›

Khóa luận Đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu in vivo của dịch chiết quả lựu (Punica granatum Linn.fruits)

pdf 47 trang thiennha21 18/04/2022 4480
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu in vivo của dịch chiết quả lựu (Punica granatum Linn.fruits)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_danh_gia_tac_dung_chong_tang_glucose_mau_va_lipid.pdf

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu in vivo của dịch chiết quả lựu (Punica granatum Linn.fruits)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC HỒ THỊ HẰNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG TĂNG GLUCOSE MÁU VÀ LIPID MÁU IN VIVO CỦA DỊCH CHIẾT QUẢ LỰU (PUNICA GRANATUM LINN.FRUITS) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: HỒ THỊ HẰNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG TĂNG GLUCOSE MÁU VÀ LIPID MÁU IN VIVO CỦA DỊCH CHIẾT QUẢ LỰU (PUNICA GRANATUM LINN.FRUITS) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khĩa: QH.2014.Y Người hướng dẫn: 1. PGS.TS Bùi Thanh Tùng 2. Ths Đặng Kim Thu Hà @Nội School- 2019 of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khĩa luận này, tơi xin được bày tỏ sự kính trọng và lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Bùi Thanh Tùng, Ths. Đặng Kim Thu giảng viên bộ mơn Dược lý, Dược lâm sàng - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã giao đề tài và luơn hướng dẫn tơi từ những ngày đầu tơi bước đi trên con đường nghiên cứu khoa học cho đến khi tơi hồn thành đề tài nghiên cứu này. Các thầy, cơ khơng chỉ trang bị cho tơi kiến thức, mà cịn truyền cho tơi niềm đam mê, lịng nhiệt huyết với nghề và luơn sẵn sàng giúp đỡ mỗi khi tơi gặp khĩ khăn. Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy, cơ giáo bộ mơn Dược lý - Dược lâm sàng, bộ mơn Hĩa dược đã hết lịng quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi thực hiện nghiên cứu và hồn thành khĩa luận này. Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa cùng tồn thể các thầy, cơ giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tơi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại nhà trường. Chúng tơi trân trọng cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu Á, Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số CA.18.10A do PGS.TS Bùi Thanh Tùng chủ trì để thực hiện nghiên cứu này. Cuối cùng, tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luơn quan tâm, chăm sĩc, động viên tơi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 30 tháng 4 năm 2019 Sinh viên Hồ Thị Hằng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. Đái tháo đường 3 1.1.1. Định nghĩa 3 1.1.2. Dịch tễ 3 1.1.3. Phân loại 3 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh 4 1.1.5. Các mơ hình gây ĐTĐ thực nghiệm 5 1.2. Tổng quan cây lựu 8 1.2.1. Tên gọi 8 1.2.2. Đặc điểm thực vật 9 1.2.3. Phân bố, sinh thái 10 1.2.4. Thành phần hĩa học 10 1.2.5. Hoạt tính sinh học 12 1.2.5.1. Tác dụng chống oxy hĩa 12 1.2.5.2. Tác dụng vi sinh 13 1.2.5.3. Tác dụng chống viêm 13 1.2.5.4. Tác dụng chống ung thư 14 1.2.5.5. Tác dụng đối với tim mạch 14 1.2.5.6. Tác dụng đối với bệnh tiểu đường 15 1.2.5.7. Tác dụng đối với bệnh béo phì 16 1.2.5.8. Độc tính của lựu 16 Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1. Mẫu thực vật 17 2.2.2. Động vật thí nghiệm 17 2.2. Dụng cụ và hĩa chất 17 2.2.1. Dụng cụ 17 2.2.2. Hĩa chất 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Phương pháp đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu 18 2.3.1.1. Tạo mơ hình chuột béo phì 18 2.3.1.2. Gây ĐTĐ typ 2 từ chuột béo phì thực nghiệm bằng Streptozocin (STZ) 19 2.3.1.3. Phân lơ chuột thí nghiệm 19 2.3.1.4. Tiến hành thí nghiệm 20 2.3.1.5. Theo dõi thí nghiệm @ School of Medicine and 20 Pharmacy, VNU
  5. 2.3.1.6. Tiến hành lấy mẫu thử nghiệm sau khi kết thúc đợt thí nghiệm . 20 2.3.2. Phương pháp xác định một số chỉ số hĩa sinh máu 20 2.3.2.1. Định lượng Glucose máu theo giai đoạn thực nghiệm 20 2.3.2.2. Định lượng Cholesterol trong huyết thanh 21 Chương 3 - KẾT QUẢ 23 3.1. Kết quả gây mơ hình béo phì thực nghiệm 23 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng của dịch chiết quả lựu lên trọng lượng chuột 25 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng của dịch chiết quả lựu lên một số chỉ số hĩa sinh trong máu chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm. 27 Chương 4 - BÀN LUẬN 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐTĐ Đái tháo đường ADA Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association ) STZ Streptozocin PE Chiết xuất vỏ (Peel extract) SE Chiết xuất hạt (Seed extract) HDL Lipoprotein tỉ trọng cao (High Density Lipoprotein) LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) IDF Liên đồn Đái tháo đường Thế giới (International Diabetes Federation ) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Thể trọng chuột sau 28 ngày nuơi theo mơ hình gây béo thực nghiệm 23 Bảng 3.2. Nồng độ glucose máu của các nhĩm chuột sau 10 ngày tiêm STZ 24 Bảng 3.3. Thể trọng chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng hai nồng độ khác nhau của dịch chiết quả lựu 26 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết quả lựu lên nồng độ glucose máu 27 Bảng 3.5. Ảnh hướng của dịch chiết quả lựu đối với các chỉ số lipid máu 29 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hĩa học của streptozocin 6 Hình 1.2. Cấu trúc hĩa học của alloxan 7 Hình 1.3. Quả lựu (Punica granatum Linn.Fruits) 9 Hình 1.4. Cấu trúc phân tử của punicalagin 10 Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của delphinidin 3,5 - diglucoside và cyanidin 3,5 - diglucoside 11 Hình 1.6. Cấu trúc phân tử của axit punicic 11 Hình 2.1. Sơ đồ và phương pháp nghiên cứu 18 Hình 3.1. Thể trọng chuột sau 28 ngày nuơi theo mơ hình gây béo thực nghiệm 24 Hình 3.2. Thể trọng chuột sau 28 ngày nuơi theo mơ hình gây béo thực nghiệm 25 Hình 3.3. Thể trọng chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng hai nồng độ khác nhau của dịch chiết quả lựu 27 Hình 3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết quả lựu lên nồng độ glucose máu 28 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. MỞ ĐẦU Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), béo phì là một trong những vấn đề sức khỏe cộng đồng thường gặp nhưng hầu như khơng được chú trọng và đang ngày càng gia tăng theo mức độ đáng báo động. Từ năm 1980, tỷ lệ béo phì trên tồn thế giới đã gia tăng gấp hai lần, tăng từ 4,7% lên 8,5% ở người lớn và dự đốn đến năm 2030 sẽ cĩ 470 triệu người mắc bệnh này [55]. Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu của Viện dinh dưỡng Quốc gia năm 2007 báo cáo rằng tỷ lệ thừa cân/béo phì (tính theo chỉ số khối cơ thể) lên tới 16,3% với đối tượng tuổi từ 25 đến 64 tuổi và vẫn tiếp tục tăng. Đây là một dấu hiệu cảnh báo về sự gia tăng bệnh mạn tính khơng lây nhiễm tại cộng đồng, gây nên những biến chứng sức khỏe nghiêm trọng như bệnh tim mạch, mỡ máu, đột quỵ và các bệnh rối loạn chuyển hĩa trong đĩ đặc biệt là bệnh ĐTĐ. Đái tháo đường là hội chứng lâm sàng đặc trưng bởi tình trạng tăng nồng độ glucose máu do thiếu hụt insulin ở tế bào. Trên tồn thế giới, ĐTĐ đang ngày càng gia tăng về tỷ lệ và mức độ ảnh hưởng đến các vấn đề sức khỏe khác. Mặc dù cĩ tiến bộ đáng kể trong điều trị bệnh ĐTĐ bằng các thuốc đường uống, việc tìm kiếm các loại thuốc mới hơn vẫn tiếp tục vì những hạn chế do các tác dụng bất lợi và chi phí điều trị [60]. Sử dụng cây thuốc trong điều trị bệnh tiểu đường rất phổ biến ở các nước đang phát triển, khi chi phí của các loại thuốc thơng thường là gánh nặng về kinh tế đối với người dân [24]. Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá tiềm năng điều trị bệnh ĐTĐ của các cây thuốc và đã cho những kết quả khả quan như: Thân cây Ý dĩ, thân cây Mướp đắng, quả cây Chuối hột [3, 4, 7]. Lựu được biết đến khơng chỉ là loại cây ăn quả được trồng nhiều ở nước ta mà cịn là loại dược liệu được sử dụng nhiều trong Y học cổ truyền. Trên thế giới đã cĩ rất nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu từ các thành phần của cây lựu. Tuy nhiên tại Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa tìm thấy nghiên cứu nào đánh giá tác dụng sinh học của lựu. Để gĩp phần cung cấp những cơ sở cho việc sử dụng và phát triển các sản phẩm từ lựu, đề tài “Đánh giá tác dụng chống tăng @ glucose School máu ofvà lipidMedicine máu in vivo and của Pharmacy, VNU 1
  10. dịch chiết quả lựu (Punica granatum Linn.fruits)” được thực hiện nhằm mục tiêu sau: Xây dựng được mơ hình chuột bị ĐTĐ typ 2 trên nền chuột béo phì. Đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu của cao chiết ethanol quả lựu trên mơ hình chuột ĐTĐ typ 2. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Đái tháo đường 1.1.1. Định nghĩa Theo định nghĩa của Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ năm 2017 (American Diabetes Association - ADA): “Đái tháo đường là bệnh rối loạn chuyển hĩa đặc trưng bởi sự tăng đường huyết, gây ra bởi sự giảm tiết insulin và/hoặc giảm hoạt tính của insulin. Sự tăng đường huyết mạn tính dẫn đến những tác hại lâu dài, rối loạn hoặc suy yếu chức năng các cơ quan đặc biệt là mắt, thận, hệ thần kinh, tim và mạch máu” [8]. 1.1.2. Dịch tễ Đái tháo đường trở thành bệnh lý đáng báo động nhất trên tồn thế giới từ những năm đầu của thế kỷ 21. Theo cuộc điều tra của Liên đồn Đái tháo đường Thế giới (International Diabetes Federation - IDF): năm 2017 dân số thế giới là 7,5 tỷ người trong đĩ cĩ 425 triệu người (trong độ tuổi 20 - 79) bị bệnh ĐTĐ, dự tính đến năm 2045 con số này sẽ là 629 triệu; đặc biệt trong hai người trưởng thành (trong độ tuổi 20 - 79) bị ĐTĐ thì cĩ một người khơng được chẩn đốn. Hầu hết những người mắc bệnh ĐTĐ sinh sống ở các nước đang phát triển, những nước cĩ thu nhập thấp và trung bình. Đơng Nam Á cĩ số người trưởng thành bị ĐTĐ cao thứ hai trong các vùng theo IDF, chiếm tỷ lệ 8,5% tổng số người bị ĐTĐ trên thế giới, trong đĩ khoảng 45,8% các trường hợp bị ĐTĐ khơng được chẩn đốn và gần 48,8% người trưởng thành mắc bệnh ĐTĐ sống ở thành thị [25]. Tại Việt Nam, trong kết quả cơng bố của “Dự án phịng chống đái tháo đường quốc gia” do Bệnh viện Nội tiết Trung ương thực hiện năm 2012 trên 11000 người tuổi 30 - 69 sống tại 6 vùng miền gồm: miền núi phía Bắc, đồng bằng sơng Hồng, duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đơng Nam Bộ và Tây Nam Bộ đã cho thấy tỷ lệ hiện mắc ĐTĐ trên tồn quốc ở người trưởng thành là 5,42%, tăng gấp gần hai lần so với tỷ lệ ĐTĐ năm 2012 là 2,7%. Ngồi ra, tỷ lệ ĐTĐ chưa được chẩn đốn trong cộng đồng lên tới 63,6% [2]. Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose tồn quốc 7,3%, rối loạn glucose máu lúc đĩi tồn quốc 1,9% (năm 2003). 1.1.3. Phân loại @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  12. Theo ADA bệnh ĐTĐ cĩ thể được phân thành [8]: Bệnh ĐTĐ typ 1: do sự tự phá hủy tế bào β đảo tụy, thường dẫn đến sự thiếu hụt insulin tuyệt đối. Bệnh ĐTĐ typ 2: do tế bào mất dần sự bài tiết insulin. Bệnh ĐTĐ thai kỳ: được chẩn đốn trong khoảng từ tháng thứ ba đến tháng thứ chín của thai kỳ và được phát hiện lần đầu trong lúc mang thai. Bệnh ĐTĐ do các nguyên nhân khác: giảm chức năng tế bào β do khiếm khuyết gen; bệnh nội tiết; tăng đường huyết do thuốc và hĩa chất như sử dụng glucocorticoid, trong điều trị HIV/AIDS hoặc sau khi ghép tạng. 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh 1.1.4.1. Bệnh sinh ĐTĐ typ 1 Đái tháo đường typ 1 hay cịn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin, được coi là một bệnh tự miễn do hệ thống miễn dịch của cơ thể tấn cơng các tế bào β sản xuất insulin trong tuyến tụy và phá hủy chúng. Tuyến tụy sau đĩ sản xuất ít hoặc khơng sản xuất insulin dẫn đến nồng độ glucose trong máu ở mức khơng bình thường và người bệnh được chẩn đốn là mắc bệnh ĐTĐ. Bệnh ĐTĐ typ 1 xuất hiện ở những cá thể cĩ gen mẫn cảm với bệnh và thêm các yếu tố mơi trường thuận lợi sẽ kích hoạt quá trình bệnh sinh. Tiếp đĩ, một loạt phản ứng miễn dịch sẽ xảy ra, các tế bào đơn nhân, đại thực bào và tế bào lympho T gây độc thâm nhiễm vào các tiểu đảo tụy. Quá trình này diễn ra rất thầm lặng và được gọi là viêm tiểu đảo tụy. Giai đoạn tiền ĐTĐ typ 1 được xác định khi phát hiện được kháng thể kháng tế bào β đảo tụy trong huyết thanh người bệnh [6, 8]. 1.1.4.2. Bệnh sinh ĐTĐ typ 2 ĐTĐ typ 2 là dạng ĐTĐ thường gặp nhất, chiếm khoảng 80 - 90% trong số bệnh nhân bị ĐTĐ. Thơng thường, với bệnh ĐTĐ typ 2, trong cơ thể vẫn cịn sản xuất insulin, nhưng insulin được sản xuất ra khơng đủ hoặc các tế bào khơng thể sử dụng nĩ và được gọi là kháng insulin [8]. Cĩ hai yếu tố cơ bản đĩng vai trị quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 là đề kháng với insulin và suy giảm chức năng tiết insulin kết hợp với nhau [8]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  13. Glucose đĩng vai trị là nguồn cung cấp năng lượng chính cho các tế bào. Tuy nhiên để cĩ thể nhận được glucose các tế bào phải cần đến insulin hoạt động như một “chiếc chìa khĩa” giúp glucose cĩ thể vào được tế bào. Kháng insulin cĩ thể xảy ra ở gan và các mơ ngoại vi theo các hình thức: giảm sử dụng glucose ở các cơ quan, giảm thu nhận glucose ở mơ ngoại vi và khả năng ức chế sản xuất glucose ở gan bị thuyên giảm. Thừa cân và béo phì là những yếu tố quan trọng làm gia tăng tình trạng kháng insulin, mà béo phì thường là do cơ thể hấp thu quá nhiều chất béo nhưng lại ít vận động. Axit béo tự do cĩ nhiều ở những người bệnh béo phì sẽ cạnh tranh với glucose trong chuyển hĩa tại cơ vân dẫn đến sự rối loạn sử dụng glucose ở ngoại biên và gây nên tình trạng đề kháng insulin [7]. Suy giảm chức năng tiết insulin Khi cơ thể cĩ hiện tượng kháng insulin, nồng độ glucose trong máu sẽ tăng cao. Tế bào β đảo tụy lại đáp ứng bằng cách sản xuất nhiều hơn insulin. Quá trình này diễn ra kéo dài sẽ dẫn đến chức năng của tế bào β bị suy giảm. Ngồi ra khi cả axit béo tự do và insulin đều tăng, quá trình chuyển hĩa sẽ tăng lên tại ty thể, làm gia tăng các gốc tự do dẫn đến gia tăng tình trạng viêm. Thêm vào đĩ, insulin trong máu cao cịn gây hiện tượng stress lưới nội chất. Cả hai tình trạng này đều dẫn đến kết quả là tế bào chết theo chu trình. Hậu quả là tế bào β giảm tiết insulin. Khi nồng độ insulin ở tế bào cửa gan thấp, gan đáp ứng bằng việc giải phĩng glucose vào máu trong khi nồng độ glucose đã cao sẵn sau bữa ăn. Ngồi ra ở tế bào cơ vân, nồng độ insulin thấp làm glucose ít vào tế bào, gĩp phần dẫn đến glucose trong máu cao. Trong giai đoạn này, nồng độ insulin thấp do tụy ít sản xuất và bài tiết insulin kèm theo tình trạng kháng insulin làm khả năng kiểm sốt nồng độ glucose ngày càng xấu đi và cĩ thể gây nên nhiều biến chứng nghiêm trọng [7]. 1.1.5. Các mơ hình gây ĐTĐ thực nghiệm Thử nghiệm ĐTĐ trên mơ hình động vật là điều cần thiết để nâng cao nhận thức và hiểu biết về các khía cạnh khác nhau của cơ chế bệnh sinh từ đĩ tìm ra các liệu pháp và các phương pháp trị liệu mới. Hầu hết các mơ hình hiện nay đều sử dụng động vật gặm nhấm vì nhiều ưu điểm như kích thước nhỏ, khoảng cách thế hệ ngắn, tính sẵn cĩ và chi phí thấp. Bệnh ĐTĐ thực nghiệm thường được gây ra ở động vật thí nghiệm @ Schoolbằng các phương of Medicine pháp phổ biến and như: Pharmacy, VNU tác nhân hĩa học, phẫu thuật, di truyền [31]. 5
  14. 1.1.5.1. Tác nhân hĩa học Các tác nhân hĩa học gây ra ĐTĐ cĩ thể phân thành ba loại: phá hủy tế bào β đảo tụy, gây ức chế tạm thời việc sản xuất và/hoặc tiết insulin, làm giảm chuyển hĩa insulin trong mơ đích. Streptozocin (STZ 61%) và Alloxan (31%) cho đến nay là những thuốc được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về bệnh ĐTĐ và giúp ích cho nghiên cứu nhiều khía cạnh của bệnh. Các loại thuốc này cĩ thể được đưa vào cơ thể bằng cách tiêm tĩnh mạch, tiêm màng bụng hoặc tiêm dưới da. Liều cần thiết để gây ra bệnh ĐTĐ phụ thuộc vào loại động vật, đường dùng thuốc và tình trạng dinh dưỡng. Tùy theo liều dùng của các thuốc này, các hội chứng tương tự như ĐTĐ typ 1, ĐTĐ typ 2 hoặc khơng dung nạp glucose cĩ thể được gây ra. Tác dụng gây độc tế bào của các loại thuốc này đều qua trung gian là các phản ứng oxy hĩa nhưng chúng khác nhau về cơ chế hoạt động [31].  Streptozocin Streptozocin là một hơp chất glucosamine nitrosourea đã được thử nghiệm lâm sàng từ năm 1967. Trước đây được chỉ định dưới tên streptozotocin. STZ gây ra ĐTĐ ở hầu hết các lồi và được sử dụng phổ biến nhất để gây ra ĐTĐ ở chuột [27, 62]. Hình 1.1. Cấu trúc hĩa học của streptozocin STZ xâm nhập vào tế bào tụy thơng qua chất vật chuyển glucose - GLUT2 và gây ra sự alkyl hĩa axit deoxyribonucleic (DNA). Ngồi ra STZ cịn gây kích hoạt sự ribosyl hĩa poly adenosin diphosphat và giải phĩng nitric oxid. Kết quả là tế bào tụy bị phá hủy do hoại tử [31]. Sử dụng STZ trong mơ hình bằng @ nhiềuSchool phương of pháp: Medicine and Pharmacy, VNU 6
  15. - STZ cho chuột mới sinh: Mơ hình tiêm STZ cho chuột mới sinh (với sự thay đổi liều và ngày tiêm STZ) biểu hiện các giai đoạn khác nhau của ĐTĐ typ 2 như giảm dung nạp glucose, glucose máu giảm nhẹ, trung bình, nặng. Các tế bào β ở chuột mới sinh tiêm STZ cĩ sự tương đồng về đặc điểm bài tiết insulin ở bệnh nhân ĐTĐ typ 2 [9, 63]. - Kết hợp Nicotinamid - Streptozocin (NAD - STZ): Nicotinamid là một chất chống oxy hĩa cĩ tác dụng bảo vệ bằng cách làm sạch các gốc tự do và do đĩ bảo vệ được một phần tế bào β khỏi tác động gây độc tế bào của STZ [42]. Một vấn đề khi sử dụng STZ là tác dụng độc hại của nĩ khơng giới hạn ở tuyến tụy vì nĩ cĩ thể gây tổn thương thận, gây viêm và rối loạn chức năng nội mơ.  Alloxan Alloxan cịn được gọi là mesozalylurea, mesoxalylcarbamide, 2, 4, 5, 6 - tetraoxohexa hydropyrimidin hoặc pyimidineteton. Nĩ là dẫn xuất của axit uric, khơng bền ở pH trung tính, khá ổn định ở pH=3. Alloxan tạo ra các phản ứng oxy hĩa trong phản ứng oxy hĩa khử tuần hồn với sản phẩm khử của nĩ là axit dialuric. Axit này tự oxy hĩa tạo thành các gốc superoxide, hydro peroxide, gốc hydroxyl. Các gốc hydroxyl này gây nên sự phân hủy tế bào β [34]. Hình 1.2. Cấu trúc hĩa học của alloxan @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  16. Alloxan tác động qua ba giai đoạn [46]: - Giai đoạn 1: gây tăng đường huyết sau thời gian ngắn (khoảng 1 - 4 giờ) do insulin giảm đột ngột và kéo dài; gây phân hủy glycogen ở gan. - Giai đoạn 2: tăng đường huyết kéo dài đến 48 giờ, thường dẫn đến co giật, tử vong. - Giai đoạn 3: gây ĐTĐ mạn tính do thiếu insulin, số lượng tế bào β cịn lại rất ít. 1.1.5.2. Phẫu thuật gây ĐTĐ Phương pháp này bao gồm cắt bỏ hồn tồn hoặc một phần tụy để gây ĐTĐ typ 1 hoặc typ 2. Trong lịch sử, mơ hình mắc bệnh tiểu đường ở chĩ được Oskar Minkowski phát hiện thơng qua phẫu thuật cắt bỏ tụy được coi là mơ hình động vật đầu tiên về bệnh tiểu đường [41]. Một số nhà nghiên cứu đã sử dụng mơ hình này để thử nghiệm các sản phẩm tự nhiên trên chuột, chĩ, linh trưởng [36, 45]. 1.1.5.3. ĐTĐ do di truyền Các động vật mắc bệnh ĐTĐ typ 2 cĩ thể được lấy từ chọn giống (các động vật cĩ một hoặc một số gen đột biến được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác) hoặc từ lai tạo (lai tạo từ chuột ob khơng bị ĐTĐ bằng nhân giống lặp đi lặp lại qua nhiều thế hệ (chuột BB, chuột tiểu đường béo phì Tsumara Suzuki). Những động vật này bị ĐTĐ là do di truyền hoặc do khiếm khuyết đơn hoặc đa gen (chuột KK, chuột db/db hoặc chuột béo Zucker). Bệnh ĐTĐ typ 2 ở người phần lớn là kết quả của sự tương tác giữa mơi trường và sự khiếm khuyết đa gen. Do đĩ động vật khiếm khuyến đa gen sẽ gần giống với người hơn động vật khiếm khuyết đơn gen [30]. 1.2. Tổng quan cây lựu 1.2.1. Tên gọi Tên khoa học: Punica granatum Linn. Tên gọi khác: Bạch lựu, tháp lựu, lựu chùa Tháp. Tên nước ngồi: Pomegranate (Anh), grenadier (Pháp). Họ: Lựu (Punicaceae). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
  17. Chi Punica gồm 2 lồi: P.protopunica và P.granatum, P.protopunica chỉ cĩ ở bán đảo Socotra (Yemen) và được liệt kê vào lồi thực vật cĩ nguy bị tuyệt chủng ở Danh sách đỏ của Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [5, 39]. Hình 1.3: Quả lựu (Punica granatum Linn.Fruits) [64] 1.2.2. Đặc điểm thực vật Cây lựu là một cây thuộc mộc, cao chừng 3 - 4 m [5]. Thân màu xám, cĩ vỏ mỏng, cành mảnh, đơi khi cĩ gai. Lá mọc đối, nhưng thường tụ họp thành cụm nhiều lá, cuống ngắn, hình mác thuơn, dài 5 - 6 cm, rộng 1 - 2 cm, gốc thuơn, đầu tù hoặc hơi nhọn, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bĩng, lá kèm rất nhỏ, hình chỉ [1]. Quả to bằng nắm tay, đầu quả cịn 4 - 5 lá đài tồn tại. Vỏ dài, ngồi da sắc lục, khi chín cĩ màu vàng đỏ lốm đốm. Trong quả cĩ 8 ngăn xếp thành 2 tầng, tầng trên cĩ 5 ngăn tầng dưới cĩ 3. Các loại ngăn phân cách bởi các màng mỏng. Hạt rất nhiều, hình 5 cạnh, sắc hồng trắng [5]. Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, màu đỏ hoặc màu vàng, loại màu trắng là bạch lựu, dài 6 phiến dày, màu đỏ nhạt, hàn liền thành ống ngắn ở phần dưới, tràng 6 cánh mỏng, nhăn nheo, nhị rất nhiều, bầu cĩ 2 tầng, tầng trên 6 - 7 ơ, tầng dưới 3 - 4 ơ, nỗn nhiều [1]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  18. 1.2.3. Phân bố, sinh thái Lựu là loại cây được trồng ở vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Lựu cĩ nguồn gốc từ các khu vực bao gồm Iran và Afganistan, được canh tác và tự nhiên hĩa trên tồn bộ khu vực Địa Trung Hải từ thời cổ đại. Ngày nay nĩ được trồng rộng rãi ở khắp Ấn Độ, Đơng Nam Á, Malaysia, Đơng Ấn và vùng nhiệt đới Châu Phi [20]. Ở Việt Nam, cây được trồng nhiều ở các tỉnh phía nam và một số tỉnh ở đồng bằng trung du Bắc Bộ [1]. Lựu là cây ưa sáng, nếu bị che bĩng cĩ thể ra nhiều hoa nhưng khơng đậu quả. Cây rụng lá về mùa đơng, tái sinh chủ yếu bằng hạt. Lựu trồng hiện nay gồm nhiều giống. Người ta căn cứ vào màu hoa và quả để phân biệt giữa các giống khác nhau [1]. 1.2.4. Thành phần hĩa học Đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về thành phần hĩa học đối với các bộ phận của quả lựu nhằm hướng tới xác định thành phần nào chịu trách nhiệm cho hoạt tính sinh học mà quả lựu cĩ được. Vỏ lựu chiếm 50% trọng lượng quả, là nguồn giàu các thành phần cĩ hoạt tính sinh học như phenolics, ellagitannins và anthocyanins [35]. Ellagitannins là nhĩm hợp chất phenolic chiếm ưu thế cả trong vỏ và thịt quả lựu với hàm lượng cao nhất là punicalagin (HHDP - gallagyl - hexoside) [17]. Hình 1.4. Cấu trúc phân@ School tử của punicalagin of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  19. Thịt quả chứa nước (85%), đường (10%) chủ yếu là fructose và glucose, pectin (1,5%) và axit tự nhiên như axit ascorbic, axit citric, axit malic [11]. Các nhĩm chất đã được xác định trong thành phần hĩa học của thịt quả lựu là anthocyanins, gallotannins, ellagitannins, estes gallagyl, axit hydroxybenzoic, hydroxycinnamic [17]. Vỏ quả và thịt quả cĩ hàm lượng anthocyanin là ngang nhau với các hợp chất đã được xác định là: delphinidin 3,5 - diglucoside, cyanidin 3,5 - diglucoside, pelargonidin 3,5 - diglucoside, delphinidin 3 - glucoside, cyanidin 3 - glucoside, cyanidin 3 - rutinoside, pelargonidin 3 - glucoside và cyanidin - pentoside [17]. Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của delphinidin 3,5 - diglucoside và cyanidin 3,5 - diglucoside Dầu hạt lựu chiếm khoảng 12 - 20% tổng trọng lượng hạt, đặc trưng bởi các axit béo khơng bão hịa đa nối đơi như linoleic, linolenic và các axit béo khác như axit palmitic, axit stearic, axit oleic trong đĩ hàm lượng cao (7%) là axit punicic, được biết đến như một đồng phân của axit linoleic [16, 40]. Hạt lựu cũng chứa protein, vitamin, khống chất, isoflavones (chủ yếu là genistein), phytoestrogen coumestrol, estrone [14]. Hình 1.6. Cấu trúc phân tử của axit punicic @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  20. 1.2.5. Hoạt tính sinh học Mặc dù mối liên quan giữa cấu trúc hĩa học và tác dụng dược lý của các thành phần trong quả lựu đến nay vẫn chưa được xác định rõ. Tuy nhiên, trong hơn thế kỷ qua rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để hướng tới sự hiểu biết tồn diện về tác dụng dược lý của lựu. Quả lựu ngồi tác dụng là nguồn cung cấp nhiều chất dinh dưỡng quan trọng, nĩ cịn cĩ thể được sử dụng với nhiều mục đích y học khác nhau. Trong y học cổ truyền, vỏ quả lựu thường được dùng để trị sán (peletierin kết hợp với tanin). Ngồi ra, nĩ cịn được dùng chữa đau răng, đi ngồi, chữa lỵ nhờ tác dụng săn da và sát khuẩn mạnh [1]. Chất chiết xuất từ vỏ, nước, hạt lựu đều được ghi nhận cĩ ý nghĩa về y học, đáng chú ý là hoạt tính chống oxy hĩa, chống viêm, tính kháng khuẩn, sử dụng trong bệnh tiểu đường, bệnh tim và ung thư. 1.2.5.1. Tác dụng chống oxy hĩa Hoạt tính chống oxy hĩa của quả lựu đã được tiến hành trong nhiều nghiên cứu, bao gồm cả in vitro và in vivo. Kannat và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính chống oxy hĩa in vitro của chiết xuất vỏ (PE) và hạt (SE) quả lựu theo mơ hình loại bỏ gốc tự do của 2,2 - diphenyl -1 - picrylhydrazyl (DPPH), cĩ đối chứng với chất chống oxy hĩa là Butylated Hydroxy Toluene (BHT). Kết quả báo cáo rằng giá trị IC50 (nồng độ trung hịa được 50% gốc tự do) của PE đối với DPPH là 4,9 µg/mL trong khi đĩ BHT với DPPH là 21,2 µg/mL, đã cho thấy tác dụng chống oxy hĩa mạnh của PE. Ngồi ra, nghiên cứu cịn báo cáo việc bổ sung PE vào các sản phẩm thịt gà đã tăng thời gian bảo quản lên 2 - 3 tuần trong điều kiện lạnh, cĩ hiệu quả trong việc kiểm sốt sự oxy hĩa của các sản phẩm này [28]. Nước quả lựu cĩ hoạt tính chống oxy hĩa mạnh nhất khi so sánh khả năng chống oxy hĩa của nước quả lựu, punicalagin, axit ellagic và tổng tanin trong quả lựu [50]. Hoạt tính chống oxy hĩa cĩ thể liên quan đến sự đa dạng của các phenolic cĩ mặt trong quả lựu, bao gồm các đồng phân của punicalagin, dẫn xuất tanin và anthocyanin (delphinidin, cyanidin và pelargonidin 3 - glucosides và 3,5 - diglucosides). Những hợp chất này được @ biếtSchool đến với of tính Medicine chất loại bỏ các and gốc Pharmacy, VNU tự do và ức chế quá trình oxy hĩa lipid trong ống nghiệm [19]. Tuy nhiên, 12
  21. Tzulker và cộng sự cho rằng punicalagin cĩ nguồn gốc từ vỏ mới là chất đĩng vai trị quan trọng trong hoạt tính chống oxy hĩa của lựu, cịn anthocyanin chỉ đĩng vai trị nhỏ trong hoạt tính này [56]. 1.2.5.2. Tác dụng vi sinh Tác dụng kháng khuẩn của quả lựu đã được nghiên cứu rộng rãi bởi các nhà khoa học khác nhau trên tồn thế giới. Năm 2005, nghiên cứu dịch chiết methanol từ quả lựu, Braga LC. đã phát hiện ra khả năng làm tăng cường đáng kể hoạt động và kéo dài thời gian tác dụng của các loại kháng sinh chống lại 30 chủng Staphylococcus aureus kháng Methicilin và Staphylococcus aureus nhạy cảm với Methicilin [12]. Nghiên cứu của Neurath và cộng sự được tiến hành để sàng lọc các loại nước ép trái cây cĩ hoạt tính ức chế virus HIV IIIB gắn lõi gp120 vào các tế bào biểu hiện thụ thể CD4 và đồng thụ thể CXCR4 trên màng tế bào. Kết quả là nước quả lựu cĩ hoạt động ức chế cao nhất. Neurath đã tách được chất ức chế sự gắn gp120 - CD4 ra khỏi nước ép lựu khi sử dụng tinh bột ngơ như một chất hấp phụ, tạo sản phẩm gần như khơng màu [38]. Trong một nghiên cứu khác trong lĩnh vực nha khoa, gel được làm từ vỏ quả lựu cho tác dụng ức chế các chủng vi khuẩn Streptococci (mutans, sanguis, mitis) và Candidan albicans tốt hơn miconazol dạng gel [57]. Chiết xuất hydroalcoholic với quả lựu cũng cho hoạt tính kháng khuẩn đối với các vi sinh vật mảng bám trong nghiên cứu trên các bệnh nhân khỏe mạnh đang sử dụng thiết bị niềng răng [37]. 1.2.5.3. Tác dụng chống viêm Sử dụng các chất chiết xuất từ quả lựu cĩ thể ức chế sự sản xuất NO của đại thực bào. Ngồi ra, nĩ cịn giảm đáng kể sự phù nề ở chuột gây ra bởi carragenin trong một thời gian (tối đa 5h). Hơn nữa, sử dụng tách phân đoạn in vitro và sắc ký cột để tách punicalagin, punicalin, strictinin A và granatan B đã cho kết quả là các hợp chất này cĩ thể ức chế sản xuất NO cũng như sự biểu hiện của iNOs trong đại thực bào. Granatin B cho thấy tác dụng ức chế iNOs và COX - 2 tốt nhất, biểu hiện qua mức PGE2 và mức phù nề ở chuột [33]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  22. Rasheed và cộng sự cho rằng chiết xuất giàu polyphenol của nước quả lựu cĩ tác dụng ức chế IL - 6, IL - 8 thơng qua NF - kB (phức hợp Protein hoạt động như một yếu tố phiên mã gen) thơng qua nghiên cứu ảnh hưởng của nĩ lên MAPK (Protein kinase được hoạt hĩa bởi Mitogen) và Nf - kB tồn tại trong PMACI (cĩ tác dụng kích thích biểu hiện của gen đáp ứng với quá trình viêm và sản xuất IL - 6, IL - 8 trong tế bào KU812 ở người). Nghiên cứu đã chứng minh khả năng làm giảm biểu hiện của gen đáp ứng với quá trình viêm và sản xuất IL - 6, IL - 8. Tác dụng ức chế của dịch chiết lên NF - kB (bị ức chế bởi protein IkB) là do nĩ ức chế sự giáng hĩa IkB trong tế bào bạch cầu [44]. 1.2.5.4. Tác dụng chống ung thư Các phân đoạn giàu polyphenol từ các bộ phận của quả lựu cĩ tác dụng hiệp đồng chống lại sự gia tăng và xâm lấn, cũng như ức chế sự biểu hiện phospholipase A2 ở các tế bào ung thư tuyến tiền liệt [32]. Chiết xuất methanol của vỏ lựu được chứng minh là cĩ tính chất điều biến thụ thể estrogen chọn lọc trong các dịng tế bào ung thư vú ở người và các mơ hình in vivo thiếu estrogen. Các chất điều biến thụ thể estrogen chọn lọc, hợp chất cĩ tác động như estrogen lên thụ thể của estrogen cĩ thể đồng vận hoặc đối vận trên mơ đích của estrogen và thường được sử dụng để điều trị ung thư vú phụ thuộc estrogen [53]. Nghiên cứu sử dụng hai dịng tế bào ung thư vú gồm tế bào MDA - MB - 231 (ER-), MCF - 7 (ER+) và dịng tế bào khơng bị ung thư MCF10A, cho thấy phần nước quả lựu chứa các thành phần luteolin, axit ellagic và axit punicic giúp tăng độ bám dính của các tế bào ung thư, giảm sự di căn của tế bào ung thư và giảm sự tăng trưởng của các tế bào ung thư vú mà khơng ảnh hưởng đến các tế bào bình thường [47]. Hỗn hợp axit ellagic, luteolin và axit punicic cĩ thể ức chế sự phát triển khối u nguyên phát [61]. 1.2.5.5. Tác dụng đối với tim mạch Nước lựu làm giảm đáng kể cholesterol tổng, LDL cholesterol, tỷ lệ LDL/HDL, và tỷ lệ cholesterol tổng/HDL. Những phát hiện này cho thấy rằng sử dụng nước ép quả lựu cĩ thể thay đổi các yếu tố nguy cơ bệnh tim mạch ở bệnh nhân cĩ tăng lipid máu [15]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  23. Sử dụng nước ép quả lựu hàng ngày cĩ thể cải thiện tình trạng thiếu máu cơ tim do stress gây ra ở những bệnh nhân bị bệnh mạch vành [54]. Nước ép quả lựu cĩ thể giúp bệnh nhân hẹp động mạch cảnh, nĩ cĩ tác dụng làm giảm độ dày của lớp áo trong - áo giữa thành động mạch và huyết áp tâm thu của họ [10]. 1.2.5.6. Tác dụng đối với bệnh tiểu đường Các nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá tác dụng của lựu đối với bệnh tiểu đường trên sự thay đổi đường huyết khi chuột bị tiểu đường do tiêm STZ được điều trị bằng chiết xuất methanol của hạt. Tất cả các chuột đươc điều trị bằng chlorpropamid và dịch chiết methanol hạt lựu đều cho kết quả nồng độ glucose máu giảm. Lơ điều trị bằng chlorpropamid biểu hiện nồng độ glucose giảm 10% sau 2h và giảm cao nhất là 42,55% sau 12h so với lơ chuột chứng. Lơ điều trị dịch chiết methanol hạt lựu ở liều 600 mg/kg cho kết quả tốt nhất so với liều 150 mg/kg và 300 mg/kg; giảm thấp nhất là 15% sau 2h và cao nhất là 52% sau 12h, trong khi đĩ liều 150 mg/kg là giảm 6% sau 2h và 40% sau 12h; liều 300 mg/kg cho kết quả giảm 7% sau 2h và 47% sau 12h so với lơ chứng. Các bệnh nhân bị tiểu đường sử dụng nước quả lựu khơng ảnh hưởng nhiều đến các thơng số cholesterol tổng, HDL cholesterol, LDL cholesterol, triglycerid. Nghiên cứu khẳng định là mặc dù cĩ sự hiện diện của đường trong nước quả lựu nhưng khơng ảnh hưởng xấu đến các thơng số tiểu đường: glucose, HbA1c, insulin, C - peptide đều khả quan [48]. Nghiên cứu của Das AK và cộng sự cho thấy rằng chuột bị gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ sau khi cho uống chiết xuất methanol hạt lựu liều 150 mg/kg, 300 mg/kg và 600 mg/kg đều đạt được mức giảm gần 10% so với nhĩm đối chứng sử dụng chlorpropamid [13]. Chiết xuất nước vỏ quả lựu liều 0,43 g/kg thể trọng chuột làm giảm nồng độ glucose máu là 57,14% so với nhĩm chuột bị tiểu đường sau 4 tuần cho chuột sử dụng liên tục, ngồi ra nồng độ insulin trong máu chuột cũng tăng lên đến 60% so với nhĩm chứng tiểu đường sau khi sử dụng chiết xuất nước vỏ quả lựu [29]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  24. 1.2.5.7. Tác dụng đối với bệnh béo phì Chuột đực C57BI/J6 được cho ăn 1g dầu hạt lựu/100 g chế độ ăn giàu chất béo trong 12 tuần làm giảm trọng lượng chuột so với nhĩm chứng [59]. Hontecillas nghiên cứu thấy dầu hạt lựu cĩ tác dụng cải thiện độ nhạy cảm với insulin trên chuột đực C57BI/J6 được cho ăn chế độ ăn giàu chất béo trong 12 tuần [23]. Chuột được cho ăn 1g axit caltapic trên 100 g thức ăn giàu chất béo trong 78 ngày cĩ sự cải thiện nồng độ glucose và nồng độ insulin so với nhĩm chứng. Axit punicic cũng làm tăng HDL cholesterol và giảm nồng độ triacylglycerol trong huyết tương [22]. 1.2.5.8. Độc tính của lựu Từ lâu nay, quả lựu được tiêu thụ rộng rãi ở khắp nơi trên thế giới và được đánh giá là an tồn khi sử dụng. Chiết xuất quả lựu khơng gây độc ở nồng độ và mức độ thường được sử dụng trong y học cổ truyền ở Cuba để điều trị các bệnh về đường hơ hấp mà gây độc ở liều cao hơn rất nhiều. Liều 0,4 mg/kg và 1,2 mg/kg khơng gây bất kỳ ảnh hưởng nào đến lượng thức ăn, cân nặng, hoạt động, thơng số sinh hĩa và mơ bệnh học của chuột, liều gây chết trung bình khi tiêm phúc mạc trên chuột là 731 mg/kg [58]. Sử dụng thuốc sắc được làm từ vỏ cây và một lượng thấp vỏ quả, cĩ thể gây viêm dạ dày cấp tính và thậm chí tử vong do sự hiện diện của cả tanin và alkaloid [52]. Nước quả lựu được báo cáo là ức chế enzyme chuyển hĩa cytochrom P450 3A (CYP3A) [21]. Sử dụng nước lựu trong quá trình điều trị bệnh cơ với rosuvastatin cho thấy nước lựu cĩ thể làm gia tăng nguy cơ tiêu cơ vân [51]. Một số người được báo cáo là dị ứng với lựu, những triệu chứng nghiêm trọng như sốc phản vệ, phù nề thanh quản đã xảy ra. Bệnh nhân dị ứng với lựu thường nhạy cảm với các chất gây dị ứng khác [18]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  25. Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu thực vật Dược liệu sử dụng là tồn bộ quả lựu chín (bao gồm: vỏ quả, thịt quả và hạt quả). Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật bởi Bộ mơn Dược liệu và Dược cổ truyền, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội. Quả lựu được rửa sạch và ngâm trong ethanol 50% (3 lần, mỗi lần 1,5L) ở nhiệt độ phịng. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gộp dịch lọc của cả ba lần, loại bỏ dung mơi bằng cách sử dụng máy cơ quay chân khơng ở nhiệt độ thu được cao tổng. 2.2.2. Động vật thí nghiệm Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng chủng Swiss, được mua từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, khỏe mạnh và trưởng thành. Chuột được nuơi trong điều kiện nhiệt độ 22±20C với chu kỳ sáng 12 giờ và tối 12 giờ, cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (được cấp từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương) trong 3 - 4 ngày để thích nghi với điều kiện mơi trường trước khi tiến hành thí nghiệm. 2.2. Dụng cụ và hĩa chất 2.2.1. Dụng cụ • Dụng cụ: phễu chiết, ống đong, bình tam giác, giấy lọc, phễu lọc, tủ hút, pipet, cốc cĩ mỏ 50 mL, 250 mL, 500 mL • Thiết bị: máy cơ quay chân khơng, tủ hút, tủ sấy, máy li tâm, máy siêu âm, bếp điện từ • Máy đo glucose huyết One Touch Ultra và que thử tương ứng. • Máy ly tâm Shimadzu - Nhật Bản. • Máy khuấy từ Shimadzu - Nhật Bản. • Máy cơ quay Shimadzu - Nhật Bản. 2.2.2. Hĩa chất • Dung mơi: ethanol • Streptozocin (250 mg, Aladdin, @ Trung School Quốc) of Medicine and Pharmacy, VNU • Gliclazide (DiamicronRMR 60 mg) 17
  26. • Nước muối sinh lý NaCl 0,9% • Dung dịch đệm citrate pH=4,3 (pha 250 ml đệm citrate gồm: 0,2966 g axit citric monohydrate và 0,2995g natri citrate dihydrat). 2.3. Phương pháp nghiên cứu Chuột được nuơi béo phì Mẫu quả lựu khơ Gây ĐTĐ typ 2 bằng cách Chiết bằng ethanol 50%, cơ tiêm STZ liều 120 mg/kg quay chân khơng Chuột cĩ nồng độ glucose huyết cao Cao ethanol Thử khả năng chống tăng đường huyết và lipid máu trên chuột ĐTĐ typ 2 Hình 2.1: Sơ đồ và phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu Để đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu của cao chiết quả lựu trên chuột nhắt trắng bị ĐTĐ typ 2, nghiên cứu được thiết kế qua hai giai đoạn: - Xây dựng mơ hình chuột ĐTĐ typ 2. - Đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu của cao chiết quả lựu trên chuột ĐTĐ typ 2. 2.3.1.1. Tạo mơ hình chuột béo phì Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng chủng Swiss, được mua từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, khỏe mạnh và trưởng thành. Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (được cấp từ Viện @ Vệ sinhSchool Dịch tễ of Trung Medicine ương) trong and 3 - 4Pharmacy, VNU 18
  27. ngày để thích nghi với điều kiện mơi trường, sau đĩ tiến hành phân ngẫu nhiên thành 2 nhĩm:  Nhĩm 1 (n= 20 con): chế độ ăn bình thường  Nhĩm 2 (n= 60 con): chế độ ăn giàu chất béo (40% hydratcacbon, 32% Lipid, 20% Protein, 2% Cholesterol, 4% chất khống, 2% vitamin và axit amin) Chuột nhĩm 1 được nuơi bằng chế độ ăn bình thường và chuột nhĩm 2 được nuơi bằng chế độ ăn giàu chất béo trong vịng 28 ngày liên tục. Sau 28 ngày nuơi, tiến hành cân trọng lượng để chọn lọc những con chuột đạt trọng lượng trên 40 g được coi là đạt tiêu chuẩn để tiến hành gây mơ hình đái tháo đường. 2.3.1.2. Gây ĐTĐ typ 2 từ chuột béo phì thực nghiệm bằng Streptozocin (STZ) Sau khi chuột được nuơi béo phì thực nghiệm thành cơng, tiến hành gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ. Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đĩi qua đêm, gây ĐTĐ nhĩm nuơi béo bằng cách tiêm phúc mạc chuột với liều duy nhất 120 mg/kg thể trọng, STZ được hịa tan trong đệm citrate 0,01M, pH=4,3. Nhĩm nuơi thường được tiêm đệm citrate. Sau đĩ, cho chuột ăn thức ăn bình thường, 10 ngày sau tiêm STZ hoặc dung dịch đệm, định lượng glucose máu ở đuơi chuột, chọn các chuột ở lơ tiêm STZ bị ĐTĐ (các chuột cĩ nồng độ glucose huyết lúc đĩi trên 10 mmol/L được coi là ĐTĐ) được tham gia nghiên cứu. 2.3.1.3. Phân lơ chuột thí nghiệm Sau khi gây được mơ hình ĐTĐ kiểu typ 2, chuột được chọn tiếp tục được tiến hành chia nhĩm để đánh giá khả năng chống tăng glucose máu và lipid máu của cao chiết quả lựu trong đĩ: nhĩm nuơi chế độ ăn bình thường ở giai đoạn trên được sử dụng làm nhĩm 1 (nhĩm chứng sinh lý) và các chuột bị ĐTĐ typ 2 được chia thành 4 nhĩm từ nhĩm 2 đến nhĩm 5: Nhĩm 1: Nhĩm chứng sinh lý, chuột bình thường, được cho uống nước muối sinh lý. Nhĩm 2: Nhĩm chứng bệnh ti ể@u đư Schoolờng: chuộ tof ĐTĐ Medicine typ 2 do tiêm and STZ Pharmacy, VNU khơng điều trị. 19
  28. Nhĩm 3: Nhĩm chứng dương: chuột ĐTĐ typ 2 được cho uống 5 mg/kg gliclazid (nhĩm thuốc đối chứng dương). Nhĩm 4: Chuột ĐTĐ typ 2 được cho uống 150 mg/kg thể trọng cao ethanol từ dịch chiết quả lựu. Nhĩm 5: Chuột ĐTĐ typ 2 được cho uống 300 mg/kg thể trọng cao ethanol từ dịch chiết quả lựu. 2.3.1.4. Tiến hành thí nghiệm Trong quá trình thí nghiệm, các lơ chuột đều được nuơi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm Khoa Y - Dược Đại học Quốc gia Hà Nội. Các lơ chuột được điều trị trong 21 ngày. Đường huyết được xác định vào 7 - 8 giờ sáng vào các ngày thứ 0, thứ 5, thứ 10, thứ 15 và thứ 21. Sau khi đo khoảng 60 phút chuột được cho ăn và uống nước bình thường. Sau 21 ngày, lấy máu chuột, tiến hành ly tâm và gửi đến Bệnh viện Đại học Y Hà Nội để phân tích các chỉ số hĩa sinh: cholesterol tổng, triglycerid, LDL cholesterol, HDL cholesterol. Hàng ngày theo dõi, ghi chép diễn biến và kết quả thí nghiệm. 2.3.1.5. Theo dõi thí nghiệm Để thí nghiệm đạt kết quả như mục tiêu đã đề ra, tình trạng chuột, vận động, bài tiết được theo dõi hàng ngày. Chuột được cân hằng ngày để xác định liều điều trị của chuột. 2.3.1.6. Tiến hành lấy mẫu thử nghiệm sau khi kết thúc đợt thí nghiệm Cho chuột nhịn ăn trước 24 giờ khi lấy mẫu. Chuột được gây mê bằng diethyl ether, dùng kim tiêm 1 mL để tiến hành lấy máu tim chuột. Sau 21 ngày điều trị, mẫu máu được thu thập vào các ống cĩ chứa heparin. Huyết thanh được tách ra bằng cách ly tâm ở 3000 vịng/phút ở 25°C trong 15 phút và được gửi đến bệnh viện Đại học Y Hà Nội để phân tích các chỉ số hĩa sinh: cholesterol tổng, LDL cholesterol, HDL cholesterol, triglycerid. 2.3.2. Phương pháp xác định một số chỉ số hĩa sinh máu 2.3.2.1. Định lượng Glucose máu theo giai đoạn thực nghiệm Máu sử dụng để định lượng glucose huyết là máu tồn phần lấy từ đuơi chuột. Định lượng glucose máu bằng @ máy School đo đườn gof huyết Medicine tự động và andbộ kít Pharmacy, VNU thử tương ứng (One touch ultra, Johnson & Johnson, USA) 20
  29. Nguyên tắc: Glucose trong máu phản ứng đặc hiệu với glucose oxidase (GOD) cĩ trong kit thử tạo thành axit gluconic và H2O2 (phản ứng 1). H2O2 tạo thành được peroxydase phân hủy giải phĩng oxy, oxy hĩa O - dianisidin tạo phức chất màu vàng nàu (phản ứng 2). Glucose oxidase Glucose + O axit gluconic + H2O2 (1) O - dianisidin + H2O2 phức hợp nâu vàng + H2O (2) 2.3.2.2. Định lượng Cholesterol trong huyết thanh Nguyên tắc: Thuỷ phân cholesterol este bằng enzym cholesterol esterase (CHE) và oxy hố bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4 - aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxidase. CHE Cholesterol este + H2O  Cholesterol + axit béo CHO Cholesterol + O2  Cholesterol–3– one + H2O2 Peroxidase 2H2O2 + 4 – aminophenazone + phenol  Quinonimin + H2O Tính kết quả: So mật độ quang của Quinonimin với ống chuẩn 2.3.2.3. Định lượng triglycerid trong huyết thanh Thuỷ phân triglycerid bằng enzym lipase, định lượng glycerol giải phĩng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4 - aminoantipyryl và 4 - chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau: lipoproteinlipase Triglycerid  Glycerol + axit béo glycerolkinase Glycerol + ATP  Glycerol–3–phosphate + ADP @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  30. glycerol 3 phosphate oxidase Glycerol – 3 – phosphate + O2 Dihydroxyacetone phosphate + H2O2 peroxidase H2O2 + Aminoantipyrine + 4 - chlorophenol Quinonimin + 4HCl + 4H2O Tính kết quả: Đo mật độ quang học quinonimin ở bước sĩng 546 nm rồi so với chuẩn của bộ KIT của hãng thương mại. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  31. Chương 3 - KẾT QUẢ 3.1. Kết quả gây mơ hình béo phì thực nghiệm Để đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu của cao chiết quả lựu trên chuột nhắt ĐTĐ typ 2, trước hết chúng tơi đã gây mơ hình ĐTĐ typ 2 trên chuột nhắt trắng. Chuột được gây béo phì hoặc tăng cân rõ rệt sau 28 ngày nuơi với chế độ ăn giàu chất béo và sau đĩ kết hợp tiêm STZ liều 120 mg/kg cân nặng để gây mơ hình chuột ĐTĐ typ 2. Kết quả gây mơ hình chuột ĐTĐ typ 2 như sau:  Sự thay đổi về thể trọng chuột trung bình của các nhĩm chuột thí nghiệm sau 28 ngày nuơi được thể hiện trong Bảng 3.1. Bảng 3.1. Thể trọng chuột sau 28 ngày nuơi theo mơ hình gây béo thực nghiệm Khối lượng (g) Thời gian (ngày) Nhĩm nuơi thường Nhĩm nuơi béo (n=20) (n=60) Ngày 0 15,3±1,14 15,1±1,32 Ngày 28 33,35±1,35 44,13±1,45 Thay đổi (%) ↑ 117,97% ↑ 192,25% Thay đổi so với đối chứng (%) ↑ 32,32% D0: Thể trọng chuột trước khi tiến hành thí nghiệm D28: Thể trọng chuột sau 28 ngày nuơi với hai chế độ ăn khác nhau @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  32. 50 44,13 45 40 33,35 35 30 lượng (g) lượng 25 Trọng 20 15,3 15,1 15 10 5 0 Lơ nuơi thường Lơ nuơi béo D 0 D 28 Hình 3.1. Thể trọng chuột sau 28 ngày nuơi theo mơ hình gây béo thực nghiệm Nhận xét: Nhĩm chuột ăn thức ăn bình thường sau 28 ngày nuơi thì khối lượng cơ thể tăng so với ngày bắt đầu thí nghiệm là 18,05 g (tăng 117,97 %), nhĩm chuột nuơi với chế độ ăn giàu chất béo thì khối lượng cơ thể tăng so với ngày đầu thí nghiệm là 29,03 g (tăng 192,25%). Chuột nuơi với chế độ ăn giàu chất béo cĩ khối lượng cơ thể lớn hơn chuột nuơi thường là 10,78 g tương đương tăng 32,32%. Như vậy cĩ thể kết luận chuột nuơi bằng thức ăn giàu chất béo đã tăng cân rõ rệt về khối lượng so với chuột nuơi chế độ ăn thức ăn thường.  Sự thay đổi nồng độ glucose máu của các nhĩm chuột thí nghiệm sau 10 ngày tiêm STZ liều 120 mg/kg thể trọng được thể hiện trong Bảng 3.2 Bảng 3.2. Nồng độ glucose máu của các nhĩm chuột sau 10 ngày tiêm STZ Glucose máu (mmol/L) Thời gian Nhĩm nuơi thường Nhĩm nuơi béo Trước khi tiêm 6,9 ± 0,56 6,72 ± 1,73 Sau khi tiêm 4 ngày 6,78 @ ± 1, School03 of Medicine10,34 ± 1,43 and Pharmacy, VNU 24
  33. Thay đổi (%) ↓ 1,74% ↑ 53,87% Sau khi tiêm 10 ngày 7,32 ± 1,22 16,22 ± 1,56 Thay đổi (%) ↑ 6,09% ↑ 141,37% 20 16,22 15 10 6,9 7,32 6,72 5 0 Nồng độ glucose máu (mmol/L) glucose độ Nồng máu Nhĩm nuơi thường Nhĩm nuơi béo D 0 D 10 Hình 3.2. Thể trọng chuột sau 28 ngày nuơi theo mơ hình gây béo thực nghiệm Nhận xét: Nồng độ glucose máu ở các thời điểm nghiên cứu nhĩm nuơi thường khơng cĩ sự khác biệt đáng kể so với trước nghiên cứu (p>0,05). Sau khi tiêm STZ 4 ngày, nồng độ glucose máu ở nhĩm chuột nuơi béo tăng 53,87% so với ban đầu và sau 10 ngày tiêm, nồng độ glucose máu đã tăng cao rõ rệt lên đến 141,37% so với ban đầu. 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng của dịch chiết quả lựu lên trọng lượng chuột Để tiến hành nghiên cứu tác dụng của dịch chiết quả lựu lên trọng lượng trên mơ hình chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm, chuột ĐTĐ typ 2 được điều trị trong 21 ngày bằng cách cho chuột uống cao pha trong nước cất của dịch chiết quả lựu vào buổi sáng. Trọng lượng chuột vào các ngày 0, 5, 10, 15, 21 được thể hiện trong Bảng 3.3. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  34. Bảng 3.3. Thể trọng chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng hai nồng độ khác nhau của dịch chiết quả lựu Thay đổi Ngày 0 (g) 5 (g) 10 (g) 15 (g) 21 (g) (%) Chứng 33,35±1,35 34,2±1 35,35±0,55 36,15±0,35 37,4±0,4 ↑ 12,14 sinh lý Chứng tiểu 42,55±1,45 45,15±1,65 46,05±2,05 48,1±1,3 49,4±1,3# ↑ 16,1 đường Gliclazid 45,6±1,2 45,05±1,55 43,6±0,8 43,05±0,95 43,1±1,8* ↓ 5,48 150 44,6±1,7 45,3±1,5 43,6±1,5 43,8±0,6 43,2±0,3* ↓ 3,14 mg/kg 300 45,1±1,2 44,35±0,55 43,1±0,3 43±1,4 43,2±1,2* ↓ 4,21 mg/kg *Khác biệt cĩ ý nghĩa so với nhĩm 2; # Khác biệt cĩ ý nghĩa so với nhĩm 1. 60 49,4 50 45,6 44,6 45,1 42,55 43,1 43,2 43,2 40 37,4 33,35 30 20 Trọng lượng (g) lượng Trọng 10 0 Nhĩm 1 Nhĩm 2 Nhĩm 3 Nhĩm 4 Nhĩm 5 D 0@ DSchool 21 of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  35. Hình 3.3. Thể trọng chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng hai nồng độ khác nhau của dịch chiết quả lựu D 0: cân nặng chuột trước ngày điều trị D 21: cân nặng chuột sau 21 ngày điều trị Nhận xét: Từ số liệu Bảng 3.3 và Hình 3.3 nhận thấy rằng sau 21 ngày điều trị, nhĩm chứng sinh lý và nhĩm chứng tiểu đường khơng điều trị chỉ cho uống nước khơng cho uống dịch chiết thì khối lượng chuột tăng dần đặc biệt là nhĩm chứng tiểu đường tăng 16,1% cịn nhĩm chứng sinh lý tăng 12,14%. Trong khi đĩ các nhĩm chuột được điều trị bằng gliclazid và lượng cao chiết khác nhau của dịch chiết quả lựu thì khối lượng cơ thể chuột giảm. Mức độ giảm mạnh nhất là ở nhĩm chuột cho uống gliclazid giảm 5,48%; tiếp đến là nhĩm cho uống dịch chiết cao ethanol liều 300 mg/kg (4,21%) và cuối cùng nhĩm điều trị bằng dịch chiết cao ethanol liều 150 mg/kg (3,14%). Mức độ giảm thể trọng ở các nhĩm chuột cho uống cao chiết là khơng tuyến tính. Từ kết quả trên cĩ thể kết luận rằng dịch chiết quả lựu cĩ tác dụng kìm hãm cân nặng của chuột. 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng của dịch chiết quả lựu lên một số chỉ số hĩa sinh trong máu chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm. 3.3.2. Nồng độ Glucose máu chuột ĐTĐ typ 2 Trong 21 ngày cho uống dịch chiết, chuột được lấy máu đuơi vào các ngày 0, 5, 10, 15, 21 để xác định nồng độ glucose máu. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết quả lựu lên nồng độ glucose máu Thay Ngày 0 5 10 15 21 đổi (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (%) Chứng 6,75±1,25 7,25±2,14 6,6±2,19 6,7±1,58 6,85±1,377 ↑ 1,48 sinh lý Chứng tiểu 16,6±3,28 16,8±3,14 17,1±2,69 16,9±3,24 17,2±2,34# ↑ 3,61 đường Gliclazid 16,1±2,67 15,8±2,51 16,28±2,69 15,72±3,81 13,65±3,69* ↓ 15,22 150 15,8±3,64 15,41±2,87 13,6± @3,19 School 14,51± of2,14 Medicine 13,53±3,16* and↓ 14,37 Pharmacy, VNU mg/kg 27
  36. 300 15,6±2,57 15,36±2,34 13,26±2,39 12,88±3,27 11,4±3,12* ↓ 26,9 mg/kg *Khác biệt cĩ ý nghĩa so với nhĩm 2; # Khác biệt cĩ ý nghĩa so với nhĩm 1 25 16,6 17,2 16,1 15,8 20 15,6 13,65 13,53 15 11,40 10 6,75 6,85 5 0 Nồng độ glucose máu (mmol/L) glucose độ Nồng máu Nhĩm 1 Nhĩm 2 Nhĩm 3 Nhĩm 4 Nhĩm 5 D 0 D 21 Hình 3.4. Chỉ số glucose máu của các nhĩm chuột trước và sau điều trị 21 ngày Nhận xét: Từ số liệu Bảng 3.4 và Hình 3.4 cho thấy, nhĩm chứng sinh lý cĩ nồng độ glucose máu tăng nhẹ và khá ổn định ở mức bình thường, nhĩm chuột tiểu đường cũng tăng nhẹ và mức nồng độ glucose máu cao. Tất cả các nhĩm chuột điều trị bằng gliclazid và hai liều khác nhau của cao chiết ethanol quả lựu đều giảm nồng độ glucose máu, nhĩm điều trị bằng gliclazid giảm nhiều nhất (17,79%), tiếp đến là nhĩm được điều trị bằng cao chiết ethanol liều 300 mg/kg (9,35%) và cuối cùng là liều 150 mg/kg (5,04%). 3.3.1. Ảnh hưởng của dịch chiết quả lựu đối với tình trạng tăng lipid máu Tiến hành đánh giá sự thay đổi một số chỉ tiêu hĩa sinh trong máu chuột sau khi điều trị, so sánh sự biến đổi của các chỉ số cholesterol tổng, triglycerid, HDL cholesterol, LDL cholesterol với nhĩm chuột ăn thức ăn bình thường (nhĩm chứng sinh lý) và nhĩm chuột ăn thức ăn cĩ hàm lượng chất béo cao (nhĩm chứng tiểu đường). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  37. Bảng 3.5. Ảnh hướng của dịch chiết quả lựu đối với các chỉ số lipid máu Cholesterol tổng Triglycerid HDLc LDLc (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) Chứng sinh lý 43,78±7,54 56,23±4,36 34,45±2,31 12,36±2,14 Chứng tiểu 78,69±5,3# 98,34±5,17# 23,12±3,18# 37,21±2,35# đường Gliclazid 36,48±5,73* 38,45±8,35* 36,31±4,21* 15,35±2,39* 150 mg/kg 56,88±6,36* 62,14±8,39* 26,12±2,47* 26,14±2,37* 300 mg/kg 46,39±4,35* 48,76±7,21* 32,47±5,36* 19,36±2,41* *Khác biệt cĩ ý nghĩa so với nhĩm 2; # Khác biệt cĩ ý nghĩa so với nhĩm 1 Nhận xét: Sau 21 ngày điều trị, hàm lượng cholesterol tổng, triglycerid và LDL cholesterol máu chuột ở các nhĩm điều trị bằng gliclazid và cao chiết quả lựu đều giảm so với nhĩm khơng điều trị. Nhĩm chuột điều trị bằng gliclazid giảm cholesterol tổng 53,64% so với nhĩm chứng tiểu đường, nhĩm điều trị bằng cao chiết quả lựu liều 150 mg/kg, 300 mg/kg giảm lần lượt 27,72% và 41,05%, sự thay đổi cĩ ý nghĩa thống kê. Cao chiết quả lựu liều 150 mg/kg làm giảm chỉ số triglycerid 36,81% và giảm LDL cholesterol 29,75% so với nhĩm chứng tiểu đường. Cao chiết liều 300 mg/kg giúp giảm chỉ số triglycerid 50,42% và giảm LDL cholesterol 47,97% so với nhĩm chứng tiểu đường. Như vậy cao chiết lựu liều 300 mg/kg giúp giảm cholesterol tổng, triglycerid, LDL cholesterol tốt hơn so với liều 150 mg/kg. HDL cholesterol là một lipoprotein cĩ vai trị quan trọng trong việc vận chuyển cholesterol ra khỏi máu và ngăn khơng cho chúng xâm nhập vào thành động mạch giúp làm giảm các nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Do đĩ, việc nâng hàm lượng HDL cholesterol trong máu cĩ ý nghĩa rất quan trọng với cơ thể con người. Trong nghiên cứu này, cao chiết quả lựu 150 mg/kg cĩ tác dụng làm tăng 11,49% và liều 300 mg/kg làm tăng 28,8% HDL cholesterol so với nhĩm chứng tiểu đường. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  38. Chương 4 - BÀN LUẬN Bệnh ĐTĐ typ 2 đặc trưng bởi sự đề kháng insulin và suy giảm chức năng tiết insulin của các tế bào β đảo tụy. Dựa trên cơ sở này, nhiều mơ hình ĐTĐ thực nghiệm đã được xây dựng theo xu hướng tạo sự đề kháng với insulin và/hoặc làm suy giảm chức năng các tế bào β đảo tụy. Nhu cầu xây dựng các mơ hình này càng lớn hơn khi việc phát hiện, nghiên cứu và đánh giá tác dụng các thuốc điều trị ĐTĐ cĩ nguồn gốc từ thiên nhiên đang trở thành một xu hướng ngày càng được chú trọng và phát triển. Cĩ thể gây ĐTĐ typ 2 bằng nhiều phương pháp. Mỗi mơ hình đều cĩ những ưu, nhược điểm riêng trong việc gây ra ĐTĐ typ 2 và ứng dụng nĩ trong thực nghiệm. Nhằm đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu trên chuột bị ĐTĐ typ 2, mơ hình kết hợp giữa chế độ ăn giàu chất béo và sử dụng hĩa chất STZ liều 120 mg/kg thể trọng chuột đã được lựa chọn. Béo phì đĩng vai trị quan trọng gây nên tình trạng kháng insulin. Dựa trên cơ sở đĩ trong mơ hình nghiên cứu này, chuột được nuơi với chế độ ăn giàu chất béo nhằm gây nên tình trạng béo phì để làm tăng khả năng kháng insulin. Sự tổn thương tế bào β đảo tụy làm giảm tiết insulin là cơ chế khơng thể thiếu trong bệnh sinh ĐTĐ typ 2 vì vậy cần kết hợp với tiêm STZ sau khi nuơi béo để gây tổn thương đảo tụy trên nền đề kháng insulin, gây ĐTĐ typ 2. STZ là kháng sinh tổng hợp gây tổn thương tế bào β được sử dụng nhiều trong các mơ hình gây ĐTĐ. Cĩ nhiều nghiên cứu sử dụng STZ với các mức liều khác nhau và qua đĩ các nghiên cứu đã thể hiện rằng mức liều khác nhau chỉ làm tổn thương tế bào β nhiều hay ít. Từ nhiều nghiên cứu của tác giả trong và ngồi nước, liều 120 mg/kg được lựa chọn trong nghiên cứu này và kết hợp với chế độ ăn giàu chất béo để gây ĐTĐ typ 2 trên chuột nhắt trắng. Mơ hình được đảm bảo dựa trên cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 với chi phí thấp, dễ thực hiện và hữu ích trong các mơ hình đánh giá tiền lâm sàng với các thuốc cĩ tiềm năng điều trị ĐTĐ. Trong mơ hình nghiên cứu này, ngồi việc so sánh với nhĩm chứng sinh lý và nhĩm chứng tiểu đường được cho uống nước cất, cịn sử dụng gliclazid làm thuốc đối chứng dương. Gliclazid thuộc thế hệ thứ hai nhĩm sulfonylure được sử dụng để điều trị ĐTĐ, kích thích tế bào β sản xuất insulin do đĩ làm giảm nồng độ glucose trong máu, được @ sửSchool dụng cho of các Medicine bệnh nhân bị and ĐTĐ Pharmacy, VNU khơng phụ thuộc insulin. 30
  39. Kết quả thực nghiệm cho thấy: trên chuột nhắt trắng bị gây ĐTĐ typ 2, sau 21 ngày uống cao chiết lựu liều 150 mg/kg và 300 mg/kg đã gây giảm nồng độ glucose máu lần lượt là 14,37% và 26,9 % so với nhĩm chứng bệnh, sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê với p<0,05, mức liều 300 mg/kg giảm cao hơn mức hạ glucose máu của gliclazid so với nhĩm chứng là 20,64%. Cho tới thời điểm này, mới chỉ tìm thấy một nghiên cứu của S. Radhika và cộng sự sử dụng bột khơ liều 100 mg/kg từ quả lựu cho thấy làm giảm nồng độ glucose, triglycerid, cholesterol tổng, cholesterol LDL và tăng nồng độ HDL cholesterol [43].Tuy nhiên, những bộ phận riêng lẻ của quả lựu là hạt, vỏ, và nước quả lựu đã được nghiên cứu rất nhiều. Nghiên cứu của Das AK và cộng sự cho thấy rằng chuột bị gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ sau khi cho uống chiết xuất methanol hạt lựu liều 150 mg/kg, 300 mg/kg và 600 mg/kg đều đạt được mức giảm gần 10% so với nhĩm đối chứng được cho uống thuốc kiểm sốt đường huyết là chlorpropamid. Một nghiên cứu khác trên bộ phận dùng là vỏ đã được Das AK và cộng sự nghiên cứu đánh giá khả năng làm giảm glucose máu trên chuột ĐTĐ typ 2. Sau 4 tuần sử dụng chiết xuất nước vỏ quả lựu liều 430 mg/kg, nồng độ glucose máu được đánh giá là giảm 57,14% so với nhĩm chuột bị tiểu đường [13]. Vỏ quả lựu cịn được đánh giá tác dụng hạ glucose huyết liều 100 mg/kg và 200 mg/kg thể trọng trên chuột cống trắng chủng Wistar. Kết quả nghiên cứu báo cáo liều 200 mg/kg chiết xuất vỏ làm giảm đáng kể nồng độ glucose huyết từ ngày thứ 7. Mức giảm đường huyết trung bình lần lượt của chiết xuất vỏ 100 mg/kg, 200 mg/kg và thuốc đối chứng dương glibenclamide lần lượt là 20,03%, 42,75% và 51,33% [49]. Với nhĩm chuột được điều trị, dịch chiết lựu cĩ khả năng làm giảm nồng độ glucose huyết cĩ thể là do cĩ chứa hàm lượng cao các hợp chất phenolic. Vishal Jain và cộng sự đã phân lập thành cơng và đánh giá hoạt động chống ĐTĐ của các thành phần hĩa học từ vỏ quả lựu bao gồm cả in vitro và in vivo. Họ đã phân lập được axit valoneic dilactone trong dịch chiết với dung mơi methanol và đánh giá khả năng ức chế aldose reductase, α - amylase và PTP1B (Protein tyrosine phosphatase 1B) trong ống nghiệm. Kết quả đã cho thấy hoạt động chống đái tháo đường mạnh trong các thử nghiệm ức chế α - amylase, aldose reductase và PTP1B với các giá @ trị SchoolIC50 lần lư ợtof đạt Medicine 0,284; 0,788; and 12,41 Pharmacy, VNU µg/mL [26]. Hơn nữa trong mơ hình tiểu đường in vivo, cả chiết xuất vỏ lựu và 31
  40. axit valoneic dilactone đều cho thấy sự bảo vệ đối với mơ tụy bị gây độc bởi alloxan. Các chỉ số lipid máu đã được xác định là đĩng vai trị quan trọng trong sinh bệnh học của ĐTĐ. Mức độ lipid máu thường tăng cao ở bệnh nhân ĐTĐ và được đánh giá như một yếu tố nguy cơ của bệnh tim mạch. Do đĩ trong nghiên cứu này, các chỉ số lipid máu sau khi chuột được điều trị cũng là thơng số được xác định. Sau 21 ngày uống cao chiết liều 150 mg/kg và 300 mg/kg, các chỉ số cholesterol tổng, LDL cholesterol, triglycerid trong huyết thanh chuột đều giảm so với nhĩm chứng tiểu đường (p<0,05) và chỉ số HDL cholesterol tăng so với nhĩm chứng tiểu đường (p<0,05). Cho đến nay trên thế giới chưa cĩ nghiên cứu nào nghiên cứu tác dụng của tồn bộ quả lựu lên các chỉ số lipid máu. Nghiên cứu của Salwe KJ báo cáo rằng chiết xuất vỏ quả lựu liều 200 mg/kg giúp làm giảm đáng kể cholesterol tổng, triglycerid và cịn gia tăng đáng kể HDL cholesterol [49]. Tuy nhiên theo nghiên cứu của Esmaillzadeh A và cộng sự thực hiện trên đối tượng là bệnh nhân ĐTĐ typ 2 cho thấy sử dụng nước ép quả lựu 40 g/ngày trong 8 tuần làm giảm đáng kể cholesterol tổng, LDL cholesterol, tỷ lệ LDL/HDL và tỷ lệ cholesterol tổng/HDL nhưng khơng cĩ sự thay đổi đáng kể nồng độ triacylglycerol và HDL cholesterol trong huyết thanh [15]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  41. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Xuất phát từ 2 mục tiêu nghiên cứu ban đầu, chúng tơi đã tiến hành nghiên cứu và kết quả thực nghiệm đưa đến các kết luận sau: - Đã tạo được mơ hình chuột ĐTĐ typ 2 trên nền chuột béo phì thực nghiệm: sau 8 tuần nuơi trọng lượng cơ thể của chuột béo phì tăng lên so với chuột bình thường. Những con chuột đủ tiêu chuẩn cĩ trọng lượng trên 40 mg được tiêm STZ liều 120 mg/kg. Sau 10 ngày tiêm STZ, mơ hình gây ĐTĐ typ 2 đã thành cơng với nồng độ glucose máu lúc đĩi đạt trên 10 mmol/L. - Sau 21 ngày chuột ĐTĐ typ 2 được điều trị bằng cao chiết quả lựu với 2 mức liều 150 mg/kg và 300 mg/kg, thể trọng chuột và các chỉ số hĩa sinh: glucose, cholesterol tổng, triglycerid, LDL cholesterol trong máu đều biểu hiện giảm trong khi đĩ cao chiết lựu giúp làm tăng HDL cholesterol. - Cao chiết ethanol quả lựu với mức liều 300 mg/kg cĩ khả năng làm giảm glucose máu tốt ở chuột ĐTĐ typ 2 sau 21 ngày điều trị với mức giảm là 26,9% trong khi đĩ điều trị bằng thuốc gliclazide khả năng giảm là 15,22%. - Cao chiết ethanol quả lựu với mức liều 300 mg/kg cĩ khả năng làm giảm cholesterol tổng, triglycerid, LDL cholesterol lần lượt là 41,05%; 50,42%; 47,97% so với nhĩm chứng tiểu đường. Đề xuất Từ những kết quả nghiên cứu như trên, nhĩm nghiên cứu đưa ra đề xuất như sau: - Cần tiếp tục nghiên cứu, tìm hiểu sâu hơn về thành phần hĩa học của các hợp chất tự nhiên cĩ trong quả lựu, đặc biệt là xác định thành phần và cấu trúc hĩa học của các hợp chất từ phân đoạn cao tổng ethanol quả lựu cĩ hiệu quả chống tăng glucose máu và lipid máu ở chuột ĐTĐ typ 2. - Tiếp tục nghiên cứu liều lượng điều trị tối ưu của các phân đoạn dịch chiết khác xuất phát từ cao tổng ethanol trên mơ hình chuột béo phì và đái tháo đường. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  42. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đồn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Tồn (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 191-196. [2] Bệnh viện Nội tiết Trung ương (2013), Báo cáo Hội nghị tổng kết hoạt động của Dự án phịng chống đái tháo đường quốc gia năm 2012 và triển khai kế hoạch năm 2013. [3] Nguyễn Thị Đơng (2013), "Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết phân đoạn cloroform thân cây ý dĩ trên động vật thực nghiệm", luận văn tốt nghiệp thạc sĩ. [4] Phùng Thanh Hương và Nguyễn Xuân Thắng (2010), "Tác dụng hạn chế tăng glucose huyết của thân cây Mướp đắng trên một số mơ hình gây tăng glucose huyết thực nghiệm", Tạp chí Dược học, 1, 22-25. [5] Đỗ Tất Lợi (2007), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học. [6] Đỗ Trung Quân (2007), Đái tháo đường và điều trị, Nhà xuất bản y học, Hà Nội. [7] Đỗ Quốc Việt, Trần Văn Sung và Nguyễn Thanh Thủy (2006), "Sơ bộ nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cây Chuối hột (Musa balbisiana Colla.) trên chuột thực nghiệm", Tạp chí Dược học, 5, 8-10. [8] American Diabetes Association (2017), "Standards of Medical Care in Diabetes", 40(1), 11-75. [9] Arulmozhi DK, Veeranjaneyulu A and Bodhankar SL (2004), "Neonatal streptozotocin-induced rat model of Type 2 diabetes mellitus: A glance", Indian Journal of Pharmacology, 36(4), 217. [10] Aviram M and Dornfeld L (2001), "Pomegranate juice consumption inhibits serum angiotensin converting enzyme activity and reduces systolic blood pressure", Atherosclerosis, 158(1), 195-198. [11] Aviram M, Dornfeld L, Rosenblat M, Volkova N, Kaplan M, Coleman R, Hayek T, Presser D and Fuhrman B (2000), "Pomegranate juice consumption reduces oxidative stress, atherogenic modifications to LDL, and platelet aggregation: studies in humans and in atherosclerotic apolipoprotein E–deficient mice", The American journal of clinical nutrition, 71(5), 1062-1076. [12] Braga LC, Leite AA, Xavier KGS, Takahashi JA, Bemquerer MP, Chartone-Souza E and Nascimento AM (2005), "Synergic interaction between pomegranate extract and antibiotics against Staphylococcus aureus", Canadian journal of microbiology @ School, 51(7), of 541Medicine-547. and Pharmacy, VNU
  43. [13] Das AK, Mandal SC, Banerjee SK, Sinha S, Saha BP and Pal M (2001), "Studies on the hypoglycaemic activity of Punica granatum seed in streptozotocin induced diabetic rats", Phytother Res, 15(7), 628-9. [14] El-Nemr S. E., Ismail I. A. Ragab M. (1990), "Chemical composition of juice and seeds of pomegranate fruit", Food / Nahrung, 34(7), 601-606. [15] Esmaillzadeh A, Tahbaz F, Gaieni I, Alavi-Majd H and Azadbakht L (2006), "Cholesterol-lowering effect of concentrated pomegranate juice consumption in type II diabetic patients with hyperlipidemia", Int J Vitam Nutr Res, 76(3), 147-51. [16] Fadavi A, Barzegar M and Azizi MH (2006), "Determination of fatty axits and total lipid content in oilseed of 25 pomegranates varieties grown in Iran", Journal of Food Composition and Analysis, 19(6-7), 676-680. [17] Fischer UA, Carle R and Kammerer DR (2011), "Identification and quantification of phenolic compounds from pomegranate (Punica granatum L.) peel, mesocarp, aril and differently produced juices by HPLC-DAD–ESI/MSn", Food chemistry, 127(2), 807-821. [18] Gaig P, Bartolome B, Lleonart R, García‐Ortega P, Palacios R and Richart C (1999), "Allergy to pomegranate (Punica granatum)", Allergy, 54(3), 287-288. [19] Gil MI, Tomás-Barberán FA, Hess-Pierce B, Holcroft DM and Kader AA (2000), "Antioxidant activity of pomegranate juice and its relationship with phenolic composition and processing", Journal of Agricultural and Food chemistry, 48(10), 4581-4589. [20] Gĩmez-Caravaca AM, Verardo V, Toselli M, Segura-Carretero A, Fernández-Gutiérrez A MF Caboni (2013), "Determination of the major phenolic compounds in pomegranate juices by HPLC–DAD–ESI-MS", Journal of agricultural and food chemistry, 61(22), 5328-5337. [21] Hidaka M, Okumura M, Fujita K, Ogikubo T, Yamasaki K, Iwakiri T, Setoguchi N and Arimori K (2005), "Effects of pomegranate juice on human cytochrome p450 3A (CYP3A) and carbamazepine pharmacokinetics in rats", Drug metabolism and disposition, [22] Hontecillas R, Diguardo M, Duran E, Orpi M and Bassaganya-Riera J (2008), "Catalpic axit decreases abdominal fat deposition, improves glucose homeostasis and upregulates PPAR alpha expression in adipose tissue", Clinical nutrition, 27(5), 764-772. [23] Hontecillas R, O'Shea M, Einerhand A, Diguardo M and Bassaganya- Riera J (2009), "Activation of PPAR γ and α by Punicic Axit Ameliorates mGlucose Tolerance and Suppresses Obesity-Related Inflammation", Journal of the American College of Nutrition, 28(2), 184-195. [24] Hui H, Tang G and Go VLW (2009), "Hypoglycemic herbs and their action mechanisms", Chin Med, @4(1), School 11-14. of Medicine and Pharmacy, VNU [25] International Diabetes Foudation, Diabetes Atlas Eighth Edition, 2017.
  44. [26] Jain V, Viswanatha GL, Manohar D and Shivaprasad HN (2012), "Isolation of Antidiabetic Principle from Fruit Rinds of Punica granatum", Evid Based Complement Alternat Med, 2012. [27] Junod ALAEOLPRCAERAE, Lambert AE, Orci L, Pictet R, Gonet AE and Renold AE (1967), "Studies of the diabetogenic action of streptozotocin", Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 126(1), 201-205. [28] Kanatt SR, Chander R and Sharma A (2010), "Antioxidant and antimicrobial activity of pomegranate peel extract improves the shelf life of chicken products", International journal of food science & technology, 45(2), 216-222. [29] Khalil and Enas AM (2004), "Antidiabetic effect of an aqueous extract of Pomegranate (Punica granatum L.) peels in normal and alloxan diabetic rats", The Egyptian Journal of Hospital Medicine, 16(1), 92-99. [30] Ktorza A, Bernard C, Parent V, Pénicaud L, Froguel P, Lathrop M and Gauguier D (1997), "Are animal models of diabetes relevant to the study of the genetics of non-insulin-dependent diabetes in humans?", Diabetes & metabolism, 23, 38-46. [31] Kumar S, Singh R, Vasudeva N and Sharma S (2012), "Acute and chronic animal models for the evaluation of anti-diabetic agents", Cardiovascular Diabetology, 11(1), 9. [32] Lansky EP, Jian W, Mo H, Bravo L, Froom P, Yu W, Harris NM, Neeman I and Campbell MJ (2005), "Possible synergistic prostate cancer suppression by anatomically discrete pomegranate fractions", Invest New Drugs, 23(1), 11-20. [33] Lee CJ, Chen LG, Liang WL and Wang CC (2010), "Anti-inflammatory effects of Punica granatum Linne in vitro and in vivo", Food chemistry, 118(2), 315-322. [34] Lenze S (2008), "The mechanisms of alloxan-and streptozotocin-induced diabetes", Diabetologia, 51(2), 216-226. [35] Li Y, Guo C, Yang J, Wei J, Xu J and Cheng S (2006), "Evaluation of antioxidant properties of pomegranate peel extract in comparison with pomegranate pulp extract", Food chemistry, 96(2), 254-260. [36] McIntosh CHS and Pederson RA (1999), "Noninsulin-dependent animal models of diabetes mellitus", Experimental models of diabetes, 337-398. [37] Menezes SMS, Cordeiro LN and Viana GSB (2006), "Punica granatum (pomegranate) extract is active against dental plaque", Journal of herbal pharmacotherapy, 6(2), 79-92. [38] Neurath AR, Strick N, Li YYand Debnath AK (2004), "Punica granatum (Pomegranate) juice provides an HIV-1 entry inhibitor and candidate topical microbicide", BMC Infectious diseases, 4(1), 41. [39] Orwa et al (2009), "Agroforestry @ Database School 4.0", of Medicine and Pharmacy, VNU
  45. [40] Ưzgül-Yücel S (2005), "Determination of conjugated linolenic axit content of selected oil seeds grown in Turkey", Journal of the American Oil Chemists' Society, 82(12), 893-897. [41] Oztürk Y, Altan VM and Yildizoğlu-Ari N (1996), "Effects of experimental diabetes and insulin on smooth muscle functions", Pharmacological reviews, 48(1), 69-112. [42] Pellegrino M, Christopher B, Michelle M and Gerard R (1998), "Development of a new model of type II diabetes in adult rats administered with streptozotocin and nicotinamide", Diabetes, 47, 224- 229. [43] Radhika S, Smila KH and Muthezhilan R (2011), "Antidiabetic and Hypolipidemic Activity of Punica granatum Linn on Alloxan Induced Rats ", 6(4), 178-182. [44] Rasheed Z, Akhtar N, Anbazhagan AN, Ramamurthy S, Shukla M TM and Haqqi (2009), "Polyphenol-rich pomegranate fruit extract (POMx) suppresses PMACI-induced expression of pro-inflammatory cytokines by inhibiting the activation of MAP Kinases and NF-κB in human KU812 cells", Journal of inflammation, 6(1), 1. [45] Rees DA and Alcolado JC (2005), "Animal models of diabetes mellitus", Diabetic medicine, 22(4), 359-370. [46] Rerup CC (1970), "Drugs producing diabetes through damage of the insulin secreting cells", Pharmacological reviews, 22(4), 485-518. [47] Rocha A, Wang L, Peniche M and Martins-Green M (2012), "Pomegranate juice and specific components inhibit cell and molecular processes critical for metastasis of breast cancer", Breast Cancer Res Treat, 136(3), 647-58. [48] Rosenblat M, Hayek T and Aviram M (2006), "Anti-oxidative effects of pomegranate juice (PJ) consumption by diabetic patients on serum and on macrophages", Atherosclerosis, 187(2), 363-371. [49] Salwe KJ, Sachdev DO, Bahurupi Y and Kumarappan M (2015), "Evaluation of antidiabetic, hypolipedimic and antioxidant activity of hydroalcoholic extract of leaves and fruit peel of Punica granatum in male Wistar albino rats", Journal of natural science, biology, and medicine, 6(1), 56. [50] Seeram NP, Adam LS, Henning SM, Niu Y, Zhang Y, Nair MG and Heber D (2005), "In vitro antiproliferative, apoptotic and antioxidant activities of punicalagin, ellagic axit and a total pomegranate tanin extract are enhanced in combination with other polyphenols as found in pomegranate juice", The Journal of nutritional biochemistry, 16(6), 360-367. [51] Soroki AV, Duncan B, Panetta R and Thompson PD (2006), "Rhabdomyolysis associated with pomegranate juice consumption", The American journal of cardiology, 98(5), 705-706. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  46. [52] Squillaci G Maggio G and Di (1946), "Acute morbidity and mortality from decoctions of the bark of Punica granatum", Bollettino Societa Italiana Biologia Sperimentale, 1946, 1095-1096. [53] Sreeja S, Kumar TR Santhosh, Lakshmi BS and Sreeja S (2012), "Pomegranate extract demonstrate a selective estrogen receptor modulator profile in human tumor cell lines and in vivo models of estrogen deprivation", The Journal of Nutritional Biochemistry, 23(7), 725-732. [54] Sumner MD, Elliott-Eller M, Weidner G, Daubenmier JJ, Chew MH, Marlin R, Raisin CJ and Ornish D (2005), "Effects of pomegranate juice consumption on myocardial perfusion in patients with coronary heart disease", The American journal of cardiology, 96(6), 810-814. [55] Tabák AG, Herder C, Rathann W and Brunner EJ (2012), "Prediabetes: a high-risk state for diabetes development", The Lancet, 379(9833), 2279- 2290. [56] Tzulker R, Glazer I, Bar-Ila I, Holland M D, Aviram M and Amir R (2007), "Antioxidant activity, polyphenol content, and related compounds in different fruit juices and homogenates prepared from 29 different pomegranate accessions", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55(23), 9559-9570. [57] Vasconcelos LCDS, Sampaio FC, Sampaio MCC, Pereira MDSV, Higino JS and Peixoto MHP (2006), "Minimum inhibitory concentration of adherence of Punica granatum Linn (pomegranate) gel against S. mutans, S. mitis and C. albicans", Brazilian Dental Journal, 17(3), 223-227. [58] Vida A, Fallarero A, Peđa BR, Medina ME, Gra B, Rivera F and Gutierrez Y (2003), "Studies on the toxicity of Punica granatum L.(Punicaceae) whole fruit extracts", Journal of ethnopharmacology, 89(2-3), 295-300. [59] Vroegrijk IO, Diepen JA van, Berg S van den, Westbroek I, Keizer H, Gambelli L, Raque l Hontecillas, Bassaganya-Riera J, Zondag GC, Romijn JA, Havekes LM and Voshol PJ (2011), "Pomegranate seed oil, a rich source of punicic axit, prevents diet-induced obesity and insulin resistance in mice", Food and Chemical Toxicology, 49(6), 1426-1430. [60] Wadkar KA, Magdum CS, Patil SS and Naikwade NS (2008), "Antidiabetic potential and Indian medicinal plants", J Herbal Med and Toxicol, 2(1), 45-50. [61] Wang L, Li W, Lin M, Garcia M, Mulholland D, Lilly M and MartinsGreen M (2014), " Luteolin, ellagic axit and punicic axit are natural products that inhibit prostate cancer metastasis. Carcinogenesis", Carcinogenesis 35(10), 2321–2330. [62] Weiss RB (1982), "Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity", Cancer treatment reports, 66(3), 427-438. [63] Young DA, Ho RS, Bell PA, Cohen DK, McIntosh RH, Nadelson J and Foley JE (1990), "Inhibition of@ hepatic School glucose of Medicine production by and SDZ Pharmacy, VNU 51641", Diabetes, 39(11), 1408-1413.
  47. [64] 2l-pot-tasty-fruit/ Ngày truy cập 05/05/2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU