›

Khóa luận Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thach Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

pdf 56 trang thiennha21 13/04/2022 6040
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thach Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_anh_huong_cua_chat_huu_co_den_sinh_truo.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thach Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

  1. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐỖ THỊ NGỌC Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT HỮU CƠ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY SINH KHỐI IN VITRO LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: K48 - CNSH Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2016 - 2020 Giảng viên hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Xuân Vũ 2. TS. Nguyễn Văn Hồng Thái Nguyên – năm 2020
  2. i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực tập và hoàn thành luận văn, em đã nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân. Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm và các thầy cô trong khoa đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện và chia sẻ những kinh nghiệm của mình để giúp đỡ em trong quá trình thực tập tốt nghiệp. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy TS. Nguyễn Xuân Vũ và thầy TS. Nguyễn Văn Hồng đã luôn tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp của mình của mình. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất cả về vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành kì thực tập của mình, cảm ơn bạn bè đã luôn ở bên cạnh cho tôi nhưng lời khuyên và động viên chân thành nhất. Em xin chân thành cảm ơn. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực tập Đỗ Thị Ngọc
  3. ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT BAP: 6-Benzylaminopurine CS: Cộng sự CT: CT VC: Coefficient of Variation (Hệ số biến động) ĐC: ĐC HSNC: Hệ số nhân chồi KC: Knudson C HSN: Hệ số nhân HCHC: Hợp chất hữa cơ LSD: Least Singnificant Difference Test (Sai số trung bình nhỏ nhất có ý nghĩa) MS: Murashige and Skoog’s NAA: Naphlene axetic acid ND: Nước dừa SD: Sắn dây THT: Than hoạt tính TB: Trung bình TQ: trùng quế VW: Vacin & Went
  4. iii DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía 24 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía 26 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía 27 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của casein đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía 30 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của Myo-inositol đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía 32 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía 33 Bảng 4.7: Ảnh hưởng của tảo spirulina đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía 35
  5. iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC BẢNG iii MỤC LỤC iv Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 3 1.2.1. Mục tiêu tổng quát 3 1.2.2. Mục tiêu cụ thể 3 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài 3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Tổng quan về lan Thạch Hộc Tía 4 2.1.1. Tên khoa học 4 2.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố 4 2.1.3. Giá trị dược liệu của lan Thạch Hộc Tía 5 2.1.4. Giá trị kinh tế 7 2.2. Ảnh hưởng của các chất hữu cơ quá trình nuôi cấy sinh khối lan Thạch Hộc Tía 8 2.5. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Thạch Hộc Tía 13 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu 18 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu 18 3.3. Điều kiện nuôi cấy 18 3.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 18 3.5. Nội dung nghiên cứu 19 3.6. Phương pháp nghiên cứu 20
  6. v 3.6.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía 20 3.6.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía 21 3.7. Chỉ tiêu đánh giá 23 3.8. Phương pháp xử lí số liệu 23 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến khả năng sinh trưởng và tích lũy in vitro sinh khối của lan Thạch Hộc Tía 24 4.2. Kết quả ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía 26 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. 27 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của casein đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía 30 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Myo-inositol đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. 31 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. 33 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tảo spirulina đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. 35 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1. Kết luận 37 5.2. Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHẦN PHỤ LỤC 43
  7. 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong hàng thập kỉ qua con người đã hướng tới việc sử dụng thực vật để cung cấp các hợp chất thiên nhiên như: polysacarit, carbohydrate, protein, chất béo để sản xuất thuốc, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Theo WHO thì có tới 80% dân số có xu hướng sử dụng thực vật chứa dược chất để làm thuốc và chăm sóc cho sức khỏe. Do nhu cầu sử dụng của con người ngày càng tăng nên quá trình khai thác và thương mại hóa cũng vô cùng sôi nổi. Tuy nhiên vấn đề đặt ra ở đây việc khai thác và quá trình thương mại hóa không có kế hoạch dẫn đến các loài chứa dược chất bị giảm nhanh chóng về số lượng trong tự nhiên. Thêm vào đó việc biến đổi khí hậu tác động mạnh mẽ đến môi trường sống trong tự nhiên của chúng khiến số lượng của chúng giảm mạnh trong tự nhiên. Điều này buộc các nhà khoa học phải tính đến việc nghiên cứu tạo ra môi trường nhân tạo và điều kiện thuận lợi để nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm có thể đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày càng tăng của con người. Nuôi cấy mô tế bào thực vật được quan tâm và nghiên cứu từ những năm 1950. Việc nuôi cấy mô tế bào thực vật mang lại nhiều ưu điểm vượt trội so với canh tác ngoài tự nhiên như: thời gian nuôi cấy ngắn hơn, hạn chế được tác động của môi trường tự nhiên, tránh được ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, và tránh được việc nhiễm các hóa chất động hại như thuốc trừ sâu, thuốc bảo vệ thực vật Bên cạnh đó nhiều nghiên cứu cho rằng hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học tích lũy bên trong tế bào thực vật được nuôi cấy in vitro tương đương hoặc cao hơn nhiều so với cơ quan tích lũy của chúng bên ngoài tự nhiên. Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale Kimura et Migo) thuộc chi Thạch Hộc, họ Lan (Orchidaceae), phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng rừng có độ cao 1.000 - 3.400m so với mặt biển. Thạch Hộc Tía là loại dược liệu tốt và quý hiếm có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu. Trong Thạch Hộc Tía có khoảng 190 hợp chất, đặc biệt
  8. 2 có nhóm polysaccharides, Alkaloids là những nhóm hoạt tính chống oxi hóa có hiệu quả cao phòng và điều trị các bệnh về đường huyết, tim mạch và ung thư. Thạch Hộc được chế biến thành phong đấu giá xuất khẩu vào những năm 80 thế kỷ trước đạt mức 3.000 USD/kg. Một cây Thạch Hộc tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ. Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên thế giới về Thạch Hộc còn rất lớn với giá cao, đem lại lợi nhuận cho những người trồng và chế biến Thạch Hộc. Dự báo trong 10 năm tới thị trường nội địa cần tới 15.000 tấn/năm tương đương hàng chục tỉ USD. Tuy nhiên việc sản xuất loại dược liệu này từ trước tới nay chưa được quan tâm đầu tư thích đáng khiến Thạch Hộc Tía có nguy cơ bị tuyệt chủng và được đưa vào danh mục đỏ của “Sách đỏ Việt Nam”. Với giá trị to lớn của Thạch Hộc Tía, các nghiên cứu về bảo tồn, khai thác và phát triển loài lan này đã và đang được thực hiện mạnh mẽ. Trong đó việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống và sản xuất sinh khối, hợp chất tự nhiên từ lan Thạch Hộc Tía đã có những thành công nhất định. Nhiều nhà nghiên cứu đã công bố thành công trong việc sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng nhằm nâng cao hệ số nhân giống lan Thạch Hộc Tía [31], [ 24]. Bên cạnh đó cũng có nhiều kết quả nghiên cứu khác nhau trong việc sử dụng các chất hữu cơ (nước dừa, khoai tây, carot, ) với mục đích nhân giống lan Thạch Hộc Tía. Ngoài các công trình nghiên cứu về nhân giống lan Thạch Hộc Tía, các nghiên cứu về nhân sinh khối trên đối tượng này còn hạn chế. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu được công bố về ảnh hưởng của chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối lan Thạch Hộc Tía in vitro. Xuất phát từ thực tế trên, việc thực hiện “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thach Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” là cần thiết và có tính khả thi cao. Thành công của đề tài không những tăng cường khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối lan Thạch Hộc Tía in vitro mà còn giảm thiểu tác hại có thể có trong việc sản xuất sinh khối an toàn Thạch Hộc Tía in vitro xuất phát từ việc sử dụng chất điều tiết sinh trưởng tổng hợp, cung cấp nguồn sinh khối lan Thạch Hộc Tía sạch sử dụng với mục đích chăm sóc sức khỏe và làm đẹp cho con người.
  9. 3 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Xác định ảnh hưởng của chất hữu cơ đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối của lan Thạch Hộc Tía trong môi trường in vitro. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể Xác định được nồng độ của một số chất hữu cơ tự nhiên đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Xác định nồng độ tối ưu của một số chất hữu cơ tổng hợp đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Đề tài sẽ xác định được nồng độ ảnh hưởng của các loại chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía, bổ sung cơ sở khoa học cho việc sử dụng các hợp chất hữu cơ trong nuôi cây mô lan Thạch Hộc Tía nói riêng và nuôi cấy mô thực vật nói chung. Đồng thời kết quả của đề tài là nguồn tài liệu khoa học có giá trị có thể tham khảo cho các nghiên cứu trên đối tượng này trong tương lai. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Thực hiện đề tài nghiên cứu giúp cho sinh viên có cơ hội củng cố lại kiến thức cũ , học hỏi được những kiến thức mới, và tích lũy được kinh nghiệm cho bản thân. Kết quả của đề tài có thể dùng làm cơ sở khoa học cho quá trình nhân sinh khối các loài thực vật chứa dược chất quy mô lớn. Góp phần bảo tồn nguồn gene, cũng như thúc đẩy phát triển nuôi cấy cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học.
  10. 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về lan Thạch Hộc Tía Theo từ điển Bách khoa dược học của Việt Nam (1999) đã ghi “Thạch Hộc” (Dendrobium nobile Lindt) có tên khác là Kim Thạch Hộc [28]. Thạch Hộc sống phụ sinh trên thân gỗ hoặc trên các vách đá ở vùng rừng có độ ẩm cao. Hiện nay trên khắp thế giới có khoảng 1.400 loài Lan, ở Trung Quốc có khoảng 81 loài. Trong chi Thạch Hộc cũng có rất nhiều loài được dùng để chữa bệnh. Tại Trung Quốc, chi Thạch Hộc có khoảng 12 loài phụ và 14 loài chính, trong đó có tới 11 loài được xem là dược liệu quý. Đặc biệt, Thạch Hộc Tía là loài được đánh giá cao nhất và cũng có giá trị kinh tế lớn nhất. Tại Việt Nam cũng có nhiều loài Lan. Chúng được phân bố rộng rãi, trải dài từ Bắc vào Nam. Có nhiều loại sắp hoặc đã bị tuyệt chủng, một số khác thì đang được liệt vào sách đỏ cần phải được bảo tồn. Trong số những loài này, chúng ta cần kể đến loài lan Thạch Hộc Dendrobium nobile Lindl. Nó phân bố chủ yếu ở vùng trung du và miền núi phía Bắc, được nghiên cứu nhân giống nhằm mục đích làm thuốc. 2.1.1. Tên khoa học Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) là một loài thuộc chi Dendrobium, họ lan (Orchidaceae). 2.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố Đặc điểm hình thái Là cây phụ sinh trên thân gỗ hay vách đá, cao 30-50 cm, thường mọc thành bụi. Thân hơi dẹt, có rãnh dọc, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5-3 cm. Lá hình thuôn dài, phía cuống tù, gần như không cuống, ở đầu hơi cuộn hình nón, dài 12cm, rộng 2-3cm trên có 5 gân dọc. Lá mọc so le thành dãy đều ở hai bên thân. Hoa to màu hồng, mọc thành chùm trên những cuống dài, ở họng hoa có những điểm màu tím. Hoa rất đẹp, to, màu hồng hay điểm hồng. Cánh môi hình bầu dục nhọn, dài 4-5cm, rộng 3cm cuộn thành hình phễu trong hoa, ở nơi họng hoa điểm màu tía [5], [13].
  11. 5 Quả nang hình thoi, khi khô tự mở. Hạt nhiều, mùa hoa tháng 2-4, mùa quả: tháng 4-6 Đặc điểm phân bố Thạch Hộc được phân bố ở Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanma và nhiều nước vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [13]. Ở Trung Quốc chi Thạch Hộc chủ yếu phân bố ở các tỉnh: Chiết Giang, Quảng Tây, Hồ Nam, Vân Nam, Quý Châu. Thạch Hộc khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên đã cạn kiệt, cấm thu hái và buôn bán. Trong tự nhiên Thạch Hộc thường sinh trưởng trong môi trường có độ ẩm khoảng 70%, lượng mưa khoảng 900 – 1.500mm, nhiệt độ từ 12 – 18ºC. Do đó nó thường tập trung ở các phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và các vách đá chua. 2.1.3. Giá trị dược liệu của lan Thạch Hộc Tía Thành phần hóa học Trong Thạch Hộc có chất nhầy và chất ankaloit gọi là dendrobin khoảng 0,3% có CT thô C16H25O22. Theo báo cáo của Viện nghiên cứu y học, hệ dược học Bắc Kinh năm 1958 thì trong Thạch Hộc Dendrobium nolile có 0,05% ankaloit, không có saponin và không cho phản ứng tanin đới [13]. Tác dụng dược lý Năm 1936, hai tác giả Kinh Lợi Bâu và Lý Đăng Bảng đã báo cáo dùng cao Thạch Hộc chế bằng rượu 1ml = 4g dược liệu tiến hành thí nghiệm tác dụng giảm sốt thì thấy với liều 2,5ml trên 1kg thể trọng, tiêm vào màng bụng thỏ đã được gây sốt bằng dung dịch 0,03% trực trùng coli (2,3ml đối với 1kg thể trọng) không thấy có tác dụng giảm sốt [13]. Trên tràng thỏ cô lập, với nồng độ thấp (0,0001-0,5%) thì thấy có tác dụng kích thích, sự co bóp được tăng cường. Nhưng với nồng độ cao: 1-10% thì lại thấy tác dụng ức chế [13].
  12. 6 Đối với tim cô lập của loài cóc Bugo sp. (dùng dung dịch Locke-Ringer) bất kể nồng độ như thế nào đều thấy sử dụng ức chế co bóp. Hiện tượng ức chế này hình như liên quan với thần kinh phó giao cảm vì thuốc chế từ thạch học đều có tác dụng làm giảm ảnh hưởng của pilocacpin, atropin và adrenalin trên cơ ruột, trên tim. Tuy nhiên tác dụng ức chế đối với adrenalin có kém hơn. Khi tiêm dung dịch Thạch Hộc trên tim của loài cóc thấy dù nồng độ nào từ 0,01-10% đều không thấy ảnh hưởng [13]. + Tăng cường khả năng miễn dịch: Nghiên cứu về dược lý hiện đại cho biết, Thạch Hộc có tác dụng tốt về chống mệt mỏi và chống chịu ngạt oxy [13]. + Hệ gan lợi mật: Thạch Hộc có tác dụng lợi mật, tư dưỡng can âm, là dược thảo tốt điều trị các bệnh gan, mật, chữa trị viêm gan, viêm túi mật, sỏi mật [13]. + Kháng phong thấp: Thạch Hộc có khả năng tư dưỡng âm dịch, bôi trơn các khớp, giúp cho gân cốt khỏe, khớp nối thanh thoát, có hiệu quả tăng cường kháng phong thấp [13]. + Giảm đường huyết, mỡ máu: Kết quả nghiên cứu lâm sàng cho biết Thạch Hộc không những có hoạt tính tăng cường Insulin, đồng thời có khả năng giảm đường huyết giúp cho máu hoạt động bình thường, xúc tiến tuần hoàn, giãn huyết quản, giảm cholesterol và triglyceride [13]. + Kháng u bướu: Thạch Hộc có khả năng tiêu diệt một số tế bào ác tính của ung thư phổi, ung thư buồng trứng, bệnh máu trắng với hoạt tính kháng ung thư tương đối mạnh. Trong lâm sàng sử dụng Thạch Hộc rỉ sắt làm thuốc điều trị bổ sung các bệnh ung thư ác tính, cải thiện tình trạng của người bệnh, giảm nhẹ tác dụng phụ của các liệu pháp xạ trị, hóa trị, tăng sức miễn dịch, nâng cao chất lượng cuộc sống, kéo dài tuổi thọ [13]. + Bảo vệ mắt: Thạch Hộc có công năng dưỡng âm, là thảo mộc quý bảo vệ mắt, có hiệu quả tương đối tốt để chữa bệnh lòa của tuổi già, bảo vệ mắt cho trẻ em. + Tự dưỡng da: Khi vào tuổi trung niên, âm dịch sa sút, da lão hóa, nám da và nhăn da. Thạch Hộc có chất nhờn, có tác dụng tư nhuận dinh dưỡng da [13].
  13. 7 + Kháng suy não: Thạch Hộc là thần dược có tác dụng trẻ hóa cơ thể. Trong Thạch Hộc có nhiều nguyên tố vi lượng quý có tác dụng chống lão hóa tốt hơn nhiều so với các loại thuốc khác [13] + Thạch Hộc ngoài tác dụng trên thì nó còn được sủ dụng như một loại thực phẩm bổ vào để bồi bổ sức khỏe. Chẳng hạn như nấu súp với hồng sâm, bách sa có tác dụng lợi phổi, sinh tân. Bên cạch đó với những kĩ thuật hiện đại ngày nay Thạch Hộc còn được sự dụng dưới dạng trà thảo mộc, cháo dinh dưỡng ăn liền bổ sung Thạch Hộc. Ngoài ra ngành y học phát triển không ngừng thì hiện nay cũng có rất nhiều dòng sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ Thạch Hộc. Chúng là những sản phẩm bổ dưỡng và cũng an toàn cho sức khỏe, do đó bạn có thể tham khảo và sử dụng. 2.1.4. Giá trị kinh tế Trong các loại hoa phong lan được trồng tại Việt Nam thì lan công nghiệm cho hiệu quả kinh tế tương đối cao. Giá của một chậu lan có thể cho thu nhập từ 100.000 1.000.000 đồng/cây [4]. Giá xuất khẩu vào những năm 80 đạt mức 3.000 USD/kg. Ở Đài Loan giá từ 1.000 -3.000USD/kg. Ở Trung Quốc khoảng 30 đến 60 triệu VNĐ/kg. Giá 1 cây Thạch Hộc tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ, 1 ha trồng 1 triệu cây Thạch Hộc, có thể thu được 25-30 tỷ trong 3 năm. Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên thế giới về Thạch Hộc còn rất lớn với giá cao, đem lại siêu lợi nhuân cho những người trồng và chế biến Thạch Hộc. Nhu cầu thị trường Trung Quốc hiện nay cần khoảng 2.000 tấn/năm, nhưng mới sản xuất được 200 tấn/năm. Dự báo trong 10 năm tới thị trường nội địa cần tới 15.000 tấn/năm tương đương hàng chục tỉ USD [13]. Với loài hoa chủ lực là Dendrobium, Thái Lan xuất khẩu đạt doanh thu gần 600 triệu USD mỗi năm. Theo thống kê của Bộ Nông nghiệm Hoa Kỳ, năm 2000, tổng sản lượng bán ra thị trường tương đương 100 nghìn USD. Bên cạnh đó, ở các nước phát triển như: Anh, Mỹ, Đức, Ý đều nhập khẩu rất nhiều phong lan [26].
  14. 8 2.2. Ảnh hưởng của các chất hữu cơ quá trình nuôi cấy sinh khối lan Thạch Hộc Tía Trong nuôi cấy sinh khối thực vật nói chung và lan Thạch Hộc Tía nói riêng chịu sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau: yếu tố vật lý (nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, ) và yếu tố hóa học (thành phần môi trường nuôi cấy). Trong thành phần môi trường nuôi cấy có nhiều yếu tố khác nhau: khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, chất điều tiết sinh trưởng và chất hữu cơ. Trong đó, chất hữu cơ là có vai trò rất quan trong và được sử dụng nhiều trong nuôi cấy sinh khối, đặc biệt là nuôi cấy sinh khối các dòng thực vật sử dụng làm thuốc, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm. Các chất hữu cơ đã và đang được nghiên cứu phục vụ trong nuôi cấy mô tế bào gồm * Nước dừa Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cho biết trong nước dừa có nhiều protein, carbohydrate, calcium, các hợp chất sắt, đường, và một số vitamin như thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic. Các chất này có thể đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy hoạt động tăng trưởng và phân chia tế bào. Tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận. Ngoài ra nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 - 20% thể tích môi trường, kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi [9]. Nước dừa là thành phần dinh dưỡng hữu cơ được bổ sung trong nhiều môi trường nuôi cấy mô đặc biệt đối với các loài phong lan. Cụ thể như sau: - Trong nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ liên quan đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) in vitro nhằm nghiên cứu về ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi lan hài hồng. Trong các nồng độ nước dừa được khảo sát, nồng độ 200 ml/l, thích hợp nhất cho sự tạo chồi, tạo lá và tăng trưởng chiều cao của chồi. Khi tăng nồng độ nước dừa lên trên 200 ml/l, quá trình tạo chồi bị hạn chế. Trong nghiên cứu này, số lượng chồi đạt cao nhất (3,2 lầncấy) ở CT có bổ sung 200 ml/l nước dừa. Từ kết quả trên có thể thấy, bổ sung nước dừa có khả năng kích thích quá trình sinh
  15. 9 trưởng và khả năng tạo chồi của lan hài hồng nuôi cấy in vitro. Điều này được giải thích bởi trong các dịch chiết này có chứa các chất có lợi cho sự sinh trưởng phát triển của cây như các amino acid, các loại vitamin, đường và các chất kích thích sinh trưởng (nhóm cytokinin), cũng như các chất khoáng vô cơ như photpho, magiê, kali và natri [2]. - Kết quả cho thấy, khi môi trường không bổ sung ND (CT1), các chỉ tiêu số lá TB (trung bình)/chồi và chiều dài lá TB chỉ đạt lần lượt là 2,27 lá và 1,4cm. Khi bổ sung ND với các nồng độ 5% (CT2), các chỉ tiêu số lá và chiều lá đã tăng rõ rệt với kết quả là 3,1 lá; 1,6cm. Tốc độ lớn của chồi lan nhanh nhất khi môi trường có bổ sung 10% ND, thể hiện ở chỉ số số lá TB/chồi là cao nhất (3,63 lá/chồi) và chiều dài lá TB là 2,7cm. Khi tăng nước dừa lên đến nồng độ 15%, 20%, các chỉ tiêu về số lá và chiều dài lá TB cao hơn CT1 (ĐC) nhưng vẫn thấp hơn CT3 ở mức có ý nghĩa, đúng với nghiên cứu của Parisa (2014) [43] khi bổ sung nước dừa làm tăng khả năng nhân nhanh giống lan Phalaenopsis lai. Vậy môi trường MS + 10% ND là thích hợp nhất cho nuôi lớn chồi nghiên cứu [22]. * Dịch nghiền chuối Dịch nghiền chuối có chứa nguồn chất sơ lành mạnh, giàu kali, Vitamin B6, Vitamin C, chất chống oxy hóa và các phytonutrients. Theo nghiên cứu của Benrt (1975) cho rằng dịch nghiền chuối có tác dụng kích thích chồi với khả năng tạo protocorm và sinh trưởng chồi. Theo Hoàng Thị Giang và cs trong nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng lan hài quý đã nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến hệ số nhân của lan hài với các nồng độ: 50, 100, 120, 150g/l môi trường. Kết quả khi bổ sung 100g/l chuối xanh hệ số nhân chồi cao làm chiều cao chồi thấp chỉ đạt 2,67cm. Qua quan sát thấy CT 4, 5 chồi Thạch Hộc có hiện tượng ra rễ, chất lượng chồi tốt; thân mập, lá xanh đậm, phát triển tốt [7]. * Dịch chiết của khoai tây Dịch chiết của khoai tây có chứa cacbonhydrat dưới dạng saccaroza, glucose và fructose, rất giàu amino axít acid amin như lysine, methionine, threonin, tryptophan, vitamin c, vitamin B6, các muối khoáng (K, Fe, Mg ). Dịch chiết khoai tây thường
  16. 10 được bổ sung vào môi trường vi nhân giống hoa lan. Vì vậy dịch chiết khoai tây được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật khác nhau cụ thể như: - Nghiên cứu nhân giống lan Thạch Hộc từ hạt bằng phương pháp nuôi cấy mô có sử dụng dịch nghiên khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm mục đích tăng thêm hàm lượng các cacbonhydrat, acid amin, và vitamin. Từ kết quả của đề tài cho thấy với nồng độ dịch chiết khoai tây 50g/l thích hợp cho hệ số nhân nhanh chồi tăng lên đáng kể [9]. - Ngoài ra một số môi trường nuôi cấy các loại lan khác như: phi diệp, lan kim tuyến, cũng sử dụng dịch chiết khoai tây với nồng độ 100ml/l bổ sung trong môi trường nền trong quá trình nghiên cứu và nhân giống [20], [14]. * Casein Casein được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô và tế bào thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung amino acid. - Ảnh hưởng của casein hydrolysate lên khả năng tăng sinh khối và giảm sử dụng nguồn nitrate vô cơ trong qui trình sản xuất sinh khối cây lan kim tuyến Casein hydrolysate với các nồng độ khác nhau (0, 1, 3, 5, 7 g/L) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy đã cho thấy hiệu quả đối với sự gia tăng sinh khối lan kim tuyến. Sau 6 tuần nuôi cấy, các chỉ tiêu tăng trưởng của cây được theo dõi, ghi nhận. Kết quả cho thấy nồng độ casein hydrolysate thích hợp cho sự tăng trưởng của cây lan kim tuyến khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy là 5g/l [21]. * Myo-inosytol Myo-inositol (inositol) là một carbohydrate giống như đường được tạo ra bởi hầu hết các loại cây. Nó có vị đã được khảo nghiệm bằng một nửa vị ngọt của đường (sucrose). Myo-inositol (inositol) là một thành phần quan trọng đối với sự tăng trưởng và phát triển bình thường của cây. Inositol cũng là một phân tử thiết yếu để sản xuất thành tế bào thực vật. Vách tế bào thực vật được làm chủ yếu bằng các chuỗi đường được gọi là polysaccharides. Một dạng oxy hóa của inositol là đường phổ biến và quan trọng nhất liên quan đến việc sản xuất polysaccharide cho thành tế bào. Ngoài việc tổng
  17. 11 hợp thành tế bào, các đường dẫn xuất inositol này cung cấp các thành phần quan trọng khác liên quan đến lưu trữ, vận chuyển và phát triển. - Với tầm quan trọng của Myo-inositol được sử dụng trong nhiều môi trường phục vụ cho nhanh nhanh sinh khối một số loài thực vật khác nhau như: + Tăng hệ số nhân nhanh chồi chuối Laba (Musa SP.) nuôi cấy in vitro bằng sử dụng ánh sáng, myo-inositol và adenin sulphate. Khảo sát ảnh hưởng của myo- inositol đến khả năng nhân nhanh sinh khối chồi. Kết quả cho thấy việc sử dụng Myo- inositol với nồng độ 0,1g/l thu được chồi có chiều cao vượt trội so với các nồng dộ thử nghiệm khác. Ngoài ra, Myo-inositol còn có tác động tích cực đến quá trình hình thành lá của chồi [6]. Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào. Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp. - Ngoài ra dịch chiết nấm men cũng được sử dụng rộng rãi trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật phổ biến như: + Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự phát triển của cây lan gấm (A. roxburghii) được thược hiện nhằm đánh giá vai trò của dịch chiết nấm men trong môi trường nuôi cấy cây lan gấm không có chất điều hòa. Dịch chiết nấm men được khảo sát với 3 nồng độ khác nhau 1, 3, 5 g/l đã cho thấy những tác động tích cực lên sự phát triển sinh khối của cây lan gấm. Sau 8 tuần nuôi cấy, mẫu ban đầu có khối lượng 0,3 – 0,4 g/cây được cấy trên môi trường Albert’s bổ sung hàm lượng dịch chiết nấm men riêng lẻ thích hợp cho cây lan gấm phát triển là 1 g/l cho khối lượng tươi và khối lượng khô đạt 0,56 g/cây và 0,074 g/cây [23]. Môi trường nuôi cấy bao gồm các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin. Việc bổ sung cao nấm men vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng hàm lượng nitơ trong môi trường có chứa hàm lượng nitơ tương đối thấp hoặc không có nitơ để thúc đẩy sự tăng trưởng của cây trồng. Sau 6 tuần nuôi cấy, mẫu cấy trên các môi trường có bổ sung cao nấm men tăng trưởng tốt hơn so với môi trường không bổ sung cao nấm men. Kết quả ghi nhận được cho thấy, cây lan kim tuyến tăng trưởng tốt nhất trên môi trường Albert’s chứa
  18. 12 muối nitrate theo các tỉ lệ (100%; 75%; 50% và 25%) kết hợp bổ sung 5 g/L cao nấm men. Kết quả cho thấy lan kim tuyến tăng cao về lượng sinh khối [21]. * Tảo spirulina Tảo spirulina: Hàm lượng protein trong Spirulina thuộc vào loại cao nhất trong các thực phẩm hiện nay, 56%-77% trọng lượng khô, cao hơn 3 lần thịt bò, cao hơn 2 lần trong đậu tương - Hàm lượng vitamin rất cao. Cứ 1 kg tảo xoắn Spirulina chứa 55 mg vitamin B1, 40 mg vitamin B2, 3 mg vitamin B6, 2 mg vitamin B12, 113 mg vitamin PP, 190 mg vitamin E, 4.000 mg caroten trong đó β-Caroten khoảng 1.700 mg (tăng thêm 1.000% so với cà rốt), 0,5 mg axít folic,inosit khoảng 500-1.000 mg. - Hàm lượng khoáng chất có thể thay đổi theo điều kiện nuôi trồng, thông thường sắt là 580–646 mg/kg(tăng thêm 5.000% so với rau chân vịt), mangan 23– 25 mg/kg, Mg 2.915-3.811/kg, selen là 0,4 mg/kg, canxi, kali, phốtpho đều khoảng là 1.000-3.000 mg/kg hoặc cao hơn (hàm lượng canxi tăng hơn sữa 500%). - Phần lớn chất béo trong Spirulina là axít béo không no, trong đó axít linoleic 13.784 mg/kg, γ-linoleic 11.980 mg/kg. Đây là điều hiếm thấy trong các thực phẩm tự nhiên khác. - Hàm lượng cacbon hydrat khoảng 16,5%, hiện nay đã có những thông tin dùng glucoza chiết xuất từ tảo Spirulina để tiến hành những nghiên cứu chống ung thư. - Tảo Spirulina có chứa phong phú các axít amin cần thiết như lysin, threonin. - Với hàm lượng dinh dưỡng cao trong tảo nên hiện nay tảo cũng được sử dụng như một chất hữu cơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật cụ thể như: + Khảo sát ảnh hưởng của tảo spirulina lên quá trình sinh trưởng và phát triển của chồi lan hài hồng nuôi cấy in vitro. Tảo spirulina được bổ sung ở các nồng độ 10 mg/l, 30 mg/l, 50 mg/l và 70 mg/l. Ảnh hưởng của tảo spirulina lên quá trình sinh trưởng và phát triền của chồi lan hài hồng nuôi cấy in vitro. Kết quả cho thấy, bổ sung của tảo spirulina có tác động tốt đến sự sinh trưởng và phát triển của chồi lan hài hồng in vitro. Khi tăng nồng độ tảo spirulina, các chỉ tiêu theo dõi như số lá, số chồi, chiều
  19. 13 cao chồi và tỷ lệ sống của mẫu cấy cũng tăng theo tương ứng và đạt tốt nhất khi bổ sung 50 mg/l bột tảo. Nếu tiếp tục gia tăng nồng độ tảo cao hơn 50 mg/l, các chỉ tiêu tăng trưởng trên bắt đầu giảm. Bột tảo spirulina làm gia tăng tỷ lệ sống của mẫu cấy và đạt 100%, đây là chỉ tiêu sinh trưởng rất quan trọng trong giai đoạn nhân chồi cây lan hài hồng. Điều này có thể giải thích, trong thành phần của tảo có chứa nhiều amino acid tự do, các loại vitamin như vitamin A, vitamin B và vitamin E làm gia tăng quá trình trao đổi chất, chống hóa nâu của mẫu cấy, giúp mẫu cấy hấp thụ dưỡng chất tốt hơn làm cho mẫu cấy sinh trưởng và phát triển mạnh làm gia tăng tỷ lệ sống [2]. 2.5. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Thạch Hộc Tía Năm 2014, Parisa Shekarriz nhân giống hạt lan Hồ Điệp trên môi trường 1/2MS bổ sung 100ml/l nước dừa, pepton giúp tăng tỷ lệ nảy mầm của lan Hồ Điệp [29]. Năm 1999, Mai Thị Tâm và cs nghiên cứu trên giống lan Dendrobium E.R. Đối tượng nghiên cứu là chồi và quả của giống Dendrobium E.R, tạo ra nguồn vật liệu khởi đầu là protocorm. Môi trường cơ bản là VW có cải tiến với 1% sacarose, 15% nước dừa và các hàm lượng khác nhau của BA. Kết quả cuối cùng tìm ra được các môi trường thích hợp cho quá trình tạo nguồn vật liệu khởi đầu, quá trình nhân nhanh tạo cây hoàn chỉnh [24]. Cũng trên giống này, với vật liệu là các protocorm đều, xanh mập, có mầm chồi, nghiên cứu đã xác định được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng, phụ gia như đường saccarose, nước dừa, NAA, axit Nicotinic đến sự phát sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của cây. Trên môi trường VW, tìm ra hàm lượng các chất bổ sung hợp lý giúp cây sinh trưởng tốt, tăng cường sức sống và tạo cây hoàn chỉnh. Năm 2003, Nguyễn Quang Thạch và cs nghiên cứu trên giống lan hồ điệp (Phalaenopsis) với quả sau khi thụ phấn trên 100 ngày là đủ độ chín thuần thục và có khả năng nảy mầm tốt nhất (95 - 100 %), thời gian khử trùng thích hợp cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, mẫu sạch sống cao là khử trùng kép 5 phút + 1 phút việc sử dụng nguồn vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng (lá non, mắt ngủ trên phát hoa và đỉnh hoa)
  20. 14 và cơ quan sinh sản hữu tính (hạt), kết quả VW + 100 ml nước dừa + 10 g đường saccarose + 6,5g agar +30 g khoai tây + 30 g cà rốt + 1g pepton thích hợp cho nhân cụm chồi in vitro [22]. Năm 2007, Nguyễn Thị Tâm và cs nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và giá thể đến sinh trưởng của cây lan Dendrobium hybrid in vitro. Sử dụng môi trường nền là VW (Vacin Went) + đường sacaroza 20 g/l + agar 9g/l + nước dừa 100 ml/l + than hoạt tính 2 g/l. Nồng độ BAP 2 mg/l và kinetine 3 mg/l thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lan Dendrobium hybrid, cho hệ số tạo chồi và lá mới cao nhất (sau 6 tuần nuôi cấy). Khi bổ sung kết hợp NAA 0,3 mg/l với BAP 2 g/l cho hệ số nhân chồi và tạo lá cao nhất (1,80 và 2,04). Bổ sung NAA 0,3 mg/l có ảnh hưởng tốt đến khả năng ra rễ và phát triển của bộ rễ (số rễ đạt 15,83 cái/cây và chiều dài rễ đạt 2,3 cm). Khi ra cây trên 3 nền giá thể: rêu ngoại, rêu ngoại: xơ dừa (1:1), xơ dừa đều cho tỷ lệ sống khá cao (57,89 % - 67,67 %). Trong đó, giá thể rêu ngoại đạt tỷ lệ sống cao nhất 67.67 % [25]. Năm 2009, Nguyễn Thanh Tùng và cs, nghiên cứu khả năng nhân nhanh in vitro cây Mỹ Dung Dạ Lan Vanda denisoniana benson. Đã xác định được: Khử trùng quả Mỹ Dung Dạ Lan bằng HgCl2 với nồng độ 0,5% trong 10 phút cho tỷ lệ sống và tỷ lệ không nhiễm cao (81,82 %). Môi trường MS bổ sung kinetine 0,5 -1,5 mg/l cho tỷ lệ nảy mầm cao (>75 %), cao nhất ở nồng độ 0,5 mg/l (đạt 92,31 %). Nồng độ NAA tối ưu cho quá trình nảy mầm của hạt là từ 0,1-0,5 mg/l (tỷ lệ nảy mầm > 85%). MS +BAP 0,5 mg/l cho hệ số nhân cao nhất (2,7 chồi/protocorm). Nồng độ kinetine tối ưu cho nhân nhanh Mỹ Dung Dạ Lan là 0,5 mg/l [27]. Năm 2010, tác giả Ngô Xuân Bình và cs nghiên cứu kĩ thuật nhân giống phong lan Đuôi Chồn (Rhynchostylis retusa blume [1]) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Xác định được môi trường MS là tối ưu nhất cho sự nảy mầm của hạt lan. Đồng thời, nhóm tác giả cho rằng cytokine có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả tái sinh hạt. Tuy nhiên, khi sử dụng kết hợp giữa BA và Kinetine với tỷ lệ kinetine 0,1 mg/l + BA 0,3 mg/l cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất đạt 86.7 % [1].
  21. 15 Năm 2011, Hoàng Thị Nga và cs, xây dựng quy trình nhân nhanh giống địa lan Hồng Hoàng (Cymbidium iridioides) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào đã cho kết quả các chồi non có kích thước từ 4-6 cm hoặc hạt được sử dụng làm mẫu cấy, môi trường để khởi động mẫu cấy là: MS + saccarose 20 g/l + agar 0,65 g + BA 1,5 ppm (hoặc 2 ppm Kinitine/l), để gieo hạt là: MS + sacarose 10 g/l + pepton 1 g + than hoạt tính 1 g/l + agar 6,5 g/l. Môi trường thích hợp để nuôi cấy lát mỏng đã xác định là: MS + 1 ppm K + sacarose 20 g/l + Kinitine 1 ppm (hoặc BA 0,5 ppm) + agar 6,5 g/l. Nghiên cứu đã xác định được môi trường tối thích để tạo cây hoàn chỉnh là MS + than hoạt tính 0,1 g/l+ sacarose 25 g/l [15]. Năm 2011, Nguyễn Văn Song, nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chysotoxum) – một loài lan có nguy cơ tuyệt chủng. Kết quả đã chỉ ra rằng nguyên liệu sử dụng là quả lan 3 tháng. Môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocom của hạt là môi trường MS cơ bản có sucarose 20 g/l + agar 8 g/l + ND 150 ml/l + BAP 2,0 mg/l. Môi trường nhân nhanh protocom tốt nhất là MS cơ bản có sucarose 20 g/l + agar 8 g/l + ND 150 ml/l + BAP 2,0 mg/l. Môi trường MS cơ bản có sacarose 30 g/l + agar 8 g/l + THT 1 g + ND 150 ml/l + BAP 2,0 mg/l + NAA 1,0 mg/l thích hợp cho tái sinh chồi từ protocom và sinh trưởng của chồi in vitro. Môi trường cơ bản có sucarose 20 g/l + agar 8 g/l + ND 150 ml/l + NAA 1,0 mg/l là thích hơp cho ra rễ của chồi in vitro [16]. Năm 2012, Nguyễn Thị Sơn và cs, nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriatumhook (Hoàng thảo Long nhãn). Kế quả nghiên cứu đã chỉ rõ: Nguyên liệu sử dụng là quả lan 3 tháng tuổi. Môi trường thích hợp cho nảy mầm là và phát sinh protocom của hạt là môi trường MS + ND 100 ml/l + saccarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường. Môi trường nhân nhanh protocom tốt nhất là môi trường KC + ND 100 ml/l + sacarose 10 g/l + khoai tây 80 g/l + agar 6,0 g/l môi trường. Môi trường MS + ND 100 ml/l + sacarose 20 g/l + chuối chín 60 g/l + agar 6,0 g/l môi trường là thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + THT 1 g/l + agar 6,0 g/l môi trường [17].
  22. 16 Năm 2013, Vũ Ngọc Lan và cs, nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile Lindl (Thạch Hộc) nhằm bảo tồn và phát triển loài lan quý thuộc chi Hoàng thảo, có giá trị thẩm mỹ dược liệu cao, đang có nguy cơ tuyệt chủng. Kết quả cho thấy nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi, môi trường gieo hạt là MS + ND 100 ml + saccarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường. Trong nhân in vitro, môi trường nhân nhanh protocom tối ưu là KC + ND 100 ml + sacarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường; nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS + ND 100ml/l + sacarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường. Môi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh là RE + sacarose 10g/l + THT 0,6 g/l, cường độ chiếu sáng 2300 lux [12]. Năm 2014, Nguyễn Thị Sơn và cs, nhân giống in vitro lan Dendrobium offcinale Kimura et Migo (Thạch Hộc Thiết bì). Một loài lan quý được sử dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng chữa bệnh tiểu đường và các bệnh nan y đang được thương mại hóa rộng rãi trên thế giới. Kết quả nghiên cứu đã chỉ rõ: Nhân giống bằng gieo hạt trên môi trường VW + saccarose 10 g/l + agar 6 g/l + ND 100 ml/l môi trường. Nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + ND 100 ml/l + sacarose 20g/l + agar 6g/l + chuối chín 60 g/l môi trường. Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ sử dụng thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi trường MS + sacarose 20 g/l + ND 100 ml/l + BA 0,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l + agar 6 g/l môi trường. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10 g/l sacarose + agar 6 g/l + THT 0,3 g/l + NAA 0,5 mg/l môi trường [19]. Năm 2017, Hoàng Thị Hằng và cs, xây dựng quy trình nhân giống in vitro lan Thạch Hộc Tía trên môi trường hưu cơ chứa phân trùn quế và kết hợp với bột sắn dây. Nhằm mục đích hoàn thiện quy trình nhân giống Thạch Hộc Tía trong môi trường hữu cơ. Kết quả cho thấy rằng: Hàm lượng phân trùn quế thích hợp cho môi trường cơ bản trong nuôi cấy in vitro lan Thạch Hộc Tía là: 5% TQ + 20g/l glucose + 8g/l agar. Môi trường bổ sung: 10g/l SD + 5% TQ + 20g/l glucose + 8g/l agar. Thử nghiệm ra rễ là: 5g/l SD + 5% TQ + 20g/l glucose + 8g/l agar [11]. Năm 2017, Nguyễn Thị Diệu Hoa, nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và biện pháp kỹ thuật đến sinh trưởng của giống lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) tại Thái Nguyên.
  23. 17 Kết quả cho thấy: môi trường nền được sử dụng là: MS + 6,3g/l Agar + 20g/l đường + 0,1g/l Myo + 30g/l khoai tây + 30g/l cà rốt + 100ml/l nước dừa sau đó được tiến hành bổ sung hàm lượng các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau [10]. Năm 2018, Mai Thị Phương Hoa và cs, nuôi cấy protocorm lan Thạch Hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) in vitro. Kết quả cho thấy nồng độ javel 75% trong thời gian 20 phút là thích hợp nhất để khử trùng mẫu lan Thạch Hộc thiết bì. Môi trường C có bổ sung NAA 0,5mg/l, đường sucrose 30g/l là môi trường thích hợp tạo protocorm. Nhân sinh khối protocorm tốt nhất trên môi trường C có bổ sung NAA 0,5mg/l, BA 0,1mg/l, đường sucrose 30g/l và nước dừa 10% [8].
  24. 18 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Giống hoa lan Thạch Hộc Tía Cao Bằng - Vật liệu nghiên cứu: Chồi lan Thạch Hộc - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ (nước dừa, chuồi, khoai tây, casein, myo-inosytol, cao nấm men, tảo spirulina) nhằm xác định ảnh hưởng của chúng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thach Hộc Tía 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu - Địa điểm thực hiện nghiên cứu: Phòng thí nghiệm: Công nghệ Tế bào, Viện khoa học Sự sống - Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 2/2020 đến 7/2020 3.3. Điều kiện nuôi cấy Thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm nuôi cấy vô trùng với các điều kiện cụ thể sau: - Môi trường nuôi cấy có pH = 5,6 – 5,8 - Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 20 0 C -25 0 C - Cường độ ánh sáng 2000 - 3000lux, quang chu kì 16h sáng/8h tối - Môi trường dinh dưỡng sử dụng để nuôi cấy mô lan Thạch Hộc Tía được khử trùng ở 1210 C và 1atm 30 phút. - Dụng cụ nuôi cấy được khử trùng ở 1210C , 1atm trong 20 phút. 3.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất - Thiết bị và dụng cụ Thiết bị sử dụng trong nuôi cấy in vitro lan Thạch Hộc Tía : cân phân tích, máy lọc nước, máy đo pH, bếp gas, nồi hấp khử trùng, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh, tủ sấy.
  25. 19 Dụng cụ dùng nuôi cấy: dao cấy, đĩa cấy, pank cấy, kéo, đèn cồn, bình nuôi cấy 250 ml, bình tam giác 250 ml. Dụng cụ khử trùng ở 1210 C Hóa chất, vật tư nghiên cứu Môi trường MS cơ bản Cồn 70% Đường saccharose Agar Hạ Long Nước dừa Chuối Khoai tây Casein Myo-inosytol Cao nấm men Tảo spirulina 3.5. Nội dung nghiên cứu Đề tài được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau: Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía - Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía - Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tổng hợp đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ casein đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía
  26. 20 - Nghiên cứu ảnh hưởng của Myo-inositol đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía - Nghiên cứu ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía - Nghiên cứu ảnh hưởng của tảo Spirulina (Earthrise, USA) đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 3.6. Phương pháp nghiên cứu Bố trí thí nghiệm: Ở tất cả các thí nghiệm chúng tôi bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại 3 bình, mỗi bình 6 mẫu Bình nuôi cấy: - Bình tam giác 250ml - Bình trụ 200ml Thể tích môi trường trong bình nuôi cấy 50ml/bình Môi trường nền: MS + 30g/l Sucrose + 5g/l agar + 0.5g/l BAP, pH = 5,6 -5,8 3.6.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía Các chồi lan tái sinh lần thứ nhất từ hạt lan Thạch Hộc Tía gieo trên môi trường MS được tách ra và cấy chuyển sang môi trường môi trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP và bổ sung chất hữu cơ ở nồng độ khác nhau tùy thuộc vào từng CT thí nghiệm. pH môi trường được chuẩn về 5,6-5,8 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến khả năng sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung nước Dừa vào môi trường nền (trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với nông độ dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các công thức (CT) thí nghiệm sau: CT 1 (đ/c): MT nền + 0 mg/l nước Dừa. CT 2: MT nền + 50 ml/l nước Dừa. CT 3: MT nền + 100 ml/l nước Dừa.
  27. 21 CT 4: MT nền + 150 ml/l nước Dừa. CT 5: MT nền + 200 ml/l nước Dừa. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung dịch nghiền chuối vào môi trường nền (trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với nông độ dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các CT thí nghiệm sau: CT 1 (đ/c): MT nền + 0 g/l dịch nghiền chuối CT 2: MT nền + 50 g/l dịch nghiền chuối CT 3: MT nền + 100 g/l dịch nghiền chuối CT 4: MT nền + 150 g/l dịch nghiền chuối CT 5: MT nền + 200 g/l dịch nghiền chuối Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung dịch chiết khoai tây vào môi trường nền (trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với nông độ dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các CT thí nghiệm sau: CT 1 (đ/c): MT nền + 0 g/l dịch chiết khoai tây CT 2: MT nền + 60 g/l dịch chiết khoai tây CT 3: MT nền + 75 g/l dịch chiết khoai tây CT 4: MT nền + 90 g/l dịch chiết khoai tây CT 5: MT nền + 105 g/l dịch chiết khoai tây 3.6.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ casein đến khả năng sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung dịch chiết khoai tây vào môi trường nền (trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với nông độ dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các CT thí nghiệm sau:
  28. 22 CT 1 (đ/c): MT nền + 0 g/l casein CT 2: MT nền + 0.05 g/l casein CT 3: MT nền + 0.1 g/l casein CT 4: MT nền + 0.15 g/l casein CT 5: MT nền + 0.2 g/l casein Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Myo-inosytol đến khả năng sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung myo-inosytol vào môi trường nền (trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với nông độ dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các CT thí nghiệm sau: CT 1 (đ/c): MT nền + 0 g/l myo-inosytol CT 2: MT nền + 0.05 g/l myo-inosytol CT 3: MT nền + 0.1 g/l myo-inosytol CT 4: MT nền + 0.15 g/l myo-inosytol CT 5: MT nền + 0.2 g/l myo-inosytol Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung cao nấm men vào môi trường nền (trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với nông độ dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các CT thí nghiệm sau: CT 1 (đ/c): MT nền + 0 g/l cao nấm men CT 2: MT nền + 1.5 g/l cao nấm men CT 3: MT nền + 3 g/l cao nấm men CT 4: MT nền + 4.5 g/l cao nấm men CT 5: MT nền + 5 g/l cao nấm men Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ tảo spirulina đến khả năng sinh trưởng tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía
  29. 23 Trong thí nghiệm này, đề tài thực hiện bổ sung tảo spirulina vào môi trường nền (trường MS + 30 gram/l saccarose + 5 gram/l agar + 0,5 gram/l BAP) với nông độ dao động từ 0 ml đến 200 ml. Bao gồm các CT thí nghiệm sau: CT 1 (đ/c): MT nền + 0 g/l tảo spirulina CT 2: MT nền + 0.03 g/l tảo spirulina CT 3: MT nền + 0.05 g/l tảo spirulina CT 4: MT nền + 0.07 g/l tảo spirulina CT 5: MT nền + 0.09 g/l tảo spirulina 3.7. Chỉ tiêu đánh giá Các chỉ tiêu xác định khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối của chồi Thạch Hộc Tía in vitro của các thí nghiệm được thu thập sau 40 ngày nuôi cấy. Bao gồm các chỉ tiêu: Tổng số chồi thu được Hệ số nhân chồi = Tổng số chồi mẫu - Biến động chiều cao chồi = chiều cao chồi sau – chiều cao chồi trước - Biến động số lá = số lá sau – số lá trước - Chất lượng chồi: Đáng giá cảm quan chất lượng chồi theo các cấp sau: Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt Số lá của chồi - Biến động khối lượng chồi= khối lượng sau – khối lượng trước 3.8. Phương pháp xử lí số liệu Số liệu theo dõi các chỉ tiêu nghiên cứu được thu thập và xử lý để xác định sự sai khác giữa các CT thí nghiệm. Xử lý số liệu được thực hiện bằng phần mềm SAS 9.1 và giá trị trung bình được so sánh theo phương pháp Duncan với P <0,01.
  30. 24 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến khả năng sinh trưởng và tích lũy in vitro sinh khối của lan Thạch Hộc Tía Trong các hợp chất hữu cơ tự nhiên có chứa các chất dinh dưỡng có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây con nuôi cấy mô. Đặc biệt là đối với phong lan. Để đánh giá được hiệu quả của hợp chất hữu cơ chúng tôi tiến hành thí nghiệm cấy 6 chồi/bình, mỗi cụm cao 8 mm trên môi trường nền MS + 30g/l Sucrose + 5g/l agar có bổ sung thành phần nước dừa. Kết quả theo dõi sau 5 tuần được thể hiện ở bảng 4.1 Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía Chỉ số theo dõi Biến Biến Nồng Tổng số động Biến động CT độ chồi vào Chất lượng chiều động số khối (ml/l) mẫu/CT HSN chồi cao lá lượng (cm) (g) d 1(ĐC) 0.0 18 1.44d 0.28e 3.11c 0.43 Chồi kém bc 2 50 18 2.61c 0.63d 5.56b 0.61 Chồi trung bình a 3 100 18 4.56a 1.64a 7.56a 0.89 Chồi tốt b 4 150 18 3.72b 1.41b 5.44b 0.66 Chồi trung bình cd 5 200 18 2.50c 0.81 c 3.44c 0.47 Chồi trung bình LSD0.5 0.44 0.15 0.41 0.15 CV% 5.46 5.56 3.01 8.99 a, b, c, thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo phương pháp Duncan Chú thích: - Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm - Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt - Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt.
  31. 25 Qua 40 ngày nuôi cấy, hệ số nhân chồi đạt được ở các CT thí nghiệm có sự sai khác ở mức ý nghĩa 99%, biến động từ 1.44 lần đến 4.56 lần. Trong đó, nồng độ 100ml/l (CT 3) cho hệ số nhân chồi đạt cao nhất (4.56 lần), tiếp theo đến các CT 4 (3.72 lần), CT 5 (2.50 lần), CT đối chứng (1.44 lần) . Không có sự sai khác ý nghĩa giữa CT 2 (50ml/l), 4 (150ml/l), 5(200ml/l). Đối với biến động số lá ở các CT thí nghiệm có sự sai ở mức độ tin cậy 99%, biên động từ 3.11 lá/chồi đến 7.56 lá/chồi. Trong đó ở CT 3 (100ml/l) cho biến động số lá cao nhất đạt 7.56 lá/chồi, tiếp đến là các CT 2 ( 5.56 lá/chồi), CT 4 (5.44 lá/chồi), CT 5 (3.44 lá/chồi) và cho biến động số lá thấp nhất ở CT đối chứng (3.11 lá/chồi). Ở chỉ tiêu biến động chiều cao các CT có sự sai khác với CT đối chứng ở mức tin cậy 99%, biến động từ 0.28 cm/chồi đến 1.64cm/chồi. Trong đó ở CT bổ sung 100ml/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (1.64 cm/chồi), tiếp đến là CT 4 (1.41 cm/chồi), CT 5 (0.81 cm/chồi) và CT 2 (0.63 cm/chồi). Biến động khối lượng ở các CT thí nghiệm có sự sai khác so với CT đối chứng ở mức độ tin cậy 99%. Khối lượng biến động từ 0.43 g/chồi (CT đối chứng) đến 0.89g/chồi. Trong đó biếng động khối lượng đạt cao nhất ở CT 3 (0.98 g/chồi),CT 4(0.66 g/chồi), CT 2(0.61 g/chồi), và CT 5 (0.47 g/chồi). Bằng mắt thường ta có thể nhận thấy chất lượng của chồi ở CT bổ sung 100ml/l (CT 3) cho chất lượng chồi tốt nhất, lá rộng xanh thẫm, chồi mập. Ở các CT khác chất lượng thấp hơn so với CT 3. Kết quả nghiên cứu này đồng thuận với các nghiên cứu trước đó của Nguyễn Thị Sơn (2014) [19] trên đối tượng lan Thạch Hộc Thiết Bì sử dụng nước dừa với nồng độ 100ml/l nước dừa được đánh giá là tốt nhất cho hệ số nhân chồi. Ngược lại, cũng có một số tác giả công bố môi trường bổ sung 200 ml/l nước dừa là môi trường phù hợp với sự sinh trưởng trên đối tượng lan Hài Hồng [2]. Nguyên nhân có thể do sự khác biệt về loài. Kết luận: từ kết quả trên ta thấy bổ sung 100ml/l nước dừa vào môi trường nuôi cấy cho tác động tích cực đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía.
  32. 26 4.2. Kết quả ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía Bảng 4.2: Ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía Chỉ số theo dõi Tổng số Biến Biến động Nồng Biến CT chồi vào động khối Chất lượng độ(g/l) HSN động mẫu/CT chiều lượng chồi số lá cao (cm) (g) 1(ĐC) 0.0 18 1.56c 0.46d 3.11c 0.17d Chồi kém 2 50 18 2.50b 0.77c 5.11b 0.29d Chồi trung bình 3 100 18 3.55a 1.34a 7.22a 1.03a Chồi tốt 4 150 18 2.83b 1.12ab 5.22b 0.79b Chồi tốt 5 20 18 2.45b 0.91b 3.44c 0.54c Chồi trung bình LSD0.5 0.70 0.22 0.28 0.13 CV% 9.09 8.61 2.18 8.82 a, b, c, thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo phương pháp Duncan Chú thích: - Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm - Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt - Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt a, b, c, thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo phương pháp Duncan Qua 40 ngày nuôi cấy, hệ số nhân chồi đạt được ở các CT thí nghiệm có sự sai khác ở mức ý nghĩa 99%, biến động từ 0.46 lần đến 1.34 lần. Trong đó, nồng độ 100 g/l (CT 3) cho hệ số nhân chồi đạt cao nhất (1.34 lần), tiếp theo đến các CT 4 (1.12 lần), CT 5 (0.91 lần), CT đối chứng (1.44 lần) . Không có sự sai khác ý nghĩa giữa CT 2, 4, 5.
  33. 27 Đối với biến động số lá ở các CT thí nghiệm có sự sai ở mức độ tin cậy 99%, biên động từ 3.11 lá/chồi đến 7.22 lá/chồi. Trong đó ở CT 3 (100g/l) cho biến động số lá cao nhất đạt 7.22 lá/chồi, tiếp đến là các CT 4 ( 5.22 lá/chồi), CT 2 (5.11 lá/chồi), CT 5 (3.44 lá/chồi) và cho biến động số lá thấp nhất ở CT đối chứng (3.11 lá/chồi). Ở chỉ tiêu biến động khối lượng các CT có sự sai khác với CT đối chứng ở mức tin cậy 99%, biến động từ 0.17g/chồi đến 1.03g/chồi. Trong đó ở CT bổ sung 100g/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (1.03 cm/chồi), tiếp đến là CT 4 (0.79 g/chồi), CT 5 (0.54 g/chồi) và CT 2 (0.29 g/chồi) và cuối cùng là CT đối chứng ( 0.17 g/chồi). Biến động chiều cao ở các CT thí nghiệm có sự sai khác so với CT đối chứng ở mức độ tin cậy 99%. Biến động chiều cao đạt được ở các CT thí nghiệm có sự sai khác ở mức ý nghĩa 99%, biến động từ 0.46 cm/chồi đến 1.34 cm/chồi. Trong đó, nồng độ 100 g/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (1.34 cm/chồi), tiếp theo đến các CT 4 (1.12 cm/chồi), CT 5 (0.91 cm/chồi), CT đối chứng (1.44 cm/chồi) . Không có sự sai khác ý nghĩa giữa CT 2, 4, 5. Bằng mắt thường ta có thể nhận thấy chất lượng của chồi ở CT bổ sung 100ml/l (CT 3) cho chất lượng chồi tốt nhất, lá rộng xanh thẫm, chồi mập. Ở các CT khác chất lượng thấp hơn so với CT 3. Hoàng Thị Giang(2010) [7] nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường có bổ sung dịch nghiền chuối trên lan Hài Hằng, kết quả cho thấy việc bổ sung dịch nghiền chuối vào môi trường nhân nhanh bổ sung 100g/l dịch nghiền chuối vào môi trường có ảnh hưởng tích cực đến chồi. Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả đã được công bố của tác giả. Kết luận: bổ sung dịch nghiền chuối ở nồng độ 100g/l phù hợp cho việc phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Thạch Hộc Tía. 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. Bảng 4.3: Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía
  34. 28 Chỉ số theo dõi Biến Biến Tổng số Nồng Biến động Biến động CT chồi vào Chất lượng độ(g/l) động chiều động khối mẫu/CT chồi HSN cao số lá lượng (cm) (g) 1(ĐC) 0.0 18 1.50d 0.28d 3.44d 0.40d Chồi kém 2 60 18 2.17c 0.73c 5.44b 0.58c Chồi trung bình 3 75 18 3.72a 1.30a 7.22a 1.10a Chồi tốt 4 90 18 2.72b 1.24a 4.44b 0.75b Chồi trung bình 5 105 18 2.83b 0.93b 3.78c 0.48cd Chồi trung bình LSD0.5 0.36 0.14 0.47 0.16 CV% 5.02 5.69 3.57 9.08 a, b, c, thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo phương pháp Duncan Chú thích: - Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm - Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt - Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt Qua 40 ngày nuôi cấy, hệ số nhân chồi đạt được ở các CT thí nghiệm có sự sai khác ở mức ý nghĩa 99%, biến động từ 1.50 lần đến 3.72 lần. Trong đó, nồng độ 75g/l (CT 3) cho hệ số nhân chồi đạt cao nhất (3.27 lần), tiếp theo đến các CT 5 (2.83 lần), CT 4 (2.72 lần), CT 2 (2.17 lần)CT đối chứng (1.44 lần) . Không có sự sai khác ý nghĩa giữa CT 2, 4, 5. Đối với biến động số lá ở các CT thí nghiệm có sự sai ở mức độ tin cậy 99%, biên động từ 3.44 lá/chồi đến 7.22 lá/chồi. Trong đó ở CT 3 (75g/l) cho biến động số lá cao nhất đạt 7.22 lá/chồi, tiếp đến là các CT 2 ( 5.44 lá/chồi), CT 4 (4.44 lá/chồi), CT 5 (3.78 lá/chồi) và cho biến động số lá thấp nhất ở CT đối chứng (3.44 lá/chồi).
  35. 29 Ở chỉ tiêu biến động chiều cao các CT có sự sai khác với CT đối chứng ở mức tin cậy 99%, biến động từ 0.28 cm/chồi đến 1.30cm/chồi. Trong đó ở CT bổ sung 75g/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (1,30 cm/chồi), tiếp đến là CT 4 (1.24 cm/chồi), CT 5 (0.93cm/chồi) và CT 2 (0.73cm/chồi). Biến động khối lượng ở các CT thí nghiệm có sự sai khác so với CT đối chứng ở mức độ tin cậy 99%. Khối lượng biến động từ 0.40 g/chồi (CT đối chứng) đến 1.10g/chồi. Trong đó biếng động khối lượng đạt cao nhất ở CT 3 (1.10 g/chồi),CT 4 (0.75 g/chồi), CT 2 (0.58 g/chồi), và CT 5 (0.48 g/chồi). Về chất lượng chồi khi quan sát thấy rằng ở CT chồi thu được có chất lượng tốt lá xanh thẫm, chồi mập. Các CT thí nghiệm còn lại cho chất lượng chồi trung bình. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả của Mai Thị Phương Hoa, Đỗ Tiến Vinh (2018) [8] nghiên cứu trên đối tượng lan Thạch Hộc Thiết Bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) kết quả thí nghiệm cho thấy việc bổ sung 75g/l khoai tây đều cho kết quả tăng sinh tương đối cao. Kết quả của chúng tôi phù với kết quả đã được công bố của tác giả Kết luận việc bổ sung 75g/l khoai tây vào môi trường nuôi cấy có tác động tích cực đến hệ số nhân chồi, chiều cao, số lá và khối lượng tươi của lan Thạch Hộc Tía.
  36. 30 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của casein đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía Bảng 4.4: Ảnh hưởng của casein đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía Chỉ số theo dõi Tổng số Biến Biến động Nồng Biến CT chồi vào động khối Chất lượng độ(g/l) HSN động mẫu/CT chiều cao lượng chồi số lá (cm) (g) 1(ĐC) 0.0 18 1.39c 0.25d 3.33c 0.53d Chồi kém 2 0.05 18 2.31b 0.65c 3.33b 0.79c Chồi trung bình 3 0.1 18 3.67a 1.37a 7.11a 1.23a Chồi tốt 4 0.15 18 3.33a 1.28a 5.22b 0.93b Chồi trung bình 5 0.2 18 2.17b 0.91b 3.44c 0.72c Chồi trung bình LSD0.5 0.43 0.11 0.44 0.09 CV% 6.12 4.25 3.32 4.007 a, b, c, thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo phương pháp Duncan Chú thích: - Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm - Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt - Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt Sau 7 tuần theo dõi, chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD0.5 là 0.43 hệ số nhân chồi của các CT tăng khi tăng nồng độ. Khi tăng nồng độ casein từ 0 -0.1g/l tương ứng từ CT1 – CT3, hệ số nhân chồi biến động từ 2.31 – 3.67 lần, đặc biệt là ở CT3 nồng độ 3g/l cho biến động hệ số nhân chồi cao nhất đạt 3.67 lần. Tuy nhiên khi tăng nồng độ lên hệ số nhân chồi giảm từ 3.33 lần ở CT4 xuống còn 2.17 lần ở CT5 Từ bảng 4.4 nhận thấy khi bổ sung casein với nồng độ từ 0 – 1g/l biến động chiều cao chồi cao hơn CT ĐC. Trong đó ở CT3 biến đọng chiều cao là 1.37 cm. ở
  37. 31 CT4 và CT5 chiều cao lần lượt là 1.28 và 0.91 cm so với CT ĐC (0.28) sai khác này không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 99%. Về biến động số lá của chồi, theo kết quả ở bảng 4.4 cho thấy: biến động số lá tăng từ 3.33 lá/chồi đến 7.11 lá/chồi trong đó CT 3 (0.1g/l) cho biến động số lá cao nhất (7.11). Nhưng khi tăng nồng độ nên thì số lá giảm xuống 5.22 ở CT4 và 3.44 ở CT5. Khi không sử dụng thì số lá tăng rất thấp chỉ đạt 3.33 lá/chồi Ở CT3 khối lượng trung bình của chồi (1.23g) lớn hơn CT ĐC và các CT còn lại. Giá trị khối lượng trung bình thu được ở CT2, CT4 không có sự thay đổi nhiều (lần lượt đạt 0.79, 0.93g) 2 CT này sai khác không có ý nghĩa so vơi CT ĐC ở độ tin cậy 99%. Ở CT5 cho khối lượng thấp nhất 0.72 so với CT ĐC (0.43g) sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 99% Đáng giá về chất lượng chồi của CT2,3,4,5 đều cho chồi cho chất lượng tốt hơn so với CT ĐC. Các CT 2,4,5 chồi thu được có chất lượng trung bình chồi nhỏ, lá có màu xanh nhạt. Riêng ở CT 3 chồi thu được có chất lượng tốt nhất chồi mập, lá xanh đậm Kết luận: khi bổ sung casein ở nồng độ 0.1g/l vào môi trường nuôi cấy đã gia tăng hệ số nhân chồi, chiều cao, số lá và cả trọng lượng chồi lan Thạch Hộc Tía. 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Myo-inositol đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. Qua nghiên cứu tài liệu về nuôi cấy lan Thạch Hộc Tía chúng tôi thấy rằng trong một vài nghiên cứu có sử dụng myo-inosytol với nồng độ tối thiểu là 0.1g/l trong môi trường nền để tiến hành nghiên cứu với các nhân tố khác mà chưa khảo sát ảnh hưởng của Myo-inosytol đến sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối của cây[10]. Chính vì thế chúng tôi thực hiên nghiên cứu ảnh hưởng của Myo-inosytol với nồng đọ 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2g/l đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía
  38. 32 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của Myo-inositol đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía Chỉ số theo dõi Nồng Tổng số Biến Biến động Biến động CT độ chồi vào Chất lượng HSN chiều động khối (g/l) mẫu/CT chồi cao số lá lượng (cm) (g) 1(ĐC) 0.0 18 1.39c 0.25d 3.56c 0.37c Chồi kém 2 0.05 18 2.31b 0.65c 5.22b 0.66b Chồi trung bình 3 0.1 18 3.67a 1.37a 6.89a 1.03a Chồi tốt 4 0.15 18 3.33a 1.28a 4.90b 0.76b Chồi trung bình 5 0.2 18 2.17b 0.91b 4.00c 0.47c Chồi trung bình LSD0.5 0.43 4.25 0.68 0.12 CV% 6.12 0.11 5.08 6.26 a, b, c, thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo phương pháp Duncan Chú thích: - Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm - Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt - Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt Qua 40 ngày nuôi cấy, biến động hệ số nhân chồi đạt được ở các CT thí nghiệm có sự sai khác ở mức ý nghĩa 99%, biến động từ 1.39 lần đến 3.67 lần. Trong đó, nồng độ 0.1g/l (CT 3) cho hệ số nhân chồi đạt cao nhất (3.67 lần), tiếp theo đến các CT 4 (3.33 lần), CT 2 (2.31 lần), CT 5 (2.17 lần)CT đối chứng (1.39 lần) . Không có sự sai khác ý nghĩa giữa CT 2, 4, 5. Đối với biến động số lá ở các CT thí nghiệm có sự sai ở mức độ tin cậy 99%, biến động từ 3.56 lá/chồi đến 6.89 lá/chồi. Trong đó ở CT 3 (0.1g/l) cho biến động số lá cao nhất đạt 6.89 lá/chồi, tiếp đến là các CT 2 ( 5.22 lá/chồi), CT 4 (4.90 lá/chồi), CT 5 (4.00 lá/chồi) và cho biến động số lá thấp nhất ở CT đối chứng (3.56 lá/chồi). Ở chỉ tiêu biến động chiều cao các CT có sự sai khác với CT đối chứng ở mức tin cậy 99%, biến động từ 0.25 cm/chồi đến 1.37cm/chồi. Trong đó ở CT bổ sung
  39. 33 0.1g/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (1,37 cm/chồi), tiếp đến là CT 4 (1.28 cm/chồi), CT 5 (0.91 cm/chồi) và CT 2 (0.25 cm/chồi). Biến động khối lượng ở các CT thí nghiệm có sự sai khác so với CT đối chứng ở mức độ tin cậy 99%. Khối lượng biến động từ 0.37 g/chồi (CT đối chứng) đến 1.03g/chồi. Trong đó biếng động khối lượng đạt cao nhất ở CT 3 (1.03 g/chồi),CT 4(0.76 g/chồi), CT 2(0.66 g/chồi), và CT 5 (0.47 g/chồi). Về chất lượng chồi khi quan sát thấy rằng ở CT chồi thu được có chất lượng tốt lá xanh thẫm, chồi mập. Các CT thí nghiệm còn lại cho chất lượng chồi trung bình. Kết luận bổ sung myo-inosytol với nồng độ 0.1g/l môi trường có tác động tích cực đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. Bảng 4.6: Ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía Chỉ số theo dõi Tổng số Biến Biến Nồng động Biến động CT chồi vào Chất lượng độ(g/l) HSN chiều động khối mẫu/CT chồi cao số lá lượng (cm) (g) 1(ĐC) 0.0 18 1.44d 0.28e 3.11d 0.43d Chồi kém 2 1.5 18 2.61c 0.63d 5.11b 0.61bc Chồi trung bình 3 3.0 18 4.56a 1.64a 6.78a 0.89a Chồi tốt 4 4.5 18 3.72b 1.41b 5.22b 0.65b Chồi trung bình 5 6.0 18 2.50c 1.41c 5.22c 0.47cd Chồi trung bình LSD0.5 0.44 0.15 0.24 8.89 CV% 5.46 5.55 1.88 0.15 a, b, c, thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo phương pháp Duncan. Chú thích: - Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm - Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt - Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt
  40. 34 Kết quả ở bảng 4.6 cho thấy khi bổ sung cao nấm men vào môi trường nuôi cấy rõ ràng có ảnh hưởng tích cực đến các chỉ tiêu sinh trưởng như hệ số nhân chồi, số lá, chiều dài và khối lượng chồi. Ở tất cả các CT bổ sung cao nấm men đều cho hệ số nhân chồi cao hơn CT đối chứng. Bổ sung cao nấm men ở nồng độ 1g/l cho hệ số nhân chồi cao nhất ( 4.56 lần). Trong khi đó ở các nồng độ khác thì hệ số nhân chồi thấp hơn dao động từ 2.50 - 3.72 lần, đối chứng lá 1.44 lần. Đối với biến động số lá ở các CT thí nghiệm có sự sai ở mức độ tin cậy 99%, biến động từ 3.11 lá/chồi đến 6.78 lá/chồi. Trong đó ở CT 3 (0.1g/l) cho biến động số lá cao nhất đạt 6.78 lá/chồi, tiếp đến là các CT 4 ( 5.22 lá/chồi), CT 2 (5.11 lá/chồi), CT 5 (5.12 lá/chồi) và cho biến động số lá thấp nhất ở CT đối chứng (3.11 lá/chồi). Ở chỉ tiêu biến động khối lượng các CT có sự sai khác với CT đối chứng ở mức tin cậy 99%, biến động từ 0.43g/chồi đến 0.89 g/chồi. Trong đó ở CT bổ sung 0.1g/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (0.89 cm/chồi), tiếp đến là CT 4 (0.65 g/chồi), CT 2 (0.61 g/chồi) và CT 5 (0.47 g/chồi) và cuối cùng là CT đối chứng ( 0.43 g/chồi). Biến động chiều cao ở các CT thí nghiệm có sự sai khác so với CT đối chứng ở mức độ tin cậy 99%, biến động từ 0.28 cm/chồi đến 1.64 cm/chồi. Trong đó, nồng độ 0.1 g/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (1.64 cm/chồi), tiếp theo đến các CT 4 (1.41 cm/chồi), CT 5 (1.41 cm/chồi), CT 3 (0.63 cm/chồi) CT đối chứng (0.28 cm/chồ) . Không có sự sai khác ý nghĩa giữa CT 2, 4, 5. Bằng mắt thường ta có thể nhận thấy chất lượng của chồi ở CT bổ sung 100ml/l (CT 3) cho chất lượng chồi tốt nhất, lá rộng xanh thẫm, chồi mập. Ở các CT khác chất lượng thấp hơn so với CT 3. Kết luận: cao nấm men phù hợp với sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía với nồng độ 3g/l
  41. 35 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tảo spirulina đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. Trong tảo spirulina có chứa các nhóm chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây như các vitamin, các amino acid, các chất khoáng đa lượng, vi lượng trong tảo spirulina có chứa các nhóm chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây như các vitamin, các amino acid, các chất khoáng đa lượng, vi lượng. Để đánh giá được ảnh hưởng của tảo chúng tôi tiến hành thí nghiệm và kết quả được thể hiện ở bảng dưới đây. Bảng 4.7: Ảnh hưởng của tảo spirulina đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía Chỉ số theo dõi Nồng Tổng số Biến Biến động Biến động CT độ chồi vào Chất lượng HSN chiều động khối (g/l) mẫu/CT chồi cao số lá lượng (cm) (g) 1 (ĐC) 0.0 18 1.44d 0.40d 3.67c 0.21d Chồi kém 2 0.03 18 2.83b 0.73c 5.44b 0.40c Chồi trung bình 3 0.05 18 4.89a 1.21a 7.78a 0.87a Chồi tốt 4 0.07 18 3.00b 0.90b 5.33b 0.60b Chồi trunh bình 5 0.09 18 1.94c 0.73c 3.89c 0.47c Chồi trung bình LSD0.5 0.20 0.20 0.20 0.10 CV% 2.53 2.5 2.53 4.12 a, b, c, thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cây P>0.01 theo phương pháp Duncan Chú thích: - Chồi tốt: chồi mập, xanh đậm - Chồi trung bình: chồi nhỏ, xanh nhạt - Chồi kém: chồi nhỏ, vàng nhạt
  42. 36 Sau 40 ngày nuôi cấy trên môi trường bổ sung tảo spirulina với dải nồng độ từ 0 đến 0.09g/l thu được kết quả ở bảng 4.7. Kết quả cho thấy các CT môi trường bổ sung tảo spirulina có sự sai khác so với CT đối chứng. Hệ số nhân có sự biến động ở các CT thí nghiệm có sự sai khác ở mức độ tin cậy 99%, giá trị này biến động từ 1.44 lần đến 4.89 lần. Môi trường bổ sung 0.05g/l tảo cho hệ số chồi cao nhất đạt 4.89 lần. Nếu tiếp tục tăng nồng độ tảo trên 0.05g/l thì hệ số nhân giảm dần. Cụ thể ở nồng độ 0.07g/l hệ số nhân chồi giảm từ 4.89 xuống 3.00 lần, CT bổ sung 0.09g/l giảm xuống còn 1.94 lần. Đối với biến động số lá ở các CT có sự sai khác với CT đối chứng. Số lá sau 40 ngày nuôi cấy biến động từ 3.67 đến 7.78 lá/chồi. Biến động số lá ở CT đối chứng thấp nhất là 3.67 lá/chồi, tiếp theo là CT 5 là 3.89 lá/chồi, CT 4 là 5.33 lá/chồi, CT 2 là 5.44 lá/chồi CT 3 có biến động số lá cao nhất 7.78 lá/chồi. Ở chỉ tiêu biến động chiều cao các CT có sự sai khác với CT đối chứng ở mức tin cậy 99%, biến động từ 0.40 cm/chồi đến 1.21cm/chồi. Trong đó ở CT bổ sung 0.05g/l (CT 3) cho biến động chiều cao lớn nhất (0.90 cm/chồi), CT 2 và 5 có chung giá trị biến động 0.73 cm/chồi Biến động khối lượng ở các CT thí nghiệm có sự sai khác so với CT đối chứng ở mức độ tin cậy 99%. Khối lượng biến động từ 0.21 g/chồi (CT đối chứng) đến 0.87g/chồi. Trong đó biếng động khối lượng đạt cao nhất ở CT 3 (0.87 g/chồi),CT 4(0.60 g/chồi), CT 5(0.47 g/chồi), và CT 2(0.40 g/chồi). Đã có nghiên cứu bổ sung tảo spirulina vào môi trường nhân chồi trên đối tượng lan hài hồng. Nguyễn Thị Cúc (2014) [2] đã xác định môi trường bổ sung 50mg/l tảo spirulina cho số chồi đạt cao nhất là 4,0 lần cấy. Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả của tác giả. Từ kết quả thí nghiệm trên kết luận rằng môi trường MS bổ sung 50mg/l tảo spirulina thích hợp cho quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối lan Thạch Hộc Tía.
  43. 37 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Kết quả nghiên cứu của đề tài khẳng định rằng chất hữu cơ có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. Cụ thể như sau: Bổ sung nước dừa làm tăng khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. Trong các nồng độ nghiên cứu (từ 0-200 ml/l), bổ sung 100ml/l nước dừa cho hệ số nhân, số lá, chiều cao và cả khối lượng tươi đều cao nhất lần lượt là 4,56 lần, 7.56 lá/chồi, 1,64 cm, 0,89g. Bổ sung 100g/l chuối hệ nhân chồi trong thí nghiệm đạt 3.55 lần, ở các chỉ tiêu khác như biến động chiều cao, số lá, khối lượng tươi của chồi cũng đạt giá trị cao nhất lần lượt là 1.34cm, 7.22 lá/chồi, 1.03 g và cho chất lượng chồi mập, xanh đậm. Bổ sung khoai tây và môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. Trong các nồng độ nghiên cứu (từ 0- 105ml/l), bổ sung 75g/l khoai tây cho hệ số nhân chồi 3.72 lần chiều cao, số lá, khối lượng tươi của chồi thu được đạt giá trị cao nhất lần lượt là 1.30 cm, 7.22 lá/chồi, 1.10 g. Chiều cao, số lá, hệ số nhân và khối lượng đạt 1.37cm, 7.11 lá/chồi, 1.23 lần, 3.67g khi bổ sung 0,1g/l và chất lượng chồi sau 40 ngày nuôi cấy cũng có hình thái xanh thẫm và mập khi bổ sung 0.1g/l casein. Khi bổ sung 0.1g/l myo-inositol có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía. Trong các nồng độ nghiên cứu (từ 0- 0.2g/l) ở nồng độ 0.1g/l cho hệ số nhân chồi, số lá, khối lượng và chiều cao đạt giá trị cao nhất trong thí nghiện này lần lượt là 3.67 chồi/mẫu, 6.89 lá/chồi, 1.03g và 1.37cm. Cao nấm bổ sung ở nồng độ 3g/l cho hệ số nhân chồi 4,56 lần, khối lượng đạt 0.89, số lá đạt 2.11 lá/chồi, chiều cao chồi đạt 1.64 cm. Tảo spirulina có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối chồi lan Thạch Hộc Tía. Môi trường cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 4.89 lần, chiều cao đạt 1.21cm, số lá 2.11 lá/chồi, trọng lượng 0.87g khi bổ sung 50mg/l, cho chất lượng chồi tốt nhất trong thí nghiệm.
  44. 38 5.2. Kiến nghị Nghiên cứu môi trường nuôi cấy loại bỏ hoàn toàn các chất điều tiết sinh trưởng . Nghiên cứu kết hợp các hợp chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối lan Thạch Hộc Tía. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống lan Thạch Hộc Tía từ hạt Tách chiết hợp chất trong cây lan Thạch Hộc bổ sung vào thực phẩm chức năng: Cao Thạch Hộc, đồ uống, nước giải khát,
  45. 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng việt 1. Ngô Xuân Bình, Võ Hà Giang(2010), “Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống phong lan Đuôi Chồn Rhynchostylis retusa [L.] blume bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”, Tạp chí nông nghiệm & phát triển nông thôn, (146), trang 25-30. 2. Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Văn Kết, Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Kim Lý(2014). “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ liên quan đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) in vitro”., Tạp chí sinh học, 36, 251-254. 3. Nguyễn Kim Dung, Nguyễn Văn Việt, Bùi Văn Thắng(2016). “Nhân giống lan hoàng thảo ý thảo ba màu (Dendrobium gratiosissimum reichenb.f) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”, Tạp chí khoa học và công nghệ lân nghiệm, 16, 157-158. 4. Đặng Văn Đông(2004), Công nghệ mới trồng hoa cho thu nhập cao, Nxb Lao Động và Xã Hội, Hà Nội. 5. Lê Trần Đức(2008), Cây thuốc Việt Nam, NXB Nông nghiệm, trang 962 – 965. 6. Đỗ Đăng Giáp, Phạm Ngọc Vinh, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Thị Huyền Trang, Phạm Ngô Ánh Thư, Thái Xuân Du(2012). “Tăng hệ số nhanh nhanh chồi chuối Laba (Musa SP.) nuôi cấy in vitro bằng sử dụng ánh sáng, myo-inositol và adenin sulphate”, Tạp chí sinh học, 34, 183-184. 7. Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà(2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng lan hài quý P. hangianum perner Gurss (Hài hằng) thu thập ở Việt Nam”, Tạp chí khoa học và phát triển, 8, 195-198. 8. Mai Thị Phương Hoa, Đỗ Tiến Vinh(2018).” Nuôi cấy protocorm lan Thạch Hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) in vitro”, Tạp chí khoa học và công nghệ, 3, 52-57. 9. Đỗ Thị Hào(2015), Nghiên cứu nhân giống lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium nobile Lindl) từ hạt bằng phương pháp nuôi cấy mô tại Trường đại Học Nông Lâm Thái Nguyên, Trường đại Học Nông Lâm Thái nguyên.
  46. 40 10. Nguyễn Thị Diệu Hoa(2017), “ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và biện phát ký thuật đến sinh trưởng của giống lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) tại Thái Nguyên”, Luận văn Thạc sỹ cây trồng, Trường Đai học Nông Lâm Thái Nguyên. 11. Hoàng Thị Hằng, Nguyễn Huỳnh Trâm Anh(2017),Xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro lan Thạch Hộc Tía(Dendrobium officinale Kimura et Migo) trên môi trường hữu cơ chứa phân trùn quế( Perionyx Excavatus )kết hợp với bột sắn dây (Pueraria Thomsoni). Hội nghị khoa học toàn quốc 2017 Sinh lý thực vật ứng dụng trong công nghệ cao, Trường Đại học Lạc Hồng tháng 12 năm 2017 12. Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013), “Nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile Lindl”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 11, số 7, 917- 925. 13. Đỗ Tất Lợi(2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, trang 628 – 642 14. Phí Thị Cẩm Miêu(2012), “ Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume)”, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên. 15. Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch, Đỗ Đức Thịnh(2008), “Xây dựng quy trình nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng (Cymbidium iridioides) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô”, Tạp chí Khoa học kĩ thuật Nông Nghiệm, 4: 387-394. 16. Nguyễn Văn Song (2011), “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dedrobium chysotoxum)- một loài lan có nguy cơ tuyệt chủng”, Tạp chí Khoa học Đại học Huế, 64: 127-136. 17. Nguyễn Thị Sơn, Trần Thế Mai, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Lý Anh (2013), “Nghiên cứu ứng dụng hệ thống bioreator plantima trong nhân giống loài lan Hoàng thảo Thạch Hộc (Dendrobium nobile Lindl)”, Tạp chí Nông nghiệm và Phát triển nông thôn, 2: 28-34.
  47. 41 18. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2014), “Nhân dòng vô tính cây lan hồ điệp Phalaenopsis sogo yukidian”. Tạp trí khoa học và phát triển, 12, 1289-1291. 19. Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thủy, Đặng Thị Nhàn và cs (2014), “Nhân giống in vitro lan Dendrobium Officinale Kimura Et Migo (Thạch Hộc Thiết Bì)”. Tạp chí khoa học và phát triển, 12, 1277. 20. Nguyễn Quỳnh Trang, Vũ Thị Huệ, Khuất Thị Hải Ninh và cs (2013), “Nhân giống in vitro lan phi điệp tím (Dendrobium anosmum)”. Tạp trí khoa học và công nghệ lâm nghiệm, 3, 17. 21. Nguyễn Thị Huyền Trang, Đặng Thị Kim Thúy, Đỗ Đức Thăng và cs (2019). “Ứng dụng các hợp chất hữu cơ thay thế nguồn Nitrate vô cơ trong môi trường nuôi cấy sinh khối và thử hoạt tính sinh học của cây Lan kin tuyến (Anoectochilus formosanus HAYATA) in vitro”. Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 55 136-139. 22. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Trường Sơn, Đỗ Năng Vịnh (2003), “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồnphong lan Phalaenopsis (lan Hồ Điệp)”, Báo cáo khoa học, hội nghị CNSH toàn quốc 2003, trang 850-85. 23. Đỗ Đức Thăng, Lê Đức Tuấn, Bùi Minh Trí, và cs, 2017. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men và peptone lên sự sinh trưởng cua cây lan gấm (Anoectochilus roxburghii) in vitro ( 24. Mai Thị Tâm, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Trường Sơn (1999), “Nghiên cứu và nhân nhanh giống lan Dendrobium E.R ”, Kết quả nghiên cứu khoa học nữ cán bộ giảng dạy Đại học Nông Nghiệm I. 25. Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thị Lan, Nguyễn Thành Luân (2007), “Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và giá thể đến sinh trưởng của cây lan Dendrrobium hybrid in vitro”. Tạp chí khoa học và công nghệ, 3, 105-108.
  48. 42 26. Huỳnh Văn Thới (2005), Cẩm nang nuôi trồng và kinh doanh phong lan, Nxb Trẻ. 27. Nguyễn Thanh Tùng và Trương Thị Bích Phượng (2009), “ Nhân nhanh invitro cây Mỹ Dung Dạ Lan vanda denisoniana benson ”, Hội nghị CNSH toàn quốc năm 2009, 452-454. 28. Từ điển Bách khoa dược học Việt Nam, (1999), Nxb Y học. II. Tiếng Anh 29. Parisa Shekarriz, Mohsen Kafi, Shirin Dianati Deilamy, Masoud Mirmasoumi (2014). III. Trang web
  49. PHẦN PHỤ LỤC Phụ lục 1: một số hình ảnh thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 333 33# 33# Hình 1: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ nước dừa CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 50ml/l nước dừa CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 100ml/l nước dừa CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 150ml/l nước dừa CT5: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 200ml/l nước dừa
  50. CT5 CT4 CT3 CT2 CT1 Hình 2: chồi lan Thạch Hộc Tía trên môi trường chuối CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 100g/l chuối CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 100g/l chuối CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 150g/l chuối CT5: MS + 30g/l Sucroza + 5g/l agar + 200g/l chuối
  51. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 3: Chồi lan Thạch Hộc Tía trên môi trường khoai tây CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 45g/l chuối CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 60g/l chuối CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 75g/l chuối CT5: MS + 30g/l Sucroza + 5g/l agar + 90g/l chuối
  52. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 4: Chồi lan Thạch Hộc Tía trên môi trường casein CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.05g/l casein CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.1g/l casein CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.15g/l casein CT5: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.2g/l casein
  53. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 5: chồi lan Thạch Hộc Tía trên môi trường myo-inosytol CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.05g/l myo-inosytol CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.1g/l myo-inosytol CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.15g/l myo-inosytol CT5: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.2g/l myo-inosytol
  54. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 6: Chồi lan Thạch Hộc Tía trên môi trường cao nấm men CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 1.5g/l cao nấm men CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 3g/l cao nấm men CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 4.5 g/l cao nấm men CT5: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 6 g/l cao nấm men
  55. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 7: Chồi lan Thạch Hộc Tía trên môi trường tảo spirulin CT1: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar CT2: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.03g/l tảo spirulin CT3: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.05g/l tảo spirulin CT4: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.07 g/l tảo spirulin CT5: MS+30g/l Sucroza + 5g/l agar + 0.09 g/l tảo spirulin