Đồ án Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus Spp

145 trang thiennha21 12/04/2022 2890

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus Spp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_phan_lap_vi_khuan_lactic_tu_thuc_pham_len_men_truyen_t.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus Spp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MỐC SINH AFLATOXIN Aspergillus spp. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : LƯU ĐẠI KIM PHƯỢNG MSSV: 1211100167 Lớp: 12DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Sinh viên thực hiện luận văn Lƣu Đại Kim Phƣợng i
Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, con xin gửi lời cám ơn đến bố mẹ. Cám ơn bố mẹ đã không quản khó khăn nuôi dưỡng con từng ngày, dạy cho con những điều hay lẽ phải. Bố mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất của con, là nguồn động viên to lớn cho con mỗi khi con vấp ngã và cũng là động lực để con tiếp tục phấn đấu trong công việc cũng như trong cuộc sống. Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cám ơn toàn thể quý Thầy Cô bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, cùng toàn thể quý Thầy Cô trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu về cũng như đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương – Trường bộ môn Công Nghệ Sinh Học, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực phẩm – Môi trường Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, người cô đáng kính, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung cấp thông tin cũng kiến thức thật hữu ích cho em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Em cũng xin cảm ơn các Thầy Cô phụ trách phòng thí nghiệm Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn tất phần thực nghiệm của đồ án. Xin chân thành cảm ơn các bạn học cùng lớp 12DSH đã gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho em trong suốt bốn năm đại học. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc, nhận xét đồ án tốt nghiệp này. TP.HCM, tháng 8 năm 2016. SVTH: Lƣu Đại Kim Phƣợng ii
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH x MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 2.1. Ngoài nước 2 2.2. Trong nước 3 3. Mục tiêu nghiên cứu 3 4. Mục đích nghiên cứu 3 5. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 6. Phƣơng pháp nghiên cứu 4 6.1. Phương pháp luận 4 6.2. Phương pháp xử lý số liệu 4 7. Kết quả đạt đƣợc của đề tài 4 8. Kết cấu đồ án 5 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 6 1.1. Tổng quan về nấm 6 1.1.1. Giới thiệu chung 6 1.1.2. Độc tố nấm 6 1.1.3. Tác hại của nấm 7 1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật 7 1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật 8 1.1.4. Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm 8 1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic 9 1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic 9 iii
Đồ án tốt nghiệp 1.2.1.1. Giới thiệu chung 9 1.2.1.2. Khái niệm 10 1.2.1.3. Đặc tính chung 12 1.2.1.4. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus chủ yếu 14 1.2.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 24 1.2.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 24 1.2.2.2. Qúa trình trao đổi chất 26 1.2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 31 1.2.3. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập 32 1.2.3.1.Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển (Owen R. Fennema et al. 2004) 32 1.2.3.2. Sự phân loại LAB đến cấp giống (Owen R. Fennema et al. 2004) 33 1.2.3.3. Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại 37 1.2.4. Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic 38 1.2.4.1. Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic 38 1.2.4.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic 40 1.2.5. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic 40 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1. Địa điểm nghiên cứu 46 2.2. Thời gian thực hiện 46 2.3. Vật liệu 46 2.3.1. Thiết bị và dụng cụ 46 2.3.2. Hóa chất 46 2.3.3. Giống nấm 50 2.4. Phƣơng pháp luận 50 2.5. Phƣơng pháp thí nghiệm 53 iv
Đồ án tốt nghiệp 2.5.1. Thu thập mẫu 53 2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 53 2.5.2.1. Tăng sinh 53 2.5.2.2. Phân lập 53 2.5.3. Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic. 55 2.5.3.1. Nhuộm Gram 55 Kết quả: 55 2.5.3.2. Nhuộm bào tử 55 2.5.3.3. Thử nghiệm Catalase 56 2.5.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid 56 2.5.3.5. Thử nghiệm khả năng di động 57 2.5.3.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí 57 2.6. Xác định hàm lƣợng acid tổng 58 2.7. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán của chủng Lactobacillus sp. với nấm bệnh 59 2.8. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt . 63 2.8.1. Ứng dụng tạo màng bao bảo quản hạt đậu phộng: 63 2.8.2. Kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm 65 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 66 3.1. Kết quả phân lập 66 3.2. Định danh các chủng phân lập 68 3.2.1. Thử nghiệm Catalase 68 3.2.2. Nhuộm Gram 69 3.2.3. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm. 76 3.2.4. Nhuộm bào tử 77 3.2.5. Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí. 79 3.3. Xác định Hàm lƣợng acid tổng 83 v
Đồ án tốt nghiệp 3.4. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phƣơng pháp khuếch tán 86 3.5. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn phân lập đƣợc trong bảo quản hạt 92 3.5.1. Ứng dụng tạo màng bao bảo vệ đậu phộng 92 3.6.2 Kiểm tra vi sinh chất lượng của sản phẩm: 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT FDA Fructose-bisphosphate aldolase ATP Adenosin triphosphat LAB lactic acid bacteria /Lactobacillales DNA Deoxyribonucleic acid rRNA ribosomal Ribonucleic acid MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar DMSO Dimethyl sulfoxide Bacillus sb. Bacillus subtilis E. coli Escherichia coli vii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại khoa học giống Lactobacillus 14 Bảng 1.2: Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986) 17 Bảng 1.3: Phân loại khoa học giống Streptococcus 19 Bảng 1.4: Phân loại khoa học giống Leuconostoc 22 Bảng 1.5: Phân loại khoa học giống Pediococcus 23 Bảng 1.6. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) 42 Bảng 1.7. Phân lập vi khuẩn lactic với khả năng ức chế độc tố sinh trưởng của nấm mốc và nấm men 43 Bảng 1.8. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh. (Holzapfel và cộng sự, 1995) 44 Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập 53 Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập 68 Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x4 và hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi x100 73 Bảng 3.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn 81 Bảng 3.4: %Acid lactic của 17 chủng vi khuẩn phân lập được 83 Bảng 3.5: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập từ Nem chua 84 Bảng 3.6: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập từ Cơm mẻ 85 Bảng 3.7: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic 85 Bảng 3.8: Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn 89 Bảng 3.9: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Nem chua 90 viii
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Cơm mẻ 91 Bảng 3.11: Kí hiệu các thành phần của thí nghiệm 92 Bảng 3.12: Khả năng kháng nấm của Nghiệm thức 1 – Canh trường nuôi cấy và Nghiệm thức 2 – Canh trường nuôi cấy + Chitosan 0.4% ứng dụng trên đậu phộng 93 Bảng 3.13: Kết quả kiểm nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí và Coliform 97 ix
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic. (Owen R. Fennema et al. 2004) 12 Hình 1.2: Lactobacillus (L. acidophilus) 15 Hình 1.3: Lactobacillus salivarius 15 Hình 1.4: Streptococcus 19 Hình 1.5: Leuconostoc 22 Hình 1.6: Pediococcus 24 Hình 1.7: Con đường lên men Glucose 30 Hình 2.1: Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic 54 Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu 54 Hình 2.3 : Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được với nấm bệnh theo phương pháp đục thạch khuếch tán 60 Hình 2.4: Hình mô tả phương pháp đặt thạch 62 Hình 2.5: Cách đo đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm bệnh theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 63 Hình 3.1: Hình thái của vi khuẩn lactic 67 Hình 3.2: Các khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO3 67 Hình 3.3: Chủng Bacillus sb. Có Catalase dương tính (Trái). Chủng phân lập có Catalase âm tính (Phải) 69 Hình 3.4: Mẫu đối chứng với nước cất (Trái). Chủng phân lập có Catalase âm tính (Phải) 69 Hình 3.5: Vi khuẩn Bacillus sb. Gram dương bắt màu tím 70 Hình 3.6: Vi khuẩn E.Coli Gram âm bắt màu hồng 70 Hình 3.7: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn 77 Hình 3.8: Vi khuẩn Bacillus sb. sinh bào tử 78 Hình 3.9: Vi khuẩn E.Coli không sinh bào tử 78 Hình 3.10: Mẫu Vi khuẩn phân lập không sinh bào tử 79 x
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11: Thử nghiệm khả năng lên men đường 80 Hình 3.12: Vi khuẩn Lactobacillus L5 có khả năng lên men đường 81 Hình 3.13: Đồ thị biểu hiện % acid lactic của 17 chủng khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy 84 Hình 3.14: Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của LN4-2 sau 3 ngày 87 Hình 3.15: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LN4-2 sau 3 ngày 87 Hình 3.16: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LC1-1 sau 3 ngày 88 Hình 3.17: Khả năng đối kháng nấm ĐN2 của LC1-1 sau 3 ngày 88 Hình 3.18: Đồ thị biểu thị Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn 89 Hình 3.19: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L9B-LC1-1 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) 95 Hình 3.20: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L11-LN4-2 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) 96 Hình 3.21: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) 98 Hình 3.22: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN2-canh trường nuôi cấy+Chitosan 0.4% (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) 98 Hình 3.23: Kết quả Coliform trên môi trường VRB của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) 99 Hình 3.24: Kết quả thử nghiệm Coliform của TN1-Canh trường nuôi cấy (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) 99 Hình 3.25: Kết quả kiểm tra sự phát triển của nấm mốc trên môi trường MRS Agar100 Hình 3.26: Thử nghiệm Catalase với NT1 (Canh trường nuôi cấy) và NT2 (Canh trường nuôi cấy và Chitosan 0,4%) 101 xi
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày xưa, con người chỉ quan tâm đến việc ăn sao cho no, mặc sao cho đủ. Thế nhưng, ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu của con người cũng được nâng cao. Con người bắt đầu đặc biệt quan tâm đến sức khỏe hơn, thay vì ăn cho no thì họ bắt đầu lựa chọn những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có lợi cho sức khỏe. Vì vậy, vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm là vấn đề quan trọng hàng đầu ở mỗi quốc gia, nó liên quan đến đời sống hàng ngày cũng như sức khỏe của con người. Theo thống kê gần đây của ngành Y tế, ngộ độc thực phẩm có nguy cơ tăng dần và ngày càng phức tạp. Nguyên nhân chính dẫn đến ngộ độc thực phẩm phần lớn có nguồn gốc từ các vi sinh vật hoặc nấm gây bệnh hiện diện trong thực phẩm, nước uống Xã hội ngày càng phát triển nên con người luôn phải chạy theo sự phát triển đó. Cuộc sống của họ trở nên bận rộn hơn, họ bắt đầu “sống vội” hơn. Thay vì sử dụng các thực phẩm xanh, sạch thì con người lại chọn những thực phẩm chế biến sẵn mà không biết hầu hết chúng đều được bảo quản bằng chất hóa học. Bản thân thực phẩm cũng có thể chứa các mầm bệnh là nguyên nhân trực tiếp gây ra các dịch bệnh hiện nay. Mặc dù áp dụng tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và quy phạm vệ sinh an toàn thực phẩm (GMP, HACCP ), nhưng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế biến thực phẩm ngày càng gia tăng (Besselink, et al., 2008). Chính vì thế, các cơ sở sản xuất thực phẩm phải dùng đến các chất bảo quản hóa học. Mặc dù, nếu chúng được sử dụng với liều lượng cho phép nhưng các chất phụ gia này vẫn gây ra các tác dụng không mong muốn cho người tiêu dùng. Nhưng còn có rất nhiều trường hợp, do lợi nhuận, các nhà sản xuất còn sử dụng các loại hóa chất bị nghiêm cấm để có thể tăng hương vị sản phẩm hoặc kéo dài được hạn sử dụng hơn. Có thể nói: Hiện nay con người dường như đang sống cùng hóa chất và sức khỏe con người đang đứng trước bờ vực thẳm. 1
Đồ án tốt nghiệp Trước tình trạng đó, con người luôn tìm kiếm những sản phẩm vừa đầy đủ các chất dinh dưỡng vừa bảo vệ được sức khỏe. Từ xưa, ông bà ta đã sử dụng các phương pháp lên men truyền thống để bảo quản thực phẩm. Các phương pháp này không những giữ cho thực phẩm không bị hư hỏng mà còn làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm. Khi lên men thực phẩm là tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát triển. Các nghiên cứu trong những thập niên gần đây cho rằng nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) có tiềm năng bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sản sinh các chất kháng vi sinh vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển (Bernet-Camard, et al., 1997). Và việc nghiên cứu sản xuất các chất bảo quản thực phẩm theo hướng sinh học phần lớn đều tập trung vào các hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin) cũng như kháng nấm mốc thực phẩm của LAB trong đó những nghiên cứu kháng nấm vẫn còn mới mẻ. Vì các LAB đặc biệt các chủng đóng vai trò lên men thực phẩm truyền thống đã được chứng minh là an toàn. Do ở Việt Nam có rất nhiều các thực phẩm lên men truyền thống, tuy nhiên vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm mốc của các chủng vi sinh vật trong đó. Hiểu được những lợi ích mà các sản phẩm lên men truyền thống mang lại và để đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng bằng cách sử dụng các lợi khuẩn từ vi khuẩn lactic để ức chế khả năng phát triển của nấm trong các loại thực phẩm. Do đó, người thực hiện đề tài xin trình bày đề tài về: “Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus spp.” 2. Tình hình nghiên cứu 2.1. Ngoài nước Phân lập các chủng Lactobacillus fermentum từ bột ngô có khả năng phân giải tinh bột (Agati et al , 1998) Phân lập và chọn lọc dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 21B có khả năng kháng nấm. (Lavermicocca et al , 2000) 2
Đồ án tốt nghiệp Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic (Magnusson J., 2003) Hoạt động kháng nấm của vi khuẩn Lactobacillus paracasei (Hassan et al , 2008) Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic ở nhiều nước trên thế giới. 2.2. Trong nước Nguyễn Hoài Hương, Đoàn Kim Như (2013). Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem chua truyền thống làm giống khởi động lên men nem chua. Tạp chí Khoa học và công nghệ (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), 51: 200-204 Phân lập và khảo sát vài đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic, muối chua nấm rơm (Hồng Thị Hiền, 1998) Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học và chế phẩm tỏi trong sản xuất thịt lên men (nem chua- xúc xích lên men) (Nguyễn Thị Lan Phương, 2012) Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn (Ngô Thị Phương Dung, 2011) Phân lập vi khuẩn Lactobacillus thuần từ tự nhiên để sản xuất măng tre lên men chua (Nguyễn Văn Chương, 2008) 3. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm. Mục tiêu cuối cùng là tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng nấm tốt. 4. Mục đích nghiên cứu Cung cấp chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng nấm cao được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống cho phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường. 5. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men truyền thống. 3
Đồ án tốt nghiệp Khảo sát khả năng lên men lactic và tăng sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic. Khảo sát sơ bộ khả năng ứng dụng của vi khuẩn lactic trong bảo quản đậu phộng. 6. Phƣơng pháp nghiên cứu 6.1. Phương pháp luận Chọn nguồn phân lập đại diện cho các thực phẩm lên men truyền thống từ Việt Nam như nem chua, cơm mẻ Phân lập chủng thuần khiết, áp dụng phương pháp phân lập và định danh sơ bộ với vi khuẩn lên men lactic. Khảo sát khả năng lên men lactic qua theo dõi sinh khối và acid tổng tạo thành. Khảo sát khả năng kháng nấm in vitro của các chủng phân lập áp dụng phương pháp đặt thạch khuếch tán – Agar Plug Diffusion Method (Mounyr Balouiri, 2011) Khảo sát khả năng kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng. 6.2. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lý số liệu 7. Kết quả đạt đƣợc của đề tài Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có khả năng tăng sinh khối và có hoạt tính kháng nấm tốt từ các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ 2 nguồn thực phẩm lên men truyền thống là cơm mẻ và nem chua. Đánh giá tỉ lệ ức chế của nấm trong thực phẩm của canh trường vi khuẩn lactic. 4
Đồ án tốt nghiệp Đánh giá sơ bộ khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic khi ứng dụng trên đậu phộng. 8. Kết cấu đồ án Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được. Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài. 5
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về nấm 1.1.1. Giới thiệu chung Giới nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng có thành tế bào bằng chitin. Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium). Nấm thường sinh sản qua bào tử hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng. Quá trình sinh sản có thể là vô tính hay hữu tính. Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể). Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường. Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động vật, thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất. 1.1.2. Độc tố nấm Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người. Hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaría và Claviceps, chúng bao gồm: Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), ochratoxin A, stermatocystin, acid cyclopianxoic. Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon. 6
Đồ án tốt nghiệp Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin. - Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion. Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà Các độc tố gây độc chủ yếu và nguy hại là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh, thường gây ô nhiễm trên một số hạt (như lạc). Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan. Nếu mức độ ô nhiễm thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật và về dài lâu sẽ gây ung thư. Ngoài Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thường gặp là ochratoxin Penicillium và Aspergillus tiết ra. Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết, độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết. 1.1.3. Tác hại của nấm 1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm. Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là nấm mốc trong nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi như các chi Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium , chỉ có vài loài là nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula,có một số loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus, Fomes, Ganoderma Bào tử nấm có thể gây ra những chứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn. Ngộ độc do ăn phải nấm độc, có thể từ rối loạn tiêu hoá, ảo giác, hoặc trầm trọng có thể tử vong. Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp. Những loài có thể gây bệnh cho người thuộc các chi như Aspergillus, Candida, Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystis. Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben, cho đến những bệnh 7
Đồ án tốt nghiệp nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm Cryptococcus) hay viêm phổi do nấm Pneumocystis carinii. 1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp và lâm nghiệp.Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae)gây bệnh cho lúa.Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría và Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc, 1.1.4. Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (fungal flora) có 3 chủng giống nấm mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm. Một trong những nguyên nhân được nhắc đến là do con người đã ăn thực phẩm có nấm mốc chứa aflatoxin, một độc tố vi nấm đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm. Vậy aflatoxin là gì? Aflatoxin là một mycotoxin được tiết ra từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus. Các chủng nấm này phát triển mạnh ở các loại thực phẩm nông sản, thức ăn gia súc, gia cầm như ngô, lạc, đậu trong các điều kiện thuận lợi nóng và ẩm, nhất là điều kiện thời tiết ở Việt Nam. Tác hại của độc tố vi nấm này đối với động vật đã được biết đến từ lâu và đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm. Người có thể bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc bị ô nhiễm hoặc ăn thịt các động vật được nuôi bằng ngũ cốc ô nhiễm aflatoxin. Các trường hợp bị ngộ độc do chất độc tự nhiên có trong thực phẩm thường xảy ra trong tình trạng cấp tính rất nặng, tỷ lệ tử vong khá cao hoặc nếu bị nhiễm lâu dài có thể ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người. Trên thực tế nếu bị nhiễm độc tố aflatoxin của vi nấm có trong thực phẩm có thể gây nên bệnh ung thư gan, giảm năng suất sinh sữa và trứng ở các động vật nuôi như 8
Đồ án tốt nghiệp bò, cừu, gia cầm Loại độc tố này khá bền vững ở nhiệt độ cao, đun nóng thường không phá hủy được chúng. Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính với các biểu hiện chính là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan. Nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư gan ở người cũng còn rất nhiều tranh cãi. Tuy nhiên ở một số nghiên cứu, các nhà khoa học đã tìm thấy có sự gắn kết của aflatoxin B1 với DNA của tế bào gan cũng như có sự đột biến gen mà đặc biệt là gene p53 – một gene kiểm soát sự chết tế bào, ở những bệnh nhân mắc ung thư gan. Có 4 tác động chính gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan, rối loạn chức năng hoạt động của thận và có thể gây tử vong đối với trường hợp nặng. Ngoài ra, các độc tố vi nấm còn tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép DNA và gây hậu quả là đột biến hoặc quái thai. 1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic 1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic 1.2.1.1. Giới thiệu chung Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà, ), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó (1878), Lister đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình thành. 9
Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt, cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính quan trọng khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin, có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, chúng được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người. 1.2.1.2. Khái niệm Vi khuẩn lactic là một nhóm các vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả năng lên men đường để tạo acid lactic, có một sự thống nhất về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa và sự trao đổi chất. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaccae và được xếp vào năm giống: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc, Aerococcus. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau, chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử. Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men carbohydrate. Vì vậy LAB được dùng trong thực phẩm lên men, acid hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng. Một số chủng LAB có thể sinh bacteriocins ức chế sinh vật gây bệnh (Klaenhammer, 1987). Hơn nữa, acid lactic và các sản phẩm trao đổi chất khác góp phần vào tăng giá trị cảm quan và cấu trúc của thực phẩm. Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng; có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem ; hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid. 10
Đồ án tốt nghiệp Theo bảng phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc ovan) và hình que, trong đó các giống chủ yếu nhất là: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weisslella. Trong khóa phân loại của Bergey 1957, giống Bifidobacterum cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic, trong đó chúng được xem như là Lb.bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae - một nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men khác với vi khuẩn lactic. Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm. Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại. 11
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1: Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic. (Owen R. Fennema et al. 2004) Trong đó: - Khoảng cách tiến hóa gần bằng nhau. - Trong đó nhóm được đống khung là nhóm vi khuẩn được xem là an toàn với con người. 1.2.1.3. Đặc tính chung Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase âm tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc. Vi khuẩn lactic có thể lên men các loại đường monosaccharide và disaccharide nhưng không phải tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men được bất kỳ loại disaccharide nào, một số không lên men được saccharose, một số 12
Đồ án tốt nghiệp không sử dụng được lactose, các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột (trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccaride khác. Theo khóa phân loại của Bergey 1986 giới thiệu về các giống của vi khuẩn lactic, thì có 5 giống phù hợp với mô tả chung về vi khuẩn lactic: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Aerococcus. Trước đây giống Bifidobacterium cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng được xem là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae một nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men đường khác với vi khuẩn lactic. Trong 5 giống thuộc vi khuẩn lactic thì có 4 giống được mô tả và nghiên cứu nhiều nhất đó là: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Đây là những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn không sinh bào tử. Tất cả vi khuẩn lactic đều không chuyển động, gram dương, hô hấp yếm khí tùy nghi. Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0.5 – 1.5μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi. Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptide, acid amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn. Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 – 10% NaCl. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2 – 3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3.8 – 4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5.5 – 6. 13
Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích trong khoảng 25 – 35oC, nhóm ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40 – 45oC, nhóm ưa lạnh phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối thấp ( 5oC). Khi gia nhiệt đến 60 – 80oC thì hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Một số vi khuẩn lactic có khả năng tạo thành màng nhầy, một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực phẩm. Như vậy, ngoài khả năng tạo ra acid lactic, các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (Bacteriocin). Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại rau, quả, sữa, thịt, ). 1.2.1.4. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus chủ yếu Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài.  Giống Lactobacillus Bảng 1.1: Phân loại khoa học giống Lactobacillus Giới : Vi khuẩn Nghành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Lactobacillaceae Giống : Lactobacillus 14
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2: Lactobacillus (L. acidophilus) Hình 1.3: Lactobacillus salivarius Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như: L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus Tế bào có dạng hình que nhưng hình dạng của chúng có thể thay đổi tùy vào điều kiện của môi trường sống, có thể là dạng que ngắn hoặc dài, xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ hoặc ở dạng que kép. Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh bào tử, âm tính với catalase, kỵ khí chịu oxy, có khả năng chịu được môi trường có pH thấp. Trên môi trường agar, khuẩn lạc lồi, mép trơn, đục có đường kính 2-5mm. Hiếm khi tạo sắc tố nhưng khi tạo sắc tố thì thường là màu vàng, màu cam hay màu gỉ sắt và màu đỏ gạch. 15
Đồ án tốt nghiệp Không có khả năng chuyển hóa nitrate, trừ loài L. plantarum khi ở điều kiện nhất định. Một số loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng, và chịu được nhiệt độ cao. Các loài Lactobacillus thường được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có chứa các vi khuẩn này. Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum. Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa theo các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của chúng. Vì vậy có thể chia các loài Lactobacillus thành 3 nhóm như sau: - Nhóm I – Lên men đồng hình bắt buộc: Chúng được gọi là Thermobacterium, cófructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase. Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, thường phát triển ở 45oC. - Nhóm II – Lên men dị hình tùy nghi: Chúng được gọi là Streptobacterium (có FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid acetic. - Nhóm III - Lên men dị hình bắt buộc: Chúng được gọi là Betabacterium (có phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình. 16
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2: Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986) Đặc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Lên men pentose - + + Tạo CO2 từ glucose - - + a a Tạo CO2 từ - + + gluconate Sự hiện diện FDP + + aldolase Sự hiện diện +b + phosphoketolase Một vài đại diện L.acidophilus L.casei L.brevis L.delbrueckii L.curvatus L.buchneri L.halveticus L.plantarum L.fermentum L.salivarius L.sake L.reuteri a: Khi lên men b: Cảm ứng khi có pentose Trên thực tế, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Lactobacillus rất hữu ích trong việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clotridium difficile, cơ thể không phân giải được lactose, bệnh về da như: bang đỏ do sốt, chàm, viêm loát da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp.  Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic đồng hình: Lactobacillus acidophilus: trực khuẩn dài. Đây là loài ưa nhiệt, nhiệt độ tối thiểu cho sinh trưởng là 20oC và tối thích là 37 – 40oC. Trực khuẩn này được phân lập từ ruột trẻ em và bê mới đẻ. Lactobacillus bulgaricus: trực khuẩn tròn (đôi khi dạng hạt), thường kết thành chuỗi rất dài được tìm ra do Metchnikoff ở sữa chua Bungari. Có khả năng lên men được đường glucose, không lên men được đường saccharose. 17
Đồ án tốt nghiệp Đây là loài ưa nhiệt, nhiệt độ tối ưu cho chúng phát triển là 45 – 50oC, nhiệt độ tối thiểu là 15 – 20oC, có khả năng tạo acid rất cao (từ 2.5 – 3.7% acid lactic). Lactobacillus plantarum: trực khuẩn nhỏ, thường kết thành đôi hoặc chuỗi. Là loài ưu ấm, nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng là 30oC, tích tụ được khoảng 1.3% acid. Loại này tìm thấy chủ yếu trong rau muối chua và ủ chua thức ăn xanh dùng cho chăn nuôi. Flening (1969) đa kết luận rằng sự đóng góp quan trọng nhất của vi khuẩn này là việc tạo mùi vị cho sản phẩm lên men và sinh ra hàm lượng acid để bảo quản, ngăn cản những vi sinh vật không mong muốn có thể sinh ra mùi xấu cho sản phẩm.  Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic không đồng hình: Lactobacillus brevis: tìm thấy chủ yếu trong muối chua bắp cải, rau cải, dưa chuột, nên nó còn được gọi là "trực khuẩn bắp cải". Trong lên men, ngoài tạo thành acid lactic (1.2%) nó còn tạo thành acid acetic, rượu ethylic (2.4%) và CO2. Đồng thời tạo hương làm sản phẩm có hương vị dễ chịu. Lactobacillus pentoaceticus: là trực khuẩn, không sinh bào tử. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 30 – 35oC. Vi khuẩn này lên men một số đường như: glucose, fructose, galactose, mannose Lactobacterium lycopersici: Là trực khuẩn gram dương, sinh hơi, tế bào tạo thành chuỗi hay đơn, có khi tạo thành từng đôi một. khi lên men tạo thành rượu, acid latic, acid acetic và CO2, chúng có khả năng tạo bào tử. Tế bào sinh dưỡng thường chết ở 77 – 80oC. Lactobacterium – coli – aerogenes: là giống đại diện của lên men lactic dị hình. Có dạng hình que, không hình thành bào tử, nhiệt độ thích hợp cho phát trển là 35 – 38oC. Thường gặp loại này trong nước, trên bề mặt rau quả, trong ruột người và động vật, trong sữa chua, Sản phẩm của vi khuẩn này là acid lactic, acid acetic, acid succinic, rượu ethylic, CO2, H2O và indole. 18
Đồ án tốt nghiệp  Giống Streptococcus Phân loại khoa học Bảng 1.3 : Phân loại khoa học giống Streptococcus Giới : Vi khuẩn Nghành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Streptococcaceae Giống : Streptococcus Hình 1.4: Streptococcus Có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế bào 0.5 – 1µm Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn, là loại vi khuẩn không nha bào, Gram dương, không di đông, và thường không tạo sắc tố, vỏ tế bào của một số loài có thể nhận thấy trong điều kiện nhất định, có khả năng lên men nhiều loại đường như: glucose, lactose, maltose, Trong môi trường lỏng, sinh khối có thể có dạng nhám có dạng hạt và nổi trên mặt nước hoặc là dạng mịn gây đục môi trường. Trên môi trường agar, khuẩn lạc 19
Đồ án tốt nghiệp thường nhỏ hơn 1mm, trong cùng 1 loài có thể chuyển từ dạng nhám sang dạng min và tạo chấy nhầy, bề mặt khuẩn lạc lồi Sau khi lên men đường, sinh ra rất ít hoặc không sinh CO2 và có thể tạo ra một lượng đáng kể ethanol, acid acetic, acid formic khi lên men glucose trong môi trường có tính kiềm (Gunsalus và Niven, 1942). Không có khả năng chuyển nitrate thành nitrite, kị khí không bắt buộc, không sống được trong môi trường với 10% muối mật, những chủng phân hủy protein chỉ có trong nhóm enterococcus. Tất cả các chủng trong Streptococcus đều có nhu cầu dinh dưỡng rất phức tạp, một số loài có nhu cầu về vitamin B và các aminoacid trong khi số khác có nhu cầu về các acid béo không no và gia tăng lượng CO2 . Vì vậy nhu cầu về dinh dưỡng cũng giúp ích trong việc xác định một loài. (Dubos, 1948). Sự phân loại các loài thuộc Streptococcus (Sherman, 1937). Theo đó, chúng được chia ra thành 4 nhóm: Nhóm sinh mủ (pyogenic) viridans Enterococcus Nhóm lactic. Sự phân chia này dựa trên các đặc điểm sinh lý đặc trưng tương ứng với mỗi nhóm, đặc biệt là khoảng nhiệt độ phát triển. Tuy nhiên với các loài mới được công nhận làm cho đặc điểm mỗi nhóm trỏ nên ít khác biệt nhau vì chúng cùng lúc mang nhiều đặc điểm của hơn 1 nhóm. Ví dụ: Streptococcus tiberis Diernhofer thuộc nhóm viridans, nhưng nó lại mang những đặc mà ta có thể đặt nó vào nhóm Enterococcus. Trong khi Streptococcus acidominimus Ayers và Streptococcus Mudge cũng thuộc nhóm viridans, nhưng cũng có thể xem như thuộc nhóm pyogenic  Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic đồng hình: Steptococcus cremoris: thường tạo thành một chuỗi dài. Tế bào có kích thước 20
Đồ án tốt nghiệp 0.6 – 0.7µm, thường phát triển ở nhiệt độ thấp hơn. Streptococcus lactis. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 25 – 35oC, nhiệt độ tối đa là 35 – 38oC. Lên men glucose và galactose. Steptococcus lactis: cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn khi còn non, kết song đôi thành chuỗi ngắn. Đây là loại ưu ấm, nhiệt độ tối ưu 30 – 35oC, Nhiệt độ tối thiểu cho sự phát triển là 10oC và tối đa là 40 – 50oC. Trong môi trường chúng có khả năng tích tụ được khoảng 0.8 – 1% acid. Một số chủng tạo thành bacteriocin ở dạng nisin, là một hợp chất có tính kháng sinh được dùng trong bảo quản thực phẩm. Streptococcus thermophillus: hình cầu kết thành chuỗi dài, phát triển tốt nhất ở 40 – 45oC, trong quá trình lên men chúng có khả năng tích tụ được khoảng 1% acid.  Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic không đồng hình: Streptobacterium brassicae fermentati: thường thấy chúng có trong dịch lên men chua rau cải. Thường tồn tại tế bào đơn hoặc ghép thành từng đôi hoặc chuỗi ngắn và thường tạo thành chuỗi dài hình sợi. Đuôi tế bào thường uốn cong lại. Khi lên men rau cải chua tạo thành acid lactic, acid acetic và rượu (đến 2.4%) và CO2. Chúng lên men saccharose tốt hơn lactose.  Giống Leuconostoc Phân loại khoa học 21
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.4: Phân loại khoa học giống Leuconostoc Giới : Vi khuẩn Nghành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Leuconostocaceae Giống : Leuconostoc Hình 1.5: Leuconostoc Đặc điểm: ( Van Tieghem, 1878), (Orla-Jensen, 1919), (Hucker và Pederson, 1930). Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan đơn lẻ, cặp đôi đường kính từ 0.5 – 0.8µm và chiều dài khoảng 1.6µm.Trong môi trường nhất định như nước trái cây hoặc rau quả có tính acid, tế bào có thể kéo dài thành dạng nhọn hay dạng que., chiều dài khoảng 1 - 3µm. Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung. Trong số đó, Leuconostoc mensenteroides cùng với một số vi khuẩn lactic đồng hình khác như Lactobacillus plantarum tham gia vào việc chế biến rau muối chua. Một số loài tạo chất nhờn đặc trưng khi sống trong môi trường chứa 22
Đồ án tốt nghiệp sucrose. Đối với môi trường bình thường, sự tăng trưởng được kích thích nhờ việc bổ sung cao nấm men, nước chiết cà chua hoặc rau củ. Leuconostoc là một loài kỵ khí không bắt buộc. Khi lên men tạo ra một lượng hạn chế acid lactic. Luôn tạo L- lactic acid nhưng đôi khi cũng tạo D-lactic acid. Acid acetic và rượu cũng được tạo thành và khoảng lượng glucose lên men được chuyển thành CO2. Không làm đông tụ sữa, chuyển hóa fructose thành mannitol, được tìm thấy trong lên men sữa và rau quả, ví dụ như : Leuconostoc mesenteraides (Cienkowski) Van Tieghem.  Giống Pediococcus Phân loại khoa học Bảng 1.5: Phân loại khoa học giống Pediococcus Giới : Vi khuẩn Nghành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Lactobacillaceae Giống : Pediococcus 23
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6: Pediococcus Gồm các loài nhƣ: P. acidilactici, P. cellicola, P. claussenii, P. damnosus, P. ethanolidurans, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus, P. stilesii Đặc điểm: ( Balcke, 1884) Pediococcus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn, có khi đơn lẻ hoặc dạng chuỗi ngắn. Có hoạt tính thủy phân protein rất yếu, Gram dương, không di động, âm tính với catalase. Khoảng nhiệt độ tối ưu là 25 – 32oC, chúng là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí. Quá trình trao đổi chất của nó là quá trình lên men đồng hình.Chúng là những vi khuẩn yếm khí tùy nghi, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí. Chúng không có khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite, khả năng phân hủy protein kém cũng không có khả năng sinh tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển của cơ thể vì vậy chủng này yêu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ môi trường . Các loài Pediococcus khác nhau về tính chịu nhiệt, chịu acid và chịu NaCl. Loài điển hình là Pediococcus cerevisiae (Balcke,1884) 1.2.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 1.2.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 24
Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Để sinh trưởng bình thường chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ, các chất sinh trưởng  Nhu cầu dinh dưỡng carbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrate carbon từ các monosaccaride (glucose, fructose, manose), các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn carbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,  Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.  Nhu cầu về vitamin Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men  Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác 25
Đồ án tốt nghiệp Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các baz nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic. Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetate để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.  Nhu cầu các muối vô cơ khác Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào.  Nhu cầu dinh dưỡng oxi Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí (microaerophile), sinh trưởng trên bề mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí. (Wood B.J.B and Holzapfel W.H. 1995). Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP. Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn. 1.2.2.2. Qúa trình trao đổi chất 26
Đồ án tốt nghiệp Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic. Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên men carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học khác và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường). LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose ), disaccharide (lactose, saccharose ); pentose (arabinose, xylose, ribose ) và các hợp chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau. Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (hình 1.7).  Lên men lactic đồng hình Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di- acetiyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men: C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J Con đường Glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-Parnas pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo thành pyruvate. Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình. 27
Đồ án tốt nghiệp  Lên men lactic dị hình Một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, con đường pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose monophosphate, con đường 6- phosphogluconate và được gọi chung là 6-phosphogluconate/phosphoketolase (6- PG/PK). Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo 6- phosphogluconate. Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate. GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic. Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde. Khi quá trình này ngoài sản phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol, acid acetic, acid succinic thì nó được gọi là lên men lactic dị hình. Phương trình chung biển diễn quá trình lên men: C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2 Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic và acid acetic 10% các loại khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic. Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn so với lên men lactic đồng hình. Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị hình. Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK. Tuy nhiên nó không phải dúng cho tất cả các trường hợp (Owen R. Fennema et al. 2004). Chú thích hình 1.7 (A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis,, EMB) (B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase) 28
Đồ án tốt nghiệp Các enzyme tham gia vào quá trình : 1. Glucokinase; 2. Fructose-1,6-diphosphate aldolase; 3. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4. Pyruvate kinase; 5. Lactate dehydrogenase; 6. Glucose-6-phosphate dehygrogenase; 7. 6-phosphogluconate dehydrogenase; 8. Phosphoketolase; 9. Acetaldehyde dehydrogenase; 10. Alcohol dehydrogenase. 29
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7: Con đường lên men Glucose 30
Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.  Thành phần môi trường nuôi cấy Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men.  Yếu tố môi trường Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh enzyme của tế bào vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40oC. Một số có thể sinh trưởng dưới 15oC và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 5oC (Wood B.J.B and Holzapfel W.H, 1995). 31
Đồ án tốt nghiệp Ảnh hưởng của pH Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH môi trường giảm, và khi nó giảm tới mức nào đó nó sẽ ức chế chính sự phát triển của vi khuẩn lactic. Do đó, cần phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình nuôi. Để lên men nhanh và trọn vẹn, phạm vi pH tối ưu phải nầm giữa 5.5 và 6.0. Ảnh hưởng của nồng độ acid Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người ta cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3. Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men. 1.2.3. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập 1.2.3.1.Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển (Owen R. Fennema et al. 2004) Ban đầu “vi khuẩn lactic” được dùng để chỉ các vi khuẩn làm sữa chua và sau đó một dạng vi khuẩn thuần khiết cũng được cho là vi khuẩn lactic (có thể là Lactococcus lactis) được đưa ra bởi J. Lister vào năm 1873. Một bước quan trọng trong phân loại vi khuẩn lactic được hình thành khi có sự giống nhau giữa các vi khuẩn trong sữa chua và các vi khuẩn tạo acid lactic khác có trong các nguồn khác nhau. Tuy nhiên vẫn còn nhiều nhầm lẫn khi chuyên khảo của Orla-Jensen xuất hiện (Orla-Jensen, 1919) và nó có ảnh hưởng lớn đến hệ thống phân loại của LAB, mặc dù đã có sự sửa đổi dáng kể nhưng cơ sở cho việc phân loại vẫn không thay đổi, Orla-Jensen vẫn phân 32
Đồ án tốt nghiệp loại dựa trên phương pháp cổ điển như : so sánh hình thái vi khuẩn (cocci, rod hoặc dạng tetrad), hình thức lên men glucose ( đồng hình, dị hình), khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau (10oC và 45oC), khả năng lên men các nguồn đường khác nhau. Năm 1985 có thêm nhiều giống LAB mới được mô tả, tuy nhiên việc phân tích theo phương pháp cổ điển dựa vào hình thái vi khuẩn vẫn giữ vai trò quan trọng trong phân loại LAB. Các giống LAB cũng đã được mô tả lại trong Bergey’s manual 1986, đây được xem như là phiên bản cuối cùng và chủ yếu tiếp tục phản ánh kết quả của Orla-Jensen 1919. Trong đó có sự phù hợp với các mô tả chung của các giống LAB điển hình: Aerococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus. Sự thay đổi chính trong Bergey’s manual 1986 là giống Streptococcus lần đầu tiên được chia thành 3 nhóm : Enterococcus, Lactococcus và Streptococcus sensu stricto (Schleifer. 1987). Một vài giống LAB giống với Lactococci được đề nghị xếp vào giống Vagococcus, các giống Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus không có thay đổi nhiều, tuy nhiên một vài loài trong Lactobacills được xếp vào giống Carnobacterium, và loài Pediococcus halophilus được đưa lên cấp giống là Tetragenococcus, một số LAB lên men dị hình trong Lactobacillus và Leuconostoc được xếp vào giống Weissella, ngoài ra một số giống mới cũng được mô tả có liên quan nhiều đến LAB như Alloiococcus, Dolosicoccus, Dolosigranulum, Eremococcus, Facklamia, Globicatella, Helcococcus, Ignavigranum và Lactosphaera Bản sửa đổi được thực hiện vào năm 1986 cũng đã hỗ trợ nhiều trong việc phân loại vi sinh vật dựa trên thành phần hóa học và di truyền. 1.2.3.2. Sự phân loại LAB đến cấp giống (Owen R. Fennema et al. 2004) Như đã đề cập, cơ sở chung cho việc phân loại LAB vào các giống khác nhau chủ bằng phương pháp định danh cổ điển và so sánh với khóa phân loại của Bergey’s manual1986, tuy nhiên việc này ngày càng gặp khó khăn để đạt kết quả tin cậy khi phân loại một số giống mới nhưng nó lại là bước quan trọng trước khi tiến hành các phân tích sâu hơn. 33
Đồ án tốt nghiệp LAB được phân chia theo hình thái như sau : dạng trực khuẩn (rod) gồm Lactobacillus và Carnobacterium; dạng cầu khuẩn gồm tất cả các giống còn lại và một ngoại lệ là đối với giống Weissella được mô tả gồm cả dạng trực khuẩn và cầu khuẩn; thêm vào đó, sự phân chia tế bào theo hai hướng vuông góc trên cùng một mặt phẳng dẫn đến sự hình thành dạng tứ cầu khuẩn (tetrad) và nó cũng được sử dụng để mô tả một dạng khác của cầu khuẩn, bao gồm các giống Aerococcus, Pediococcus và Tetragenococcus. Phân chia theo hình thức lên men glucose, LAB được chia vào 2 nhóm: lên men đồng hình chuyển hóa glucose chủ yếu thành acid lactic và lên men dị hình tạo acid lactic, ethanol, acid acetic và CO2. trong thực nghiệm, kiểm tra sự sinh khí CO2 để phân biệt giữa 2 nhóm (Sharpe. 1979). Leuconostoc, Oenococci, Weissella và phân nhóm của Lactobacilli là lên men dị hình, tất cả các LAB khác là lên men đồng hình. Sự phát triển ở các nhiệt độ khác nhau cũng gióp phần phân biệt một số giống thuộc cầu khuẩn: Enterococci phát triển ở 10oC và 45oC, Lactococci và Vagococci phát triển được ở 10oC nhưng không thể sống ở 45oC, Streptococci thường không phát triển ở 10oC trong khi lại có thể phát triển ở 45oC tùy vào loài. Sự chịu muối (6,5% NaCl) cũng được sử dụng để phân biệt giữa Enterococci và Lactococci; Vagococci và Streptococci (Mundt. 1986). Đặc biệt khả năng chịu muối (18% NaCl) được giới hạn trong Tetragenococcus. Khả năng chịu acid ơ kiềm cũng rất hữu ích trong việc phân loại. Aerococci, Carnobacteria, Enterococci, Tetragenococci và Vagococcicos thể phát triển ở pH cao những không phát triển ở pH=9.6. Ngoài ra sự hình thành các dạng đồng phân của acid lactic trong quá trình len men glucose cũng được sử dụng trong phân biệt giữa Leuconostocs (chỉ tạo D-lactic acid) và Lactobacilli lên men dị hình (tạo acid lactic cả 2 dạng D và L). Tuy nhiên Weissella có thể gây nhầm lẫn trong vấn đề này.  Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái: Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến). 34
Đồ án tốt nghiệp Kiểm tra khả năng di động: Nhuộm tiên mao, phương pháp kiểm tra trên môi trường thạch mềm. Nhuộm bào tử: Nhuộm Lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton) Nhuộm Carbolic Fuchsin. Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): Phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo, Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet) Nhuộm thành tế bào Nhuộm hạt dị nhiễm Nhuộm hạt PHB (Poly-β-hydroxybutyric acid) Nhuộm tinh thể protein (ở Bacillus thuringiensis) Nhuộm vi khuẩn kháng acid  Các phương pháp dựa trên điều kiện nuôi cấy và đặc điểm sinh lý: Hình thái khuẩn lạc Nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt, chịu acid, chịu muối mật Nhu cầu oxygen.  Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa: Tùy thuộc vào nguồn phân lập mà ta định hướng cho các phản ứng sinh hóa định danh cho phù hợp như: Khả năng đồng hóa các nguồn carbon, Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ, khả năng sinh sắc tố huỳnh quang, tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn, đồng hóa Malonat, xét nghiệm đồng hóa Citrat, nhu cầu muối và tính chịu muối, khả năng đồng hóa tartrat, khả năng sinh trưởng với KCN, xét nghiệm oxidaza, xét nghiệm catalase, khả năng lên men/ôxy hóa amygdalin, arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, sorbitoi, phản ứng M.R. (Đỏ Methyl - Methyl Red), phản ứng V.P. (Voges-Proskauer), phản ứng ONPG-aza. Ngoài ra còn một số dựa trên phản ứng sinh hóa chuyên biệt hơn như: API20E KIT 35
Đồ án tốt nghiệp Nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Nói chung hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trường hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả. Phân biệt bằng thực khuẩn thể: Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ. Phân biệt theo Typ huyết thanh: Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại. 36
Đồ án tốt nghiệp Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin): Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin. 1.2.3.3. Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu như các phương pháp truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật. Nói chung các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu là: Phân tích acid nucleic. Phân tích protein. Phân tích polysaccharid. Hóa phân loại học. Việc phân loại LAB như đã mô tả trong mục 1.2.3 chủ yếu dựa trên hình thái và đặc điểm sinh lý, sinh hóa . Tuy nhiên trong thực nghiệm, các đặc điểm này không đủ để định danh chính xác một chủng đến cấp loài cụ thể. Ngày nay với công nghệ xác định trình tự DNA một các tự động và nhanh chóng, người ta đã trực tiếp xác định được trình tự của gen mã hóa cho 16S rRNA và tạo phương tiện dễ dàng cho phân loại vi khuẩn. (Owen R. Fennema et al. 2004) Việc xác định trình tự của gen 16S rRNA để phân tích sự phát sinh loài của LAB đã được thự hiện vào những năm 1990, bắt đầu từ sự phát triển các đầu dò DNA để định danh vi khuẩn. Việc phân loại LAB bằng các đầu dò 16S hoặc 23S RNA đã được phát triển và sử dụng đối với Lactococci, Enterococci, Lactobacilli, Carnobacteria và phân biệt Vagococci với các LAB khác . Dữ liệu về trình tự các gen 16S rRNA của 37
Đồ án tốt nghiệp LAB đã được tích lũy trong suốt nhiều năm qua và danh mục các đầu dò hiện có được đưa ra bởi Pot et al. 1.2.4. Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic 1.2.4.1. Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic  Các enzyme tiêu hóa Các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp một sốt lượng lớn các enzyme ngoại bào kích thước hệ thống tiêu hóa như: tổng hợp enzyme amylase, protease, lipase, glycolase và lactic dehydrogenase. Proteolysis (khả năng phân giải protein): Vi sinh vật tổng hợp protease giúp phân hủy protein thành những hợp chất đơn giản có thể tiêu hóa được.Hoạt tính này của Lactobacilli trong đường ruột giúp phân hủy protein và vật chủ có thể tiêu thụ dễ dàng. Lipolysis: Vi sinh vật tổng hợp lipase giúp phân hủy các chất béo phức tạp thành những hợp chất đơn giản. Điều này có thể hữu ích trong việc tạo ra các khẩu phần ăn dinh dưỡng và hợp lý cho trẻ em, người già và người đang dưỡng bệnh. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh rằng Lactobacilli có thể phân hủy cholesterol. Biến dưỡng lactose: Vi khuẩn sinh acid lactic có enzyme b-galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase có thể sản sinh acid lactic từ lactose. Acid lactic có những lợi ích như sau: Chữa trị bệnh không dung nạp lactose do thiếu các enzyme biến dưỡng enzyme. Tăng cường khả năng tiêu hóa protein trong sữa bằng việc làm đông tụ sữa. Tăng cường việc sử dụng canxi, phospho, sắt. Kích thích sự bài tiết. Kích thích sự tiêu hóa trong dạ dày. Bảo tồn nguồn năng lượng trong quá trình hô hấp. 38
Đồ án tốt nghiệp  Các vitamin và các chất trao đổi có lợi cho sự tăng trưởng Vitamin: Vi sinh vật dùng làm probiotics đóng vai trò nổi bật trong ruột bằng việc tổng hợp vitamin: vitamin B, acid folic, biotin (vitamin H), vitamin K. Khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn Bacteriocin: Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất. Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn gram âm hoặc gram dương. Bacteriocin khác biệt với kháng sinh ở những điểm chủ yếu sau: Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome. Tế bào chủ miễn dịch với chúng. Phổ kháng khuẩn hẹp, vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất. Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong đó LAB (lactic acid bacteria) được quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm và vì tính an toàn của chúng. Bacteriocin được sản xuất bởi LAB được chia thành 4 lớp: Lớp I: (Lantibiotic) là những phân tử peptide nhỏ ( 30kDa) và bền nhiệt, lớp này gồm những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của 39
Đồ án tốt nghiệp bacteriocin. Bacteriocin lớp III được thu nhận từ một số giống Lactobacillus. Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành phần lipid và carbohydrate. Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng như chức năng của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào thuộc lớp này được tinh sạch.  Các chất khác có khả năng kháng bệnh Vi khuẩn sinh acid lactic cũng có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh thông qua một số các sản phẩm biến dưỡng khác như: hydrogen peroxide, carbon dioxide và diacetyl. Quá trình biến dưỡng của vi khuẩn sinh acid lactic có ảnh hưởng đến khả năng kháng lại các vi sinh vật có hại và các dạng hoạt động khác của chúng. 1.2.4.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. Khi ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007). Vi khuẩn lactic còn sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học. Ngoài ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính kháng nấm như reuretin, acid lactic, 1.2.5. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic 40
Đồ án tốt nghiệp Khả năng đối kháng của các vi khuẩn lactic liên quan đến sự ức chế của các vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995). Khả năng kháng nấm và các thành phần ức chế đã được tìm thấy và công nhận trong nhiều nghiên cứu. Các vi khuẩn lactic (LAB) có thể sản xuất một số chất kháng sinh như acid lactic và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm. LAB đã được biết đến trong nhiều năm và đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men. Lợi ích sức khỏe của LAB được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường tiêu hóa của con người (Cogan và cộng sự năm 1995, Hafidh và cộng sự, 2010). Giống Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt động kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và Schnurer, 2001). Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như L.Plantarum và L.Sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998; Lavermicocca và cộng sự, 2003.). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic (Gardiner và cộng sự, 2000; Corcoran và cộng sự, 2004.). Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của LAB đã xác định được một số hợp chất có tác dụng ức chế chống lại nấm mốc và các loài nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.6).; Lavermicocca và cộng sự, 2000;.NikuPaavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003.Sjogren, 2005). 41
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.6. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) Hợp chất đƣợc xác định Nguồn sản xuất giống 4-hydroxy-phenyllacticacid 3- Lactobacillusphantar 21B phenyllacticacid 3 –hydroxydecanoicacid 3- Lactobacillusphantarum MILAB14 hydroxydodecanoicacid 3 – hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5- cis-dodecenoicacid Cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin Lactobacillusphantarum VTTE-78076 mevalonolactone Caproic-,propionic-,buturie-,acetic- Lactibacillus sanfranciscensis CB1 ,formic- and n-valeric acid. Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996). Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất. Các chủng kháng nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua (Corsetti và cộng sự, 1996), xúc xích (Coloretti và cộng sự, 2007), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phô mai và sữa (Roy và cộng sự, 1996) và rau (Sathe và cộng sự, 2007). 42
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.7. Phân lập vi khuẩn lactic với khả năng ức chế độc tố sinh trưởng của nấm mốc và nấm men 43
Đồ án tốt nghiệp Corsetti và cộng sự báo cáo về tác dụng ức chế nấm của LAB khác được phân lập từ bột nhào chua là Lactobacillus sanfranciscensis CB1 (Corsetti và cộng sự , 1998). Họ phát hiện ra một hỗn hợp của acid hữu cơ là bổ trợ về tác dụng ức chế của dòng này (acetic , caproic , formic , propionic, butyric và acid n- valeric), trong đó acid caproic dường như quan trọng nhất. Tất cả các chất này được xác định là những hợp chất có phân tử lượng thấp, nhưng cũng có những báo cáo của các hợp chất protein không xác định với hoạt động kháng nấm rộng (Gourama và Bullerman ,1997; Magnusson và Schnurer , 2001). Một peptide giống như bacteriocin có hiệu lực kìm nấm Candida albicans đã được báo cáo bởi Okkers và cộng sự.(Okkers và cộng sự , 1999). Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính acid và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl, (Bảng 1.8) Bảng 1.8. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh. (Holzapfel và cộng sự, 1995) Sản phẩm Các sinh vật chính Vi khuẩn gram âm, 1 vài loài Acid lactic nấm Acid hữu cơ Nấm men, nấm, vi khẩun gây Acid acetic thối rữa Sinh vật gây bệnh đặc biệt H2O2 trong thức ăn giàu protein Vi khuẩn gây bệnh (sữa và Hệ thống lactoperosidase với H2O2 Enzyme các sản phẩm làm từ sữa) Isozyme Vi khuẩn gram dương 44
Đồ án tốt nghiệp Reuterin(3-OH-propionaldehyde) Nấm mốc, nấm men Diacetyl Vi khuẩn gram âm Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau 1 vài loại vi khuẩn lactic, vi nisin khuẩn gram dương, các thế Bacteriocin nội bào tử 1 số loại khác Vi khuẩn gram dương Ngoài sự ức chế tăng trưởng thực tế của nấm, LAB cũng có thể ức chế sản phẩm đặc biệt của độc tố nấm mốc (Gourama và Bullerman, 1997) hoặc làm bất động độc tố thông qua liên kết với bề mặt của chúng (El-Nezami và cộng sự, 2004).  Các hợp chất kháng nấm và phƣơng thức hoạt động Chất ức chế tăng trưởng nấm có tầm quan trọng cả trong việc kiểm soát tác nhân gây bệnh của con người và động vật, và trong công tác phòng chống nấm mọc trong thực phẩm và các vật liệu khác. Các phương thức hoạt động của kháng sinh chống nấm hiện nay là rất quan trọng cho sự ức chế nấm. Nhiều chất trong số các chất này được dành riêng cho sử dụng lâm sàng nhưng một số đang được sử dụng trong sự kiểm soát của nấm gây bệnh thực vật. Thuốc kháng sinh được xác định là chất được sản xuất bởi các vi sinh vật có tác dụng diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác ở nồng độ thấp. 45
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TP HCM. 2.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ ngày đến ngày 2.3. Vật liệu 2.3.1. Thiết bị và dụng cụ Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA) Máy đo pH Horiba (Nhật Bản) Autoclave (Memmmert – Đức) Kính hiển vi quang học Olympus – Nhật Bản Cân phân tích, cân kỹ thuật Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmmert – Đức), tủ sấy (Memmmert – Đức) Pipetman 100 – 1000 µl Bếp điện Bông thấm nước, bông không thấm nước Giấy lọc, lame, lamell Các dụng cụ thí nghiệm: becher, erlen, que cấy, đèn cồn, bình định mức, ống đong, pipet, crucible, 2.3.2. Hóa chất Các hóa chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm: Tím kết tinh (Crystal violet) Ethanol 95% Ammonoxalat 46
Đồ án tốt nghiệp Iod KI Thuốc nhuộm Fushin Malachite green Methylene blue Ethanol KOH Dung dịch Acid Carbonic H2CO3 Dung dịch Acid tannic FeCl3 Formalin NaOH AgNO3 NH4OH H2O2 Dung dịch Tetramethy-p-phenylene diamine dihydrochloride Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS Broth. Đây là môi trường tổng hợp đặc hiệu cho việc nuôi cấy vi khuẩn lactic, tên đầy đủ là: de Man, Rogosa and Sharpe (Robinson, 2007) Peptone 10g Glucose 20g Cao thịt 5g Cao nấm men 5g Natri acetate 2g Diamoni citrate 2g Tween 80 1ml 47
Đồ án tốt nghiệp MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.4H2O 0.2g K2HPO4 2g Nước cất 1000ml Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC Khử trùng ở 121 oC trong 15 phút Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS Agar (de Man, Rogosa and Sharpe (Robinson, 2007)) Peptone 10g Glucose 20g Cao thịt 5g Cao nấm men 5g Natri acetate 2g Diamoni citrate 2g Tween 80 1ml MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.4H2O 0.2g K2HPO4 2g Agar 20g Nước cất 1000ml Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC Khử trùng ở 121oC trong 15 phút Môi trường PDA Khoai tây 200g Glucose 20g Agar 20g 48
Đồ án tốt nghiệp Nước cất 1000ml Điều chỉnh pH = 7 tại 25oC Môi trường PCA (Plate Count Agar) Casein enzymic hydrolysate 5g Yeast extract 2.5g Dextrose 1g Agar 15g Nước cất 1000ml Điều chỉnh pH = 7.0±0.2 tại 25°C Môi trường VRB (Violet Red Bile Agar) Peptic digest of animal tissue 7g Yeast extract 3g Sodium chloride 5g Bile salts mixture 1g Lactose 10g Neutral red 0.03g Crystal violet 0.002g Agar 15g Điều chỉnh pH = 7.4±0.2 tại 25°C Môi trường EC Broth Casein enzymic hydrolysate 20g Lactose 5g Bile salts mixture 1.5g Dipotassium phosphate 4g Monopotassium phosphate 1.5g Sodium chloride 5g 49
Đồ án tốt nghiệp Điều chỉnh pH = 6.9±0.2 tại 25°C Thuốc thử Uffelmann: Cho 2% dung dịch phenol tinh chất vào trong nước rồi thêm dung dịch FeCl3 cho tới khi dung dịch phenol chuyển thành màu tím. 2.3.3. Giống nấm Các loại nấm ĐN3, ĐN2, CĐP1, CĐP2, HCP2 do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TP.HCM cung cấp. Nhóm nấm phân lập từ đậu nành: ĐN3, ĐN2 Nhóm nấm phân lập từ đậu phộng: CĐP1, CĐP2 Nhóm nấm phân lập từ cà phê: HCP2 2.4. Phƣơng pháp luận Để đạt được mục tiêu đặt ra tôi chọn các nguồn vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống chứa vi khuẩn sống phân lập ra các chủng vi khuẩn lactic và thông qua các kiểm tra sinh lý, sinh hóa, so sánh với khóa phân loại của Bergey để phân loại, định danh chúng đến cấp giống. Theo tiêu chí an toàn sinh học là trên hết, cho nên đề tài chủ yếu tiến hành phân lập các vi khuẩn lên men lactic (LAB) vì chúng được xếp vào loại GRAS (generally recognized as safe). Để phân lập trước hết cần chọn các nguồn vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống như nem, các loại sữa chua, dưa cải muối chua và các nguồn đã được nghiên cứu là có chứa hệ vi sinh vật đường ruột để phân lập ra các chủng vi khuẩn lactic và phân lập bằng phương pháp phân lập giống thuần khiết phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh. Việc định danh LAB chủ yếu dựa vào các phương pháp cổ điển (hình thái, cấu trúc, sinh hóa ) theo Bergey’s Manual (Benson Lab Manual, 2001) cùng với việc kiểm tra khả năng lên men các loại đường khác nhau và so sánh với khóa phân loại của Bergey để phân loại, định danh chúng đến cấp giống. 50
Đồ án tốt nghiệp Chọn môi trường sử dụng trong suốt quá trình phân lập là môi trường MRS có bổ sung thêm 0.02% natri azide (NaN3) do chất này gây ức chế quá trình hô hấp cho nên loại bỏ được các vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, làm tăng tính chọn lọc của môi trường dối với LAB và giúp loại bỏ phần lớn các vi khuẩn gây bệnh. Mục tiêu của đề tài này là phân lập vi khuẩn lactic có khả năng kháng nấm. Vì vậy để xác định những chủng đã phân lập có mang hoạt tính này hay không ta tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm của chúng bằng cách cho chúng đối kháng trực tiếp với nấm bằng phương pháp đục lỗ thạch. Nếu xác định được các chủng phân lập được sinh nhiều acid lactic và có tính kháng nấm cao thì đã đạt được mục tiêu của đề tài. 51
Đồ án tốt nghiệp Cơm mẻ Nem chua Tăng sinh trong MRS Broth MRS bổ sung 0.02% NaN3 để loại vi khuẩn hiếu khí bắt Cấy truyền sang MRS Agar buộc Phân lập giống thuần khiết Quan sát hình thái khuẩn lạc Thử nghiệm Catalase Loại bỏ vi khuẩn dương tính với H2O2 Nhuộm Gram Loại bỏ vi khuẩn Gram âm Quan sát hình thái tế bào Nhuộm bào tử Loại vi khuẩn sinh bào tử Định tính acid lactic Sinh acid Kháng nấm Nuôi cấy trong MRS Broth Phương pháp khuếch tán Xác định %Acid tổng - Kiểm tra khả năng di động. - Khả năng lên men đường (Glucose, Lactose, Saccharose, Xylose) Chủng chọn lọc 52 Hình 2.1: Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic
Đồ án tốt nghiệp 2.5. Phƣơng pháp thí nghiệm 2.5.1. Thu thập mẫu Mẫu là những sản phẩm lên men truyền thống có chứa vi sinh vật sống được dùng làm nguồn phân lập vi khuẩn lactic gồm: cơm mẻ, nem chua. Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập Sản phẩm Kí hiệu các nguồn phân lập Cơm mẻ C Nem chua N 2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 2.5.2.1. Tăng sinh Mục đích: Làm cho các vi khuẩn có trong mẫu phát triển lại bình thường do chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản mẫu. Trong đó các vi khuẩn lactic có khả năng phát triển nhiều hơn vì ta đã sử dụng môi trường chọn lọc đối với vi khuẩn lactic. Đồng thời đây cũng là bước đầu giúp ta thu được lượng sinh khối để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Tiến hành: Môi trường dùng để tăng sinh là môi trường MRS Broth có bổ sung o 0.02% NaN3, hút 10ml cho vào mỗi ống nghiệm đem hấp khử trùng ở 121 C trong 15 phút. Với các mẫu là dạng rắn như: cơm mẻ, nem chua, dưa cải chua: Nghiền nhỏ 2g rồi cho vào ống nghiệm chứa MRS Broth. Quấn màng PVC (màng bọc thực phẩm) quanh nắp ống nghiệm cho kín rồi đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. 2.5.2.2. Phân lập Mục đích: Tách các khuẩn lạc rời rạc khác nhau, giúp chọn lựa được các chủng vi khuẩn đồng nhất. Tiến hành: 53
Đồ án tốt nghiệp Các mẫu sau khi tăng sinh đem pha loãng tới độ pha loãng là 10-9. Sử dụng môi trường phân lập là môi trường MRS bổ sung 20% agar. Các mẫu sau khi tăng sinh sẽ được đem pha loãng bằng nước muối vô trùng, mỗi ống chứa 9ml. + Hút 1 ml mẫu vào ống nước cất vô trùng thứ nhất có độ pha loãng 10-1. + Hút 1 ml hỗn hợp nước cất và mẫu ở ống thứ nhất cho vào ống thứ hai có độ pha loãng 10-2. + Hút 1ml hỗn hợp ở ống thứ hai vào ống thứ ba có độ pha loãng10-3 - Tiếp tục thao tác tương tự để có độ pha loãng là 10-9 Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu Lấy các ống nghiệm có độ pha loãng từ 10-5 ÷ 10-9, mỗi ống lấy 0,1ml cho lên bề mặt thạch chứa trong đĩa petri. Tương ứng với mỗi độ pha loãng sẽ thực hiện trên hai đĩa petri. Dùng que trang, trang điều canh trường với điều kiện không làm rách bề mặt thạch và trang thật đều nhằm tách khuẩn lạc riêng lẻ. Ghi độ pha loãng tương ứng lên nắp đĩa petri và dùng giấy báo gói các hộp, đưa vào nuôi trong tủ ấm ở 37oC,sau 24 giờ, các khuẩn lạc riêng lẻ vào các ống thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn. Nuôi vi 54
Đồ án tốt nghiệp khuẩn đã được cấy chuyền sang ống thạch nghiêng trong tủ ấm ở nhiệt độ 35 – 37oC, thời gian từ 24 giờ, bảo quản ống giống ở nhiệt độ 4oC. 2.5.3. Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic. 2.5.3.1. Nhuộm Gram Mục đích: Giúp ta phân loại được 2 nhóm lớn: Vi khuẩn Gram dương (Gram- positive) bắt màu tím và Vi khuẩn Gram âm (Gram-negative) bắt màu hồng. Ngoài ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống. Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến - Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. - Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. - Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 30 giây, rửa nước, để khô trong không khí. - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x. Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ. 2.5.3.2. Nhuộm bào tử Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid). Đầu tiên xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và acid. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu hồng. 55
Đồ án tốt nghiệp Các vi khuẩn Gram dương thu được từ bước trên được tiếp tục kiểm tra khả năng sinh bào tử. Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già để nhuộm bào tử. Từ kết quả thu được ta loại bỏ các chủng có bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương không sinh bào tử. Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton - Nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 – 7 ngày. - Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram. - Nhuộm bằng dung dịch malachite green trong 10 phút, rửa nước. - Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô. - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ. Chú ý: phân biệt bào tử với các hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục 2.5.3.3. Thử nghiệm Catalase Mục đích: Kiểm tra khả năng phân hủy H2O2 tạo ra O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh enzyme catalase. Các chủng vi khuẩn thu được sau bước nhuộm acid được tiến hành thử nghiệm Catalase. Trong thí nghiệm này, chỉ có những chủng vi khuẩn cho catalase âm tính là có khả năng là vi khuẩn lactic. Tiến hành: - Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính. - Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính. Kết quả: Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính. Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự. 2.5.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid 56
Đồ án tốt nghiệp Mục đích: Kiểm tra khả năng sinh acid của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất của chúng. Trong thí nghiệm này các chủng cho catalase âm tính thu được từ các bước trên sẽ được kiểm tra với thuốc thử Uffelmann. Các chủng phân lập là vi khuẩn lactic khi chúng tạo acid lactic và làm đổi màu thuốc thử từ màu tím chuyển sang màu vàng nhạt. Tiến hành: dùng phương pháp sử dụng thuốc thử Uffelmann Nhỏ vài giọt dung dịch thuốc thử Uffelmann có màu tím lên khuẩn lạc trên đĩa thạch. - Nếu có acid chloryhric, sẽ làm mất màu dung dịch. - Nếu có acid lactic, dung dịch sẽ chuyển ra màu vàng. 2.5.3.5. Thử nghiệm khả năng di động Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch mềm 0,5 – 0,7% agar. Vì vi khuẩn lactic không có khả năng di động, chỉ mọc theo đường cấy thẳng đứng trong ống chứa môi trường thạch mềm và không làm đục môi trường xung quanh nên trong thử nghiệm này, ta loại bỏ được các vi khuẩn di động không phải là vi khuẩn lactic, chúng sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. Tiến hành: - Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường thạch bán lỏng. - Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1-3 ngày, có khi lâu hơn. Kết quả: Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động. Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động 2.5.3.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí 57
Đồ án tốt nghiệp Mục đích: kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào. Các loại đường được sử dụng là: glucose, lactose, saccharose, maltose và xylose. Kết quả từ thí nghiệm này giúp ta định danh đến cấp giống các chủng vi khuẩn lactic phân lập được dựa theo khóa phân loại của Bergey Tiến hành: Môi trường MRS broth với lượng đường glucose lần lựơc thay thế bằng các loại đường cần kiểm tra. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 10ml Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 1210C. Đường xylose, và các đường kép cần khử trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ sung vào môi trường. Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 37 0C, theo dõi hiện tượng sinh acid sau 1-3 ngày. Trường hợp dùng nút bông cần quấn bằng màng PVC (màng bọc thực phẩm) để bịt kín miệng ống nghiệm. Kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh acid) chất chỉ thị Phenol red sẽ chuyển màu vàng. Nếu có bọt khí bên trong ống durham thì chủng vi khuẩn đó lên men có sinh khí Đối với những ống nghiệm không có bọt khí trong ống durham thì ta cần kiểm tra lại bằng cách đốt đỏ que cấy và đặt sát bề mặt môi trường, nếu thấy có bọt khí nổi lên thì chủng vi khuẩn đó cũng lên men có sinh khí. 2.6. Xác định hàm lƣợng acid tổng Mục đích: Xác định hàm lượng acid tổng bằng phương pháp quy về acid lactic để xác định hàm lượng acid lactic sinh ra từ các chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm nhằm chọn ra chủng vi khuẩn lactic mạnh nhất để kháng nấm. Hàm lượng acid trong 58
Đồ án tốt nghiệp dịch lên men có thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử Phenolphatalein. Tiến hành:Định lượng acid lactic bằng dung dịch NaOH 0.1N với chất chỉ thị Phenolphtalein 1% . Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên men vi khuẩn, thêm 2 giọt Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Sử dụng máy đo pH để chuẩn độ đến khi pH đạt 8.0 và ghi nhận kết quả. Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic theo công thức: % A 푖d 푙ac푡푖 = Trong đó: VNaOH: Thể tích NaOH 0.1 N chuẩn độ được 10: Số ml dịch Dx được đem đi chuẩn độ 0.1: Nồng độ NaOH dùng để chuẩn độ 1000: Hệ số chuyển đổi ra gam 90: Mỗi ml NaOH chuẩn độ tương đương với 90 mg acid lactic trong dịch Dx 2.7. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán – Agar Plug Diffusion Method (Mounyr Balouiri, 2011) của chủng Lactobacillus sp. với nấm bệnh Phương pháp khuếch tán này được phát triển vào năm 1940, là phương pháp thông dụng được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng để thử nghiệm phản ứng nhạy cảm kháng sinh thông thường. Nhưng hiện nay, CLSI đã chấp nhận cho vi khuẩn và nấm bệnh thử nghiệm. Mặc dù không phải hầu hết các vi khuẩn đều thể hiện khả năng đối kháng trên phương pháp này nhưng cũng đã thành công trên một số vi khuẩn và thể hiện rõ sự ức chế đối với sự phát triển của nấm bệnh. 59
Đồ án tốt nghiệp Hoạt hóa giống của các chủng vi khuẩn lactic đã phân lập được trong MRS Broth ở o Giống Nấm 37 C trong 24 giờ Bệnh ĐN2, ĐN3, CĐP2, Tăng sinh ống giống đã hoạt hóa trong o CĐP1, MRS Broth rồi ủ ở 37 C trong 24 giờ HCP2 Tạo huyền phù nấm Cấy trang các chủng vi khuẩn lactic đã phân trong nước muối sinh lập được trên môi trường MRS Agar lí 85% có bổ sung Tween 80 Ủ ở 37oC trong 24 giờ Pha loãng Đục lỗ thạch vi khuẩn Hút 0.1ml dịch Cấy trang Đặt thạch VK Đĩa petri chứa môi trường MRS cải tiến Ủ trong 72 giờ Đo vòng ức chế nấm bệnh Tỉ lệ ức chế nấm bệnh Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được với nấm bệnh theo phương pháp đục thạch khuếch tán. 60
Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình : Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm bệnh của 17 chủng vi khuẩn theo phương pháp khuếch tán. Tiến hành:  Chuẩn bị đĩa thạch vi khuẩn: Hoạt hóa các chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS broth ở 37oC trong 24 giờ. Sau 24 giờ, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS broth ở 37oC trong 24 giờ. Hút 0.1ml dịch tăng sinh và trang vi khuẩn vào đĩa petri chứa môi trường MRS agar đã hấp khử trùng ở 121oC trong vòng 20 phút. Sau đó, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Đục lỗ thạch vi khuẩn  Chuẩn bị huyền phù nấm: Cấy truyền giống nấm vào đĩa petri có chứa môi trường PDA đã hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút. Sau đó, ủ trong 72 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau 72 giờ, ta dùng muỗng đã hấp khử trùng gạt hết phần bào tử nấm trên đĩa petri và pha loãng với nước muối sinh lí có bổ sung Tween 80 đã hấp khử trùng để nấm đạt đến mật độ 105/ml nấm.  Chuẩn bị môi trường để khảo sát sự đối kháng: Môi trường sử dụng là môi trường MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút. Sau đó, đổ 15ml môi trường MRS cải tiến vào đĩa petri đã hấp khử trùng. Để thạch đông tự nhiên Sau đó, ta tiến hành hút 0.1ml dịch huyền phù nấm đã pha loãng và trang đều đến khi khô. Sau đó, đặt khoanh thạch vi khuẩn đã chuẩn bị trước đó vào đĩa petri. Đối với đĩa đối chứng, ta chỉ hút dịch huyền phù nấm và trang khô, không đặt thạch vi khuẩn. 61
Đồ án tốt nghiệp A B Hình 2.4: Hình mô tả phương pháp đặt thạch A: đĩa petri chứa dịch huyền phù nấm đã trang khô B: đĩa petri chứa vi khuẩn Cuối cùng, ủ 72 giờ ở nhiệt độ phòng. Quan sát và đọc kết quả đối kháng dựa trên sự phát triển của vòng ức chế nấm của vi khuẩn. Ta tiến hành đo và tính toán kết quả dựa theo hình vẽ và công thức: Trung bình vòng ức chế (mm) = Trong đó: DNT1: đường kính vòng ức chế (D) của vi khuẩn trong nghiệm thức 1 chưa trừ ra đường kính lỗ thạch (d). DNT2: đường kính vòng ức chế (D) của vi khuẩn trong nghiệm thức 2 chưa trừ ra đường kính lỗ thạch (d). DNT3: đường kính vòng ức chế (D) của vi khuẩn trong nghiệm thức 3 chưa trừ ra đường kính lỗ thạch (d). 62
Đồ án tốt nghiệp D d Hình 2.5: Cách đo đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm bệnh theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 2.8. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt 2.8.1. Ứng dụng tạo màng bao bảo quản hạt đậu phộng: 63
Đồ án tốt nghiệp Hạt đậu phộng sau khi được sàng lọc, loại bỏ các hạt nứt, bể hay héo, được ngâm trong cồn 70° để khử trùng bề mặt và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó để ráo. Cứ mỗi 12g đậu phộng, sẽ được ngâm trong 200ml dung dịch tạo màng bao được chuẩn bị như sau: Chitosan 0.4%: 4g Chitosan + 1000ml CH3COOH 1% Nystatin: 1g Nystatin/50ml DMSO 64
Đồ án tốt nghiệp Đối chứng 1 200ml nước cất Đối chứng 2 200ml Chitosan 0.4% Đối chứng 3 100ml Chitosan 0.4% +100ml Nystatin Thí nghiệm 1 200ml Canh trường nuôi cấy Thí nghiệm 2 100ml Canh trường nuôi cấy + 100ml Chitosan 0.4% Hạt đậu phộng sau khi ngâm được để khô ở nhiệt độ phòng, kế đến phối vào các chai thuỷ tinh vô trùng và được cảm nhiễm 0,1ml huyền phù nấm mốc mật độ 102. Theo dõi từng ngày ở nhiệt độ thường. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. 2.8.2. Kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm Ngoài khả năng kháng nấm, người thực hiện đề tài mong muốn sản phẩm của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn được còn có khả năng kháng khuẩn. Chính vì thế mà sau 7 ngày, các nghiệm thức không nhiễm nấm được kiểm tra chất lượng vi sinh các chỉ tiêu: Tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC), Coliform và cấy lên môi trường MRS Agar để kiểm tra sự phát triển của nấm mốc cũng như các vi sinh vật khác. Các chỉ tiêu sẽ được so sánh theo Quyết định 46/2007/QĐ-BYT “Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hoá học trong thực phẩm” do Bộ Y Tế ban hành ngày 19/12/2007 mục Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu, đỗ: bánh, bột (dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt). 65
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả phân lập Người làm đề tài đã tiến hành phân lập vi khuẩn lactic từ 2 nguồn thực phẩm lên men truyền thống khác nhau như cơm mẻ và nem chua với mong muốn có thể thu thập được các chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc hoang dại có hoạt lực cao hơn so với các chủng công nghiệp và có thể đóng góp thêm vào bộ sưu tập giống. Môi trường sử dụng để phân lập là MRS agar là môi trường chọn lọc chứa nhiều thành phần thích hợp với sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic (DeMan et al., 1960). Ở vi khuẩn khi ta nuôi cấy ở điều kiện hiếu khí sẽ loại bỏ được những vi khuẩn kỵ khí và ngược lại khi nuôi ủ ở điều kiện kỵ khí sẽ loại bỏ bớt được vi khuẩn hiếu khí. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms) và không hô hấp nên để tăng khả năng chọn lọc, nên tôi đã bổ sung natri azide (NaN3) vào môi trường MRS với nồng độ 0.02% nhằm ức chế vi khuẩn hiếu khí và tăng điều kiện kỵ khí bằng cách dán kín các đĩa pettri bằng màng nhựa PVC đồng thời bổ sung thêm 5g/l CaCO3 vào môi trường MRS Agar. Vi khuẩn xuất hiện trên đĩa thạch với các khuẩn lạc màu trắng, nhỏ (Sharpe, 1979) và có xuất hiện vòng phân giải CaCO3 sẽ được chọn (hình 3.1). Từ đó chọn lựa và nuôi cấy được 38 chủng có hình thái khuẩn lạc đồng nhất có khả năng là vi khuẩn lactic. 66
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1: Hình thái của vi khuẩn lactic Hình 3.2: Các khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO3 Các chủng tuyển chọn được kí hiệu theo bảng 3.1 67
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập. Sản phẩm Kí hiệu các chủng phân lập Cơm mẻ LC Nem chua LN 3.2. Định danh các chủng phân lập Sau khi đã có được các chủng vi khuẩn đồng nhất, tôi tiến hành định danh các chủng phân lập bằng phương pháp cổ điển: khảo sát hình thái, sinh lý và sinh hóa. 3.2.1. Thử nghiệm Catalase Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2 khi cho H2O2 lên sinh khối của chúng thì sẽ có hiện tượng sủi bọt khí, sử dụng vi khuẩn Bacillus sb. có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng dương (hình 3.3). Theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm tính. Đồng thời nhờ vào phản ứng catalase ta còn loại được một số vi khuẩn gây bệnh có thể có mặt trong sản phẩm thực phẩm làm nguồn phân lập, chúng có catalase dương tính như Staphylococcus là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm; Micrococcus, Corynebacterium spp. là các vi khuẩn gây nhiễm trùng và cả E. coli gây tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa. Kết quả : Khi tiến hành cho H2O2 lên sinh khối của từng chủng vi khuẩn, có 26 chủng không có hiện tượng sủi bọt khí chứng tỏ chúng không có hệ enzyme catalase. * Kết quả: - 26 chủng âm tính. - 12 chủng dương tính. 68