›

Khóa luận Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời auramine O và rhodamine B trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến

pdf 78 trang thiennha21 15/04/2022 4700
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời auramine O và rhodamine B trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_quy_trinh_xac_dinh_dong_thoi_auramine_o.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời auramine O và rhodamine B trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU GIA VỊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN Sinh viên thực hiện: Phan Thị Ngọc Trinh MSSV: 40201104 Giáo viên hướng dẫn: Ths. Huỳnh Thị Nhàn Ths. Nguyễn Thị Tuyết Nhung TP Hồ Chí Minh - Tháng 5/2018
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU GIA VỊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN Sinh viên thực hiện: Phan Thị Ngọc Trinh MSSV: 40201104 Giáo viên hướng dẫn: Ths. Huỳnh Thị Nhàn Ths. Nguyễn Thị Tuyết Nhung TP Hồ Chí Minh - Tháng 5/2018
  3. LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cô Huỳnh Thị Nhàn vì đã giao cho em đề tài nghiên cứu này. Cảm ơn cô vì đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ em trong suốt thời gian nghiên cứu. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Ngọc Hưng, thầy Nguyễn Thành Lộc, thầy Trần Bữu Đăng, cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết, cô Phạm Thị Thảo Uyên và cô Văn Thị Cẩm Duyên đã giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận. Và em cũng không quên gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lê Thị Hồng Vân, thầy Huỳnh Lời, thầy Lê Văn Huấn và Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn (Sapharcen) – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em được sử dụng trang thiết bị, máy móc cần thiết phục vụ đề tài này và cũng hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em. Cảm ơn gia đình, tất cả bạn bè đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và là chỗ dựa tinh thần, nguồn động viên cho em trong những lúc khó khăn. Đặc biệt, cảm ơn bạn Nguyễn Thanh Thơi đã đồng hành cùng em trong quá trình thực hiện đề tài. Một lần nữa em xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa học – trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy em trong bốn năm qua. Cuối cùng xin cảm ơn tất cả mọi người. Kính chúc thầy cô, tất cả bạn bè và gia đình thật nhiều sức khỏe. TP. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2018 Sinh viên Phan Thị Ngọc Trinh
  4. XÁC NHẬN CỦA CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chủ tịch Hội đồng
  5. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Auramine O 3 1.1.1. Khái quát chung 3 1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học 3 1.1.3. Độc tính 4 1.2. Rhodamine B 4 1.2.1. Khái quát chung 4 1.2.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học 4 1.2.3. Độc tính 5 1.3. Tình hình nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước 5 1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 8 1.4.1. Định nghĩa 8 1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký 8 1.4.3. Phân loại sắc ký hấp phụ 9 1.4.4. Một số đại lượng đặc trưng của hệ sắc ký 10 1.4.5. Hệ thống HPLC 15 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 18 2.1. Hóa chất và dụng cụ 18 2.1.1. Hóa chất 18 2.1.2. Dụng cụ - thiết bị 19 2.2. Nội dung nghiên cứu 20 2.3. Các bước tiến hành sắc ký 20 2.3.1. Chuẩn bị dung môi 20
  6. 2.3.2. Chuẩn bị mẫu đo 20 2.3.3. Cách vận hành thiết bị 21 2.4. Khảo sát các điều kiện phân tích sắc ký 22 2.4.1. Khoảng bước sóng của detector 22 2.4.2. Tối ưu hóa pha động 22 2.5. Thẩm định phương pháp 26 2.5.1. Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 26 2.5.2. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 27 2.5.3. Xác định độ lặp lại của phép đo 28 2.6. Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu 29 2.6.1. Lấy mẫu 29 2.6.2. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích 30 2.7. Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị 30 2.7.1. Khảo sát giai đoạn chiết pha rắn (SPE) 30 2.7.2. Khảo sát thể tích dung dịch chiết 32 2.7.3. Xác định hệ số thu hồi của quy trình 33 2.7.4. Tính chọn lọc của quy trình 33 2.8. Phân tích một số mẫu gia vị 33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký 34 3.1.1. Chọn khoảng bước sóng cho detector 34 3.1.2. Tối ưu hóa pha động 34 3.2. Thẩm định phương pháp 46 3.2.1. Xây dựng đường chuẩn 46 3.2.3. Xác định LOD, LOQ 48 3.2.4. Xác định độ lặp lại của phương pháp 50
  7. 3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị 50 3.3.1. Khảo sát giai đoạn SPE 50 3.3.2. Khảo sát thể tích dung dịch chiết 53 3.3.3. Tính chọn lọc của quy trình 54 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 56 4.1. Kết luận 56 4.2. Đề xuất 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 60
  8. DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Một số phương pháp xác định AO và RB 5 Bảng 2.1. Danh mục dung môi 18 Bảng 2.2. Danh mục hóa chất 18 Bảng 2.3. Danh mục thiết bị và máy móc phục vụ đề tài nghiên cứu 19 Bảng 2.4. Cách pha các dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn của AO và RB 27 Bảng 2.5. Thông tin về các mẫu gia vị phân tích 29 Bảng 3.1. Kết quả bước sóng hấp thụ cực đại, độ hấp thụ quang của AO và RB trong MeOH và ACN 34 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của CH3COOH đến sự phân tách AO, RB 37 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của HCOOH đến sự phân tách AO, RB 38 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của H3PO4 đến sự phân tách AO, RB 39 Bảng 3.5. Chương trình gradient pha động khảo sát tốc độ dòng 40 Bảng 3.6. Khảo sát tỷ lệ dung môi ban đầu 41 Bảng 3.7. Các chương trình sắc ký với đệm acetate (pH = 4,2) 42 Bảng 3.8. So sánh kết quả khảo sát giữa dung môi MeOH với dung môi ACN 43 Bảng 3.9. Chương trình pha động tối ưu 45 Bảng 3.10. Giá trị nồng độ và diện tích của peak AO, RB thu được khi tiến hành phân tích HPLC 46 Bảng 3.11. Kết quả xác định LOD 48 Bảng 3.12. Kết quả xác định LOQ 49 Bảng 3.13. Kết quả độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích peak 50 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát của giai đoạn SPE 51 Bảng 3.15. Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN khảo sát 52 Bảng 3.16. Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN và hệ số thu hồi của giai đoạn SPE 52 Bảng 3.17. Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ vị hương lần 1 53 Bảng 3.18. Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ vị hương lần 2 54 Bảng 4.1. Thành phần pha động 56 Bảng 4.2. Phương trình đường chuẩn của AO và RB 56
  9. DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1. Công thức cấu tạo của AO 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của RB 4 Hình 1.3. Sơ đồ sự tương tác trong cột sắc ký 9 Hình 1.4. Thời gian lưu trong HPLC [6] 10 Hình 1.5. Giản đồ về sự tách hai peak sắc ký A và B [6] 14 Hình 1.6. Các thiết bị trong hệ thống HPLC 15 Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn chương trình 5 (MeOH – CH3COOH pH = 3,6) 23 Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn chương trình 6 (ACN – CH3COOH pH = 3,6) 24 Hình 2.3. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH từ 3,0 đến 4,5 25 Hình 2.4. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH 2,3 và 2,6 25 Hình 2.5. Cách xác định S/N [4] 27 Hình 2.6. Sơ đồ các giai đoạn chiết pha rắn 30 Hình 2.7. Sơ đồ quy trình chiết mẫu gia vị 32 Hình 3.1. Sắc đồ của chương trình 5 35 Hình 3.2. Sắc đồ của chương trình 6 35 Hình 3.3. Sắc đồ của chương trình 7 36 Hình 3.4. Sắc đồ của chương trình 8 36 Hình 3.5. Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acetic acid (pH = 3,0) 37 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số không đối xứng T theo pH 38 Hình 3.7. Sắc đồ khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid formic (pH = 3,0) 38 Hình 3.8. Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid phosphoric 0,03% 39 Hình 3.9. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,6 mL/phút 40 Hình 3.10. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,7 mL/phút 40 Hình 3.11. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,85 mL/phút 40 Hình 3.12. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 1,0 mL/phút 41 Hình 3.13. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn AO 47 Hình 3.14. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn RB 47 Hình 3.15. Sắc đồ xác định LOD của AO và RB 48 Hình 3.16. Sắc đồ xác định LOQ của AO và RB 49 Hình 3.17. Độ tinh khiết của peak AO, RB xác định bằng phần mềm 55
  10. Hình 3.18. Sắc đồ chuẩn AO 0,03 ppm và RB 0,02 ppm trong nền mẫu ngũ vị hương 55 Hình 4.1. Sơ đồ giai đoạn SPE tối ưu 57
  11. KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Tiếng Việt (Tiếng Anh) ACN Acetonitrile AO Auramine O AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association Official Analytical Chemists) C Nồng độ (Concentration) CPT Chất phân tích EtOH Ethanol H Chiều cao peak sắc ký HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) IARC Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới (International Agency for Research on Cancer) LC Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography) LC50 Nồng độ hóa chất cho các thí nghiệm hít phải trong không khí có thể tiêu diệt 50% các động vật thử nghiệm trong một thời gian nhất định (Lethal Concentration, 50%) LD50 Lượng chất độc hoặc phóng xạ cần thiết để tiêu diệt 50% số lượng sinh vật thử nghiệm sau một khoảng thời gian nhất định (Lethal Dose, 50%) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) MeOH Methanol MP Pha động (Mobile Phase) MS Phổ khối lượng (Mass Spectrometry) PAD, DAD Detector mảng diot quang (Photo Array Diode Detector) PDA Mảng diot quang (Photo Diode Array) ppm Một phần triệu (Parts Per Milion) RB Rhodamine B
  12. RP Pha đảo (Reversed Phase) Speak Diện tích peak sắc ký SP Pha tĩnh (Stationary Phase) SPE Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction) STT Số thứ tự tR Thời gian lưu (Retention Time) v:v Tỷ lệ về thể tích UV/Vis Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet Visible)
  13. MỞ ĐẦU Nhằm đáp ứng nhu cầu đời sống ngày càng cao của con người thì công nghiệp thực phẩm ngày càng phát triển nhanh. Trong những năm gần đây, vệ sinh an toàn thực phẩm là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Việc sử dụng các chất phụ gia trong sản xuất và bảo quản gia vị đang ngày càng được coi trọng. Để tạo màu sắc đẹp và bắt mắt cho gia vị thì trong quá trình sản xuất, một số cơ sở sản xuất sử dụng thêm các phẩm màu công nghiệp cho vào gia vị. Điều này khiến người tiêu dùng đang bị đánh lừa bởi vẻ ngoài của các sản phẩm gia vị đang được bày bán trên thị trường. Trong số các phẩm màu công nghiệp này, phải kể đến Auramine O (AO) và Rhodamine B (RB), hai phẩm màu công nghiệp bị cấm sử dụng trong thực phẩm, gia vị và được xếp vào nhóm chất có khả năng gây ung thư. Hiện nay, AO và RB chỉ còn sản xuất ở các nước châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, ). Trong một vài năm trở lại đây, vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt Nam nổi cộm với vấn đề bột gia vị, thực phẩm nhiễm phẩm màu độc hại. Cụ thể, AO từng bị phát hiện trong một số loại thực phẩm như thịt gà, măng chua, dưa cải chua; RB cũng bị phát hiện trong hạt dưa, ớt bột, Mặc dù, AO và RB là hai chất cấm sử dụng trong thực phẩm, gia vị nhưng vẫn được thêm vào, điều này thật đáng lo ngại. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các phòng kiểm nghiệm đã được trang bị các kỹ thuật hiện đại để phân tích và xác định hàm lượng của các phẩm màu công nghiệp đã sử dụng trái phép trong sản xuất, nhằm kiểm soát chất lượng thực phẩm. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong số những phương pháp được sử dụng nhiều hiện nay. HPLC có nhiều ưu điểm như: phân tích nhanh chóng, xác định đồng thời được nhiều chất, ít tốn mẫu, thao tác đơn giản Tại Việt Nam, trong những năm gần đây, đã có những công trình nghiên cứu xác định RB trong thực phẩm, gia vị bằng phương pháp HPLC [1],[8]; xác định AO trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp HPLC [5]. Qua đó, chúng tôi thấy rằng chưa có những nghiên cứu về quy trình xác định đồng thời AO và RB trong bột gia vị. 1
  14. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến” với mong muốn đề xuất quy trình phân tích hiệu quả, phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng thí nghiệm với hai mục tiêu: - Xây dựng được quy trình xác định đồng thời AO và RB bằng phương pháp HPLC kết nối detector tử ngoại khả kiến. - Áp dụng quy trình này để xác định đồng thời AO và RB trong mẫu gia vị. 2
  15. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Auramine O 1.1.1. Khái quát chung Auramine O (dạng muối hydrochloride) thuộc nhóm thuốc nhuộm diphenylmethane [22]. AO được sử dụng làm chất nhuộm màu cho giấy và mực, ở mức độ thấp hơn đối với hàng dệt và da. AO đã được phát hiện trong các mẫu thực phẩm từ Ấn Độ, bao gồm cả đậu Hà Lan tươi và các sản phẩm đậu ở Trung Quốc. Việc sản xuất AO bị cấm ở Châu Âu và Hoa Kỳ, hiện nay chủ yếu sản xuất ở Ấn Độ và Trung Quốc [19]. Bên cạnh đó, AO không có trong danh sách phụ gia thực phẩm trong quy chuẩn Việt Nam. AO thường chứa dextrin hoặc các chất pha loãng khác được thêm vào để chuẩn hóa hàm lượng thuốc nhuộm. AO được sử dụng như là nguyên liệu tạo màu vàng, kết hợp với các thuốc nhuộm khác, nó tạo ra hoặc tăng cường màu xanh hoặc đỏ. Năng suất lượng tử của thuốc nhuộm huỳnh quang này phụ thuộc vào độ nhớt của dung môi; trong ethanol 95% hoặc saccarose 60% thì cao gấp 87 và 10 lần so với trong nước. Ngoài ra AO còn được dùng làm chất nhuộm màu huỳnh quang, khi kết hợp với thuốc nhuộm RB làm cho các vi sinh vật kháng acid phát huỳnh quang [23]. 1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học NH.HCl N N Hình 1.1. Công thức cấu tạo của AO - Công thức phân tử: C17H21N3 HCl. Khối lượng mol phân tử: 303,834 g/mol - Danh pháp: 4,4'-Carbonimidoylbis [N, N-dimethylbenzenamine] hydrochlorid - Tên gọi khác: Auramine O, Basic Yellow 2, Vàng ô - AO dạng tinh khiết là chất bột màu vàng. Tan trong nước và EtOH, tan rất ít trong xylene [22] (10 mg/mL trong nước; 20 mg/mL trong EtOH; 60 mg/mL trong ethylene glycol methyl ether [19]). AO nóng chảy ở trên 250 °C. Bước sóng hấp thụ cực đại là 370 nm, 432 nm. Bước sóng phát xạ cực đại là 550 nm. pKa: 9,8 ; 10,7 [22] 3
  16. 1.1.3. Độc tính Một nghiên cứu ở Anh đã báo cáo ca lâm sàng ung thư bàng quang ở công nhân làm việc trong ngành công nghiệp sản xuất AO [19]. Các nhà khoa học cũng đã tiến hành nhiều nghiên cứu thử nghiệm tác hại của AO trên động vật. Kết quả cho thấy, AO làm tổn thương ADN trên gan, thận, tuỷ xương của chuột nhắt và chuột cống với liều LD50 là 135 mg/kg, gây chết hoặc làm xuất hiện các khối u lympho trên chuột. Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới IARC đã xếp AO vào nhóm 2B là nhóm các chất hoặc hỗn hợp có thể gây ung thư cho người [19]. 1.2. Rhodamine B 1.2.1. Khái quát chung Rhodamine B thuộc nhóm thuốc nhuộm xanthene. RB được sử dụng làm thuốc nhuộm cho giấy, len, lụa và mỹ phẩm [24]. Ngoài ra RB còn được sử dụng trong sinh học như là chất nhuộm phát huỳnh quang, thường được kết hợp với AO trong phép nhuộm Auramine - Rhodamine để phát hiện trực khuẩn lao, Mycobacterium tuberculosis (MTB) [13]. 1.2.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học Hình 1.2. Công thức cấu tạo của RB - Công thức phân tử: C28H31ClN2O3. Khối lượng mol phân tử: 479,02 g/mol - Danh pháp: 9-(2-carboxyphenyl)-6-(diethylamino)-N,N-diethyl-3H-xanthen-3-iminium - Tên gọi khác: Rhodamine B; Brilliant Pink B; Basic Violet 10; Tetraethylrhodamine - RB là tinh thể màu tối có ánh xanh, ở dạng bột màu nâu đỏ. Tan tốt trong MeOH, EtOH, nước (khoảng 50 g/L). Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 199°C đến 201°C. Bước sóng hấp thụ cực đại:  = 542 – 554 nm [3]. pKa: 3,1; 3,25 [4] 4
  17. 1.2.3. Độc tính RB gây độc tính cấp theo đường miệng, số liệu thống kê cho biết LD50 ở chuột là lớn hơn 2000 mg/kg. Kích thích và gây tổn thương mắt nghiêm trọng khi thử nghiệm với thỏ. Khi RB kết hợp với hemoglobin trong máu hình thành methemoglobin sẽ gây các triệu chứng như: đau đầu, loạn nhịp tim, giảm huyết áp, khó thở và co thắt. Nếu tích tụ trong thời gian dài còn gây hại cho thủy sinh vật. Chẳng hạn, LC50 thử nghiệm với Gambusia affinis (cá muỗi) là 10 – 100 mg/L trong 96 giờ [2]. 1.3. Tình hình nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước Bảng 1.1. Một số phương pháp xác định AO và RB CPT, nền Đánh giá Xử lý mẫu Phương pháp mẫu phương pháp Trong nước AO trong - Dung môi chiết: HPLC – MS/MS - Khoảng tuyến thức ăn chăn MeOH - Cột Agilent C18 (1,8 µm x 2,1 tính: 0,5 – 50 nuôi [5] - Giai đoạn SPE: mm x 50 mm) và tiền cột tương ng/mL cột C18 ứng - LOD: 8 µg/kg Rửa tạp bằng - Pha động: gradient hai kênh, - LOQ: 20 µg/kg dung môi MeOH : ACN (A) và HCOOH 0,1% (B) - Hệ số thu hồi: H2O (20:80, v:v) 82,4 – 109,2% Rửa giải bằng dung môi MeOH AO trong - Dung môi chiết: LC – MS/MS - LOD: 3,0 µg/kg mẫu thịt và ACN - Cột sắc ký pha đảo C18 (1,8 µm (mẫu thịt); 5,0 các mẫu thực x 2,1 mm x 100 mm) µg/kg (mẫu thực phẩm khác - Pha động: gradient hai kênh, phẩm khác) [10] dung dịch ammonium acetate 0,005 M (A) và MeOH (B) 5
  18. RB trong bột - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis - LOD: 0,2 ppm gia vị [1] hỗn hợp ACN : - Cột sắc ký: Symmetry C18 (5 - LOQ: 0,6 ppm acetone (90:10, v:v) m x 4,6 mm x 150 mm) - Hệ số thu hồi: - Pha động: ACN : ammonium 84,8 – 87,2 % acetate (60:40, v:v) RB trong gia - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis hoặc HPLC – _ vị và hạt dưa MeOH DAD [12] - Cột phân tích HPLC C18 (5 µm x 4,6 mm x 250 mm) - Pha động: đẳng dòng, ACN: H2O (75:25, v:v) RB trong hạt - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis Theo phương dưa, bánh xu hỗn hợp MeOH : - Pha tĩnh: RP – C8 (5 m x 4,6 pháp phân tích xê, sirô dâu, H2O (40:60, v:v) mm x 150 mm) trực tiếp: nước ngọt - Pha động: đẳng dòng, 85% - LOD: 1,00 ppb hương dâu [8] ACN – 15% đệm (HCOOH – - LOQ: 3,33 ppb 0,007 mM sodium 1 – Theo phương heptansunfonate), pH = 3,0 pháp đường chuẩn: - LOD: 15,0 ppb - LOQ: 50,2 ppb Ngoài nước RB trong bột - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis - Khoảng tuyến ớt [18] hỗn hợp ACN : - Cột: Waters Novapark ODS (4 tính: 0,2 – 50 ppm acetone (90:10, v:v) μm x 3,9 mm x 150 mm) với cột - Hệ số thu hồi: 84 bảo vệ – 92% - Pha động: gradient hai kênh, 10 mM ammonium acetate, pH = 3,6 (A) và ACN (B) Auramine và - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis - Khoảng tuyến RB trong 10 mL 5% amonia - Côt: µ-Bondapak C18 (3,9 mm tính: 0,2 – 25 ppm bánh quy, kẹo trong 75% MeOH x 300 mm) với tiền cột 90 mm (Auramine); 0,2 – ngọt [15] - Giai đoạn SPE: 50 ppm (RB) cột Polyamide 6
  19. Rửa tạp: H2O - Pha động: ACN – sodium Rửa giải: 3% acetate (20 mM, pH = 4,0; 80:20, - LOD: acetic acid - v:v) 0,107 – 0,754 MeOH (1:1, v:v) mg/L - LOQ: 0,371 – 2,27 mg/L - Hệ số thu hồi: 75 – 96,5% AO và RB - Dung môi chiết: HPLC – MS/MS - LOD: 0,05 μg/kg trong bột ớt, hỗn hợp ACN : H2O - Cột XTerra C18 RP (5 µm x 2,1 - LOQ: 0,3 μg/kg tương ớt, xúc (90:10, v:v) mm x 150 mm) xích [16] - Pha động: gradient hai kênh, 5 mM ammonium acetate, pH = 3,0 (A), MeOH (B) AO và RB - Dung môi chiết: HPLC – MS/MS - LOD: 0,03 – trong các sản ACN - Cột: Waters XTerra C18 (5 µm 0,75 ppm phẩm từ đậu - Giai đoạn SPE: x 2,1 mm × 150 mm) - LOQ: 0,1 – 2,0 và thịt [17] Pha loãng dịch - Pha động: gradient hai, 5 mM ppm chiết bằng nước ammonium acetate, pH = 3,0 (A) - Hệ số thu hồi: đến còn không và MeOH (B) 71,2 – 116,9% quá 5% ACN Rửa giải: MeOH Cô dịch chiết bằng khí nitơ. Phần còn lại tái tạo với ACN AO, RB trong - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis - Hệ số thu hồi: gia vị và thực hỗn hợp ACN : - Cột Waters C18 (5 µm x 4,6 mm 73,1 – 103,3% phẩm [21] acetone (90:10, v:v) x 250 mm) (AO) - Pha động: gradient hai kênh, 10 mM ammonium acetate, pH = 3,0 (A) và ACN, pH = 3,0 (B) 7
  20. 1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp này ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích cũng là phương pháp được ứng dụng trong nhiều ngành kiểm nghiệm [7]. 1.4.1. Định nghĩa Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử CPT lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu CPT gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử CPT có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [4]. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia tách và phân tích các chất với pha động là chất lỏng, làm việc với áp suất từ 150 – 250 bar. Trong đó, pha tĩnh có thể là chất lỏng (nó được giữ trong cột tách như một lớp màng nhờ một chất mang trơ) hoặc là chất rắn. Cùng với pha tĩnh, trong kỹ thuật HPLC, pha động có thể chỉ là một dung môi nước hay dung môi hữu cơ; hỗn hợp của dung môi hữu cơ và nước hoặc cũng có thể là dung môi có thêm các chất đệm, chất dẫn điện, chất tạo phức, [6] Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc ký cột lỏng hiệu năng cao [6]. Trong kỹ thuật phân tích HPLC, tùy theo cơ chế của quá trình sắc ký trong cột tách mà người ta chia thành: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký rây phân tử [6]. Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường 1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố 8
  21. hay sắc ký chiết. Nếu pha tĩnh là rây phân tử thì ta có sắc ký rây phân tử. Để rửa giải CPT ra khỏi cột tách, cần một dung môi rửa giải, đó là pha động [6]. Với ba thành phần chính của hệ sắc ký: pha tĩnh, pha động, CPT; hiệu quả của sự tách sắc ký được quyết định bởi tổng của các mối tương tác: giữa CPT và pha tĩnh (F1), , . giữa CPT và pha động (F2) giữa pha tĩnh và pha động (F3) [6] Hình 1.3. Sơ đồ sự tương tác trong hệ sắc ký Tổng của ba lực tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước. Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được xác định bởi ba lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng. Ở đây, F1 là lực giữ CPT trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với CPT ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Còn thành phần F3 trong một hệ sắc ký có thành phần pha động và các điều kiện khác là không đổi thì F3 của các chất hầu như không khác nhau. Vì vậy, trong một hệ sắc ký, nếu các CPT có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh thì có khả năng các CPT sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và sẽ có sự tách các CPT khỏi nhau khi đi qua cột [6]. 1.4.3. Phân loại sắc ký hấp phụ Trong sắc ký hấp phụ, quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các CPT và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo CPT ra khỏi cột. Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Có hai kiểu hấp phụ: - Sắc ký hấp phụ pha thường (Normal Phase): pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực; - Sắc ký hấp phụ pha đảo (Reversed Phase): pha tĩnh ít hay không phân cực, pha động phân cực. 9
  22. Sắc ký hấp phụ được áp dụng rộng rãi, thành công để tách hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình. Hiện nay, chúng ta sử dụng loại sắc ký hấp phụ pha đảo là chủ yếu. 1.4.4. Một số đại lượng đặc trưng của hệ sắc ký ' 1.4.4.1. Thời gian lưu tR, thời gian lưu thực t R Các CPT trong hỗn hợp mẫu, khi được nạp vào cột sắc ký sẽ bị lưu giữ ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định. Thời gian lưu là thời gian tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào cột cho tới khi peak đạt giá trị cực đại. Như vậy nếu gọi tRi là thời gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có: ' tRi = to + tRi (1.1) Trong đó: to là thời gian không lưu giữ (thời gian CPT nằm trong pha động) ' t Ri là thời gian lưu giữ thực của chất i ở trong cột sắc ký (thời gian lưu hiệu chỉnh). Nếu to = 0 thì ta sẽ có tRi = : trường hợp này chỉ có khi tRi là rất nhỏ (thường là khi tRi nhỏ hơn 4 phút) [6]. Hình 1.4. Thời gian lưu trong HPLC [6] Giá trị của một CPT trong quá trình sắc ký phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ví dụ như: - Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp; - Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động; - Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế; 10
  23. - Trong một số trường hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha động, nồng độ chất tạo phức nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc ký. Trong sắc ký, các chất ion thì yếu tố này thể hiện rõ nét. ' Giá trị thời gian lưu t Ri có ý nghĩa rất lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc ký. Vì nó cho biết các CPT trong hỗn hợp mẫu được rửa giải ra như thế nào trong các điều kiện thí nghiệm và một hệ pha đã chọn. Đồng thời, đó cũng là đại lượng để chúng ta phát hiện định tính một chất. ' Trong một phép phân tích, nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, ngược lại nếu quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại thấp, thời gian phân tích dài. Điều này kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố đã trình bày ở trên. Mặt khác, trong một hệ sắc ký còn có: L (1.2) t=Ri ui L t=o (1.3) uo ' tRi = to ( 1 + ki ) (1.4) Trong đó ui và uo là tốc độ tuyến tính của CPT i và của pha động (cm/s); là hệ số dung lượng của CPT i; L là chiều dài của cột sắc ký [6]. ' 1.4.4.2. Hệ số phân bố Ki và hệ số dung lượng k i Quá trình tách sắc ký của các chất dựa trên cơ sở sự phân bố của CPT giữa pha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong hệ sắc ký. Sự phân bố này được đặc trưng bởi một đại lượng gọi là hệ số phân bố Ki của chất i. Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nồng độ của CPT i ở trong pha tĩnh và pha động: Ci(SP) K=i (1.5) Ci(MP) Trong đó, Ci(SP) và Ci(MP) là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và pha động. Hệ số Ki cho biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh). 11
  24. Hệ số phân bố Ki chưa nói lên được sức chứa của cột tách vì thế, người ta phải đưa ' thêm vào hệ số dung lượng ki . Hệ số dung lượng cho ta biết tỷ số khối lượng của CPT i phân bố vào trong mỗi pha là bao nhiêu, ta có: ' mi(SP) k=i (1.6) mi(MP) Trong đó, mi(SP) và mi(MP) là khối lượng CPT i trong pha tĩnh và trong pha động. Mối quan hệ giữa hệ số dung lượng và hệ số phân bố Ki thể hiện qua phương trình sau: ' Vi(SP) k =ii K (1.7) Vi(MP) Với Vi(SP) và Vi(MP) là thể tích của CPT i trong pha tĩnh và trong pha động. 1.4.4.3. Hệ số tách Hệ số tách α (hay còn gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B) là đại lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố và là tỷ số của hệ số phân bố của hai chất [6]. ' t' KkAAR(A) α '' (1.8) KktBBR(B) Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α ≠ 1. 1.4.4.4. Số đĩa lý thuyết Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc ký, người ta dùng khái niệm số đĩa lý thuyết N. Đây là một đại lượng hình thức, có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc ký như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) đĩa lý thuyết là H. Tất nhiên đây là lớp có tính chất động, và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như: - Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay mảnh; - Độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh; - Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (CPT); - Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc ký; - Độ nhớt của pha động. Vì thế với một hệ nhất định và trong những điều kiện sắc ký đã chọn, thì chiều cao đĩa lý thuyết H có những giá trị xác định ứng với các CPT khác nhau. Chiều cao đĩa lý thuyết H và số đĩa lý thuyết N được xác định theo công thức: 12
  25. 2 L W H= i (1.9) 16 t Ri 2 L t N==16 Ri (1.10) HW i Trong đó, Wi là chiều rộng đáy peak sắc ký của CPT i. Trong thực tế, số đĩa lý thuyết hiệu dụng Nef và chiều cao đĩa lý thuyết hiệu dụng Hef của một cột sắc ký mới là đại lượng giúp ta đánh giá đúng khả năng của một cột tách và hiệu quả của nó là như thế nào, tốt hay không tốt trong mỗi trường hợp cụ thể. 2 L W H= i ef (1.11) 16t- tRio 2 t-tRio N=16ef (1.12) Wi Nếu giá trị Nef quá nhỏ thì không có sự tách tốt của các chất, hoặc sự tách không hoàn toàn. Nếu Nef quá lớn thì cũng không cần thiết, vì khi đó peak sắc ký của các chất tách xa nhau quá và việc rửa giải là tốn nhiều pha động. Trong thực tế, Nef nằm trong khoảng 5000 đến 8000 là vừa đủ [6]. 1.4.4.5. Độ phân giải R Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép sắc ký. Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao. Độ phân giải của hai peak cạnh nhau được tính theo công thức sau: 2(t-t)'' R= RBRA (1.13) W+BA W Trong đó, WA và WB là bề rộng đáy của peak sắc ký của hai chất A và B. Nếu R càng lớn, hai chất A và B càng tách ra xa nhau, khi này giữa hai peak sẽ có một đoạn đường nền nằm ngang theo trục hoành của biểu đồ sắc ký. Song nếu đoạn đường nền này dài quá thì cũng không cần thiết, vì như thế ta tốn nhiều dung môi (pha động) để rửa giải các chất hơn. Do đó, giá trị R chỉ vừa đủ để hai chất tách khỏi nhau là được. 13
  26. a) b ) c) Hình 1.4. Giản đồ về sự tách hai peak sắc ký A và B [6] a) Tối thiểu để có sự tách. b) Đủ để hai chất tách khỏi nhau. c) Hai chất tách xa hẳn nhau. Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách nhau là R = 1,0. Trong phép định lượng R = 1,5 là phù hợp. 1.4.4.6. Hệ số không đối xứng Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của peak trên sắc ký đồ thu được. T được tính theo công thức sau đây: b T= (1.13) a Trong đó, a và b là bề rộng ở bên phải và bên trái peak sắc ký ở chiều cao 10% so với chiều cao cực đại của peak sắc ký. Nếu tỷ số này nằm trong vùng từ khoảng 0,90 đến 1,10 thì cột đã nạp dùng được [6]. 14
  27. 1.4.5. Hệ thống HPLC (5) (6) Hình 1.5. Các thiết bị trong hệ thống HPLC Trong đó: 1 – Bình chứa dung môi pha động 2 – Bộ phận khử khí 3 – Bơm cao áp 4 – Bộ phận tiêm mẫu 5 – Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt 6 – Đầu dò (nhận tín hiệu) 7 – Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống 8 – Thiết bị in dữ liệu 1.4.5.1. Bình đựng dung môi Hiện nay, máy HPLC thường có bốn kênh dung môi nối vào đầu bơm cao áp, cho phép chúng ta sử dụng bốn bình chứa dung môi cùng lúc để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của bốn đường là 100%. Tuy nhiên theo kinh nghiệm, chúng ta ít khi sử dụng bốn đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa cùng một lúc là hai hoặc ba đường. Khi đó, hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất để quá trình rửa giải được ổn định. 15
  28. 1.4.5.2. Bộ phận khử khí Mục đích sử dụng bộ khử khí là loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà pha động còn sót các bọt khí thì kết quả phân tích sẽ bị ảnh hưởng, cụ thể như sau: - Tỷ lệ pha động của các đường dung môi đưa vào hệ không đúng với lý thuyết sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi; - Trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể bơm sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động. 1.4.5.3. Bơm cao áp Đây là bộ phận có nhiệm vụ bơm pha động vào cột tách thực hiện quá trình sắc ký theo một chương trình phù hợp. Bơm phải tạo được áp suất khoảng 150 – 250 bar và bơm phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 mL/phút. Hiện nay đã có nhiều loại bơm có áp suất rất cao lên đến 1200 bar. Hiện tại bơm có hai pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục. 1.4.5.4. Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với thể tích của vòng mẫu là 5 – 100 μL . Có hai cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng syringe) và tiêm mẫu tự động (auto sampler). 1.4.5.5. Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Các kết quả thực nghiệm về HPLC đều chỉ ra rằng, các hạt pha tĩnh có đường kính nhỏ và đồng đều luôn cho hiệu quả tách sắc ký cao và ổn định. Chính vì thế mà hiện nay, hầu hết người ta chỉ dùng hạt pha tĩnh có đường kính nhỏ hơn 10 µm, phổ biến là đường kính hạt từ 5 – 7 µm cho mục đích phân tích và từ 15 – 25 µm cho mục đích sản xuất (sắc ký điều chế) [6]. Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong thiết bị điều nhiệt. 1.4.5.6. Đầu dò Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của CPT. 16
  29. A = k.C (1.14) Trong đó: A là cường độ tín hiệu đo được C là nồng độ CPT k là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn Hiện nay, người ta chế tạo các loại detector khác nhau cho kỹ thuật HPLC, cụ thể đã có các loại: - Detector phổ hấp thụ phân tử (UV, UV/Vis hay PDA); - Detector phổ huỳnh quang; - Detector phổ phát xạ nguyên tử; - Detector phổ hấp thụ nguyên tử; - Detector khối phổ; - Detector điện hóa đo dòng và cực phổ; - Detector đo chiết suất; - Detector đo độ dẫn điện; - Detector đo hiệu ứng nhiệt [6] 1.4.5.7. Bộ phận ghi tín hiệu Bộ phận này được dùng để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao, Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, độ phân giải, đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD% . 1.4.5.8. Thiết bị in dữ liệu Sau khi đã phân tích xong các mẫu, người phân tích có thể in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ. 17
  30. CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và dụng cụ 2.1.1. Hóa chất 2.1.1.1. Chất chuẩn - Auramine O: dạng rắn, độ tinh khiết 85% , Sigma-Aldrich USA. - Rhodamine B: dạng rắn, độ tinh khiết 95% , Sigma-Aldrich India. Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm được chuẩn bị từ việc cân chính xác lượng chất chuẩn và hòa tan trong MeOH tinh khiết, được bảo quản trong tủ lạnh. Các dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng bằng MeOH từ dung dịch chuẩn gốc. 2.1.1.2. Dung môi – hóa chất Bảng 2.1. Danh mục dung môi Tên dung Hàm lượng STT Nhà sản xuất Tiêu chuẩn môi nguyên trạng (%) Merk KGaA - Đức Dùng cho 9 9 ,8 % 1 Methanol Lapscan HPLC 99,9% Dùng cho 2 Acetonitrile Merk KGaA - Đức 99,8% HPLC Bảng 2.2. Danh mục hóa chất Hàm lượng STT Tên hóa chất Nhà sản xuất Tiêu chuẩn nguyên trạng (%) 1 Acid acetic Merck KGaA - Đức Dùng cho 100% (băng) HPLC 2 Acid formic Scharlau, Scharlab Dùng cho 98-100% S.L – Spain HPLC 3 Acid Scharlau, Scharlab Dùng cho 85% phosphoric S.L – Spain HPLC 4 Acetone Merck KGaA - Đức Dùng cho - HPLC 5 Ammonia Guangdong Dùng cho 25-28% Guanghua Sci-Tech phân tích Co., Ltd 18
  31. 2.1.2. Dụng cụ - thiết bị 2.1.2.1. Thiết bị Bảng 2.3. Danh mục thiết bị và máy móc phục vụ đề tài nghiên cứu STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Separations 1 Hệ HPLC / PDA 2996 Waters Module 2695 ZORBAX Agilent – USA 2 Cột sắc ký Eclipse XDB- 5 μm x 4,6 mm x 250 mm C18 Eclipse XDB- Agilent – USA 3 Cột bảo vệ C18 4-Pack Oasis HLB Waters 4 Cột chiết pha rắn 600 mg C18 Agilent 5 Máy deion Water Pro PS LABCONCO S100H 6 Máy siêu âm Elma – Germany Elmasonic DNA miVac, Genevac Ltd. Ipswich 7 Máy ly tâm concentrator England Lambda 25 8 Máy đo quang UV/Vis Perkin Elmer Spectrometor 9 Tủ sấy - WTB binder 12 – Port 10 Bộ chiết pha rắn Vacuum Agilent Manifold 2.1.2.2. Một số dụng cụ khác - Bình định mức, pipet, cốc thủy tinh các loại - Micropipet: 10-100μL , 100-1000μL , 1000-5000μL - Vial (1,5 mL, 10 mL); ống ly tâm (50 mL); phễu chiết (250 mL). - Ống nhỏ giọt, bình tia, giấy parafin, giấy nhôm, màng bọc thực phẩm, đầu lọc 0,2 µm PTFE, rây tiêu chuẩn Ø = 200 mm đường kính lỗ 0,5 mm. 19
  32. 2.2. Nội dung nghiên cứu Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau: - Tối ưu hoá các thông số trong chương trình sắc ký để phân tách chất chuẩn AO và RB trên hệ thống HPLC; - Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị nhằm đem lại hiệu quả chiết tách, làm sạch và làm giàu mẫu tốt nhất; - Sử dụng quy trình phân tích AO và RB trong một số mẫu gia vị. 2.3. Các bước tiến hành sắc ký 2.3.1. Chuẩn bị dung môi Các dung môi là loại tinh khiết dành cho HPLC. Các hóa chất dùng cũng phải là loại tinh khiết phân tích. - Kiểm tra các chai đựng dung môi và các chai đựng dung môi để rửa: kênh A (MeOH), kênh B (H2O), kênh C (ACN), kênh D (dung dịch acid hay đệm, hoặc là hỗn hợp dung môi), chai rửa kim (MeOH) và chai rửa seal (MeOH 10 - 20%). - Lọc tất cả dung môi sử dụng màng lọc cellulose acetate hoặc cellulose nitrate 0,45 μm (tốt nhất là 0,2 μm ). Nếu là hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước (hoặc dung dịch đệm) thì lọc qua màng lọc polyamide hay nilon. Dung môi hữu cơ thì lọc qua màng lọc teflon, riêng ACN và MeOH nguyên chai không cần lọc. - Siêu âm tất cả các bình dung môi ở các kênh A, B, C, D để đuổi khí trong khoảng 10 - 15 phút cho mỗi bình, khi siêu âm phải mở nắp bình. Sau đó, đặt các bình đúng vị trí quy định và để các đầu lọc luôn cắm ngập trong dung môi. 2.3.2. Chuẩn bị mẫu đo Mẫu chuẩn: pha dung dịch chuẩn có thành phần CPT giống như mẫu thử trong cùng dung môi. Nồng độ các thành phần CPT trong dung dịch chuẩn tương đương như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần. Mẫu thử: xử lý mẫu thử theo đúng quy trình đã khảo sát và tối ưu hóa. Đảm bảo các yêu cầu sau: - Dung môi hòa tan CPT phải tương thích với pha động, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu; - Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết ; 20
  33. - Phải lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm; - Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Nồng độ CPT cao quá có thể gây ra nghẽn cột. 2.3.3. Cách vận hành thiết bị Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất và phần mềm điều khiển hệ thống sắc ký HPLC. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo trình tự sau: 1) Kiểm tra hệ thống: nguồn điện, hệ thống bơm, hệ thống đầu dò, kết nối LC – PDA, buồng chứa cột tách. 2) Chuẩn bị: dung môi, mẫu phân tích. 3) Khởi động thiết bị - Khởi động hệ thống bơm: bật chế độ đuổi khí, thực hiện chế độ đuổi khí, rửa kim, cân bằng cột. - Khởi động máy tính. - Khởi động đầu dò, để kéo dài thời gian sử dụng đầu dò, nên bật công tắc sử dụng đầu dò sau khi hoàn tất việc khử khí và cân bằng cột. 4) Khởi động chương trình - Tạo một “Method” để sử dụng. - Thiết lập thông số sắc ký: tỷ lệ dung môi pha động, bước sóng khảo sát, thành phần mẫu, các thông số khác của quá trình phân tích yêu cầu. 5) Tiến hành phân tích 6) Rửa hệ thống Đặc biệt cột sắc ký phải được rửa theo quy định sau mỗi lần chạy sắc ký. Ví dụ: - Sắc ký pha thường: rửa bằng MeOH; không rửa bằng nước. - Sắc ký pha đảo: khi chạy pha động thành phần chứa muối thì phải rửa nước trước cho sạch. 7) Xử lý kết quả 8) Tắt hệ thống 9) Ghi nhật ký sử dụng máy 21
  34. 2.4. Khảo sát các điều kiện phân tích sắc ký 2.4.1. Khoảng bước sóng của detector Phương pháp nghiên cứu được lựa chọn là sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector PDA, vì thế việc xác định khoảng bước sóng của detector là cần thiết. Trước khi tiến hành định tính và định lượng AO và RB trên máy HPLC thì phải xác định được bước sóng ứng với cực đại hấp thụ của AO và RB. Dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất trong dung dịch để xác định bước sóng ứng với cực đại hấp thụ. AO và RB là các hợp chất có màu, nên có thể tiến hành khảo sát phổ hấp thụ quang trong vùng khả kiến trên máy Lambda 25 UV/Vis Spectrometor ở phòng Phân tích Trung tâm 1. Dung dịch đo là chuẩn đơn AO, chuẩn đơn RB và chuẩn hỗn hợp (AO và RB) với: Nồng độ CPT 2,0 ppm đối với mỗi chất Dung môi 100% MeOH; 100% ACN Khoảng quét phổ 300 – 600 nm 2.4.2. Tối ưu hóa pha động Pha động là một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả tách trong kỹ thuật phân tích HPLC. Để tìm được điều kiện tối ưu cho pha động, chúng tôi tiến hành thay đổi từng yếu tố và khảo sát theo thứ tự sau: 1 – Khảo sát dung môi pha động 2 – Khảo sát chương trình hóa dung môi 3 – Khảo sát pH của pha động 4 – Khảo sát tốc độ dòng 5 – Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu 2.4.2.1. Khảo sát dung môi pha động Trong sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC), pha động là hệ dung môi phân cực, đó là những dung môi hữu cơ tan tốt trong nước và trong nhiều trường hợp nước cũng là một thành phần của pha động. Hệ pha động được sử dụng nhiều như MeOH, ACN hay hỗn hợp MeOH với nước, ACN với nước hoặc có thêm chất đệm pH, [3]. Vì vậy việc lựa chọn dung môi phù hợp sẽ là một trong những yếu tố mang lại hiệu quả cho quá trình tách sắc ký. Đối với mẫu đơn giản, pha động gồm hỗn hợp MeOH/nước có tỷ lệ thể tích thường chọn là 80/20 [4]. 22
  35. Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành so sánh hiệu quả tách sắc ký giữa dung môi MeOH và ACN. Và hệ pha động sử dụng là dung môi hữu cơ (MeOH hoặc ACN) kết hợp thêm nước để tạo hệ pha động phân cực hơn. Chúng tôi tiến hành so sánh hiệu quả tách của hệ MeOH/H2O và ACN/H2O trong hai trường hợp: thành phần pha động giữ cố định (đẳng dòng) và thành phần pha động thay đổi (gradient). Tiến hành tiêm mẫu là hỗn hợp dung dịch chuẩn gồm AO nồng độ 5,0 ppm và RB nồng độ 5,0 ppm vào hệ thống HPLC với điều kiện như sau: - Cột tách: ZORBAX Eclipse XDB – C18 (5 μm x 4,6 mm x 250 mm) - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút - Bước sóng cực đại ở 430 nm và 540 nm - Thể tích vòng mẫu: 20 μL - Nhiệt độ cột: 35±5oC - Nhiệt độ buồng mẫu: 20±5oC - Pha động: * Chế độ rửa giải đẳng dòng: - Thời gian phân tích: 40 phút . Chương trình 1: MeOH: HCOOH pH = 3,0 (40:60, v:v) . Chương trình 2: MeOH: HCOOH pH = 3,0 (50:50, v:v) . Chương trình 3: ACN: HCOOH pH = 3,0 (40:60, v:v) . Chương trình 4: ACN: HCOOH pH = 3,0 (50:50, v:v) * Chế độ rửa giải gradient: 100 80 60 40 %V (MEOH) %V 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Thời gian (phút) Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn chương trình 5 (MeOH – CH3COOH pH = 3,6) 23
  36. 100 80 60 40 %V (ACN) %V 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Thời gian (phút) Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn chương trình 6 (ACN – CH3COOH pH = 3,6) 2.4.2.2. Khảo sát chế độ rửa giải Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột tách. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của pha động thay đổi, tức làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích ra khỏi cột và do đó làm thay đổi hệ số dung lượng của chất phân tích. Sau khi lựa chọn được dung môi pha động ở mục 2.4.2.1, chúng tôi thực hiện các bước khảo sát như sau:  Khảo sát chương trình đẳng dòng Thực hiện phân tích sắc ký với một số chương trình đẳng dòng như sau: - Chương trình 7: MeOH và HCOOH (pH = 3,0) (80:20, v:v) - Chương trình 8: MeOH và đệm acetate (pH = 4,2) (80:20, v:v)  Khảo sát chương trình gradient Lựa chọn các đoạn gradient và đặt tỷ lệ thành phần dung môi ở đầu mỗi đoạn gradient, thời gian gradient. Chương trình sắc ký dùng để khảo sát cố định các yếu tố: cột tách, nhiệt độ cột tách, bước sóng, tốc độ dòng, thể tích vòng mẫu, nồng độ hai chất phân tích là 2,0 ppm. 2.4.2.3. Khảo sát pH của pha động Dựa vào giá trị pKa của AO và RB, để hạn chế tồn tại đồng thời nhiều dạng phân tử AO, RB và loại bỏ sự kéo đuôi của peak AO, RB trong quá trình tách sắc ký thì nên tiến hành khảo sát với điều kiện giá trị pH < 7. Theo khuyến cáo của hãng Agilent, cột tách C18 làm việc trong khoảng pH từ 2 đến 9 nên chúng tôi chọn các acid cho chương trình dung môi pha động như sau: 24
  37. - Acid acetic có pH bằng 3,0; 3,6; 4,0 và 4,5 - Acid formic có pH bằng 3,0 - Acid phosphoric có pH bằng 2,3 và 2,6 Tiến hành cố định các yếu tố: cột tách, nhiệt độ, bước sóng, thể tích vòng mẫu. Đối với các giá trị pH từ 3,0 đến 4,5 tiến hành với tốc độ dòng 1,0 mL/phút và chương trình gradient pha động như đồ thị dưới đây: 100 80 60 40 %V (MeOH) %V 20 0 0 5 10 15 20 25 Thời gian (phút) Hình 2.3. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH từ 3,0 đến 4,5 Đối với các giá trị pH 2,3 và 2,6 tiến hành với tốc độ dòng 0,7 mL/phút và chương trình gradient pha động như đồ thị dưới dây: 100 80 60 40 %V (MeOH) %V 20 0 0 5 10 15 20 Thời gian (phút) Hình 2.4. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH 2,3 và 2,6 Thực hiện phân tích sắc ký với chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng nồng độ 2,0 ppm, tính toán các giá trị hệ số dung lượng, hệ số không đối xứng, độ phân giải để chọn loại acid thích hợp cho pha động. 25
  38. 2.4.2.4. Khảo sát tốc độ dòng Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng đến quá trình thiết lập cân bằng của CPT giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng peak, thời gian rửa giải lâu hơn. Tuy nhiên, nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau. Vì vậy, chúng ta cần phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích. Chúng tôi cố định các yếu tố: pha tĩnh, thể tích vòng mẫu, nhiệt độ cột, nhiệt độ buồng mẫu và bước sóng khảo sát và tiến hành khảo sát hệ sắc ký với các tốc độ dòng khác nhau: 0,6; 0,7; 0,85; 1,0 mL/phút và các điều kiện đã được tối ưu ở các mục trên. 2.4.2.5. Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu Sau khi chọn được tốc độ dòng tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu với hai mức: 30% MeOH và 43,7% MeOH để thiết lập điều kiện sắc ký tối ưu cho quá trình phân tích HPLC. 2.5. Thẩm định phương pháp 2.5.1. Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn Khoảng nồng độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích. Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ của CPT nằm trong khoảng tuyến tính. Đối với mỗi chất, trong một giới hạn nhất định của nồng độ, độ lớn diện tích peak sắc ký phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của chất trong mẫu phân tích. Để định lượng chính xác một chất thì nồng độ của chất đó trong mẫu phải nằm trong khoảng tuyến tính này, do đó việc xác định khoảng tuyến tính của AO và RB là hết sức quan trọng. Theo tài liệu tham khảo [14], khoảng tuyến tính của AO và RB là 0,05 – 100 ppm. Khoảng tuyến tính của AO và RB là khoảng nồng độ tương đối rộng khi sử dụng phương pháp HPLC. Tuy nhiên, hàm lượng AO và RB trong mẫu là hàm lượng vết, vì thế việc xây dựng đường chuẩn với khoảng nồng độ nhỏ gần với nồng độ của AO và RB trong mẫu sẽ cho kết quả chính xác hơn, đồng thời tiết kiệm hóa chất, thời gian và công sức tiến hành. Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn của AO và RB với dãy các nồng độ dung dịch chuẩn sau: 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 ppm. 26
  39. Bảng 2.4. Cách pha các dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn của AO và RB Nồng độ chuẩn hỗn Thể tích dung dịch Thể tích dung Nồng độ chuẩn hợp lấy pha (ppm) chuẩn hỗn hợp lấy dịch cuối (mL) hỗn hợp cuối pha (µL) (ppm) 2 25 1 0,05 10 10 1 0,1 10 20 1 0,2 10 50 1 0,5 10 100 1 1 10 200 1 2 2.5.2. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện là giá trị nồng độ thấp nhất của CPT mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của đường nền. Giới hạn định lượng được xem là nồng độ thấp nhất của CPT mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có nghĩa định lượng so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2 – 3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10 [9]. Hình 2.5. Cách xác định S/N [4] 27
  40. 2.5.3. Xác định độ lặp lại của phép đo Một phương pháp phân tích tốt ngoài yêu cầu về độ đúng của phương pháp, người ta còn chú ý đến độ lặp lại của phương pháp. Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp AO và RB (có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính) vào hệ thống sắc ký với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 2.4. Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký Speak và thời gian lưu tR. Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành tiêm lặp bảy lần chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng nồng độ 2,0 ppm. 28
  41. 2.6. Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu 2.6.1. Lấy mẫu Chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu gia vị ở một số chợ trên khu vực TP. Hồ Chí Minh. Danh sách các mẫu gia vị được liệt kê trong Bảng 2.5. Bảng 2.5. Thông tin về các mẫu gia vị phân tích Địa điểm – thời gian lấy STT Tên mẫu Hình Đặc điểm mẫu Bột gia vị Chợ Nhật Tảo (quận 10) Bột khô, 1 nấu bò kho 7h15 ngày 20/12/2017 màu đỏ cam Bột khô, Chợ Thành Thái (quận 10) 2 Bột cà ri màu vàng 7h45 ngày 20/12/2017 cam Chợ Thị Nghè (quận 1) Bột khô, 3 Bột ớt 16h15 ngày 19/04/2018 màu đỏ Bột khô, Bột ngũ vị Chợ Thành Thái (quận 10) 4 màu vàng hương 7h45 ngày 25/04/2018 nâu 29
  42. 2.6.2. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích Đối với mỗi loại mẫu gia vị lấy ít nhất 100 g. Đối với mẫu gia vị dạng thô, nghiền cẩn thận mẫu bằng máy nghiền cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua rây có đường kính lỗ 0,5 mm. Sau đó trộn kỹ. Mẫu sau khi đồng nhất có thể phân tích ngay hoặc được bảo quản trong túi zipper, để nơi thoáng mát và ít ánh sáng [11],[12]. 2.7. Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị Nền mẫu gia vị có nhiều tạp chất vì vậy sẽ ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích. Cũng như đã nêu, AO và RB trong các mẫu gia vị là hàm lượng vết. Để tăng độ nhạy phép phân tích định lượng và loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu, chúng tôi đã kết hợp giai đoạn chiết pha rắn trong quy trình xử lý mẫu. 2.7.1. Khảo sát giai đoạn chiết pha rắn (SPE) 2.7.1.1. Khảo sát loại cột SPE Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành so sánh hiệu quả giữa cột chiết pha rắn C18 và cột Oasis HLB. Mẫu sử dụng trong giai đoạn khảo sát này được chuẩn bị như sau: dung dịch chuẩn hỗn hợp của AO và RB được pha trong nước cất hai lần. Tiến hành thao tác thí nghiệm lặp hai lần đối với cột C18 và cột Oasis HLB. Hoạt hóa cột: 3 mL MeOH, 3 mL H2O Nạp mẫu: 15 mL dung dịch mẫu đã chuẩn bị Rửa tạp: 4 mL hỗn hợp 5% MeOH trong H2O Rửa giải 1: 3 mL HCOOH 2% trong MeOH (95:5, v:v) HPLC Rửa giải 2: 1 mL HCOOH 2% HPLC trong MeOH (95:5, v:v) Rửa giải 3: 1 mL HCOOH 2% trong MeOH (95:5, v:v) HPLC Hình 2.6. Sơ đồ các giai đoạn chiết pha rắn 30
  43. Các bước nạp mẫu, rửa tạp đều thu lại để tiêm vào hệ thống HPLC để kiểm tra tín hiệu của CPT trên sắc đồ. Khi so sánh hệ số thu hồi giữa cột C18 và Oasis HLB, chúng tôi chọn được cột chiết tối ưu, đồng thời chọn được thể tích hỗn hợp dung dịch rửa giải phù hợp nhất. 2.7.1.2. Khảo sát tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết Chúng tôi chọn hỗn hợp ACN : NH3 (0,5%, v:v) (70:30, v:v) để khảo sát quy trình chiết mẫu gia vị. Vì tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết cao (70%) ảnh hưởng sự lưu giữ CPT trên cột SPE nên chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết trước khi cho qua cột SPE. Chuẩn bị các dịch chiết khảo sát như sau: 15 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp AO và RB có cùng nồng độ 0,4 ppm với tỷ lệ phần trăm ACN lần lượt là 5; 10; 20; 30; 50; 100%. Sau đó nạp 15 mL dung dịch đã chuẩn bị như trên qua cột SPE theo các bước đã tối ưu như mục 2.7.1.1. Sau đó thu dung dịch rửa giải, lọc qua màng 0,2 µm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC. Tiến hành so sánh hệ số thu hồi để lựa chọn tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết thích hợp. 31
  44. 2.7.2. Khảo sát thể tích dung dịch chiết Tiến hành khảo sát với quy trình chiết mẫu như sau: Cân 3 g mẫu gia vị đã được đồng nhất cho vào ống ly tâm 50 mL Thêm 30 mL hỗn hợp ACN : NH3 (0,5%, v:v) (70:30, v:v) Lắc đều 10 phút Siêu âm 30 phút Ly tâm 10 phút Thu lấy dịch chiết vào bình định mức Ly tâm 10 phút Lặp 1 lần Thu lấy dịch chiết vào bình định mức trên Hình 2.7. Sơ đồ quy trình chiết mẫu gia vị Để khảo sát thể tích dung dịch chiết tối ưu cho quy trình chiết, sau khi chiết lần thứ nhất với 30 mL hỗn hợp ACN : NH3 (0,5%, v:v) (70:30, v:v), tiến hành thêm tiếp 15 mL hỗn hợp ACN : NH3 (0,5%, v:v) (70:30, v:v) để chiết lần thứ hai. Dịch chiết sau mỗi lần ly tâm của lần chiết thứ hai được thu tập hợp vào một bình định mức riêng với lần chiết đầu. Dựa vào kết quả khảo sát mục 2.7.1.2, chúng tôi tiến hành pha loãng các dịch chiết bằng nước cất để được tỷ lệ phần trăm ACN phù hợp trong dịch chiết. Tiếp theo, lấy 20 mL dịch chiết trong mỗi bình định mức trên để tiến hành giai đoạn SPE. Thu lấy dung dịch rửa giải, lọc qua màng 0,2 µm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC. Quá trình thêm thể tích hỗn hợp chiết được lặp lại cho đến khi thu được dung dịch phân tích không còn cho tín hiệu của AO và RB trên sắc đồ. 32
  45. 2.7.3. Xác định hệ số thu hồi của quy trình Để đánh giá và kiểm tra độ đúng của quy trình, chúng tôi đã tiến hành xác định hệ số thu hồi của quy trình. Trong đề tài này, để xác định hệ số thu hồi của quy trình xác định đồng thời AO và RB trong mẫu gia vị, chúng tôi đã thực hiện phân tích mẫu gia vị và mẫu gia vị có thêm chuẩn. Thêm một lượng chuẩn AO và RB xác định vào mẫu thử, phân tích mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại 3 lần bằng quy trình đã khảo sát, tính hệ số thu hồi theo công thức sau đây: C-C R % =m+c m .100% C c Trong đó: R%: hệ số thu hồi Cm+c: nồng độ CPT trong mẫu có thêm chuẩn Cm: nồng độ CPT trong mẫu thử Cc: nồng độ chất chuẩn thêm theo lý thuyết Sau đó, tính hệ số thu hồi là trung bình của hệ số thu hồi các lần làm lặp. Hệ số thu hồi ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau. Trong đề tài này, lượng chuẩn thêm vào mẫu thử là 1,0 ppm và theo AOAC thì kỳ vọng hệ số thu hồi trong khoảng 80 – 110% [9]. 2.7.4. Tính chọn lọc của quy trình Tính chọn lọc liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một quy trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc. Trong sắc ký cần xác định peak sắc ký có phải là một peak đơn hay peak có lẫn các tạp chất khác. Đối với hệ thống sắc ký kết nối detector PDA có thể xác định tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh khiết của peak. Và chúng tôi có thể xác định độ tinh khiết của peak trực tiếp qua phần mềm điều khiển [9]. 2.8. Phân tích một số mẫu gia vị Tiến hành xử lý mẫu gia vị theo quy trình thực nghiệm đã khảo sát ở mục 2.2.5. Dung dịch rửa giải sau giai đoạn SPE được lọc qua màng 0,2 µm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC. Tiến hành tiêm lặp ba lần mỗi mẫu gia vị đã chuẩn bị vào hệ thống HPLC, ghi kết quả. Dựa vào phương trình hồi quy, tính nồng độ các CPT. 33
  46. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký Sau khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát, chúng tôi thu được kết quả như sau: 3.1.1. Chọn khoảng bước sóng cho detector Kết quả khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại, độ hấp thụ quang của AO và RB được trình bày trong Bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả bước sóng hấp thụ cực đại, độ hấp thụ quang của AO và RB trong MeOH và ACN Dung Nồng độ Bước sóng hấp thụ Độ hấp thụ Chất phân tích môi (ppm) cực đại ( m a x ,nm ) (A) AO 2,0 430,70 0,3355 MeOH RB 2,0 545,34 0,5007 AO 2,0 440,99 0,3255 ACN RB 2,0 555,33 0,4022 Nhận xét: - Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn AO và RB trong MeOH cao hơn trong ACN nên chúng tôi chọn MeOH làm dung môi pha chuẩn. - Dựa vào bước sóng hấp thụ cực đại của AO và RB, chúng tôi chọn khoảng bước sóng khảo sát của detector PDA là 400 – 600 nm. 3.1.2. Tối ưu hóa pha động 3.1.2.1. Khảo sát dung môi pha động Sắc đồ của chương trình 1, 2, 3 và 4 lần lượt được trình bày ở Phụ lục 7, 8, 9 và 10. Chương trình 2 với 50% MeOH thì thời gian lưu của AO ngắn hơn so với chương trình 1 với 40% MeOH. Nhưng cả hai chương trình 1 và 2 thì RB vẫn bị lưu giữ trên cột trong khoảng thời gian 40 phút. Điều này chứng tỏ độ phân cực của AO lớn hơn RB. Chương trình 3 với 50% ACN và chương trình 4 với 40% ACN thì cả AO và RB đều được rửa giải, cho thấy lực rửa giải với hai CPT của ACN cao hơn MeOH. Nhưng peak của AO bị tách đầu, peak RB bị không thon, nhọn. 34
  47. Vậy trong trường hợp rửa giải đẳng dòng chưa chọn được dung môi pha động là MeOH hay ACN. Tiếp tục so sánh hai chương trình rửa giải gradient như đã trình bày ở mục 2.4.2.1. AO RB Hình 3.1. Sắc đồ của chương trình 5 RB AO Hình 3.2. Sắc đồ của chương trình 6 Kết quả rửa giải gradient pha động cho thấy với ACN thì CPT được rửa giải ra sớm khoảng 6 phút dễ bị lẫn với peak tạp. Với dung môi ACN thì AO và RB chưa tách tốt, peak RB có hiện tượng bị kéo đuôi. Với MeOH thì peak được thon, gọn hơn tuy nhiên có hiện tượng sụt nền. Chiều cao peak với MeOH thì cao hơn với ACN. Qua một số so sánh hiệu quả rửa giải, chúng tôi chọn MeOH là một trong những thành phần của dung môi pha động. 35
  48. 3.1.2.2. Khảo sát chế độ rửa giải Sau khi tiến hành phân tích sắc ký với chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi MeOH và HCOOH (pH = 3,0) theo tỷ lệ 80:20 (v:v), chúng tôi thu được sắc đồ như Hình 3.3. AO RB Hình 3.3. Sắc đồ của chương trình 7 Sau khi tiến hành phân tích sắc ký với chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi MeOH và đệm acetate (pH = 4,2) theo tỷ lệ 80:20 (v:v), chúng tôi thu được sắc đồ như Hình 3.4. RB AO Hình 3.4. Sắc đồ của chương trình 8 Kết quả cho thấy, khi tiến hành chương trình dung môi pha động với chế độ rửa giải đẳng dòng thì các peak AO và RB đều không đủ tiêu chuẩn định lượng. Vì vậy, để định lượng AO và RB cần thực hiện chương trình dung môi pha động với chế độ rửa giải gradient. 36
  49. 3.1.2.3. Khảo sát pH của pha động Kết quả khảo sát pH được thể hiện trong các bảng bên dưới. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của CH3COOH đến sự phân tách AO, RB Acid acetic Thông số pH = 3,0 pH = 3,6 pH = 4,0 pH = 4,5 AO RB AO RB AO RB AO RB Thời gian lưu (tR) 6,83 7,78 7,17 7,93 6,58 8,52 6,75 8,02 Hệ số dung lượng (k’) 2,25 2,71 1,24 1,52 3,33 5,41 2,21 2,82 Hệ số không đối xứng (T) 1,37 1,07 6,57 5,06 4,30 1,78 2,33 1,92 Độ phân giải AO và RB 2,00 0,32 1,55 1,50 Khi sử dụng acid acetic điều chỉnh pH của pha động thì đường nền không ổn định. Vùng phía trước peak AO thường bị dâng nền, vùng phía sau peak AO và RB bị sụt nền. RB AO Hình 3.5. Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acetic acid (pH = 3,0) Với việc sử dụng chất chuẩn AO và RB có độ tinh khiết từ 85% và 95% trở lên, trong các sắc đồ chúng tôi nhận thấy trước các peak AO và RB có xuất hiện peak nhỏ phía trước, với pH = 3,0 thì peak nhỏ phía trước ở gần phút 7,4. Nghĩa là các thành phần không tinh khiết trong chất chuẩn cũng hấp thụ trong vùng tử ngoại khả kiến. Khi sử dụng acid acetic điều chỉnh pH của pha động thì chưa tách được các peak tạp này ra xa peak của CPT. 37
  50. Dựa vào số liệu ở Bảng 3.2, chúng tôi thiết lập mối quan hệ giữa hệ số đối xứng T của peak sắc ký với giá trị pH được điều chỉnh bằng acid acetic như Hình 3.6. 8 6 T 4 2 0 3 3.5 4 4.5 5 pH Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số không đối xứng T theo pH Đồ thị cho thấy để thu được peak sắc ký đối xứng cao thì nên giảm pH của pha động. Dưới đây là kết quả khảo sát pH với acid formic. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của HCOOH đến sự phân tách AO, RB Acid formic (pH = 3,0) Thông số AO RB Thời gian lưu (tR) 6,50 7,97 Hệ số dung lượng (k’) 1,60 2,19 Hệ số không đối xứng (T) 2,00 1,66 Độ phân giải AO và RB 1,47 Khi sử dụng acid formic điều chỉnh pH của pha động thì vẫn chưa tách được peak tạp ra xa chất cần phân tích, đường nền không ổn định, peak sắc ký của AO kéo đuôi như trong Hình 3.7. RB AO Hình 3.7. Sắc đồ khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid formic (pH = 3,0) 38
  51. Dưới đây là kết quả khảo sát pH với acid phosphoric. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của H3PO4 đến sự phân tách AO, RB Acid phosphoric Thông số pH = 2,6 (H3PO4 0,03%) pH = 2,3 (H3PO4 0,072%) AO RB AO RB Thời gian 16,42 19,38 16,24 19,17 lưu (tR) Hệ số dung 4,78 5,83 4,52 5,79 lượng (k’) Hệ số không 1,00 1,19 1,38 1,19 đối xứng (T) Sắc đồ chuẩn AO và RB khi sử dụng acid phosphoric 0,03% điều chỉnh pH pha động như Hình 3.8. RB AO Hình 3.8. Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid phosphoric 0,03% Như vậy, khi sử dụng acid phosphoric để điều chỉnh pH của pha động thì các peak AO và RB tách tốt, độ phân giải Rs > 1,5, các peak tạp được tách ra xa peak của chất cần phân tích, đường nền ổn định, hệ số không đối xứng (T) của AO và RB nằm trong khoảng 0,9 – 1,2 nên peak AO và RB có tính đối xứng cao. Khi sử dụng acid phosphoric 0,072% cho kết quả tương đồng với acid phosphoric 0,03%. Giá trị các thông số về thời gian lưu, hệ số dung lượng, hệ số không đối xứng không khác nhau nhiều. Vì vậy để bảo vệ cột chúng tôi chọn acid phosphoric 0,03% để ổn định pH pha động. Tuy nhiên, thời gian lưu của AO và RB quá lâu nên cần khảo sát chương trình dung môi pha động (rửa giải gradient) và tốc độ dòng để giảm thời gian lưu nhằm đạt được tính kinh tế trong quá trình phân tích. 39
  52. 3.1.2.4. Khảo sát tốc độ dòng Chúng tôi khảo sát các mức tốc độ dòng là 0,6 mL/phút; 0,7 mL/phút; 0,85 mL/phút và 1,0 mL/phút với chương trình pha động như Bảng 3.5. Bảng 3.5. Chương trình gradient pha động khảo sát tốc độ dòng Thời gian (phút) %MeOH %H3PO4 (0,03%) 0 43,7 56,3 5 43,7 56,3 13 80 20 20 30 70 Sau khi thực hiện phân tích HPLC với các điều kiện trên, chúng tôi thu được các sắc đồ: RB AO Hình 3.9. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,6 mL/phút RB AO Hình 3.10. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,7 mL/phút RB AO Hình 3.11. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,85 mL/phút 40
  53. RB AO Hình 3.12. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 1,0 mL/phút Với các mức tốc độ dòng khảo sát, các peak AO kéo đầu nhiều. Khi tốc độ dòng 0,85 và 1,0 mL/phút, cường độ tín hiệu có giảm nhưng thời gian lưu AO và RB ngắn hơn. Do đó để tiết kiệm thời gian phân tích chúng tôi chọn tốc độ dòng là 1,0 mL/phút để khảo sát yếu tố tiếp theo. 3.1.2.5. Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu Như đã khảo sát tốc độ dòng được lựa chọn là 1,0 mL/phút. Với tốc độ dòng này, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ dung môi ban đầu ở hai mức: 30% MeOH và 43,7% MeOH. Bảng 3.6. Khảo sát tỷ lệ dung môi ban đầu Tốc độ dòng 1,0 mL/phút Thời gian % H3PO4 Thời gian % % H3PO4 % MeOH (phút) (0,03%) (phút) MeOH (0,03%) 0 30 70 0 43,7 56,3 5 30 70 5 43,7 56,3 16 80 20 13 80 20 20 30 70 20 30 70 RB RB AO AO - Peak của AO và RB đều thon, gọn. - Peak RB thon, gọn nhưng peak AO bị - Các peak tạp tách ra xa peak AO, RB. kéo đầu. - Các peak tạp tách ra xa peak AO, RB. - Đường nền phía sau RB bị dâng. 41
  54. Với 30% MeOH ở thời điểm ban đầu đã kết luận được điều kiện tối ưu để phân tách AO và RB nhưng giá trị pH của pha động thấp, gần với giới hạn chịu đựng của cột tách C18 nên chúng tôi đã khảo sát bổ sung chương trình sắc ký sử dụng đệm acetate (pH = 4,2) Bảng 3.7. Các chương trình sắc ký với đệm acetate (pH = 4,2) Tốc độ dòng 1,0 mL/phút Thời gian Thời gian % MeOH % đệm % ACN % đệm (phút) (phút) 0 30 70 0 30 70 5 30 70 5 30 70 16 80 20 16 80 20 20 30 70 20 30 70 RB RB AO AO - Peak AO kéo đuôi. - Peak AO và RB kéo đuôi. - Cường độ peak AO, RB nhỏ. - Cường độ peak AO, RB nhỏ. Tốc độ dòng 1,5 mL/phút Thời gian Thời gian % MeOH % đệm % ACN % đệm (phút) (phút) 0 30 70 0 30 70 5 30 70 5 30 70 16 80 20 16 80 20 20 30 70 20 30 70 42
  55. RB RB AO AO - AO kéo đuôi. - AO và RB kéo đuôi. - Cường độ peak AO, RB nhỏ - Cường độ peak AO, RB nhỏ. Từ kết quả trên, nhận thấy việc sử dụng đệm điều chỉnh pH chưa mang lại hiệu quả. Ngoài ra, để đảm bảo tìm được đúng điều kiện tối ưu cho quy trình phân tích HPLC chúng tôi đã thực hiện bổ sung một số chương trình sắc ký và so sánh kết quả thu được. Với điều kiện pH được điều chỉnh bằng H3PO4 0,03%, chúng tôi tiến hành so sánh hiệu quả giữa dung môi MeOH và ACN. Bảng 3.8. So sánh kết quả khảo sát giữa dung môi MeOH với dung môi ACN Tốc độ dòng 0,7 mL/phút Thời gian % % H3PO4 Thời gian % H3PO4 % ACN (phút) MeOH (0,03%) (phút) (0,03%) 0 30 70 0 30 70 5 30 70 5 30 70 16 80 20 16 80 20 20 30 70 20 30 70 RB RB AO AO - Thời gian lưu của các CPT dài, rửa giải - Thời gian lưu của các CPT ngắn hơn. ở cuối thời gian chạy sắc ký. - Cường độ peak nhỏ. - Cường độ peak lớn. 43
  56. Tốc độ dòng 0,7 mL/phút Thời gian % % H3PO4 Thời gian % H3PO4 % ACN (phút) MeOH (0,03%) (phút) (0,03%) 0 43,7 56,3 0 43,7 56,3 5 43,7 56,3 5 43,7 56,3 13 80 20 13 80 20 20 30 70 20 30 70 RB RB AO AO - Thời gian lưu của các CPT dài. - Thời gian lưu của các CPT ngắn hơn. - Cường độ peak lớn. - Peak AO ra trước 5 phút nên dễ bị lẫn với các peak tạp khi phân tích mẫu thực tế. - Cường độ peak nhỏ. Tốc độ dòng 1,0 mL/phút Thời gian % % H3PO4 Thời gian % % H3PO4 (phút) MeOH (0,03%) (phút) ACN (0,03%) 0 30 70 0 30 70 5 30 70 5 30 70 16 80 20 16 80 20 20 30 70 20 30 70 44
  57. RB RB AO AO - Thời gian lưu của các CPT dài. - Thời gian lưu của các CPT ngắn hơn - Cường độ peak lớn. - Cường độ peak nhỏ. - Peak AO, RB thọn, gọn. - Peak AO tù.  Kết luận Sau khi tối ưu hóa dung môi pha động, chế độ rửa giải, pH của pha động, tốc độ dòng, tỷ lệ dung môi pha động ban đầu. Đồng thời kiểm tra cường độ tín hiệu, sự nhiễu nền, tR lưu, hình dạng peak của AO và RB, chúng tôi thu được các kết quả tối ưu như Bảng 3.9. Bảng 3.9. Chương trình pha động tối ưu Thời gian Tốc độ dòng % MeOH % (H3PO4 0,03%) Curve (phút) (mL/phút) 0 30 70 1,0 1 5 30 70 1,0 6 16 80 20 1,0 6 20 30 70 1,0 1 45
  58. 3.2. Thẩm định phương pháp 3.2.1. Xây dựng đường chuẩn Kết quả ở mục 3.1.1 cho thấy độ hấp thụ của AO và RB đều cao trong MeOH nên chúng tôi đã tiến hành pha các dung dịch chuẩn AO, RB trong dung môi MeOH để xây dựng đường chuẩn. Bảng 3.10. Giá trị nồng độ và diện tích của peak AO, RB thu được khi tiến hành phân tích HPLC Nồng độ AO và Diện tích peak sắc ký Lần đo RB (ppm) AO RB Lần 1 113,989 93,910 Lần 2 113,710 124,479 0,05 Lần 3 117,010 119,236 Trung bình 114,9 ± 4,5 113 ± 41 Lần 1 245,700 240,125 0,1 Lần 2 246,130 236,670 Trung bình 245,9 ± 2,7 238 ± 22 Lần 1 521,200 561,683 0,2 Lần 2 521,292 561,241 Trung bình 521,25 ± 0,58 561,5 ± 2,8 Lần 1 1437,478 1498,623 0,5 Lần 2 1433,890 1488,640 Trung bình 1436 ± 23 1494 ± 63 Lần 1 2950,071 2971,018 1,0 Lần 2 2956,904 2982,394 Trung bình 2953 ± 43 2977 ± 72 Lần 1 6004,887 5855,801 2,0 Lần 2 5976,327 5837,512 Trung bình 5991 ± 181 5847 ± 116 46
  59. Dựa vào bảng số liệu thu được sau khi tiến hành sắc ký, sử dụng phần mềm Microsoft Excel xây dựng đường chuẩn. Kết quả đường chuẩn của AO và RB được trình bày dưới đây: 6000 y = 3022,8x - 62,647 5000 R² = 0,9999 4000 3000 2000 Diện Diện (AU) tích 1000 0 0 0.5 1 1.5 2 Nồng độ AO (ppm) Hình 3.13. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn AO 6000 5000 y = 2949,4x - 20,993 R² = 0,9997 4000 3000 2000 Diện Diện (AU) tích 1000 0 0 0.5 1 1.5 2 Nồng độ RB (ppm) Hình 3.14. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn RB 47
  60. 3.2.3. Xác định LOD, LOQ Tính toán sơ bộ LOD của AO, RB bằng phương pháp HPLC theo đường chuẩn: S 19,00977117 LOD33.0,01887 y (ppm) AO b3022,8 S 40,25468917 LOD33.0,04095 y (ppm) RB b2949,4 Dựa trên LOD tính được theo đường chuẩn, chúng tôi pha loãng dung dịch chuẩn AO và RB đến nồng độ 0,02 ppm, sau đó tiến hành tiêm vào hệ thống HPLC và xác định LOD dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N). Kết quả thu được như sau: Bảng 3.11. Kết quả xác định LOD SH CPT Nồng độ (ppm) H h N h 2 AO 0,02 392 308 2,545 RB 0,02 645 442 2,919 Như vậy, LOD của AO và RB đều là 0,02 ppm. RB AO Hình 3.15. Sắc đồ xác định LOD của AO và RB 48
  61. Giới hạn định lượng AO, RB được xác định bằng phương pháp HPLC dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N). Kết quả thu được như sau: Bảng 3.12. Kết quả xác định LOQ SH CPT Nồng độ (ppm) H h N h 2 AO 0,05 1042 200 10,420 RB 0,05 1321 274 9,642 Như vậy, LOQ của AO và RB đều là 0,05 ppm. RB AO Hình 3.16. Sắc đồ xác định LOQ của AO và RB 49
  62. 3.2.4. Xác định độ lặp lại của phương pháp Bảng 3.13. Kết quả độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích peak tR Speak Lần AO RB AO RB 1 14,467 17,400 5664,660 5588,101 2 14,450 17,383 5753,625 5646,242 3 14,450 17,383 5787,972 5693,114 4 14,450 17,383 5761,298 5711,542 5 14,450 17,383 5812,427 5704,386 6 14,450 17,383 5802,885 5776,700 7 14,433 17,367 5800,698 5748,406 Trung bình 14,4500±0,0091 17,3830±0,0088 5769±47 5695±58 RSD% 0,068% 0,055% 0,88% 1,1% Kết luận: Tại mức nồng độ khảo sát 2,0 ppm thì RSD% nằm trong khoảng 0,06 – 1,1% phù hợp với yêu cầu của AOAC. 3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị 3.3.1. Khảo sát giai đoạn SPE 3.3.1.1. Khảo sát loại cột SPE Pha 100 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng nồng độ 0,2 ppm. Cách pha như sau: lấy 200 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp AO và RB có cùng nồng độ là 100 ppm, định mức bằng nước đến 100 mL. Các ký hiệu mẫu, thể tích dung dịch thu sau rửa giải, diện tích peak, hệ số thu hồi được trình bày trong Bảng 3.14. 50
  63. Bảng 3.14. Kết quả khảo sát của giai đoạn SPE Hệ số thu hồi Ký hiệu Thể tích rửa Speak Cột (%) mẫu giải (mL) AO RB AO RB A1 3 2351,89 2446,77 A2 1 40,12 32,60 86,97 87,96 A3 1 - - C18 B1 3 2259,24 2474,34 B2 1 45,71 32,55 83,91 88,90 B3 1 - - C1 3 1914,16 2554,57 C2 1 858,17 110,88 85,01 94,94 C3 1 408,02 151,74 Oasis D1 3 2113 2745,30 D2 1 587,14 56,89 88,60 100,39 D3 1 Ghi chú: - A1, A2, A3: tương ứng với ba lần rửa giải của mẫu A - B1, B2, B3: tương ứng với ba lần rửa giải của mẫu B - C1, C2, C3: tương ứng với ba lần rửa giải của mẫu C - D1, D2, D3: tương ứng với ba lần rửa giải của mẫu D Các mẫu A, B, C và D có nồng độ CPT và thể tích dung dịch như nhau. Mẫu A và B sử dụng khảo sát lặp với cột C18; mẫu C và D sử dụng khảo sát lặp với cột Oasis HLB. Kết luận: Theo khuyến cáo của hãng Waters, thể tích rửa giải tối đa 4 mL ứng với cột 6cc/ 200mg nên chúng tôi đã tiến hành khảo sát với thể tích rửa giải 5mL. Kết quả khảo sát ở Bảng 3.14 cho thấy, hệ số thu hồi của AO và RB trong trường hợp sử dụng cột chiết Oasis HLB cao hơn so với cột C18, đồng thời hệ số thu hồi trong khoảng phù hợp cho phân tích định lượng. Vì vậy, chúng tôi chọn cột Oasis HLB để tiến hành giai đoạn chiết pha rắn trong quy trình xử lý mẫu gia vị và chọn thể tích dung dịch rửa giải là 5 mL hỗn hợp HCOOH 2% trong MeOH (95:5, v:v). 51
  64. 3.3.1.2. Khảo sát tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết Để khảo sát tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết, chúng tôi tiến hành pha các dung dịch được thêm chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng nồng độ với tỷ lệ phần trăm thể tích ACN tương ứng là 5, 10, 20, 30, 50, 100%. Bảng 3.15. Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN khảo sát Ký hiệu Thể tích chuẩn hỗn hợp Thể tích Thể tích H2O Tỷ lệ ACN mẫu 100 ppm thêm vào (mL) ACN (mL) (mL) (%) A 0,06 14,94 0 100 B 0,06 7,50 7,44 50 C 0,06 4,50 10,44 30 D 0,06 3,00 11,94 20 E 0,06 1,50 13,44 10 F 0,06 0,75 14,19 5 Ghi chú: Các mẫu A, B, C, D, E, F có cùng nồng độ chuẩn AO và RB là 0,4 ppm và cùng thể tích là 15 mL; khác nhau về tỷ lệ ACN như được trình bày trong Bảng 3.15. Kết luận: Đối với mẫu A và B, các giai đoạn rửa giải đều không thu được tín hiệu của AO và RB trên sắc đồ, tuy nhiên giai đoạn nạp mẫu có tín hiệu của AO và RB. Đối với các mẫu C, D, E và F không thu được tín hiệu AO và RB ở giai đoạn nạp mẫu; chỉ thu được tín hiệu Ao và RB ở giai đoạn rửa giải. Và kết quả của các mẫu C, D, E và F được trình bày trong Bảng 3.16. Bảng 3.16. Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN và hệ số thu hồi của giai đoạn SPE Ký hiệu Tỷ lệ ACN Speak Hệ số thu hồi mẫu (%) AO RB AO RB C 30 4181,88 4900,17 102,00 108,64 D 20 5416,33 6313,22 129,22 140,58 E 10 4837,68 5945,87 116,46 132,28 F 5 3192,78 4996,56 80,19 110,82 Kết quả trên cho thấy tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết trước khi cho qua cột SPE tối ưu là 30%. Và trong những bước tiếp theo của quy trình thì tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết có thể không quá 30%. 52
  65. 3.3.2. Khảo sát thể tích dung dịch chiết Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát thể tích dung dịch chiết là 45 mL với lần chiết thứ nhất là 30 mL, lần chiết thứ hai là 15 mL. Mẫu bột ngũ vị hương được sử dụng để khảo sát thể tích dung dịch chiết. Bảng 3.17. Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ vị hương lần 1 Ký hiệu Thể tích rửa Speak Hệ số thu hồi (%) mẫu giải (mL) AO RB AO RB A1 5 4057,51 879,37 50,49 52,53 A2 5 1917,10 292,37 B1 5 3919,52 845,92 30,07 51,19 B2 5 1758,73 306,74 C1 5 3511,53 - - - C2 5 1730,49 - - - Ghi chú: - Ký hiệu mẫu A và B được thêm vào 0,06 mL chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng nồng độ 100 ppm, mẫu C không thêm chuẩn. - Ký hiệu mẫu A1, B1, C1 tương ứng với lần chiết thứ nhất và A2, B2, C2 tương ứng với lần chiết thứ hai của các mẫu A, B và C. Nhận xét: - Kết quả mẫu C cho thấy mẫu ngũ vị hương được sử dụng có chứa AO; - Với thể tích dung dịch chiết là 45 mL thì chưa chiết được hết CPT ra khỏi mẫu gia vị. Cho nên chúng tôi đề xuất thể tích dung dịch chiết là 50 mL với 3 lần chiết. Chúng tôi tiến hành khảo sát tiếp như sau: phân tích 3 mẫu bột ngũ vị hương thêm chuẩn và 1 mẫu ngũ vị hương không thêm chuẩn. Và sử dụng 50 mL hỗn hợp ACN : NH3 (0,5%, v:v) (70:30, v:v) chia làm 3 lần chiết, sau đó dịch chiết được tập hợp vào một bình định mức và định mức bằng nước đến 100 mL. Lấy 20 mL dịch chiết trong bình định mức nạp qua cột SPE, rửa giải thu được 5 mL dung dịch, lọc qua màng 0,2 µm, tiêm vào hệ thống HPLC để xác định hệ số thu hồi. 53
  66. Bảng 3.18. Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ vị hương lần 2 Ký hiệu Khối Thể tích Speak Hệ số thu hồi (%) mẫu lượng rửa giải AO RB AO RB (g) (mL) A 3,02688 3487,90 2179,93 33,18 75,83 B 3,00695 5 3812,62 2621,18 44,59 90,80 C 3,04706 3729,05 2525,63 40,48 87,56 D 3,04079 2499,03 - - - Ghi chú: Mẫu A, B, C thêm 0,25 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng nồng độ 100 ppm. Mẫu D không thêm chuẩn. Nhận xét: hệ số thu hồi đối với AO chưa cao, hệ số thu hồi của RB trong mẫu B và C lớn hơn 80% đáp ứng kỳ vọng theo AOAC. 3.3.3. Tính chọn lọc của quy trình Chúng tôi đã khảo sát tín hiệu của chuẩn hỗn hợp AO và RB được thêm vào mẫu thử thì thấy rằng peak của AO và RB bị ảnh hưởng nhiều bởi nền mẫu. Khi đó, độ tin khiết xác định bằng phần mềm với nồng độ chuẩn AO, RB 1,0 ppm thì đạt 100%, có thể kết luận CPT phân biệt rõ với những chất khác. Đối với trường hợp nồng độ chuẩn AO, RB nhỏ hơn 0,1 ppm, diện tích các peak nhỏ và sẽ bị ảnh hưởng nhiều bởi nền nên gây khó khăn trong bước định lượng dựa vào Speak. RB AO a) Sắc đồ chuẩn hỗn hợp AO và RB 1,0 ppm được thêm vào mẫu thử 54
  67. AO b) Sắc đồ ở 430 nm RB c) Sắc đồ ở 540 nm Hình 3.17. Độ tinh khiết của peak AO, RB xác định bằng phần mềm AO RB Hình 3.18. Sắc đồ chuẩn AO 0,03 ppm và RB 0,02 ppm trong nền mẫu ngũ vị hương 55
  68. CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. Kết luận Trong khoảng thời gian thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối với detector tử ngoại khả kiến”, chúng tôi đã thực hiện những công việc sau: 1. Chọn được điều kiện để tách và xác định đồng thời AO và RB trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp HPLC - Cột tách: ZORBAX Eclipse XDB – C18 (5 μm x 4,6 mm x 250 mm) và cột bảo vệ tương ứng - Pha động: gradient với hai kênh, A: MeOH, B: H3PO4 0,03% Bảng 4.1. Thành phần pha động Thời gian (phút) % MeOH % (H3PO4 0,03%) Curve 0 30 70 1 5 30 70 6 16 80 20 6 20 30 70 1 - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút - Thể tích vòng mẫu: 20 μL - Nhiệt độ cột: 35±5oC - Nhiệt độ buồng mẫu: 20±5oC - Bước sóng: 430 nm (AO) và 540 nm (RB) 2. Xây dựng được đường chuẩn để xác định AO và RB. Xác định được LOD và LOQ Bảng 4.2. Phương trình đường chuẩn của AO và RB AO RB Phương trình hồi quy y = 3022,8x – 62,647 y = 2949,4x – 20,993 Hệ số tương quan R = 0,9999 R= 0,9998 - LOD = 0,02 ppm - LOQ = 0,05 ppm 56
  69. 3. Tối ưu hóa được giai đoạn SPE sử dụng cột Oasis HLB Hoạt hóa cột: 3 mL MeOH, 3 mL H2O Nạp mẫu: 15 mL dung dịch mẫu đã chuẩn bị Rửa tạp: 4 mL hỗn hợp 5% MeOH trong H2O Rửa giải: 5 mL HCOOH 2% trong MeOH (95:5, v:v) Hình 4.1. Sơ đồ giai đoạn SPE tối ưu 4. Chưa hoàn tất việc khảo sát thể tích chiết đối với mẫu gia vị nên chưa thể tiến hành phân tích AO và RB trong mẫu gia vị. 5. Trong quá trình khảo sát, nhận thấy mẫu bò kho có tín hiệu của AO nên chúng tôi đã gửi mẫu đi phân tích ở Trung tâm phân tích công nghệ cao Hoàn Vũ: hàm lượng AO trong mẫu bột gia vị bò kho là 19,7 ppm và không phát hiện RB. Trong quá trình khảo sát, chúng tôi cũng phát hiện trong mẫu bột ngũ vị hương có hàm lượng AO. 4.2. Đề xuất - Tiến hành khảo sát tiếp thể tích dung dịch chiết cũng như là số lần chiết để tối ưu hóa được quy trình xử lý mẫu gia vị. - Áp dụng quy trình phân tích xác định đồng thời AO và RB cho một số mẫu gia vị, trong đó có bột gia vị bò kho và bột ngũ vị hương. 57
  70. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Bùi Thị Kim Ngân (2010). Xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Y học thực hành, 732 (9), 47 – 49. 2. Công ty TNHH Merck Việt Nam. Phiếu an toàn hóa chất theo Quy định (EU) số 1907/2006 (sửa đổi, bổ sung: 16/06/2017). 3. Khoa Hóa học (2000). Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội. 4. Nguyễn Văn Ri (2007). Các phương pháp tách sắc ký. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội. 5. Phạm Thị Thu Hà (2016). Nghiên cứu phương pháp xác định Auramine O trong thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS. Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Dược Hà Nội. 6. Phạm Luận (2014). Phương pháp phân tích sắc ký và chiết tách. Nhà xuất bản Bách khoa Hà Nội. 7. Phòng phân tích sắc ký (CASE). (09/02/2012). Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 11/07/2017, truy cập từ 8. Trần Thị Thanh Nga (2011). Xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector UV. Luận văn Thạc sĩ khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội. 9. Trần Cao Sơn (2010). Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, trang 16 – 59. 10. Trung tâm Chất lượng nông nghiệp thủy sản vùng 1 – Cục Quản lý chất lượng Nông lâm sản và thủy sản. Dự thảo TCVN Thực phẩm – Xác định hàm lượng Auramine – Phương pháp sắc lý lỏng ghép khối phổ (LC – MS/MS). Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ. 11. Trung tâm Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng khu vực I. TCVN 4889:1989 Gia vị - Lấy mẫu. Ủy ban Khoa học và kỹ thuật Nhà nước. 12. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia. TCVN 8670-2011 Thực phẩm - xác định Rhodamine B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ. 58
  71. 13. Võ Đức Minh. (22/08/2013). Lao. 29/11/2017, truy cập từ Tiếng Anh 14. Chiye Tatebe, Xining Zhong, Takashi Ohtsuki, Hiroki Kubota, Kyoko Sato & Hiroshi Akiyama (2014). A simple and rapid chromatographic method to determine unauthorized basic colorants (rhodamine B, auramine O, and pararosaniline) in processed foods. Food Science & Nutrition, 2(5), 547– 556p. 15. Dixit, Sumita; Khanna, Subhash K.; Das, Mukul (2011). A Simple Method for Simultaneous Determination of Basic Dyes Encountered in Food Preparations by Reversed-Phase HPLC. Journal of AOAC International, 94 (6), 1874 – 1881p. 16. Juan Li, Xiao-Ming Ding, Dan-Dan Liu, Fei Guo, Yu Chen, Yan-Bing Zhang, Hong-Min Liu (2013). Simultaneous determination of eight illegal dyes in chili products by liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 942–943, 46–52p. 17. Juan Li, Xiaoming Ding, Jiaxin Zheng, Dandan Liu, Fei Guo1 Hongmin Liu, Yanbing Zhang (2014). Determination of synthetic dyes in bean and meat products by liquid chromatography with tandem mass spectrometry. J. Sep. Sci., 37, 2439–2445p. 18. Government Chemist (2006). Analysis illegal dyes in chilli powder by LC/UV. 15p. 19. IARC. Auramine and Auramine Production. IARC Monograph Volume 99. 30p. 20. I. Lopez Arbeloa and P Ruiz Ojeda (1981). Molecular Forms Of Rhodamine B. Chemical Physics Letters, 79 (2), 347 – 350p. 21. KM Gray, MJ Walker, MJS Burn, M Mazur, K Niedzwiedzka, K Liszka and D Thorburn Burns (2016). Illegal Dyes in Food and Speakes – A 2006 LGC LC UV/Visible Method Reviewed and Updated for 19 Dyes. Journal of the Association of Public Analysts, 18 – 39p. 22. Sabnis R.W (2010). Handbook of biological dyes and stains. The United States: John Wiley & Sons, Inc; P, 27-29p. 23. Sigma-Aldrich, Inc. Auramine O (A9655) – Product Information Sheet. 2p. 24. Ruth Winter, M.S (2010). A Consumer’s Dictionary Of Cosmetic Ingredient (6th). Potter/TenSpeed/Harmony; p576. 59
  72. PHỤ LỤC Phụ lục 1. Quang phổ hấp thụ của chuẩn đơn AO 2,0 ppm trong MeOH Phụ lục 2. Quang phổ hấp thụ của chuẩn đơn AO 2,0 ppm trong ACN 60
  73. Phụ lục 3. Quang phổ hấp thụ của chuẩn đơn RB 2,0 ppm trong MeOH Phụ lục 4. Quang phổ hấp thụ của chuẩn đơn RB 2,0 ppm trong ACN 61
  74. Phụ lục 5. Quang phổ chuẩn hỗn hợp AO và RB trong MeOH Phụ lục 6. Quang phổ chuẩn hỗn hợp AO và RB trong ACN 62
  75. AO Phụ lục 7. Sắc đồ của chương trình 1 AO Phụ lục 8. Sắc đồ của chương trình 2 AO RB Phụ lục 9. Sắc đồ của chương trình 3 63
  76. RB AO Phụ lục 10. Sắc đồ của chương trình 4 AO Phụ lục 11. Sắc đồ ở bước sóng 430 nm của chương trình 5 RB Phụ lục 12. Sắc đồ ở bước sóng 540 nm của chương trình 5 64
  77. AO Phụ lục 13. Sắc đồ ở bước sóng 430 nm của chương trình 6 RB Phụ lục 14. Sắc đồ ở bước sóng 540 nm của chương trình 6 65