Đồ án Ứng dụng nấm trichoderma trong quản lý nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long tại Bình Thuận

91 trang thiennha21 12/04/2022 2780

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Ứng dụng nấm trichoderma trong quản lý nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long tại Bình Thuận", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_ung_dung_nam_trichoderma_trong_quan_ly_nam_gay_benh_do.pdf

Nội dung text: Đồ án Ứng dụng nấm trichoderma trong quản lý nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long tại Bình Thuận

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG NẤM TRICHODERMA TRONG QUẢN LÝ NẤM GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN THANH LONG TẠI BÌNH THUẬN Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện: Huỳnh Lê Trúc Giang MSSV: 1151110109 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian làm đề tài tại Phòng thí nghiệm, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, dưới sự giúp đỡ, chỉ bảo và dìu dắt tận tình của thầy cô, sự hổ trợ của gia đình, bạn bè cùng với sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, em đã hoàn đề tài tốt nghiệp của mình. Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quan trọng, quý báu trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn tới sinh viên Lê Huỳnh Hoài Thương, sinh viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình giúp đỡ trong quá trình thu thập mẫu Thanh long tại Bình Thuận cũng như hổ trợ em trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu. Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn tới Bố, Mẹ, người thân và bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên, hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp. TP.HCM, Ngày 20 tháng 08 năm 2015 Sinh viên Huỳnh Lê Trúc Giang
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoán: - Những nội dung trong đề tài này do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Thị Hai. - Các só liệu phân tích trong đề tài có nguồn gốc rõ ràng , được công bố theo đúng quy định. - Mọi tham khảo trong đề tài được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian nghiên cứu. - Các kết quả được thể hiện trong đề tài cho tôi tự nghiên cứu, phân tích một cách trung thực, khách quan. - Nếu có sự sao chép, vi phạm qui định hay gian trá, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Sinh viên Huỳnh Lê Trúc Giang
MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài: 1 2. Tình hình nghiên cứu: 2 3. Mục đích nghiên cứu: 2 4. Nội dung nghiên cứu: 2 5. Các kết quả đạt được của đề tài: 3 6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp: 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 4 1.1. Giới thiệu về thanh long: 4 1.1.1. Tình hình thanh long ở trong nước: 5 1.1.2. Tình hình thanh long ngoài nước: 5 1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của trái thanh long: 6 1.1.4. Phân loại: 7 1.1.5. Thanh long tại Bình Thuận: 9 1.1.5.1. Đặc điểm của thanh long tại Bình Thuận: 9 1.1.5.2. Diện tích phân bố và năng suất của thanh long tại Bình thuận: 10 1.1.5.3. Tình hình xuất khẩu thanh long tại Bình Thuận: 10
1.2. Giới thiệu về bệnh đốm trắng hại thanh long và biện pháp phòng trừ: 11 1.2.1. Sâu bệnh hại thanh long và biện pháp phòng trừ: 11 1.2.1.1 . Côn trùng: 11 1.2.1.2. Bệnh, dịch hại: 13 1.2.1.3. Các hiện tượng sinh lý 15 1.2.2. Bệnh đốm trắng hại thanh long: 15 1.2.2.1. Tác nhân gây bệnh: 15 1.2.2.2. Thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra: 17 1.2.3. Biện pháp phòng trừ: 18 1.3. Giới thiệu về nấm Trichoderma: 19 1.4. Cơ chế đối kháng nấm gây bệnh của nấm Trichoderma: 22 1.4.2. Hiện tượng “giao thoa sợi nấm”: 22 1.4.3. Cơ chế tiết kháng sinh: 23 1.4.4. Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống: 25 1.4.5. Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật: 26 1.5. Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực vật: 26 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Địa điểm và thời gian: 30 2.1.1. Địa điểm: 30 2.1.2. Thời gian: 30 2.2. Vật liệu: 30 2.2.1. Nguyên liệu: 30 2.2.1.1. Cành thanh long: 30
2.2.1.2. Chủng nấm Trichoderma: 30 2.2.2. Hóa chất: 30 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị: 30 2.2.3.1. Dụng cụ: 30 2.2.3.2. Thiết bị: 31 2.2.3.3. Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm: 31 2.3. Phương pháp nghiên cứu: 32 2.3.1 Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng: 32 2.3.2 Chọn lọc chủng Trichoderma theo phương pháp đối kháng trực tiếp trong đĩa petri (in vitro): 35 2.3.3. Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh đốm trắng của các chủng Trichoderma có triển vọng trong điều kiện in vivo: 36 2.3.4. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm: 39 2.4. Phương pháp xử lí số liệu: 41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1. Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng: 42 3.1.1. Kết quả phân lập: 42 3.1.2. Đặc điểm đặc trưng của nấm N1: 43 3.1.2.1. Đặc điểm đại thể: 43 3.1.2.2. Đặc điểm vi thể: 45 3.1.3. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch: 46 3.2. Chọc lọc chủng nấm Trichoderma đối kháng với nấm Neoscytalidium dimidiatum trong đĩa petri (in vitro): 48
3.3. Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh đốm trắng của các chủng Trichoderma có triển vọng ở điều kiện in vivo: 54 3.4. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm: 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật Ctv: Cộng tác viên PDA: Potato D – Glucose Agar
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần sinh hóa của 100g thịt quả thanh long 6 Bảng 1.2. Các loại thuốc tham gia thí nghiệm và hoạt chất 27 Bảng 2.1. Số cành và số vết bệnh lây nhiễm trên cây thanh long khỏe 38 Bảng 2.2. Liều lượng thuốc BVTV sử dụng cho 100ml môi trường 40 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và đường kính trung bình của nấm N1 nuôi cấy trên môi trường PDA. 43 Bảng 3.2. So sánh nấm N1 với nấm Neoscytalidium dimidiatum 46 Bảng 3.3. Kết quả lây nhiễm bệnh trên thanh long khỏe theo quy tắc Koch 47 Bảng 3.4. Đường kính trung bình tản nấm và phần trăm ức chế của 7 chủng nấm Trichoderma với nấm Neoscytalidium dimidiatum: 49 Bảng 3.5. Phần trăm ức chế của 7 chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh: 52 Bảng 3.6. Tỷ lệ nhiễm bệnh trên thanh long sau khi xử lí đối kháng 54 Bảng 3.7. Chỉ số bệnh đốm trắng xuất hiện trên cành thanh long sau khi xử lí đối kháng 56 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các loại thuốc đến sự phát triển của nấm Trichoderma ở 2 ngày sau cấy 60 Bảng 3.9. Tỷ lệ ức chế của thuốc đối với nấm Trichoderma trong điều kiện invitro 61
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cây thanh long và trái thanh long 4 Hình 1.2. Trái thanh long vỏ hồng, ruột trắng 7 Hình 1.3. Trái thanh long vỏ hồng, ruột đỏ 8 Hình 1.4. Trái thanh long vỏ vàng, ruột trắng 8 Hình 1.5. Nấm Neoscytalidium dimidiatum 16 Hình 1.6. Khuẩn ty và bào tử của một số loài nấm Trichoderma 20 Hình 1.7. Hiện tượng giao thoa sợi nấm (Agrios, 2005) 23 Hình 2.1. Thanh long được ươm trồng trong chậu 37 Hình 3.1. Cành thanh long bệnh thu tại vườn thanh long ở Bình Thuận 42 Hình 3.2. Cành thanh long bị bệnh trước và sau khi lây nhiễm theo quy tắc Koch 47 Hình 3.3. Nấm phân lập từ cành thanh long nhiễm bệnh theo quy tắc Koch 48 Hình 3.4. Kết quả đối kháng của 7 chủng Trichoderma với nấm gây bệnh Neoscytalidium dimidiatum 53 Hình 3.5. Mẫu thanh long đối chứng khi phun nấm N1 57 Hình 3.6. Mẫu thanh long thí nghiệm khi phun nấm N1 và phun thuốc BVTV Dipomate 80WP 58 Hình 3.7. Mẫu thanh long thí nghiệm khi phun nấm N1 và phun bào tử Trichoderma T5 58 Hình 3.8. Mẫu thanh long thí nghiệm khi phun nấm N1 và phun bào tử Trichoderma T6 59 Hình 3.9. Mẫu thanh long thí nghiệm khi phun nấm N1 và phun bào tử Trichoderma T7 59 Hình 3.10. Ảnh hưởng của thuốc đối với chủng Trichoderma T5 62 Hình 3.11. Ảnh hưởng của thuốc đối với chủng Trichoderma T6 63 Hình 3.12. Ảnh hưởng của thuốc đối với chủng Trichoderma T7 64
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài: Trong những năm gần đây, thanh long là một trong những cây ăn quả có kim ngạch xuất khẩu lớn nhất so với các loại cây ăn quả khác và trở thành cây có giá trị kinh tế cao. Quả thanh long hiện nay được xem là một loại “siêu thực phẩm”, vì không chỉ ăn ngon mà còn rất bổ dưỡng. Giá trị dinh dưỡng của thanh long khá cao, một quả thanh long chứa rất nhiều chất dinh dưỡng có lợi như: calo, natri, canxi, sắt, đường, chất xơ, vitamin, chất béo không bão hòa và protein. Với các thành phần dinh dưỡng phong phú như: tốt cho hệ tim mạch, hổ trợ tiêu hóa, thanh nhiệt cơ thể, làm đẹp da, chữa bỏng nhẹ . quả thanh long có những ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe của con người. Để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ở Việt Nam và tăng cường xuất khẩu ra các nước trên Thế giới, diện tích trồng cây thanh long ngày càng được mở rộng ở nước ta, nhiều nhất là ở Bình Thuận (22.000 ha), Long An (3.000 ha), Tiền Giang (2.500 ha) và rải rác ở các nơi khác. Trước kia, thanh long được xem là một loại cây dễ trồng và ít sâu bệnh hại, nhưng hiện nay, với những điều kiện thâm canh, sâu bệnh hại xuất hiện ngày càng nhiều gây những ảnh hưởng tiêu cực đến cây thanh long. Có thể kể đến bệnh thối đầu cành, thán thư, nám cành, Đặc biệt là bệnh đốm trắng (hay còn gọi là bệnh “đốm nâu”, “tắc kè”, bệnh ma) đã gây những hậu quả nghiêm trọng và hiện nay, biện pháp phòng và chữa trị bệnh đốm trắng vẫn đang trong quá trình nghiên cứu. Theo báo cáo của Chi cục Bảo vệ thực vật Bình Thuận và Long An, bệnh đốm trắng bắt đầu xuất hiện rải rác từ năm 2009 – 2011, bệnh xuất hiện với tỷ lệ rất thấp. Nhưng đến đầu mùa mưa năm 2012, bệnh bắt đầu phát sinh trên diện rộng và gây hại nặng ở nhiều vùng trồng thanh long ở Bình Thuận, Long An, Tiền Giang. Cho đến nay, bệnh đốm trắng vẫn chưa được nghiên cứu một cách có hệ thống, vì vậy việc nghiên cứu tác nhân gây bệnh cũng như các đặc điểm sinh học để làm cơ sở đưa ra hướng phòng trừ hiệu quả căn bệnh này là một trong những vấn đề cấp thiết hiện nay. Đặc biệt là tại Bình Thuận
Đồ án tốt nghiệp – vùng trọng điểm trồng cây thanh long của nước ta, bệnh đốm trắng thanh long đã gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng và năng suất, dẫn đến thanh long không thể xuất khẩu và tồn đọng quá nhiều. Vì lí do trên, sinh viên tiến hành thực hiện đề tài “Ứng dụng nấm Trichoderma trong quản lý nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long tại Bình Thuận” nhằm góp phần hạn chế được căn bệnh đã gây những thiệt hại lớn lao cho người nông dân và cho cả nước. 2. Tình hình nghiên cứu: Tại Việt Nam mặc dù cũng có vài báo cáo công bố sơ lược về tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long nhưng vẫn còn tồn tại nhiều vấn đề nghiên cứu cần làm sáng tỏ thêm (Nguyễn Thành Hiếu và ctv., 2011). Theo báo điện tử nông nghiệp Việt Nam 28/11/2013, Thạc sĩ Nguyễn Mỹ Phi Long, người phụ trách kỹ thuật của công ty Điền Trang cho biết đã phân lập và nhân nuôi thành công bào tử của nấm gây nên bệnh đốm trắng. Mặc dù chưa khẳng định 100% nhưng có thể chắc chắn đến 90% rằng đấy là nấm Neoscytalidium dimidiatum. Nguyễn Thành Hiếu, Nguyễn Ngọc Anh Thư, Nguyễn Văn Hòa, Viện cây ăn quả miền Nam đã nghiên cứu xác định tác nhân, đặc điểm hình thái và sinh học của nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên thanh long. Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014 cũng nghiên cứu Biện pháp quản lý tạm thời bệnh đốm trắng trên cây thanh long. Phan Thị Thu Hiền & cvt, Trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu II đã nghiên cứu định danh và khảo sát đặc điểm sinh học của tác nhân gây bệnh đốm trắng hại thanh long. 3. Mục đích nghiên cứu: Xác định được tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long tại Bình Thuận, từ đó xây dựng nên các biện pháp phòng trừ loại bệnh này. 4. Nội dung nghiên cứu: - Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long tại Bình Thuận. - Chọn lọc các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng với tác nhân gây
Đồ án tốt nghiệp bệnh đốm trắng trong điều kiện in vitro. - Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh đốm trắng của các chủng Trichoderma có triển vọng. - Ảnh hưởng của các loại thuốc BVTV trừ nấm đến các chủng nấm Trichoderma. 5. Các kết quả đạt được của đề tài: - Phân lập được tác nhân chính gây bệnh đốm trắng trên thanh long. - Chọn lọc được chủng Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh trong điều kiện in vitro và in vivo. - Khảo sát ảnh hưởng các loại thuốc trừ nấm đối với Trichoderma. 6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp: Đồ án tốt nghiệp gồm có: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Kết luận và kiến nghị
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về thanh long: Cây Thanh long (Hylocereus undulatus Haw.) có tên tiếng Anh là Pitahaya hay còn gọi là Dragon fruit, là một thành viên của gia đình xương rồng (Cactaceae), có nguồn gốc từ các nước Trung - Nam Mỹ, Mexico. Tên của loại quả này là thanh long - có nghĩa là "rồng xanh". Sở dĩ chúng có tên như vậy là bởi nhiều người liên tưởng đến hình ảnh những chiếc "vảy" màu xanh bao bọc phía bên ngoài quả, trông giống vảy của loài rồng. Không chỉ vậy, có nhiều tài liệu cũng ghi lại truyền thuyết khá thú vị về loại quả này. Hiện nay, thanh long cũng được trồng nhiều ở các nước Đông Nam Á như Thái Lan, Việt Nam, Malaysia Cách đây trên 100 năm, thanh long được người Pháp du nhập vào Việt Nam nhưng mới được đưa lên thành hàng hóa từ những năm 1980. Đến thập kỉ 80, cùng với sự phát triển của nước nhà, đời sống nhân dân được nâng cao, thị trường tiêu thụ trong và ngoài nước được mở rộng, thanh long trở thành loại trái cây mới, có giá trị và có hiệu quả kinh tế cao. Từ năm 1988 – 1990, nhiều người tiêu dùng ưa chuộng, thanh long bắt đầu phát triển mạnh ở Bình Thuận, Nha Trang, Long An, Tiền Giang. Hình 1.1. Cây thanh long và trái thanh long
Đồ án tốt nghiệp 1.1.1. Tình hình thanh long ở trong nước: Việt Nam hiện nay là nước duy nhất ở Đông Nam Á trồng thanh long tương đối tập trung trên quy mô thương mại với diện tích ước lượng 4.000 hectare (1998), tập trung tại Bình Thuận 2.716 hectare, phần còn lại là Long An, Tiền Giang, TP. HCM, Khánh Hòa và rải rác ở một số nơi khác. Thanh long được trồng đầu tiên ở Nha Trang và Phan Thiết từ thời Pháp thuộc. Sau khi thanh long trở thành hàng hóa thương mại và xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới, phong trào trồng thanh long phát triển mạnh ở Phan Rang, Phan Thiết, Bình Thuận, Buôn Ma Thuộc và các tỉnh ở đồng bằng sông Cửu Long như: Tiền Giang, Long An . Thanh long là cây có nguồn gốc nhiệt đới, chịu hạn giỏi, nên được trồng ở những vùng nóng. Một số loài chịu được nhiệt độ từ 500C tới 550C nhưng nó không chịu được giá lạnh. Chúng thích hợp khi trồng ở các nơi có cường độ ánh sáng mạnh, vì thế khi bị che nắng thân cây sẽ ốm yếu và lâu cho quả. Cây mọc được trên nhiều loại đất khác nhau như đất xám bạc màu (Bình Thuận), đất phèn (TP.HCM), đất đỏ latosol (Long Khánh) Cây thanh long có khả năng thích ứng với các độ chua (pH) của đất rất khác nhau. Khi trồng thanh long nên chọn các chân đất có tầng canh tác dày tối thiểu 30 - 50 cm và để có năng suất cao, nên tưới và giữ ẩm cho cây vào mùa nắng. Cây thuộc họ xương rồng chịu hạn giỏi nhưng chịu độ mặn kém, dù vậy đã có một số hộ ở Cần Giờ trồng thử thanh long trên đất bị nhiễm mặn (0,8%) đã được lên liếp và cải tạo tầng mặt, mùa khô không tưới. Lượng mưa hằng năm từ 500 – 1500 mm thích hợp nhất cho sự phát triển của cây thanh long. 1.1.2. Tình hình thanh long ngoài nước: Trên thế giới Thanh long là cây ăn quả lâu năm được trồng nhiều ở Mỹ, Nhật, Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc, Đài Loan. Vài năm gần đây Thái Lan, Taiwan và cả Trung Quốc cũng đã bắt đầu nghiên cứu trồng và phát triển loại cây này. Hiện nay, thanh long đang được trồng ở ít nhất 22 nước nhiệt đới như: Australia, Cambodia, China, Colombia, Ecuador, Guatemala, Indonesia, Israel, Philippines, Tây Ban Nha, Sri Lanka, Đài Loan, Thái Lan, miền Nam nước Mỹ và Việt Nam.
Đồ án tốt nghiệp Thanh long là cây ăn quả phổ biến và được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới. Vì vậy, việc nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm đang được quan tâm, đã có rất nhiều nghiên cứu về tình hình bệnh hại trên thanh long. Thanh long bị gây hại bởi một số bệnh như bệnh thối đầu cành (Alternaria sp.), bệnh đốm nâu trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành (Sphaceloma sp.). Tuy nhiên những năm gần đây thanh long lại bị gây hại nặng bởi nấm Neoscytalidium. dimidiatum, đây là một bệnh có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất và chất lượng sản phẩm, gây thiệt hại lớn cho người trồng thanh long 1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của trái thanh long: Thanh long là một loại quả có thành phần dinh dưỡng rất phong phú và vô cùng có lợi cho sức khỏe con người. Theo phân tích tại Bộ môn Sinh lý - Sinh hóa và Bộ môn Thủy Nông thuộc Đại học Nông Lâm TP. HCM, thành phần sinh hóa của 100g thịt quả được thể hiện ở bảng 1.1: Bảng 1.1. Thành phần sinh hóa của 100g thịt quả thanh long Thành phần Hàm lượng Brix (tổng số chất hòa tan) 13 Đường khử (g) 6.1 Đường tổng số (g) 11.5 Acid hữu cơ (g) 0.13 Protein (g) 0.53 K (mg) 212.2 P2O5 (mg) 8.7 Ca (mg) 134.5 Mg (mg) 60.4 Vitamin C (mg) 9.4 Xơ (g) 0.71
Đồ án tốt nghiệp 1.1.4. Phân loại: Quả của thanh long có ba loại, tất cả đều có vỏ giống như da và có một chút lá. ❖ Thanh long ruột trắng, vỏ hồng hoặc đỏ: Tên khoa học là Hylocereus undatus thuộc chi Hylocereus. Quả có màu cơm trắng, hạt đen đậm, có thịt khá chắc, giòn, ngọt, rất ngon. Bên ngoài thanh long đỏ có vỏ cứng, màu đỏ đậm tươi sáng. Hình 1.2. Trái thanh long vỏ hồng, ruột trắng ❖ Thanh long ruột đỏ, vỏ hồng hoặc đỏ: Hay được gọi là thanh long “Nữ hoàng”, tên khoa học là Hylocereus polyrhizus thuộc chi Hylocereus. Đặc điểm của loại thanh long này nhìn quả không to nhưng nặng cân, ruột đỏ tươi, cơm giòn, thơm, đặc biệt rất ngon. Thanh long ruột đỏ có vỏ cứng, màu đỏ đậm tươi sáng, tai quả xanh, bên trong màu đỏ thắm như son, hạt đen nhỏ, hương vị nhẹ hơn.
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Trái thanh long vỏ hồng, ruột đỏ ❖ Thanh long ruột trắng với vỏ vàng: Giống thanh long vỏ vàng có tên khoa học là Hylocereus megalanthus, trước đây được coi là thuộc chi Selenicereus, có dạng trái tựa các giống thanh long thông thường nhưng thay cho các tai trái là những cục gù có gai, ruột màu trắng, hạt to nhỏ không đều. Hình 1.4. Trái thanh long vỏ vàng, ruột trắng
Đồ án tốt nghiệp 1.1.5. Thanh long tại Bình Thuận: Bình Thuận là một tỉnh nằm ở cực Nam Trung Bộ Việt Nam, diện tích đất tự nhiên là 782.846 ha, trong đó 219.741 ha đất nông nghiệp. Điều kiện thời tiết tại Bình Thuận hầu như nóng nhất cả nước, mang đặc trưng của khí hậu nhiệt đới, khô nắng, nhiệt độ cao. Bình Thuận có 2 mùa rõ rệt trong năm: mùa mưa từ tháng 5 – 10, và mùa nắng từ tháng 11 – 4. Lượng mưa ít, trung bình 1,000 đến 1,600 mm/ năm (bằng ½ lượng mưa trung bình ở Nam Bộ). Độ ẩm trung bình hàng năm là 79%. Nhiệt độ trung bình của tỉnh Bình Thuận khoảng 270C, vào tháng giêng hoặc tháng 2, nhiệt độ thấp nhất từ 240C - 250C. Mặt khác, vào tháng 5 và tháng 6, nhiệt độ cao nhất có thể tới 280C – 28.50C. Số ngày nắng : 2,556 – 2,924 giờ. Trong đó tháng 7,8,9 là những tháng ít ánh nắng mặt trời nhất trong năm. Vì vậy, với điều kiện thời tiết tại Bình Thuận rất phù hợp cho việc canh tác cây thanh long. 1.1.5.1. Đặc điểm của thanh long tại Bình Thuận: - Cành phát triển mạnh, cành to và dài - Trái có dạng hơi tròn, dày vỏ (2 – 2.5 cm), gai nở to, vỏ có màu đẹp - Tỷ lệ trái: 68 – 72% - Chắc thịt, vị ngọt - Độ brix 13 – 14% - Độ chua (pH/ep): 4.8 – 5.0 - Hạt nhỏ, trọng lượng 1000 hạt: 1.1 – 1.2g - Về cảm quan: thanh long Bình Thuận đẹp, vỏ dày nên thời gian bảo quản và giữ màu sắc kéo dài hơn, thuận lợi trong vận chuyển đến nơi tiêu thụ. - Về chỉ tiêu hóa học: thanh long Bình Thuận được bán ra cao hơn các loại thanh long khác do mẫu mã và hình thức của thanh long Bình Thuận đẹp hơn. Ngoài ra do thanh long trồng tại Bình Thuận nổi tiếng nhất cả nước, sản lượng cũng cao nhất nên là lợi thế cạnh tranh quan trọng cho thanh long Bình Thuận trên thị trường tiêu thụ.
Đồ án tốt nghiệp 1.1.5.2. Diện tích phân bố và năng suất của thanh long tại Bình thuận: Theo số liệu thống kê vào năm 1991, diện tích thanh long toàn tỉnh Bình Thuận khi đó rất khiêm tốn, độ khoảng 750 ha. Nhưng nhờ những đặc điểm nổi trội nên loại trái cây này ngày càng được thị trường ưa chuộng. Nhờ đó giá cả tiêu thụ không ngừng tăng lên và thúc đẩy diện tích cây thanh long trên địa bàn tỉnh mở rộng đáng kể. Đến năm 2000, diện tích cây thanh long tại Bình Thuận tăng khoảng 3.220 ha và trong mười năm sau đó (năm 2010) đã phát triển lên hơn 13.400 ha. Trong khi UBND tỉnh phê duyệt quy hoạch thanh long đến năm 2015 “đóng khung” ở con số 15.000 ha, thì đến cuối năm 2011 diện tích loại cây này tại Bình Thuận đã vượt 18.600 ha. Từ cây “xóa đói giảm nghèo”, thanh long nay đã trở thành loại cây trồng có hiệu quả kinh tế cáo, trung bình mỗi hecta đem lại thu nhập 80 – 100 triệu đồng/năm, lãi bình quân hơn 40 triệu đồng/ha. Giá trị sản xuất thanh long đạt 800 – 900 tỷ đồng/năm, chiếm 20% giá trị sản xuất nông nghiệp và 25% giá trị sản xuất ngành trồng trọt; xuất khẩu thanh long đóng góp trên 10% kim ngạch xuất khẩu hàng hóa của tỉnh Bình Thuận. 1.1.5.3. Tình hình xuất khẩu thanh long tại Bình Thuận: Đây là mặt hàng trái cây xuất khẩu chủ lực của tỉnh Bình Thuận, các năm trước đây đạt mức tăng trưởng tương đối ổn định. Riêng năm 2008 lượng xuất khẩu giảm 6.4% so với năm 2007, ước đạt 29.250 tấn, chủ yếu do ảnh hưởng của khủng hoảng kinh tế toàn cầu và thay đổi quy định nhập khẩu của một số thị trường. Tuy lượng xuất khẩu giảm nhưng do giá xuất khẩu bình quân tăng 20 USD/tấn nên kim ngạch xuất khẩu thanh long năm 2008 chỉ giảm nhẹ so với năm trước, đạt khoảng 16.63 triệu USD. Hồng Kông và Đài Loan là các thị trường chủ lực trong xuất khẩu chính ngạch của thanh long Bình Thuận, trong khi Trung Quốc là thị trường xuất khẩu biên mậu chính. Tuy nhiên thời gian gần đây phía Đài Loan, Trung Quốc đang thắt chặt các quy định về vệ sinh an toàn thực phẩm đối với trái cây nhập khẩu từ Việt Nam nên lượng xuất khẩu sang các thị trường này giảm.
Đồ án tốt nghiệp Sản phẩm thanh long đạt tiêu chuẩn EurepGAP đang từng bước tiếp cận các thị trường Hà Lan, Đức, Pháp và một số nước châu Âu khác. Tỉnh Bình Thuận đã tổ chức các chuyến đi khảo sát thị trường Đức và Hà Lan nhằm duy trì và mở rộng thị trường. Riêng đối với thị trường Mỹ, thanh long muốn xâm nhập thị trường cần hội đủ các yếu tố: nhà vườn sản xuất theo hướng GAP, xưởng đóng gói đủ điền kiện và quy chuẩn xuất khẩu qua Mỹ, sản phẩm phải được chiếu xạ theo tiêu chuẩn Mỹ. Đến nay, phía Mỹ đã cấp giấy chứng nhận cho ba cơ sở chế biến của Bình Thuận có nhà đóng gói đạt tiêu chuẩn sản xuất thanh long qua Mỹ là HTX Thanh long Hàm Minh. Công ty TNHH Thanh long Hoàng Hậu và Công ty Bảo Thanh, với tổng diện tích là 560.2 hs có đủ điều kiện cung ứng thanh long qua Mỹ. Tính đến năm 2013 có 65.5 tấn thanh long Bình Thuận xuất khẩu qua Mỹ. 1.2. Giới thiệu về bệnh đốm trắng hại thanh long và biện pháp phòng trừ: 1.2.1. Sâu bệnh hại thanh long và biện pháp phòng trừ: 1.2.1.1 . Côn trùng: a. Kiến: Kiến cắn, đục khoét làm hư hom giống và các cành thanh long non, cắn mất tai lá trên trái, gây tổn thương vỏ trái, đây là loại côn trùng dễ phòng trừ. Để phòng trị dùng Basudin (Diazinon) 10H, Padan 4G, 10G trộn đều với cát 2/1000 rải đều quanh gốc hoặc những nơi làm tổ. Khi tấn công vào các ổ kiến thì dùng Bi 58, Diazinon. b. Bọ xít: Bọ xít hại thanh long từ khi có nụ hoa đến khi trái hình thành, chúng hại bằng cách chích hút nhựa, để lại những vết chích rất nhỏ nhưng đến khi quả chín nơi các vết chích sẽ xuất hiện một chấm đen, mất giá trị xuất khẩu. Phòng trừ bọ xít dùng Trebon, Applaud Mipc, Bassa nồng độ 0,2% phun lên khu vườn có chúng xuất hiện. c. Ruồi vàng hay ruồi trái cây (Dacus dorsalis): Ruồi vàng là đối tượng nguy hiểm đang được báo động hiện nay. Ruồi trưởng thành chích và đẻ trứng vào quả gây thoái hóa phần thịt quả và phần nhựa chảy ra ngoài vỏ làm quả thanh long bị hư, không xuất vườn được. Đây là đối tượng mới xuất
Đồ án tốt nghiệp hiện trên thanh long nhưng ruồi trái cây đã phá rất nhiều loại quả ở nước ta vì vậy cần chú ý phòng trừ. Việc vệ sinh đồng ruộng như thu dọn và hủy các quả rụng, rải thuốc diệt nhộng dưới đất, đặt bả có chứa chất dẫn dụ trích từ cây é tía trộn với thuốc trừ sâu có thể diệt ruồi. Hiện nay các thuốc như Ruvacon 90L và Vizubon D đã có chứa sẵn chất dẫn dụ là Metyl eugenol 75% nên tiện cho nhà vườn hơn. d. Ngâu (Bọ cánh cứng): Ngâu là loài bọ cánh cứng màu nâu đen, rất bóng, trên cánh có những mảng màu trắng rất đặc trưng. Chúng gây hại bằng cách đục phá cành non, cành già và cả nụ hoa làm ảnh huởng đến tỷ lệ đậu trái. e. Rệp sáp: Rệp sáp chích hút nhựa ở tất cả các bộ phận của cây: cành non, nụ hoa, trái, làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và tỷ lệ đậu trái. Chất thải của rệp tạo điền kiện cho nấm bồ hóng phát triển. Rệp tấn công dưới rễ làm cho cây bị vàng, còi cọc, trái nhỏ, giảm năng suất. f. Bọ trĩ: Bọ trĩ thường tấn công trên hoa và trái non. Chúng gây hại bằng cách chích hút nhựa cây làm ảnh hưởng đến tỷ lệ đậu trái và giảm giá trị thương phẩm. g. Rầy mềm: Rầy mềm có nhiều loại gây hại trên hoa và trái chích hút nhựa làm hoa bị rụng. Trên trái để lại những vết chích nhỏ, khi chín bị mất màu đỏ tự nhiên, giảm giá trị thương phẩm. Khí hậu khô nóng làm gia tăng mật số gây hại của rầy mềm. h. Tuyến trùng: Tuyến trùng chích hút hoặc chui vào trong rễ làm cho rễ cây phình ra tạo thành các khối u (bướu rễ), làm cho cây chậm phát triển, còi cọc. Những vết chích tạo điều kiện cho mầm bệnh xâm nhập vào trong cây. i. Ốc sên, ốc bươu: Ốc sên và ốc bươu tập trung nhiều ở phần gốc cây, cạp vỏ cây, leo lên thân và cạp thân, trái làm giảm năng suất, giá trị thương phẩm.
Đồ án tốt nghiệp 1.2.1.2. Bệnh, dịch hại: a. Bệnh thối đầu cành: - Triệu chứng: ngọn cành thanh long chuyển màu vàng, rồi mềm, sau đó thối, cây tăng trưởng chậm, số cành giảm hẳn. Bệnh hay xảy ra vào cuối mùa nắng. Bệnh xảy ra không những trên đất phèn (đất thấp) mà còn cả trên đất cao. - Nguyên nhân chính: là do nấm Alternaria sp. gây ra. - Biện pháp phòng trị: bằng cách phun Rovral 2 lần liên tiếp cách nhau 1 tuần. b. Bệnh đốm nâu trên cành: - Triệu chứng: thân cành thanh long có những đốm tròn như mắt của màu nâu. Vết bệnh nằm rải rác hoặc tập trung, thường kéo dài thành từng vệt dọc theo thân cành. Có nhiều vết acervulus tròn đen nằm rải rác. - Tác nhân: là do nấm Gloeosporium agaves, thuộc họ Nectrioidaceae, bộ Melanconialea, lớp Deuteromycetes. c. Bệnh nám cành: - Triệu chứng: trên thân cành có một lớp màng mỏng màu xám tro, nhám. - Tác nhân: là do nấm Macssonina agaves Syd và Sphaceloma sp, họ Nectrioidaceae, bộ Melanconiales, lớp Deuteromycetes. - Biện pháp phòng trị chung cho các bệnh thanh long: vệ sinh đồng ruộng, chống úng và chống hạn cho cây. Khi tới mức độ phải trị thì dùng thuốc Rovral, hoặc Anvil 5sc (30 - 100 g a.i./ha) phối hợp với Topas (10 - 50 g a.i./ha). Ngoài sâu bệnh kể trên thanh long còn bị dơi, chim, chuột phá hoại quả nữa. d. Bệnh thán thư: ❖ Tác nhân gây hại: do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra. ❖ Triệu chứng bệnh: - Trên cành: thân cành thối mềm có màu vàng sáng sau đó chuyền sang nâu, vết thối từ phần ngọn vào trong. - Trên hoa: Bệnh tấn công cả phần nụ hoa, làm cho nụ hoa bị biến màu nâu, sau đó rụng rất nhanh.
Đồ án tốt nghiệp - Trên trái: Ở điều kiện ngoài đồng bệnh ít khi tấn công trên trái, tuy nhiên ở giai đoạn trái lớn sắp thu hoạch hoặc đã thu hoạch và tồn trữ. Vết bệnh là những đốm tròn hoặc gần tròn, có tâm màu nâu đỏ, lõm xuống, xung quanh có những vòng đồng tâm nâu sậm, sau đó phát triển nhanh thành những mãng thối lõm vào vỏ, gây thất thoát lớn trong quá trình vận chuyển, tồn trữ. ❖ Đặc điểm phát sinh và phát triển của bệnh: - Bệnh thán thư phát triển mạnh ở điều kiện ẩm ướt và nhiệt độ không khí cao. Nấm có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 40C, nhưng thích hợp là 25 – 290C. Bề mặt mô bệnh ẩm ướt kéo dài có ảnh hưởng đến sự xâm nhiễm và sinh trưởng của nấm Colletotrichum gloeosporioides. - Trong điều kiện ngoài đồng: Bệnh bình thường tồn tại trong xác bã thực vật có trong vườn hoặc trên cành, trái bệnh. Bệnh phát triển mạnh và bộc phát ở điều kiện ẩm độ cao nhất là vào mùa mưa. Bệnh phát triển và gây hại nặng ở giai đoạn ra hoa, trái sắp thu hoạch và sau thu hoạch. ❖ Nguồn bệnh và sự lây lan: - Nấm bệnh thường tồn tại trong xác bã thực vật có trên vườn hoặc trên cành, trái nhiễm bệnh, trên cây trồng khác như xoài, ớt, - Bệnh có thể lây lan qua gió, nước, ❖ Biện pháp quản lý: - Đối với những vườn trồng mới, nên thiết kế vườn, đắp mô cao đảm bảo tránh bị ngập úng trong mùa mưa. - Sau thu hoạch nên tỉa cành (cành sâu bệnh, cành vô hiệu, ) và tiêu huỷ triệt để nguồn bệnh nhằm tạo thông thoáng và hạn chế mầm bệnh lây lan cho vườn cây. Nên phun thuốc trừ nấm gốc đồng sau khi cắt tỉa để sát trùng vết thương và làm giảm áp lực mầm bệnh. - Tăng cường bón vôi cho cây thanh long 1-2 lần/năm (vào đầu và cuối mùa mưa). - Bón phân cân đối và hợp lý. Nên bón nhiều phân hữu cơ hoai mục và nấm đối kháng Trichoderma nhằm giúp cây sinh trưởng mạnh, chống chịu tốt với bệnh.
Đồ án tốt nghiệp - Có thể phun thuốc kích kháng như Salicylic acid (Bion, Exin, ) 15 ngày trước khi thu hoạch. - Sử dụng thuốc trừ nấm gốc đồng để phun ngừa và phun luân phiên thuốc Propined (Antracol, ), Difenoconazole + Propiconazole (Score, Tilt super, ), Azoxystrobin + Difenoconazole (Amistar top, ), Diniconazole (Sumi eight, ) định kỳ 7 – 10 ngày/lần tùy theo áp lực bệnh. - Phòng trừ trên diện rộng: đây là loại nấm đa ký chủ và gây hại quan trọng, khó quản lý, để phòng trị hiệu quả nên thực hiện phòng trị đồng loạt trên diện rộng sẽ mang lại hiệu quả cao. 1.2.1.3. Các hiện tượng sinh lý a. Hiện tượng rụng nụ: Xuất hiện khi số nụ trên cành nhiều. Sau khi nụ xuất hiện 5 - 7 ngày thì nụ không phát triển nữa, vàng rồi rụng. Tỷ lệ rụng từ 10% đến 20%. Cây tự quân bình sinh lý để nuôi quả còn lại trên cây. Để hạn chế sự rụng quả sinh lý cần bón phân tưới nước đầy đủ và quân bình. b. Hiện tượng nứt vỏ trái: Do thời tiết, trời hạn ở giai đoạn vỏ quả phát triển, sau đó mưa nhiều hoặc tưới nhiều vào lúc ruột quả phát triển nên quả nứt. Mặt khác do nhà vườn treo quả lâu đợi dịp có giá mới bán. Để hạn chế nên kiểm soát độ ẩm đất, không để vườn khô hạn trong thời kỳ cây nuôi quả. 1.2.2. Bệnh đốm trắng hại thanh long: Bệnh đốm trắng trên thanh long khi mới xuất hiện có triệu chứng ban đầu là các vết lõm màu trắng (nên một số nông dân còn gọi là bệnh đốm trắng), sau đó vết bệnh nổi lên thành những đốm tròn màu nâu như mắt cua. Trong điều kiện thuận lợi bệnh phát triển mạnh, các vết bệnh liên kết với nhau làm cho cành thanh long bị sần sùi, gây thối khô từng mảng 1.2.2.1. Tác nhân gây bệnh:
Đồ án tốt nghiệp Bệnh đốm nâu được ghi nhận đã và đang xuất hiện ở một số nước như Trung Quốc, Malaysia, Đài Loan. Ở Việt Nam, một số vườn thanh long tại các địa phương thuộc tỉnh Bình Thuận và Long An đã xuất hiện loại bệnh này, tuy mới xuất hiện nhưng bệnh có tốc độ lây lan nhanh và gây hại trên diện rộng. Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, cành bào tử, kích thước bào tử và hình thái tản nấm, dựa vào khóa phân loại của Ellis (1976) đã xác định tác nhân gây bệnh loét trên Thanh long là do nấm Scytalidium dimidiatum ((Penz.) B. Sutton & Dyko (1989)), hiện nay nấm còn được gọi tên là Neoscytalidium dimidiatum ((Penz.) Crous & Slippers (2006)). Đặc điểm vị trí phân loại của nấm N. dimidiatum (Agrios. 2005), (Crous & Slippers. 2006): Ngành: Ascomyta Lớp: Dothideomycetes Bộ: Botryosphaeriales Họ: Botryosphaeriaceae Chi: Neoscytalidium Loài: Neoscytalidium dimidiatum Hình 1.5. Nấm Neoscytalidium dimidiatum
Đồ án tốt nghiệp Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thường có một nhân đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo thành cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân. Vách tế bào cấu tạo bằng chitin hay glucan, đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất, trong nước, trên cạn, thực vật động vật, một số lại ký sinh gây bệnh trên thực vật, động vật, người gây nên những thiệt hại lớn. Ascomyta sinh sản sinh dưỡng bằng sự chia đôi tế bào nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản vô tính bằng bào tử đính (conidia), và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Các bào tử khác tính (+, -) sợi nấm đơn bội, phân nhánh thành hệ sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hình thành sợi sinh túi đa bào, sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lưỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi. Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch và giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế. Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở lỗ và quả thể hở. Neoscytalidium dimidiatum có cơ thể dạng sợi, đơn bào, phân nhánh có vách ngăn sinh sản bằng hình thức sinh dưỡng đứt đoạn sợi nấm tạo cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục, chứa một hay nhiều nhân. 1.2.2.2 . Thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra: Bệnh đốm trắng phát sinh, phát triển và lây lan nhanh trong điều kiện thời tiết ẩm ướt, ẩm độ không khí cao, nhất là vào mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11. Bệnh phát sinh gây hại nặng hơn trên những vườn thanh long bón nhiều phân đạm, sử dụng nhiều chất kích thích sinh trưởng. Bệnh đốm nâu cây thanh long lây lan chủ yếu qua các con đường: - Qua hom giống, tàn dư cây bệnh và các sản phẩm của thanh long. - Bào tử nấm phát tán, lây lan nhờ gió, dòng nước chảy và qua một số sinh vật (một số loài ốc sên, côn trùng).
Đồ án tốt nghiệp Bệnh thường gây hại trên bẹ non, nụ bông, trái non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Bệnh còn tấn công trên trái chín chuẩn bị thu hoạch. Theo thống kê đến cuối năm 2013, diện tích thanh long bị nhiễm bệnh đốm trắng nhẹ ở tỉnh Bình Thuận là 800 ha, nặng 400 ha, trong tổng số 21 nghìn ha; Tiền Giang với gần 3 nghìn ha thanh long thì có đến 2420 ha nhiễm bệnh đốm trắng nhẹ, diện tích nhiễm nặng 80 ha; Long An, nhiễm đốm trắng nhẹ 766 ha, nặng 41 ha, trong tổng số gần 2700 ha và đang có xu hướng lây lan nhanh. Thanh long Việt Nam đã xuất khẩu tới 40 quốc gia và vùng lãnh thổ. Năm 2013, kim ngạch xuất khẩu (chính ngạch) trái cây tươi đạt 307 triệu USD thì thanh long chiếm tới 61,4%. Ngoài một số thị trường truyền thống như Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Hà Lan thanh long đang từng bước xâm nhập vào một số thị trường mới như Ấn Độ, New Zealand, Úc, Chi Lê tạo được sự đa dạng hóa trong cơ cấu thị trường xuất khẩu thanh long của Việt Nam. Tuy nhiên, với tình hình bệnh đốm trắng trên thanh long đang có xu hướng lây lan nhanh, làm giảm năng suất và chất lượng quả thanh long, không đảm bảo kim ngạch xuất khẩu có nguy cơ mất một số thị trường tiêu thụ lớn. 1.2.3. Biện pháp phòng trừ: Qua thực tế thành công của nhiều nhà vườn tại Long An, Tiền Giang, Công ty Điền Trang cùng nhà vườn trồng thanh long đã đúc kết và đưa ra được biện pháp khắc phục và phòng ngừa bệnh đốm trắng theo phương châm quản lý dịch hại tổng hợp gồm 3 bước. Biện pháp này bước đầu đã mang lại hiệu quả tích cực và khả quan đáng ghi nhận: ▪ Bước 1: - Vệ sinh vườn, tạo thông thoáng cho vườn: Cắt tỉa cành bệnh, trái bệnh, thu gom tập trung lại một chỗ, đào hố, dùng vôi để xử lý. Không vứt cành bệnh, trái bệnh xuống mương, rạch hoặc trong vườn vì sẽ tạo điều kiện cho bệnh lây lan nhanh. - Quản lý chặt nguồn nước: đánh rãnh thoát nước, không để ứ đọng nước trên vườn. ▪ Bước 2:
Đồ án tốt nghiệp - Bón vôi xung quanh gốc cây, 1 - 2 kg/trụ để nâng độ pH lên (nên nâng tối thiểu phải đạt 4,5), không nên rải lên cây. - Đồng thời, phun các loại thuốc trừ nấm phổ rộng (nên sử dụng kết hợp 2 loại thuốc có hoạt chất Hexaconazole, Carbendazim theo tỉ lệ 1:1), phun kỹ và đều khắp tán cây, chú ý phun đẫm ngay đỉnh trụ. Phun định kỳ 5 - 7 ngày/1lần, phun lặp lại 2 - 3 lần. ▪ Bước 3: Sau khi thực hiện xong bước 2 được 7 ngày. - Phun men vi sinh siêu đậm đặc TRICHOMIX-DT chuyên dùng cho Thanh long (nhãn hiệu 02 trái Thanh long) trên khắp tán cây, gốc cây và đỉnh trụ (liều dùng 01 gói 500 gr/100 lít nước), phun liên tục 5 - 7 ngày/1lần. Chú ý phun lặp lại sau khi mưa. Khi cây đã hết bệnh phun và tưới gốc định kỳ 10 - 15 ngày/lần. - Trong trường hợp lấy trái thì phải phun men TRICHOMIX- DT trực tiếp vào nụ và trái 4 lần, lần 1 ở giai đoạn nụ 10 - 15 ngày tuổi, lần 2 khi rứt râu (bẻ hoa) và lần 3, lần 4 trong giai đoạn nuôi trái, cách nhau 7 - 10 ngày/1lần. - Bón phân chuồng đã ủ hoai bằng nấm Trichoderma (3 - 5 kg/trụ) hoặc phân hữu cơ TRICHOMIX-DT, TRIMIX-N1 (50 kg/bao, liều bón: 1 - 2 kg/gốc), bón xung quanh gốc và nên ủ cỏ mục, rơm hoặc lấp đất ở gốc để giữ ẩm, bón 2 - 3 lần liên tục cách nhau 20 - 30 ngày/lần. 1.3. Giới thiệu về nấm Trichoderma: Trichoderma là loại nấm có mặt nhiều trong đất và các rễ cây (Howell và cộng sự, 2003). Nấm Trichoderma có khu vực phân bố rất rộng, chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Khi quan sát hạch nấm hay chồi mầm của nhiều loại nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma (Klein và Eveleigh, 1998). Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác (Gary J. Samuels, 2004).
Đồ án tốt nghiệp Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội ký sinh với thực vật. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Gary E. Harman, 2000). Nhìn chung các loài Trichoderma xuất hiện ở các vùng đất acid nhiều hơn ở vùng đất trung tính và kiềm (Papavizas, 1985). Theo Persoon ex Gray, loài Trichoderma được phân loại như sau: Giới: Fungi. Ngành: Ascomycota. Lớp: Sordariomycetes. Phân lớp: Hypocreomycetidae. Bộ: Hypocreales. Họ: Hypocrea. Chi: Trichoderma. Loài: Trichoderma sp. Hình 1.6. Khuẩn ty và bào tử của một số loài nấm Trichoderma Hình thái của nấm Trichoderma là cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn. Bào tử thường có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng, vàng hay xanh xám. Đơn bào hình trứng, tròn, elip hoặc hình oval (với tỉ lệ dài: rộng từ 1 – 1,1 µm) hay hình chữ
Đồ án tốt nghiệp nhật (với tỉ lệ dài: rộng là hơn 1,4 µm), đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5 µm tùy từng loài. Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Ở một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định. Cuống bào tử của một số nấm bệnh xen vào nhau. Một số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T. koningii), có kích thước từ 1 – 7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng như bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động như chồi mầm. Khuẩn lạc Trichoderma tăng trưởng rất mạnh đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 250C (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998). Chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác), chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%). Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2,5 đến 9,5 và phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 – 300C. Một vài dòng phát triển tốt ở 350C. Một số ít phát triển được ở 400C (Gary J. Samuels, 2004). Theo Prausun K. M. và Kanthadai R. (1997), hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 350C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường, ở 370C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy. Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic (enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là hai enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Tuy nhiên cơ chế của tác động này chưa được biết (Gary J. Samuels, 2004). Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện tượng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác
Đồ án tốt nghiệp động của điều kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loại Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng như trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh thực vật (Gary E. Harman, 2000). 1.4. Cơ chế đối kháng nấm gây bệnh của nấm Trichoderma: 1.4.2. Hiện tượng “giao thoa sợi nấm”: Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế. Weidling (1932) đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho hiện tượng đó là “giao thoa sợ nấm”. Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” là hiện tượng tấn công trực tiếp của nấm này lên một nấm khác. Nó là một quá trình rất phức tạp bao gồm các bước chính sau: đầu tiên là sự nhận biết sự có mặt của nấm bệnh, sau đó là quá trình tấn công, xuyên qua thành tế bào và cuối cùng giết chết nấm bệnh. Một số chi tiết của cơ chế này ở Trichoderma đã được nghiên cứu và làm sáng tỏ. Để giải thích rõ hiện tượng “giao thoa sợi nấm” có thể chia quá trình tấn công của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh làm 3 giai đoạn. ❖ Giai đoạn 1: Bước đầu tấn công nấm bệnh Giai đoạn đầu tấn công chủng nấm bệnh. Trong giai đoạn đầu này có thể chia làm 4 bước: - Bước 1: Nấm Trichoderma phát hiện nấm bệnh Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ có tính hướng hóa chất, nó ký sinh phân nhánh hướng về nấm bệnh đã được định trước (do những nấm này tiết ra hóa chất). Ngoài ra, chúng có thể nhận dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này có thể do tự nhiên hay hóa học (qua trung gian là pectin trên bề mặt tế bào của nấm bệnh). - Bước 2: Sợi nấm bám sát vào nấm bệnh Sau khi phát hiện nấm bệnh, chúng nhanh chóng phát triển về hướng nấm bệnh và phân nhánh để tăng diện tích diện tích tiếp xúc với nấm bệnh. - Bước 3: Phát triển cuống bào tử và bào tử đính
Đồ án tốt nghiệp Sau khi đã tiếp xúc được với nấm bệnh, chúng bắt đầu tăng sinh cuống bào tử đính và hình thành các bào tử đính. - Bước 4: Tạo các giác bám trên bề mặt nấm bệnh. Kết thúc giai đoạn đầu, nấm Trichoderma tạo các giác bám trên bề mặt nấm bệnh và chẩn bị bước qua giai đoạn 2 là tiết enzyme. ❖ Giai đoạn 2: Giai đoạn tiết enzyme phá hủy vách tế bào Trichoderma sản sinh ra một số enzyme phá huỷ thành tế bào nấm bệnh và cũng có thể sinh những kháng sinh peptaibol. Kết quả của những hoạt động phối hợp nhiều nhân tố này đã tạo thành những lỗ thủng tại vị trí giác bám trên sợi nấm bệnh. ❖ Giai đoạn 3: Tấn công vào tế bào chất và tiêu diệt nấm bệnh Các sợi nấm Trichoderma xuyên qua lỗ thủng vào khoang trong của nấm bệnh, phá huỷ chất nguyên sinh nấm chủ và sinh trưởng trong đó. Sự phá hủy các chất nguyên sinh của nấm bệnh làm cho chúng bị teo lại và chết đi. Hình 1.7. Hiện tượng giao thoa sợi nấm (Agrios, 2005) 1.4.3. Cơ chế tiết kháng sinh: Cơ chế tiết kháng sinh Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp xúc và ký sinh đã làm cho nấm bệnh chết. Tuy nhiên, ở những điểm không có sự tiếp xúc của nấm Trichoderma, nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên
Đồ án tốt nghiệp cứu cho là tác động của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh. Howell (1987), thấy rằng những chủng T. virens đột biến mất khả năng ký sinh nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm bệnh R. solani tương đương với chủng tự nhiên. Kết quả này đã chỉ ra rằng ký sinh không là cơ chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể. Sự sinh kháng sinh cũng là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma. Nó là một trong những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học. Những kháng sinh này có thể ức chế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác. Khả năng sinh kháng sinh của các loài, các chủng không giống nhau, chúng gồm: ▪ Gliotoxin: chất kháng sinh này được R. Weindling và O. Emerson mô tả năm 1936 do nấm T. lignorum sinh ra. Gần đây được xác định lại là do nấm T. virens sinh ra. Chất gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm (Ascochyta, Botrytis, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia ). ▪ Steroids (viridin): đây là chất kháng sinh thứ cấp do nấm Trichoderma tạo thành trong hoạt động của chúng. Chất kháng sinh này được phát hiện năm 1945. Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và là một độc tố thực vật, có hiệu lực như một loại thuốc diệt cỏ, giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử nấm. Được sản xuất từ T. virens. ▪ Trichodermin và Dermadi: được Atsushi và Shunsuke phát hiện ở Nhật Bản năm 1975. Hai chất kháng sinh này có trong dịch nuôi cấy loài T. koningii và T. aureoviride. Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do Trichoderma sinh ra có liên quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine, anthraquinones, butenolides, isonitrin D và F, trichorzianines, furanone do T. harzianum sinh ra; các kháng sinh gliovirin, viridian, viridiol và valinotricin do T. virens sinh ra. ▪ Peptaibols: chất kháng sinh này là một chuỗi các oligopeptides của 12-22 aminoacid có chứa nhiều α -aminoisobutyric acid, N-acetylated tại N-terminus và chứa một amino alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-terminus [21] do T. polysporum, hazianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong
Đồ án tốt nghiệp sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh, và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. 1.4.4. Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống: Không chỉ có cơ chế kí sinh, sự sinh kháng sinh hay tiết enzyme là hiệu quả trong điều khiển sinh học mà cơ chế cạnh tranh cũng được coi là cơ chế có ý nghĩa hết sức quan trọng vì sự thiếu dinh dưỡng là nguyên nhân gây chết phổ biến đối với vi sinh vật. Cơ chế này cũng được ứng dụng nhiều và hiệu quả trong kiểm soát sinh học điều khiển các bệnh do nấm. Nấm Trichoderma có thể biểu hiện tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nấm bệnh về dinh dưỡng, nơi cư trú. Nấm Trichoderma thường định cư trước so với các nấm bệnh. Do đó, chúng chiếm các chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nấm bệnh (Green et al., 1996; Martin et al., 1985). Trichoderma có khả năng cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe). Nấm Trichoderma sử dụng những mô già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Phytium spp., do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Phytium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Phytium spp. bằng cách sử dụng dịch tiết đó vì thế mà các bào tử Phytium spp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh. Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn cacbon, nitơ và yếu tố tăng trưởng khác với nấm bệnh. T. hazianum có thể kiểm soát nấm Botrysis cinerea (gây bệnh trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tại những vùng bị nhiễm (Gullino, 1992). Sivan và Chet (1989), đã chứng minh rằng sự
Đồ án tốt nghiệp cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T. hazianum sử dụng để kiểm soát nấm bệnh F. oxysporum. Trichoderma có thể hòa tan tốt các chất dinh dưỡng vô cơ trong môi trường rễ cây như: đồng, photpho, sắt, mangan, kẽm và natri giúp cho cây hấp thu tốt các nguồn dinh dưỡng này. Ngoài ra, Trichoderma còn có khả năng làm giảm mức oxy hóa của các kim loại để tăng độ hòa tan của những kim loại này, và cũng có thể sản xuất ra các thể mang sắt (siderophores) để vận chuyển các nguyên tố vi lượng như sắt. Nhờ vào khả năng sinh ra siderophores hiệu quả cao do đó cạnh tranh mạnh mẽ với khả năng hấp thu sắt của nấm khác đặc biệt là nấm bệnh. Bị thiếu sắt, các đỉnh sinh trưởng mới của nấm bệnh không được hình thành. Bên cạnh đó, Trichoderma cũng tác động trực tiếp lên vùng rễ như loại bỏ mầm bệnh, làm tăng sự sinh trưởng và phát triển của rễ hoặc từ những điểm mà Trichoderma tác động đến sẽ kích thích cây trồng tăng sản xuất các enzym bảo vệ và các hợp chất kháng sinh nhờ đó giúp cây đề kháng tốt với mầm bệnh. 1.4.5. Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật: Ngoài khả năng bảo vệ giúp thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn trong đất, nhiều loài trong chi Trichoderma được bổ sung vào đất có khả năng kích thích cơ chế tự bảo vệ thực vật chống lại virus, vi khuẩn, nấm. Trong trường hợp này, các nấm Trichoderma đóng vai trò là những nhân tố mẫn cảm với rễ, kích thích hệ rễ miễn dịch chủ động và bị động ở thực vật. Nấm Trichoderma còn có tác dụng tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển trong đất, kích thích sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ, đồng thời có khả năng phân giải chất xơ, chitin, ligin, trong các phế thải hữu cơ thành các chất dinh dưỡng tạo điều kiện cho cây trồng hấp thu dễ dàng. 1.5. Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực vật: Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) hay nông dược là những chất độc có nguồn gốc từ tự nhiên hay hóa chất tổng hợp được dùng để bảo vệ cây trồng và nông sản, chống lại sự phá hoại của những sinh vật gây hại đến tài nguyên thực vật. Những sinh vật gây hại chính gồm sâu hại, bệnh hại, cỏ dại, chuột và các tác nhân khác.
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2. Các loại thuốc tham gia thí nghiệm và hoạt chất Loại thuốc Hoạt chất Tác dụng Là các hạt đồng dạng Nano kích thước 5-7 nano mét. Nhờ kích thước siêu nhỏ (nm), các hạt đồng trong Cup xâm nhập dễ dàng vào Cup 2,9 SL Đồng hệ sợi nấm, vi khuẩn, ngăn ngừa sự hình thành và phát triển các loại nấm bệnh cực kì hiệu quả nhờ cơ chế bất hoạt enzyme. Thuốc trừ nấm nội hấp có tác dụng bảo vệ và diệt trừ. Xâm nhập qua rễ mà mô xanh; vận chuyển hướng Carbenzim 50 WP Carbendazim ngọn. Tác động kìm hãm sự phát triển của ống mầm, ngăn cản sự hình thành giác bám và sự phát triển của sợi nấm. Thuốc trừ nấm nội hấp có tác dụng phòng và trừ bệnh. Dùng trừ nhiều loại nấm Saizole 5 SC Hexaconazole thuộc nấm túi và nấm đảm. Trừ các bệnh khô vằn, lem lép hạt lúa, rỉ sắt, nấm hồng
Đồ án tốt nghiệp cà phê, đốm lá lạc, khô vằn ngô, phấn trắng xoài Thuốc trừ nấm nội hấp, có tác dụng phòng và trừ bệnh. Dùng để trừ nhiều loại nấm bệnh thuộc bộ sương mai Peronosporales trên các cây trồng nhiệt đới và á nhiệt đới. Hỗn hợp các thuốc trừ nấm bảo vệ phun lên cây để Mancozeb 64% + Metalaxyl trừ giải sương mai. Xử lý Mexyl Mz 72 WP 8% đất bằng metalaxyl để trừ các bệnh hại rễ và các bệnh thối thân của cam chanh. Xử lý hạt giống chốn giả sương mai trên thuốc lá ở vườn ươm, chống các bệnh thối (Pythium spp) trên ngộ, đậu, ngũ cốc, hướng dương và nhiều cây trồn khác. Thuốc trừ nấm tiếp xúc có tác dụng bảo vệ. Phun lên cây, xử lý hạt giống trừ Dipomate 80 WP Mancozeb 85% nhiều loài nấm bệnh trên cây ngắn ngày, cây ăn quả, rau và cây cảnh Dùng để trừ cháy sớm và sương mai
Đồ án tốt nghiệp cà chua khoai tây, đốm lá dưa chuột, ngũ cốc, bệnh thối đốm quả, thán thư và nhiều bệnh hại cây con và cây trồng khác.
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian: 2.1.1. Địa điểm: Phòng Thí Nghiệm Vi Sinh, Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thời gian: Đề tài được thực hiện từ 03/03/2015 đến ngày 20/07/2015. 2.2. Vật liệu: 2.2.1. Nguyên liệu: 2.2.1.1. Cành thanh long: Các mẫu bệnh trên cây thanh long và các cành thanh long khỏe để lây nhiễm bệnh nhân tạo được thu thập tại thôn Kim Bình, xã Hàm Thắng, Hàm Thuận Bắc, Bình Thuận. 2.2.1.2. Chủng nấm Trichoderma: Chủng nấm Trichoderma được phân lập từ đất ca cao và đất hồ tiêu được lấy từ Phòng thí nghiệm - khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TPHCM. 2.2.2. Hóa chất: - Agar - Đường D – Glucose - Kháng sinh Chloramphenicol 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị: 2.2.3.1. Dụng cụ: - Bình môi trường 250ml, 500ml - Đĩa petri - Ống nghiệm - Ống đong 100ml, 500ml
Đồ án tốt nghiệp - Cốc 100ml, 200ml, 500ml - Que cấy - Bình tia 2.2.3.2. Thiết bị: - Cân phân tích - Cân kỹ thuật - Nồi hấp Autoclave - Bếp từ - Bếp hồng ngoại - Tủ cấy - Đèn cồn Các dụng cụ, thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm 2.2.3.3. Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm: a. Môi trường WA (Water agar): Thành phần môi trường: - Agar: 20g - Nước cất: 1000ml Cân đủ 20g agar và cho vào 1000ml nước cất, lắc đều và hấp khử trùng ở 121oC, trong vòng 20 phút. Sau khi hấp môi trường, chờ nhiệt độ môi trường hạ xuống 60oC thì tiến hành đổ môi trường ra đĩa petri. Môi trường WA được dùng làm giá thể cho bào tử nảy mầm trước khi cấy đơn bào tử. Sợi nấm mọc thưa thớt trên môi trường này cho nên rất thích hợp làm môi trường nền để nuôi cấy các tản nấm mới. Việc nấm mọc thưa trên WA cũng thuận lợi cho việc phân lập nấm từ các bộ phận của cây, như cành hoặc rễ. b. Môi trường PDA (Potato – D – Glucose Agar): Thành phần môi trường: - Khoai tây 200g - Đường D – Glucose 10g
Đồ án tốt nghiệp - Agar 10g - Kháng sinh Chloramphenicol 0.25g - Nước cất 1000ml Khoai tây rửa sạch, cắt nhỏ từng miếng vuông (khoảng 1cm2), cân đủ 200g, rồi cho vào nước đun cho đến khi mềm. Gạn lấy dịch nước khoai tây. Sau đó cho đường, agar, kháng sinh và bổ sung nước vào cho đủ 1000ml. Lắc đều và đem đi hấp khử trùng ở 121oC, trong vòng 20 phút. Để nguội đến 60oC rồi tiến hành đổ môi trường ra đĩa petri. 2.3. Phương pháp nghiên cứu: 2.3.1 Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng: a. Thu mẫu thanh long bị bệnh: Chọn những cành thanh long vừa xuất hiện bệnh, biểu hiện bằng những chấm nhỏ li ti, đốm nhỏ màu trắng. Khi mới xuất hiện, triệu chứng ban đầu là các vết lõm màu trắng li ti, sau đó, vết bệnh nổi lên thành những đốm tròn màu nâu. ❖ Các bước phân lập nấm từ mẫu thực vât bị bệnh: - Rửa mẫu dưới vòi nước máy để loại bỏ đất và bụi bẩn. - Khử trùng bề mặt mẫu bằng cách dùng giấy thấm cồn 70o lau nhẹ bề mặt mẫu trong vòng 5 giây và sau đó lau lại bằng nước cất, để khô mẫu. - Dùng dao cắt đã khử trùng cắt nhỏ mẫu bệnh, kích thước 1 – 2 cm, từ phần ranh giới giữa mô không có dấu hiệu bệnh và mô bệnh còn mới. - Cho mẫu cấy vào cồn 70o trong vòng 1 phút. - Rửa lại mẫu bằng nước cất 3 – 4 lần bằng nước cất. - Thấm khô mẫu bằng giấy thấm đã khử trùng. - Dùng kẹp vô trùng lấy mẫu cấy ấn nhẹ vào đĩa petri chứa môi trường WA. Mỗi đĩa petri cấy 4 mẫu bệnh ở 4 góc. - Đậy nắp đĩa petri và ủ ở nhiệt độ phòng. b. Phương pháp cấy chuyền: ❖ Các bước của phương pháp cấy chuyền:
Đồ án tốt nghiệp - Kiểm tra đĩa cấy phân lập hàng ngày và đánh giá sự phát triển của sợi nấm từ các miếng cấy. - Xác định xem có nhiều hơn một loài nấm mọc lên hay không. Nếu có nhiều loài phải tiến hành tách từng dạng khuẩn lạc ra cấy chuyền để làm thuần các loài thu nhận được. - Cấy chuyền khi sợi nấm mọc được khoảng 5mm từ miếng cấy. - Cắt một miếng thạch nhỏ (2 – 2mm) từ rìa mỗi tản nấm và cấy sang đĩa petri chứa môi trường PDA. - Ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát sau 2 – 3 ngày. c. Phương pháp làm thuần: ❖ Các bước tiến hành phương pháp làm thuần: - Dùng que cấy dẹp đã khử trùng, cắt một miếng thạch nhỏ (khoảng 2 – 2 mm) chứa phần đỉnh của một sợi nấm trên đĩa nấm đã cấy truyền và cấy sang đĩa petri chứa môi trường PDA. - Kí hiệu tên mẫu cấy, ngày cấy. d. Phương pháp phòng ẩm: ❖ Chuẩn bị: - Đĩa petri vô trùng có chứa môi trường PDA (môi trường được đổ tương đối dày). - Đĩa petri có đặt một lớp bông gòn thấm ở dưới, giấy lọc ở trên. Đặt trên miếng giấy lọc mỗi đĩa petri 1 miếng lame và lamelle. Tất cả đều được vô trùng. - Đĩa petri chứa mẫu nấm đã được làm thuần. - Nước cất vô trùng. ❖ Cách bước tiến hành: - Đĩa petri vô trùng chứa môi trường PDA, dùng dao mổ đã khử trùng cắt thành những mảnh hình vuông (1 x 1cm). - Dùng kẹp đã khử trùng chỉnh sửa miếng lame vào giữa đĩa petri vô trùng có kèm bông gòn và giấy lọc. - Dùng kẹp gắp mảnh môi trường PDA đã cắt đặt vào giữa miếng lame.
Đồ án tốt nghiệp - Dùng que cấy thước thợ đã khử trùng lấy sinh khối từ đĩa petri chứa nấm gây bệnh đã làm thuần, cấy vào 4 cạnh của miếng thạch PDA. - Đặt miếng lamelle lên trên mảnh thạch. - Cho nước cất vô trùng vào vừa đủ để thấm hết miếng giấy lọc trong đĩa cấy. Không cho nước dính vào miếng lame vì sẽ ảnh hưởng đến việc hình thành bào tử. - Đậy nắp đĩa, ghi chú tên và ngày cấy. - Tùy thuộc vào thời gian sinh bào tử của từng loài nấm mà sau 3 ngày, 5 ngày hoặc 7 ngày ta bắt đầu soi bào tử dưới kính hiển vi. ❖ Cách bước soi bào tử dưới kính hiển vi: Dùng bông gòn lau lame bằng cồn 96o. - Nhỏ 1 giọt methylen blue lên lame, sau đó dùng kẹp gắp lamelle trong đĩa phòng ẩm đặt lên giọt methylen blue, soi ở vật kính 10X để xem hình thái sợi nấm. - Sau đó, cho 1 giọt dầu soi kính lên miếng lamelle, soi ở vật kính 100X để xem hình thái bào tử. e. Phương pháp lây bệnh nhân tạo: ❖ Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành trên cành thanh long khỏe, chưa nhiễm bệnh. Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện trên 3 cành thanh long, mỗi cành gây 10 vết thương bằng cách dùng kim tiêm châm nhẹ vào và tiến hành lây bệnh theo công thức: - Công thức 1 (ĐC): phun nước cất vô trùng. - Công thức 2: phun chủng nấm đã phân lập được. ❖ Các bước tiến hành: - Dùng bông gòn thấm nước cất lau nhẹ để làm sạch bề mặt của các cành thanh long. Phun nước cất vô trùng cho ướt cành. - Dùng kim tiêm châm nhẹ lên bề mặt cành thanh long để tạo vết thương. - Đối với mẫu đối chứng: phun nước cất lên bề mặt sau khi tạo vết thương. - Đối với mẫu thí nghiệm: hòa bào tử vào nước cất để tạo dịch bào tử, sau đó dùng bình xịt phun lên bề mặt cành thanh long sau khi tạo vết thương.
Đồ án tốt nghiệp - Đặt các mẫu thanh long ở nơi thoáng mát, tránh ánh nắng trực tiếp và nơi có độ ẩm cao. Ghi tên mẫu và ngày bắt đầu thí nghiệm. - Quan sát mẫu và ghi chú ngày xuất hiện bệnh, biểu hiện bệnh và so sánh với mẫu đối chứng. Đồng thời so sánh biểu hiện mẫu lây bệnh với mẫu thu thập từ đồng thanh long để xác định chính xác. - Lưu ý: Để làm thí nghiệm này, ta nên chọn những cành thanh long khỏe, không bị nhiễm bệnh.Trong dịch bào tử nấm nên cho vài giọt tween 80 giúp tăng khả năng bám dính của bào tử nấm vào vết thương. Thời gian phun tốt nhất là vào buổi chiều tối khoảng 17 giờ. - Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian xuất hiện bệnh, tỷ lệ bệnh và quan sát triệu chứng xuất hiện vết bệnh của từng nghiệm thức ghi nhận bằng hình ảnh sau khi lây bệnh. 2.3.2. Chọn lọc chủng Trichoderma theo phương pháp đối kháng trực tiếp trong đĩa petri (in vitro): a. Bố trí thí nghiệm: - Thí nghiệm được thực hiện với 8 công thức, tương ứng với 7 loại nấm Trichoderma và 1 công thức đối chứng. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. - Tuyển chọn 3 trong 7 chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao nhất để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. b. Các bước thực hiện thí nghiệm: ❖ Chuẩn bị nguồn nấm: - Đĩa nấm Trichoderma gốc: cấy điểm các chủng Trichoderma cần khảo sát vào giữa đĩa môi trường PDA vô trùng và ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 7 ngày làm nguồn đối kháng nấm bệnh. - Đĩa nấm bệnh gốc: cấy điểm chủng nấm bệnh cần khảo sát vào giữa đĩa môi trường PDA vô trùng và ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 7 ngày làm nguồn thử khả năng bị ức chế bởi nấm Trichoderma. - Đĩa petri vô trùng chứa môi trường PDA. ❖ Thí nghiệm đối kháng trực tiếp:
Đồ án tốt nghiệp - Đĩa đối kháng: dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5mm đục một miếng thạch có chứa nấm bệnh từ đĩa nuôi cấy nấm bệnh gốc, đặt khoanh thạch cách mép đĩa petri chứa môi trường PDA là 1 cm. Sau đó, tiến hành tương tự khoan lấy 1 khoanh thạch từ đĩa nấm Trichoderma gốc, đặt vào đĩa môi trường PDA có chứa nấm bệnh đã cấy, cách mép đĩa 1 cm nhưng ở phía đối xứng với nấm bệnh qua tâm đĩa petri. - Đĩa đối chứng: khoan khoanh thạch nấm bệnh, đường kính 5mm đặt tương tự trên đĩa petri chứa môi trường PDA cách mép đĩa 1 cm và không cấy nấm Trichoderma. - Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. - Ghi chú tên, ngày cấy và đem ủ ở nhiệt độ phòng. c. Chỉ tiêu theo dõi: - Đường kính tản nấm bệnh ở các đĩa đối kháng và đối chứng. - Tỷ lệ (%) ức chế nấm bệnh của nấm Trichoderma. d. Tính toán khả năng đối kháng: Hiệu quả đối kháng được tính bằng công thức: R − R 푃 = 1 2 × 100% R1 Trong đó: R1: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối chứng khi không cấy Trichoderma (mm). R2: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối kháng khi cấy Trichoderma (mm). 2.3.3. Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh đốm trắng của các chủng Trichoderma có triển vọng trong điều kiện in vivo: ❖ Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện với các công thức: - CT1 (Công thức 1): Nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum. - CT2 (Công thức 2): Chủng nấm Trichoderma T5 đối kháng với nấm Neoscytalidium dimidiatum.
Đồ án tốt nghiệp - CT3 (Công thức 3): Chủng nấm Trichoderma T6 đối kháng với nấm Neoscytalidium dimidiatum. - CT4 (Công thức 4): Chủng nấm Trichoderma T7 đối kháng với nấm Neoscytalidium dimidiatum. - CT5 (Công thức 5): Thuốc bảo vệ thực vật Dipomate 80 WP trừ nấm Neoscytalidium dimidiatum. Thí nghiệm được thực hiện trong các chậu đã ươm trồng cành thanh long khỏe và đã phát triển ra cành non. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là trên 3 cành thanh long. Hình 2.1. Thanh long được ươm trồng trong chậu Các bước thực hiện thí nghiệm: ❖ Chuẩn bị: - 45 cành thanh long khỏe, được phân bố trồng ở mỗi chậu theo từng nghiệm thức riêng biệt. - Nấm Neoscytalidium dimidiatum hòa tan bào tử vào nước cất tạo dịch bào tử làm nguồn nấm gây bệnh.
Đồ án tốt nghiệp - 3 chủng nấm Trichoderma cũng hòa tan bào tử vào nước cất tạo dịch bào tử làm nguồn nấm đối kháng. - Thuốc bảo vệ thực vật Dipomate 80 WP hòa tan vào nước cất một lượng vừa đủ theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất để làm nguồn thuốc kháng nấm. ❖ Các bước tiến hành: Bảng 2.1. Số cành và số vết bệnh lây nhiễm trên cây thanh long khỏe Số cành thanh long Số vết lây Công thức đối kháng lây nhiễm nhiễm CT1 9 90 CT2 9 90 CT3 9 90 CT4 9 90 CT5 9 90 Ghi chú: CT1 (Công thức 1): mẫu đối chứng, chỉ phun nấm bệnh N1 CT2 (Công thức 2): phun nấm bệnh N1 và phun dịch bào tử T5 CT3 (Công thức 3): phun nấm bệnh N1 và phun dịch bào tử T6 CT4 (Công thức 4): phun nấm bệnh N1 và phun dịch bào tử T7 CT5 (Công thức 5): phun nấm bệnh N1 và thuốc BVTV Dipomate 80 WP - Dùng bông gòn thấm nước cất lau nhẹ để làm sạch bề mặt của các cành thanh long. Phun nước cất vô trùng cho ướt cành. - Dùng kim tiêm châm nhẹ lên bề mặt cành thanh long để tạo vết thương. Mỗi cành thanh long tạo 10 vết thương. - Lây bệnh nhân tạo: dùng bình xịt phun dịch bào tử nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum lên bề mặt cành thanh long sau khi tạo vết thương. Sau đó 3 ngày, tiếp tục phun dịch bào tử nấm bệnh lần 2. Sau 3 ngày tính từ ngày phun nấm bệnh lần 2, tiến hành phun dịch bào tử nấm Trichoderma T5, T6, T7 và thuốc bảo vệ thực vật Dipomate
Đồ án tốt nghiệp 80WP lên cành thanh long tương ứng ở các công thức, trừ công thức đối chứng chỉ phun nước cất. - Đặt các mẫu thanh long ở nơi thoáng mát, tránh ánh nắng trực tiếp và nơi có độ ẩm cao. Ghi tên mẫu và ngày bắt đầu thí nghiệm. - Quan sát mẫu và ghi chú ngày xuất hiện bệnh, biểu hiện bệnh và so sánh với mẫu đối chứng. Đồng thời so sánh biểu hiện mẫu lây bệnh với mẫu thu thập từ đồng để xác định chính xác. ❖ Chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ cành bệnh: đếm số cành thanh long nhiễm bệnh/tổng số cành thí nghiệm. - Tỷ lệ vết bệnh: đếm số vết thanh long nhiễm bệnh/tổng số vết thí nghiệm. - Chỉ số bệnh: (( 1 ∗ 1) + ( 2 ∗ 2) + ( 3 ∗ 3) + ⋯ + ( 푛 ∗ 푛)) 푆 (%) = ∗ 100 ∗ 푛 Trong đó: N1, N2, N3, , Nn: tương ứng với cành bị nhiễm bệnh ở mỗi cấp 1,2,3, ,n. n: Cấp bệnh cao nhất. N: Sô cành thanh long theo dõi trên trụ. Cấp 1: 0 – 5%: diện tích cành bị bệnh Cấp 2: 6 – 10%: diện tích cành bị bệnh Cấp 3: 11 – 15%: diện tích cành bị bệnh Cấp 4: 16 – 20%: diện tích cành bị bệnh Cấp 5: > 20%: diện tích cành bị bệnh 2.3.4. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm: ❖ Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện đối với 3 chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt nhất được tuyển chọn từ 7 chủng Trichoderma ban đầu. Bao gồm Trichoderma T5, Trichoderma T6, Trichoderma T7. Mỗi chủng được thử nghiệm với công thức, cụ thể như sau:
Đồ án tốt nghiệp - Công thức 1: Cup 2,9 SL - Công thức 2: Carbenzim 50 WP - Công thức 3: Saizole 5 SC - Công thức 4: Mexyl Mz 72WP - Công thức 5: Dipomate 80WP - Công thức 6: Đối chứng (Không bổ sung) a. Các bước tiến hành: ❖ Chuẩn bị: - Chuẩn bị nguồn Trichoderma khảo sát: cấy điểm các chủng Trichoderma cần khảo sát vào giữa đĩa môi trường PDA vô trùng và ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 7 ngày làm nguồn khảo sát. - Các bước chuẩn bị môi trường PDA hòa tan thuốc BVTV: ▪ Chuẩn bị môi trường PDA đã hấp khử trùng ở 6 chai môi trường ứng với 6 công thức thí nghiệm. Mỗi chai chứa 100ml môi trường. ▪ Đặt 6 chai môi trường vào tủ ủ, ủ đến 55oC. ▪ Dùng micropipette lần lượt cho 5 loại thuốc BVTV theo liều lượng đã tính vào từng chai môi trường. ▪ Tiến hành đổ đĩa petri và ghi chú. Bảng 2.2. Liều lượng thuốc BVTV sử dụng cho 100ml môi trường Hoạt chất Liều lượng Cup 2,9 SL 0.125 ml Carbenzim 50 WP 0.2 ml Saizole 5 SC 0.2 ml Mexyl Mz 72 WP 0.375 g Dipomate 80 WP 0.475 g
Đồ án tốt nghiệp ❖ Thí nghiệm: - Đĩa khảo sát: dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5mm đục một miếng thạch có chứa nấm Trichoderma từ đĩa gốc, đặt khoanh thạch vào chính giữa tâm đĩa petri chứa môi trường PDA có hòa tan từng công thức thuốc bảo vệ thực vật. - Đĩa đối chứng: dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5mm đục một miếng thạch có chứa nấm Trichoderma từ đĩa gốc, đặt khoanh thạch vào chính giữa tâm đĩa petri chứa môi trường PDA không hòa tan bất kì công thức thuốc nào. - Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. - Ghi chú tên, ngày cấy và đem ủ ở nhiệt độ phòng. b. Chỉ tiêu theo dõi: - Đo đường kính tản nấm (mm) ở 2, 4, 6 ngày sau cấy. d + d - Đường kính trung bình tính theo công thức: = 1 2 2 (Trong đó, d1 và d2 là hai đường chéo tản nấm phân bố) - Tính độ hữu hiệu của thuốc theo công thức: − Hiệu lực của thuốc (%) = × 100 Trong đó: - C: Đường kính tản nấm trên môi trường không thuốc - T: Đường kính tản nấm trên môi trường có thuốc. 2.4. Phương pháp xử lí số liệu: Tiến hành xử lý số liệu thống kê trong phần mềm Statgraphics theo trình tự: - Xử lý số liệu của kết quả nghiên cứu thu được. - So sánh các tham số đặc trưng của hai hay nhiều kết quả nghiên cứu Phép phân tích phương sai ANOVA và giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với độ tin cậy 95%.
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng: 3.1.1. Kết quả phân lập: Thanh long là cây ăn quả nhiệt đới, thích hợp khí hậu nắng nóng, chịu hạn tốt. Tuy nhiên trong điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm, lượng mưa cao ở Việt Nam, những năm gần đây cây thanh long đã bị gây hại nghiêm trọng bởi bệnh đốm trắng. Bệnh gây hại trên bẹ non, nụ bông, trái non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch làm ảnh hưởng lớn đến diện tích trồng và năng suất của thanh long. Trên ruộng thanh long, bệnh hại trên thân và quả. Trên quả, vết bệnh lúc đầu là những đốm tròn nhỏ màu trắng, vết lõm thấp hơn so với bề mặt quả, sau 7 - 10 ngày những đốm trắng lõm xuống tạo thành mảng, vết bệnh có màu vàng cam và phát triển nhô lên nếu bị nặng gây thối, quả nhũn. Trên thân, có nhiều triệu chứng khác nhau như vết loét to và có nhiều chấm đen trên bề mặt vết bệnh, vết trắng nhỏ lõm và vết nâu đỏ lồi. Việc thu mẫu bệnh là một bước đầu có ý nghĩa quan trọng để làm cơ sở cho công tác nghiên cứu trong bảo vệ thực vật, từ đó cơ sở xây dựng phương pháp phòng trừ hiệu quả giúp tăng năng suất và chất lượng. Hình 3.1. Cành thanh long bệnh thu tại vườn thanh long ở Bình Thuận Từ các mẫu thanh long vừa mới bị bệnh thu thập tại vườn thanh long ở tỉnh Bình Thuận, sinh viên đã phân lập được chủng nấm N1. Nấm N1 phát triển rất nhanh trên môi trường PDA và có những đặc điểm như sau:
Đồ án tốt nghiệp 3.1.2. Đặc điểm đặc trưng của nấm N1: 3.1.2.1. Đặc điểm đại thể: Để tìm hiểu khả năng phát triển của nấm trên môi trường nhân tạo, sinh viên tiến hành nuôi cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1: Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và đường kính trung bình của tản nấm N1 nuôi cấy trên môi trường PDA. Ngày Đường kính Đặc điểm hình thái sau trung bình tản Hình ảnh tản nấm cấy nấm (mm) Tản nấm mỏng, mịn, 2 70 tơ nấm màu trắng, kết cấu lỏng lẻo. Tản nấm phát triển đầy đĩa, tơ nấm tạo nhiều lớp, khá dày, 4 90 mịn màu trắng. Mặt sau đĩa xuất hiện nhiều đốm màu xám đen
Đồ án tốt nghiệp Dẹt, dày, tơ nấm chuyển màu xám tro, vẫn tiếp tục tạo 6 90 lớp tơ mới .Mặt sau đĩa chuyển dần sang màu đen. Dẹt, dày, mịn, tơ nấm màu xám tro xếp nhiều lớp chồng 10 90 lên nhau. Mặt sau đĩa chuyển thành màu đen. Tóm lại, qua thời gian theo dõi 10 ngày sau cấy, nhận thấy chủng nấm N1 có khả năng sinh trưởng rất nhanh trên môi trường PDA, tản nấm tròn, ban đầu có màu trắng sau chuyển sang màu xám đen rất nhanh. Sợi nấm có màu nâu đến nâu sậm, mịn, dày. Chủng nấm N1 phát triển trên môi trường thạch PDA làm môi trường từ màu vàng nhạt chuyển sang màu đen sậm, không có vòng tròn đồng tâm. Đặc điểm đại thể của chủng nấm này hoàn toàn trùng khớp với đặc điểm của nấm Neoscytalidium dimidiatum theo mô tả của Crous ct al (2006).
Đồ án tốt nghiệp 3.1.2.2. Đặc điểm vi thể: Quan sát trên kính hiển vi ở thấu kính 10X, 40X và 100X cho thấy sợi nấm phân nhánh, có màu nâu, có vách ngăn và tự tách ra thành bào tử. Bào tử hình thành rất nhanh chỉ sau 2 ngày nuôi cấy. Bào tử có màu nâu nhạt đến nâu sẫm, không hoặc có 1 vách ngăn. Bào tử có hình trứng, elip, que, tròn, đơn bào, không màu, hoặc màu nâu không có hoặc có 1 - 2 vách ngăn. Ngoài ra còn quan sát được quả cành có lỗ mở nhỏ, hình cầu, màu đen trên kính hiển vi. Tương tự như trên, đặc điểm vi thể cũng như hình thái sợi nấm, hình thái bào tử hoàn toàn giống với đặc điểm của nấm Neoscytalidium dimidiatum (Crous & ctv, 2006). Như vậy, có thể khẳng định nấm phân lập được là nấm Neoscytalidium dimidiatum. Tuy nhiên, cần phải lây nhiễm nấm trên cành thanh long khỏe để có kết luận chính xác nhất.
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. So sánh nấm N1 với nấm Neoscytalidium dimidiatum Nấm N1 phân lập được Nấm Neoscytalidium dimidiatum (theo Lý Phương Ngà, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam) 3.1.3. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch: Lây bệnh là một phần không thể thiếu trong việc xác định chính xác tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch. Vì vậy, sau khi tiến hành phân lập tác nhân gây bệnh trên
Đồ án tốt nghiệp môi trường, sinh viên đã kiểm chứng lại tác nhân bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch cho các cây thanh long khỏe trồng trong chậu từ 1 - 2 tháng. Bảng 3.3. Kết quả lây nhiễm bệnh trên thanh long khỏe theo quy tắc Koch Số Tỷ lệ cành Tỷ lệ vết Số cành Số vết Số vết bị cành nhiễm nhiễm Công thức thể hiện lây nhiễm lây bệnh bệnh bệnh nhiễm bệnh nhiễm (%) (%) Đối chứng 3 0 0 30 0 0 Nhiễm nấm 3 3 100 30 16 53,33 Ghi chú: Đối chứng: đối chứng phun nước cất. Nhiễm nấm: Mẫu khảo sát phun dịch bào tử nấm N1. Số liệu ở bảng 3.3 cho thấy đối với công thức đối chứng phun nước cất không hình thành bất kì vết bệnh hay triệu chứng gây hại nào. Còn mẫu khảo sát phun dịch bào tử nấm N1 có triệu chứng vết nâu đỏ, lồi giống với triệu chứng vết nâu đỏ thu được ngoài đồng ruộng hình thành sau 2 tháng lây nhiễm. Sau đó vết bệnh lan dần và thối giống với triệu chứng loét to thu được ngoài đồng ruộng. Điều này cho thấy khả năng lây bệnh của nấm Neoscytalidium dimidiatum trên cành thanh long là rất lớn. Hình 3.2. Cành thanh long bị bệnh trước và sau khi lây nhiễm theo quy tắc Koch
Đồ án tốt nghiệp Từ các cành thanh long bị bệnh do lây bệnh nhân tạo, sinh viên tiến hành phân lập lại trên môi trường WA. Kết quả cho thấy, mẫu phân lập chỉ xuất hiện một loài nấm có đặc điểm đại thể và vi thể giống như mẫu bệnh phân lập ban đầu. Như vậy có thể khẳng định, bệnh đốm trắng thanh long ở Bình Thuận do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Đĩa nấm trước Koch Đĩa nấm sau Koch Hình 3.3. Nấm phân lập từ cành thanh long nhiễm bệnh theo quy tắc Koch 3.2. Chọc lọc chủng nấm Trichoderma đối kháng với nấm Neoscytalidium dimidiatum trong đĩa petri (in vitro): Cho đến nay, việc phòng trừ nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long vẫn là vấn đề nan giải đối với sản xuất. Với hi vọng tìm ra được chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm Neoscytalidium dimidiatum để giới thiệu cho sản xuất là một điều rất cần thiết. Vì vậy, dựa trên bộ nấm Trichoderma của nhóm sinh viên phòng thí nghiệm, sinh viên tiến hành chọn lọc chủng nấm đối kháng với nấm Neoscytalidium dimidiatum. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và bảng 3.4:
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Đường kính trung bình tản nấm và phần trăm ức chế của 7 chủng nấm Trichoderma với nấm Neoscytalidium dimidiatum: Đường kính trung bình tản nấm Neoscytalidium dimidiatum Chủng sau các ngày nuôi cấy (mm) Trichoderma 3NSC 5NSC 7NSC 10NSC T1 41,67±1,53 b 30±2,00 b 26,33±1,15 b 26,33±1,15 b T2 38,67±1,15 bc 33,33±2,89 b 21±1,73 c 21±1,73 c T3 33,5±4,95 d 21±1,41 c 15d 11,5±2,12 d T4 38±2,65 c 31,33±1,15 b 25,67±3,06 b 24,33±1,15 b T5 39,33±0,58 bc 31,33±1,15 b 5,67±1,15 e 5,67±1,15 e T6 37 cd 17,67±2,08 c 5,67±0,58 e 5,67±0,58 e T7 33,67±1,53 d 19,67±2,52 c 14,67±1,15 d 3,33±2,89 e ĐC 47±2,00 a 72,67±2,52 a 90 a 90 a Ghi chú: các giá trị là trung bình 3 đĩa cấy ± SD, NSC: Ngày sau cấy. Các số liệu trên cùng một cột có cùng chữ cái theo sau thì không có sự khác biệt với mức ý nghĩa 5%. Số liệu ở bảng 3.4 cho thấy, chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum phát triển khá nhanh trên môi trường PDA. Sau 3 ngày nuôi cấy, đường kính tản nấm đã đạt 47mm và đến 7 ngày nấm đã lan đầy đĩa (90 mm) khi không có mặt của nấm Trichoderma. Ở các đĩa đối kháng, nấm Neoscytalidium dimidiatum bị ức chế bởi nấm Trichoderma nên tốc độ phát triển kém hơn hẳn. Đường kính tản nấm của Neoscytalidium dimidiatum ở các công thức có nấm Trichoderma đều thấp hơn so với đĩa đối chứng. Sự chênh lệch này thể hiện rõ từ ngày thứ 3 sau khi cấy. Đến 7 ngày sau khi cấy, đường kính tản nấm Neoscytalidium dimidiatum ở các công thức đối kháng có chủng nấm T5 và T6 chỉ còn khoảng 5,67 mm so với đĩa đối chứng là 90 mm. Đến 10 ngày sau khi cấy, đường kính tản nấm Neoscytalidium dimidiatum ở các công thức có các chủng nấm T5, T6 và T7 đều < 10 mm. Sự có mặt của các chủng nấm Trichoderma
Đồ án tốt nghiệp khác nhau đã ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh trưởng của nấm Neoscytalidium dimidiatum. Cụ thể như sau: Đối với chủng Trichoderma T1, vào thời điểm 3 ngày sau khi cấy, đường kính tản nấm Neoscytalidium dimidiatum đạt 41,67 mm. Lúc này, 2 tản nấm đã chạm nhau nhưng sự đối kháng vẫn chưa diễn ra. Sang ngày thứ 5 sau cấy, sự đối kháng bắt đầu và tản nấm Trichoderma T1 tấn công sang nấm gây bệnh dẫn đến đường kính nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum giảm còn 30 mm. Lúc này bào tử Trichoderma T1 đã bắt đầu hình thành và trở nên dày đặc vào ngày thứ 7, đường kính nấm Neoscytalidium dimidiatum giảm còn 26,33 mm và không đổi vào thời điểm 10 ngày sau cấy. Xét chủng Trichoderma T2, qua 3 ngày cấy tản nấm Neoscytalidium dimidiatum và nấm Trichoderma T2 đều phát triển nhanh, lúc này tản nấm bệnh đạt đường kính 38,67 mm. Sang ngày thứ 5 sau cấy, chủng Trichoderma bắt đầu đối kháng làm đường kính nấm bệnh giảm còn 33,33 mm. Trichoderma T2 bắt đầu hình thành bao tử màu xanh bao phủ nấm bệnh và làm đường kính nấm bệnh chỉ còn 21 mm ở ngày thứ 7 và vẫn giữ kết quả đến ngày thứ 10 sau khi cấy. Chủng Trichoderma T3 cũng có khả năng đối kháng với nấm Neoscytalidium dimidiatum. Tại thời điểm 3 ngày sau cấy, khi tản nấm của nấm Neoscytalidium dimidiatum và nấm Trichoderma chạm nhau, chủng Trichoderma T3 đã lấn át một phần tản nấm bệnh. Sang đến ngày thứ 5, nấm bệnh bị tấn công chỉ còn 21 mm và tiếp tục giảm đường kính còn 11,5 mm vào ngày thứ 7 sau khi cấy. Bào tử Trichoderma hình thành dày đặc tấn công vào tâm cấy nấm Neoscytalidium dimidiatum và lan rộng, chiếm gần hết đĩa petri. Đường kính nấm bệnh vào thời điểm kết thúc thí nghiệm đạt 11,5 mm. Đối với chủng Trichoderma T4, thời điểm những ngày đầu sau khi cấy, đường kính nấm bệnh đạt 38 mm. Sau khi hai tản nấm chạm nhau và sự đối kháng bắt đầu diễn ra, tản nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum giảm dần đường kính còn 31,33 mm vào ngày thứ 5 sau khi cấy. Sang ngày thứ 7, nấm Neoscytalidium dimidiatum tiếp tục
Đồ án tốt nghiệp bị nấm Trichoderma T4 tấn công, đường kính nấm bệnh còn 25,67 mm và sang ngày thứ 10 còn 24.33 mm. Đối với chủng Trichoderma T5, đường kính nấm gây bệnh ở 3 ngày đầu tiên là 39,33 mm và giảm sau 5 ngày ở 31,33 mm. Lúc này tản nấm T5 bao phủ và bắt đầu tấn công vào tản nấm bệnh. Đến ngày thứ 7, sự đối kháng diễn ra mạnh và nhanh hơn khi tản nấm đối kháng lan sang vùng cấy nấm bệnh và chiếm hầu hết đĩa petri, hình thành bào tử nấm màu xanh dày đặc ở vùng cấy nấm gây bệnh và toàn bộ đĩa. Kết quả không đổi sau 10 ngày nuôi cấy, tản nấm T5 ức chế nấm bệnh làm cho đáy đĩa petri mất hẳn màu đen đặc trưng của nấm bệnh. Đối với nấm Trichoderma T6, vào ngày thứ 3, tản nấm của cả nấm bệnh và nấm đối kháng đã hình thành tơ nấm có màu trắng, cả 2 tản nấm đã chạm nhau chuẩn bị cho quá trình đối kháng diễn ra, lúc này đường kính nấm bệnh đạt 37 mm. Đến ngày thứ 5, nấm đối kháng lan nhanh sang vùng cấy nấm bệnh, tản nấm bệnh dần biến mất và tản nấm đối kháng xuất hiện ở phần lớn đĩa petri. Đến ngày thứ 7 sau khi cấy, nấm bệnh bị bao phủ toàn bộ nên đường kính chỉ còn 5,67 mm và vẫn giữ nguyên đến ngày thứ 10. Lúc này, tản nấm Trichoderma đã ăn sâu vào tâm cấy nấm Neoscytalidium dimidiatum và hình thành bào tử dày đặc ở đĩa petri. Đối với chủng Trichoderma T7, ở thời điểm 3 ngày sau cấy đường kính nấm Neoscytalidium dimidiatum là 33,67 mm, tản nấm của cả 2 đã chạm nhau và tản nấm của nấm đối kháng đã có dấu hiệu tấn công qua phần rìa nấm bệnh. Sang ngày thứ 5 sau khi cấy, đường kính nấm giảm nhanh còn 33,67 mm. Lúc này, tản nấm đối kháng bắt đầu phủ dần lên bề mặt tản nấm bệnh và hình thành bào tử màu xanh xen lẫn trắng dày đặc. Đường kính nấm bệnh tiếp tục giảm còn 14,67 mm vào ngày thứ 7 và đến ngày thứ 10 sau cấy, nấm bệnh bị bao phủ toàn bộ. Tản nấm gây bệnh hầu như đã biến mất và nấm đối kháng chiếm toàn bộ phần đĩa petri. Quan sát dưới đáy đĩa petri không thấy xuất hiện quầng đen của nấm bệnh.
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5. Phần trăm ức chế của 7 chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh: Chủng Khả năng ức chế đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum (%) Trichoderma 3NSC 5NSC 7NSC 10NSC T1 11,33 ±0,82 c 58,74±1,34 b 70,74±1,28 d 70,74±1,28 d T2 17,69±1,89 cd 54,02±5,28 b 76,67±1,93 c 76,67±1,93 c T3 33,33±8,26 a 70,65±1,11 a 83,33b 87,23±2,35 b T4 19,17±3,82 b 56,84±2,34 b 71,48±3,39 d 72,96±1,28 d T5 16,24±2,61 cd 56,88±0,63 b 93,7±1,28 a 93,7±1,28 a T6 21,18±3,36 b 75,71±2,38 a 93,7±0,64 a 93,7±0,64 a T7 28,22±5,63 a 72,87±3,94 a 83,7±1,28 b 96,29±3,21 a Ghi chú: các giá trị là trung bình 3 đĩa cấy ± SD và % ức chế ± SD, NSC: Ngày sau cấy. Các số liệu trên cùng một cột có cùng chữ cái theo sau thì không có sự khác biệt với mức ý nghĩa 5%. Số liệu ở bảng 3.5 cho thấy phần trăm ức chế của 7 chủng Trichoderma đều > 70% sau 7 ngày nuôi cấy nên có thể khẳng định rằng, trong điều kiện in vitro cả 7 chủng Trichoderma này đều có khả năng đối kháng lại nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh long. Đến 10 ngày sau cấy, khả năng ức chế thấp nhất là 70,74% ở chủng T1 và cao nhất là 96,29% ở chủng T7. Dựa vào kết quả ở 10 ngày sau cấy, sinh viên và lựa chọn 3 chủng Trichoderma có hiệu quả kháng nấm tốt nhất để tiến hành thử nghiệm in vivo trên cành thanh long trồng trong chậu đó là các chủng T5, T6 và T7.
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4. Kết quả đối kháng của 7 chủng Trichoderma với nấm gây bệnh Neoscytalidium dimidiatum
Đồ án tốt nghiệp 3.3. Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh đốm trắng của các chủng Trichoderma có triển vọng ở điều kiện in vivo: Kết quả đối kháng trong đĩa petri cho thấy 3 chủng Trichoderma T5, T6, T7 có khả năng đối kháng tốt với nấm Neoscytalidium dimidiatum. Vì vậy, sinh viên chọn 3 chủng này để kiểm tra khả năng đối kháng nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long Neoscytalidium dimidiatum trong điều kiện in vivo. Kết quả được trình bày như sau: Bảng 3.6. Tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên thanh long sau khi xử lí nấm Trichoderma Tỷ lệ vết bệnh xuất hiện (%) Công thức 9 NSP 11 NSP 13 NSP 15 NSP 18 NSP ĐC 31,11 36,67 43,33 45,56 47,78 T5 7,78 7,78 13,33 13,33 14,44 T6 5,56 5,56 7,78 7,78 7,78 T7 10 10 10 12,22 12,22 Dipomate 80 WP 25,56 30 31,11 32,22 33,33 Ghi chú: NSP: ngày sau phun. Số liệu được ghi nhận tính từ ngày đầu tiên bắt đầu phun nấm. Kết quả đối kháng trong đĩa petri cho thấy 3 chủng Trichoderma T5, T6, T7 có khả năng đối kháng tốt với nấm Neoscytalidium dimidiatum. Vì vậy, sinh viên chọn 3 chủng này để kiểm tra khả năng đối kháng nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long Neoscytalidium dimidiatum trong điều kiện in vivo. Kết quả được trình bày như sau: Theo kết quả ở bảng 3.4, triệu chứng bệnh đã xuất hiện ở 4 công thức thí nghiệm và công thức đối chứng với các tỷ lệ khác nhau. Sau khi nhiễm bệnh nhân tạo Neoscytalidium dimidiatum và phun các nghiệm thức đối kháng, hiệu quả đối kháng được đánh giá thông qua tỷ lệ vết bệnh (bảng 3.6) và mức độ nhiễm bệnh (bảng 3.7). Qua thời gian phun nấm 9 ngày, triệu chứng bệnh đã bắt đầu xuất hiện với những vết nổi màu nâu. Qua các ngày tổng số vết bệnh thay đổi khác nhau ở các công thức khác nhau.
Đồ án tốt nghiệp Tại thời điểm 9 ngày sau khi phun, so với công thức đối chứng có tỷ lệ vết bệnh xuất hiện đạt 31,11% thì công thức thí nghiệm thuốc BVTV Dipomate 80WP có tỷ lệ vết bệnh xuất hiện cao nhất là 25,56%. Đối với 3 chủng Trichoderma đều có tỷ lệ xuất hiện bệnh thấp hơn công thức thuốc BVTV Dipomate 80WP. Chủng Trichoderma T5 có tỷ lệ vết bệnh là 7,78%, chủng Trichoderma T6 là 5,56%, và chủng Trichoderma T7 là 10%. Đến thời điểm 11 ngày sau khi phun, công thức đối chứng có tỷ lệ vết bệnh tăng đến 36,67%. Trong khi đó, công thức Dipomate 80WP, tỷ lệ vết bệnh tăng nhanh đến 30%. Còn 3 công thức Trichoderma có tỷ lệ bệnh vẫn giống 3 ngày sau khi phun. Ở thời điểm 13 này sau khi phun, tỷ lệ nhiễm bệnh ở công thức đối chứng tăng đến 43,33%. Ở 4 công thức thí nghiệm, công thức Trichoderma T5 có tỷ lệ vết bệnh tăng đến 13,33%. Đối với công thức Trichoderma T6, tỷ lệ vết bệnh cũng tăng đến 7,78%. Còn công thức Dipomate 80WP tỷ lệ vết bệnh tăng đến 31,11%. Trong khi đó,công thức Trichoderma T7 vẫn không thay đổi tỷ lệ bệnh. Đến ngày thứ 15 sau khi phun, công thức đối chứng có tỷ lệ vết bệnh tăng thêm đến 47,78%, trong khi các công thức thí nghiệm số lượng vết bệnh có những thay đổi khác nhau. Đối với chủng Trichoderma T6 thì tỷ lệ vết bệnh không thay đổi. Còn 3 công thức thí nghiệm Trichoderma T5, Trichoderma T7 và Dipomate 80WP thì tỷ lệ vết bệnh tăng lần lượt là 14,44%, 12,22% và 33,33%. Theo dõi đến ngày thứ 18 sau khi phun, khi công thức đối chứng có tỷ lệ vết bệnh tăng đến 47,78% thì ở công thức Trichoderma T6 và T7 tỷ lệ này vẫn không thay đổi. Trong khi đó, công thức Trichoderma T5 và Dipomate 80WP có tỷ lệ vết bệnh tăng đến 14,44% và 33,33%. Từ kết quả này cho thấy trong quá trình theo dõi thí nghiệm, trong khi công thức đối chứng và công thức Dipomate 80 WP luôn có tỷ lệ xuất hiện bệnh lần lượt tăng qua các ngày theo dõi, nhưng 3 công thức Trichoderma T5, T6 và T7 có những giai đoạn tỷ lệ vết bệnh không tăng thêm và khả năng xuất hiện triệu chứng bệnh ở 3 công thức này cũng thấp hơn 2 công thức còn lại.
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7. Chỉ số bệnh đốm trắng xuất hiện trên cành thanh long sau khi xử lý đối kháng. Chỉ số bệnh (%) Công thức 9 NSP 11 NSP 13 NSP 15 NSP 18 NSP ĐC 8 19,11 25,11 30,22 33,56 T5 3,33 3,33 5,11 6 6,88 T6 1,78 1,78 2,89 2,89 3,11 T7 5,78 6,22 6,22 7,33 7,33 Dipomate 80WP 7,56 14,44 18,22 19,78 20,67 Ghi chú: NSP: ngày sau phun Theo số liệu ghi nhận được trình bày ở bảng 3.7, mức độ nhiễm bệnh ở các công thức thí nghiệm có sự khác nhau. Cụ thể như sau: Sau khi phun nấm Neoscytalidium dimidiatum 9 ngày, ở tất cả các công thức đều bị nhiễm bệnh, trong đó chỉ số bệnh cao nhất nằm ở công thức đối chứng và chỉ số bệnh thấp nhất là công thức phun nấm Trichoderma T6. So với công thức đối chứng, 4 công thức thí nghiệm đều có chỉ số bệnh thấp hơn. Điều này chứng tỏ mức độ nhiễm bệnh trên thanh long ở 4 công thức này được hạn chế. Riêng 3 công thức phun chủng Trichoderma T5, T6, T7 có chỉ số bệnh thấp hơn công thức Dipomate 80 WP, nhận thấy 3 chủng Trichoderma này có thể hạn chế được nấm bệnh lây lan và phát triển. Đến thời điểm 11 ngày sau khi phun, công thức đối chứng có chỉ số bệnh tăng đến 19,11%. Bên cạnh đó, công thức Dipomate 80 WP cũng có mức độ nhiễm tăng đến 14,44%. 2 công thức T5, T6 chỉ số bệnh không thay đổi, chứng tỏ vết bệnh không phát triển thêm. Còn công thức T7, chỉ số bệnh tăng lên 6,22%. Qua 13 ngày thực hiện thí nghiệm, sau khi công thức T7 có mức độ nhiễm bệnh tăng đến 6,22% ở thời điểm 11 ngày sau phun, thì qua ngày thứ 13, chỉ số bệnh không thay đổi, nhận thấy vết bệnh không tăng thêm. Còn 4 công thức thí nghiệm còn lại, chỉ số bệnh đều tăng. So với công thức đối chứng và công thức Dipomate 80 WP có chỉ số
Đồ án tốt nghiệp bệnh tăng nhanh, lần lượt là 25,11% và 18,22%, thì công thức T5, T6 chỉ số bệnh tăng nhưng tăng rất ít, chỉ tăng đến 5,11% và 2,89%. Đến 15 ngày sau khi phun, công thức T6 tiếp tục không thay đổi mức độ nhiễm bệnh, vẫn thấp nhất trong công thức thí nghiệm là 2,89%. 3 công thức thí nghiệm còn lại là T5, T7 và Dipomate 80 WP đều có chỉ số bệnh tăng, lần lượt là 6%, 7,33% và 19,78%. So với công thức đối chứng, cả 4 công thức thí nghiệm đều có khả năng hạn chế bệnh. Qua 18 ngày sau khi phun, cả 3 công thức phun nấm đối kháng Trichoderma T5, T6, T7 đều có chỉ số bệnh thấp (đều <10%). Trong khi đó, công thức Dipomate 80 WP có chỉ số bệnh cao hơn gấp 5 lần 3 nghiệm thức Trichoderma. So với công thức đối chứng, 4 công thức thí nghiệm đều có khả năng hạn chế sự lây lan và sự phát triển của vết bệnh, nhưng 3 công thức T5, T6 và T7 đặc biệt ngăn chặn nấm bệnh tốt hơn công thức Dipomate 80 WP. Thông qua 2 bảng kết quả 3.6 và 3.7, chứng tỏ 3 chủng Trichoderma T5, T6 và T7 đối kháng được nấm Neoscytalidium dimidiatum ở điều kiện thử nghiệm trên cành thanh long khỏe. Từ đây sinh viên nhận thấy có thể sản xuất các chế phẩm sinh học trừ nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long từ 3 chủng Trichoderma này để góp phần hạn chế thiệt hại trong sản xuất thanh long . Hình 3.5. Mẫu thanh long đối chứng khi phun nấm Neoscytalidium dimidiatum
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6. Mẫu thanh long thí nghiệm khi phun nấm Neoscytalidium dimidiatum và phun thuốc BVTV Dipomate 80WP Hình 3.7. Mẫu thanh long thí nghiệm khi phun nấm Neoscytalidium dimidiatum và phun nấm Trichoderma T5
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8. Mẫu thanh long thí nghiệm khi phun nấm Neoscytalidium dimidiatum và phun nấm Trichoderma T6 Hình 3.9. Mẫu thanh long thí nghiệm khi phun nấm Neoscytalidium dimidiatum và phun nấm Trichoderma T7
Đồ án tốt nghiệp 3.4. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm: Trên cây thanh long, ngoài bệnh đốm trắng còn bệnh thán thư và nhiều loại bệnh hại khác. Vì vậy, người nông dân thường xuyên sử dụng các loại thuốc BVTV. Liệu các loại thuốc BVTV này có ảnh hưởng và tiêu diệt nấm Trichoderma hay không? Để làm rõ điều này, sinh viên tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm thường sử dụng đến nấm Trichoderma. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5: Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các loại thuốc đến sự phát triển của tản nấm Trichoderma ở 2 ngày sau cấy Đường kính trung bình của tản nấm Trichoderma (mm) Công thức T5 T6 T7 Cup 2,9 SL 17,5 ± 0,5 b 19,33 ± 0,29 b 19,5 ± 0,5 b Carbenzim 50 WP 5c 5c 5c Saizole 5 SC 5c 5c 5c Mexyl Mz 72WP 5c 6,5c ± 2,6 5c Dipomate 80WP 17,67 ± 0,29 b 14,5± 3,04 d 12,33 ± 0,29 d Không bổ sung 81,67 ± 1,26 a 69,83 ± 3,51 a 77,67 ± 0,58 a Ghi chú: các giá trị là trung bình ± SD. Số liệu ghi nhận vào thời điểm 2 ngày sau khi cấy chủng nấm. Các số liệu trên cùng một cột có cùng chữ cái theo sau thì không có sự khác biệt với mức ý nghĩa 5%. Từ bảng kết quả 3.8 nhận thấy, tại thời điểm 2 ngày sau khi cấy, các loại thuốc BVTV có hiệu lực khác nhau và có những ảnh hưởng khác nhau đến đường kính tản nấm của 3 chủng nấm Trichoderma. Có những loại thuốc BVTV ngăn cản hoàn toàn sự phát triển của tản nấm, bên cạnh đó, chủng nấm Trichoderma vẫn có thể phát triển trên những môi trường thuốc BVTV khác. Trên các công thức xử lý Carbenzim 50 WP, Saizole 5 SC và Mexyl Mz 72WP, ở thời điểm 2 ngày sau cấy, đường kính tản nấm của cả 3 chủng nấm Trichoderma T5, T6 và T7 ở 3 công thức thí nghiệm này không hề phát triển, không xuất hiện tơ nấm
Đồ án tốt nghiệp mới, so với công thức đối chứng (môi trường không bổ sung thuốc BVTV) có đường kính lan rộng gần đầy đĩa petri và đã hình thành bào tử màu xanh đặc trưng. Công thức Dipomate 80WP, đường kính nấm ở 2 ngày sau cấy của chủng Trichoderma T5 đạt 17,67 mm, chủng Trichoderma T6 phát triển đến 14.5 mm và chủng Trichoderma T7 là 12,33 mm. Lúc này, tản nấm đang phát triển, tơ nấm có màu trắng đục, mịn như nhung và xuất hiện nhiều bào tử màu xanh. Đối với công thức Cup 2,9 SL, đường kính nấm phát triển nhanh khi 3 chủng nấm Trichoderma T5, T6 và T7 có đường kính lần lượt là 17,5 mm, 19,33 mm và 19,5 mm. Tản nấm hình tròn đồng tâm và xuất hiện dày đặc bào tử màu xanh. Bảng 3.9. Tỷ lệ ức chế của thuốc đối với nấm Trichoderma trong điều kiện invitro Tỷ lệ ức (%) chế của thuốc (%) đối với các chủng Công thức nấm T5 T6 T7 Cup 2,9 SL 78,56 ± 0,85 a 72,28 ± 1,06 a 74,89 ± 0,81 a Carbenzim 50 WP 93,88 ± 0,1 b 92,83 ± 0,36 b 93,56 ± 0,05 b Saizole 5 SC 93,88 ± 0,1 b 92,83 ± 0,36 b 93,56 ± 0,05 b Mexyl Mz 72WP 93,88 ± 0,1 b 90,79 ± 3,23 b 93,56 ± 0,05 b Dipomate 80WP 78,37 ± 0,14 a 79,07 ± 5,38 c 84,12 ± 0,44 c Ghi chú: các giá trị là trung bình ± SD. Số liệu ghi nhận vào thời điểm 2 ngày sau khi cấy chủng nấm. Các số liệu trên cùng một cột có cùng chữ cái theo sau thì không có sự khác biệt với mức ý nghĩa 5%. Số liệu ở bảng 3.9 cho thấy: Khả năng ức chế của thuốc BVTV đối với chủng nấm Trichoderma không giống nhau và có sự tương đương giữa 3 chủng Trichoderma T5, T6 và T7. Ở 2 công thức Carbenzim 50 WP và Saizole 5 SC, tỷ lệ ức chế của thuốc đối với 3 chủng Trichoderma đều đạt mức 93,88%. Còn công thức Mexyl Mz 72WP, đối với 2 chủng Trichoderma T5 và T7 hiệu lực cũng đạt 93,88%, còn hiệu lực thuốc đối với chủng
Đồ án tốt nghiệp Trichoderma T6 là 90,79%. Nhìn chung, 3 công thức thuốc BVTV này ức chế mạnh sự phát triển nấm Trichoderma. Đối với công thức Dipomate 80WP, hiệu lực thuốc đối với 3 chủng Trichoderma lần lượt là 78,37% đối với chủng T5, 79,07% đối với chủng T6 và 84.12% đối với chủng T7. Còn công thức Cup 2,9 SL, hiệu lực của thuốc BVTV đối với chủng Trichoderma T5, T6 và T7 là 78.56%, 72.28% và 74.89%. Có thể thấy 2 công thức thuốc BVTV này có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Trichoderma nhưng yếu hơn 3 công thức còn lại. Như vậy, các loại thuốc BVTV khảo sát đều ức chế các chủng nấm Trichoderma khảo sát và tỷ lệ ức chế >72%. Hình 3.10. Ảnh hưởng của thuốc đối với chủng Trichoderma T5
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11. Ảnh hưởng của thuốc đối với chủng Trichoderma T6
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12. Ảnh hưởng của thuốc đối với chủng Trichoderma T7
Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận: Bệnh đốm trắng gây hại trên cây thanh long tại Bình Thuận do tác nhân chính là nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. - Cả 7 chủng nấm đối kháng Trichoderma đều có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum trong điều kiện in vitro. Trong đó, các chủng T5, T6, T7 có khả năng đối kháng rất cao đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum trong điều kiện in vitro. - Kết quả thí nghiệm đối kháng của 3 chủng Trichoderma đã chọn với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên cây thanh long được lây bệnh nhân tạo cho thấy cả 3 chủng Trichoderma T5, T6 và T7 đều hạn chế được khả năng nhiễm bệnh và khả năng lây lan bệnh. - Các loại thuốc Cup 2,9 SL, Carbenzim 50 WP, Saizole 5 SC, Mexyl Mz 72WP đều ức chế mạnh đối với tất cả các chủng nấm Trichoderma khảo sát. 4.2. Kiến nghị: - Tiếp tục các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế xâm nhiễm cũng như tính gây bệnh của nấm Neoscytalidium dimidiatum, mức độ nhiễm và diễn biến của bệnh. - Khảo sát hiệu quả trừ bệnh đốm trắng thanh long của các chủng T5, T6 và T7 trên diện rộng để có kết luận chính xác hơn. - Nghiên cứu tiến hành tạo chế phẩm Trichoderma từ các chủng T5, T6 và T7 để sử dụng phòng trừ bệnh đốm trắng cho các ruộng thanh long tại Bình Thuận.
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Phan Thị Thu Hiền và ctv, 2014. Nghiên cứu định danh và khảo sát đặc điểm sinh học của tác nhân gây bệnh đốm trắng hại thanh long (Hylocereus undatus). Hội thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam 6 – 7/5/2014. Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2012. Nghiên cứu xác định tác nhân gây hiện tượng vàng bẹ - rám cành thanh long (Hylocereus undatus) và khảo sát hiệu quả phòng trị của một sốvi sinh vật đối kháng và thuốc sinh, hóa học trong điều kiện In vitro. Hội thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam 20 – 23/4/2012. Viện Cây ăn quả miền Nam. Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014. Nghiên cứu xác định tác nhân, đặc điểm hình thái và sinh học của nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên thanh long (Hylocereus undatus). Hội thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam 6 – 7/5/2014. Viện Cây ăn quả miền Nam. Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014. Biện pháp quản lý tạm thời bệnh đốm trắng trên cây thanh long. Viện Cây ăn quả miền Nam. Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014. Tình hình dịch hại trên thanh long và kết quả nghiên cứu của Viện Cây ăn quả miền Nam trong thời gian qua. Viện Cây ăn quả miền Nam. Nguyễn Thị Hai, 2013. Bài giảng ứng dụng công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật. Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí minh. Nguyễn Văn Kế, 2000. Cây thanh long. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh. Võ Thị Ngọc Liễu, 2013. Khảo sát đặc điểm sinh học của tác nhân gây bệnh đốm trắng thanh long và đánh giá hiệu quả phòng trừ của một số hoạt chất. Lý Phương Ngà, 2014. Nghiên cứu, xác định nấm gây bệnh loét trên cây Thanh long. Báo cáo Thực tập, Bộ môn bệnh cây khoa nông học và Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
Đồ án tốt nghiệp Võ Thị Lan Thanh, 2011. Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh. Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học. Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Agrios, G. N. , 2005. Plant Pathology. Academic Press, USA. Crous, P. W., Slipper, B., Wingfield M. J., Rheeder, J., Marasas, W. F. O., Philips, A. J. L., Alves, A., Burgess, P., Groenewald, J. Z. (2006). Phylogenetic lineeages in the Botryosphaeriaceae. Studies in Mycology. Chuang, M. F., Ni, H. F., Yang, H. R., Shu, S. L. and Lai, S. Y. (2012). First report of stem canker disease of pitaya cause by Neoscytalidium Dimidiatum in Taiwan. Ezra, D., Liarzi, O., Gat, T. and Hershcovich, M. (2013). First report of internal black rot caused by Neoscytalidium Dimidiatum on Hylocereus undatus fruit in Israel. Lan, G. B. and He, Z. F. and Xi, P. G. and Jiang, Z. D. (2012). First report of brown spot disease cause by Neoscytalidium Dimidiatum in Guangdong, Chinese Mainland. Mohd, M. H., Salleh, B., Zakaria, L., (2013). Identification and molecular characterizations of Neoscytalidium Dimidiatum causing stem canker of red- fleshed dragon fruit in Malaysia. TÀI LIỆU INTERNET Nguyễn Thành Hiếu, Nguyễn Văn Hòa và Nguyễn Minh Châu. Biện pháp quản lý tạm thời bệnh đốm trắng trên thanh long, Viện Cây ăn quả miền Nam, Nguyễn Thành Hiếu, Nguyễn Văn Hòa, Nguyễn Minh Châu. Bệnh đốm trắng thanh long và giải pháp quản lý tạm thời, 2013,
Đồ án tốt nghiệp trang-thanh-long-giai-phap-quan-ly-tam-thoi.html Nguyễn Văn Hòa. Những yếu tố cần thiết trong bảo vệ thực vật trên cây thanh long trong sản xuất theo hướng GAP, Viện Cây ăn quả miền Nam, 2013, Trần Thanh Phong. Phòng trừ bệnh đốm trắng trên thanh long, 2013, long-318453/ Nông Nghiệp Việt Nam. Hướng mới điều trị bệnh đốm trắng (đốm nâu) thanh long, 2013, nong/huong-moi-dieu-tri-benh-dom-trang-dom-nau-cay-thanh-long.html Nông Nghiệp Việt Nam. Sớm ban hành quy trình quản lý bệnh đốm trắng thanh long, 2014, nong/som-ban-hanh-quy-trinh-quan-ly-benh-dom-trang-thanh-long.html
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A. CÁC BẢNG SỐ LIỆU THÔ A.1. Đối kháng giữa chủng nấm Trichoderma T1 với nấm gây bệnh: Ngày sau cấy CTTD 3NSC 5NSC 7NSC 10NSC ĐKTB CĐK 42 28 25 25 43 30 27 27 (mm) 40 32 27 27 ĐKTB CĐC 47 70 90 90 49 73 90 90 (mm) 45 75 90 90 10.64 60.00 72.22 72.22 % Ức chế 12.24 58.90 70.00 70.00 11.11 57.33 70.00 70.00 A.2. Đối kháng giữa chủng nấm Trichoderma T2 với nấm gây bệnh: Ngày sau cấy CTTD 3NSC 5NSC 7NSC 10NSC ĐKTB CĐK 38 35 20 20 40 35 20 20 (mm) 38 30 23 23 ĐKTB CĐC 47 70 90 90 49 73 90 90 (mm) 45 75 90 90 19.15 50.00 77.78 77.78 % Ức chế 18.37 52.05 77.78 77.78 15.56 60.00 74.44 74.44
Đồ án tốt nghiệp A.3. Đối kháng giữa chủng nấm Trichoderma T3 với nấm gây bệnh: Ngày sau cấy CTTD 3NSC 5NSC 7NSC 10NSC ĐKTB CĐK 30 20 15 10 37 22 15 13 (mm) R R R R ĐKTB CĐC 47 70 90 90 49 73 90 90 (mm) 45 75 90 90 36.17 71.43 83.33 88.89 % Ức chế 24.49 69.86 83.33 85.56 R R R R A.4. Đối kháng giữa chủng nấm Trichoderma T4 với nấm gây bệnh: Ngày sau cấy CTTD 3NSC 5NSC 7NSC 10NSC ĐKTB CĐK 40 32 29 25 39 30 25 25 (mm) 35 32 23 23 ĐKTB CĐC 47 70 90 90 49 73 90 90 (mm) 45 75 90 90 14.89 54.29 67.78 72.22 % Ức chế 20.41 58.90 72.22 72.22 22.22 57.33 74.44 74.44
Đồ án tốt nghiệp ❖ A.5. Đối kháng giữa chủng nấm Trichoderma T5 với nấm gây bệnh: Ngày sau cấy CTTD 3NSC 5NSC 7NSC 10NSC ĐKTB CĐK 39 30 5 5 40 32 7 7 (mm) 39 32 5 5 ĐKTB CĐC 47 70 90 90 49 73 90 90 (mm) 45 75 90 90 17.02 57.14 94.44 94.44 % Ức chế 18.37 56.16 92.22 92.22 13.33 57.33 94.44 94.44 A.6. Đối kháng giữa chủng nấm Trichoderma T6 với nấm gây bệnh: Ngày sau cấy CTTD 3NSC 5NSC 7NSC 10NSC ĐKTB CĐK 37 17 6 6 37 16 6 6 (mm) 37 20 5 5 ĐKTB CĐC 47 70 90 90 49 73 90 90 (mm) 45 75 90 90 21.28 75.71 93.33 93.33 % Ức chế 24.49 78.08 93.33 93.33 17.78 73.33 94.44 94.44