Đồ án Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic xử lý hạt giống đậu phộng

198 trang thiennha21 13/04/2022 6770

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic xử lý hạt giống đậu phộng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_ung_dung_vi_khuan_len_men_lactic_xu_ly_hat_giong_dau_p.pdf

Nội dung text: Đồ án Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic xử lý hạt giống đậu phộng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC XỬ LÝ HẠT GIỐNG ĐẬU PHỘNG Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: TS. NGUYỄN HỒI HƯƠNG SVTH: NGUYỄN THANH HIẾU MSSV: 1411100748 Lớp: 14DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 8/2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC XỬ LÝ HẠT GIỐNG ĐẬU PHỘNG Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: TS. NGUYỄN HỒI HƯƠNG SVTH: NGUYỄN THANH HIẾU MSSV: 1411100748 Lớp: 14DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 8/2018
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thơng tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Sinh viên thực hiện luận văn Nguyễn Thanh Hiếu i
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Cơng nghệ TP. HCM đã tạo điều kiện cho chúng em được học tập tại Trường. Em cũng xin chân thành biết ơn sự dạy dỗ tận tình của tồn thể quý thầy cơ Viện Khoa học Ứng dụng Hutech, Trường Đại học Cơng nghệ TP. HCM đã cho chúng em những kiến thức quan trọng trong suốt thời gian qua, nhờ vậy chúng em mới cĩ được những tri thức quý giá để làm hành trang cho con đường sự nghiệp phía trước. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Hồi Hương đã trang bị cho em những kiến thức bổ ích và luơn theo sát quá trình làm việc của em để kịp thời hướng dẫn cũng như khắc phục những lỗi sai để cơng việc đạt kết quả tốt nhất. Cơ luơn chia sẽ cũng như động viên em khi cơng việc chưa ổn và giúp em tìm được niềm vui khi thấy được thành quả mình sắp gặt hái được. Em xin được bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã tiếp cho em nghị lực, sự bình yên trong tâm hồn, luơn bên em những lúc khĩ khăn. Em cũng xin được cảm ơn tới những người bạn đã gắn bĩ, động viên và giúp đỡ em suốt quãng thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp. Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy/Cơ trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này. Em xin gửi đến Thầy/Cơ lời chúc sức khỏe va. Trong quá trı̀nh làm đồ án, do kinh nghiệm còn thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên cĩ nhiều thiếu sĩt, mong các Thầy Cơ bỏ qua. TP. HCM, ngày 3 tháng 08 năm 2018 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thanh Hiếu ii
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 2.1. Ngồi nước: 2 2.2.Trong nước: 3 3.Mục đích nghiên cứu: 3 4.Mục tiêu nghiên cứu: 3 5. Nội dung nghiên cứu: 3 6. Phương pháp nghiên cứu: 4 6.1.Phương pháp luận: 4 6.2.Phương pháp xử lý số liệu: 4 7. Kết quả đạt được: 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 5 1. Tổng quan về xử lý hạt giống: 5 1.1. Giới thiệu chung: 5 1.2. Các phương pháp khử nhiễm độc tố: 6 1.2.1. Phương pháp vật lý: 6 1.2.2. Phương pháp hĩa học: 9 1.2.3. Phương pháp sinh học: 9 2. Các vi sinh vật hỗ trợ tăng trưởng cây trồng: 12 iii
Đồ án tốt nghiệp 2.1. Khả năng phân giải lân: 12 2.1.1. VSV phân giải lân hữu cơ 13 2.1.2. VSV phân giải lân vơ cơ 14 2.2. Tạo màng sinh học biofilm 15 2.3. Khả năng sinh Indole-3-acetic acid (IAA) 17 3. Tổng quan về vi khuẩn lactic. 19 3.1. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus sp. 19 3.2. Đặc điểm sinh lý 20 3.3. Đặc điểm sinh hĩa 20 3.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 21 3.5. Quá trình trao đổi chất 23 3.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 28 3.7. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 29 3.7.1. Khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic 29 3.7.2. Các hợp chất kháng nấm 30 3.7.3. Các hợp chất kháng khuẩn khác 37 3.8. Ứng dụng của vi khuẩn lactic 40 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1. Địa điểm nghiên cứu 42 2.2. Thời gian thực hiện 42 2.3. Vật liệu nghiên cứu 42 2.3.1. Vật liệu 42 2.3.2. Hĩa chất sử dụng 42 2.3.3. Thiết bị 43 2.3.4. Dụng cụ 43 2.4. Phương pháp luận 44 iv
Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Mục tiêu đồ án 44 2.4.2. Nội dung 44 2.5. Phương pháp nghiên cứu 45 2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu 45 2.5.2. Khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic 46 2.5.2.1. Nhuộm gram 47 2.5.2.2. Nhuộm bào tử 48 2.5.2.3. Thử nghiệm Catalase 49 2.5.2.4. Thử nghiệm khả năng lên men đường 49 2.5.2.5. Khả năng di động 50 2.5.3. Khả năng phân giải lân 51 2.5.4. Khả năng sinh IAA 52 2.5.5. Khả năng tạo màng Biofilm 53 2.5.6. Chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1. 54 2.5.6.1. Khảo sát sự phát triển trên các loại mơi trường 55 2.5.6.2. Khảo sát hình thái 55 2.5.7. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1. 56 2.5.8. Phương pháp khảo sát mơi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic 56 2.5.9. Xác định acid lactic 57 2.5.10. Xác định mật độ vi khuẩn 57 2.5.11. Phương pháp khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 60 2.5.12. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng Lactobacillus sp. L5, L3, L2N đối với sự phát triển của hạt giống. 68 2.5.12.1. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng Lactobacillus sp. L5, L3, L2N đối với sự nảy mầm của hạt. 68 v
Đồ án tốt nghiệp 2.5.12.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn Lactobacillussp. L5, L3, L2N đến độ khỏe mầm ở cây đạu phộng 69 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 70 3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hố của chủng vi khuẩn lactic: 70 3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc: 70 3.1.2 Nhuộm Gram: 71 3.1.3 Nhuộm bào tử: 71 3.1.4 Thử nghiệm Catalase: 72 3.1.5 Thử nghiệm tính di động: 73 3.1.6 Thử nghiệm lên men các loại đường 74 3.2 Khảo sát sự phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 76 3.3. Khảo sát mơi trường lên men thích hợp. 78 3.3.1. Khảo sát khả năng sinh acid lactic và mật độ tế bào của các chủng Lactobacillus spp. L5, L2N, L3 79 3.3.2. Khảo sát khả năng tạo màng sinh học biofilm của các chủng Lactobacillus spp. L5, L2N, L3 83 3.3.3. Đánh giá khả năng phân giải lân của các chủng Lactobacillus spp. L5, L2N, L3 86 3.3.4. Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng Lactobacillus spp. L5, L2N, L3. 91 3.3.5. Đánh giá khả năng kháng nấm invitro của các chủng vi khuẩn lactic 93 3.5.6. Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng 96 3.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 tới sự phát triển của hạt giống. 100 3.3.7.1. Ảnh hưởng của dịch nuơi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 tới khả năng phát triển của cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm. 100 vi
Đồ án tốt nghiệp 3.3.7.2. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuơi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 tới cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm 104 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110 4.1. Kết luận 110 4.2. Kiến nghị 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 111 vii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactic acid bacteria/ Lactobacillales VSV Vi sinh vật VK Vi khuẩn BVTV Bảo vệ thực vật IAA Indole-3-acetic acid EPS Extracellular polymeric substance MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm NT Nghiệm thức KĐC Khơng điều chỉnh MT Mơi trường viii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn 10 Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hĩa của LAB và phương thức hoạt động 27 Bảng 1.3: Một số hợp chất tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men 30 Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất 34 Bảng 1.5: Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M. P. Zacharof, 2012) 38 Bảng 1.6: Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng vi khuẩn LAB 39 Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm bảo quản trong chai 67 Bảng 3.1 Khả năng lên men đường của các chủng L5, L3, L2N. 75 Bảng 3.3 Thống kê xếp hạng OD 550nm của các chủng vi khuẩn lactic. 84 Bảng 3.3. Khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn lactic ở ngày 3 90 Bảng 3.4: Hàm lượng IAA do 3 chủng vi khuẩn tổng hợp. 92 Bảng 3.5: Tỷ lệ ức chế của 3 chủng vi khuẩn trên các loại mơi trường với chủng nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. 94 Bảng 3.6: Ngày xuất hiện tơ nấm trong thí nghiệm bảo quản hạt đậu phộng 98 Bảng 3.7: Thành phần các nghiệm thức ngâm đậu phộng. 100 Bảng 3.8: Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ mầm trên các nghiệm thức của đậu phộng 101 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuơi cấy vi khuẩn đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7 ngày sau nảy mầm. 103 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuơi cấy đối với chiều dài của cây đậu phộng sau 14 ngày nảy mầm 104 ix
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Một số loại auxin phổ biến 18 Hình 1.2: Con đường lên men Glucose 26 Hình 1.3: Cấu trúc phân tử của các hợp chất kháng nấm 33 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 45 Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic 46 Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả năng phát triển của chủng nấm CĐP1 53 Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1. 55 Hình 2.5: Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn 58 Hình 2.6: Sơ đồ khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 60 Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng Lactobacillus sp. L5, L3, L2N đối với sự phát triển của hạt giống 68 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc các chủng Lactobacillus spp. trên mơi trường MRS agar 70 Hình 3.2: Kết quả nhuộm gram của các vi khuẩn 71 Hình 3.3: Kết quả nhuộm bào tử của các vi khuẩn 72 Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 73 Hình 3.5: Thử nghiệm tính di động của chủng Lactobacillus sp. L5 và chủng vi khuẩn đối chứng Bacillus subtilis. 74 Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn 75 Hình 3.7: Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 trên mơi trường MRS Agar cải tiến 77 Hình 3.8: Hình thái nấm nấm Aspergillus sp. CĐP1 78 Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic sp. L5 79 Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic L2N 80 x
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic L3 80 Hình 3.12: Hàm lượng acid tổng của chủng L5 trên các mơi trường 81 Hình 3.13: Hàm lượng acid tổng của chủng L2N trên các mơi trường 82 Hình 3.14: Hàm lượng acid tổng của chủng L3 trên các mơi trường 82 Hình 3.15: Biểu đồ đánh giá khả năng tạo màng biofilm của ba chủng vi khuẩn lactic trên các mơi trường. 84 Hình 3.16: Vi khẩn tạo màng biofilm trên thành ống nghiệm 86 Hình 3.17: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L5 87 Hình 3.18: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L2N 88 Hình 3.19: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L3 89 Hình 3.20: Biều đồ so sánh khả năng phân giải lân tổng cộng của ba chủng vi khuẩn lactic trên 3 mơi trường theo ngày. 89 Hình 3.21: Biểu đồ thể hiện khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn lactic trên ba mơi trường ở ngày 3. 90 Hình 3.22. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy lên khả năng sinh IAA của 3 chủng vi khuẩn. 92 Hình 3.23: Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn trên mơi trường khác nhau. 94 Hình 3.24: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kháng nấm của 3 chủng vi khuẩn trên 3 mơi trường khác nhau 95 Hình 3.25: Hình ảnh bảo quản đậu phộng trong chai sau 25 ngày 97 Hình 3.26: Cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm 101 Hình 3.27: Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ của mầm trên các nghiệm thức của hạt đậu phộng 102 Hình 3.28: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của dịch nuơi cấy vi khuẩn của 3 nghiệm thức TN1-TN1, TN3-NT8 và TN1-NT12 đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7 ngày sau nảy mầm 103 xi
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.29: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng dịch nuơi cấy của 3 nghiệm thức TN1-NT1, TN1- NT12, TN3-NT8 cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm. 105 Hình 3.30: Cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm. 106 xii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Vệ sinh an tồn thực phẩm đang là vấn đề xã hội cần giải quyết kịp thời để bảo vệ sức khoẻ con người. Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nĩng ẩm, độ ẩm trong khơng khí thường cao, là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm và thức ăn chăn nuơi, gây độc cho người và gia súc, gây tổn thương gan (ung thư gan ). Tình trạng phơi nhiễm của nấm mốc ảnh hưởng đến 25 % mùa màng trên tồn thế giới, làm tổn thất trung bình 418 triệu đơ và ảnh hưởng trên gia súc 472 triệu đơ mỗi năm (theo Bơ Nơng Nghiệp Mỹ, 2009). Tại Việt Nam, mỗi năm bị ảnh hưởng khoảng 13-16 % lượng nơng sản tuỳ loại. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển trên nơng sản (được bảo quản trong kho tàng , bao bì ), nấm mốc làm giảm nghiêm trọng chất lượng của các loại nơng sản được bảo quản. Nhiều lồi nấm mốc phát triển trên nơng sản (thĩc, ngơ, lạc, đậu tương ) làm cho sản phẩm nơng nghiệp biến đổi màu sắc, mùi vị, giảm chất lượng, đặc biệt là các chất dinh dưỡng như tinh bột, đường, protein, acid amin, lipid, vitamin và các khống chất. Nấm mốc làm thối rữa các sản phẩm nơng nghiệp như hoa quả, rau, hạt ngũ cốc và tạo điều kiện cho nhiều loại vi khuẩn khác phát triển và gây hại làm ảnh hưởng đến chất lượng hạt, sản lượng thu hoạch và gây thiệt hại cho người sử dụng. Bên cạnh sử dụng các biện pháp trong lúc trồng trọt như canh tác ruộng đất, bĩn phân, phun thuốc, thì một trong những xu hướng hiện nay là xử lý hạt giống. Xử lý nguồn bệnh tồn tại trên hạt giống trước khi gieo trồng là một trong những điều quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng hạt giống, vừa tăng khả năng chống chọi của hạt khỏi những tác nhân gây bệnh, ngăn ngừa nguồn bệnh lan truyền từ hạt sang đồng ruộng, vừa làm tăng sản lượng thu hoạch cĩ lợi cho người nơng dân, gĩp phần phát triển nền nơng nghiệp bền vững, khơng ảnh hưởng mơi trường. 1
Đồ án tốt nghiệp Xử lý hạt giống bằng hĩa chất ngày nay được sử dụng rộng rãi để phịng trừ sâu bệnh hại cây trong nơng nghiệp với những ưu điểm tác dụng nhanh, tương đối đơn giản, đem lại hiệu quả kinh tế cao, nhưng các hợp chất hĩa học dần cĩ những yếu điểm độc hại với mơi trường gây ơ nhiễm đất, nguồn nước và khơng khí, hình thành các lồi kháng thuốc, ảnh hưởng đến quần thể sinh vật và đăc biệt ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Do đĩ, các hợp chất sinh học được thay thế mang lại hiệu quả và thân thiện, an tồn với mơi trường đặc biệt các hợp chất sinh học từ các lồi vi sinh vât. Một trong những chủng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất chính là các chủng sinh acid lactic. Vi khuẩn dạng này cĩ hoạt tính sinh học khá cao, an tồn, cĩ khả năng tiêu diệt vi sinh vật cĩ hại và là nguồn vi sinh vật hữu ích, duy trì hệ cân bằng vi khuẩn đường ruột. Nhận thấy đây là những lý do cần thiết cho đời sống của con người và đĩ là lý do chúng tơi thực hiện đề tài “Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic xử lý hạt giống đậu phộng” 2. Tình hình nghiên cứu: 2.1. Ngồi nước: Trên thế giới, cĩ rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm do vi khuẩn sinh acid lactic tạo thành, chẳng hạn như: “Khả năng kháng nấm của 2 chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium in vitro và trong nấu mạch nha lúa mạch” của A. Laitila và cơng sự (2002). Năm 2004, Cassandra De Muynck và cơng sự nghiên cứu “Khả năng kháng nấm của vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất kháng nấm trong thực phẩm”. Kim Jeong Dong với “Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic phân lập từ kimchi kháng Aspergillus fumigatus” năm 2005. R Muđoz và cộng sự với nghiên cứu “Ngăn cản sự sản xuất độc tố của Aspergillus nomius vsc 23 của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces cerevisae” năm 2010. “Độc tố aflatoxin bị ức chế bởi các vi khuẩn lactic như Lactobacillus casei cĩ hoạt động mạnh chống sự phát triển của nấm và sự nảy mầm của bào tử nấm” Kim, 2005. 2
Đồ án tốt nghiệp 2.2. Trong nước: Hiện nay, nước ta cũng một số sản phẩm và cơng trình nghiên cứu vi khuẩn kháng nấm bệnh trên các loại cây và hạt khác nhau như: Cơng trình nghiên cứu như Chế phẩm EM bảo vệ cây trồng hay ứng dụng trong thuỷ sản. Chế phẩm Sadi Bio 1 (là tên gọi của chế phẩm vi sinh Biomix 2) của Viện cơng nghệ Mơi trường Việt Nam, được sản xuất từ các chủng vi sinh vật hữu ích thuộc nhĩm xạ khuẩn Streptomyces ưa ấm sinh tổng hợp mạnh các enzym ngoại bào, cĩ khả năng sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn Gram âm. “Khả năng giảm hàm lượng Aflatoxin từ nấm mốc của vi khuẩn lactic và nấm Trichoderma” của Lương Thị Phương Thảo (2015). Chế phẩm vi sinh SB2 của cơng ty Cơng nghệ Cát Tường cĩ cơng dụng phịng trừ tác nhân gây bệnh cho cây trồng như nấm, vi khuẩn, virus, xạ khuẩn, Vi khuẩn lactic chưa được ứng dụng rộng rãi trong xử lý hạt giống trong các nghiên cứu trong nước ta hiện nay. 3. Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn lên men lactic tạo chế phẩm sinh học bảo quản và xử lý hạt giống. 4. Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát khả năng dịch nuơi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N trong bảo quản và phát triển của hạt đậu phộng. 5. Nội dung nghiên cứu: Hoạt hố chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 và chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hố chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 3
Đồ án tốt nghiệp Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 với các chủng nấm Aspergillus sp.CĐP1 Khảo sát mơi trường lên men thích hợp của chủng Lactobacillus sp. L5, L2N, L3. Ứng dụng dịch nuơi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 trong bảo quản và xử lý hạt đậu phộng. Xây dựng quy trình sản xuất hạt giống đã xử lý. 6. Phương pháp nghiên cứu: 6.1. Phương pháp luận: Để ứng dụng vi khuẩn lactic xử lý hạt giống đậu phộng thay cho chất hĩa học, vi khuẩn lactic cĩ nguồn phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống được khảo sát tuyển chọn theo khả năng sinh acid, tạo sinh khối, tạo màng biofilm, đối kháng nấm, phân giải lân và sinh hoocmon tăng trưởng thực vật IAA. Đồng thời ảnh hưởng của các mơi trường lên men lên các tính chất này cũng được khảo sát. Sau khi chọn được mơi trường lên men thích hợp, thí nghiệm xử lý hạt đậu phộng và nảy mầm được tiến hành để so sánh độ khỏe mầm của hạt đậu phộng xử lý và khơng xử lý. 6.2. Phương pháp xử lý số liệu: Phần mềm Excel để tính tốn và vẽ đồ thị Phần mềm thống kê SAS 9.1 7. Kết quả đạt được: Xác định khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N đối với chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 phân lập từ hạt đậu phộng. Xác định được khả năng bảo quản hạt của chủng Lactobacillus sp. L5, L3, L2N khỏi nấm mốc. Xác định được ảnh hưởng của dịch nuơi cấy lên sự phát triển của hạt đậu phộng (tỷ lệ nảy mầm, độ khỏe mầm, ). Xây dựng được quy trình xử lý hạt đậu phộng. 4
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về xử lý hạt giống: 1.1. Giới thiệu chung: Hiện nay trên thị trường cĩ rất nhiều loại thuốc xử lý hạt giống với nhiều thương hiệu khác nhau của các cơng ty thuốc BVTV. Nơng dân bắt đầu làm quen với lợi ích của việc xử lý hạt giống trong bảo vệ cây trước sự tấn cơng của sâu bệnh, cơn trùng, vi khuẩn, nấm gây hại. Trước kia việc xử lý giống chỉ cĩ mục đích duy nhất là giúp giữ giống khơng bị nấm bệnh hại tấn cơng. Các hạt giống được áo các loại thuốc trừ nấm như captan, thiram hay là carbendazim để trừ nấm bệnh trên bề mặt hạt giống. Sau đĩ hạt giống này được nhuộm phẩm màu đỏ để cảnh báo người tiêu dùng khơng được sử dụng làm thực phẩm. Nhưng carbendazim cùng một số hoạt chất khác bị cấm sử dụng hiện nay vì là hoạt chất hĩa học cĩ độc tính cao, với nhiều tác động tới mơi trường, hệ sinh thái cũng như sức khỏe con người. Thuốc trừ nấm bảo vệ hạt giống đang nảy mầm và tránh khỏi bị sâu bệnh trong đất tấn cơng, giúp tăng tỷ lệ nảy mầm, mọc đều ngay cả trong điều kiện bất lợi như thiếu hoặc thừa nước. Lợi ích của xử lý hạt giống: - Giúp hạt giống nảy mầm nhanh, bắt rễ sớm. - Giúp hình thành nốt sần ở cây họ đậu - Tiệt kiệm lượng thuốc và cơng lao động trên cùng đơn vị diện tích so với phân bĩn gốc và phân bĩn lá. - Dễ áp dụng hơn phân bĩn gốc và phân bĩn lá, chỉ trộn thuốc xử lý hạt với giống gieo sạ. Việc xử lý hạt giống cịn mở ra nhiều triển vọng mới như : Tăng cường tính kháng bệnh: Kích thích tính kháng bệnh ở cây trồng (kích kháng) là phương pháp giúp cho giống cây bị nhiễm bệnh trở nên cĩ khả năng kháng bệnh ở mức độ nào đĩ sau khi được xử lý chất kích kháng. Kích kháng khơng tác động trực 5
Đồ án tốt nghiệp tiếp lên mầm bệnh mà nĩ kích thích quá trình tự vệ của cây trồng. Chất kích kháng cĩ thể cĩ nguồn gốc hĩa học hoặc vi sinh vật. Tăng cường chịu điều kiện bất lợi: Các vi khuẩn sống vùng rễ lúa cố định đạm như Azospirillum lipoferum, Azospirillum lipoferum; vi khuẩn Pseudomonas sp, Baccilus sp đều kích thích khả năng tổng hợp các chất điều hịa sinh trưởng thực vật như Auxin và Gibberelin giúp bộ rễ cây trồng phát triển tốt hơn, gia tăng diện tích tiếp xúc của rễ với đất. Các vi khuẩn này vừa tăng cường cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, vừa tăng cường chống chịu điều kiện bất lợi. Các chất ly trích thực vật như Lychnis viscaria, xoan Melia azedarach đều cĩ tác dụng kích hoạt tăng cường cây trồng chống chịu điều kiện bất lợi khi gieo sạ như ngập úng, hạn hán Phịng trừ sâu bệnh: Đây là xu thế phổ biến hiện nay của phần lớn các sản phẩm xử lý hạt giống trên thị trường. Điển hình là thuốc xử lý hạt giống Cruiser cĩ chứa chất Thiamethoxam là hoạt chất chuyên trên rầy nâu và bọ trỉ, chất Defenoconazole thuốc trừ nấm phổ rộng ức chế tổng hợp màng tế bào nấm, chất Fludioxonil là hoạt chất trừ nấm trên hạt khơng lưu dẫn, chủ yếu trên bệnh lúa von. Ngồi ra cịn cĩ Gaucho chứa hoạt chất imidacloprid là thuốc trừ sâu ức chế thần kinh trừ bọ trỉ, rầy nâu. Sunato chứa hoạt chất Fipronil là thuốc trừ sâu thuộc nhĩm phenylpyrazole bảo vệ lúa 7-14 ngày sau khi sạ, cùng với Isotianil là thuốc trừ sâu thuộc nhĩm Cloronicotinyl chuyên trừ rầy nâu, bọ trỉ. 1.2. Các phương pháp khử nhiễm độc tố: 1.2.1. Phương pháp vật lý: Phân hủy aflatoxin bằng khơng khí nĩng: Dùng khơng khí nĩng thổi qua nguyên liệu cĩ chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể. Nếu nhiệt độ khơng khí nĩng đưa vào là 100 °C – 145 °C ở ngơ hạt thì lượng aflatoxin B1 cĩ thể giảm từ 877 ppb 6
Đồ án tốt nghiệp cịn 452 ppb, từ 378 ppb cịn 213 ppb. Nếu tăng nhiệt độ lên tới 165°C cĩ thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm đến 65% (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá hủy nhanh chĩng vịng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Theo Rehana (1979) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120°C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) cĩ thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng cĩ độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120°C trong 4 giờ giảm cịn 370 ppb. Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vịng một giờ đã phân hủy hồn tồn aflatoxin. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụ thường là các chất vơ cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) cĩ hoạt tính bề mặt cao. Các chất cĩ khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vơ cơ cĩ bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone). Những chất này khơng được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra ngồi (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Tách aflatoxin bằng dung mơi hữu cơ: Đây là phương pháp cĩ thể áp dụng đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuơi, do ít cĩ khả năng tạo sản phẩm khác cĩ hoạt tính từ aflatoxin và cĩ thể thu hồi được dung mơi mà khơng ảnh hưởng đến thành phần dinh dưỡng của thức ăn. Những kết quả cĩ nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexan- ethanol-nước và hexan-acetone-nước. Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành cơng nhất được tìm thấy cĩ thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khơ của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg. 7
Đồ án tốt nghiệp Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá hủy nhanh chĩng vịng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Theo Rehana (1979) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120 °C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) cĩ thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng cĩ độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120 °C trong 4 giờ giảm cịn 370 ppb. Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vịng một giờ đã phân hủy hồn tồn aflatoxin. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụ thường là các chất vơ cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) cĩ hoạt tính bề mặt cao. Các chất cĩ khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vơ cơ cĩ bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone). Những chất này khơng được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra ngồi (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Tách aflatoxin bằng dung mơi hữu cơ: Đây là phương pháp cĩ thể áp dụng đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuơi, do ít cĩ khả năng tạo sản phẩm khác cĩ hoạt tính từ aflatoxin và cĩ thể thu hồi được dung mơi mà khơng ảnh hưởng đến thành phần dinh dưỡng của thức ăn. Những kết quả cĩ nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexan- ethanol-nước và hexan-acetone-nước. Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành cơng nhất được tìm thấy cĩ thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khơ của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg. Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím. Ở bước sĩng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại. Okonkwo (1978) nhận 8
Đồ án tốt nghiệp thấy, lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) cĩ thể giảm tới 30% và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). 1.2.2. Phương pháp hĩa học: Phương pháp sử dụng các chất oxi hĩa-khử: Các chất oxy hĩa-khử như Natri Hypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin. Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin cĩ thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin. Khí ozone (O3) cũng được thử nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song cĩ bằng chứng là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin. Phương pháp sử dụng các chất kiềm: Ammonium Hydroxide (NH4OH) và Natri Hydroxide (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vơ hoạt aflatoxin. Các chất này đều cĩ hoạt tính mạnh, cĩ thể phá vỡ vịng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Phương pháp sử dụng khí NH3: Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NH3 làm vơ hoạt aflatoxin. Xử lý ngơ bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả. Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độ bên ngồi là 25 °C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200 ppb cĩ thể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). 1.2.3. Phương pháp sinh học: Mặc dù các biện pháp phịng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên nơng sản ở mức độ cao quá giới hạn là khơng thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hĩa chất cĩ giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khĩ áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất. Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học cĩ thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hĩa sinh học của các độc tố nấm mốc trực tiếp 9
Đồ án tốt nghiệp nhờ vi sinh vật. Một số vi khuẩn cĩ khả năng khử nhiễm độc tố aflatoxin được trình bày trong bảng 1.1. Bảng 1.1: Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn Tên vi khuẩn Đối tượng Cơ chế khử nhiễm Tác giả Sử dụng các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào, sinh ra trong quá trình nuơi cấy B. Aspergillus C. Munimbazi và Bacillus pumilus pumilus, ức chế sự phát triển parasiticus LB.Bullerman, 1997 và quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp. parasiticus Streptomyces sp. tổng hợp được aflastatin A, là hợp chất cĩ bản chất là protein, ức chế Aspergillus Ono. M và cộng sự, Streptomyces sp. 1 số enzyme esterase tham gia parasiticus 1997 quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp. parasiticus A. xylosoxidan tổng hợp Cyclo (L-leucyl-L-prolyl), là Achromobacter Aspergillus 1 cyclodipeptide, ức chế sự PS. Yan và cộng sự, xylosoxidans parasiticus phát triển và sự tổng hợp 2004 aflatoxin của nấm Asp. parasiticus. Lactobacillus Aspergillus Sử dụng các sản phẩm trao I. Chang và JD. 10
Đồ án tốt nghiệp casei flavus đổi chất ngoại bào, sinh ra Kim, 2007. trong quá trình nuơi cấy L. casei, ức chế sự phát triển và quá trình tổnghợp độc chất aflatoxin của nấm Asp. flavus. Bacillus subtilis Aspergillus Ting Zang và cộng Hợp chất thứ cấp B-FS06 flavus sự, 2007. B. subtilis tổng hợp các enzyme ngoại bào như Aspergillus R. Thakaew và cộng Bacillus subtilis protease, chitinase, β-1,3- flavus sự, 2013 glucanase làm ức chế sự phát triển của nấm Asp. flavus. Các loại nơng sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, cà phê, tiêu, điều, thanh long, vú sữa xuất khẩu đậu phộng của Việt Nam, bao gồm nguyên vỏ, bĩc vỏ và hạt cao (số liệu này khơng bao gồm thương mại biên giới với Trung Quốc). Các thị trường xuất khẩu chính của Việt Nam là Đài Loan, Hồng Kơng, Thái Lan, Nga, Malaysia và một số nước khác. Bộ Nơng nghiệp Hoa Kỳ (USDA) điều chỉnh ước tính cho xuất khẩu đậu phộng của Việt Nam trong vụ 2016/17 lên 10 nghìn tấn, bao gồm xuất khẩu đậu phộng thơng qua thương mại biên giới và xuất khẩu đậu đã qua chế biến. Để đạt được năng suất ấy, người nơng dân sử dụng rất nhiều phân bĩn hĩa chất khác và khơng ít các loại thuốc bảo vệ thực vật. Hệ quả khơng chỉ nơng dân phải mất nhiều tiền vào hĩa chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phá nghiêm trọng. Phương pháp sinh học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa học khuyến khích sử dụng vì chúng cĩ những ưu điểm sau: 11
Đồ án tốt nghiệp - Khơng gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuơi, cây trồng như thuốc bảo vệ thực vật từ hĩa chất. - Cân bằng hệ sinh thái trong mơi trường đất nĩi riêng và mơi trường nĩi chung. - Khơng làm thối hĩa đất mà cịn gĩp phần tăng độ phì nhiêu của đất. - Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, gĩp phần tăng năng suất và chất lượng nơng phẩm. - Tiêu diệt cơn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà khơng làm ảnh hưởng đến mơi trường như các loại thuốc BVTV cĩ nguồn gốc hĩa chất. Tác dụng của CPSH đến từ từ chứ khơng nhanh như các loại hĩa chất nhưng tác dụng dài lâu. - Cĩ khả năng phân hủy, chuyển hĩa các phế thải sinh học, phế thải nơng nghiệp, cơng nghiệp, gĩp phần làm sạch mơi trường. - Các chủng nấm sinh độc tố sẽ khơng thể hình thành cơ chế kháng. 2. Các vi sinh vật hỗ trợ tăng trưởng cây trồng: 2.1. Khả năng phân giải lân: Vi khuẩn phân giải lân khĩ tan đã được sử dụng như phân bĩn sinh học thương mại để cải thiện tình trạng nơng nghiệp. Nhĩm vi khuẩn phân giải lân được coi là phân bĩn sinh học cĩ triển vọng nhất vì rất nhiều loại đất giàu lân tổng số nhưng lại thiếu hụt trầm trọng lân dễ tan cung cấp cho cây trồng. Các vi khuẩn phân giải lân lại rất cĩ tiềm năng để sản xuất phân vi sinh đa chức năng vì cĩ thể tương tác kết hợp tốt với các vi khuẩn cĩ lợi khác như Azospirillum và Azotobacter. Ngồi vai trị cung cấp lân dễ tan cho cây trồng, các vi khuẩn hịa tan lân cịn cĩ khả năng sinh các yếu tố cĩ vai trị nâng cao hiệu suất tăng trưởng như cố định đạm, sinh tổng hợp các phytohormone, kháng sinh hay các enzyme chitinase, cellulase giúp cây trồng phát triển tốt hơn, chống chịu tốt hơn đối với điều kiện bất lợi từ bên ngồi. 12
Đồ án tốt nghiệp VSV phân giải lân thúc đẩy sự tăng trưởng của thực vật, làm tăng lượng lân cĩ giá trị cho cây trồng. Hịa tan lân là một hiện tượng phức tạp, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dinh dưỡng, điều kiện sinh lý và phát triển của các VSV. Trong đất, các VSV là trung tâm của chu trình chuyển hĩa lân và đĩng vai trị trung gian quan trọng trong việc chuyển hĩa lân vơ cơ và hữu cơ, sau đĩ giải phĩng lân cĩ giá trị cung cấp cho cây trồng. Trong quần thể VSV đất, VSV phân giải lân cĩ thành phần lồi khác nhau và thay đổi tùy từng loại đất. VSV phân giải lân được phân lập từ vùng rễ của các cây trồng khác nhau. Số lượng VSV phân giải lân hiện diện ở vùng rễ nhiều hơn so với đất ngồi vùng rễ. Các VSV phân giải lân chiếm 0,1-0,5 % của tổng số vi khuẩn và nấm. VSV phân giải lân phát triển ở cả vùng đất màu mỡ giàu lân và đất thiếu lân. Penicillium sp. và Aspergillus sp. là hai loại nấm chủ yếu chi phối khả năng phân giải lân trong vùng rễ. Các vi khuẩn phân giải lân quan trọng nhất là Pseudomonas, Bacilllus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium,Microccocus, Flavobacterium và Erwinia. Theo Babenko và cộng sự (1984), lượng lân hòa tan tăng tuyến tính cùng với sự tăng trưởng của vi khuẩn trong mơi trường nuơi cấy, lượng lân hòa tan tăng tại các điểm khác nhau trong những giai đoạn tăng trưởng (khơng phải trong suốt thời gian nuơi cấy). Rodríguez và Fraga (1999) cũng so sánh khả năng phân giải lân của 13 chủng vi khuẩn khác nhau và nhận thấy rằng Rhizobium, Pseudomonas và các lồi vi khuẩn Bacillus là những chủng mạnh nhất trong việc phân giải lân. 2.1.1. VSV phân giải lân hữu cơ Các chất hữu cơ chứa lân sẽ được vơ cơ hĩa do các enzyme tiết ra từ VSV trong đất. Trong quá trình sống, VSV cần phân hủy các chất hữu cơ thành các đường đơn để lấy carbon cho sự phát triển của chúng. Trong quá trình phân hủy này, nhờ các men 13
Đồ án tốt nghiệp của VSV tiết ra, các hợp chất hữu cơ cĩ chứa lân đã phĩng thích lân dưới dạng phosphate. Chủng Bacillus: B. megaterium, B. subtilis, B. malaberensis khơng những cĩ khả năng phân giải hợp chất lân vơ cơ mà cịn cĩ khả năng phân giải hợp chất lân hữu cơ (Bạch Phương Lan, 2004). Đồng thời B. megaterium cịn cĩ khả năng hình thành bào tử nên sức sống rất mạnh (Nguyễn Hữu Hiệp, 2009). Ngồi ra cịn cĩ Serratia, Proteus, Arthrobscter, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Cunnighamella, Streptomyces Cơ chế phân giải: sự chuyển hĩa các hợp chất lân hữu cơ thành muối của H3PO4 theo sơ đồ sau: 1. Nucleoprotein → Nuclein → Acid nucleic → Nucleotic → H3PO4 2. Leucine → Glixerphosphate → H3PO4 Trong sự phân hủy acid phytic, VSV tiết ra men phytase nhờ enzyme này acid phytic được phân ra làm một phân tử inositol và 6 phân tử H3PO4. Phytin cũng được phân hủy như trên vì phytin là một muối canxi và magiê của acid phytic. Sự phân hủy của phytin hoặc acid phytic trong đất chậm hơn so với các acid nucleic. 2.1.2. VSV phân giải lân vơ cơ Trong đất, lân vơ cơ khĩ tan cĩ thể được VSV chuyển hĩa thành lân dễ tan. Phần lớn VSV trong đất đều cĩ khả năng này. Cĩ đến 1/10 đến 1/2 chủng vi khuẩn phân lập được từ đất cĩ khả năng chuyển hĩa lân khĩ tan thành lân dễ tan. Theo Katznelson và cộng sự (1984), VSV phân giải những hợp chất lân khĩ tan thuộc nhiều nhĩm, nhiều loại khác nhau, cĩ thể chiếm khoảng 10- 15% hệ VSV đất, vi khuẩn phân giải những hợp chất lân vơ cơ khĩ tan thường gặp gồm các giống: Pseudomonas denitrificans, Alcaligenes faecalis, Achromobacter delicatulus, Agrobacterium radiobacter, Aerobacter aerogenes, Escherichia freundi, Brevibacterium, micrococus, Flavobacterium aurantiacus, Chlorobacterium denitrificans, Mycobacterium cyaneum, Sarcina flava, Bacillus megaterium var. 14
Đồ án tốt nghiệp phosphaticum. Người ta dùng chúng làm phân bĩn vi sinh phân giải lân. Bên cạnh các vi khuẩn, xạ khuẩn, các chủng nấm như Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Sclerotium cũng cĩ tác dụng trong quá trình hịa tan hợp chất lân khĩ tan. Đại đa số nghiên cứu đều cho rằng, sự phân giải Ca3(PO4)2 cĩ liên quan mật thiết với sự sản sinh acid trong quá trình sống của VSV. Trong đĩ, acid carbonic đã làm cho Ca3(PO4)2 phân giải. Ca3(PO4)2 + H2CO3 + H2O → Ca(PO4)2.H2O + Ca(HCO3)2 Trong đất, vi khuẩn nitrat hĩa và vi khuẩn chuyển hĩa lưu huỳnh cũng cĩ tác dụng quan trọng trong việc phân giải Ca3(PO4)2. Vì trong quá trình sống, các vi khuẩn này tích lũy trong đất HNO3 và H2SO4. Quá trình hịa tan cĩ thể biểu thị theo phương trình sau: Ca3(PO4)2 + 4HNO3 → Ca(H2PO4)2 + 2Ca(NO3)2 Ca3(PO4)2 + 2H2SO4 → Ca(H2PO4)2 + 2CaSO4 Các nghiên cứu cho thấy sự xuất hiện các acid này xảy ra cùng lúc với sự xuất hiện lân hòa tan. Cĩ nghĩa là ngay sau khi VSV tiết ra các acid thì chúng tác dụng lên lân khĩ tan và cho ra ngay lân hịa tan. Mặt khác các dạng lân bị cố định trong đất như phosphate sắt và phosphate nhơm cũng được chuyển hĩa sang dạng dễ tan dưới tác dụng của VSV trong đất. Một số vi khuẩn cĩ khả năng sinh ra H2S tác dụng lên phosphate sắt hoặc nhơm và phĩng thích ra dạng phosphate dễ tan. Hiện tượng này xảy ra trong điều kiện thiếu oxy. Cơ chế của hiện tượng này chưa được giải thích rõ. Ở đất phèn trồng lúa, hầu hết lân đều ở dạng phosphate sắt hoặc nhơm, lúa khơng hấp thu được. Trong điều kiện này việc bĩn phân chuồng hoặc chơn vùi rơm rạ kết hợp với bĩn đạm và vơi để giúp VSV phát triển sẽ giúp chuyển lân cố định sang dạng dễ tan và cung cấp cho lúa. Sự chuyển hĩa này hơi chậm nên tự nĩ khơng cung cấp lân đủ cho nhu cầu của lúa nên phải kết hợp thêm lân trong phân bĩn hĩa học nhưng với liều lượng ít hơn. 2.2. Tạo màng sinh học biofilm 15
Đồ án tốt nghiệp Các tế bào vi khuẩn sinh sống trơi nổi trong mơi trường lỏng (dạng phù du) vơ tình bám vào một bề mặt nào đĩ, và nếu sau một thời gian chúng khơng chịu tác động di chuyển đi nơi khác, quá trình sinh trưởng vẫn cứ tiếp tục, dần sẽ hình thành một kiểu khuẩn lạc trên bề mặt đĩ, đây là giai đoạn đầu của sự hình thành màng sinh học. Kế đến vi khuẩn sẽ bắt đầu thay đổi thay đổi kiểu hình, khả năng sinh hĩa mới để thuận lợi hơn trong việc tổng hợp nên cơ chất ngoại bào - extracellular polymeric substance (EPS). Phân tích về mặt hình thái học kết hợp với di truyền học, người ta xác định rằng các tế bào xuất hiện cấu trúc tua, nhung mao hoặc tiêm mao sẽ tăng thêm độ vững chắc của màng sinh học. Giai đoạn cuối của sự hình thành màng sinh học, các tế bào sẽ một lần nữa biến đổi quay lại dạng phù du, tách ra khỏi màng sinh học để tìm địa điểm định cư khác, giai đoạn này gọi là giai đoạn phát tán. Khả năng tạo màng sinh học như là một cách thức tồn tại, phát triển của vi sinh vật trong những điều kiện dinh dưỡng thấp của mơi trường. EPS là các polymer sinh học cĩ trọng lượng phân tử cao được vi sinh vật tiết ra ngồi mơi trường sống xung quanh chúng. EPS là thành phần chính, đồng thời quyết định tính hĩa lý của màng sinh học. EPS chiếm từ 50 – 90% tổng lượng chất hữu cơ của một màng sinh học. EPS là vật liệu giúp cho tế bào vi khuẩn bám dính lên một bề mặt nào đĩ và đồng thời liên kết với các tế bào khác. Trong màng sinh học, các tế bào liên kết với nhau bằng mạng lưới do chúng tự tổng hợp nên EPS. EPS khơng chỉ bao gồm polysaccharides do tế bào tổng hợp ra, mà cịn các thành phần từ mơi trường xung quanh như các ion khống, bụi bẩn, hồng cầu, fibrin, protein và các acid nucleic. Xen kẽ với mạng lưới EPS còn cĩ các kênh nước, giúp vận chuyển chất dinh dưỡng và tín hiệu giữa các tế bào. EPS sẽ bao phủ tế bào vi khuẩn, nhưng vẫn tạo điều kiện cho các tế bào trao đổi tín hiệu sinh hĩa cũng như trao đổi gen với nhau. EPS chính là chìa khĩa quan trọng cho việc sự hình thành, phát triển của màng sinh học. EPS cịn cĩ chức năng giữ cho các 16
Đồ án tốt nghiệp enzyme ngoại bào gần với tế bào, giúp hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn ổn định hơn. Nghiên cứu về màng sinh vật (Biofilm) gĩp phần tạo ra những sản phẩm ứng dụng cao trong cuộc sống như tạo các cơng nghệ sinh học xử lý ơ nhiễm mơi trường, ứng dụng trong nghiên cứu phịng bệnh cho cây trồng cũng như các nghiên cứu trong cơng nghiệp thực phẩm, hĩa mỹ phẩm, 2.3. Khả năng sinh Indole-3-acetic acid (IAA) Indole-3-acetic acid (IAA) hay cịn goi là Auxin, là chất điều hịa chủ yếu của sự sinh trưởng thực vật. IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, sự phân sinh mơ, sự phát triền trái và hạt , chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng (Theologis và Gay 1982). Auxin là những hợp chất cĩ nhân indol, được tổng hợp từ tryptophan trong mơ phân sinh (ngọn, lĩng) và lá non. Sau đĩ, auxin sẽ di chuyễn đến rễ và tích tụ trong rễ. Cĩ nhiều loại auxin khác nhau với cấu trúc hố học khác nhau. Loại auxin quan trọng nhất là β-indol-acetic acid (IAA), ngồi ra một số auxin khác cũng khá phổ biến là napthalen-acetic acid (NAA), phenyl-acetic acid (PAA) 17
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1: Một số loại auxin phổ biến Với nhiều thí nghiệm khác nhau của nhiều nhà khoa học đã chứng minh được vai trị của IAA do vi sinh vật tạo ra đối với cây trồng như kích thích sự kéo dài rễ, tăng số lượng rễ phụ, làm tăng khả năng nẩy mầm của hạt. Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng VSV dựa trên nồng độ IAA cĩ trong dịch chiết nuơi cấy vi khuẩn. Nồng độ IAA cĩ trong dịch chiết càng cao chứng tỏ khả năng sinh IAA của VSV càng mạnh. Nồng độ IAA được xác định bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ với thuốc thử Salkowski ở bước sĩng 530nm. 3. Tổng quan về vi khuẩn lactic. 18
Đồ án tốt nghiệp 3.1. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus sp. Vi khuẩn lactic cĩ nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trong khoảng 25 – 35 °C. Chúng chịu được trạng thái khơ hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều lồi vẫn sống được trong mơi trường 10-15 % cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, cĩ thể sống trong mơi trường từ 7-10 % NaCl. Vi khuẩn lactic cĩ hoạt tính protease phân hủy protein thành peptide, acid amin, hoạt tính này ở các lồi khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn. Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que, đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5 μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi cĩ chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 – 8 μm. Trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng lồi. Phân loại khoa học giống Lactobacillus: - Giới: Vi khuẩn - Ngành: Firmicutes - Lớp: Bacilli - Bộ: Lactobacillales - Họ: Lactobacillacea - Giống: Lactobacillus Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 lồi như: L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus, Các lồi Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hĩa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng cĩ chứa các vi khuẩn này. Các vi khuẩn lactic thuộc nhĩm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum. 19
Đồ án tốt nghiệp 3.2. Đặc điểm sinh lý Lactobacillus spp. thuộc nhĩm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi. Các lồi trong chi khơng cĩ khả năng di động, khơng sinh bào tử. Phổ nhiệt tăng trưởng từ 2 – 53oC, nhưng tối ưu ở khoảng 30 – 40oC. Tăng trưởng tốt trong điều kiện mơi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.5 – 6.2, nhưng vẫn cĩ thể chịu được mức pH 5.0 hoặc thấp hơn. Tốc độ tăng trưởng giảm trong điều kiện pH mơi trường trung tính hoặc kiềm. Vì Lactobacillus spp. cĩ khả năng chịu được mơi trường cĩ pH cao, nên việc tiết ra acid lactic chính là yếu tố cạnh tranh của chúng đối với những vi khuẩn khác trong cùng một mơi trường. Thường được tìm thấy trong các sản phẩm cĩ nguồn gốc từ sữa, ngũ cốc, thịt, cá, bia, rượu, trái cây, nước trái cây, rau củ muối chua, bã thực phẩm, dưa cải bắp, cỏ ủ, bột nhào chua, nước, đất, chất thải. Chúng cũng xuất hiện trong cơ quan sinh dục nữ, khoang miệng, hệ tiêu hĩa ở người và nhiều động vật khác. Đây là những mơi trường được cung cấp thường xuyên nguồn carbohydrate và một số chất dinh dưỡng khác. Chính là nơi thích hợp để chúng thực hiện các phản ứng lên men và cho ra sản phẩm chính là acid lactic 3.3. Đặc điểm sinh hĩa Lactobacillus spp. âm tính với thử nghiệm nitrate, một số trường hợp hiếm dương tính chỉ xảy ra khi pH mơi trường cân bằng ở 6.0 trở lên hoặc bổ sung sắc tố đỏ heme bào mơi trường nuơi cấy. Khơng cĩ khả năng phân giải gelatin, casein. Thử nghiệm Indole, Citrate và khả năng sinh H2S âm tính. Thử nghiệm catalase âm tính. Lactobacillus spp. thường sinh ra mùi đặc trưng khi cĩ mặt trong thực phẩm. Một nửa sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là lactate. Ngồi ra quá trình lên men cịn sinh các sản phẩm khác như là: diacetyl, acetic acid, và acetaldehyde. Bên cạnh đĩ quá trình dị hĩa amino acid sẽ sinh ra H2S, amines, hợp chất carbonyl, cresol, skatol, 20
Đồ án tốt nghiệp benzaldehyde, và methanethiol. Tất cả những sản phẩm của quá trình trao đổi chất này đã tạo ra nhiều loại hương đặc trưng của sản phẩm lên men. Lactobacillus spp. thường khơng cĩ khả năng gây bệnh, ngồi trừ một số ít trường hợp cĩ bệnh tiềm ẩn bởi khả năng sinh ra acid khử khống men răng. Đa số các lồi trong chi Lactobacillus đều cĩ khả năng tổng hợp EPS, nhưng chia thành hai dạng. Homopolysaccharides là dạng EPS được tổng hợp từ carbohydrate chủ yếu là dextran, glucan và levan. Trong khi dạng Heteropolysaccharides được tổng hợp từ nucleotide. Homopolysaccharides chủ yếu được tổng hợp từ lồi lên men dị hình như L. pontis, L. frumenti, L. sanfranciscensis và L. reuteri. Heteropolysaccharides được tổng hợp với số lượng ít, khoảng 0.1 – 1.5 g/l bởi những lồi lên men đồng hình như L. kefiranofaciens, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. paracasei, L. rhamnosus, L. helveticus, và L. sakei 3.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật cĩ yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì cĩ nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Để sinh trưởng bình thường chúng khơng chỉ cĩ nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà cịn cĩ nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vơ cơ, các chất sinh trưởng 3.4.1. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Vi khuẩn lactic cĩ thể sử dụng được nhiều loại carbohydrate từ các monosaccharide (glucose, fructose) và các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic, 3.4.2. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ 21
Đồ án tốt nghiệp Mỗi lồi vi khuẩn khác nhau cĩ nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi khuẩn lactic khơng thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp cĩ chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ cĩ sẵn trong mơi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic cĩ thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và cĩ hiệu quả nhất. tuy nhiên ở quy mơ cơng nghiệp khơng thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém. 3.4.3. Nhu cầu về vitamin Vitamin đĩng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các lồi vi khuẩn lactic khơng cĩ khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào mơi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường được sử dụng như dịch chiết từ khoai tây, ngơ, cà rốt hay dịch tự phân nấm men. 3.4.4. Nhu cầu các chất hữu cơ khác Ngồi các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic cịn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các base nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ cĩ ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần mơi trường nuơi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic. Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng cĩ những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetate để làm chất đệm cho mơi trường khi nuơi cấy vi khuẩn lactic. 3.4.5. Nhu cầu các muối vơ cơ khác Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vơ cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khống như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan. Đặc biệt là magie và mangan, vì nĩ tham gia và đảm bảo chức 22
Đồ án tốt nghiệp năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào. 3.4.6. Nhu cầu dinh dưỡng oxy Vi khuẩn lactic cĩ khả năng sống được trong mơi trường cĩ oxy hay khơng cĩ oxy. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí. Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hĩa hồn tồn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đĩ lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn. 3.5. Quá trình trao đổi chất Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thơng qua việc lên men lactic. Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên men carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học khác và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường). LAB cĩ khả năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose ), disaccharide (lactose, saccharose ); pentose (arabinose, xylose, ribose ) và các hợp chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy nhiên, LAB cĩ thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau. Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhĩm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (hình 1.2). - Lên men lactic đồng hình 23
Đồ án tốt nghiệp Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đĩ cĩ các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di- acetiyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men: → C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J Con đường Glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-Parnas pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhĩm III Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3- phosphate (GAP) đối với những chất cĩ mức phosphoryl hĩa ở 2 vị trí, sau đĩ tạo thành pyruvate. Trong điều kiện cĩ nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đĩ NADH đã được oxy hĩa trước đĩ, khi thế oxy hĩa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình. - Lên men lactic dị hình Một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, con đường pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose monophosphate, con đường 6- phosphogluconate. Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo 6-phosphogluconate. Theo sau đĩ là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hĩa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate. GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic. Trong điều kiện khơng cĩ mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thơng qua CoA và acetaldehyde. Khi quá trình này ngồi sản phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol, acid acetic, acid succinic thì nĩ được gọi là lên men lactic dị hình. Phương trình chung biển diễn quá trình lên men: 24
Đồ án tốt nghiệp → C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2 Trong đĩ, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic và acid acetic 10% các loại khí 20% đơi khi khơng cĩ các khí mà thay vào đĩ là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic. Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn so với lên men lactic đồng hình. Theo quan điểm tiến hố sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hố độc lập của lên men dị hình. Thơng thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK. Tuy nhiên nĩ khơng phải dúng cho tất cả các trường hợp (Owen R. Fennema et al. 2004). 25
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2: Con đường lên men Glucose 26
Đồ án tốt nghiệp Chú thích hình 1.7 (A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis,, EMB) (B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase) Các enzyme tham gia vào quá trình : 1. Glucokinase; 2. Fructose-1,6- diphosphate aldolase; 3. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4. Pyruvate kinase; 5. Lactate dehydrogenase; 6. Glucose-6-phosphate dehygrogenase; 7. 6- phosphogluconate dehydrogenase; 8. Phosphoketolase; 9. Acetaldehyde dehydrogenase; 10. Alcohol dehydrogenase. Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hĩa của LAB và phương thức hoạt động. Sản phẩm chuyển hố Phương thức hoạt động Ngăn cản sự khử nhĩm carboxyl, Carbon dioxide giảm tính thấm của màng Diacetyl Phản ứng với protein gắn arginine Hydrogen peroxide/ Lactoperoxidase Oxy hố các protein cơ bản Acid lactic bị phân ly đi xuyên qua màng, làm thấp pH nội bào. Nĩ gây Acid lactic trở ngại quá trình chuyển hố như oxi hố khử phosphor. Ảnh hưởng đến màng, tổng hợp Bacteriocin protein và DNA. 27
Đồ án tốt nghiệp 3.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Trong cơng nghiệp, vật liệu dùng để làm mơi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, khơng cĩ độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp khơng chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuơi cấy mà cịn ảnh hưởng khơng nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này. • Thành phần mơi trường nuơi cấy Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với mơi trường bên ngồi. Thành phần mơi trường MRS để nuơi cấy vi khuẩn lactic cĩ chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuơi cấy vi khuẩn lactic. Ngồi ra, để duy trì sự sống, điều hịa các quá trình chuyển hĩa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid cĩ trong mơi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khống và các yếu tố vi lượng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men. • Yếu tố mơi trường - Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh enzyme của tế bào vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuơi cấy quá cao hay quá thấp đều cĩ thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40 0C. Một số cĩ thể sinh trưởng 28
Đồ án tốt nghiệp dưới 15 0C và thậm chí một số dịng cĩ thể sinh trưởng dưới 5 0C (Wood B.J.B and Holzapfel W.H, 1995). - Ảnh hưởng của pH Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH mơi trường giảm, và khi nĩ giảm tới mức nào đĩ nĩ sẽ ức chế chính sự phát triển của vi khuẩn lactic. Do đĩ, cần phải luơn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình nuơi. Để lên men nhanh và trọn vẹn, phạm vi pH tối ưu phải nầm giữa 5.5 và 6.0. - Ảnh hưởng của nồng độ acid Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong mơi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường khơng bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người ta cho vào mơi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid sinh ra thơng thường chất đệm này là CaCO3. - Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau cĩ thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men. 3.7. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 3.7.1. Khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic Khả năng đối kháng của các vi khuẩn lactic liên quan đến sự ức chế của các vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995). Khả năng kháng nấm và các thành phần ức chế đã được tìm thấy và cơng nhận trong nhiều nghiên cứu. Các vi khuẩn lactic (LAB) cĩ thể sản xuất một số chất kháng sinh như lactic acid và reuterin, ngồi ra cịn cĩ các acid hữu cơ, peroxide hydro, bacteriocine kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm. Các vi khuẩn lactic đã được biết đến trong nhiều năm và 29
Đồ án tốt nghiệp đĩng vai trò quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men. Lợi ích sức khỏe của vi khuẩn lactic được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường tiêu hĩa của con người (Cogan và cộng sự năm 1995, Hafidh và cộng sự năm 2010). Giống Lactobacillus đã được báo cáo là cĩ hoạt tính kháng nấm khi đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại một loạt các nấm làm hỏng thực phẩm. Hoạt động kháng nấm của L. coryniformis ổn định khi bị nung nĩng ở nhiệt độ cao và độ pH 3 – 4.5 (Magnusson và Schnurer, 2001). Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như L. plantarum và L. sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - Nisin cĩ thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic (Gardiner và cộng sự, 2000; Corcoran và cộng sự, 2004.). Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của LAB đã xác định được một số hợp chất cĩ tác dụng ức chế chống lại nấm mốc và các lồi nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.6).; Lavermicocca và cộng sự, 2000;.NikuPaavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003.Sjogren, 2005). 3.7.2. Các hợp chất kháng nấm Bảng 1.3: Một số hợp chất được xác định cĩ tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất 4-hydroxy-phenyllactic acid Lactobacillus plantarum 21B 3-phenyllactic acid 30
Đồ án tốt nghiệp 3-hydroxydecanoic acid 3-hydroxydodecanoic acid Lactobacillus plantarum 3-hydroxytetradecanoic acid MILAB14 3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid Cyclo(Gly-Leu) Lactobacillus plantarum VTTE- Methylhydantoin 78076 Mevalonolactone Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, formic- and Lactibacillus sanfranciscensis n-valeric acid. CB1 Vi khuẩn lactic cĩ khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm cĩ tính axit và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất kháng nấm được xác định đều cĩ trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl, a b 31
Đồ án tốt nghiệp c d e f g h 32
Đồ án tốt nghiệp i j k l Hình 1.3: Cấu trúc phân tử của các hợp chất kháng nấm a) 4-hydroxy-phenyllactic acid, b) 3-phenyllactic acid, c) 3-hydroxydecanoic acid, d) 3-hydroxydodecanoic acid, e) 3-hydroxytetradecanoic acid, f) 3-hydroxy cis-dodecenoic acid, g) Cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin mevalonolactone, h) Caproic acid, i) Propionic acid, j) Butyric acid, k) Formic aicd, l) n-valeric acid 33
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất Tổng hợp của lactic acid và acid acetic là một trong những nhân tố chủ yếu chịu trách nhiệm về việc bảo tồn sinh học (Trias, Baneras, Badosa và Montesinos, 2008a). Sản xuất acid trong mơi trường gây ra sự suy giảm pH dẫn đến sự ức chế của nấm, các phân tử acid gây ra sự phá vỡ màng tế bào. pH thấp sẽ chuyển đổi các phân tử acid phân ly thành các phân tử acid khơng phân ly khi pH giảm xuống dưới pKa của acid tương ứng (Piper, Calderon, Hatzixanthis và Mollapour, 2001). Các phân tử acid hoạt động ở dạng khơng phân tách, vì chúng là lipo-philic và do đĩ cĩ thể đi qua màng tế bào chất. Do pH nội bào cao, acid phân ly giải phĩng proton và anion (cơ sở tiếp hợp) làm gián đoạn lực chuyển động của proton màng (Adams và Hall, 1988). Acid hữu cơ Sự ức chế tác nhân gây bệnh nấm bằng acid hữu cơ cĩ thể liên quan đến sự ức chế hoạt động của enzyme, bên cạnh cơ chế phá vỡ màng tế bào gây ra bởi các cấu tử hoạt động khơng liên kết của các acid hữu cơ này (Gerez, Carbajo, Rollan, Torres, và Font de Valdez, 2010). Baek, Kim, Choi, Yoon, Kim (2012) và Lan et al. (2012) báo cáo việc sản suất hỗn hợp các acid hữu cơ của Leuconostoc và Weissella sp. việc sử dụng chúng trong việc bảo tồn sinh học để ngăn chặn sự phát triển của nấm gây hư hỏng thực phẩm. Acid 3-phenyllactic (PLA) cũng ức chế nấm và vi khuẩn. PLA ức chế sự phát triển của nấm Candida pulcherrima, C. parapsilosis và Rhodotorula mucilaginosa (Schwenninger và cộng sự, 2008). Trong số vi khuẩn lactic, hoạt động của PLA từ Lact. plantarum 21B được chứng minh bởi Lavermicocca et al. (2000) và 34
Đồ án tốt nghiệp Lavermicocca, Valerio và Visconti (2003) lần đầu tiên chỉ ra rằng PLA được sinh ra từ Lactobacillus plantarum cĩ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của 23 chủng nấm mốc thuộc 14 lồi của chi Aspergillus, Penicillium và Fusarium đặc biệt cĩ những lồi sinh độc tố như Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus, Penicillium roquefoti, Penicillium verrucosum và Penicillium citrium phân lập từ các sản phẩm như bánh, bột, ngũ cốc. Một số vi khuẩn lactic đã được chứng minh là cĩ khả năng tổng hợp các axit PLA và 4-hydroxy- phenyllactic acid (Valerio, Lavermicocca, Pascale và Visconti, 2004). Acid béo được biết là chất gây ức chế nấm (Hou và Forman, 2000). Bốn loại HFA kháng nấm, cụ thể là 3-(R)-hydroxydecanoic acid, 3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid,3-(R)-hydroxydodecanoic acid và 3-(R)-hydroxytetradecanoic acid, đã được phân lập từ dịch nuơi cấy nổi phía trên của Lact. plantarum MiLAB 14 (Sjogren, Magnusson, Broberg và Schnurer, 2003). Tất cả các HFA được tổng hợp trong giai đoạn tăng trưởng logarit. Điều này cho thấy HFA khơng xuất hiện từ màng tế bào lysed của tế bào vi khuẩn. Cơ chế Acid béo hoạt động chính xác của hoạt động của HFA khơng được hiểu rõ. Cơ chế chung cĩ thể là, chúng thể hiện hoạt động giống như chất tẩy rửa và phá vỡ màng tế bào vi khuẩn. Do đĩ, tính thấm của màng tăng lên và giải phĩng các chất điện giải nội bào và protein từ tế bào nấm. Lact. sanfrancisco CB1 từ bột chua sản xuất axit butyric, caproic, propionic và valeric ức chế sự phát triển của Fusarium sp., Penicillium sp., Aspergillus sp. và Monilia sp. (Corsetti, Gobbetti, Rossi và Damiani, 1998). Trong số này, axit caproic là hợp chất 35
Đồ án tốt nghiệp kháng nấm chính hoạt động kết hợp với các axit khác. Gần đây, Ryu, Yang, Woo và Chang (2014) đã tinh chế thuốc kháng nấm 3-hydroxy-decanoic acid, 5-oxododecanoic acid và 3- hydroxy-5-dodecenoic từ Lact. plantarum phân lập từ kim chi. Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phơ mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 cĩ hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996) Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất. Các chủng kháng nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua (Corsetti và cộng sự, 1996), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phơ mai và sữa (Roy và cộng sự, 1996). Vi khuẩn lactic cĩ khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm cĩ tính axit và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất kháng nấm được xác định đều cĩ trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl, 3.7.3. Các hợp chất kháng khuẩn khác Bacteriocin là protein cĩ hoạt tính sinh học do vi khuẩn tiết ra, cĩ thể tiêu diệt hoặc ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác cĩ quan hệ họ hàng với chúng. Bacteriocin cĩ hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi nhiều nhĩm vi khuẩn đa dạng, cĩ thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng, đặc điểm sinh hĩa và nguồn gốc gene (Klaenhamme, 1993). Bacteriocin cĩ bản chất là peptide kháng khuẩn sinh ra để chống lại vi khuẩn khác, vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì cĩ khả năng kháng lại chính bacteriocin đĩ. Các 36
Đồ án tốt nghiệp tế bào sản xuất thì miễn dịch với hoạt tính bacteriocin (TS. Vũ Thị Lâm An, 2013). Bacteriocin được sinh ra ở cả vi khuẩn Gram dương và âm, nhưng bacteriocin từ vi khuẩn lactic được nghiên cứu nhiều nhất do tính hiệu quả, mức độ an tồn và khả năng ứng dụng làm chất bảo quản cĩ nguồn gốc tự nhiên trong cơng nghiệp thực phẩm. Bacteriocin khơng phải thuốc kháng sinh; do chúng là các peptide được tổng hợp bởi ribosome vi khuẩn, khơng phải chất chuyển hĩa thứ cấp nên nhanh chĩng bị phân cắt bởi protease trong hệ thống tiêu hĩa của người. Ưu điểm của bacteriocin là cĩ hoạt tính kháng khuẩn cao ngay cả khi ở nồng độ rất thấp. Tuy nhiên, bacteriocin thường cĩ phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh. Khác với chất kháng sinh, bacteriocin thường được dùng trong thực phẩm và khơng cĩ ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn cịn chất kháng sinh chỉ được dùng trong y tế và cĩ ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn. Trên thế giới bacteriocin được sản xuất bằng cơng nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic. Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi được trình bày trong bảng 1.5. Đa số các bacteriocin của vi khuẩn LAB cĩ trọng lượng nhỏ ( 30 kDa), cĩ tính thấm nước, khơng ổn định nhiệt và khơng được nghiên cứu rộng rãi. - Lớp IV: Là các đại phân tử, kị nước, thường là những phức vì cịn cĩ thêm chất khác. • Ứng dụng bacteriocin 37
Đồ án tốt nghiệp - Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thường là vi khuẩn lactic – LAB: Lactic acide bacteria) để tạo bacteriocin. Trong trường hợp này, khả năng LAB sinh trưởng và tạo bacteriocin trong sản phẩm là quyết định. - Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực phẩm. - Sử dụng bán thành phẩm lên men trước đĩ với một chủng sinh bacteriocin như là một thành phần trong quá trình chế biến thực phẩm. - Một lựa chọn mới hiện nay trên cơ sở dạng thứ hai là dùng màng polyethylen hoạt tính bacteriocin cho đĩng gĩi thực phẩm. Bảng 1.5: Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M. P. Zacharof, 2012) Chủng Bacteriocins Tác động Nisin Vi khuẩn gram dương Clostridium spp. Listeria monocytogenes Lactococcus lactis Staphylococcus aureus spp. Staphylococcus Lacticin 3147 dysgalace Enterococcus feacalis Propionibacterium acne Streptococcus mutans L. acidphilus spp. Acidophin CH5 Vi khuẩn gram dương Pediococcus Plantaricin EF, Plantaricin W, Carnobacteria L. plantarum spp. Plantaricin JK, Plantaricin S Clostiridia 38
Đồ án tốt nghiệp Listeria monocytogenes Leuconostoc gelidum Leucocin A Enterococcus feacalis L. casei spp. Lactocin 705 Listeria monocytogenes Các vi khuẩn sinh acid lactic cịn cĩ khả năng ức chế sự phát triển gây bệnh thơng qua một số các sản phẩm biến dưỡng ngồi bacteriocins. Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB được trỉnh bày trong bảng 1.6. Bảng 1.6: Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB. (Holzapfel và cộng sự, 1995) Sản phẩm Các sinh vật ảnh hưởng Acid lactic Vi khuẩn gram âm, 1 vài lồi nấm Acid acetic Nấm men, nấm, vi khuẩn gây thối rửa Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong thức H2O2 ăn giàu protein Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản Hệ thống lactoperoxidase với H2O2 phẩm làm từ sữa) Lysozyme Vi khuẩn gram dương Reuterin (3-OH- propoonaldehyde) Nấm mốc, nấm men Diacetyl Vi khuẩn gram âm Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau 39
Đồ án tốt nghiệp Chất ức chế tăng trưởng nấm cĩ tầm quan trọng cả trong việc kiểm sốt tác nhân gây bệnh của con người và động vật, và trong cơng tác phịng chống nấm mọc trong thực phẩm và các vật liệu khác. Các phương thức hoạt động của kháng sinh chống nấm hiện nay là rất quan trọng cho sự ức chế nấm. Nhiều chất trong số các chất này được dành riêng cho sử dụng lâm sàng nhưng một số đang được sử dụng trong sự kiểm sốt của nấm gây bệnh thực vật. Thuốc kháng sinh được xác định là chất được sản xuất bởi các vi sinh vật cĩ tác dụng diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác ở nồng độ thấp. 3.8. Ứng dụng của vi khuẩn lactic Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật cĩ hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong cơng nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong cơng nghiệp, nơng nghiệp, mơi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. 3.8.1. Trong cơng nghiệp Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu acid lactic. Cĩ vi chua dễ chịu và cĩ đặc tính bảo quản nên cĩ thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt. Chúng được dùng để axit hĩa rượu vang và hoa quả nghèo axit. Ngồi ra cịn được sử dụng trong cơng nghiệp thuộc da, dệt , nhuộm, sơn và chất dẻo. 3.8.2. Trong nơng nghiệp và mơi trường Vi khuẩn lactic cĩ khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium loại nấm gây bệnh quan trọng trong nơng nghiệp. Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây yếu đi và đây là cơ hội gây bệnh cho cây trồng. Các chế phẩm EM hay chế phẩm vi sinh hữu cơ bao gồm 80 chủng vi sinh trong đĩ cĩ sự gĩp mặt của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng. Giải quyết vấn đề gây ơ nhiễm mơi trường. 40
Đồ án tốt nghiệp Trong nơng nghiệp vi khuẩn lactic được sử dụng để ủ chua thức ăn gia súc cho mục đích sử dụng lâu dài và làm tăng giá trị dinh dưỡng. Ở Việt Nam, gần đây người ta khơng chỉ thành cơng trong lên men lactic để bảo quản thức ăn cỏ xanh cho trâu, bị mà cịn thành cơng trong việc bảo quản cá, tơm và sản phẩm phụ, phế phẩm gây ra khi thiếu hoặc khơng cĩ phương tiện bảo quản chuyên chở, chế biến kịp thời. Do đĩ đã hạn chế được các sản phẩm phụ, phế phẩm của các xí nghiệp chế biến thuỷ hải sản, các lị mổ 3.8.3. Trong y dược Vi khuẩn lactic được trong y học để chữa bệnh đường ruột, dùng trong phẫu thuật chỉnh hình, nha khoa, bệnh phụ khoa . 3.8.4. Trong bảo quản và chế biến thực phẩm Khi ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hĩa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, cĩ thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an tồn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm cĩ tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007). Vi khuẩn lactic còn sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học. Ngồi ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ cĩ hoạt tính kháng nấm như reuretin, acid lactic, Vi khuẩn lactic được sử dụng làm dưa muối, làm quả chua mà khơng mất màu tự nhiên của quả. Dùng trong sản xuất đậu phụ hay lên men sữa. 41
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phịng thí nghiệm vi sinh Viện Khoa Học Ứng Dụng Hutech Trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ 1/2018 đến 7/2018. 2.3. Vật liệu nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu Các giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacilus sp. (L5), Lactobacillus sp. (L3), Lactobacillus sp. (L2N) và nấm Aspergillus sp. (CDP1) do phịng thí nghiệm vi sinh Viện Khoa Học Ứng Dụng Hutech Trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp. Hạt đậu phộng và bắp được mua tại chợ Thị Nghè, quận Bình Thạnh, Thành Phố Hồ Chí Minh. Hạt đậu nành mua tại siêu thị, Thành phố Hồ Chí Minh. Bắp cải và giá đậu được mua ở chợ, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.3.2. Hĩa chất sử dụng Các hố chất dùng để pha mơi trường MRS – broth, MRS cải tiến và mơi trường PDA. Các hố chất dùng để pha các loại thuốc thử: Lugol, Phenolphthalein, Crystal violet NaOH 0.1N Cồn 96°, 70° Nước cất - Mơi trường sử dụng: Mơi trường MRS broth, MRS agar cải tiến để nuơi cấy vi khuẩn lactic. Mơi trường PDB, PDA để nuơi cấy các chủng nấm mốc. 42
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3. Thiết bị Tủ cấy vi sinh (Brlad France) Tủ ủ (Memmert Germany) Tủ lạnh Toshiba Tủ sấy (Memmert Germany) Máy ly tâm (Tuttligen Germany) Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA) Autoclave (Memmert - Đức) Cân phân tích (Orbital Germany) Bếp từ (Billy – England) Máy nước cất (Branstead USA) Bể điều nhiệt 2.3.4. Dụng cụ Ống nghiệm, đĩa petri thuỷ tinh, erlen, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống đong, đũa thuỷ tinh, chai thủy tinh 100 ml. Pipet thuỷ tinh 5 ml, 10 ml, 20 ml, pipetman 100 – 1000 µl. Que cấy, que trang, kẹp gắp thạch, que đục lỗ thạch, đèn cồn, eppendorf 1 ml, ống falcon 50 ml. Bơng thấm nước, bơng khơng thấm nước, giấy lọc, giá đỡ ống. 2.4. Phương pháp luận 2.4.1. Mục tiêu đồ án Khảo sát khả năng dịch nuơi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N trong bảo quản và xử lý của hạt đậu phộng. 2.4.2. Nội dung Hoạt hĩa các chủng lactic Lactobacilus sp. (L5), Lactobacillus sp. (L3), Lactobacillus sp. (L2N) và chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1. Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hĩa của các chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L2N. 43
Đồ án tốt nghiệp Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với Aspergillus sp. CĐP1. Khảo sát mơi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy vi khuẩn lactic đến khả năng nảy mầm của các loại hạt giống. Khảo sát khả năng bảo quản các loại hạt giống khỏi Aspergillus sp. CĐP1 của dịch nuơi cấy vi khuẩn lactic. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy vi khuẩn lên men lactic đến sự phát triển của hạt giống. 2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu 44
Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn lactic Chủng nấm L5, L2N, L3 mốc CĐP1 Khảo sát hình thái, sinh lý Khảo sát khả năng phát hĩa triển, hình thái Khảo sát khả năng: Khảo sát mơi trường lên sinh acid lactic, sinh men thích hợp (MRS borth, IAA, phân giải lân, Bắp cải, Giá đậu) tạo màng biofilm, đối kháng nấm Khảo sát khả năng phối hợp ba chủng lactic bảo Chọn mơi trường quản hạt đậu phộng lên men Tỷ lệ phối trộn L5:L3:L2N lần lượt 1:1:1, 1:1:2, 1:2:1 x Khơng xử lý nhiệt, 85 0C -10 phút, 100 0C - 3 phút x Khơng trung hịa, pH5, pH6 Tỷ lệ nảy mầm, chiều Ứng dụng vi khuẩn lactic kích thích nảy dài, khối mầm, tăng trưởng cây đậu phộng lượng thân lễ, độ khỏe mầm Đề nghị quy trình sản xuất hạt giống đã xử lý Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 45
Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic Phương pháp khảo sát độ thuần khiết của các chủng vi khuẩn lactic Lactobacilus sp. (L5), Lactobacillus sp. (L3), Lactobacillus sp. (L2N) và chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1. Chủng vi khuẩn lactic Tăng sinh trong mơi trường MRS Broth 37 0C,24 h Quan sát hình Cấy truyền sang MRS agar thái khuẩn lạc Sinh IAA, Phân giải lân, Khảo sát đặc điểm nuơi cấy Các thử Tạo Biofilm của chủng vi khuẩn lactic nghiệm sinh hĩa, sinh lý Thích hợp tạo chế phẩm Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic 46
Đồ án tốt nghiệp Các chủng vi khuẩn sinh acid lactic và nấm mốc cĩ khả năng bị suy yếu hoặc nhiễm các lồi vi khuẩn khác, chính vì thế cần phải được hoạt hố, khảo sát để đánh giá sự thuần khiết. Ba chủng vi khuẩn sinh lactic L5, L2N, L3 cĩ khả năng kháng nấm cao, sinh acid lactic mạnh được lấy từ phịng thí nghiệm vi sinh khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi Trường của Trường Đại Học Cơng Nghệ Hồ Chí Minh. Chủng vi khuẩn lactic được tăng sinh trong mơi trường MRS Broth và ủ ở 37 °C trong 24 giờ. Sau đĩ, tiến hành cấy chuyển trên MRS Agar và ủ 1 ngày ở 37 °C, sau khi quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm nuơi cấy ở hai điều kiện lắc và khơng lắc, đem thử nghiệm thí nghiệm sinh lý, sinh hố, khả năng sinh IAA, phân giải P và khả năng tạo biofilm. 2.5.2.1. Nhuộm gram Mục đích: Giúp ta phân loại được 2 nhĩm lớn: Vi khuẩn Gram dương (Gram- positive) bắt màu tím và Vi khuẩn Gram âm (Gram-negative) bắt màu hồng. Ngồi ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống. Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến - Chuẩn bị vết bơi: dùng que cấy vơ trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hồ vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khơ trong khơng khí. - Cố định tế bào: hơ nhanh vết bơi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. Việc cố định nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bơi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống. - Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khơ. - Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khơ. - Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước, thấm khơ. - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 30 giây, rửa nước, để khơ trong khơng khí. 47
Đồ án tốt nghiệp - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x. Kết quả: Vi khuẩn gram dương bắt màu tím, gram âm bắt màu hồng. 2.5.2.2. Nhuộm bào tử Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khĩ bắt màu, chứa nhiều lipid). Đầu tiên xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và acid. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm cĩ hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nĩ bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đĩ tế bào chất của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt. Trong đĩ bào tử sẽ cĩ màu xanh và tế bào cĩ màu hồng. Các vi khuẩn Gram dương thu được từ bước trên được tiếp tục kiểm tra khả năng sinh bào tử. Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già để nhuộm bào tử. Từ kết quả thu được ta loại bỏ các chủng cĩ bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương khơng sinh bào tử. Tiến hành: Phương pháp Schaeffer – Fulton và sử dụng dịch nuơi cấy sau 7 ngày. - Nuơi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 – 7 ngày. - Làm vết bơi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram. - Nhuộm bằng dung dịch malachite green trong 10 phút, rửa nước. - Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khơ. - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x Kết quả: Bào tử bắt màu lục, tế bào bắt màu hồng. Chú ý: Phân biệt bào tử với các hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục 2.5.2.3. Thử nghiệm Catalase Mục đích: Kiểm tra khả năng phân hủy H2O2 tạo ra O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh enzyme catalase. 48
Đồ án tốt nghiệp Các chủng vi khuẩn thu được sau bước nhuộm acid được tiến hành thử nghiệm Catalase. Trong thí nghiệm này, chỉ cĩ những chủng vi khuẩn cho catalase âm tính là cĩ khả năng là vi khuẩn lactic. Tiến hành: - Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính. - Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hố (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính. Kết quả: Vi khuẩn cĩ khả năng sinh enzyme catalase nếu xuất hiệt bọt khí sủi bọt mạnh và nhanh, âm tính khi khơng cĩ hiện tượng xảy ra. 2.5.2.4. Thử nghiệm khả năng lên men đường Mục đích: Kiểm tra khả năng lên men các loại đường khác nhau của vi khuẩn. Tiến hành: Mơi trường MRS Broth lần lượt thay thế đường glucose thành các loại đường (Sucrose, D-galactose, D-glucose, D-malnitol, Fructose, D(+)manose) cần kiểm tra, bổ sung Bromocresol green và cĩ ống durham, hấp khử trùng và cấy vi khuẩn vào, ủ ở 37°C trong 24 giờ. Kết quả: Nếu mơi trường đổi màu, đục và cĩ bọt khí bên trong ống Durham thì chủng vi khuẩn đĩ lên men dị hình. Đối với những ống nghiệm khơng cĩ bọt khí trong ống Durham thì cần kiểm tra lại bằng cách đốt đỏ que cấy và đặt sát bề mặt mơi trường, nếu thấy cĩ bọt khí nổi lên thì chủng vi khuẩn đĩ cũng lên men cĩ sinh khí yếu. Đánh giá khả năng lên men qua mức độ đổi màu mơi trường. Mơi trường màu vàng: lên men mạnh (+++) Mơi trường màu xanh lá: lên men trung bình (++) Mơi trường màu xanh dương nhạt: lên men yếu (+) Mơi trường màu lam đậm (khơng đổi màu): khơng lên men (-) 49
Đồ án tốt nghiệp 2.5.2.5. Khả năng di động Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong mơi trường thạch mềm 0,5 – 0,7% agar. Vì vi khuẩn lactic khơng cĩ khả năng di động, chỉ mọc theo đường cấy thẳng đứng trong ống chứa mơi trường thạch mềm và khơng làm đục mơi trường xung quanh nên trong thử nghiệm này, ta loại bỏ được các vi khuẩn di động khơng phải là vi khuẩn lactic, chúng sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục mơi trường xung quanh. Tiến hành: - Dùng que cấy cĩ đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào mơi trường thạch bán lỏng. - Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1-3 ngày, cĩ khi lâu hơn. Kết quả: Vi khuẩn cĩ khả năng di động khi đường cấy lan ra, vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng khơng cĩ khả năng di động, một vài trường hợp do vi khuẩn sinh hơi nên thạch bị nứt. 2.5.3. Khả năng phân giải lân Mục đích: Các chủng khác nhau sẽ cĩ khả năng phân giải phosphate khĩ tan khác nhau. Do đĩ, để thu được chủng cĩ đặc tính phân giải phosphate khĩ tan tốt ứng dụng được trong thực tiễn nơng nghiệp, cần thiết đánh giá hoạt tính phân giải phosphate khĩ tan của từng chủng VSV. Vi sinh vật phân giải hợp chất phosphor khĩ tan là vi sinh vật, thơng qua hoạt động của chúng tương tác với các hợp chất phosphor khĩ tan được chuyển hĩa thành dễ tiêu đối với cây trồng (cơ chế tiết acid hữu cơ hoặc enzyme phosphatase). Vi sinh vật phân giải hợp chất khĩ tan tạo vịng trịn trong suốt bao quanh khuẩn lạc (vịng phân giải) trên mơi trường chứa nguồn phosphor duy nhất là Ca3(PO4) hoặc lecithin (chủ yếu là phosphatidylcholine). 50
Đồ án tốt nghiệp Đánh giá hoạt tính phân giải phosphate của các chủng VSV dựa trên nồng độ 3- orthophosphate (PO4 ) cĩ trong dịch nuơi cấy. Nồng độ orthophosphate càng cao chứng tỏ lượng phosphate khĩ tan bị phân giải càng nhiều. Nồng độ orthophosphate được xác định bằng phương pháp Stannous Chloride. Trong mơi trường acid, orthophosphate trong mẫu sẽ phản ứng với ammonium molypdate (AM) tạo thành molypdophosphoric acid màu vàng, acid này sau đĩ bị khử bởi SnCl2 và sản phẩm khử là phức chất màu xanh dương. Phức màu xanh cĩ bước sĩng hấp thụ cực đại ở 690nm. - Nuơi cấy vi khuẩn lactic trên mơi trường MRS Broth, trong 24 giờ ở điều kiện lắc. - Kiểm sốt dịch tăng sinh OD 600nm = 0.8. - Hút 1ml dịch nuơi cấy và chuyển vào 20ml mơi trường P đã hấp khử trùng. - Kiểm tra khả năng phân giải phosphate khĩ tan sau 3, 5, 7 ngày bằng phương pháp Stannous Chloride: Lấy dịch nuơi cấy VSV, đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch trong, bổ sung thêm 4ml AM, 10 giọt dung dịch SnCl2. Định mức tới vạch 50ml bằng nước cất, đảo đều bình, đợi 10-12 phút, đo OD690nm. 2.5.4. Khả năng sinh IAA Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng VSV dựa trên nồng độ IAA cĩ trong dịch chiết nuơi cấy vi khuẩn. Nồng độ IAA cĩ trong dịch chiết càng cao chứng tỏ khả năng sinh IAA của VSV càng mạnh. Nồng độ IAA được xác định bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ với thuốc thử Salkowski ở bước sĩng 530nm. Thu dịch nuơi cấy và li tâm 8000v/p trong 15 phút, lấy 1ml dịch trong cho vào ống nghiệm dán băng keo đen, bổ sung 2ml thuốc thử Salkowski, lắc đều, để 15 phút trong tối ở nhiệt độ phòng chờ phản ứng xảy ra hồn tồn. Tiến hành đo OD ở bước sĩng 530nm. Tạo đường chuẩn: 51
Đồ án tốt nghiệp • Cân 0.01g IAA bổ sung vào 100ml mơi trường MRS Broth ban đầu, thu được dung dịch IAA cĩ nồng độ 100mg/l. Pha lỗng để thu được dung dịch IAA ở các nồng độ 5, 10, 15, 20, 25 mg/l. • Hút 1ml mỗi nồng độ IAA ở trên cho vào ống nghiệm được dán băng keo đen, bổ sung vào mỗi ống 2ml thuốc thử Salkowski, lắc đều, để 15 phút trong tối ở nhiệt độ phịng chờ phản ứng xảy ra hồn tồn. Tiến hành đo OD ở bước sĩng 530nm. 2.5.5. Khả năng tạo màng Biofilm Mục đích: Xác định khả năng tạo màng biofilm của vi khuẩn. Tiến hành: - Pha lỗng dịch nuơi cấy 1:100 trong mơi trường MRS Broth mới. - Phối 5ml vào 1 ống falcon (15ml), mỗi chủng 8-10 ống. - Ủ ở 37°C, qua đêm. - Đổ bỏ dịch trong, lắc nhẹ cho trơi hết mơi trường. - Rửa nhẹ bằng nước cất vơ trùng (khơng được làm khuấy đảo lớp tế bào), đổ bỏ nước. Lặp lại như vậy 3 lần. - Cố định tế bào bằng cách đặt ống falcon trong tủ sấy 80°C, trong 30 phút. - Thêm 6.5ml dung dịch Crystal Violet (CV) 0.1%, để ở nhiệt độ phịng 10 – 15 phút. - Rửa bằng nước cất vơ trùng, lắc và dậm lên 1 tờ khăn giấy để loại bỏ tế bào dư và thuốc nhuộm. - Lập úp ống để khơ. - Thêm 6.5ml acid acetic 30% (trong nước cất) vào ống falcon để hồ tan CV. - Để ở nhiệt độ phịng từ 10 – 15 phút. - Chuyển vào trong ống cuvette. - Đo quang phổ ở bước sĩng 550nm. Mẫu blank sử dụng là acid acetic 30% 2.5.6. Chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1. 52
Đồ án tốt nghiệp Chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 370C,24h Tăng sinh trong mơi trường PDB Cấy điểm 0 37 C,72h Đĩa peptri MRS Quan sát hình Đĩa peptri PDA thái, sợi nấm agar cải tiến Đo đường kính tăng trưởng của nấm Hình 2.3 Sơ đồ khảo sát khả năng phát triển của chủng nấm CĐP1 Chủng nấm CĐP1 phân lập từ hạt đậu phộng (CĐP1) được lấy từ phịng thí nghiệm vi sinh khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi Trường trường đại học Cơng Nghệ Hồ Chí Minh, người thực hiện tiến hành kiểm tra sự phát triển của các chủng nấm, vì chủng nấm mốc cần khoẻ mạnh để làm đề tài. Chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 được nuơi cấy trong cấy điểm trên đĩa mơi trường PDA và MRS Agar cải tiến đã được hấp khử trùng và ủ ở 37°C trong vịng 72 giờ. Tiến hành đo đường kính vịng phát triển của nấm, so sánh khả năng phát triển của chủng nấm mốc trên 2 loại mơi trường. 53
Đồ án tốt nghiệp Quan sát hình thái chủng nấm dưới kính hiển vi điện tử và thực hiện phương pháp phịng ẩm để quan sát vi thể. Xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin và xác định mật độ. 2.5.6.1. Khảo sát sự phát triển trên các loại mơi trường Mục đích: Kiểm tra mơi trường MRS Agar cải tiến khơng làm ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc. Thích hợp sử dụng để thực hiện các thí nghiệm về sau. Tiến hành: - Chủng nấm mốc được cấy điểm sang đĩa mơi trường PDA đã được hấp khử trùng và ủ ở 37°C trong vịng 72 giờ. - Sau đĩ dùng que đục, đục lỗ thạch nấm và chuyển từ mơi trường PDA sang mơi trường MRS Agar cải tiến, ủ ở 37°C trong vịng 72 giờ. - Tiến hành đo đường kính vịng phát triển của nấm. 2.5.6.2. Khảo sát hình thái Quan sát dưới kính hiển vi và thực hiện phương pháp phòng ẩm. Tiến hành - Chuẩn bị mơi trường: Đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) mơi trường PDA lên đĩa petri. Khi thạch đơng cứng dùng dao mổ vơ trùng cắt thành từng mẫu hình vuơng 1cm x 1cm. - Chuẩn bị đĩa petri, lame, lamelle, giấy lọc, tất cả đều được vơ trùng bằng cách sấy 1600C trong vịng 1h hoặc hấp vơ trùng. - Đặt khối thạch (1cm2) lên lame. - Dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, lấy một ít sinh khối nấm cấy lên 4 gĩc khối thạch. Sau đĩ đậy lamelle lên khối thạch rồi cho vào đĩa petri cĩ lĩt sẵn giấy thấm. - Nhỏ giọt nước cất vơ trùng cho ướt tồn bộ giấy thấm trong đĩa. - Đậy nắp đĩa petri và ủ đĩa ở nhiệt độ phịng trong vịng 2 – 3 ngày. 54
Đồ án tốt nghiệp - Lấy khẽ lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch cĩ sẵn một giọt Methylene blue. - Lấy nhẹ nhàng khối thạch ra khỏi lame, nhỏ một nhọt Methylene blue và đặt một miếng lamelle sạch lên. - Sử dụng kính hiển vi quang học với độ phĩng đại 10X và 40X để quan sát. - Các thao tác thực hiện như trên được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn 2.5.7. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1. Thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định khả năng kháng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 của vi khuẩn lactic in vitro. Chủng vi khuẩn lactic được tăng sinh trong mơi trường MRS Broth ở 37°C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5%. Dịch nuơi cấy chủng LAB Cấy 2 đường Đục lỗ Nấm mốc trên Đĩa petri MRS Agar cải tiến PDA 0 37 C, 72 giờ Đo đường kính vịng phát Tỷ lệ ức chế nấm mốc triển của nấm Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1. 55
Đồ án tốt nghiệp Tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm. - Mơi trường sử dụng là MRS Agar cải tiến. - Chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 được đục từ mơi trường PDA đã cấy trước đĩ 3 ngày và đặt vào tâm đĩa. Ủ ở 37 0C trong 24 giờ. - Dùng que cấy ria 2 đường song song nhau, cách thành đĩa 1,5 cm. - Ủ ở 37 0C trong 72 giờ. Sau đĩ đo đường kính vịng nấm và tính tỉ lệ kháng nấm. Cơng thức tính tỉ lệ kháng nấm được tính theo W.S. Abbott. Dđối chứng − Dthí nghiệm Tỉ lệ kháng nấm (%) = × 100% Dđối chứng Trong đĩ: Dđối chứng – Đường kính vịng nấm đĩa đối chứng (mm). Dthí nghiệm – Đường kính vịng nấm đĩa thí nghiệm (mm). 2.5.8. Phương pháp khảo sát mơi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic Nhằm tìm kiếm mơi trường thích hợp cho sự phát triển và sản xuất chế phẩm sinh học. Các loại mơi trường khác nhau được sử dụng để khảo sát và so sánh với mơi trường MRS Broth gồm cĩ: - MRS Broth - Nước giá: 500 g giá được nấu với 1 L nước trong 15-20 phút, bổ sung 15 g đường và 12 g pepton. Đem hấp khử trùng. - Nước bắp cải: 500 g bắp cải được nấu với 1 L nước trong 15-20 phút, bổ sung 15 g đường và 12 g peptone. Đem hấp khử trùng. Chủng vi khuẩn lactic L5, L2N và L3 được tăng sinh trong mơi trường MRS Broth trong 24 giờ, ở 37 0C. Sau đĩ chuyển qua các mơi trường khảo sát, tỉ lệ cấy giống 5%. Tiến hành so sánh mật độ tế bào, khả năng sinh acid lactic của các chủng LAB giữa các loại mơi trường. Đồng thời kiểm tra khả năng: Kháng nấm, sinh IAA, phân giải P và tạo biofilm để khẳng định vi khuẩn vẫn cịn duy trì các khả năng mong muốn. 2.5.9. Xác định acid lactic 56
Đồ án tốt nghiệp Mục đích: Xác định hàm lượng acid tổng bằng phương pháp quy về acid lactic để xác định hàm lượng acid lactic sinh ra từ chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm nhằm. Hàm lượng acid trong dịch lên men cĩ thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ cĩ sự đổi màu của dung dịch thuốc thử Phenolphatalein. Tiến hành: Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên nuơi cấy vi khuẩn, thêm 2 – 3 giọt Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Sử dụng máy đo pH để chuẩn độ đến khi pH đạt 8,0 và ghi kết quả. Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic như sau V × K % Acid lactic = 1 × 100% V2 Trong đĩ: V1 – Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml). K – Hệ số đổi ra acid tương ứng, với acid lactic là 0,009. V2 – Thể tích dịch nuơi cấy đem đi chuẩn độ (ml). Đường chuẩn vi khuẩn lacti 2.5.10. Xác định mật độ vi khuẩn Các chủng vi khuẩn được tăng sinh trong mơi trường lỏng trong 24 giờ. Ly tâm 4000 vịng/phút trong 15 phút. Thu sinh khối. Rửa lại bằng nước cất để sạch mơi trường, đem ly tâm 4000 vòng/phút. Lặp lại 3 lần. Đưa về thể tích ban đầu bằng nước muối sinh lý 0.9%. Pha lỗng theo hệ số 2n. Đo OD 600 nm, ống trắng là nước muối sinh lý 0.9%. Dựng đường chuẩn 57
Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn lactic 37 0C, 24 giờ Tăng sinh trong mơi trường lỏng Ly tâm 400 vịng/phút trong Pha lỗng ra các nồng độ bằng 15phút mơi trường lên men Thu sinh khối, hịa tan bằng Phương pháp bản nước muối sinh lý giọt Đo OD600nm Đếm khuẩn lạc Đường chuẩn tế bào Hình 2.5: Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn Đĩa petri chứa mơi trường MRS Agar được đặt trong tủ sấy qua đêm, nhiệt độ 37°C để khơ mặt mơi trường. Chủng vi khuẩn lactic được tăng sinh trong mơi trường lên men. Tiến hành pha lỗng bằng eppendorf thành các nồng độ thích hợp. Hút 10µl dịch pha lỗng và nhỏ lên đĩa petri. Lặp lại 3 lần, 4 nồng độ trên 1 dĩa petri. Ủ đĩa ở 37°C, trong 24 tiếng. Đếm số khuẩn lạc. Cơng thức tính số tế bào vi khuẩn. 58
Đồ án tốt nghiệp N A (cfu/ml) = n1 × V × f1 + ⋯ + ni × V × fi Trong đĩ: A – Số tế bào vi khuẩn trong 1ml. N – Tổng số khuẩn lạc. n – Số lượng cấy tại độ pha lỗng. V – Thể tích (ml) cấy vào mơi trường. f – Độ pha lỗng tương ứng. Xác định mật độ tế bào (tb/ml): Sử dụng kết quả A và chia cho các hệ số pha lỗng 2n, để ra được mật độ tế bào tại từng độ pha lỗng đĩ. Lấy log. Dựng đường tương quan của 5 giá trị OD600nm (cĩ OD < 0.4) và log (tb/ml). 2.5.11. Phương pháp khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 Sơ đồ thí nghiệm được trình bày như trên hình 2.6 59
Đồ án tốt nghiệp Các chủng VK lactic 108 cfu/ml Hạt đậu Điều chỉnh pH, phộng Phối theo tỷ lệ xử lý nhiệt độ Ngâm Khử trùng bề mặt Ngâm 15 phút Làm khơ Vào chai thủy tinh 100 ml vơ trùng Bảo quản ở nhiệt độ phịng và theo dõi tơ nấm mọc theo các ngày Hình 2.6: Sơ đồ khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 Chủng vi khuẩn lactic được tăng sinh trong mơi trường lên men chọn được ở nội dung 2 ở 37 0C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5 %, mật độ tế bào được đưa về 108 cfu/ml, bổ sung thêm 0.1 % Tween 80 và đem xử lý ở các điều kiện khác nhau như trên bảng 2.1 60
Đồ án tốt nghiệp Hạt đậu phộng được chọn lựa kĩ càng, đồng đều nhau, khơng cĩ hư hỏng, nứt hạt. Hạt được rửa sạch bằng nước cất và để ráo. Sau đĩ cứ 50 g hạt mỗi loại được ngâm trong 120 ml dung dịch. Cĩ cơng thức phối trộn và xử lý như sau: Thí nghiệm 1: Dịch nuơi cấy khơng trung hồ pH. Đối chứng 1 Nước cất Đối chứng 2 Daconil 0.5g/l 1 Dịch nuơi cấy L5 khơng gia nhiệt 1 Dịch nuơi cấy L3 khơng gia nhiệt Nghiệm thức 1 1 Dịch nuơi cấy L2N khơng gia nhiệt 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 khơng gia nhiệt 2 Dịch nuơi cấy L3 khơng gia nhiệt Nghiệm thức 2 1 Dịch nuơi cấy L2N khơng gia nhiệt 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 khơng gia nhiệt 1 Dịch nuơi cấy L3 khơng gia nhiệt Nghiệm thức 3 2 Dịch nuơi cấy L2N khơng gia nhiệt 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút 1 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 4 1 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút 2 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 5 1 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút 0.1% Tween 80 61
Đồ án tốt nghiệp 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút 1 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 6 2 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút 1 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 7 1 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút 2 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 8 1 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút 1 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 9 2 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút 1 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 10 1 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút 2 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 11 1 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 12 1 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút 62
Đồ án tốt nghiệp 2 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút 0.1% Tween 80 Thí nghiệm 2: Dịch nuơi cấy trung hồ pH về 5.0 Đối chứng 1 Nước cất Đối chứng 2 Daconil 0.5g/l 1 Dịch nuơi cấy L5 khơng gia nhiệt 1 Dịch nuơi cấy L3 khơng gia nhiệt Nghiệm thức 1 1 Dịch nuơi cấy L2N khơng gia nhiệt 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 khơng gia nhiệt 2 Dịch nuơi cấy L3 khơng gia nhiệt Nghiệm thức 2 1 Dịch nuơi cấy L2N khơng gia nhiệt 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 khơng gia nhiệt 1 Dịch nuơi cấy L3 khơng gia nhiệt Nghiệm thức 3 2 Dịch nuơi cấy L2N khơng gia nhiệt 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút 1 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 4 1 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút 2 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 5 1 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút 0.1% Tween 80 63
Đồ án tốt nghiệp 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút 1 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 6 2 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút 1 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 7 1 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút 2 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 8 1 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút 1 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 9 2 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút 1 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 10 1 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút 2 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 11 1 Dịch nuơi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút 0.1% Tween 80 1 Dịch nuơi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 12 1 Dịch nuơi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút 64