›

Đồ án Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất theo phương pháp kết tủa bằng nước chua

pdf 76 trang thiennha21 12/04/2022 2780
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất theo phương pháp kết tủa bằng nước chua", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_kha_nang_ung_dung_chitosan_hoa_tan_trong_nu.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất theo phương pháp kết tủa bằng nước chua

  1. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan toàn bộ nội dung đồ án tốt nghiệp là của riêng em. Các kết quả nghiên cứu đƣa ra trong đồ án này do em tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan, không sao chép của bất kỳ kết quả nghiên cứu nào của các tác giả khác. Nội dung của đồ án có tham khảo và sử dụng một số thông tin, tài liệu từ các nguồn sách, tạp chí đƣợc liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo. Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Linh Chi
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Qua hơn 3 tháng thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất theo phương pháp kết tủa bằng nước chua” đến nay đã đƣợc hoàn thành. Em xin cám ơn BGH trƣờng Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh cùng tất cả quý Thầy Cô, bạn bè trong phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài. Đặc biệt em xin gửi lời cám ơn đến TS. Nguyễn Lệ Hà, Cô đã tận tình giúp đỡ và hƣớng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Bên cạnh những nỗ lực của bản thân thì đây vẫn là một lĩnh vực khá mới, đòi hỏi chuyên môn sâu và kinh nghiệm thực tế. Song, do bản thân còn nhiều hạn chế về kiến thức, kinh nghiệm cũng nhƣ gặp phải một số khó khăn trong việc sƣu tầm tài liệu và những thông tin cần thiết có liên quan đến đề tài nên những thiếu sót trong việc phân tích, trình bày đồ án là không thể tránh khỏi. Em rất mong nhận đƣợc sự chỉ dẫn thêm từ quý Thầy Cô. Kính chúc mọi ngƣời luôn dồi dào sức khỏe, vui vẻ và luôn thành công trong công việc. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 07 năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Linh Chi
  3. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục đích và nội dung nghiên cứu 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về đậu hũ 3 1.1.1. Giới thiệu về đậu nành 3 1.1.1.2.1. Tính tan 4 1.1.2. Quy trình sản xuất đậu hũ 6 1.1.3. Các chỉ tiêu chất lƣợng của đậu hũ 11 1.1.4. Những nguyên nhân và biến đổi gây hƣ hỏng đậu hũ 13 1.2. Tổng quan về chitin - chitosan 15 1.2.1. Giới thiệu về chitin – chitosan 15 1.2.2. Cấu trúc hóa học của chitin – chitosan 16 1.2.3. Tính chất của chitosan 18 1.2.4. Các phƣơng pháp thu nhận chitosan 25 1.2.5. Chitosan tan trong nƣớc (WSC) 28 1.2.6. Ứng dụng của chitosan trong thực phẩm 30 CHƢƠNG 2.NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. Nguyên vật liệu 34 2.1.1. Nguyên liệu 34 2.1.2. Vật liệu 34 2.2. Bố trí thí nghiệm 34 2.2.1. Chuẩn bị cho nghiên cứu 34 2.2.3. Tiến hành thí nghiệm 37 i
  4. Đồ án tốt nghiệp 2.2.4. Phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu 38 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. Một số thông số cơ bản của đậu hũ dùng trong nghiên cứu 39 3.2. Nghiên cứu quá trình biến đổi của đậu hũ trong thời gian bảo quản 39 3.2.1. Khảo sát biến đổi pH của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 39 3.2.2. Khảo sát độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 42 3.2.3. Khảo sát chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 44 3.2.4. Khảo sát chỉ tiêu nấm men – nấm mốc trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 46 3.2.5. Khảo sát chỉ tiêu E. coli trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 48 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1. Kết luận 51 4.2. Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 ii
  5. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CFU: colonies forming unit, đơn vị hình thành khuẩn lạc EMB: Eosine Methylene Blue Agar MPN: most probable number MR: Methyl Red PCA: Plate Count Agar PDA: Potato Dextrose Agar SCA: Simmon Citrate Agar TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam TPC: tổng vi sinh vật hiếu khí VP: Voges – Proskauer WSC: chitosan hòa tan trong nƣớc iii
  6. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.3. Hàm lƣợng acid amin không thay thế trong protein đậu nành 4 Bảng 1.4. So sánh hai phƣơng pháp đông tụ protein trong sữa đậu nành 10 Bảng 1.5. Chỉ tiêu cảm quan của đậu hũ (TCVN 4978 : 1997) 11 Bảng 1.6. Chỉ tiêu vi sinh của đậu hũ (Lê Văn Việt Mẫn, 2011) 12 Bảng 1.7. Chỉ tiêu hóa lý của đậu hũ (TCVN 49 : 78) 12 Bảng 1.8. Tính chất chitosan sản xuất từ chitin chiết rút bằng phƣơng pháp hóa học và sinh học 27 Bảng 1.9. Bảng so sánh các tính chất của chitosan tan trong acid và chitosan tan trong nƣớc 29 Bảng 2.1. Các phƣơng pháp xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của dung dịch ngâm đậu hũ 38 Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu đƣợc xác định của đậu hũ dùng trong nghiên cứu 39 Bảng 3.2. Giá trị pH của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 39 Bảng 3.3. Giá trị độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 42 Bảng 3.4. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 44 Bảng 3.5. Mật độ nấm men nấm mốc trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 46 Bảng 3.6. Số lƣợng E. coli giả định trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 48 iv
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ quy trình sản xuất đậu hũ 7 Hình 1.2. Cấu tạo hóa học của chitin 16 Hình 1.3. Cấu tạo hóa học của chitosan 17 Hình 1.4. Sơ đồ sản xuất và thu nhận chitosan 27 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36 Hình 3.1. Biến đổi pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 40 Hình 3.2. Biến đổi độ đục của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 43 Hình 3.3. Biến đổi về tổng vi sinh vật hiếu khí của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 45 Hình 3.4. Biến đổi về nấm men – nấm mốc của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 47 Hình 3.5. Biến đổi về E. coli giả định của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh 49 v
  8. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu hũ là một sản phẩm đƣợc ƣa chuộng của ngƣời châu Á, thích hợp cho nhiều đối tƣợng do dễ tiêu hóa, dễ sử dụng, ít cholesterol và chất béo bão hòa rất tốt cho sức khỏe của con ngƣời. Tuy nhiên, đậu hũ khó bảo quản và dễ hƣ hỏng do thành phần giàu dinh dƣỡng và chứa hàm lƣợng nƣớc cao, thời hạn sử dụng cao nhất của đậu hũ là từ 1 đến 2 ngày trong điều kiện bình thƣờng (Dotson và cộng sự, 1977; Kovats và cộng sự, 1984). Vì vậy, nhiều ngƣời sản xuất đã bổ sung thạch cao, chất phụ gia hoặc chất bảo quản trong quá trình sản xuất để kéo dài thời gian bảo quản, điều này gây ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe của ngƣời tiêu dùng. Hiện nay, các nhà nghiên cứu đang cố gắng tìm ra các chất bảo quản có hoạt tính sinh học để thay thế cho chất bảo quản hóa học, và một trong những chất đó là chitosan. Chitosan là polysaccharide nhiều thứ hai sau cellulose đƣợc tìm thấy trong tự nhiên, đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng chitosan trong thực tế nhƣ nông nghiệp, công nghiệp, y dƣợc, bảo vệ môi trƣờng, chất bảo vệ hoa quả, Một số nƣớc nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc đã có nghiên cứu khoa học về ứng dụng chitosan vào bảo quản đậu hũ. Ở Việt Nam chƣa có báo cáo khoa học nào về đề tài này, vì vậy, chúng tôi muốn thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất bằng phương pháp kết tủa nước chua” trong điều kiện khí hậu cũng nhƣ nguồn nguyên liệu của Việt Nam. 2. Mục đích và nội dung nghiên cứu Mục đích chung của đồ án là nghiên cứu khả năng sử dụng chitosan hòa tan trong nƣớc để kéo dài thời gian bảo quản đậu hũ sản xuất theo phƣơng pháp kết tủa bằng nƣớc chua. Để đạt đƣợc mục đích này, nghiên cứu tập trung vào một số nội dung sau: - Phân tích một số chỉ tiêu cơ bản của đậu hũ dùng trong nghiên cứu. Trang 1
  9. Đồ án tốt nghiệp - Theo dõi biến đổi chất lƣợng của đậu hũ thông qua dung dịch ngâm đậu hũ trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh. Trang 2
  10. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đậu hũ 1.1.1. Giới thiệu về đậu nành 1.1.1.1. Khái quát về đậu nành Đậu nành là một trong những cây trồng cổ nhất của nhân loại đƣợc trồng từ hơn 5000 năm trƣớc, có tên khoa học là Glycine Maxx Merril. Bảng 1.1. Thành phần của hạt đậu nành (Nguyễn Thị Hiền, 2006) Thành Tỷ lệ Protein Lipid Tro Chất bột phần của (%) (%) (%) (%) đƣờng (%) hạt Đậu hạt 100,0 40,0 21 4,9 34 Tử diệp 90,3 43,0 23 5,0 29 Vỏ đậu 8,0 8,8 1 4,3 86 Mầm 2,4 41,1 11 4,4 43 Bảng 1.2. Thành phần protein đậu nành (Ngô Thế Dân và cộng sự, 1998) Phân đoạn Hàm lƣợng Thành phần Phân tử lƣợng (S) (%) (Da) 2 15 Chất ức chế trypsin 8000 – 20000 7 35 – conglicinine 150000 – amylase 62000 Lipoxygenase 102000 Hemagglutinin 110000 11 40 Glycinin 320000 - 350000 15 10 600000 Trang 3
  11. Đồ án tốt nghiệp Đậu nành cũng nhƣ tất cả các hạt khác đều chứa enzyme cần thiết cho quá trình nảy mầm. Về mặt công nghệ thì enzyme quan trọng của đậu nành là lipoxygenase. Enzyme này xúc tác cho phản ứng oxy hóa acid béo không bão hòa, gây mùi hôi cho đậu nành. Bảng 1.3. Hàm lƣợng acid amin không thay thế trong protein đậu nành Các acid amin Giá trị (%) không thay thế Tryptophan 1,28 Leucine 7,78 Isoleucine 4,54 Valine 4,80 Threonine 3,86 Lysine 6,38 Methionine 1,26 Phenylalanine 4,94 Trừ methionine quá thấp, các acid amin khác của đậu nành có thành phần gần giống thịt. 1.1.1.2. Tính chất của protein đậu nành 1.1.1.2.1. Tính tan Trong protein đậu nành, globulin không tan trong nƣớc trong khi phosphate canxi, acid phititic có thể làm cho protein đậu tan đến 90%. Tuỳ loại thực phẩm mà tính tan này đƣợc ƣa chuộng hoặc không. Ở đây ta lợi dụng tính chất trái ngƣợc, đó là đặc tính kết tủa của protein đậu nành. Protein đậu kết tủa ở pI = 4,5. Tính tan của protein đậu nành còn bị ảnh hƣởng bởi lực ion. Ở pH=6,8 lực ion ít ảnh hƣởng, ở pH = 2 lực ion làm giảm tính tan, ở pH = 4,7 lực ion làm tăng tính tan. Trang 4
  12. Đồ án tốt nghiệp Tính tan của protein đậu nành còn bị ảnh hƣởng bởi chế độ xử lý nhiệt. Nhiệt xử lý làm biến tính và giảm tính tan của protein đậu nành, sau đó một số protein có thể phân cắt thành các thành phần nhỏ hơn và tan lại. 1.1.1.2.2. Khả năng hấp thụ và giữ nước Khả năng hấp thụ và giữ nƣớc của protein dựa trên tƣơng tác giữa protein – protein và protein – nƣớc. Khi nồng độ protein tăng, khả năng hấp thụ nƣớc tăng. Khi pH thay đổi thì sự tích điện của protein cũng thay đổi. Do đó, ở điểm đẳng điện, sự hút nƣớc là thấp nhất vì tƣơng tác giữa protein – protein rất chặt chẽ. Ở pH cao hơn và thấp hơn pI, sự hấp thụ và giữ nƣớc của protein tăng. Khi nhiệt độ tăng, khả năng hấp thụ nƣớc giảm vì giảm các liên kết hydro nhƣng làm tăng các liên kết khác nhƣ liên kết disunfide 1.1.1.2.3. Khả năng tạo gel Protein đậu nành có khả năng tạo gel. Khi đó protein tạo mạng lƣới giữ các phân tử nƣớc lại cho thực phẩm chứa nhiều nƣớc và có sự liên kết chặt chẽ nhƣ cấu trúc của agar. Khi protein bị biến tính, các cấu trúc bậc cao bị phá hủy, các mạch polypeptide duỗi ra, tiến lại gần nhau, tiếp xúc và tạo nên mạng lƣới không gian tƣơng đối chặt chẽ. Các yếu tố gây tạo gel: Sử dụng nhiệt: khi dịch sữa protein đậu nành có nồng độ cao đƣợc đun nóng ở pH trung tính thì sẽ tạo gel. Sử dụng pH đẳng điện: ở pH đẳng điện, protein có khả năng tạo gel. Sử dụng các muối của ion kim loại hóa trị 2: nhờ liên kết giữa Ca2+, Mg2+ và nhóm carboxyl. 1.1.1.2.4. Khả năng tạo kết cấu Protein đậu nành có khả năng tạo sợi tốt. Khi protein bị phân ly, chuỗi polypeptide duỗi mạch và cho qua khuôn đúc sẽ định hƣớng đƣợc các phân tử protein và các sợi hình thành. Trang 5
  13. Đồ án tốt nghiệp 1.1.1.2.5. Khả năng tạo nhũ Trong phân tử protein đậu nành có đầu ƣa nƣớc và ƣa béo nên có khả năng làm bền hệ nhũ tƣơng chất béo/nƣớc. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tạo nhũ: pH: ở điểm đẳng điện, khả năng hòa tan là thấp nhất nên khả năng tạo nhũ giảm. Nhiệt độ: gia nhiệt và cô đặc làm đông tụ protein nên làm giảm độ bền của nhũ tƣơng, nhƣng do khả năng tạo gel đã tạo nên lớp màng protein và chất béo (tàu hũ ki). 1.1.2. Quy trình sản xuất đậu hũ 1.1.2.1. Quy trình sản xuất đậu hũ Trang 6
  14. Đồ án tốt nghiệp Đậu nành Loại bỏ tạp chất Ngâm hạt Đãi vỏ Xay ƣớt Dịch sữa đậu thô Lọc Bã Sữa đậu Gia nhiệt Nƣớc chua Kết tủa Ép Nƣớc Đậu hũ Hình 1.1. Sơ đồ quy trình sản xuất đậu hũ Trang 7
  15. Đồ án tốt nghiệp 1.1.2.2. Thuyết minh quy trình 1.1.2.2.1 Loại bỏ tạp chất Mục đích: loại bỏ các tạp chất cơ học nhƣ hạt sâu mọt, rơm, hạt lép khô, đất, đá, có trong nguyên liệu. 1.1.2.2.2. Ngâm hạt Mục đích: ngâm hạt nhằm mục đích làm hạt đậu hút nƣớc và trƣơng nở, làm mềm cấu trúc hạt đậu, dễ dàng cho công đoạn xay đậu và trích lọc protein đậu nành. Khi đó các phần tử nƣớc có tính lƣỡng cực sẽ tác động lên protein, lipid, glucid, cellulose. Quá trình này xảy ra hai giai đoạn: Giai đoạn đầu xảy ra quá trình solvat hóa. Ở giai đoạn này các liên kết trong hạt đậu chƣa bị phá vỡ. Giai đoạn hai xảy ra khi các phân tử nƣớc tiếp tục tác động và làm phá vỡ liên kết các phân tử trong hạt đậu, chuyển chúng sang trạng thái dịch thể keo linh động nằm trong các tế bào hạt đậu. Thời gian ngâm: Nhiệt độ ngoài trời từ 15oC – 25oC, ta ngâm 5 – 6 giờ. Nhiệt độ ngoài trời từ 25oC – 30oC, ta ngâm 3 – 4 giờ. Kết thúc giai đoạn ngâm là thời điểm độ ẩm hạt đậu đạt 55% - 65% là tốt nhất. 1.1.2.2.3. Đãi vỏ Mục đích: Sau khi ngâm, vỏ tách khỏi hạt đậu nành, tránh một số thành phần không mong muốn có trong vỏ hạt nhƣ sắc tố, chất chát, đi vào sữa đậu khi xay, làm giảm chất lƣợng của đậu hũ. 1.1.2.2.4 Xay Mục đích: Dùng lực cơ học để phá vỡ tế bào, nhằm giải phóng protein, lipid, glucid, Nhờ có nƣớc hòa tan các chất này và sẽ chuyển chúng sang dạng huyền phù. Trang 8
  16. Đồ án tốt nghiệp Các biến đổi: Kích thƣớc hạt đậu nành giảm đáng kể thành các hạt mịn. Nhiệt độ tăng do ma sát giữa các hạt rắn trong quá trình xay. Hóa lý: đây là biến đổi quan trọng vì các chất dinh dƣỡng trong đậu nành đƣợc trích ly vào nƣớc, đậu nành chuyển từ trạng thái hạt rời thành hỗn hợp huyền phù gọi là sữa đậu nành thô. Hóa sinh: có thể xảy ra phản ứng oxy hóa do enzyme lipoxygenase xúc tác. Enzyme này đƣợc giải phóng ra khi tế bào hạt đậu bị phá vỡ. Tuy nhiên, phản ứng xảy ra không đáng kể vì quá trình xay đƣợc thực hiện trong nƣớc. 1.1.2.2.5. Lọc Sau khi xay ta có một dung dịch huyền phù, gồm có dung dịch keo và những chất rắn không tan trong nƣớc. Trong quá trình tách dung dịch keo khỏi các chất rắn sẽ xảy ra hiện tƣợng các chất rắn sẽ giữ trên mặt nó những tiểu phần keo, vì vậy phải dùng nƣớc rửa lại phần bã. Lƣợng nƣớc dùng để rửa không nên quá nhiều. 1.1.2.2.6. Gia nhiệt Mục đích gia nhiệt: Ức chế enzyme và tiêu diệt toàn bộ các hệ vi sinh vật có mặt trong sữa. Loại bỏ những hợp chất gây mùi khó chịu trong dịch sữa. Phá vỡ lớp solvat (lớp nƣớc bao quanh) tạo điều kiện cho các phần tử sữa gần lại nhau hơn và dễ keo tụ hơn. Các biến đổi: Độ nhớt của dịch sữa giảm khi nhiệt độ tăng. Một số phản ứng phân hủy xảy ra làm tổn thất các thành phần dinh dƣỡng trong dịch sữa. Các thành phần đƣờng khử và acid amin tham gia phản ứng Maillard làm cho dịch sữa bị sậm màu. 1.1.2.2.7. Kết tủa Một số phƣơng pháp kết tủa protein đậu nành: Trang 9
  17. Đồ án tốt nghiệp - Kết tủa bằng ion kim loại kiềm thổ kết hợp với nhiệt độ. Các muối đông tụ protein đậu nành: CaSO4, MgSO4, CaCl2, MgCl2 Quá trình cho chất đông tụ vào đơn giản, dễ kiểm soát, có thể chỉ cho một lần vào dung dịch. Cơ chế đông tụ: đông tụ bằng muối của ion kim loại kiềm thổ xảy ra theo hai bƣớc: + Bƣớc 1: protein bị biến tính bởi nhiệt, các mạch polypeptide duỗi ra làm lộ các gốc –COO-. + Bƣớc 2: cation hóa trị 2 (kim loại kiềm thổ) cho vào sẽ liên kết các mạch protein lại với nhau nhờ các gốc –COO-, làm cho khối protein bị đông tụ. - Kết tủa bằng acid thực phẩm kết hợp với nhiệt độ. Các acid thực phẩm đƣợc dùng làm tác nhân gây đông tụ protein nhƣ: acid acetic, acid lactic, acid citric, glucono – delta – lactone (GDL) Trong các acid nói trên, acid lactic đƣợc sử dụng nhiều nhất. Acid lactic: có dạng lỏng, không thuận lợi cho việc vận chuyển, sử dụng. Ở các cơ sở sản xuất đậu hũ quy mô gia đình, ngƣời ta dùng nƣớc chua – là acid lactic đƣợc tạo ra bằng cách lên men phần nƣớc trong của sữa đậu nành sau khi tách protein. Cơ chế đông tụ: + Bƣớc 1: nhiệt sẽ làm biến tính protein, các mạch polypeptide duỗi ra và sẽ làm lộ ra các nhóm kỵ nƣớc nằm bên trong. + Bƣớc 2: acid hữu cơ cho vào sẽ cung cấp H+ trung hòa các điện tích âm của các mạch polypeptide bị biến tính bởi nhiệt, giúp tạo các liên kết kỵ nƣớc và disunfide, dẫn đến sự tập hợp protein. Bảng 1.4. So sánh hai phƣơng pháp đông tụ protein trong sữa đậu nành Các yếu tố Đông tụ bằng CaSO4 Đông tụ bằng acid thực phẩm Thời gian bảo quản Sản phẩm có pH = 6 – 6,8 Sản phẩm có pH = 5 – 5,5, khả nên thời gian bảo quản năng ức chế vi sinh vật cao nên ngắn. bảo quản lâu hơn. Trang 10
  18. Đồ án tốt nghiệp Mùi vị Không có mùi thơm đặc Có mùi thơm đặc trƣng của đậu trƣng của đậu nành nành Trạng thái bìa đậu Bìa đậu bị cứng, ngả màu Bìa đậu mềm, cầm dẻo tay, màu vàng trắng kem Ảnh hƣởng đến sức Để lại dƣ lƣợng kim loại An toàn cho sức khỏe ngƣời khỏe ngƣời dùng nặng nhƣ Cu, Pb, Hg dùng gây nguy hiểm cho sức khỏe con ngƣời 1.1.2.2.8. Ép và định hình thành khuôn bánh Sau khi chắt gạn nƣớc xong, cho ngay hoa đậu kết tủa vào khuôn ép để loại nƣớc, tạo khối cho sản phẩm. Thời gian ép định hình khoảng 10 phút, dùng vật nặng với khối lƣợng cố định để ép. 1.1.3. Các chỉ tiêu chất lượng của đậu hũ Bảng 1.5. Chỉ tiêu cảm quan của đậu hũ (TCVN 4978 : 1997) Tên chỉ tiêu Yêu cầu Hình dạng Sản phẩm có dạng hình hộp đáy chữ nhật, không bị vỡ nát. Cho phép không quá 20% sản phẩm bị mất góc và sứt mẻ. Khối lƣợng sản phẩm bị mất góc và sứt mẻ không quá 5%. Màu sắc Bề mặt màu trắng ngà, mặt cắt màu trắng Mùi vị Mùi thơm, vị ngon của đậu hũ không có mùi ôi, chua, khê và các mùi vị lạ khác. Tạp chất Không có cát sạn, mảnh vụn của cháy đậu và các loại tạp chất khác. Trạng thái Bề mặt đậu hũ mịn, sờ vào hơi ráp tay, không mủn bột. Khi sản xuất xong, để nguội ở nhiệt độ phòng, đậu hũ phải dẻo, khi cầm ở giữa miếng đậu không bị nứt. Mặt cắt của đậu hũ Trang 11
  19. Đồ án tốt nghiệp mịn, nhẵn. trên mặt cắt ngang của đậu hũ có lỗ hổng không quá 3. Ăn sống có cảm giác béo ngậy, dai. Miếng đậu khi ráng phải nở đều. Bảng 1.6. Chỉ tiêu vi sinh của đậu hũ (Lê Văn Việt Mẫn, 2011) Vi sinh vật Giới hạn cho phép trong 1g sản phẩm (cfu/g) Tổng số vi sinh vật hiếu khí 3.105 Coliforms 50 Escherichia coli 3 Clostridium perfringens 0 Salmonella 0 Bacillus cereus 10 Staphylococcus aureus 10 Clostridium botulinum 0 Bảng 1.7. Chỉ tiêu hóa lý của đậu hũ (TCVN 49 : 78) Tên chỉ tiêu Yêu cầu Hàm lƣợng nƣớc 83% Hàm lƣợng protein 10% Hàm lƣợng lipid 4.5% Hàm lƣợng chất xơ 0.7% Độ chua tính theo % trọng lƣợng (tính 0,9 0,1 theo acid acetic) Tạp chất và bã cháy Không có Trang 12
  20. Đồ án tốt nghiệp 1.1.4. Những nguyên nhân và biến đổi gây hư hỏng đậu hũ 1.1.4.1. Những nguyên nhân gây hư hỏng đậu hũ Có 2 nguyên nhân cơ bản dẫn đến giảm chất lƣợng và hƣ hỏng thực phẩm: do hoạt động của vi sinh vật và do hoạt động sinh lý, sinh hóa của nguyên liệu. Ngoài ra, các yếu tố khác nhƣ độ ẩm môi trƣờng, ánh sáng, không khí cũng ảnh hƣởng không nhỏ tới chất lƣợng của thực phẩm. Các vi sinh vật gây hƣ hỏng bao gồm vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và một số loại tảo, kí sinh trùng, virus Khi xâm nhập vào thực phẩm, đầu tiên vi sinh vật sẽ phát triển về mặt số lƣợng, trong quá trình đó chúng tiết ra các sản phẩm thải, làm biến đổi màu sắc, trạng thái, mùi vị của thực phẩm dẫn đến hƣ hỏng hoặc giảm chất lƣợng thực phẩm. Vi khuẩn có khả năng tiết ra nhiều enzyme hỗn hợp có thể phân hủy đƣợc tất cả các thành phần protein, glucid, lipid có trong thực phẩm. Sự lên men glucid hình thành các acid hữu cơ làm cho môi trƣờng trở nên acid. Trong quá trình này, các acid đƣợc tạo thành nhƣ acid acetic, acid lactic, ức chế vi sinh vật gây thối. Nấm men, nấm mốc tiêu thụ các acid làm cho môi trƣờng trở nên trung tính. Vi sinh vật gây thối bắt đầu phát triển chuyển hóa protid thành peptid, acid amin, và cuối cùng là các chất đơn giản bay hơi có mùi khó chịu nhƣ NH3, H2S, indol, phenol, Quá trình hƣ hỏng đậu hũ luôn bắt đầu từ bề mặt sau đó mới đi dần vào bên trong. Thƣờng trong giai đoạn đầu các vi khuẩn chứa enzyme hỗn hợp sẽ nhân lên trƣớc và hoạt động mạnh mẽ để khai phá nguyên liệu, sau đó đến lƣợt các vi khuẩn chứa enzyme đơn tiến hành phân hủy thực phẩm một cách mạnh mẽ và triệt để. Cùng với các enzyme do vi sinh vật tiết ra thì đồng thời những enzyme có sẵn trong bản thân khối thực phẩm cũng bị kích hoạt và tham gia vào các phản ứng phân hủy làm tăng tốc độ hƣ hỏng của thực phẩm. Đậu hũ là loại thực phẩm chứa nhiều protein, glucid và lipid. Mặt khác, hàm lƣợng nƣớc trong đậu hũ rất cao, đây là môi trƣờng thuận lợi cho vi sinh vật gây hƣ hỏng phát triển. Trang 13
  21. Đồ án tốt nghiệp 1.1.4.2. Những biến đổi của đậu hũ trong quá trình hư hỏng - Biến đổi protein: Từ các chất đạm tạo ra các chất nhƣ: amoniac, phenol, indol và các amin nhƣ: putresin, tyramin, histamin, Yếu tố quyết định tốc độ quá trình hƣ hỏng là nhiệt độ, độ ẩm tƣơng đối của không khí và mức độ nhiễm vi sinh vật ban đầu. Quá trình biến đổi protein thể hiện qua các dạng thối rữa, lên mốc, đổi màu, hóa nhầy - Sự lên men thối: quá trình lên men thối đƣợc chia làm 3 giai đoạn: Quá trình thủy phân protein dƣới tác dụng của enzyme protease do vi sinh vật tiết ra tạo thành nhiều sản phẩm trung gian và cuối cùng là acid amin. Quá trình khử acid amin thành amoniac, acid (acetic, propyonic, butyric), rƣợu (propyolic, butylic, amylic), H2S, indol, skatol. Các chất hữu cơ đƣợc tạo thành do sự phân hủy sơ bộ acid amin lại tiếp tục chuyển hóa. Tùy theo loại vi sinh vật và điều kiện môi trƣờng mà các hợp chất đó bị oxy hóa hoàn toàn cho ra các hợp chất vô cơ nhƣ CO2, H2O, NH3, H2S. Trong điều kiện kỵ khí sẽ cho ra các acid hữu cơ, rƣợu, amin, trong đó có nhiều chất độc và mùi hôi thối. Các vi khuẩn hiếu khí hoạt động mạnh nhƣ Bacterium Vulgaris, Bacterium Paecalis, Pseudomonas Fiuoresen, vi khuẩn yếm khí nhƣ Bacillus Spectogennes, Bacillus Putripicus, Bacillus Putripiciens, Bacillus Postamus, Clostridium Butulinum, Clostridium Sporogenes - Sự lên men chua: Trong quá trình lên men chua xảy ra hàng loạt các quá trình: quá trình tăng sinh khối của vi sinh vật tạo ra acid lactic, quá trình ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối bởi acid lactic và muối. Quá trình này xảy ra 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: đƣờng và các chất hòa tan có trong dịch bào của mô thực vật đƣợc thẩm thấu ra ngoài tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic và một số vi sinh vật khác phát triển. Trang 14
  22. Đồ án tốt nghiệp Giai đoạn 2: Trong giai đoạn này, sinh khối của vi khuẩn lactic đạt cao nhất. Đồng thời acid lactic tích tụ nhiều, pH của dịch giảm. Do tác dụng của vi khuẩn lactic mà các vi khuẩn gây thối phát triển rất nhanh. Cuối giai đoạn này lƣợng acid lactic tích tụ cực đại nên quá trình chyển sang giai đoạn 3. Giai đoạn 3: Vi khuẩn lactic chết dần trong khi nấm mốc và nấm men lại tăng dần số lƣợng. Acid lactic bắt đầu giảm nên sản phẩm hƣ hỏng nhanh. - Biến đổi lipid: Sự hóa chua lipid (sự thủy phân): sự tạo thành gốc tự do do hoạt động của enzyme. Dạng phân giải lipid này liên quan đến cả hai quá trình thủy phân lipid và sự oxy hóa acid béo do hoạt động của enzyme lipoxydase. Quá trình thủy phân lipid gây ra do vi sinh vật hoặc enzyme lipase nội tại. Bƣớc đầu tiên của phản ứng này là sự thủy phân triglyceride tạo thành glycerol và các acid béo tự do. Glycerol làm tăng độ nhớt, nhầy của chất béo. Các acid béo tạo ra càng nhiều càng làm cho thực phẩm bị chua (chỉ số acid tăng cao, chất lƣợng chất béo giảm). Oxy hóa: dƣới tác động của enzyme lipoxydase và oxy không khí. Sau khi thủy phân các sản phẩm glycerin và các chất béo tiếp tục bị oxy hóa tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau, trong đó nhiều sản phẩm độc hại nhƣ: peroxyde, hydroperoxyde, ceton, Các sản phẩm này làm cho thực phẩm có mùi khó chịu. 1.2. Tổng quan về chitin - chitosan 1.2.1. Giới thiệu về chitin – chitosan Chitin, chitosan là những polysaccharide tồn tại trong tự nhiên với sản lƣợng rất lớn (đứng thứ 2 sau cellulose). Chitin lần đầu tiên đƣợc tìm thấy trong nấm bởi nhà khoa học ngƣời Pháp Braconnot vào năm 1811, nó cũng đƣợc tách ra từ biểu bì của sâu bọ và đƣợc đặt tên là chitin, có nghĩa là bao bọc, tức là vỏ bọc của cuộc sống trong tiếng Hy Lạp, bởi nhà khoa học ngƣời Pháp Odier vào năm 1823. Và chất đƣợc khử acetyl từ chitin đã đƣợc khám phá bởi Roughet vào năm 1859, nó đƣợc đặt tên là chitosan bởi nhà khoa học ngƣời Ðức Hoppe Seyler vào năm 1894. Chitosan (đƣợc chuyển hoá từ chitin) rất độc đáo, là polymer hữu cơ tự Trang 15
  23. Đồ án tốt nghiệp nhiên duy nhất mang điện tích dƣơng do có những nhóm amino tự do tích điện dƣơng, điều này khiến cho chitosan có những thuộc tính đặc biệt hơn nhóm amide của chitin. Cho đến hôm nay, việc sử dụng hợp chất thiên nhiên này vẫn còn rất ít, vì chitin/chitosan dù dồi dào nhƣng lại ở các nguồn phân tán quá rộng, đặc biệt hàm lƣợng chứa trong các nguồn ấy thƣờng nhỏ, không đạt hiệu quả kinh tế (giá thành điều chế chitosan còn rất đắt). Hơn nữa, cả chitin và chitosan đều rất khó tan trong các dung môi thông thƣờng và các phản ứng hoá học nhằm biến tính chúng đều tốn kém và có hiệu suất thấp. 1.2.2. Cấu trúc hóa học của chitin – chitosan 1.2.2.1. Cấu trúc hóa học của chitin Chitin là polysaccharide mạch thẳng, có thể xem nhƣ là dẫn xuất của cellulose, trong đó nhóm (-OH) ở nguyên tử C(2) đƣợc thay thế bằng nhóm acetyl amino (-NHCOCH3) (cấu trúc I). Nhƣ vậy chitin là poly-(N-acety-2-amino-2- deoxy-β-D-glucopyranose) liên kết với nhau bởi các liên kết β-(C-1-4) glycoside. Trong đó các mắt xích của chitin cũng đƣợc đánh số nhƣ của glucose. Hình 1.2. Cấu tạo hóa học của chitin Tên gọi: poly(1 – 4) – 2- acetamido – 2 – deoxy – β- D- Glucose Trang 16
  24. Đồ án tốt nghiệp Công thức phân tử : [ C8H13O5N ]n Phân tử lƣợng: Mchitin = (203,09)n 1.2.2.2. Cấu trúc hóa học của chitosan Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C(2). Chitosan đƣợc cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glycozide, do vậy chitosan có thể gọi là poly β-(1,4)-2-amino-2- deoxy-D-glucose hoặc là poly β-(1,4)-D-glucosamine (cấu trúc III). Hình 1.3. Cấu tạo hóa học của chitosan Tên gọi: Poly(1,4) – 2- amino- 2- deoxy- β- D- glucose Công thức phân tử: [ C6H11O4N ]n Phân tử lƣợng: Mchitosan= (161,07)n Qua cấu trúc hóa học của chitin và chitosan, ta thấy chitin chỉ có 1 nhóm chức hoạt động là –OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hidoxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh), còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là –OH và –NH2, do đó dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin. Chitin có cấu trúc thuộc họ polysaccharide, hình thái tự nhiên ở dạng rắn. Do đó, các phƣơng pháp nhận dạng chitin, xác định tính chất, phƣơng pháp hoá học để Trang 17
  25. Đồ án tốt nghiệp biến tính chitin cũng nhƣ việc sử dụng và lựa chọn các ứng dụng của chitin gặp nhiều khó khăn. Mặt khác, khả năng ứng dụng của chitin thƣờng thấp hơn so với các dẫn xuất của nó nhƣ chitosan, glucosamine, vì vậy chitin thƣờng đƣợc sử dụng để điều chế các dẫn xuất của nó. Chitosan là một chất có nhiều đặc tính hóa học thích hợp nên đƣợc nghiên cứu sử dụng trong nhiều ngành lĩnh vực. 1.2.3. Tính chất của chitosan 1.2.3.1. Mức độ deacetyl hóa Quá trình deacetyl hóa bao gồm quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân tử chitin và hình thành phân tử chitosan với nhóm amin hoạt động hóa học cao. Mức độ deacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất chitosan bởi vì nó ảnh hƣởng đến tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của chitosan sau này. Mức độ deacetyl hóa của chitosan vào khoảng 56% - 99% (nhìn chung là 80%) phụ thuộc vào loài giáp xác và phƣơng pháp sử dụng. Chitin có mức độ deacetyl hóa khoảng 75% trở lên thƣờng đƣợc gọi là chitosan. Phƣơng pháp để xác định mức độ deacetyl hóa của chitosan bao gồm thử ninhydrin, chuẩn độ theo điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn độ bằng HI 1.2.3.2. Trọng lượng phân tử Chitosan là polymer sinh học có khối lƣợng phân tử cao. Giống nhƣ cấu tạo, khối lƣợng nguồn nguyên liệu và phƣơng pháp chế biến. Khối lƣợng chitin thƣờng lớn hơn 1 triệu Da trong khi các sản phẩm chitosan thƣơng phẩm có khối lƣợng khoảng 100,000 – 1,200,000 Da, phụ thuộc quá trình chế biến và loại sản phẩm. Thông thƣờng, ở nhiệt độ cao, sự có mặt của oxy và sức kéo có thể dẫn đến phân hủy chitosan. Giới hạn nhiệt độ là 280°C, sự phân hủy do nhiệt xảy ra và mạch polymer nhanh chóng bị phá vỡ, do đó khối lƣợng phân tử giảm. 1.2.3.3. Độ nhớt Độ nhớt là một nhân tố quan trọng để xác định khối lƣợng phân tử của chitosan. Chitosan phân tử lƣợng cao thƣờng làm cho dung dịch có độ nhớt cao, điều này có thể không mong muốn trong đóng gói công nghiệp. Trang 18
  26. Đồ án tốt nghiệp Một số nhân tố trong quá trình sản xuất nhƣ mức độ deacetyl hóa, khối lƣợng nguyên tử, nồng độ dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH và nhiệt độ ảnh hƣởng đến sản xuất chitosan và tính chất của nó. Quá trình loại protein trong dung dịch NaOH 3% và sự khử trong quá trình khử khoáng làm giảm độ nhớt của dung dịch chitosan thành phẩm. Tƣơng tự nhƣ vậy, độ nhớt của chitosan bị ảnh hƣởng đáng kể bởi các biện pháp xử lý vật lý (nghiền, gia nhiệt, hấp khử trùng, siêu âm) và hóa học (xử lý bằng ozone), trừ quá trình làm lạnh thì độ nhớt sẽ giảm khi thời gian và nhiệt độ xử lý tăng. Dung dịch chitosan bảo quản ở 4°C đƣợc cho là ổn định nhất. 1.2.3.4. Tính tan Chitin tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ, trong khi đó chitosan tan trong các dung dịch acid có pH dƣới 6,0. Các acid hữu cơ nhƣ acetic, formic và lactic thƣờng đƣợc sử dụng để hòa tan chitosan. Thƣờng sử dụng nhất là dung dịch chitosan 1% tại pH 4,0. Chitosan cũng tan trong dung dịch HCl 1% nhƣng không tan trong H2SO4 và H3PO4. Dung dịch acid acetic nồng độ cao tại nhiệt độ cao có thể dẫn đến depolymer hóa chitosan. Ở pH cao, có thể xảy ra hiện tƣợng kết tủa hoặc đông tụ, nguyên nhân là do hình thành hỗn hợp poly_ion với chất keo anion. Tỉ lệ nồng độ giữa chitosan và acid rất quan trọng. Ở nồng độ dung môi hữu cơ cao hơn 50%, chitosan vẫn hoạt động nhƣ là một chất gây nhớt giúp cho dung dịch mịn. Một số nhân tố ảnh hƣởng đến dung dịch chitosan bao gồm nhiệt độ và thời gian quá trình deacetyl hóa, nồng độ các chất kiềm, việc xử lý sơ bộ, kích thƣớc của các phần tử. 1.2.3.5. Khả năng kết hợp với nước (WBC) và khả năng kết hợp với chất béo (FBC) Sự hấp thụ nƣớc của chitosan lớn hơn rất nhiều so với cellulose hay chitin. Thông thƣờng, khả năng hấp thụ của chitosan khoảng 581 - 1150% (trung bình là 702%), và sự thay đổi trong thứ tự sản xuất nhƣ quá trình khử khoáng và khử protein cũng ảnh hƣởng đáng kể đến khả năng giữ nƣớc và giữ chất béo. Sự khử Trang 19
  27. Đồ án tốt nghiệp protein sau quá trình khử khoáng sẽ làm khả năng giữ nƣớc tăng. Bên cạnh đó quá trình khử màu cũng là nguyên nhân làm giảm khả năng này của chitosan. Khả năng hấp thụ chất béo của chitin và chitosan trong khoảng 315 - 170%, chitosan có khả năng thấp hơn rất nhiều chitin. Bƣớc tẩy trắng trong quá trình sản xuất làm giảm khả năng này cũng nhƣ ảng hƣởng đến độ nhớt của chitosan. Các bƣớc tiến hành theo thứ tự: khử khoáng, khử protein, deacetyl hóa sẽ làm tăng khả năng này hơn là theo thứ tự khử protein, khử khoáng, deacetyl hóa. 1.2.3.6. Khả năng tạo màng Chitosan có khả năng tạo màng sử dụng trong bảo quản thực phẩm nhằm hạn chế các tác nhân gây bệnh trong các sản phẩm đóng gói thịt, cá tƣơi hay đã qua chế biến. Khi dùng màng chitosan, dễ dàng điều chỉnh độ ẩm, độ thoáng không khí cho thực phẩm. Nếu dùng bao gói bằng PE thì mức cung cấp oxy bị hạn chế, nƣớc sẽ bị ngƣng đọng tạo môi trƣờng cho nấm mốc phát triển. Màng chitosan cũng khá dai, khó xé rách, có độ bền tƣơng đƣơng với một số chất dẻo vẫn đƣợc dùng làm bao gói. Màng chitosan làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả. Rau quả sau khi thu hoạch sẽ dần dần bị thâm, làm giảm chất lƣợng và giá trị. Rau quả bị thâm là do quá trình lên men tạo ra các sản phẩm polymer hóa của oquinon. Nhờ bao gói bằng màng chitosan mà ức chế đƣợc hoạt tính oxy hóa của các polyphenol, làm thành phần của anthocyamin, flavonoid và tổng lƣợng các hợp chất phenol ít biến đổi, giữ cho rau quả tƣơi lâu hơn. Cách tạo màng chitosan: Chitosan đƣợc nghiền nhỏ bằng máy để gia tăng bề mặt tiếp xúc. Pha dung dịch chitosan 3% trong dung dịch acid acetic 1,5%. Sau đó bổ sung chất phụ gia PEG - EG 10% (tỷ lệ 1:1) vào và trộn đều, để yên một lúc để loại bọt khí. Sau đó đem hỗn hợp thu đƣợc quét đều lên một ống inox đã đƣợc nung nóng ở nhiệt độ 64 - 65°C (ống inox đƣợc nâng nhiệt bằng hơi nƣớc). Trang 20
  28. Đồ án tốt nghiệp Để khô màng trong vòng 35 phút rồi tách màng. Lúc này ngƣời ta thu đƣợc một vỏ bóng có màu vàng ngà, không mùi vị, đó là lớp màng chitosan có những tính năng mới ƣu việt. 1.2.3.7. Tính kháng khuẩn của chitosan Cơ chế chính xác về hoạt động kháng khuẩn của chitosan, chitin và các dẫn xuất của chúng vẫn chƣa đƣợc biết đến đầy đủ. Tuy nhiên hiện nay có 2 cơ chế đƣợc quan tâm: - Cơ chế thứ nhất: Chitosan là đại phân tử tích điện dƣơng, trong khi màng tế bào vi sinh vật đa số tích điện âm, do đó xảy ra tƣơng tác tĩnh điện làm cho màng tế bào vi sinh vật bị hƣ hỏng, ngăn cản quá trình trao đổi chất qua màng tế bào, đồng thời làm xuất hiện những lỗ hổng trên thành tế bào, tạo điều kiện để protein và các thành phần cấu tạo của tế bào bị thoát ra ngoài dẫn đến tiêu diệt vi sinh vật (Shahidi, Arachchi, và Jeon, 1999). Trong một nghiên cứu khá rộng về tính kháng khuẩn của chitosan từ tôm kháng lại E.coli, ngƣời ta đã tìm ra rằng nhiệt độ cao và pH acid của thức ăn làm tăng ảnh hƣởng của chitosan đến vi khuẩn. Nghiên cứu cũng chỉ ra cơ chế ức chế vi khuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polymer của chitosan với các ion kim loại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Khi bổ sung chitosan vào môi trƣờng, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điện dƣơng. Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy chitosan không trực tiếp hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli mà là do sự kết lại của các tế bào và sự tích điện dƣơng ở màng của vi khuẩn. Chitosan N – carboxybutyl – một polycation tự nhiên, có thể tƣơng tác và hình thành polyelectrolyte với polymer acid có trên bề mặt vi khuẩn, do đó làm dính kết một lƣợng vi khuẩn với nhau. Cũng từ thí nghiệm này ngƣời ta thấy rằng có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh hƣởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan nhƣ K+, Na+, Mg2+ và Ca2+. Nồng độ lớn các ion kim loại có thể khiến mất tính chất này, ngoại trừ ảnh hƣởng của Na+ đối với hoạt động kháng Staphylococcus aureus. Ngƣời ta cũng thấy rằng chitosan Trang 21
  29. Đồ án tốt nghiệp có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào nhiều vi khuẩn. Khi sử dụng chitosan thì một lƣợng lớn các ion K+ và ATP bị rò rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus aureus và nấm Candida albicans. Cả chitosan phân tử lƣợng 50 kDa và 5 kDa đều kháng tốt hai loại trên nhƣng chitosan phân tử lƣợng 50 kDa làm mất nhiều gấp 2 - 4 lần ion K+ và ATP so với chitosan 5 kDa. Điều này thể hiện cơ chế kháng khuẩn khác nhau ở chitosan khối lƣợng phân tử thấp và cao. Hoạt động kháng khuẩn của chitosan phân tử lƣợng khác nhau đã đƣợc nghiên cứu trên 6 loài vi khuẩn. Cơ chế kháng khuẩn này đã đƣợc chứng minh dựa trên việc đo tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào. Kết quả chỉ ra rằng khả năng này giảm khi khối lƣợng nguyên tử tăng và tăng cao ở nồng độ pH thấp, giảm rõ rệt khi có mặt ion Ca2+, Mg2+. Nồng độ ức chế thấp nhất khoảng 0,03 – 0,25%, thay đổi tùy từng loài vi khuẩn và khối lƣợng phân tử của chitosan. Đối với vi khuẩn gram dƣơng, chitosan 470 kDa có ảnh hƣởng đến hầu hết các loài trừ lactobacillus spp., trong khi với vi khuẩn gram âm, chitosan có khối lƣợng 1106 kDa mới có ảnh hƣởng. Điều này là do vi khuẩn gram dƣơng nhạy cảm hơn, vi khuẩn gram âm có lớp màng chắn bên ngoài (Zhong và cộng sự, 2008). Theo Ming Kong và cộng sự (2008), tất cả các vi khuẩn gram âm có một màng ngoài do sự biểu hiện của lớp lipopolysaccharide (LPS). Sự ổn định của lớp LPS thông qua tƣơng tác tĩnh điện với các cation hóa trị 2. Giống nhƣ EDTA, chitosan loại bỏ các cation, việc giải phóng LPS làm mất sự ổn định của màng ngoài. Cơ chế hoạt động kháng khuẩn của chitosan khác nhau ở vi khuẩn gram dƣơng và gram âm (Zheng & Zhu, 2003). Trong nghiên cứu này, họ phân biệt tác động của chitosan trên Staphylococcus aureus (gram dƣơng) và Escherichia coli (gram âm). Đối với Staphylococcus aureus, hoạt động kháng khuẩn tăng khi tăng trọng lƣợng phân tử của chitosan. Trong khi đó, với E.coli, hoạt động kháng khuẩn tăng lên khi giảm trọng lƣợng phân tử. Các tác giả gợi ý hai cơ chế khác nhau cho hoạt động kháng khuẩn: (1) Trong trƣờng hợp của Staphylococcus aureus, các chitosan trên bề mặt của tế bào có thể hình thành một màng polymer, ức chế các Trang 22
  30. Đồ án tốt nghiệp chất dinh dƣỡng đi vào tế bào. (2) Đối với E.coli, chitosan trọng lƣợng phân tử thấp sẽ đi vào các tế bào thông qua sự lan tỏa. - Cơ chế thứ hai: Các phân tử chitosan khi phân tán xung quanh tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra các tƣơng tác làm biến đổi ADN, ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp ARN thông tin và tổng hợp protein, ngăn cản sự hình thành bào tử, ngăn cản trao đổi chất, hấp thu các thành phần dinh dƣỡng của vi sinh vật (Sudarshan và cộng sự, 1992) - Các cơ chế khác: Chitosan kích hoạt một số hàng rào phòng thủ trên tế bào chủ: tiếp xúc với các mô thực vật và kích thích tiết ra các enzyme bảo vệ nhƣ chitinase, chitosanase,  - 1,3 - glucanase, từ đó tiêu diệt vi sinh vật. Cơ chế này không đúng trong trƣờng hợp sử dụng màng bao chitosan cho các sản phẩm bảo quản nguyên quả, vì khi đó chitosan bao bọc bên ngoài lớp vỏ thực vật, không có điều kiện tiếp xúc với các mô thực vật nên không thể kích thích tiết enzyme tiêu diệt vi sinh vật. Chitosan hoạt động nhƣ một tác nhân kìm hãm, liên kết có chọn lọc với kim loại dạng vết do đó ức chế sự sản xuất chất độc và tăng trƣởng vi sinh vật (Cuero, Osuji, Washington, 1991). Các nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan: - Nghiên cứu trên vật thí nghiệm cho thấy chitin và chitosan có hoạt động ức chế vi khuẩn và nấm. Một trong các đồng phân của chitosan là N - carboxybutyl chitosan có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt 298 loài vi sinh vật gây bệnh. Khi có chitosan và chitin trên bề mặt các tác nhân gây bệnh ở thực vật, chúng ức chế sự phát triển của những loài này. Ở nồng độ 0,1% và pH 5,6, chitosan kháng các loại nấm: Fusarium, Alternaria, Rhizopus Và hoạt động kháng này sẽ giảm ở những vi sinh vật mà trên thành tế bào có chứa chitin, chitosan hoặc chitin – ß – glucan. - Chitosan đã đƣợc cho phép làm chất phụ gia thực phẩm ở Nhật và Hàn Quốc lần lƣợt từ năm 1983 và 1995. Chính hoạt động ức chế vi khuẩn của chitosan ở pH thấp nên khi thêm chitosan vào những thực phẩm có tính acid thì nó có chức năng tăng cƣờng hoạt động kháng khuẩn nhƣ là một chất bảo quản tự Trang 23
  31. Đồ án tốt nghiệp nhiên. Ở pH 5,5, với nồng độ 0,5 - 1% chitosan có tác dụng ức chế đến các loài Staphylococcus aureus, E.coli, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes. Ở pH 6,5 chỉ có Staphylococcus aureus bị ức chế ở nồng độ 0,5% trong khi các loài khác vẫn phát triển ở nồng độ 2,5% (nồng độ cao nhất đã đƣợc nghiên cứu). Chitosan phân tử nhỏ có tính kháng các tác nhân gây bệnh trên thực vật mạnh hơn rất nhiều các chất phân tử lớn. - Các hợp chất chitosan lactate và chitosan hydroglutamate cũng đƣợc sử dụng nhƣ là tác nhân ức chế E.coli, Staphylococcus aureus và Saccharomyces cerevisiae. Nồng độ chitosan lactate trong nƣớc cất có ảnh hƣởng mạnh nhất đến E.coli. Chƣa đến 1h, số lƣợng vi khuẩn này giảm khoảng 104, còn Staphylococcus aureus giảm đến 106. Đối với nấm men, chúng hoàn toàn ngừng hoạt động ở nồng độ 1 mg/ml chitosan lactate sau 17 phút. Độc tính của chitosan: - Nghiên cứu về độ an toàn, độ độc tích lũy: Chitosan đƣợc thử độ an toàn (LD50) trên 123 chuột trắng (18 – 21 g) chia 5 đợt, với liều lƣợng tăng dần 0,0025 - 0,020 g/ngày cho mỗi chuột. Theo dõi liên tục trong 72 giờ. Kết quả chuột vẫn khỏe mạnh, không chuột nào chết. Theo dõi độc tính tích lũy trên chuột nhắt, liều uống 0,02 g một ngày cho một chuột, cho uống liên tục 14 ngày, chuột vẫn sống khỏe mạnh bình thƣờng. - Độc tính cấp: Trên 5 lô chuột nhắt trắng (50 con) cho uống chitosan với liều lƣợng 9 g/kg cân nặng, theo dõi liên tục 72 giờ: không có chuột nào chết, suy ra chỉ số điều trị là 250g theo đƣờng uống, chứng tỏ chitosan dùng an toàn. - Độc tính tại chỗ Kết quả nghiên cứu dƣợc lý cho thấy chitosan không gây tổn thƣơng các cơ quan, không gây phù nề tại chỗ, không gây phản ứng giãn mạch tại chỗ trên thỏ và chuột cống thực nghiệm. - Kết quả Trang 24
  32. Đồ án tốt nghiệp Chitosan đƣợc thử trên động vật thực nghiệm(chuột nhắc, chuột cống, thỏ), kết quả cho thấy: chitosan không gây độc tính tại chỗ, không ảnh hƣởng đối với trọng lƣợng cơ thể, trọng lƣợng gan, cơ quan tạo máu, các chỉ tiêu hóa sinh trong nƣớc tiểu của động vật thực nghiệm. 1.2.4. Các phương pháp thu nhận chitosan Chitosan đƣợc sản xuất theo quy trình nhƣ sau: Trang 25
  33. Đồ án tốt nghiệp Vỏ tôm Rửa sạch, loại bỏ tạp chất Xử lý với Flavourzyme: tỷ lệ Xử lý NaOH 5%, tỷ lệ 1:5 enzyme/ph ế liệu: 0,2% (w/w), (w/v), nhiệt độ phòng, 24h nhi ệt độ phòng, 24h Rửa trung tính Xử lý HCl 4%, thời gian 12h, tỷ lệ 1:5 (w/v), nhiệt độ phòng Rửa trung tính Làm khô Chitin Chuyển chitin thành chitosan: Ngâm trong NaOH 60%, tỷ lệ 1:5 (w/v), nhiệt độ 65oC, thời gian 20h Rửa trung tính Làm khô Chitosan Trang 26
  34. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Sơ đồ sản xuất và thu nhận chitosan Theo Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007), hiện nay có hai nhóm phƣơng pháp sản xuất chitin từ vỏ giáp xác là phƣơng pháp hóa học và sinh học, trong đó phƣơng pháp hóa học tách chiết chitin là phƣơng pháp đã có từ rất lâu và ngày nay vẫn là phƣơng pháp chính đƣợc áp dụng trong sản xuất polymer sinh học này, còn phƣơng pháp sinh học mới đƣợc nghiên cứu áp dụng trong thời gian gần đây với mục đích thay thế phƣơng pháp hóa học truyền thống tiêu hao nhiều hóa chất và gây ô nhiễm môi trƣờng. Hai nhóm phƣơng pháp này giống nhau ở điểm là chúng đều đƣợc thực hiện theo 3 công đoạn chính đó là: loại khoáng, loại protein, loại các chất màu, tuy trình tự các công đoạn có thể phụ thuộc vào từng phƣơng pháp cụ thể. Điểm khác nhau căn bản của hai nhóm phƣơng pháp này là ở cách loại protein. Trong các phƣơng pháp sinh học, protein bị loại trong những điều kiện rất “mềm” nhờ sử dụng hoạt tính proteolytic (phân hủy protein) của các enzyme thuộc nhóm proteinase, còn trong các phƣơng pháp hóa học protein bị loại bằng acid và kiềm. Bảng 1.8. Tính chất chitosan sản xuất từ chitin chiết rút bằng phƣơng pháp hóa học và sinh học (Phạm Thị Đan Phƣợng và Trang Sĩ Trung, 2012) Tính chất Chitosan từ chitin Chitosan từ chitin chiết chiết rút bằng phƣơng rút bằng phƣơng pháp pháp hóa học sinh học Màu sắc Trắng sáng Hồng, đục Hàm lƣợng tro 0,98 0,6 1,89 0,03 (%) Hàm lƣợng protein 0,93 0,1 1,95 0,05 (%) Độ nhớt (cps) 930 66 1358 62 Độ deacetyl (%) 84,2 0,9 80,1 1,3 Độ tan (%) 99,7 0,2 97,7 1,6 Trang 27
  35. Đồ án tốt nghiệp Độ đục (NTU) 26,3 2,8 42,2 6,4 Kết quả cho thấy chitosan sản xuất từ hai loại chitin với quá trình khử protein khác nhau thì tính chất khác nhau. Sử dụng quy trình khử protein bằng phƣơng pháp sinh học có hàm lƣợng protein và khoáng còn lại cao hơn so với phƣơng pháp hóa học nên ảnh hƣởng đến chất lƣợng chitosan thu đƣợc. Bên cạnh đó, độ nhớt và độ deacetyl của chitosan cũng bị ảnh hƣởng rõ rệt bởi chất lƣợng chitin ban đầu. Độ nhớt của chitosan từ chitin khử protein bằng phƣơng pháp sinh học thì cao hơn nhƣng độ deacetyl thì thấp hơn so với mẫu chitosan từ chitin khử protein bằng phƣơng pháp hóa học. Độ nhớt cao của phƣơng pháp xử lý sinh học có thể do khi xử lý bằng Flavourzyme thì chitin ít bị cắt mạch so với phƣơng pháp hóa học. Nhƣng hàm lƣợng protein và khoáng còn lại trong chitin đã làm giảm hiệu quả của quá trình deacetyl, dẫn đến chitosan từ chitin xử lý sinh học có độ deacetyl thấp hơn. Chitosan từ chitin khử protein bằng phƣơng pháp sinh học có thể ứng dụng vào các lĩnh vực nhƣ nông nghiệp và xử lý môi trƣờng (chất kích thích sinh học, keo tụ trong xử lý môi trƣờng ) với yêu cầu về độ tinh sạch không cao thì phƣơng pháp xử lý sinh học là một sự lựa chọn hợp lý vì đây là phƣơng pháp sản xuất thân thiện với môi trƣờng. 1.2.5. Chitosan tan trong nước (WSC) 1.2.5.1. Điều chế chitosan tan trong nước Chitosan tan trong nƣớc (WSC) đƣợc điều chế theo phƣơng pháp acetyl hóa. Hòa tan 25 g chitosan trong 500 ml dung dịch acid lactic 3% thu đƣợc dung dịch A. Sau đó cho 150 ml cồn 96o vào dung dịch A, khuấy đều đƣợc dung dịch B. Cho 15 ml anhydride acetic vào 150 ml cồn 96o, khuấy đều ta đƣợc dung dịch C. Cho từ từ C vào B, khuấy đều để thực hiện phản ứng acetyl hóa trong 2 giờ. Dung dịch chitosan đã acetyl hóa đƣợc điều chỉnh pH về 7 – 7,5 bằng NH4OH 5% và đƣợc kết tủa bằng cồn 96o. Lọc kết tủa qua vải, rửa kết tủa bằng cồn 96o vài lần, sau đó sấy quạt cho bay hết dung môi cồn 96o, thu đƣợc chitosan tan trong nƣớc. Trang 28
  36. Đồ án tốt nghiệp Chitosan tan trong nƣớc đƣợc điều chế theo phƣơng pháp trên có độ deacetyl hóa DDA = 60,1% và có khối lƣợng phân tử trung bình là 249790 Da (Nguyễn Thị Thanh Hải, 2012). 1.2.5.2. Tính chất của WSC Theo Ying Chien Chung (2011), hoạt động kháng khuẩn của chitosan hòa tan trong nƣớc đƣợc đánh giá trên 6 loại vi sinh vật: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, B. cereus, E.coli, Shigella dysenteriae và Salmonella typhimurium ở các pH khác nhau của chitosan hòa tan trong nƣớc và chitosan hòa tan trong acid. Kết quả của bài báo cáo này kết luận rằng, khả năng kháng khuẩn của chitosan tan trong nƣớc cao hơn chitosan tan trong acid. Bảng 1.9. Bảng so sánh các tính chất của chitosan tan trong acid và chitosan tan trong nƣớc Chitosan từ Chitosan từ chitin sản xuất chitin sản xuất Chitosan tan Tính chất bằng phƣơng bằng phƣơng trong nƣớc pháp hóa học pháp sinh học Màu sắc Trắng sáng Hồng, đục Vàng Hàm lƣợng tro (%) 0,98 ± 0,6 1,89 ± 0,03 0,05 ± 0,003 Hàm lƣợng protein (%) 0,93 ± 0,1 1,95 ± 0,05 0,2 ± 0,01 Độ deacetyl (%) 84,2 ± 0,9 80,1 ± 1,3 87 ± 2 Độ tan (%) 99,7 ± 0,2 97,1 ± 1,6 > 99% Ngoài khả năng kháng khuẩn cao của chitosan tan trong nƣớc thì theo bảng 1.9 cho thấy hàm lƣợng protein và hàm lƣợng khoáng của chitosan tan trong nƣớc thấp hơn so với chitosan tan trong acid nên có độ tan tƣơng đối cao (> 99%). Do hàm lƣợng protein và hàm lƣợng khoáng của chitosan tan trong acid cao hơn chitosan tan trong nƣớc nên độ deacetyl hóa của chitosan tan trong acid thấp hơn so với chitosan tan trong nƣớc. Trang 29
  37. Đồ án tốt nghiệp Tóm lại, chitosan tan trong nƣớc có độ tan tƣơng đối cao, độ deacetyl cao hơn và khả năng kháng khuẩn của chitosan tan trong nƣớc tốt hơn chitosan tan trong acid. 1.2.6. Ứng dụng của chitosan trong thực phẩm 1.2.6.1. Chất làm trong - Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước quả Trong sản xuất nƣớc quả, việc làm trong là yêu cầu bắt buộc. Thực tế hiện nay đang sử dụng các chất làm trong nhƣ: genatin, bentonite, kali caseinate, tannin, polyvinyl pirovinyl. Chitosan là tác nhân tốt loại bỏ đi đục, giúp điều chỉnh acid trong nƣớc quả. Chitosan đƣợc sử dụng nhƣ tác nhân lọc các chất lơ lửng trong nƣớc quả. Sử dụng dung dịch chitosan 2% trong acid acetic 7% giúp làm giảm độ đục hiệu quả hơn so với sử dụng bentonite và gelatin. Đối với nƣớc táo, khi sử dụng dung dịch chitosan hòa tan trong acid malic 2%, ngƣời ta nhận thấy rằng độ đục giảm đáng kể khi tăng lƣợng chitosan sử dụng từ 0,1 – 0,7 g/l nƣớc quả. Tuy nhiên, khi tăng lên đến 1 g/l thì độ đục tăng lên, điều đó đƣợc giải thích là do sự bão hòa về tính chất hấp phụ của chitosan. Chitosan còn đƣợc dùng để điều chỉnh độ chua của nƣớc quả. Imeri và Knorr (1998) đã nghiên cứu chitosan nồng độ 1,2% trong 2% acid ascorbic đối với nƣớc ép cà rốt và táo, kết quả cho thấy chitosan làm giảm đáng kể lƣợng acid của dịch ép. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chitosan có ái lực lớn đối với hợp chất pholyphenol chẳng hạn: catechin, proanthocianydin, acid cinamic, những chất mà có thể biến màu nƣớc quả bằng phản ứng oxy hóa. 1.2.6.2. Bảo quản trứng gà tươi Ở nhiệt độ thƣờng, trứng gà tƣơi bọc màng chitosan nồng độ 1,5% có bổ sung 0,05% Sodium Benzoate hoặc 1% Sorbitol có khả năng duy trì hạng chất lƣợng ở mức A đến 15 - 20 ngày sau khi đẻ. Trong khi đó, trứng gà tƣơi không qua bọc màng chỉ duy trì hạng chất lƣợng ở mức A không quá 5 ngày sau khi đẻ. Đồng thời các chỉ tiêu chất lƣợng khác (hao Trang 30
  38. Đồ án tốt nghiệp hụt khối lƣợng, chỉ số màu lòng đỏ trứng) đều có biến đổi lớn hơn so với trứng có xử lý màng bọc chitosan. Kết quả nghiên cứu của PGS.TS Trần Thị Luyến (Trƣờng ĐH Nha Trang) và Th.S Lê Thanh Long (Trƣờng ĐH Nông Lâm Huế) đã cho thấy màng bọc không tạo cảm giác khác lạ cho ngƣời sử dụng so với trứng gà tƣơi thƣơng phẩm cùng loại về chất lƣợng cảm quan bề mặt. Phƣơng pháp tạo màng trên vỏ đƣợc các nhà khoa học thực hiện nhƣ sau: trứng gà tƣơi sau khi gà đẻ không quá 24 giờ, không rạn nứt, không có khuyết tật và đạt tiêu chuẩn TCVN 1858 : 1986. Sau đó tiến hành lau sạch và nhúng trong dung dịch bao màng chitosan đƣợc chuẩn bị gồm hỗn hợp dung dịch lọc bao gồm chitosan 1,5% pha trong dung dịch acetic acid 1% bổ sung thêm SB 0,05%, hoặc SOR 1%. Tiếp theo để khô tự nhiên và bảo quản ở nhiệt độ thƣờng nơi khô ráo thoáng mát. 1.2.6.3. Sử dụng trong thực phẩm chức năng Chitosan có khả năng làm giảm hàm lƣợng cholesterol trong máu. Nếu sử dụng thực phẩm chức năng có bổ sung 4% chitosan thì lƣợng cholesterol trong máu giảm đi đáng kể chỉ sau 2 tuần. Ngoài ra chitosan còn đƣợc xem là chất chống đông tụ máu. Nguyên nhân việc giảm cholesterol trong máu và chống đông tụ máu đƣợc biết là do không cho tạo các mixen. Điều chú ý là ở pH = 6 – 6,5 chitosan bắt đầu bị kết tủa, toàn bộ chuỗi polysaccharide bị kết lắng và giữ lại toàn bộ lƣợng mixen trong đó. Chính nhờ đặc điểm quan trọng này chitosan đƣợc ứng dụng trong sản phẩm thực phẩm chức năng. 1.2.6.4. Thu hồi protein Whey đƣợc coi là chất thải trong công nghiệp sản xuất phomat, nó có chứa một lƣợng lớn lactose và protein ở dạng hòa tan. Nếu thải trực tiếp ra ngoài sẽ gây ô nhiễm môi trƣờng, còn nếu xử lý nƣớc thải thì tốn kém do vận hành hệ thống dẫn đến hiệu quả kinh tế không cao. Việc thu hồi protein trong whey đƣợc xem là biện pháp làm tăng hiệu quả kinh tế của sản xuất phomat. Whey protein khi thu hồi đƣợc bổ sung vào đồ uống, thịt băm và các loại thực phẩm khác. Nhiều phƣơng pháp khác nhau đã đƣợc đƣa ra nhằm thu hồi protein và chitosan đƣợc coi là Trang 31
  39. Đồ án tốt nghiệp mang lại nhiều hiệu suất phân tách cao nhất. Tỷ lệ chitosan để kết bông các hạt lơ lửng là 2,15% (30 mg/l); độ đục thấp nhất ở pH 6,0. Nghiên cứu về protein thu đƣợc bằng phƣơng pháp này: không hề có sự khác biệt về giá trị giữa protein có chứa chitosan và protein thu đƣợc bằng đông tụ casein hoặc whey protein. Ngoài thu hồi protein từ whey, ngƣời ta sử dụng chitosan trong thu hồi các acid amin trong nƣớc của sản xuất đồ hộp , thịt, cá 1.2.6.5. Phân tách rượu - nước Chitosan đƣợc xử lý đặc biệt để tạo ra dạng màng rỗng. Với việc điều chỉnh tốc độ thẩm thấu (lƣợng chất lỏng đi qua màng khoảng 1 m3/h). Màng này đƣợc sử dụng trong hệ thống phản ứng đòi hỏi không dùng nhiệt độ quá cao. Việc phân tách này chỉ loại đi nƣớc, kết quả là hàm lƣợng ethanol có thể lên đến 80%. 1.2.6.6. Ứng dụng làm màng bao (bảo quản hoa quả) Lớp màng không độc bao quanh bên ngoài khối nguyên liệu nhằm hạn chế sự phát triển vi sinh vật bề mặt - một nguyên nhân chính gây thối hỏng thực phẩm. N-O carboxymethy (NOCC) đƣợc xử lý đặc biệt từ phản ứng của chitosan và monochloroacetic acid trong điều kiện kiềm, NOCC có thể hòa tan trong dung dịch ở pH > 6 hoặc pH < 2. Màng NOCC dẻo có thể tạo thành ngay trong dung dịch nƣớc đó. Lớp màng này có tính thấm chọn lọc các khí nhƣ oxy, cacbon dioxide mà còn có khả năng phân tách hỗn hợp khí nhƣ: ethylene, ethane, acetylence. Quả táo đƣợc nhúng hoặc phun bởi màng NOCC có thể giữ độ tƣơi hơn 6 tháng và độ acid trong khoảng 250 ngày nếu ở điều kiện bảo quản lạnh. Màng này mang lại cho quả độ bóng sáng nhƣng trong và không nhớt khi cầm. Chúng dễ dàng loại đi bằng rửa với nƣớc, NOCC cũng có hiệu quả đối với bảo quản các loại trái cây khác nhƣ lê, đào, mận. Lê đƣợc xử lý với NOCC tỷ lệ bị mắc hỏng thịt cùi và thối ít hơn so với lê ở không khí có tỷ lệ oxygen là 1 - 2%. Viện bảo vệ và chăm sóc sức khỏe Canada đã chứng minh rằng việc sử dụng NOCC trên quả, khi sử dụng không cần phải rửa và lột vỏ trƣớc khi ăn. Bởi vì NOCC vẫn chứa lƣợng amin tự Trang 32
  40. Đồ án tốt nghiệp do, nó có thể có nhiều ở tính chất chitosan và ứng dụng trong chữa lành vết thƣơng đang lên da non, giảm hàm lƣợng cholesterol trong máu. Màng chitosan cũng có lợi ích lớn với việc làm cứng thịt quả, ổn định acid. Điều này đƣợc chỉ ra bởi nó làm giảm lƣợng anthocyanin chứa trong quả. Nấm là thủ phạm chính dễ gây thối quả nhất trong khi đó ƣu điểm của chitosan nó có thể kháng nấm. Thêm vào đó, màng chitosan gần giống nhƣ môi trƣờng bên ngoài mà không gây ra nguyên nhân hô hấp kỵ khí, nó có thể hấp thu chọn lọc tới oxy nhiều hơn là carbonic. Ngoài việc sử dụng một mình màng chitosan, hiện nay ở Việt Nam có sự kết hợp giữa bảo quản bởi màng chitosan và PE. Quy trình bảo quản trái quýt đƣờng với thời gian tồn trữ đến 8 tuần. Bao màng chitosan ở nồng độ 0,25% kết hợp với bao Polyethylene (PE) đục 5 lỗ với đƣờng kính mỗi lỗ 1 mm và ghép mí lại bằng máy ép. Sau đó, bảo quản ở nhiệt độ 12oC. Với phƣơng pháp này, chất lƣợng bên trong trái nhƣ: hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng vitamin C luôn ổn định, tỷ lệ hao hụt khối lƣợng thấp, màu sắc vỏ trái đồng đều và đẹp. 1.2.6.7. Bánh mì Park và cộng sự (2002) đã nghiên cứu tác động của chitosan đƣợc quét trên bề mặt của bánh mì. Kết quả cho thấy chitosan nồng độ 1% trong 1% acid acetic giúp làm giảm sự mất mát về khối lƣợng do màng chitosan có khả năng ngăn không cho nƣớc thoát ra ngoài. Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng kháng khuẩn hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trên bánh mì. 1.2.6.8. Kim chi Kim chi có bổ sung chitosan có thể kéo dài thời hạn sử dụng từ 2 – 6 lần so với kim chi bình thƣờng. Bên cạnh đó, chitosan còn có khả năng ngăn chặn sự mềm hóa của kim chi trong quá trình lên men. Trang 33
  41. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Nguyên liệu Đậu hũ dùng để nghiên cứu đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp thủ công kết tủa bằng nƣớc chua theo quy trình hình 1.1. Dịch sữa đậu dùng cho chế biến đậu hũ có nồng độ chất khô hòa tan là 5oBrix. Sau khi gia nhiệt đến 100oC, pH của dịch sữa là 6,5, dịch sữa đƣợc kết tủa bằng nƣớc chua có pH = 5,3 theo tỷ lệ nƣớc chua/dịch sữa là 1/9, khuấy nhẹ hỗn hợp cho đến khi xuất hiện hoa đậu, lúc này pH của hỗn hợp là 6,1, nhiệt độ phải đƣợc duy trì ở 85 – 90oC. Hoa đậu kết tủa đƣợc đổ vào khuôn dài 80 cm có lót vải mềm và ép bằng thanh chặn, thời gian ép 15 phút tạo thành bánh đậu. 2.1.2. Vật liệu Chitosan hòa tan trong nƣớc dùng cho nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi Trung tâm công nghệ sinh học, trƣờng đại học Nha Trang. Chitosan hòa tan trong nƣớc có các chỉ tiêu hóa sinh sau: Hàm lƣợng tro: 0,2 ± 0,01% Hàm lƣợng khoáng: 0,05 ± 0,003% Mức độ deacetyl (DD): 87 ± 2% Trọng lƣợng phân tử: 450 ± 47 kDa 2.2. Bố trí thí nghiệm 2.2.1. Chuẩn bị cho nghiên cứu 2.2.1.1. Chuẩn bị dung dịch ngâm 1 g chitosan hòa tan trong 100 ml nƣớc cất sẽ đƣợc chitosan 1%. Chuẩn bị 800 ml dung dịch chitosan 0,2% và 800 ml dung dịch chitosan 0,4%. 2.2.1.2. Chuẩn bị đậu hũ Đậu hũ sau khi ép bánh định hình đƣợc cắt thành miếng theo kích thƣớc: chiều dài 7 cm – chiều rộng 4 cm – chiều cao 3 cm. Sau đó làm nguội ở nhiệt độ Trang 34
  42. Đồ án tốt nghiệp thƣờng, miếng đậu sau khi đã nguội sẽ đƣợc cho vào hộp nhựa có kích thƣớc: chiều dài 8 cm – chiều rộng 6 cm – chiều cao 3,6 cm đã đƣợc khử trùng bằng H2O2, đóng nắp hộp và vận chuyển về phòng thí nghiệm. 2.2.2. Tiến hành thí nghiệm Nghiên cứu tập trung vào 2 mảng công việc chính: - Xác định các thông số cơ bản của nguyên liệu đậu hũ dùng trong nghiên cứu, bao gồm: độ ẩm, hàm lƣợng tro, hàm lƣợng protein và lipid. - Theo dõi quá trình bảo quản đậu hũ trong dung dịch chitosan với các nồng độ khác nhau ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh thông qua các chỉ tiêu: pH độ đục tổng vi sinh vật hiếu khí nấm men – nấm mốc E. coli Các nội dung nghiên cứu đƣợc thể hiện trên sơ đồ hình 2.1 Trang 35
  43. Đồ án tốt nghiệp Phân tích một số thành phần cơ bản: Độ ẩm Đậu hũ Hàm lƣợng nito tổng Hàm lƣợng lipid Hàm lƣợng tro tổng Ngâm trong dung dịch chitosan 0% 0,2% 0,4% Bảo quản Nhiệt độ thƣờng Nhiệt độ lạnh Kiểm tra một số chỉ tiêu: pH Kiểm tra độ đục TPC So sánh và kết luận Nấm men, nấm mốc E. coli Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Trang 36
  44. Đồ án tốt nghiệp Đậu hũ sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm đƣợc phân tích các thông số ban đầu nhƣ: độ ẩm, hàm lƣợng tro, protein và lipid. Các mẫu đậu hũ đƣợc bảo quản trong dung dịch chitosan 0%, 0,2% và 0,4%, thể tích dung dịch chitosan cho mỗi hộp là 60 ml để đảm bảo đậu hũ ngập trong dung dịch. Sử dụng màng bọc thực phẩm PE để bao kín miệng hộp, đóng nắp hộp. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ thƣờng ở nơi thoáng mát và nhiệt độ lạnh. Sau mỗi thời gian 0, 1, 3, 6, 9, 12 ngày bảo quản, lấy mẫu kiểm tra các chỉ tiêu: pH, độ đục, tổng vi sinh vật hiếu khí, nấm men – nấm mốc, E. coli. Dựa vào số liệu thu đƣợc, tiến hành phân tích và so sánh các chỉ tiêu giữa mẫu nghiên cứu và mẫu đối chứng ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh rồi rút ra kết luận. 2.2.3. Tiến hành thí nghiệm 2.2.3.1. Thí nghiệm 1: Xác định các thành phần cơ bản của đậu hũ Đậu hũ sau khi sản xuất đƣợc xác định các thành phần cơ bản nhƣ: độ ẩm, hàm lƣợng tro, hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Ghi nhận và tính toán số liệu sau mỗi lần thí nghiệm. 2.2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát những biến đổi chất lượng của đậu hũ thông qua dung dịch ngâm được bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh Để đánh giá chất lƣợng của đậu hũ cần theo dõi các chỉ tiêu sau: pH độ đục tổng vi sinh vật hiếu khí nấm men – nấm mốc E. coli Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Ghi nhận và tính toán số liệu sau mỗi lần thí nghiệm. Trang 37
  45. Đồ án tốt nghiệp 2.2.4. Phương pháp sử dụng trong nghiên cứu 2.2.4.1. Phương pháp xác định chất lượng đậu hũ - Độ ẩm của nguyên liệu đậu hũ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sấy ở 105oC đến khối lƣợng không đổi. - Xác định hàm lƣợng nito tổng số bằng phƣơng pháp Kjeldahl từ đó xác định đƣợc hàm lƣợng protein của nguyên liệu đậu hũ. - Xác định hàm lƣợng tro bằng phƣơng pháp nung ở nhiệt độ cao (600oC) đến khối lƣợng không đổi. - Xác định hàm lƣợng lipid của đậu hũ bằng phƣơng pháp Soxhlet. 2.2.4.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu theo dõi Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật của đậu hũ: Bảng 2.1. Các phƣơng pháp xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của dung dịch ngâm đậu hũ STT Chỉ tiêu kiểm nghiệm Phƣơng pháp Đơn vị tính 1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí Đổ đĩa, đếm khuẩn lạc CFU/ml 2 Nấm men – Nấm mốc Cấy trang, đếm khuẩn lạc CFU/ml 3 E.coli giả định MPN MPN/ml Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu hóa lý của đậu hũ: - Xác định pH của dung dịch ngâm đậu hũ bằng máy đo pH. - Xác định độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bằng máy đo OD với bƣớc sóng 800 nm. 2.2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu nhận đƣợc từ nghiên cứu đƣợc xử lý trên phần mềm Excel 2010 và phần mềm thống kê Statgraphics. Trang 38
  46. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Một số thông số cơ bản của đậu hũ dùng trong nghiên cứu Đậu hũ sử dụng cho nghiên cứu đƣợc xác định một số thông số cơ bản. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu đƣợc xác định của đậu hũ dùng trong nghiên cứu Tên chỉ tiêu Giá trị Hàm lƣợng nƣớc (%) 64,2 % Hàm lƣợng protein (%) 7,5 % Hàm lƣợng lipid (%) 3,62 % Hàm lƣợng tro (%) 1,76 % Hàm lƣợng lipid và protein của đậu hũ thấp hơn so với các loại thực phẩm khác có nguồn gốc từ động vật. Đậu hũ chứa hàm lƣợng nƣớc cao (64,2%) cùng với sự có mặt của các thành phần dinh dƣỡng khác là môi trƣờng lý tƣởng cho vi sinh vật phát triển.Vì vậy, đậu hũ khó bảo quản và thời gian bảo quản thƣờng không lâu. 3.2. Nghiên cứu quá trình biến đổi của đậu hũ trong thời gian bảo quản 3.2.1. Khảo sát biến đổi pH của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh pH là một giá trị quan trọng để đánh giá chất lƣợng đậu hũ, độ pH chỉ thị giá trị của sản phẩm hay xác định độ hƣ hỏng của thực phẩm. Kết quả đo đƣợc sau thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Giá trị pH của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh Chế độ bảo Ngày Mẫu đối Nồng độ chitosan của dung quản chứng dịch ngâm đậu hũ Nƣớc cất 0,2% 0,4% Bảo quản ở 0 5 3,8 3,8 nhiệt độ 1 4,6 4,8 5,3 Trang 39
  47. Đồ án tốt nghiệp thƣờng 3 5,2 5,0 4,9 6 5,1 5,3 5,4 9 4,7 5,6 5,8 12 4,3 5,8 5,5 Bảo quản ở 0 5 3,8 3,8 nhiệt độ lạnh 1 6,5 6,2 6 3 6,4 6,3 6,3 6 6,4 6,4 6,3 9 6 6,1 6,4 12 5,7 6,1 6,1 pH 7 6 Nƣớc cất (thƣờng) 0.2% (thƣờng) 5 0.4% (thƣờng) nƣớc cất (lạnh) 0.2% (lạnh) 4 0.4% (lạnh) 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ngày Hình 3.1. Biến đổi pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh Trang 40
  48. Đồ án tốt nghiệp Từ biểu đồ hình 3.1, có thể thấy các đƣờng biểu diễn pH ở nhiệt độ lạnh có xu hƣớng tăng và ổn định sau các ngày bảo quản. Đến ngày thứ 12, các mẫu đậu hũ ngâm ở nhiệt độ lạnh vẫn còn mùi thơm đặc trƣng của đậu hũ. Trong khi đó, ở nhiệt độ thƣờng, pH của mẫu đối chứng có xu hƣớng giảm do không có chất bảo quản, đậu hũ là thực phẩm chứa hàm lƣợng nƣớc cao, giàu protein, đây là môi trƣờng thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Vi sinh vật lên men sẽ phát triển từ bề mặt đậu hũ sau đó mới đi dần vào bên trong, kết quả của quá trình này là hình thành các acid hữu cơ nhƣ acid lactic, acid acetic làm cho pH của dung dịch ngâm giảm tạo điều kiện để các vi sinh vật khác phát triển gây hƣ hỏng đậu hũ. Đối với mẫu nghiên cứu chitosan 0,2% và 0,4% ở nhiệt độ thƣờng, các đƣờng biểu diễn pH có xu hƣớng tăng, nhƣng xét về mặt cảm quan thì ngày thứ 3 các mẫu này có mùi chua nhẹ và đến ngày thứ 6 thì có dấu hiệu hƣ hỏng. Bên cạnh đó, độ pH của mẫu đối chứng, mẫu nghiên cứu 0,2% và 0,4% chitosan khác biệt không đáng kể, điều này có thể kết luận rằng nhiệt độ bảo quản có ảnh hƣởng đến độ pH của dung dịch nhiều hơn nồng độ chitosan. Qua xử lý thống kê, pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở 2 chế độ bảo quản khác biệt có ý nghĩa với mức ý nghĩa 0,05, dung dịch ngâm ở nhiệt độ lạnh có pH cao hơn so với nhiệt độ thƣờng. Ở nhiệt độ lạnh, các loài vi sinh vật sẽ bị ức chế nên quá trình này diễn ra chậm hơn, mẫu đối chứng và mẫu nghiên cứu đƣợc bảo quản đến ngày thứ 12 vẫn chƣa có dấu hiệu hƣ hỏng. Vì vậy, vẫn chƣa thể kết luận đƣợc rằng chitosan có ảnh hƣởng đến pH của dung dịch ngâm hay không. Về mặt cảm quan, khi bảo quản ở nhiệt độ thƣờng, các mẫu đậu hũ đƣợc ngâm trong dung dịch chitosan 0,2% và 0,4% đã có mùi chua vào ngày thứ 6. Tuy nhiên, quan sát trên biểu đồ hình 3.1, đƣờng biểu diễn của các mẫu này lại có xu hƣớng tăng. Điều này cho thấy pH không phải là chỉ tiêu đáng tin cậy để đánh giá mức độ hƣ hỏng của đậu hũ. Trang 41
  49. Đồ án tốt nghiệp 3.2.2. Khảo sát độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng có thể xác định đƣợc sinh khối vi sinh vật phát triển trong dung dịch ngâm, khi số lƣợng tế bào tăng lên sẽ dẫn đến việc tăng độ đục. Tuy nhiên, độ đục của dung dịch tăng cũng có thể do nồng độ của cơ chất hay các chất lơ lửng có trong dịch ngâm. Kết quả đo đƣợc trình bày trong bảng 3.3. Bảng 3.3. Giá trị độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh Chế độ bảo Ngày Mẫu đối Nồng độ chitosan của dung quản chứng dịch ngâm đậu hũ Nƣớc cất 0,2% 0,4% Bảo quản ở 0 0 0,001 0,001 nhiệt độ 1 0,333 0,094 0,169 thƣờng 3 0,596 0,163 0,299 6 0,572 0,207 0,411 9 0,623 0,399 0,438 12 0,734 0,572 0,599 Bảo quản ở 0 0 0,001 0,001 nhiệt độ lạnh 1 0,126 0,019 0,131 3 0,178 0,029 0,152 6 0,260 0,035 0,186 9 0,329 0,048 0,261 12 0,393 0,053 0,266 Trang 42
  50. Đồ án tốt nghiệp 0,8 0,7 0,6 0,5 Nƣớc cất (thƣờng) 0.2% (thƣờng) 0,4 0.4% (thƣờng) 0,3 Nƣớc cất (lạnh) độ đục đục độ (OD 800nm) 0,2 0.2% (lạnh) 0.4% (lạnh) 0,1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ngày Hình 3.2. Biến đổi độ đục của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh Thời gian bảo quản càng kéo dài, độ đục của dung dịch ngâm càng tăng do sự phát triển của vi sinh vật, các biến đổi hóa lý của đậu hũ và dung dịch ngâm. Các đƣờng biểu diễn trên biểu đồ hình 3.2 cho thấy mẫu đối chứng bảo quản ở nhiệt độ thƣờng có độ đục cao nhất. Vi sinh vật phân giải đậu hũ gây ra các vết nứt trên bề mặt đậu hũ, các mảnh vỡ nhỏ từ đậu hũ tan vào dung dịch ngâm làm cho độ đục của dung dịch ngâm tăng lên. Đối với mẫu chitosan 0,2% và 0,4% do có sử dụng chất bảo quản nên độ đục của dung dịch thấp hơn so với mẫu đối chứng. Tuy nhiên, ở nhiệt độ thƣờng, nồng độ chitosan 0,2% và 0,4% có thể không có tác dụng ức chế tốt đối với sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn. Quan sát cảm quan cho thấy ở nồng độ chitosan 0,2% và 0,4% có mức độ hƣ hỏng nhẹ hơn so với mẫu đối chứng, biểu hiện là: trên bề mặt đậu hũ của mẫu 0,2% và 0,4% xuất hiện các vết nứt nhỏ. Trong khi đó, ở mẫu đối chứng vết nứt xuất hiện nhiều hơn, sâu hơn và sau 12 ngày bảo quản đậu hũ có hiện tƣợng vữa nát. Trong điều kiện bảo quản lạnh, hầu hết các hoạt động của vi sinh vật đều bị ức chế nên giá trị độ đục thấp hơn, nƣớc ngâm trong hơn, đậu hũ bảo quản đƣợc lâu Trang 43
  51. Đồ án tốt nghiệp hơn so với điều kiện bảo quản thƣờng. Mẫu đối chứng có giá trị độ đục cao nhất do không sử dụng chất bảo quản. So sánh giữa mẫu 0,2% và 0,4% cho thấy dung dịch có nồng độ chitosan cao khi gặp môi trƣờng có tính acid sẽ bị kết tủa thành những mảng trắng nên các mẫu nghiên cứu 0,4% chitosan có độ đục cao hơn các mẫu nghiên cứu 0,2%. 3.2.3. Khảo sát chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trƣởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy. Thông qua số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa petri cho phép xác định đƣợc lƣợng vi sinh vật có trong môi trƣờng đó. Chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, đánh giá nguy cơ hƣ hỏng của thực phẩm. Khi xử lý bảo quản đậu hũ không có quá trình bài khí nên vẫn còn một lƣợng không khí tồn tại trong hộp, vi sinh vật hiếu khí có thể nhiễm vào đậu hũ thông qua con đƣờng này, vì vậy phải xác định chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí để đánh giá chất lƣợng sản phẩm. Mật độ vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đƣợc trình bày trong bảng 3.4. Bảng 3.4. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh Chế độ bảo Ngày Mẫu đối Nồng độ chitosan của dung quản chứng dịch ngâm đậu hũ Nƣớc cất 0,2% 0,4% Bảo quản ở 0 0,091.103 0,091.103 0,091.103 nhiệt độ 1 2,82.103 2,27.103 1,98.103 thƣờng 3 5,34.103 5,13.103 2,92.103 6 9,48.103 7,44.103 9,15.103 9 10,99.103 9,50.103 10,25.103 12 13,59.103 10,36.103 11,86.103 Bảo quản ở 0 0,091.103 0,091.103 0,091.103 nhiệt độ lạnh 1 3,03.103 2,59.103 2,32.103 Trang 44
  52. Đồ án tốt nghiệp 3 4,24.103 3,80.103 3,56.103 6 5,88.103 4,96.103 3,64.103 9 6,41.103 5,36.103 5,50.103 12 8,21.103 5,73.103 6,15.103 16 *1000 14 12 10 Nƣớc cất (thƣờng) 0.2% (thƣờng) 8 0.4% (thƣờng) 6 Nƣớc cất (lạnh) 0.2% (lạnh) 4 0.4% (lạnh) 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ngày Hình 3.3. Biến đổi về tổng vi sinh vật hiếu khí của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh Kết quả xử lý thống kê cho thấy sự khác biệt về tổng vi sinh vật hiếu khí của dung dịch ngâm giữa 2 chế độ nhiệt có ý nghĩa với mức ý nghĩa 0,05, các mẫu đƣợc bảo quản ở nhiệt độ thƣờng có số lƣợng vi sinh vật hiếu khí cao hơn mẫu bảo quản ở nhiệt độ lạnh. Mặc dù khi nhìn trên sơ đồ có thể thấy sự khác biệt giữa mẫu đối chứng và mẫu nghiên cứu nhƣng khi xử lý thống kê thì tổng vi sinh vật hiếu khí giữa 2 mẫu khác biệt không đáng kể. Vì vậy, có thể thấy chitosan không ảnh hƣởng nhiều đến chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí, yếu tố ảnh hƣởng đến chỉ tiêu này nhiều nhất chính là nhiệt độ. Trang 45
  53. Đồ án tốt nghiệp Hầu hết qua kiểm nghiệm đều bắt gặp vi sinh vật hiếu khí. Tuy nhiên vi sinh vật hiếu khí chỉ có giá trị chỉ thị về hiện trạng của sản phẩm hơn là dự báo về thời hạn sử dụng của sản phẩm bởi khó xác định tỷ lệ vi khuẩn gây hƣ hỏng. 3.2.4. Khảo sát chỉ tiêu nấm men – nấm mốc trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh Trong thực phẩm, nấm men và nấm mốc hiện diện có thể làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hƣ hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Vì vậy cần xác định chỉ tiêu nấm men và nấm mốc để đánh giá chất lƣợng của mẫu, nguy cơ hƣ hỏng cũng nhƣ mức độ vệ sinh trong quá trình bảo quản. Bảng 3.5. Mật độ nấm men nấm mốc trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh Chế độ bảo Ngày Mẫu đối Nồng độ chitosan của dung quản chứng dịch ngâm đậu hũ Nƣớc cất 0,2% 0,4% Bảo quản ở 0 0 0 0 nhiệt độ 1 0,09.103 0,02.103 0,02.103 thƣờng 3 1,71.103 0,27.103 0,18.103 6 3,45.103 1,36.103 2,82.103 9 9,91.103 4,68.103 5,73.103 12 16,01.103 7,36.103 9,23.103 Bảo quản ở 0 0 0 0 nhiệt độ lạnh 1 0,02.103 0,02.103 0,02.103 3 0,11.103 0,07.103 0,18.103 6 0,41.103 0,09.103 0,23.103 9 0,73.103 0,17.103 0,32.103 12 1,64.103 0,32.103 0,54.103 Trang 46
  54. Đồ án tốt nghiệp 18 *1000 16 14 12 Nƣớc cất (thƣờng) 10 0.2% (thƣờng) 8 0.4% (thƣờng) Nƣớc cất (lạnh) 6 0.2% (lạnh) 4 0.4% (lạnh) 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ngày Hình 3.4. Biến đổi về nấm men – nấm mốc của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh Các đƣờng biểu diễn trên biểu đồ hình 3.4 cho thấy số lƣợng nấm men – nấm mốc của mẫu đối chứng bảo quản ở nhiệt độ thƣờng tăng cao nhất. Điều này có thể đƣợc giải thích là do trong mẫu không có chất bảo quản, vi sinh vật phát triển mạnh sinh ra nhiều acid, lúc này nấm men – nấm mốc sẽ sử dụng các sản phẩm mà vi sinh vật đã phân hủy trƣớc đó để sinh trƣởng và phát triển. Ở nồng độ 0,2% và 0,4%, nấm men – nấm mốc cũng phát triển mạnh nhƣng vẫn thấp hơn nhiều so với mẫu đối chứng. Điều này có thể do nấm men và nấm mốc là những vi sinh vật có vách tế bào có thành phần chitin nên hoạt tính kháng khuẩn của chitosan có hiệu quả rất thấp đối với nấm men – nấm mốc, do đó số lƣợng nấm men - nấm mốc trong dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng tăng mạnh. Số lƣợng nấm men – nấm mốc trong dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng cao hơn so với dung dịch ngâm trong nhiệt độ lạnh. Nhiệt độ thấp tuy không thể tiêu diệt vi sinh vật nhƣng cũng có thể ức chế các hoạt động của chúng, mặt khác, nấm Trang 47
  55. Đồ án tốt nghiệp men và nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật ƣa mát nên khi bảo quản ở nhiệt độ lạnh thì nấm men và nấm mốc phát triển rất chậm. 3.2.5. Khảo sát chỉ tiêu E. coli trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh Số lƣợng hiện diện của E. coli trong thực phẩm chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nƣớc uống hoặc dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Kết quả thí nghiệm đã xác định không phát hiện E. coli trong tất cả các mẫu. Số liệu đƣợc trình bày trong bảng 3.6 là số lƣợng E. coli giả định (coliforms chịu nhiệt). Bảng 3.6. Số lƣợng E. coli giả định trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh Chế độ bảo Ngày Mẫu đối Nồng độ chitosan của dung quản chứng dịch ngâm đậu hũ Nƣớc cất 0,2% 0,4% Bảo quản ở 0 0 0 0 nhiệt độ 1 0,34.102 0,27.102 0,15.102 thƣờng 3 0,42.102 0,28.102 0,38.102 6 0,43.102 0,34.102 0,39.102 9 0,75.102 0,40.102 0,58.102 12 0,95.102 0,38.102 0,66.102 Bảo quản ở 0 0 0 0 nhiệt độ lạnh 1 0,03.102 0,03.102 0,03.102 3 0,24.102 0,03.102 0,036.102 6 0,26.102 0,09.102 0,036.102 9 0,30.102 0,15.102 0,21.102 12 0,34.102 0,19.102 0,29.102 Trang 48
  56. Đồ án tốt nghiệp 1,2 *100 1 0,8 Nƣớc cất (thƣờng) 0.2% (thƣờng) 0,6 0.4% (thƣờng) Nƣớc cất (lạnh) 0,4 0.2% (lạnh) 0,2 0.4% (lạnh) 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ngày Hình 3.5. Biến đổi về E. coli giả định của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh Kết quả xử lý thống kê cho thấy khác biệt về số lƣợng E. coli giả định của dung dịch ngâm ở 2 chế độ nhiệt có ý nghĩa với mức ý nghĩa 0,05, số lƣợng E. coli giả định ở nhiệt độ thƣờng cao hơn so với nhiệt độ lạnh. Ở nhiệt độ thƣờng, kết quả xử lý số liệu cho thấy có sự khác biệt về số lƣợng E. coli giả định giữa mẫu đối chứng và mẫu nghiên cứu, số lƣợng E. coli ở mẫu nghiên cứu thấp hơn so với mẫu đối chứng. Theo kết quả của phần 3.2.1, pH của dung dịch ngâm có giá trị trung bình là 5,5, ở giá trị pH này chitosan có tác dụng ức chế E. coli rất tốt nên số lƣợng vi khuẩn của mẫu nghiên cứu thấp hơn nhiều so với mẫu đối chứng. Đối với mẫu đối chứng, số lƣợng E. coli giả định ở ngày thứ 9 (75 MPN/ml) đã vƣợt qua chỉ tiêu E. coli của TCVN (50 MPN/ml), trong khi đó mẫu đậu hũ ngâm trong dung dịch 0,4% chitosan đến ngày thứ 9 và mẫu đậu hũ ngâm trong dung dịch 0,2% chitosan đến ngày thứ 12 mới vƣợt qua chỉ tiêu của TCVN. Điều này cho thấy chitosan đã thể hiện tính kháng khuẩn của mình và nồng độ ức chế E. coli tốt nhất là 0,2%. Trang 49
  57. Đồ án tốt nghiệp Ở nhiệt độ lạnh, số lƣợng E. coli của mẫu đối chứng và mẫu nghiên cứu không có sự khác biệt do hoạt động của vi sinh vật đã bị ức chế, thời gian lấy mẫu tƣơng đối ngắn nên chƣa thấy đƣợc những tác động của chitosan. Từ phân tích trên có thể rút ra nhận xét: - Nhiệt độ bảo quản có ảnh hƣởng đến chỉ tiêu E. coli của dung dịch ngâm, trong đó đậu hũ đƣợc bảo quản ở nhiệt độ lạnh là tốt nhất. - Chitosan có ảnh hƣởng đến chỉ tiêu E. coli của dung dịch ngâm và nồng độ ngâm thích hợp nhất là 0,2%. Trang 50
  58. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sau thời gian nghiên cứu, thực hiện đề tài cho phép rút ra những kết luận sau: 1. Xác định đƣợc một số chỉ tiêu của đậu hũ dùng trong nghiên cứu: Tên chỉ tiêu Giá trị Hàm lƣợng nƣớc (%) 64,2 Hàm lƣợng protein (%) 7,2 Hàm lƣợng lipid (%) 3,62 Hàm lƣợng tro (%) 1,76 Đậu hũ dễ hƣ hỏng và khó bảo quản do có độ ẩm cao, thành phần nhiều chất dinh dƣỡng. 2. Nhiệt độ bảo quản là yếu tố ảnh hƣởng nhiều nhất đến chất lƣợng của đậu hũ. Từ các phân tích trong phần kết quả và thảo luận cho thấy trong điều kiện bảo quản lạnh luôn cho kết quả tốt hơn bảo quản thƣờng do vi sinh vật gây hƣ hỏng đậu hũ chủ yếu là loài ƣa ấm và chịu lạnh kém. Ở nhiệt độ thấp, vi sinh vật bị ức chế làm cho hoạt động sống và sinh trƣởng kém hơn so với nhiệt độ thƣờng, trong quá trình bảo quản bằng nƣớc lạnh, vi sinh vật vẫn có thể phát triển nhƣng với tốc độ chậm hơn so với việc bảo quản ở nhiệt độ thƣờng. Khi bảo quản ở nhiệt độ lạnh, do thời gian nghiên cứu ngắn, không thấy rõ đƣợc những tác động của chitosan đối với các chỉ tiêu theo dõi của đậu hũ. Vì vậy khi bảo quản ngắn hạn việc sử dụng chitosan là không cần thiết. Khi bảo quản ở nhiệt độ thƣờng, chitosan tỏ ra có hiệu quả đối với nấm men, nấm mốc, E. coli và độ đục dung dịch, những ảnh hƣởng của chitosan đối với chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí và là không đáng kể. Tuy nhiên, xét về tổng thể thì việc chitosan để kéo dài thời gian bảo quản đậu hũ là cần thiết. Trang 51
  59. Đồ án tốt nghiệp 4.2. Kiến nghị 1. Cần kéo dài thời gian bảo quản đậu hũ ở nhiệt độ lạnh để có thể phân tích rõ ràng hơn về những ảnh hƣởng của chitosan đối với các chỉ tiêu chất lƣợng của đậu hũ. 2. Cần tiếp tục thử nghiệm thêm các nồng độ chitosan khác nhau để tìm ra nồng độ bảo quản tối ƣu nhất. 3. Có thể nghiên cứu thêm một số phƣơng pháp sử dụng chitoan để bảo quản đậu hũ nhƣ phối trộn chitosan vào đậu hũ sau giai đoạn kết tủa. 4. Kết hợp chitosan với một số chất bảo quản khác để nâng cao khả năng bảo quản đậu hũ. Trang 52
  60. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Lê Văn Hòa, Nguyễn Bảo Vệ. “Nghiên cứu bảo quản tươi, kéo dài thời gian tồn trữ trái cây tại Cần Thơ”. Đại Học Cần Thơ. 2. Lê Thị Lành, Nguyễn Thị Thanh Hải, Trần Thái Hòa (2012). Tổng hợp nano vàng sử dụng chitosan tan trong nước làm chất khử và chất ổn định. Tạp chí khoa học, số 5. Đại học Huế. 3. Trần Mạnh Lục (2008). Điều chế chitin/chitosan từ vỏ tôm và nghiên cứu ứng dụng của màng chitosan trong bảo quản táo ta. Đại học Đà Nẵng. 4. Trần Thị Luyến, Lê Thanh Long (2007). Nghiên cứu bảo quản trứng gà tươi bằng màng bọc chitosan kết hợp phụ gia. Tạp chí Khoa học - Công nghệ - Thuỷ sản, số 1. Ðại học Nha Trang. 5. Lê Văn Việt Mẫn (2011). “Công nghệ chế biến thực phẩm”, NXB Đại học Quốc gia. 6. Phạm Thị Đan Phƣợng, Trang Sỹ Trung (2012). Tính chất của chitin và chitosan từ vỏ tôm thẻ chân trắng khử protein bằng phương pháp hóa học và sinh học. Tạp chí Khoa học - Công nghệ - Thuỷ sản, số 3. Đại học Nha Trang. 7. Trần Linh Thƣớc (2010). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, tái bản lần thứ sáu. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. 8. Nguyễn Thị Ngọc Tú (1995). Nghiên cứu chế tạo chitosan và xây dựng tiêu chuẩn dược dụng dùng trong y tế. Viện hóa học, Trung tâm khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia. 9. Vũ Hoàng Yến (2012). Phân tích thực phẩm. Trƣờng đại học công nghiệp Tp.HCM. Tài liệu nƣớc ngoài 10. Kie Hwan Chun, Byung Yong Kim (1997). The extension of tofu shelf – life with water-soluble degraded chitosan as immersion solution. Korean J.Food SIC technol. Trang 53
  61. Đồ án tốt nghiệp 11. H.K.No, S.P.Meyyers (2007). Applications of chitosan for improvement of quality and shelf life of foods: A review. Journal of food science. TRANG WEB THAM KHẢO 12. hoa-sinh-va-mot-so-ung-dung-cua-chitosan-20636/ 13. 36086/ 14. 15. 7870/ Trang 54
  62. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A Phụ lục 1.1. Phƣơng pháp xác định độ ẩm Nguyên lý: dùng sức nóng làm bay hết hơi nƣớc trong thực phẩm. Cân trọng lƣợng thực phẩm trƣớc và sau khi sấy khô từ đó tính ra phần trăm nƣớc có trong thực phẩm. Mẫu đƣợc đem sấy khô ở nhiệt độ 105oC đến khối lƣợng không đổi. Dụng cụ: - Cân điện tử có độ chính xác 0,001 g. - Tủ sấy điều chỉnh đƣợc nhiệt độ (105oC). - Bình hút ẩm. - Chén thủy tinh. Tiến hành: Cân chính xác 5 g mẫu phân tích cho vào chén cân đã biết trƣớc khối lƣợng. Cho chén vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 105oC trong khoảng 1 giờ. Sau đó lấy chén ra cho vào bình hút ẩm, để nguội trong 30 phút, lấy chén ra, đem cân chính xác đến 0,001 g. Lặp lại quá trình sấy nhƣ trên cho đến khối lƣợng không đổi (mẫu đƣợc coi là có khối lƣợng không đổi khi chênh lệch giữa hai lần cân liên tiếp nhỏ hơn 0,0005 g). Thời gian sấy mỗi lần tiếp theo là 30 phút. Kết quả: Độ ẩm của mẫu (X) đƣợc tính theo công thức: ( ) X = (%) ( ) Trong đó: G: trọng lƣợng chén sứ (g) G1: trọng lƣợng chén sứ và mẫu trƣớc khi sấy (g) G2: trọng lƣợng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g) Phụ lục 1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tro Nguyên lý: dùng nhiệt độ cao (550 – 600oC) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ, phần còn lại sau khi nung là tổng số tro có trong thành phần cần xác định. Trang 1
  63. Đồ án tốt nghiệp Dụng cụ: chén sứ, cân phân tích, lò nung, bình hút ẩm. Tiến hành: Nung chén sứ ở nhiệt độ 600oC trong 1 giờ bằng lò nung. Hạ nhiệt độ chén sứ từ từ bằng cách cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC, để nguội rồi cho vào bình hút ẩm. Sau đó đem cân chính xác 0,001 g. Cho 3 g mẫu vào chén sứ và cân khối lƣợng chén sứ có chứa mẫu. Cho tất cả vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ cho đến 550 – 600oC. Nung cho đến khi tro trắng hoàn toàn. Hạ nhiệt độ chén sứ tƣơng tự nhƣ trên rồi đem cân chén sứ có chứa tro. Kết quả: Hàm lƣợng tro của mẫu đƣợc tính theo công thức: ( ) X = (%) ( ) Trong đó: G: trọng lƣợng chén (g) G1: trọng lƣợng của chén và mẫu (g) G2: trọng lƣợng của chén và trọng lƣợng tro trắng sau khi đã nung và cân tới khối lƣợng không đổi (g) Phụ lục 1.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nito tổng số Hàm lƣợng nito tổng số trong thành phần nguyên liệu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Kjeldahl. Nguyên lý: Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác, sau đó dùng kiềm mạnh (NaOH hay KOH) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do. Định lƣợng NH3 bằng H2SO4. Dụng cụ: bộ Kjeldahl Tiến hành: Trang 2
  64. Đồ án tốt nghiệp Vô cơ hóa mẫu: Cân 0,5 g mẫu cho vào bình Kjeldahl với 10 ml H2SO4 đậm đặc và 5 g chất xúc tác ( K2SO4 và CuSO4). Để nghiêng bình Kjeldahl trên bếp và đun từ từ cho đến khi thu đƣợc dung dịch trong suốt không màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4, để nguội. Cất đạm: Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, cho một ít nƣớc cất vào bình Kjeldahl để tráng rồi cho vào bình cầu, tráng rửa bình Kjeldahl và phễu vài lần vào bình cầu rồi cho khoảng 10 ÷ 15 ml NaOH 40%, vài giọt Tasiro vào bình cầu và tiến hành cất đạm. Định lƣợng trực tiếp NH3 bay ra hòa tan trong bình hứng bằng dung dịch H2SO4 0,1N. Sau khi đuổi hết NH3, chuẩn độ H2SO4 thừa bằng NaOH 0,1N. Kết quả: Hàm lƣợng nito toàn phần đƣợc tính theo công thức: ( ) N (%) = Trong đó: V1: số ml dung dịch H2SO4 dùng để đuổi hết NH3 V2: số ml dung dịch NaOH dùng để chuẩn độ M: khối lƣợng mẩu dùng để vô cơ hóa mẫu (mg) Phụ lục 1.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng lipid Hàm lƣợng lipid đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Soxhlet Nguyên lý: Dùng dung môi nóng để hòa tan tất cả chất béo tự do có trong thực phẩm. Sau khi đuổi hết dung môi, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lƣợng lipid có trong thực phẩm. Dụng cụ: bộ Soxhlet Tiến hành: Cân 1 g mẫu cho vào túi bằng giấy lọc (đã sấy khô đến khối lƣợng không đổi và cân). Sau đó cho túi mẫu vào ống chiết Soxhlet. Cho ete vào 2/3 bình cầu. Cho nƣớc lạnh chảy qua ống sinh hàn. Trang 3
  65. Đồ án tốt nghiệp Đun sôi cách thủy đến khi chất béo đƣợc chiết hết. Thời gian khoảng 8 ÷ 12 giờ (trong một giờ dung môi tràn từ ống chiết về bình chứa không ít hơn 5 ÷ 6 lần và không nhiều hơn 8 ÷ 10 lần). Thử xem đã hết dung môi chƣa bằng cách lấy vài giọt dung môi trong ống nhỏ lên trên mặt kính đồng hồ, để bay hơi nếu trên bề mặt mặt kính đồng hồ không có vết loang coi nhƣ đã chiết xong. Sau khi chiết xong, lấy túi mẫu ra khỏi bình chiết, cho bay hơi hết dung môi, sấy khô đến khối lƣợng không đổi và cân. Kết quả: Hàm lƣợng lipid đƣợc tính theo công thức: ( ) Hàm lƣợng lipid trong thực phẩm = (%) Trong đó: m: Khối lƣợng mẫu ban đầu (g) G1: Khối lƣợng mẫu và giấy lọc trƣớc khi tách lipid (g) G2: Khối lƣợng mẫu và giấy lọc sau khi tách lipid (g) Phụ lục 1.5. Phƣơng pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí Nguyên tắc: Tổng số vi sinh vật hiếu khí đƣợc đếm bằng cách đỗ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30oC trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ ± 6 giờ Môi trƣờng sử dụng: - Môi trƣờng pha loãng mẫu: Buffer Peptone Water (BPW). - Môi trƣờng nuôi cấy: Plate Count Agar (PCA). Tiến hành: Hút 1 ml dịch ngâm cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng BPW đã đƣợc hấp khử trùng ta đƣợc dung dịch pha loãng 10-1, làm tiếp tục để có độ pha loãng 10-2 và 10-3. Dùng micropipet với các đầu tip vô trùng để chuyển 1 ml dịch pha loãng vào giữa đĩa petri. Sau khi cấy, đổ vào đĩa 10 – 15 ml môi trƣờng PCA sau khi đƣợc hấp Trang 4
  66. Đồ án tốt nghiệp khử trùng và làm nguội đến 45 – 50oC. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc. Các đĩa đƣợc lật ngƣợc lại và ủ ở 37oC trong 48 giờ. Kết quả: Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 – 250 tế bào vi sinh vật để tính. Mật độ vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm đƣợc tính nhƣ sau: A = (CFU/ml) Trong đó: A: Số tế bào vi khuẩn trong mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa đã chọn n: Số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu cấy vào môi trƣờng (ml) f: Độ pha loãng tƣơng ứng Phụ lục 1.6. Phƣơng pháp xác định nấm men, nấm mốc Nguyên tắc: Tổng nấm men, nấm mốc đƣợc xác định bằng cách cấy trang và ủ ở 30oC trong 48 giờ. Môi trƣờng sử dụng: - Môi trƣờng pha loãng: Buffer Peptone Water (BPW) - Môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng dịch chiết khoai tây có bổ sung kháng sinh. Khoai tây 200g Agar 2% Kháng sinh chloramphenicol 2% Nƣớc cất 1 lít Tiến hành: Trang 5
  67. Đồ án tốt nghiệp Hút 1 ml dịch ngâm cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng BPW đã đƣợc hấp khử trùng ta đƣợc dung dịch pha loãng 10-1, làm tiếp tục để có độ pha loãng 10-2 và 10-3. Đổ vào đĩa 10 – 15 ml môi trƣờng dịch chiết khoai tây đã đƣợc hấp khử trùng, để nguội cho đến khi môi trƣờng đông lại. Dùng micropipet hút 0,1 ml dịch ngâm mẫu cho vào đĩa, dùng que cấy trang trang đều mẫu trên bề mặt môi trƣờng cho đến khi khô. Sau khi cấy, ủ các đĩa ở 30oC trong 48 giờ. Kết quả: Đếm tất cả các khuẩn lạc nấm men, nấm mốc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 – 250 tế bào vi sinh vật để tính. Mật độ nấm men – nấm mốc trong thực phẩm đƣợc tính nhƣ sau: A = (CFU/ml) Trong đó: A: Số tế bào vi khuẩn trong mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa đã chọn n: Số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu cấy vào môi trƣờng (ml) f: Độ pha loãng tƣơng ứng Phụ lục 1.7. Phƣơng pháp xác định mật độ E.coli Nguyên tắc: Mật độ E.coli đƣợc xác định bằng phƣơng pháp MPN (Most Probable Number). Phƣơng pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu đƣợc pha loãng thành một dãy thập phân liên tiếp và đƣa vào các ống nghiệm có chứa môi trƣờng thích hợp có chứa ống Durnham, ủ và đọc số ống có kết quả dƣơng tính. Môi trƣờng sử dụng: - Môi trƣờng pha loãng: Buffer Peptone Water (BPW) - Canh Lactose broth. - Canh EC (E.coli medium) Trang 6
  68. Đồ án tốt nghiệp - Môi trƣờng Eosine Methylene Blue Lactose agar (EMB) Tiến hành: Hút 1 ml dịch ngâm cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng BPW đã đƣợc hấp khử trùng ta đƣợc dung dịch pha loãng 10-1, làm tiếp tục để có độ pha loãng 10-2 và 10-3. Hút 1 ml dịch mẫu đã pha loãng đầu tiên vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10 ml canh Lactose broth có bổ sung ống Durnham. Thực hiện tƣơng tự với dịch mẫu ở các độ pha loãng tiếp theo. Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 24 giờ. Ghi nhận các ống sinh hơi. Dùng que cấy vòng cấy chuyển mẫu từ ống Lactose broth dƣơng tính sang các ống chứa canh EC broth và ủ ở 44oC trong 24 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi. Đọc số lƣợng các ống sinh hơi. Số ống nghiệm cho phản ứng dƣơng tính của các nồng độ pha loãng đƣợc tra theo bảng MPN (Mac Crady). Dùng que cấy vòng chuyển một ít sinh khối từ các ống có sinh hơi trong môi trƣờng canh EC sang môi trƣờng thạch EMB. Ủ các đĩa này ở 37oC trong 24 giờ. Chọn các khuẩn lạc có hình đĩa, tròn, dẹt và có ánh kim tím. Các khuẩn lạc nghi ngờ đƣợc cấy vào môi trƣờng canh tryptone, môi trƣờng MR – VP và simmon citrate agar (SCA) để thực hiện nghiệm pháp IMViC và đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Kết quả: Mật độ E. coli đƣợc tính theo công thức: A = Số Mac Crady * (MPN/ml) Trong đó: A: Mật độ E.coli có trong mẫu f: nồng độ pha loãng (lấy nồng độ ở giữa trong 3 nồng độ pha loãng) Trang 7
  69. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B 1.1. Kết quả so sánh pH của dung dịch ngâm đậu hũ giữa các mẫu Analysis of Variance for pH - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:nong do 0.0205556 2 0.0102778 0.04 0.9579 B:ngay 11.2914 5 2.25828 9.48 0.0000 C:nhiet do 7.0225 1 7.0225 29.47 0.0000 INTERACTIONS AC 0.411667 2 0.205833 0.86 0.4337 RESIDUAL 5.95694 25 0.238278 TOTAL 24.7031 35 (CORRECTED) - Kết quả so sánh pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh: Multiple Range Tests for pH 2 by nhiet do Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups Thƣờng 18 4.99444 0.115055 X Lạnh 18 5.87778 0.115055 X - Kết quả so sánh pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng: Multiple Range Tests for thuong by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups 0 6 4.81667 X 0.2 6 5.05 X Trang 8
  70. Đồ án tốt nghiệp 0.4 6 5.11667 X - Kết quả so sánh pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ lạnh: Multiple Range Tests for lanh by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups 0.2 6 5.81667 X 0.4 6 5.81667 X 0 6 5.96667 X 1.2. Kết quả so sánh độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ giữa các mẫu Analysis of Variance for do duc - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:nong do 0.265285 2 0.132643 13.40 0.0001 B:nhiet do 0.389168 1 0.389168 39.31 0.0000 C:ngay 0.709442 5 0.141888 14.33 0.0000 INTERACTIONS AB 0.0177141 2 0.00885703 .89 0.4214 RESIDUAL 0.247502 25 0.00990006 TOTAL 1.62911 35 (CORRECTED) - Về nông độ: Multiple Range Tests for do duc by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 0.2 12 0.135083 0.0286106 X 0.4 12 0.242833 0.0286106 X Trang 9
  71. Đồ án tốt nghiệp 0 12 0.345333 0.0286106 X - Về nhiệt độ: Multiple Range Tests for do duc by nhiet do Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups L 18 .137111 .0233605 X T 18 .345056 .0233605 X - Kết quả so sánh độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng: Multiple Range Tests for thuong by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups 0.2 6 0.239333 X 0.4 6 0.3195 X 0 6 0.476333 X - Kết quả so sánh độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ lạnh: Multiple Range Tests for lanh by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups 0.2 6 0.0308333 X 0.4 6 0.166167 X 0 6 .214333 X Trang 10
  72. Đồ án tốt nghiệp 1.3. Kết quả so sánh tổng vi sinh vật hiếu khí của dung dịch ngâm đậu hũ giữa các mẫu Analysis of Variance for tpc 2 - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:nong do 9.03984 2 4.51992 1.99 0.1573 B:ngay 369.939 5 73.9878 32.63 0.0000 C:nhiet do 48.3025 1 48.3025 21.30 0.0001 INTERACTIONS AC 0.34835 2 0.174175 0.08 0.9263 RESIDUAL 56.6802 25 2.26721 TOTAL 484.31 35 (CORRECTED) - Về nhiệt độ: Multiple Range Tests for tpc by nhiet do Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups L 18 3.98072 .354903 X T 18 6.29739 .354903 X - Kết quả so sánh TPC của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng: Multiple Range Tests for thuong by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups 0.2 6 5.7985 X 0.4 6 6.04183 X 0 6 7.05183 X Trang 11
  73. Đồ án tốt nghiệp - Kết quả so sánh độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ lạnh: Multiple Range Tests for lanh by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups 0.4 6 3.5435 X 0.2 6 3.75517 X 0 6 4.6435 X 1.4. Kết quả so sánh nấm men – nấm mốc của dung dịch ngâm đậu hũ giữa các mẫu Analysis of Variance for nmnm - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:nong do 17.5645 2 8.78226 1.37 0.2732 B:nhiet do 93.3478 1 93.3478 14.53 0.0008 C:ngay 168.025 5 33.605 5.23 0.0020 INTERACTIONS AB 10.5442 2 5.2721 .82 0.4516 RESIDUAL 160.563 25 6.42254 TOTAL 450.045 35 (CORRECTED) - Về nhiệt độ: Multiple Range Tests for nmnm by nhiet do Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups L 18 0.270556 0.597334 X T 18 3.49111 0.597334 X Trang 12
  74. Đồ án tốt nghiệp - Kết quả so sánh nấm men – nấm mốc của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng: Multiple Range Tests for thuong by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups 0.2 6 2.28167 X 0.4 6 2.99667 X 0 6 5.195 X - Kết quả so sánh nấm men – nấm mốc của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ lạnh: Multiple Range Tests for lanh by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do1 Count Mean Homogeneous Groups 0.2 6 0.111667 X 0.4 6 0.215 X 0 6 0.485 X 1.5. Kết quả so sánh E.coli của dung dịch ngâm đậu hũ giữa các mẫu Analysis of Variance for ecoli - Type III Sums of Squares Source Sum of Df Mean F- P- Squares Square Ratio Value MAIN EFFECTS A:nong do .216572 2 .108286 8.01 . 21 B:nhiet do .642669 1 .642669 47.52 . 0 C:ngay .912514 5 .182503 13.50 . 0 INTERACTIONS AB .0350056 2 .0175028 1.29 .2918 Trang 13
  75. Đồ án tốt nghiệp RESIDUAL .338069 25 .0135228 TOTAL 2.14483 35 (CORRECTED) - Về nồng độ: Multiple Range Tests for ecoli by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 0.2 12 0.18 0.0339333 X 0.4 12 0.231667 0.0339333 X 0 12 0.364167 0.0339333 X - Về nhiệt độ: Multiple Range Tests for ecoli by nhiet do Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups L 18 0.125 0.0277064 X T 18 0.392222 0.0277064 X - Kết quả so sánh E.coli của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng: Multiple Range Tests for thuong by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups 0.2 6 0.278333 X 0.4 6 0.36 X 0 6 0.538333 X - Kết quả so sánh E.coli của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ lạnh: Trang 14
  76. Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for lanh by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups 0.2 6 0.0816667 X 0.4 6 0.103333 X 0 6 0.19 X Trang 15