›

Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Rau má (Centella asiatica L. Urb.)

pdf 51 trang thiennha21 18/04/2022 14544
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Rau má (Centella asiatica L. Urb.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_dac_diem_thuc_vat_va_thanh_phan_hoa_hoc.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Rau má (Centella asiatica L. Urb.)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC  ĐẶNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY RAU MÁ (Centella asiatica (L.) Urb) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC  ĐẶNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY RAU MÁ (Centella asiatica (L.) Urb.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: PGS.TS. Vũ Đức Lợi HÀ NỘI - 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Vũ Đức Lợi - Chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khoá luận này. Em xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền của Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý Thầy cô, ban Giám hiệu Trường Đại học Y Dược đã dạy dỗ, trang bị kiến thức, tạo điều kiện cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường. Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè những người đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Do kiến thức còn hạn hẹp, thời gian nghiên cứu và thực hiện khóa luận không dài nên Khoá luận này của em không tránh khỏi thiếu sót. Em rất mong nhận được những lời nhận xét, góp ý của Quý thầy cô để Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ của em được hoàn thiện hơn. Cuối cùng, em xin kính chúc các Thầy cô sức khỏe, hạnh phúc, thành công trong cuộc sống, vững bước trên con đường sự nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Đặng Thị Quỳnh
  4. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt Distortionless Enhancement DEPT Phổ DEPT by Polarization Transfer Heteronuclear Multiple HMBC Phổ HMBC Bond Correlation Electrospray Ionization Khối phổ đo bằng phương pháp ESI-MS Mass Spectrometry ion hóa phun điện tử 13C Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR Resonance Spectroscopy cacbon-13 1H Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR Resonance Spectroscopy proton IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại  (ppm)  (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học J (Hz) J coupling constant Hằng số ghép m/z Mass to charge ratio Khối lượng/điện tích EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol MeOH Methanol d Doublet dd double doublet s Singlet br s Broad singlet m Multiple
  5. DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1: Hình ảnh một số loài thuộc chi Centella 4 2 Hình 1.2: Hình ảnh cây Rau má 5 3 Hình 1.3: Khung cấu trúc chung các hợp chất Triterpenoid 7 4 Hình 1.4: Cấu trúc hợp chất 3-glucosyl quercetin 8 5 Hình 1.5: Một số sản phẩm từ Rau má 12 6 Hình 3.1: Đặc điểm các cơ quan của cây Rau má 21 7 Hình 3.2: Đặc điểm vi phẫu thân cây Rau má 22 8 Hình 3.3: Đặc điểm vi phẫu lá cây Rau má 23 9 Hình 3.4: Đặc điểm vi phẫu cuống lá cây Rau má 24 10 Hình 3.5: Đặc điểm bột dược liệu 25 11 Hình 3.6: Sơ đồ chiết xuất các hợp chất từ lá cây Rau má 27 12 Hình 3.7: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Rau má 29 13 Hình 3.8: Cấu trúc hợp chất RM1 31 14 Hình 3.9: Cấu trúc hợp chất RM2 33 15 Hình 3.10: Cấu trúc hợp chất RM3 35
  6. DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ 26 trong lá cây Rau má bằng phương pháp hóa học 2 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất RM1 và hợp 30 chất tham khảo 3 Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của hợp chất RM2 và hợp 32 chất tham khảo 4 Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của hợp chất RM3 và hợp 34 chất tham khảo
  7. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về chi 2 1.1.1. Vị trí phân loại chi 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố của họ Hoa tán và chi Centella 2 1.2. Tổng quan về loài 5 1.2.1. Giới thiệu thực vật 5 1.2.2. Đặc điểm thực vật 5 1.2.3. Phân bố 6 1.2.4. Thành phần hóa học 6 1.2.5. Tác dụng dược lý 8 1.2.6. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền 11 1.2.7. Một số bài thuốc có Rau má 11 1.2.8. Một số sản phẩm từ Rau má trên thị trường 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.1. Nguyên liệu 13 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 13 2.2. Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1. Xử lý và bảo quản mẫu 14 2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái 14 2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm vi học 15 2.2.4. Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá cây Rau má 15 2.2.5. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có trong lá cây Rau má 19
  8. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật 21 3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái 21 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu thân 22 3.1.3. Đặc điểm vi phẫu lá 23 3.1.4. Đặc điểm vi phẫu cuống lá 24 3.1.5. Đặc điểm bột dược liệu 24 3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học 25 3.2.1. Kết quả định tính các nhóm chất bằng phương pháp hóa học 25 3.2.2. Kết quả chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá cây Rau má 26 3.2.3. Kết quả xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được 29 3.3. Bàn luận 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 Kết luận 38 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  9. MỞ ĐẦU Với điều kiện khí hậu và vị trí địa lý thuận lợi, nước ta có một hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Từ xa xưa, ông cha ta đã biết sử dụng cây cỏ trong tự nhiên làm thuốc phòng bệnh và chữa bệnh nhưng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm dân gian, có sự khác nhau giữa các vùng miền. Phần lớn các cây thuốc ở Việt Nam chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ nhất là về thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Vì vậy đây sẽ là một hướng nghiên cứu sẽ có nhiều triển vọng trong tương lai. Cây Rau má (Centella asiatica L.) má thuộc chi Centella của họ Apiaceae [1]. Ở Việt Nam, cây Rau má mọc hoang hoặc được trồng phổ biến khắp nơi, cây thường được tìm thấy tại những chỗ ẩm mát [6]. Các tác dụng sinh học chính của Rau má được cho là do các saponin triterpenoid chiếm ưu thế, đặc biệt là asiaticosid, madecassosid, acid asiatic và acid madecassic [26], các hợp chất phenolic và flavonoid cũng được chứng minh là có hoạt tính sinh học cụ thể chống lại độc tính thần kinh và các rối loạn liên quan đến stress oxy hóa. Rau má được biết đến như một loại cây thuốc có khả năng điều trị nhiều loại bệnh [6, 26]. Cây có nhiều tác dụng đã được nghiên cứu như tăng cường collagen giúp cải thiện quá trình chữa lành vết thương nhỏ, sẹo phì đại và bỏng [26, 27], bảo vệ tim mạch, chống xơ vữa động mạch, hạ huyết áp, hạ lipid máu, chống đái tháo đường, chống oxy hóa và chống viêm [28, 34]. Mặc dù cây Rau má đã được biết tới từ rất lâu nhưng hiện nay vẫn có rất nhiều công trình mới công bố về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của nó. Để góp phần cung cấp những cơ sở tiền đề cho việc nhận biết và sử dụng có hiệu quả cây Rau má làm thuốc ở Việt Nam, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Rau má (Centella asiatica L. Urb.)” được thực hiện nhằm mục tiêu như sau: 1. Nghiên cứu được các đặc điểm thực vật và xác định được tên khoa học của mẫu cây Rau má. 2. Định tính được các nhóm chất hữu cơ có trong lá cây Rau má. 3. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số chất từ lá cây Rau má. 1
  10. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi 1.1.1. Vị trí phân loại chi Vị trí phân loại chi Centella được tóm tắt như sau [1]: Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Thù du (Cornidae) Bộ Ngũ gia bì (Araliales) Họ Hoa tán (Apiaceae) Phân họ: Mackinlayoideae Chi: Rau má (Centella) 1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố của họ Hoa tán và chi Centella 1.1.2.1. Đặc điểm thực vật Họ Hoa tán là một họ lớn trong hệ thực vật trên Trái đất. Các cây trong họ Hoa tán thường là cây thân thảo, có gióng rỗng và mấu. Lá đơn chia thùy có khi chẻ thùy lông chim 1 hay nhiều lần, mọc cách, không có lá kèm, thường có mùi thơm. Cuống phình ra hình bẹ ôm lấy thân [1, 3-6]. Hoa nhỏ, cụm hoa tán đơn hay tán kép (tán gồm nhiều tán), có lá hoa tạo thành một vòng tổng bao. Hoa nhỏ đều hay không đều do cánh hoa các hoa xung quanh phát triển lệch. Hoa lưỡng tính hay đơn tính; mẫu 5; 4 vòng. Nhị đẳng số và xếp xen kẽ với cánh hoa. Bộ nhụy 2 lá noãn dính ở mặt trong, 2 vòi tự do với đầu nhụy hơi phồng lên. Đỉnh bầu có đĩa mật loe [1, 3-6]. Quả bế thường có cánh dẹt do hai mảnh ghép lại, khi chín thì tách thành 2
  11. 2 quả bế dính nhau ở đỉnh [1]. Theo APG III, họ Hoa tán chia làm 4 phân họ [18]: - Apioideae với khoảng 400 chi, 3200 loài - Azorelloideae với khoảng 21 chi, 155 loài - Mackinlayoideae với khoảng 10 chi, 98 loài - Saniculoideae với khoảng 10 chi, 355 loài. Chi Centella - Rau má thuộc phân họ Mackinlayoideae, gồm khoảng 20 loài. Đặc điểm thực vật của chi Centella: cây cỏ mọc bò, lá mọc so le, phiến lá hình thận, gân chân vịt, cụm hoa tán đơn gồm 1-5 hoa [4]. 1.1.2.2. Phân bố Trên thế giới họ Hoa tán có hơn 400 chi và 3800 loài, phân bố hầu như khắp thế giới, nhất là vùng ôn đới núi cao. Việt Nam có khoảng 20 chi, trên 30 loài, phần lớn được trồng để làm gia vị, hương liệu, lấy tinh dầu (Thìa là, Rau mùi, Cần tây, Mùi tàu, ), làm thuốc [1]. Chi Centella có khoảng 40 loài, phân bố ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới nhất là ở Bắc Phi và Ostraylia [4, 7]. Ở nước ta có một loài Centella asiatica L. [10, 15]. 3
  12. Hình 1.1: Hình ảnh một số loài thuộc chi Centella 1.1.2.3. Công dụng Công dụng: Các loài thực vật thuộc họ Hoa tán ở Việt Nam có khoảng 20 chi, trên 30 loài, phần lớn được trồng để làm gia vị, hương liệu, lấy tinh dầu (Thìa là, Rau mùi, Cần tây, Mùi tàu, ), làm thuốc [1]. Là thức ăn quan trọng, ví dụ như Cà rốt (Daucus carota), làm thuốc (Angelica spp., Ligusticum spp.), làm gia vị (Eryngium foetidum, Coriandrum sativum), là nguồn cung cấp nhựa, mỹ phẩm và cây làm cảnh [1, 4]. 4
  13. 1.2. Tổng quan về loài 1.2.1. Giới thiệu thực vật • Tên khoa học: Centella asiatica (L.) Urb., (Hydrocotyle asiatica L. Trisanthus cochinchinensis Lour.) [6]. • Tên nước ngoài: Phanok (Vientian), trachiek ktranh (Campuchia), Indian pennywort (Anh), Centelle, Bévillacque (Pháp) [3, 5, 6]. • Tên tiếng việt: Rau má, Tích tuyết thảo, Liên tiền thảo [6]. • Họ: Hoa tán (Apiaceae hoặc Umbelliferae) [1]. 1.2.2. Đặc điểm thực vật Rau má là một lại cây thân thảo, cao 7-10 cm. Thân mảnh, mọc bò, hơi có lông khi còn non, bén rễ ở các mấu [7]. Thân phân nhánh nhiều trên mặt đất, thân gầy, nhẵn [6]. Lá mọc so le, nhưng thường tụ họp 2-5 cái ở một mấu, có cuống mảnh, dài từ 3-5 cm có khi đến 7-8 cm [7], phiến hình thận hoặc gần tròn [3], mép khía tai bèo rộng 2-4 cm trong những nhánh mang hoa và dài 10-12 cm trong những nhánh thường [6]. Hình 1.2: Hình ảnh cây Rau má [6] 5
  14. Cụm hoa hình tán đơn mọc ở nách lá gồm 1-5 hoa nhỏ không cuống màu trắng hoặc phớt đỏ [3]. Hoa giữa không có cuống, tổng bao có 2 hoặc 3 mảnh hình trái xoan lõm, dạng màng, cánh hoa hình tam giác hoặc trái xoan; nhị có chỉ nhị ngắn, bao phấn hình mắt chim; bầu hình cầu [7]. Quả màu nâu đen, đỉnh lõm, có 7-9 cạnh lồi, nhẵn hoặc có lông nhỏ, có vân mạng [7]. Quả dẹt rộng 3-5 mm có sống hơi rõ [6]. Sinh thái: Cây mọc thành đám trên các bãi hoang, bờ ruộng, ven đường, dọc đường sắt, nơi ẩm mát, mùa ra quả kéo dài từ tháng 4 đến tháng 6 [3, 41]. 1.2.3. Phân bố Cây có nguồn gốc từ các khu vực ẩm ướt của các vùng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới như Đông Nam Á. Sau đó, được di thực đến Ấn Độ, Sri Lanka, Nam Phi và Madagascar, và cũng có mặt ở đông nam Mỹ [3, 4]. Tại Việt Nam, cây Rau má mọc hoang hoặc được trồng phổ biến khắp nơi. Cây thường được tìm thấy tại những chỗ ẩm mát. Ngoài ra, người ta còn tìm thấy cây Rau má ở các nước nhiệt đới châu Á, Ostraylia, châu Phi và châu Mỹ. 1.2.4. Thành phần hóa học Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Rau má, tuy nhiên kết quả nghiên cứu chưa có sự thống nhất [6]. Tùy theo điều kiện tự nhiên của khu vực hay mùa thu hái mà thành phần cũng như tỷ lệ các hợp chất hóa học có trong cây Rau má có sự sai khác. Rau má chứa các hợp chất hóa học thuộc nhiềm nhóm khác nhau [7]. Một số hợp chất được biết đến như: saponin, alkaloid, flavonoid, saccharid, beta caroten, sterol, một số nguyên tố vi lượng kim loại (Ca, Mg, P, Zn, ), các loại vitamin (B1, B2, B3, C, K) [2, 13]. • Saponin: Phần trên mặt đất của cây Rau má có các saponin triterpen 5 vòng [40] và các sapogenin của chúng, chủ yếu thuộc nhóm ursan. Một số ít thuộc nhóm oleanan và lupan. Các hợp chất triterpenoid thuộc nhóm ursan được xem là hoạt chất chính trong Rau má. Cho đến nay đã có hơn 20 chất 6
  15. được phân lập với hơn nửa trong số đó là các saponosid [8]. Các saponin quan trọng trong Rau má là: asiaticosid (madecassol), madecassosid, irahmosid, brahmiosid [13]. Ngoài ra còn có thankunisid, isothankunisid. Các acid trong Rau má là acid asiatic, acid brahmic, acid isobrahmic. Rau má không được chứa dưới 2% triterpen ester glucosid [12, 17]. Hình 1.3: Khung cấu trúc chung các hợp chất Triterpenoid [7] Acid asiatic R1 = H R2 = H 6 4 Asiaticosid R1 = H R2 = glc -glc -rha Acid madecassic R1 = OH R2 = H 6 4 Madecassosid R1 = OH R2 = glc -glc - rha • Alcaloid: Hydrocotylin có công thức phân tử C22H38O8N có nhiệt độ nóng chảy từ 210-212 ℃. Chất này cho các muối oxalat (độ chảy 295 ℃), muối picrat (độ chảy 110-112 ℃), muối cloroclatinat (độ chảy 134-136 ℃) [11, 12]. • Tinh dầu: Phần trên mặt đất của cây Rau má mọc ở Malaysia có 41 thành phần trong đó có 80% là các sesquiterpen và 10% là gremacren-D. Cây Rau má mọc ở Srilanca chứa tinh dầu, trong đó có α-copaen 14%, β- caryophylen 12%, trans-β-farnesen 53% và α-humulen 9% [7]. • Các hợp chất polyacetylen: Rau má có chứ 14 hợp chất polyacetylen, trong đó có 5 hợp chất đã được nhận dạng: pentadeca-2, 9-dien-4, 6-diyn-1-ol acetat; 3, 8-diacetoxypentadeca -1, 9-dien-4, 6-diyn; 3-hydroxy-8-acetoxy pentadeca-1, 9-dien-4, 6-diyn; 3-hydroxy-10-acetoxy-pentadeca-1, 8-dien-4, 7
  16. 6-diyn và pentadeca-1, 8-dien-4, 6-diyn-3, 10-diol [7, 8]. • Flavoloid: Các flavoloid bao gồm kaempferol, quercetin, 3-glucosyl quercetin, 3-glucosyl kaempferol [12, 15]. Hình 1.4: Cấu trúc hợp chất 3-glucosyl quercetin [12] • Steroid: Các hợp chất steroid bao gồm: β-sitosterol, stigmasterol, campestrol [12, 42]. • Dầu béo: Các glycerin của các acid oleic, linoleic, lignocric, palmitic, stearic, linolenic, elaidic [13]. • Các acid amin: Acid glutamic, serin, alanin. • Các nhóm thành phần khác: Tanin, carotenoid, vitamin C, oligosaccharid (centelose) [6-8, 12, 42]. 1.2.5. Tác dụng dược lý Các nghiên cứu in vitro và in vivo đã cho thấy cây Rau má có những lợi ích quan trọng đối với sức khỏe như chống đái tháo đường, chữa lành vết thương, kháng khuẩn, chống oxy hóa, tăng cường trí nhớ và các hoạt động bảo vệ thần kinh [6, 8, 29]. Vào những năm 1940, các nhà khoa học đã bắt đầu tiến hành nghiên cứu về tác dụng của cây Rau má. Nhờ những hoạt chất hóa học thuộc nhóm saponins, triterpenoid Rau má được biết đến với những lợi ích sau: ➢ Đối với da C. asiatica có hiệu quả trong việc điều trị các vết thương nhỏ [37], vết 8
  17. thương phì đại cũng như bỏng, bệnh vẩy nến và xơ cứng bì. Cơ chế hoạt động liên quan đến việc thúc đẩy tăng cường collagen giúp cải thiện quá trình chữa lành vết thương nhỏ [26, 27, 37], sẹo phì đại và bỏng, đồng thời cải thiện độ bền của da mới hình thành cũng như ức chế giai đoạn tăng sinh của sẹo lồi [25]. Một số nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết từ Rau má có tác dụng kích hoạt quá trình phân chia tế bào và thúc đẩy sự tổng hợp collagen của các mô liên kết, giúp hình thành tế bào da mới, hỗ trợ làm lành vết thương. Chính nhờ sự kích thích mau lên da non, Rau má được ứng dụng trong ngành mỹ phẩm với mục đích xóa vết nhăn, làm chậm quá trình lão hóa, làm đẹp da [26]. ➢ Trị bệnh phong, lao Hoạt chất asiaticosid có trong Rau má đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị bệnh phong do làm tan lớp màng sáp bọc vi khuẩn phong, đồng thời giúp tăng cường hệ miễn dịch chống lại nhóm chủng khuẩn này [7]. Asiaticosid và oxy-asiaticosid được dùng để điều trị một số thể bệnh lao [7, 23]. ➢ Tác dụng đối với hệ tim mạch Rau má chứa lượng lớn các chất có tác dụng chống tăng lipid máu, chống oxy hóa đầy hứa hẹn [38], giúp ngăn ngừa mắc các bệnh lý về tim mạch. Đồng thời, hoạt chất Bracoside A chiết xuất từ Rau má có tác dụng kích thích bài tiết oxit nitric (NO) của mô. Từ đó giúp làm giãn nở vi động mạch, hỗ trợ máu lưu thông qua mô tốt hơn, giảm nhanh cơn đau tim. Song song quá trình đó, chất độc tích tụ trong cơ thể được đào thải ra ngoài dễ dàng hơn [28, 34]. Theo một nghiên cứu của Nyuk Jet Chong và Zoriah Aziz, C. asiatica có thể có lợi cho việc cải thiện các dấu hiệu và triệu chứng của suy giãn tĩnh mạch mạn tính [22]. ➢ Giảm căng thẳng, tăng khả năng tập trung, cải thiện trí nhớ ở người già 9
  18. Hợp chất Bracoside B có trong Rau má có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, làm tăng cường chất trung gian chuyển hóa giúp não bộ hoạt động tốt hơn. Nhờ đó, tăng khả năng tập trung và hỗ trợ cải thiện trí nhớ ở người cao tuổi. Bên cạnh đó, triterpenoid từ Rau má có công dụng tăng cường chức năng thần kinh và giảm sự lo lắng, giúp giảm căng thẳng [23, 24]. ➢ Điều trị ung thư Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện các thành phần hóa học có trong Rau má có tác dụng giúp ổn định DNA, ngăn chặn tế bào biến tính thành ung thư. Đã có nghiên cứu chỉ ra C.asiatica có tác dụng chống oxy hóa, chống lại các cytokin gây viêm và chết tế bào suy kiệt từ đó làm giảm tình trạng suy kiệt do ung thư [20]. ➢ Một số tác dụng khác Rau má có tác dụng làm giảm nhẹ cơn khó thở do dị ứng ở chuột lang được tiêm kháng nguyên, kháng lại nọc độc rắn, nâng cao tỷ lệ sống, kéo dài thời gian cầm cự của chuột đã tiêm nọc rắn hổ mang [7]. Nghiên cứu của Abas và các cộng sự đã chỉ ra rằng dịch chiết cồn của cây Rau má có tác dụng kiểm soát đường huyết và mỡ máu trên mô hình chuột béo phì bị tiểu đường [35]. Nước sắc Rau má có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn đối với tụ cầu vàng và trực khuẩn mủ xanh, virus herpes II [13, 34, 36]. ➢ Độc tính: Không tìm thấy bằng chứng về độc tính cấp của Rau má khi nghiên cứu trên chuột, tuy nhiên về lâu dài có ảnh hướng đến trong lượng cơ thể và lượng tiêu thụ thức ăn của chuột [39]. Ngoài ra hợp chất asiaticosid làm giảm khả năng sinh sản ở chuột nhắt cái. Rau má có tác dụng độc khi dùng liều rất lớn 10
  19. hoặc dùng thời gian kéo dài. Rau má có thể gây nhức đầu chóng mặt, ở người mẫn cảm có thể dẫn đến hôn mê [7]. 1.2.6. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền Tính vị: vị hơi đắng, tính hàn [6]. Quy kinh: quy vào 3 kinh tỳ, can và thận [6]. Công năng: Thanh nhiệt trừ thấp, giải độc, tiêu sưng. Chủ trị: Hoàng đản thấp nhiệt, tiêu chảy, thổ huyết, chảy máu cam, nhọt độc sưng, tiểu tiện rắt buốt [6]. Tác dụng và công dụng: Theo Trung y, Rau má có tác dụng thanh nhiệt, dưỡng âm, lợi tiểu, nhuận gan và giải độc. Thông thường, Đông y thường sử dụng Rau má làm thuốc bổ và chủ trị các chứng bệnh như hư khí, rôm sẩy, bạch đới, tả lỵ, mụn nhọt, chữa thổ huyết, sát trùng, [3, 6]. Dân gian thường dùng Rau má trị cảm mạo phong nhiệt, thủy đậu, sởi, sốt da mặt vàng, viêm họng, viêm khí quản, ho, viêm đường tiết niệu, đái rắt, đái buốt, còn dùng trị thổ huyết, chảy máu cam, tả lỵ, khí hư bạch đới [6, 7, 11]. Rau má thường được dùng ăn sống hoặc ép lấy nước, pha đường uống cho mát. 1.2.7. Một số bài thuốc có Rau má Chè giải nhiệt: Rau má 15,3%, vỏ đậu xanh 15,3%, bạch biển đậu 15,3%, bạch môn đông 15,3%, sinh địa 9,18%, sa sâm 7,65%, lá tre 7,65%, cam thảo 4,6%, bạch chỉ 2,26%. Hãm uống trong ngày. Chữa tiêu chảy cấp tính: Rau má sao vàng 10 g, biển đậu 12 g, hoắc hương, hương phụ, hạt mã đề mỗi vị 8 g, sa nhân 3 g gừng 2 g. Sắc uống ngày một thang. 11
  20. Chữa vàng da: Rau má 100 g, nhân trần hoặc bồ bồ, chi tử mỗi vị 30 g, vàng đắng 3 g. Sắc uống ngày một thang [7]. 1.2.8. Một số sản phẩm từ Rau má trên thị trường Hình 1.5: Một số sản phẩm từ Rau má 12
  21. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Cây Rau má được thu hái tại xã Cẩm Chế, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương vào tháng 12 năm 2020. Mẫu lá được thu hái, phơi sấy, bảo quản trong túi nilon kín, làm nguyên liệu cho các phản ứng định tính thành phần hóa học và chiết xuất, phân lập hợp chất. Bảo quản, lưu mẫu tại: Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN (số hiệu tiêu bản: UMP-102021). 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 2.1.2.1. Dung môi, hóa chất Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: nước javen, acid acetic, xanh metylen, đỏ son phèn và nước cất, Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH), etyl acetat (EtOAc), chloroform (CHCl3), n-hexan, metanol (MeOH), đicloromethan (DCM), Các hóa chất dùng để định tính: H2SO4, NH3, NaOH, Mg, HCl, FeCl3, Na2CO3, thuốc thử Liebermann, Baljet, Legal, Mayer, Bouchardat, Dragendorff, Fehling A, B, Hóa chất dùng trong sắc ký cột: bản mỏng tráng sẵn pha thường silicagel F254 (Merck), pha đảo RP-18 F254s (Merck), chất hấp phụ silicagel pha thường (cỡ hạt 63-200 μm, Merck), acid sulfuric 10%/ethanol. Các hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích. 2.1.2.2. Trang thiết bị Kính hiển vi soi vi phẫu gắn camera: Meiji Infinity 1 (Nhật Bản) tại Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN. 13
  22. Kính hiển vi soi nổi gắn camera: Optika (Ý) tại Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN. Các loại cột sắc ký, đèn tử ngoại tại Viện Dược liệu. Máy đo phổ hồng ngoại (IR) FT-IR Spectrophotometer (Perkin Elmer, Mỹ) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Máy đo phổ khối Agilent 1100 LC/MSD tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC) Bruker AM500 FT-NMR tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Một số các thiết bị khác. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Xử lý và bảo quản mẫu Mẫu dược liệu gồm dược liệu tươi và dược liệu đã phơi khô sau khi thu hái. Dược liệu được bảo quản như sau: Mẫu dược liệu cắt làm vi phẫu là mẫu tươi, sau khi có mẫu tiến hành làm ngay. Mẫu dược liệu dùng để soi bột được sấy khô, nghiền thành bột, bảo quản trong lọ có nút kín, có ghi nhãn và để nơi khô ráo. Mẫu dược liệu dùng để định tính, chiết xuất, phân lập, nhận dạng cấu trúc hóa học được sấy ở nhiệt độ <50℃ trong tủ sấy, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời. 2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái Phân tích hình thái thực vật: mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp mô tả phân tích. 14
  23. Làm tiêu bản mẫu khô theo phương pháp làm tiêu bản cây khô. 2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm vi học Nghiên cứu đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu theo tài liệu, cụ thể: mẫu sau thu hái được đem xử lí theo phương pháp thích hợp rồi tiến hành nghiên cứu. 2.2.3.1. Đặc điểm vi phẫu Chọn mẫu có kích thước thích hợp. Cắt mẫu làm tiêu bản: tiêu bản vi phẫu thân được cắt ngang ở đoạn thân. Tiêu bản vi phẫu cuống lá được cắt ngang ở đoạn giữa từ thân đến lá. Tiêu bản vi phẫu lá được cắt ngang ở vị trí gân lá trưởng thành. Xử lý lát cắt: chọn những lát cắt mỏng đem nhuộm và làm tiêu bản vi phẫu theo quy trình chuẩn. Quan sát, mô tả và chụp ảnh: quan sát các đặc điểm vi phẫu, chụp ảnh bằng kính hiển vi có gắn camera tại Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.2.3.2. Đặc điểm bột dược liệu Mẫu nghiên cứu được sấy khô, nghiền thành bột. Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi, xác định màu, mùi, vị. Làm tiêu bản bột dược liệu bằng phương pháp giọt ép, quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột trên nền kính hiển vi có gắn camera. Ảnh các đặc điểm bột được đưa vào máy tính sau đó ghép thành ảnh hoàn chỉnh. 2.2.4. Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá cây Rau má Nguyên liệu nghiên cứu là lá cây Rau má đã được phơi sấy khô, nghiền thành bột và bảo quản. Các phương pháp định tính tham khảo trong các tài liệu 15
  24. [9, 14, 29]. ➢ Định tính alcaloid Lấy 2 g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 50 mL. Thêm 15 mL dung dịch thấm ẩm NH4OH 6N. Sau 30 phút thêm 15 mL chloroform ngập dược liệu, lắc, đậy kín. Ngâm 3h, gạn dịch chloroform vào bình gạn lắc kỹ với dung dịch H2SO4 1N. Gạn lấy dịch chiết acid để làm các phản ứng với thuốc thử chung của alcaloid • Phản ứng với thuốc thử Mayer: Cho 2 mL dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5-6 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính. • Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Cho 2 mL dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5-6 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu thấy xuất hiện kết tủa cam thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính saponin Cho 5 g bột dược liệu vào bình nón 50 mL, chiết bằng 30 mL cồn 90°, lọc dịch chiết bằng giấy lọc gấp nếp. Dịch chiết cồn để làm phản ứng. • Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vài giọt dịch chiết cồn vào ống nghiệm có chứa 5 mL nước cất. Lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút. Để yên và quan sát cột bọt, thấy cột bọt bền sau 15 phút thì dương tính. • Phản ứng với H2SO4 đậm đặc: Nhỏ 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc vào cốc chứa cắn của dịch chiết cồn, thấy xuất hiện màu tím hồng thì phản ứng dương tính. • Phản ứng sơ bộ phân biết saponin sterolic và saponin triterpenic: Bố trí thí nghiệm trong 2 ống nghiệm: Ống 1: 5 mL dung dịch NaOH 0,1N Ống 1: 5 mL dung dịch HCl 0,1N 16
  25. Thêm vào 2 ống mỗi ống 5 giọt dịch chiết cồn, lắc mạnh trong 1 phút, để yên 1 phút. Thấy cột bọt ở 2 ống bằng nhau. Sơ bộ kết luận dược liệu chứa saponin triterpenic. ➢ Định tính flavonoid Lấy khoảng 5 g bột dược liệu cho vào cốc có mỏ, thêm cồn 90°, đun sôi cách thủy trong vài phút. Lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc để làm các phản ứng định tính: • Phản ứng với hơi amoniac (NH3): Nhỏ vài giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, để khô rồi hơ lên miệng lọ amoniac đặc, quan sát nếu thấy vết chất chuyển sang màu vàng thì phản ứng dương tính. • Phản ứng với dung dịch FeCl3: Cho 1 mL dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10%, nếu thấy dịch vẩn đục màu vàng thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính coumarin Chuẩn bị dịch lọc như phần định tính flavonoid để làm phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 mL dịch lọc: + Ống 1: thêm 0,5 mL NaOH 10%. + Ống 2: để nguyên. Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện tượng + Ống 1: có tủa đục màu vàng. + Ống 2: trong suốt. Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4 mL, lắc đều, quan sát: + Ống 1: trong suốt. 17
  26. + Ống 2: có tủa đục. Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, thấy đục như ống 2 thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính anthranoid Phản ứng Borntraeger: Lấy khoảng 1 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm, thêm 5 mL dung dịch H2SO4 1N. Đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc cho vào bình gạn. Thêm 3 mL ether vào dịch lọc, lắc nhẹ, gạn lấy lớp ether. Cho 1 mL dịch ether vào ống nghiệm, thêm 1 mL NaOH 10% vào, lắc kỹ, nếu xuất hiện màu đỏ sim thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính acid hữu cơ Cho 1 g bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm nước cất, đun sôi trực tiếp trong vài phút, để nguội, lọc. Lấy khoảng 2 mL dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3 nếu thấy có bọt khí bay lên thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính tanin Cho 1 g bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm nước cất, đun sôi trực tiếp trong vài phút, để nguội, lọc. Lấy 1 mL dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt gelatin 1% nếu thấy xuất hiện tủa bông trắng thì phản ứng dương tính. ➢ Định tính đường khử Hòa tan cắn vào 1 mL nước nóng, đem lọc thu được dịch lọc. Thêm vào đó 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling A và 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy sôi vài phút nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng dương tính. 18
  27. 2.2.5. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có trong lá cây Rau má 2.2.5.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất Lá cây Rau má được thu hái, rửa sạch, phơi khô, ngâm chiết 3 lần bằng dung môi EtOH 80%, sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40℃ trong vòng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu cao chiết tổng ethanol. Phân tán cao chiết này trong nước cất và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần). Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng. 2.2.5.2. Phương pháp phân lập các hợp chất Sử dụng các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng (dùng để khảo sát) và sắc ký cột để phân lập các hợp chất. Sắc ký lớp mỏng: được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254, độ dày 0,2 mm và RP-18 F254s (Merck), độ dày 0,25 mm; hoạt hóa ở 110℃ trong 1 giờ. Sau khi triển khai sắc ký, phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu. Sắc ký cột: được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường cỡ hạt 0,063-0,200 mm và 0,040-0,063 mm (Merck) và pha đảo RP-18 cỡ hạt 0,03-0,05 mm (Merck). 2.2.5.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được Xác định cấu trúc của các chất phân lập được dựa trên phân tích kết quả phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 19
  28. 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC) sử dụng chất nội chuẩn là TMS (tetramethyl silan) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố. 20
  29. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật 3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái Hình 3.1: Đặc điểm các cơ quan của cây Rau má Chú thích: 1. Toàn cây. 2. Lá cây Rau má; 2a. Mặt trước lá. 2b. Mặt sau lá. 3a. Nụ hoa, 3b. Hoa và cụm hoa. 4a. Đài hoa có cuống. 4b. Đài hoa. 4c. Tràng hoa. Cây cỏ mọc bò, lan rộng trên mặt đất, phân nhiều nhánh. Rễ mọc ở các mấu thân. Thân nhỏ, đường kính 1-1,5 mm chia thành các đốt, mỗi đốt dài từ 8-12 cm, có màu xanh đậm hoặc xanh tím, thân non có phủ một lớp lông mềm 21
  30. hoặc gần như nhẵn. Lá mọc so le hoặc tụ tập 3-7 lá ở một mấu. phiến lá hình tròn hoặc hình thận, mép khía tai bèo. Lá rộng từ 2-4 cm, gân lá hình chân vịt. Cuống lá tròn, dạng ống rỗng bên trong, đường kính 1-1,5 mm có màu xanh lá hoặc xanh tím. Đáy của cuống lá phình ra hình bẹ ôm lấy thân. Hoa mọc từ các mấu, mỗi mấu có từ 3-5 hoa rất nhỏ. Hoa lưỡng tính, dài từ 3-5 mm. Đài tiêu giảm. Cánh hoa hình tròn hoặc hình trứng, rộng từ 1-2 mm, màu trắng hoặc phớt đỏ. Nhị 5, xen giữa các cánh hoa, chỉ nhị dài. Bầu nhụy 1 ô gồm 2 lá noãn đính với nhau ở phía trong. Vòi nhụy xẻ 2 dạng sợi chỉ. Đầu nhụy hơi phồng. Quả dẹt, tròn đường kính 2-3 mm, có nhiều rãnh dọc, mang theo vòi nhụy. Hạt đính chặt vào vỏ quả. 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu thân Vi phẫu tiết diện gần tròn có nhiều cạnh lồi. Tế bào biểu bì (1) là một hàng tế bào hình chữ nhật, kích thước không đều. Mô dày (2) nằm sát dưới biểu bì gồm 1-4 lớp tế bào có thành dày. Tiếp theo là mô mềm (3) gồm 5-8 lớp tế bào hình tròn hoặc đa giác gần tròn, vách hơi uốn lượn, kích thước không đều. Túi tiết kiểu ly bào có trong vùng vỏ và khoảng gian bó. Hình 3.2: Đặc điểm vi phẫu thân cây Rau má Chú thích: 1. Tế bào biểu bì. 2. Mô dày. 3. Mô mềm. 4. Libe. 5. Trụ bì hóa mô cứng. 6. Mạch gỗ. 7. Mô mềm ruột 22
  31. Libe (4) gồm 5-6 lớp tế bào đa giác, vách uốn lượn, kích thước nhỏ, xếp lộn xộn. Trụ bì gồm 2-5 lớp tế bào hình đa giác, hóa mô cứng (5) thành cụm trên libe. Mạch gỗ (6) to, hình tròn hoặc đa giác gần tròn, mô mềm gỗ ít 2-3 lớp tế bào đa giác, kích thước nhỏ. Mạch gỗ hình tròn hoặc đa giác gần tròn; mô mềm quanh gỗ tế bào hình đa giác, vách hơi uốn lượn, kích thước không đều, vách cellulose. Mô mềm ruột (7) là các tế bào thành mỏng, hình đa giác hoặc đa giác gần tròn, kích thước to, không đều. 3.1.3. Đặc điểm vi phẫu lá Phần gân giữa trên hơi lõm, dưới lồi, các tế vào biểu bì trên và dưới (1, 7) hình chữ nhật nhỏ, bên cạnh là những tế bào kích thước lớn hơn. Mô dày (2) nằm sát dưới biểu bì gồm 3-4 lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều. Mô mềm khuyết gồm 2-5 lớp tế bào hình tròn hoặc đa giác gần tròn, kích thước không đều. Mạch gỗ (3) kích thước không đều, hình tròn hoặc gần tròn; mô mềm gỗ hình đa giác, vách cellulose. Bó libe (4) gỗ gồm phần cung libe ôm lấy phần gỗ. Libe gồm nhiều lớp tế bào kích thước nhỏ, sắp xếp lộn xộn. Mô dậu (5) là các tế bào hơi đi sâu vào phần gân giữa. Mô khuyết (6) nằm ngay dưới mô dậu, gồm nhiều lớp tế bào hình thuôn dài, vách uốn lượn. Hình 3.3: Đặc điểm vi phẫu lá cây Rau má Chú thích: 1. Tế bào biểu bì trên. 2. Mô dày. 3. Mạch gỗ. 4. Bó libe. 5. Mô dậu. 6. Mô khuyết. 7. Tế bào biểu bì dưới. 23
  32. 3.1.4. Đặc điểm vi phẫu cuống lá Tiết diện gần tròn hơi khuyết ở mặt trên. Biểu bì (1) tế bào hình chữ nhật, rải rác có lỗ khí. Mô dày (2) nằm sát dưới biểu bì, góc gồm 1-3 lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều. Mô mềm (3) là những tế bào tròn hoặc hơi tròn, to, có màng mỏng, ở giữa rỗng. Các bó libe gỗ (4) xếp theo vòng, mỗi bó gồm một đám mô cứng (5) và mạch gỗ lớn (6). Hình 3.4: Đặc điểm vi phẫu cuống lá cây Rau má Chú thích: 1. Biểu bì. 2. Mô dày. 3. Mô mềm. 4. Libe. 5. Mô cứng. 6. Mạch gỗ. 3.1.5. Đặc điểm bột dược liệu Bột màu xám. Mảnh mô mềm thân và lá tế bào có hình đa giác gần tròn, vách mỏng. Mảnh biểu bì tế bào gần đa giác, lỗ khí kiểu dị bào. Sợi khoang rộng. Tế bào mô cứng hình đa giác thuôn dài hoặc một đầu nhọn. Tinh thể calci oxalat kích thước lớn. Mảnh mạch xoắn, mạch vạch. 24
  33. Hình 3.5: Đặc điểm bột dược liệu Chú thích: 1. Mảnh mô mềm. 2. Đám tinh bột. 3. Mảnh. 4, 5. Mảnh vạch. 6. Mảnh mạch xoắn. 7. Sợi. 8. Mảnh biểu bì mang lỗ khí. 3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học 3.2.1. Kết quả định tính các nhóm chất bằng phương pháp hóa học Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá cây Rau má bằng phản ứng đặc trưng được trình bày ở Bảng 3.1. 25
  34. STT Tên nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết luận 1 Alcaloid Phản ứng với thuốc thử Mayer + Phản ứng với thuốc thử + Có Dragendorff 2 Saponin Hiện tượng tạo bọt +++ Có Phản ứng với H2SO4 đậm đặc + 3 Flavonoid Phản ứng với hơi amoniac ++ Có Phản ứng dung dịch FeCl3 5% ++ 4 Coumarin Phản ứng đóng và mở vòng + Có lacton 5 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Không 6 Acid hữu cơ Phản ứng với Na CO giải 2 3 + Có phóng CO2 7 Tanin Phản ứng với dung dịch gelatin - Không 8 Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling - Không Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Rau má bằng phương pháp hóa học. Ghi chú: (-) âm tính, (+) dương tính, (+++) dương tính rõ. Nhận xét: Bằng các phản ứng hóa học sơ bộ nhận thấy dược liệu Rau má thu hái ở tỉnh Hải Dương có các nhóm hợp chất: alcaloid, saponin, flavonoid, coumarin, acid hữu cơ. 3.2.2. Kết quả chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá cây Rau má 3.2.2.1. Chiết các phân đoạn từ lá cây Rau má Mẫu lá cây Rau má (1,5 kg) được ngâm chiết bằng dung môi EtOH 70% (3 lần, mỗi lần 8 L), sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40℃ trong vòng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 120 g cao chiết tổng ethanol. 26
  35. Lấy 100 g cao chiết phân tán trong nước cất (600 mL) và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 600 mL). Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng n-hexan (33,8 g) và ethyl acetat (58,9 g). Mẫu lá cây Rau má (1,5 kg) Chiết siêu âm 40℃ trong 30 phút Dung môi ethanol 70% (3 lần, mỗi lần 8 L) Dịch chiết ethanol Lọc, cất thu hồi dung môi Cao chiết tổng ethanol (120 g) Lưu làm đối chiếu (20 g) Chiết phân đoạn (100 g) 1.Hòa tan trong 600 mL nước 2.Chiết lần lượt bằng dung môi n-hexan, EtOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 600 mL) 3.Cất loại dung môi bằng áp suất giảm Cao chiết n-hexan (33,8 g) Cao chiết etyl acetat (58,9 g) Hình 3.6: Sơ đồ chiết xuất các hợp chất từ lá cây Rau má 3.2.2.2. Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột Tiến hành phân tách phân đoạn dịch chiết EtOAc (45,0 g) trên cột sắc ký silicagel (Φ85 mm × 90 mm) với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexan:EtOAc (5:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 mL) và tiếp sau là CHCl3:MeOH (10:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 500 mL) thu được 5 phân đoạn 27
  36. ký hiệu là M1 ~ M5. Từ phân đoạn M1 (8,3 g), chạy sắc ký cột silicagel (Φ45 mm × 350 mm) với hệ pha động CHCl3:MeOH (10:1; 6:1; 3:1, v/v, 2,5 L) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn là M1.1 ~ M1.3. Phân tách phân đoạn nhỏ M1.1 (2,6 g) bằng sắc ký cột pha thường sử dụng hệ dung môi rửa giải CHCl3:MeOH (15:1, v/v, 1,5 L) thu được 1 hợp chất ký hiệu là RM1 (21 mg). Phân tách phân đoạn nhỏ M1.2 (3,1 g) bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi MeOH:H2O (3:1) thu được 1 hợp chất ký hiệu là RM2 (26 mg). Tiến hành triển khai phân tách trên sắc ký cột pha thường phân đoạn M1.3 (2,5 g) với hệ dung môi rửa giải CHCl3:MeOH (5:1) thu được hợp chất RM3 (29 mg). 28
  37. Sắc ký cột silicagel (Φ85 mm × 90 mm) Cắn chiết etyl acetat (45 g) n-hexan:EtOAc (5:1 → 1:1, v/v, 600 mL) CHCl : MeOH 3 (10:1 → 1:1, v/v, 500 mL) M1 (8,3 g) M2 M3 M4 M5 Sắc ký cột silicagel (Φ45 mm × 350 mm) CHCl3:MeOH (10:1; 6:1; 3:1, v/v, 5L) M1.1 (2,6 g) M1.2 (3,1 g) M1.3 (2,5 g) CHCl3:MeOH CHCl3:MeOH MeOH:H2O (3:1) (15:1, v/v, 1,5 L) (5:1) RM1 (21 mg) RM2 (26 mg) RM3 (29 mg) Hình 3.7: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Rau má 3.2.3. Kết quả xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được Hợp chất RM1: 3,4-Dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranosid Chất bột, màu trắng. 31 Độ quay cực [α ] D : -26 (c 0,4, MeOH). tnc = 195-196℃. Công thức phân tử C14H20O8, M = 316. Phổ ESI−MS (Phụ lục 2) 29
  38. Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất RM1 và hợp chất tham khảo [30, 31] X(a,b) RM1(a,b) RM1(a,c) X(a,c) C DEPT δC δC δH δH 1 C 135,1 154,0 - - 2 CH 113,6 104,1 6,85 (d, J = 2,0 Hz) 6,94 (brs) 3 C 149,3 146,1 - - 4 C 150,3 151,2 - - 5 CH 121,7 114,0 6,88 (d, J = 8,5 Hz) 6,84 (d, J = 8,0 Hz) 6,69 (dd, J = 2,0 Hz, 6 CH 113,6 109,4 8,5 Hz) 6.88 (brd, J = 8,0 Hz) 3-OCH3 CH3 56,5 57,2 3,81(s) 3,80 (s) 4-OCH3 CH3 56,5 56,6 3,84(s) 3,83 (s) 1-O- Glc - - 1ꞌ CH 104,7 103,5 4,81 (d, J = 7,5 Hz) 4,31 (d, J = 7,9 Hz) 3.20 (dd, J = 8,5, 8,0 2ꞌ CH 75,1 75,0 - Hz) 3,34 (dd, J = 8,3, 6,5 3ꞌ CH 78,2 78,1 - Hz) 4ꞌ CH 71,7 71,6 3,69(dd, J = 5,0 Hz, 5ꞌ CH 78,0 78,2 12,5 Hz) 3.27 (m) 3,93(dd, J = 2,5 Hz, 3,67 (dd, J = 12,0, 5,4 6ꞌ CH2 62,8 62,6 12,5 Hz) Hz) (a) (b) (c) đo trong CD3OD, 125 MHz, 500 MHz, X là hợp chất tham khảo [30, 31]. Hợp chất RM1 thu được dưới dạng bột màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của RM1 xuất hiện 3 tín hiệu proton tại δH 6,88 (1H, d, J = 8,5 Hz), 6,85 (1H, 30
  39. d, J = 2,0 Hz) và 6,69 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz) đặc trưng của một vòng thơm có hệ proton dạng ABX một proton anome tại δH 4,81 (1H, d, J = 7,5 Hz) gợi ý sự có mặt của 1 phân tử đường và tín hiệu của hai nhóm methoxy tại δH 3,81 (3H, s) và 3,84 (3H, s). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của RM1 xuất hiện tín hiệu của 14 carbon, bao gồm 6 carbon tại δC 103,5 (C-1ꞌ), 75,0 (C-2ꞌ), 78,1 (C-3ꞌ), 71,6 (C-4ꞌ), 78,2 (C-5ꞌ) và 62,6 (C-6ꞌ) gợi ý sự có mặt của 1 phân tử đường glucopyranosyl; 6 carbon tại δC 154,0 (C-1), 104,1 (C-2), 146,1 (C-3), 151,2 (C-4), 114,0 (C-5), 109,4 (C-6) đặc trưng của vòng thơm và 2 carbon oxymethyl tại δC 57,2 (3- OCH3) và 56,6 (4-OCH3). Số liệu phổ của hợp chất RM1 khá giống với số liệu phổ của hợp chất 3,4-dimethoxyphenyl-1-O-β-D-(6′-sulpho)-glucopyranosid nhưng có sự khác biệt về độ chuyển dịch hóa học của C-5′ (ΔδC +2,2 ppm) và C-6′ (ΔδC ‒5,4 ppm), cho thấy sự vắng mặt của nhóm (6′-sulpho) ở hợp chất RM1. Mặt khác, số liệu phổ 13C-NMR [103,5 (C-1ꞌ), 75,0 (C-2ꞌ), 78,1 (C-3ꞌ), 71,6 (C-4ꞌ), 78,2 (C-5ꞌ) và 62,6 (C-6ꞌ)] cho thấy sự có mặt của một đơn vị đường D-glucopyranosid trong hợp chất RM1. Từ các dữ liệu phổ nêu trên, kết hợp so sánh với dữ liệu phổ hợp chất tham khảo [30, 31], cho phép khẳng định hợp chất RM1 là 3,4-dimethoxyphenyl-1-O-β-D-glucopyranosid. Hình 3.8: Cấu trúc hợp chất RM1 Hợp chất RM2: 3,3’-Di-O-metyl acid 4-O-α-L-rhamnosid-ellagic Chất rắn, màu trắng. tnc = 186-187℃. Rf = 0,30 (TLC silicagel, CH2Cl2/MeOH: 9/1, v/v). ESI-MS: m/z 475 [M-H]-. (Phụ lục 3) 31
  40. Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của hợp chất RM2 và hợp chất tham khảo [32] Y(a,b) RM2(a,b) RM2(a,c) Y(a,c) C DEPT δC δC δH δH 1 C 110,6 111,8 - - 2 C 138,0 141,0 - - 3-OCH3 C 147,1 141,7 4,07 (s) 4,07 (s) 4 C 153,1 150,1 - - 5 CH 112,7 111,6 7,79 (s) 7,73 (s) 6 C 115,1 114,1 - - 7 C 159,8 158,3 - - 1’ C 110,5 110,8 - - 2’ C 138,0 141,4 - - 3’-OCH3 C 141,5 140,1 4,06 (s) - 4’-OH C 149,5 152,7 - 4,12 (s) 5’ CH 112,4 111,5 7,53 (s) 7,49 (s) 6’ C 113,8 112,5 - - 7’ C 159,7 158,1 - - 5,47 (d, J = 1,2 1’’ CH 100,8 99,7 5,59 (br s) Hz) 2’’-OH CH 70,6 70,0 3,97 (br s) 4,03 (br) 3,84 (dd, J = 9,4, 3 3’’-OH CH 70,7 71,4 3,35 (m) Hz) 4’’-OH CH 72,5 70,2 3,53 (m) 3,30 (t, J = 9,4 Hz) 5’’ CH 70,8 70,3 3,72 (m) 3,50 (m) 1,15 (d, J = 6,0 1,15 (d, J = 6,0 6’’ CH3 18,6 17,8 Hz) Hz) (a) đo trong DMSO, (b) 125 MHz, (c) 500 MHz, Y là hợp chất tham khảo [32]. Hợp chất RM2 được phân lập dưới dạng chất rắn, màu trắng, điểm nóng chảy 186-187℃. Phổ khối ESI-MS(-MS) cho pic ion phân tử deproton hóa ở 32
  41. m/z 475[M-H]-. Phân tích phổ 1D-NMR của RM2 cho thấy hợp chất này cũng là một dẫn chất của acid ellagic với các tín hiệu của 2 nhóm carboxylic tại δC 158,1 (C-7’); 158,3 (C-7) và 12 tín hiệu carbon aromatic, trong đó có 2 nhóm methyl vòng thơm ở [δC 111,6 (C-5); δH 7,79 (H-5) và δC 111,5 (C-5’); δH 7,53 (H-5’) và 10 carbon bậc 4. Trên phổ 1H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm methoxy tại δH 4,06 (3’-OCH3) và 4,06 (3-OCH3). Proton anome của đường glucopyranose xuất hiện dưới dạng broad singlet, cho phép xác định đây là đường α-L-rhamnopyranoside. Phân tích phổ HMBC cho thấy nhóm methoxy tại δH 4,06 (3’-OCH3) tương tác với C-3’ (δC 140,1) và nhóm methoxy ở 4,07 (3-OCH3) thể hiện tương tác với C-3 (δC 141,7). Điều này cho thấy nhóm hydroxy tại C-3 và C-3’ của khung acid ellegic đã bị methyl hóa. Ngoài ra, nhóm rhamnopyranose được xác định liên kết tại C-4 từ tương tác của proton anomeric H-1’’ (δH 5,59) với C-4 (δC 150,1) trên phổ HMBC. Kết hợp các phương pháp phổ 1D-NMR, 2D-NMR và so sánh với tài liệu đã được công bố [32], cấu trúc của hợp chất RM2 được xác định là 3,3’- di-O-methylellagic acid 4-O-α-L-rhamnopyranosid. Hình 3.9: Cấu trúc hợp chất RM2 Hợp chất RM3: Màu đỏ tía, dạng keo. 25 Rf = 0,2 (DCM:MeOH:H2O = 4:1:0,1), [α]D = +14° (MeOH, c 0,1). Công thức phân tử C15H14O6. 33
  42. Phổ ESI−MS (Phụ lục 4) Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của hợp chất RM3 và hợp chất tham khảo [33] Z(a,b) RM3(a,b) RM3(a,c) Z(a,c) C DEPT δC δC δH δH 2 CH 82,9 82,9 4,58 (d, J = 8 Hz) 4,55 (d, J = 7,4) 3,96 (ddd, J = 5,5, 3 CH 68,8 68,9 4,00 (m) 7,5, 8,1 Hz) a: 2,85 (dd, J = 5,5, a: 2.84 (dd, J = 15,9, 5,5 Hz) 5,5 Hz) b: 2,52 (dd, J = 8, 8 b: 2.84 (dd, J = 15,9, 4 CH2 28,5 28,5 Hz) 8,0 Hz) 5 C 156,9 157,9 - - 6 CH 95,5 96,4 5,87 (d, J = 2,5 Hz) 5,84 (d, J = 2,2 Hz) 7-OH C 157,6 157,6 - - 8 CH 96,3 95,6 5,94 (d, J = 2,5 Hz) 5,91 (d, J = 2,2 Hz) 9 C 157,8 156,9 - - 10 C 100,8 100,9 - - 1’ C 132,3 - - 2’ CH 115,3 116,2 6,85 (d, J = 2 Hz) 6,82 (d, J = 1,9 Hz) 3’-OH C 146,2 146,3 - - 4’-OH C 146,2 146,3 - - 6,73 (dd, J = 2,2 5’ CH 116,1 115,3 Hz) 7,65 (d, J = 8,2 Hz) 6,77 (dd, J = 2, 6,5 6,70 (dd, J = 8,2 1,9 6’ CH 120,0 120,1 Hz) Hz) (a) (b) (c) đo trong CD3OD, 125 MHz, 500 MHz, Z là hợp chất tham khảo [33]. Trên phổ 13C-NMR và DEPT cho biết phân tử RM3 có 15 carbon đặc trưng cho khung flavan-3-ol bao gồm 1 nhóm methylen (1×CH2), 7 nhóm methin (7×CH) và 7 carbon bậc 4 (7×Cq). Trên phổ 1H-NMR xuất hiện 5 tín 34
  43. hiệu proton ở vòng thơm trong đó có 2 tín hiệu doublet ở δH 5,94 và 5,86 có cùng hằng số tương tác nhỏ (J = 2,2 Hz) của hai proton thơm ở vị trí meta với nhau. Điều này chứng minh vòng A đã bị thế ở hai vị trí C-5 và C-7. Các tín hiệu doublet ở δH 6,85 (1H, d, J = 2 Hz) và δH 6,77 (1H, d, J = 6,5 Hz) cùng với tín hiệu doublet kép tại δH 6,73 (1H, dd, J = 6,5; 2 Hz) cho biết vòng B có nhóm thế C-3’ và C-4’. Hai proton H-2 và H-3 nằm ở vị trí trans với nhau được xác định qua hằng số tách lớn của hai tín hiệu δH 4,58 (1H, d, J = 8 Hz, H-2) và δH 4,0 (1H, m, H-3). Từ dữ liệu phân tích phổ nêu trên và so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất trong tài liệu tham khảo [33] có thể kết luận cấu trúc của RM3 chính là catechin. Hình 3.10: Cấu trúc hợp chất RM3 3.3. Bàn luận Trong quá trình thực nghiệm, đề tài đã sử dụng mẫu nghiên cứu là cây Rau má (Centella asiatica L.) thu hái tại tỉnh Hải Dương. Nghiên cứu này đã đi sâu mô tả chi tiết hơn về đặc điểm hình thái thực vật, đặc biệt về thân, lá, hoa với những hình ảnh rõ nét, trong khi các nghiên cứu trước đây chỉ được trình bày bằng lời và bản vẽ [3, 6, 8]; đồng thời xác định được tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Centella asiatica L Kết quả đạt được trên đây góp phần phân biệt loài Centella asiatica L. với các loài khác trong chi Centella, là nghiên cứu bước đầu làm tiền đề cho mục đích nghiên cứu sâu hơn, góp phần xây dựng và hoàn thiện tiêu chuẩn của chuyên luận về 35
  44. dược liệu này trong Dược điển Việt Nam. Về đặc điểm thực vật, có một số khác biệt của loài Centella asiatica L. so với các loài khác có thể thấy như: thân thảo, không rỗng, chia nhiều mấu, cuống lá dạng ống rỗng, lá hình thận, mép lá khía tai bèo, đài hoa tiêu giảm. Nghiên cứu đã tiến hành phân tích đặc điểm vi phẫu, soi bột toàn cây. Kết quả nghiên cứu cho thấy, các đặc điểm vi học của cây mang các đặc điểm chung đặc trưng của thực vật họ Apiaceae. Vi phẫu thân, cuống lá bắt màu khá tốt, có thể quan sát rõ các lớp tế bào trên kính hiển vi. Các hình ảnh về cấu tạo vi học của cây rất rõ nét, có những mức phóng đại khác nhau, có thể dùng làm tư liệu cho việc tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm xác định mẫu cây Rau má; đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân biệt và so sánh các mẫu Rau má có trên thị trường, tránh dược liệu kém chất lượng. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phương pháp hóa học là một trong các phương pháp hiện đang được áp dụng chủ yếu ở Việt Nam, bởi tính thuận tiện và giá thành hóa chất tương đối rẻ. Kết quả định tính được một số nhóm chất có trong cây Rau má, thu hái từ Hải Dương phù hợp với các nghiên cứu trước đó tại Việt Nam và trên thế giới là: alcaloid, saponin triterpenoid, flavonoid, coumarin, acid hữu cơ. Kết quả này phù hợp với các tài liệu đã công bố trước đó về thành phần hóa học của cây Rau má. Chiết xuất và phân lập: Phương pháp chiết xuất bằng EtOH 70% sử dụng thiết bị chiết siêu âm là một phương pháp tiết kiệm thời gian và chi phí, cho hiệu suất chiết cao. Phân lập các chất bằng sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel pha thường và pha đảo, cùng các hệ dung môi khác nhau được tham khảo từ các nghiên cứu trước đó. Kết quả phân lập được 3 chất: 3,4-Dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranosid, 3,3’-Di-O-metyl acid 4-O-α-L-rhamnosid-ellagic, catechin. Đây là 3 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ cây Rau má. Trong đó catechin có tác dụng bảo vệ DNA tránh khỏi sự tổn thương do oxy hóa, từ 36
  45. đó giúp hỗ trợ nguồn lực cho các nghiên cứu lâm sàng về điều trị các bệnh liên quan đến tổn thương DNA do oxy hóa [33]. Các nghiên cứu của đề tài chỉ mới là bước đầu, tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sâu hơn về Rau má; bổ sung tư liệu cho việc sử dụng cây làm thuốc trong dân gian, cũng như phục vụ cho lĩnh vực kiểm nghiệm dược liệu sau này. 37
  46. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau một thời gian thực hiện, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả như sau: - Đã mô tả được đặc điểm hình thái thực vật và xác định được tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Centella asiatica L., thuộc họ Hoa tán (Apiaceae). - Đã mô tả được đặc điểm vi phẫu thân, lá, cuống lá và đặc điểm bột toàn cây của loài nghiên cứu góp phần tiêu chuẩn hóa loài này. - Đã định tính và xác định được một số nhóm chất có trong mẫu cây Rau má là: alcaloid, saponin triterpenoid, flavonoid, coumarin, acid hữu cơ. - Đã chiết xuất, phân lập bằng phương pháp sắc ký cột thu được 3 hợp chất có trong cây Rau má. - Đã xác định được cấu trúc hợp chất phân lập được: Thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ tử ngoại - khả kiến, phổ khối, và phổ cộng hưởng hạt nhân, đã xác định được cấu trúc 3 hợp chất vừa phân lập được đó là: 3,4-Dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranosid, 3,3’-Di-O- metyl acid 4-O-α-L-rhamnosid-ellagic, catechin. Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu phân lập các chất để có thể xác định thêm các thành phần khác từ loài Centella asiatica L - Thử đánh giá tác dụng kháng khuẩn của các nhóm chất và các chất phân lập được, cũng như của dịch chiết loài Centella asiatica L. này. 38
  47. TÀI LIỆU THAM KHẢO • Tài liệu Tiếng Việt: 1. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học, tr. 293-296. 2. Bộ Y tế (2018), Dược điển Việt Nam V Tập II, NXB Y học, tr. 1299-1300. 3. Võ Văn Chi (2006), Từ điển Cây thuốc Việt Nam, tập II, NXB Y học, tr. 367-369. 4. Trương Thị Đẹp (2007), Thực vật Dược, NXB Giáo dục, tr. 62-77. 5. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam tập III, NXB Trẻ, tr. 475-477. 6. Đỗ Tất Lợi (2007), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Hồng Đức, tr. 631-633. 7. Đỗ Huy Bích và cs (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập II, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr. 582-586. 8. Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học tập 1, NXB Y Học, tr. 237-240. 9. Vũ Đức Lợi, Lê Thị Thu Hường (2017), Thực hành: Thực vật - Dược liệu - Dược học cổ truyền, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.65-90. 10. Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 275-277. 11. Trần Văn Lộc cùng các cộng sự (2016) “Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ Cây Rau má Centella asiatica (L.) Urban, họ Hoa tán [Apiaceae]”, Luận án Tiến sĩ Hóa học. 12. Võ Thị Quỳnh Như, Trần Văn Lộc, Trần Thị Phương Thảo, Nguyễn Tuấn Thành, Lê Thị Thu Hà, Trần Văn Sung, “Thành phần hóa học của cây Rau má [Centella asiatica (L.) Urban] má thu hái tại thành phố Hồ Chí Minh”, Tạp chí Hóa học số 54(3), tr.373-376.
  48. 13. Nguyễn Ngọc Hạnh, Lê Ngọc Thạnh (2011), “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Rau má”, Tạp chí Dược học số 428, tr. 27-30. 14. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh. 15. Nguyễn Thị Thu Hoài (2003), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Rau má [Centella asiatica (L.) Urban]”, Luận văn thạc sĩ Dược học. 16. Võ Thị Quỳnh Như, Lê Thị Thu Hà, Trần Thị Phương Thảo, Trần Văn Lộc (2016), “Hoạt tính bảo vệ gan của axit asiatic tách từ cây Rau má [Centella asiatica (L.) Urban]”, Tạp chí Hóa học số 54(5), tr. 540-541. 17. Ung Thị Như Tuyền (2012), “Nghiên cứu chiết tách và chuyển hóa một số dẫn xuất của Acid Asiatic từ cây Rau má [Centella Asiatica (L.) Urban]”, Luận văn thạc sĩ Hóa học. • Tài liệu Tiếng Anh: 18. Angiosperm Phylogeny Group (2009), “An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III”, Botanical Journal of the Linnean Society, 161(2), tr. 105- 121. 19. Alqahtani A., Cho J. L., Wong K. H., Li K. M., Razmovski-Naumovski, V., & Li G. Q (2017) , “Differentiation of three Centella species in Australia as inferred from morphological characteristics, ISSR molecular fingerprinting and phytochemical composition”, Frontiers in plant science, 8, tr. 1980. 20. Naidoo D. B., Chuturgoon A. A., Phulukdaree A., Guruprasad K. P., Satyamoorthy K., & Sewram V. (2017), “Centella asiatica modulates cancer cachexia associated inflammatory cytokines and cell death in leukaemic THP-1 cells and peripheral blood mononuclear cells (PBMC’s)”, BMC complementary and alternative medicine, 17(1), tr. 1-11.
  49. 21. Gohil K. J., Patel J. A., Gajjar A. K. (2010), “Pharmacological review on Centella asiatica: a potential herbal cure-all”, Indian journal of pharmaceutical sciences, 72(5), tr. 546. 22. Chong N. J., Aziz Z. (2013), “A systematic review of the efficacy of Centella asiatica for improvement of the signs and symptoms of chronic venous insufficiency”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2013. 23. Puttarak P., Dilokthornsakul P., Saokaew S., Dhippayom T., Kongkaew C., Sruamsiri R., Chaiyakunapruk N (2017), “Effects of Centella asiatica (L.) Urb. on cognitive function and mood related outcomes: A Systematic Review and Meta-analysis”, Scientific reports, 7(1), tr. 1-12. 24. Azerad R. (2016), “Chemical structures, production and enzymatic transformations of sapogenins and saponins from Centella asiatica (L.) Urban”, Fitoterapia, 114, tr. 168-187. 25. Bylka W., Znajdek-Awiżeń P., Studzińska-Sroka E., Brzezińska M. (2013), “Centella asiatica in cosmetology”, Advances in Dermatology and Allergology/Postȩpy Dermatologii I Alergologii, 30(1), tr. 46. 26. Bylka W., Znajdek‐Awiżeń P., Studzińska‐Sroka E., Dańczak‐Pazdrowska A., Brzezińska M. (2014), “Centella asiatica in dermatology: an overview”, Phytotherapy research, 28(8), tr. 1117-1124. 27. Hashim P., Sidek H., Helan M. H. M., Sabery A., Palanisamy U. D., Ilham, M. (2011), “Triterpene composition and bioactivities of Centella asiatica”, Molecules, 16(2), tr. 1310-1322. 28. Razali N. N. M., Ng C. T., Fong L. Y. (2019), “Cardiovascular protective effects of Centella asiatica and its triterpenes: a review”, Planta medica, 85(16), tr. 1203-1215. 29. Singh D., Singh P., Gupta A., Solanki S., Sharma E., Nema R. (2012),
  50. “Qualitative estimation of the presence of bioactive compound in Centella asiatica: an important medicinal plant”, International journal of life science and medical science, 2(1), tr. 5-7. 30. Zhang Y. M., Xu J., Xiao, L., Zeng, G. Z., Sun Z. H., Tan N. H. (2013), “A New Phenolic Glycoside from Chamaecyparis obtusa var. breviramea f. crippsii”, Molecules, 18(1), tr. 1255-1261. 31. You M., Xiong J., Zhao Y., Cao L., Wu S. B., Xia G., Hu J. F. (2011), “Glycosides from the methanol extract of Notopterygium incisum”, Planta Medica-Natural Products and MedicinalPlant Research, 77(17), tr. 1939. 32. El-Toumy S. A., Rauwald H. W. (2003), “Two new ellagic acid rhamnosides from Punica granatum heartwood”, Planta medica, 69(7), tr. 682-684. 33. Zor M., Aydin S., Güner N. D., Başaran N., Başaran A. A. (2017), “Antigenotoxic properties of Paliurus spina-christi Mill fruits and their active compounds”, BMC complementary and alternative medicine, 17(1), tr. 1-10. 34. Seevaratnam V., Banumathi P., Premalatha M. R., Sundaram S. P., Arumugam T. (2012), “Functional properties of Centella asiatica (L.): a review”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 4(5), tr. 8-14. 35. Abas F., Khatib A., Perumal V., Suppaiah V., Ismail A., Hamid M., Lajis N. H. (2016), “Metabolic alteration in obese diabetes rats upon treatment with Centella asiatica extract”, Journal of ethnopharmacology, 180, tr. 60- 69. 36. Prakash V., Jaiswal N. I. S. H. I. T. A., Srivastava M. (2017, “A review on medicinal properties of Centella asiatica”, Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 10(10), 69.
  51. 37. Azis H. A., Taher M., Ahmed A. S., Sulaiman W. M. A. W., Susanti D., Chowdhury S. R., Zakaria Z. A. (2017), “In vitro and In vivo wound healing studies of methanolic fraction of Centella asiatica extract”, South African Journal of Botany, 108, tr. 163-174. 38. Kumari S., Deori M., Elancheran R., Kotoky J., Devi R. (2016), “In vitro and in vivo antioxidant, anti-hyperlipidemic properties and chemical characterization of Centella asiatica (L.) extract”, Frontiers in pharmacology, 7, tr. 400. 39. Chivapat S., Chavalittumrong P., Tantisira M. H. (2011), “Acute and sub- chronic toxicity studies of a standardized extract of Centella asiatica ECa 233”, Thai Journal of Pharmaceutical Sciences, 35, tr. 55-64. 40. Sudhakaran M. V. (2017), “Botanical Pharmacognosy of Centella asiatica (Linn.) Urban”, Pharmacognosy Journal, 9(4). • Website 41. thuoc/Centella_asiatica_1696 42.