dâu liều 100 mg/kg thể trọng): xuất huyết nhẹ, hơi phù nề. - Nhóm cao lá dâu 2 (sử dụng cao chiết lá dâu liều 200 mg/kg thể trọng): xuất huyết nhẹ, hơi phù nề. Như vậy, từ góc nhìn đại thể mà nói, khi sử dụng cao lá dâu ở mức liều 100 mg/kg thể trọng và 200 mg/kg thể trọng cho kết quả khả quan trong điều trị viêm đại tràng. 26
  35. Sinh lý Bệnh lý Chứng thuốc Liều 100mg/kg Liều 200mg/kg Hình 10: Hình ảnh đại diện cho đại tràng của các nhóm nghiên cứu 27
  36.  Đánh giá mức độ chống oxy hóa: Tác dụng điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu tằm trên chuột nhắt trắng được đánh giá qua khả năng chống peroxy hóa lipid. Khả năng này được đánh giá thông qua việc định lượng MDA – một sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid. Kết quả định lượng MDA được thể hiện cụ thể trên hình 11. 8.00 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 5.98# MDA (nmol/mg protein) MDA(nmol/mg 2.00 2.79* 3.12* 2.88* 1.00 1.76 0.00 Sinh lý Bệnh lý Chứng thuốc Dâu 100 Dâu 200 Nhóm * Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm bệnh lý, p<0.05 # Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm sinh lý, p<0.05 Hình 11: Kết quả định lượng MDA. Từ hình 11, thông qua kết quả nồng độ MDA, nhận thấy quá trình peroxy hóa lipid là khác nhau giữa các nhóm. Ở nhóm chứng bệnh lý, MDA cao hơn so với nhóm sinh lý, sự khác biệt là có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Nhóm được uống thuốc sulfasalazine, nồng độ MDA thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm bệnh lý (p<0,05). Hai nhóm được uống cao dược liệu cũng cho kết quả tương tự nhóm được sử dụng thuốc điều trị, lượng MDA là thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm bệnh lý (p<0,05). 28
  37. 2. Bàn luận: 2.1 Về cao chiết lá dâu: Kết quả cao chiết trong nghiên cứu này khá nhỏ, với hiệu suất quá trình chỉ vào 20,3%. Nguyên nhân dẫn đến hiệu suất chiết thấp có thể là do dung môi sử dụng để chiết là cồn có nồng độ thấp (EtOH 300). Sau đó, đem phần cao thu được đi định tính bằng phương pháp GC-MS/MS đã đánh giá được sơ bộ được các thành phần có trong cao chiết (Bảng 1) 2.2 Về khả năng điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu: Viêm đại tràng đang dần trở thành bệnh lý phổ biến trên thế giới, ảnh hưởng rất nhiều đến chất lượng cuộc sống của con người và đặc biệt nó để lại nhiều biến chứng nghiêm trọng chẳng hạn như gây thủng ruột, tạo lỗ rò và ung thư đại tràng [17]. Bệnh viêm đại tràng là bệnh lý đặc trưng với tình trạng tiêu chảy ra máu và liên quan mật thiết đến tình trạng stress oxy hóa, biểu hiện ở tình trạng mất cân bằng các các chất oxy hóa và các chất chống oxy hóa tại niêm mạc đại tràng [17, 37]. Dựa trên cơ sở này, nhiều nghiên cứu thực nhiệm nghiên cứu về viêm đại tràng đã xây dựng mô hình bệnh tật bằng việc gây tăng sinh các chất oxy hóa, giảm khả năng loại bỏ các gốc tự do ở niêm mạc ruột chuột. Hiện nay có đến hơn 20 mô hình gây viêm ruột nói chung và viêm dại tràng nói riêng đã được đưa vào thực nghiệm, mỗi mô hình lại có những ưu điểm và hạn chế riêng [28]. Với ưu điểm dễ thực hiện và có hiệu quả cao, cysteamin cũng là một trong các tác nhân đã được sử dụng gây viêm đại tràng trên chuột, nhằm đánh giá khả năng điều trị bệnh của các thuốc và cao dược liệu. Cysteamin là một chất gây độc tế bào, gây nên tình trạng stress oxy hóa, khiến tế bào sản sinh nhiều yếu tố gây viêm [41, 44]. Việc sử dụng cysteamin làm chất gây viêm đại tràng đã được ứng dụng trên nhiều mô hình viêm đại tràng ở chuột [44, 3]. Chuột được gây viêm bằng cách sử dụng cysteamin theo đường uống ở mức liều 200 mg/kg thể trọng hoặc 400 mg/kg thể trọng [41]. Trong nghiên cứu này, mức liều 200 mg/kg thể trọng là mức liều được khảo sát và cho thấy là phù hợp để tiến hành nghiên cứu đánh giá khả năng điều trị viêm đại tràng mà không gây chết toàn bộ chuột. Sau 7 ngày, chuột được mổ và tách mở phần đại tràng, 29
  38. quan sát được rõ ràng phần đại tràng của chuột nhóm chứng bệnh lý bị loét và xuất huyết. Kết quả đo nồng độ MDA cũng cho thấy mức độ peroxy hóa lipid của chuột nhóm này là cao hơn nhiều so với nhóm chứng sinh lý, và sự khác biệt này là có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Sulfasalazine vốn là thuốc được phát triển vào năm 1940 để điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp [32]. Sau đó, nó nhanh chóng được công nhận là có hiệu quả trong điều trị bệnh viêm đại tràng và trở thành một chất chính dùng trong điều trị bệnh này trong hơn 50 năm qua. Cấu trúc của sulfasalazine bao gồm 1 phân tử acid 5-aminosalicylic (5-ASA) được liên kết azo với phân tử sulfapyridine [32]. Sau khi vào đến đại tràng, liên kết này bị phá hủy bởi enzym azore ductase của các vi khuẩn đường ruột, phần sulfapyridine được hấp thu qua thành ruột, biến đổi ở gan và đào thải qua nước tiểu [32]. Phần 5-ASA còn lại, cũng chính là phần cho tác dụng của thuốc, tiếp xúc trực tiếp với niêm mạc đại tràng, ngăn chặn các con đường gây viêm khác nhau bao gồm ức chế cyclooxygenase và sự sản xuất prostaglandin E2; ức chế tổng hợp leukotriene; ngăn chặn các phản ứng viêm bằng việc ức chế sinh IL-1, IL-6 và TNF-α [32]. Do đó mà các phản ứng viêm và xuất huyết ở bệnh nhân viêm đại tràng được cải thiện sau khi sử dụng sulfasalazine. Điều này cũng được thể hiện rất rõ ở kết quả nhóm chứng thuốc sử dụng sulfasalazine liều 222mg/kg thể trọng trong nghiên cứu này của chúng tôi. Cụ thể, khi quan sát đại thể thấy được phần đại tràng của nhóm chứng thuốc chỉ còn hơi phù nề, không rõ vết loét và không xuất huyết. Sau khi đem phần đại tràng đi đo MDA, kết quả thu được cũng rất khả quan, nồng độ MDA của nhóm này nhỏ hơn đáng kể so với nhóm chứng bệnh lý (p<0,05). Trong nghiên cứu này, phương pháp đo quang MDA và thuốc chứng dương sulfasalazine đã được sử dụng để đánh giá được khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá dâu thông qua chỉ số peroxy hóa lipid của mô đại trạng. Kết quả cho thấy, hai nhóm sử dụng cao chiết lá dâu liều 100 mg/kg thể trọng và 200 mg/kg thể trọng đáp ứng điều trị tốt. Chỉ số nồng độ MDA của 2 nhóm này là thấp hơn so với nhóm chứng bệnh lý và khá tương đồng với nhóm được sử dụng sulfasalazine. Như vậy, có thể khẳng định rằng khả năng chống oxy hóa của cao lá dâu có thể 30
  39. ứng dụng trong điều trị bệnh viêm đại tràng. Kết quả về khả năng chống oxy hóa và chống viêm của cao chiết lá dâu trong nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đồng với các nghiên cứu trước đó. Trong các nghiên cứu trước đây, kết quả thu được đều cho thấy dịch chiết lá dâu tằm có khả năng chống oxy hóa rất tốt [29, 52, 53]. Năm 2009, Abdulla và cộng sự báo cáo rằng dịch chiết trong ethanol của lá dâu tằm có hoạt tính chống loét đáng kể ở chuột [10]. Zora Vochyánová và cộng sự đã chỉ ra morusin phân lập từ cây dâu tằm có hiệu quả điều trị tương tự sulfasalazine (50 mg/kg) và có tiềm năng lớn trong việc điều trị các bệnh viêm mãn tính như viêm đại tràng [48]. 31
  40. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT. 1. Kết luận: Từ các mục tiêu đã nêu ra trong nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và kết quả thực hiện đưa đến được kết luận sau: - Phân tích sơ bộ định tính các thành phần có trong cao chiết lá dâu. - Sau 7 ngày điều trị bằng cao chiết lá dâu với 2 mức liều 100 mg/kg thể trọng và 200 mg/kg thể trọng, chuột bị viêm đại tràng do cysteamin gây ra được cải thiện tình hình viêm. Điều này chứng tỏ rằng, khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá dâu có tiềm năng hỗ trợ điều trị bệnh viêm đại tràng. 2. Đề xuất: Từ những kết quả thu được từ nghiên cứu về cao chiết lá dâu, chúng tôi có một số đề xuất như sau: - Tiếp tục các nghiên cứu phân lập các hoạt chất chính từ cao chiết lá dâu có tác dụng trong việc điều trị viêm đại tràng. - Tiến hành các nghiên cứu về cơ chế tác dụng điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu. 32
  41. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 720-723. 2. Lê Thị Mai (2016), Nghiên cứu tình trạng stress oxi hóa ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, Đại học Khoa học tự nhiên 3. Lục Thị Thanh Hằng và các cộng sự. (2019), "Nghiên cứu tác dụng làm lành viêm loét đại tràng và cải thiện hội chứng ruột kích thích của sản phẩm SColona", Tạp chí Y Dược cổ truyền Việt Nam. 2(21). 4. Mai Thị Ngọc Anh (2018), Xác định hàm lượng Phthalates trong dầu ăn bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối hai lần khối phổ GC - MS/MS, Đại học khoa học tự nhiên 5. Phạm Xuân Sinh (2006), Dược học cổ truyền, NXB Y học. 6. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật và thông dụng tập 2, NXB Khoa học và Kỹ Thuật. Tiếng Anh 7. Aditya RSJ và các cộng sự. (2012), "Anthelmintic and antimicrobial activities in some species of mulberry", Int J Pharm Pharm Sci, 4(5), tr. 335-338. 8. American Gastroenterological Association (2020), Ulcerative colitis. 9. Ananthakrishnan Ashwin N. (2015), "Epidemiology and risk factors for IBD", Nature reviews Gastroenterology & Hepatology. 12(4), tr. 205-217. 10. Awaad Amani S, El-Meligy Reham M và Soliman Gamal A (2013), "Natural products in treatment of ulcerative colitis and peptic ulcer", Journal of Saudi chemical society, 17(1), tr. 101-124. 33
  42. 11. Barrett Jeffrey C và các cộng sự. (2009), "Genome-wide association study of ulcerative colitis identifies three new susceptibility loci, including the HNF4A region", Nature genetics. 41(12), tr. 1330. 12. Besouw Martine và các cộng sự. (2013), "Cysteamine: an old drug with new potential", Drug Discovery Today. 18(15), tr. 785-792. 13. Bhattacharyya Asima và các cộng sự. (2014), "Oxidative stress: an essential factor in the pathogenesis of gastrointestinal mucosal diseases", Physiological reviews, 94(2), tr. 329-354. 14. Breuer Richard I và các cộng sự. (1991), "Rectal irrigation with short-chain fatty acids for distal ulcerative colitis", Digestive diseases and sciences, 36(2), tr. 185-187. 15. Chan E. W., Lye P. Y. và Wong S. K. (2016), "Phytochemistry, pharmacology, and clinical trials of Morus alba", Chin J Nat Med. 14(1), tr. 17-30. 16. Cosnes. Jacques và các cộng sự. (2011), "Epidemiology and Natural History of Inflammatory Bowel Diseases", Gastroenterology. 140(6), tr. 1785-1794. 17. Crohn’s & Colitis UK (2019), Ulcerative Colitis 18. Dat Nguyen Tien và các cộng sự. (2010), "Cytotoxic prenylated flavonoids from Morus alba", Fitoterapia. 81(8), tr. 1224-1227. 19. Doi Kayo và các cộng sự. (2001), "Studies on the constituents of the leaves of Morus alba L", Chemical pharmaceutical bulletin, 49(2), tr. 151-153. 20. Duvallet C. và các cộng sự. (2017), "Meta-analysis of gut microbiome studies identifies disease-specific and shared responses", Nat Commun. 8(1), tr. 1784. 21. Eaden JA, Abrams KR và Mayberry JF (2001), "The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis", Gut. 48(4), tr. 526-535. 22. Fathy Shadia A và các cộng sự. (2013), "The antiproliferative effect of mulberry (Morus alba L.) plant on hepatocarcinoma cell line HepG2", Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 14(4), tr. 375-382. 34
  43. 23. Gérard-Monnier Dominique và các cộng sự. (1998), "Reactions of 1- methyl-2-phenylindole with malondialdehyde and 4-hydroxyalkenals. Analytical applications to a colorimetric assay of lipid peroxidation", Chemical research in toxicology, 11(10), tr. 1176-1183. 24. Hallert C. và các cộng sự. (2003), "Increasing fecal butyrate in ulcerative colitis patients by diet: controlled pilot study", Inflamm Bowel Dis. 9(2), tr. 116-21. 25. Heikkilä Katriina và các cộng sự. (2014), "Job strain and the risk of inflammatory bowel diseases: individual-participant meta-analysis of 95 000 men and women", PLoS One. 9(2), tr. e88711. 26. Jostins Luke và các cộng sự. (2012), "Host–microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease", Nature. 491(7422), tr. 119-124. 27. Jr Edward V Loftus (2004), "Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease: incidence, prevalence, and environmental influences", Gastroenterology. 126(6), tr. 1504-1517. 28. Jurjus Abdo R., Khoury Naim N. và Reimund Jean-Marie (2004), "Animal models of inflammatory bowel disease", Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50(2), tr. 81-92. 29. Katsube Takuya và các cộng sự. (2006), "Antioxidant flavonol glycosides in mulberry (Morus alba L.) leaves isolated based on LDL antioxidant activity", Food chemistry, 97(1), tr. 25-31. 30. Kim Sun Yeou và các cộng sự. (2000), "Two flavonoids from the leaves of Mours alba induce differentiation of the human promyelocytic leukemia (HL-60) cell line". 23(4), tr. 451-455. 31. Lee Sang Hee và các cộng sự. (2002), "Mulberroside F isolated from the leaves of Morus alba inhibits melanin biosynthesis", Biological Pharmaceutical Bulletin, 25(8), tr. 1045-1048. 35
  44. 32. Linares Victoria, Alonso Virginia và Domingo José L (2011), "Oxidative stress as a mechanism underlying sulfasalazine-induced toxicity", Expert opinion on drug safety. 10(2), tr. 253-263. 33. Liu Jimmy Z và các cộng sự. (2015), "Association analyses identify 38 susceptibility loci for inflammatory bowel disease and highlight shared genetic risk across populations", Nature genetics. 47(9), tr. 979-986. 34. Miller Stanley L và Schlesinger Gordon (1993), "Prebiotic syntheses of vitamin coenzymes: I. Cysteamine and 2-mercaptoethanesulfonic acid (coenzyme M)", Journal of molecular evolution, 36(4), tr. 302-307. 35. Mohammadi Jamshid và Naik Prakash R (2008), "Evaluation of hypoglycemic effect of Morus alba in an animal model", Indian journal of pharmacology, 40(1), tr. 15. 36. Moller Frederik Trier và các cộng sự. (2015), "Familial risk of inflammatory bowel disease: a population-based cohort study 1977–2011", The American Journal of Gastroenterology. 110(4), tr. 564-571. 37. Moura Fabiana Andréa và các cộng sự. (2015), "Antioxidant therapy for treatment of inflammatory bowel disease: Does it work?", Redox Biology. 6, tr. 617-639. 38. Park Ji Min và các cộng sự. (2009), "Postprandial hypoglycemic effect of mulberry leaf in Goto-Kakizaki rats and counterpart control Wistar rats", Nutrition Research Practice, 3(4), tr. 272. 39. Ponferrada Ángel và các cộng sự. (2007), "The Role of PPARγ on Restoration of Colonic Homeostasis After Experimental Stress-Induced Inflammation and Dysfunction", Gastroenterology. 132(5), tr. 1791-1803. 40. Porter Ross J., Kalla Rahul và Ho Gwo-Tzer (2020), "Ulcerative colitis: Recent advances in the understanding of disease pathogenesis", F1000Research. 9, tr. F1000 Faculty Rev-294. 36
  45. 41. Pouyet Laurent và các cộng sự. (2009), "Epithelial vanin-1 controls inflammation-driven carcinogenesis in the colitis-associated colon cancer model", Inflammatory Bowel Diseases. 16(1), tr. 96-104. 42. Sarikaphuti Ariya và các cộng sự. (2013), "Preventive effects of Morus alba L. anthocyanins on diabetes in Zucker diabetic fatty rats", Experimental Therapeutic Medicine, 6(3), tr. 689-695. 43. Sies Helmut (2015), "Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine", Redox Biology. 4, tr. 180-183. 44. Sikiric Predrag và các cộng sự. (2001), "Cysteamine-colon and cysteamine- duodenum lesions in rats. Attenuation by gastric pentadecapeptide BPC 157, cimetidine, ranitidine, atropine, omeprazole, sulphasalazine and methylprednisolone", Journal of Physiology-Paris. 95(1), tr. 261-270. 45. Singab Abdel Nasser B và các cộng sự. (2005), "Hypoglycemic effect of Egyptian Morus alba root bark extract: effect on diabetes and lipid peroxidation of streptozotocin-induced diabetic rats", Journal of ethnopharmacology, 100(3), tr. 333-338. 46. Ungaro Ryan và các cộng sự. (2017), "Ulcerative Colitis", Lancet. 389(10080), tr. 1756-1770. 47. Vernia P. và các cộng sự. (1995), "Short-chain fatty acid topical treatment in distal ulcerative colitis", Aliment Pharmacol Ther. 9(3), tr. 309-13. 48. Vochyánová Z. và các cộng sự. (2017), "Prenylated flavonoid morusin protects against TNBS-induced colitis in rats", PLoS One. 12(8), tr. e0182464. 49. Yang Yan và các cộng sự. (2010), "Four new 2-arylbenzofuran derivatives from leaves of Morus alba L", Chemical Pharmaceutical Bulletin, 58(2), tr. 257-260. 50. Yang Yan và các cộng sự. (2010), "Two new chalcones from leaves of Morus alba L", Fitoterapia, 81(6), tr. 614-616. 37
  46. 51. Yang Zhenzhong và các cộng sự. (2012), "Bioassay-guided screening and isolation of α-glucosidase and tyrosinase inhibitors from leaves of Morus alba", Food chemistry, 131(2), tr. 617-625. 52. Yen Gow-Chin, Wu She-Ching và Duh Pin-Der (1996), "Extraction and identification of antioxidant components from the leaves of mulberry (Morus alba L.)", Journal of Agricultural Food Chemistry, 44(7), tr. 1687- 1690. 53. Yuan Qingxia và các cộng sự. (2015), "Extraction optimization, characterization and antioxidant activity in vitro of polysaccharides from mulberry (Morus alba L.) leaves", Carbohydrate Polymers. 128, tr. 52-62. 38