Đồ án Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh

113 trang thiennha21 12/04/2022 3960

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_xac_dinh_tac_nhan_gay_benh_dom_trang_tren_thanh_long_v.pdf

Nội dung text: Đồ án Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN THANH LONG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÁC NHÂN GÂY BỆNH Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Võ Thị Lan Thanh MSSV: 1051110144 Lớp: 10DSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2014
PHÒNG XÉT NGHIỆM NK-BIOTEK 793/58 TRẦN XUÂN SỌAN, P. TÂN HƯNG, Q.7, TP. HCM ĐT: (08) 37715818, (08) 37752252 Fax: (08) 37750583, ( 08) 37752250 Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com, namkhoa.biotek@gmail.com GP số: 41G8005341 Theo định hướng ISO 15189 Số: 328/2014/DVVS KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM THƠNG TIN VỀ MẪU THỬ Nơi gởi mẫu: VÕ THỊ LAN THANH Mẫu thử: TL Yêu cầu: Định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 28S PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN  Giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH Kết quả SAB Kết quả giải trình tự gen 28S CACACCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCAT TTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC GATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTG GTGTTGGGCGTTTTGTCTTTGCATCAAAGACTCGCCTTAAAACGATTGGCAGCCGGCCTA CTGGTTTCGGAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAGAGGTCGGCAATCCATC AAGTCCATTTCTCACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGG CAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGGCG CTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCC CGTACGTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCC
Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH Cochliobolus lunatus internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|JF798505.1|Length: 929Number of Matches: 1 Related Information Range 1: 77 to 716GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1083 bits(586) 0.0 623/640(97%) 6/640(0%) Plus/Plus Query 1 CACACCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCAT 60 |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 77 CACATCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCAT 136 Query 61 TTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 137 TTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC 196 Query 121 GATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 197 GATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC 256 Query 181 CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 257 CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTT 316 Query 241 GGTGTTGGGCGTTTT GTCTTTGCAT CAAAGACTCGCCTTAAAACGATTGGCAGCCG 296 ||||||||||||||| ||||||| | |||||||||||||||||| |||||||||||| Sbjct 317 GGTGTTGGGCGTTTTTTGTCTTTGGTTGCCAAAGACTCGCCTTAAAAGGATTGGCAGCCG 376 Query 297 GCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGC AAGAGGTCGGCA 354 |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| ||||| Sbjct 377 GCCTACTGGTTTCGCAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAAAGAGGACGGCA 436
Query 355 ATCCATCAAGTCCATTTCTCACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT 414 |||||||||| | ||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 437 ATCCATCAAGACTCCTTCTCACGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT 496 Query 415 AAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTG 474 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 497 AAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTG 556 Query 475 AAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAG 534 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 557 AAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAG 616 Query 535 AGGGCGCTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGA 594 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 617 AGGGCGCTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGA 676 Query 595 GAATCCCGTACGTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCC 634 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 677 GAATCCCGTACGTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCC 716 KẾT LUẬN Cochliobolus lunatus TP. Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 06 năm 2014 TRƯỞNG PHỊNG TS.BS.Phạm Hùng Vân
LỜI CAM ĐOAN Tơi xin “CAM ĐOAN”, luận văn tốt nghiệp này đƣợc tơi thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trƣờng, trƣờng Đại học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Tơi cam đoan những nội dung, các số liệu và trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp là hồn tồn trung thực. Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 9 tháng 8 năm 2014 Sinh viên thực hiện Võ Thị Lan Thanh
LỜI CÁM ƠN Để hồn thành khĩa luận tốt nghiệp này, ngồi sự nổ lực hết sức của bản thân, em cịn nhận đƣợc sự hổ trợ, giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cơ, gia đình và bạn bè, em xin chân thành gửi lời “CÁM ƠN” tới: Em xin gửi lời cám ơn đến tồn thể thầy cơ trƣờng Đại học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, quý thầy cơ khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi Trƣờng đã truyền đạt những kiến thức quý báu làm nền tảng để em thực hiện khĩa luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn, lời tri ân sâu sắc đến TS.Nguyễn Thị Hai, Cơ đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm để em hồn thành khĩa luận thật tốt. Con xin gửi lời cảm ơn, lịng biết ơn sâu sắc đến ba, mẹ, gia đình, ngƣời thân đã luơn bên cạnh con, cổ vũ, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để con cĩ thể hồn thành tốt khĩa luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời cám ơn đến quý thầy, cơ và các bạn trong phịng thí nghiệm đã giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để em cĩ thể hồn thành đồ án tốt nghiệp một cách tốt nhất. Trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp, khĩ tránh khỏi sai sĩt; đồng thời, do trình độ cũng nhƣ kinh nghiệm thực tiễn cịn hạn chế nên bài báo cáo khơng thể tránh khỏi những thiếu sĩt, em rất mong nhận đƣợc ý kiến đĩng gĩp của quý Thầy, Cơ để em cĩ thêm nhiều kiến thức cũng nhƣ kinh nghiệm trong cơng việc sắp tới. Em xin chân thành cảm ơn ! Tp. Hồ Chí Minh, ngày 9 tháng 8 năm 2014 Sinh viên thực hiện Võ Thị Lan Thanh
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục đích nghiên cứu đề tài 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu về cây thanh long 3 1.1.1. Nguồn gốc 3 1.1.2. Phân loại 3 1.1.3. Đặc điểm phân bố 5 1.1.4. Đặc điểm chung của cây thanh long 5 1.2. Thành phần bệnh hại trong sản xuất thanh long 6 1.2.1. Tình hình dịch hại trên thanh long 6 1.2.2. Các bệnh thường gặp trên cây thanh long 10 1.2.2.1. Bệnh thối đầu cành 10 1.2.2.2. Bệnh đốm nâu trên cành 10 1.2.2.3. Bệnh rám cành 10 1.2.3. Cơn trùng gây hại trên cây thanh long 10 1.2.3.1. Kiến 10 1.2.3.2. Bọ xít 11 1.2.3.3. Ruồi vàng hay ruồi trái cây 11 1.2.4. Các hiện tượng sinh lý thường gặp trên cây thanh long 11 1.2.4.1. Hiện tượng rụng nụ 11 i
Đồ án tốt nghiệp 1.2.4.2. Hiện tượng nứt vỏ trái 11 1.3. Một số bệnh hại chính 11 1.3.1. Bệnh thán thư 12 1.3.1.1. Đặc điểm gây hại 12 1.3.1.2. Phổ ký chủ 13 1.3.1.3. Phương pháp phịng trừ 14 1.3.2. Bệnh đốm trắng 16 1.3.2.1. Thời gian xuất hiện 17 1.3.2.2. Tác hại 17 1.3.2.3. Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên thanh long 18 1.3.2.4. Một số biện pháp phịng trừ bệnh đốm trắng 20 1.4. Giới thiệu về nấm Cochliobolus lunatus 22 1.4.1. Phân loại 22 1.4.2. Đặc điểm hình thái, sinh hĩa 23 1.4.3. Phổ ký chủ 23 1.4.4. Cơ chế xâm nhập và gây bệnh 24 1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus 24 1.4.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 24 1.4.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 25 1.4.5.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại 25 1.4.5.4. Ảnh hưởng của pH 25 1.4.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 26 1.5. Sử dụng nấm Trichoderma trong phịng trừ bệnh đốm trắng 26 1.5.1. Giới thiệu về nấm đối kháng Trichoderma. 26 1.5.1.1. Đặc điểm phân loại 26 1.5.1.2. Nguồn gốc 26 ii
Đồ án tốt nghiệp 1.5.1.3. Đặc điểm hình thái nấm 26 1.5.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hĩa 27 1.5.2. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma 28 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. Địa điểm và thời gian 34 2.1.1. Địa điểm 34 2.1.2. Thời gian 34 2.2. Vật liệu 34 2.2.1. Nguyên liệu 34 2.2.1.1. Trái và cành thanh long 34 2.2.1.2. Chủng nấm mốc 35 2.2.2. Hĩa chất 35 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 35 2.2.3.1. Dụng cụ 35 2.2.3.2. Thiết bị 35 2.2.3.3. Mơi trường nuơi cấy 36 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. 37 2.3.1. Phương pháp vi sinh 37 2.3.1.1. Phương pháp thu thập, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh 37 2.3.1.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến tốc độ phát triển kích thước khuẩn lạc 42 2.3.1.3. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh với các chủng Trichoderma . 43 2.3.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu 46 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1. Kết quả nhận dạng, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long 48 iii
Đồ án tốt nghiệp 3.1.1. Kết quả phân lập 48 3.1.1.1. Chủng nấm N1 48 3.1.2.2. Chủng nấm N2 51 3.1.1.3. Chủng nấm N3 53 3.1.2. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch 55 3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến kích thƣớc tăng trƣởng của nấm Cochliobolus lunatus 60 3.2.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến kích thước tăng trưởng của nấm Cochliobolus lunatus 60 3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng kích thước của nấm Cochliobolus lunatus 62 3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tăng trưởng kích thước của nấm Cochliobolus lunatus 64 3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm Cochliobolus lunatus 67 3.3.1. Khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma virens với nấm Cochliobolus lunatus 67 3.3.2.Khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus 69 3.3.3. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma virens, Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus 70 Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73 4.1. Kết luận 73 4.2. Kiến nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật Ctv: Cộng tác viên GĐ: Giám đốc PDA: Potato D – Glucose Agar TL: Thanh long v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại các lồi xƣơng rồng (cĩ trái ăn đƣợc) khác nhau dựa trên đặc điểm sinh thái, màu vỏ và ruột thịt của trái 4 Bảng 1.2. Điều kiện phát triển thích hợp của cây thanh long 6 Bảng 1.3. Thành phần dịch hại quan trọng trên thanh long 8 Bảng 3.1. Thành phần nấm phân lập đƣợc trên cành thanh long bị bệnh đốm trắng 48 Bảng 3.2. Đƣờng kính trung bình (mm) của tản nấm N1 trƣớc Koch 50 Bảng 3.3. Đƣờng kính trung bình (mm) của tản nấm N2 53 Bảng 3.4. Đƣờng kính trung bình (mm) tản nấm N3 55 Bảng 3.5. Tỷ lệ bệnh của 3 loại nấm trên cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo 56 Bảng 3.6. Hình thái chủng nấm N1 trƣớc Koch và sau Koch 58 Bảng 3.7. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên mơi trƣờng PDA với các điều kiện chiếu sáng khác nhau khi nuơi cấy ở nhiệt độ phịng 61 Bảng 3.8. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên mơi trƣờng PDA ở các mức pH khác nhau 63 Bảng 3.9. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu nấm Cochliobolus lunatus trên mơi trƣờng PDA cĩ bổ sung nguồn nitơ khác nhau 64 Bảng 3.10. Đƣờng kính trung bình tản nấm và phần trăm ức chế của Trichoderma virens với nấm Cochliobolus lunatus 67 Bảng 3.11. Đƣờng kính trung bình tản nấm và phần trăm ức chế của Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus 69 Bảng 3.12. Phần trăm ức chế trung bình 3 lần nhắc của nấm Trichoderma virens, Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus 70 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình quả thanh long 4 Hình 1.2. Hình ký sinh của nấm Trichoderma 31 Hình 2.1. Cành thanh long bị bệnh đốm trắng 34 Hình 2.2. Dịch bào tử sau khi lắc 41 Hình 2.3. Cành thanh long trƣớc khi lây bệnh nhân tạo 41 Hình 2.4. Phƣơng pháp cấy đối kháng 46 Hình 3.1. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N1 49 Hình 3.2. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N1 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b), 7NSC (c) 50 Hình 3.3. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N2 52 Hình 3.4. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N2 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b), 7NSC (c) 53 Hình 3.5. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N3 54 Hình 3.6. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N3 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b), 7NSC (c) 55 Hình 3.7. Cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch 56 Hình 3.8. Kết quả giải trình tự gen 28S rRNA 59 Hình 3.9. Kết quả tra cứu BLAST SEARCH 60 Hình 3.10. Đƣờng kính trung bình của nấm Cochliobolus lunatus ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau qua 4 ngày sau cấy 62 Hình 3.11. Đƣờng kính trung bình tản nấm Cochliobolus lunatus trên mơi trƣờng PDA ở các mức pH khác nhau qua 4 ngày sau cấy 64 Hình 3.12. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu nấm Cochliobolus lunatus trên mơi trƣờng PDA với các nguồn nitơ khác nhau ở 4 ngày sau cấy 67 Hình 3.13. Mức độ đối kháng của nấm Trichoderma virens, Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus 72 vii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây thanh long (Hylocereus undatus) là cây trồng chủ lực mang lại hiệu quả kinh tế cao cho ba tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang (Huyện Chợ Gạo) và Long An (Huyện Châu Thành). Trong những năm gần đây do việc mở rộng diện tích đất canh tác để gia tăng sản xuất, thâm canh đồng thời ứng dụng nhiều kỹ thuật mới vào sản xuất (chong đèn xử lý nghịch vụ, trồng mới bằng trụ bê tơng, tăng lƣợng phân bĩn, chăm sĩc vƣờn, ) nên năng suất đƣợc nâng cao, phục vụ cho nhu cầu của ngƣời tiêu dùng trong nƣớc và quốc tế cũng nhƣ cải thiện đáng kể nguồn thu nhập của ngƣời sản xuất. Tuy nhiên, ngồi những mặt tích cực trên vẫn cịn tồn tại những mặt tiêu cực của vấn đề này là tình hình sâu bệnh trên cây thanh long ngày càng trở nên phức tạp hơn. Trong những năm qua nhiều đối tƣợng dịch hại đã cĩ xu hƣớng phát triển và gây hại ngày càng nặng hơn trên cây thanh long nhƣ bệnh thối trái do vi khuẩn, bệnh thán thƣ, đốm đồng tiền, hiện tƣợng vàng bẹ rám cành Đặc biệt, vài năm gần đây bệnh đốm trắng hay nhiều nơi bà con cịn gọi là bệnh lạ phát triển mạnh và gây thiệt hại nặng ở các vùng trồng thanh long trong cả nƣớc. Bệnh gây hại trên cành và trái làm giảm khả năng quang hợp, gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất cũng nhƣ chất lƣợng trái thanh long. Hiện nay, ngƣời ta vẫn chƣa biết đối tƣợng gây bệnh lạ trên thanh long cũng nhƣ chƣa tìm ra phƣơng thức lây lan và giải pháp quản lý hữu hiệu để ứng dụng vào trong sản xuất. Bệnh này đang là bức xúc lớn cho nơng dân mà cịn cho các nhà chức năng ở các địa phƣơng. Việc tìm ra tác nhân gây bệnh và biện pháp quản lý để giúp làm giảm thiệt hại cho sản xuất thanh long ở các vùng là nhu cầu rất cấp thiết hiện nay. Xuất phát từ lý do trên, sinh viên thực hiện đề tài “Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bƣớc đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến tác nhân gây bệnh”. 1
Đồ án tốt nghiệp 2. Mục đích nghiên cứu đề tài Xác định đƣợc tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long, các yếu tố ảnh hƣởng đến nấm gây bệnh làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng biện pháp phịng trừ loại bệnh mới này. 3. Nội dung nghiên cứu Xác định tác nhân gây bệnh lạ trên cây thanh long. Ảnh hƣởng của các yếu tố đến sự phát triển của nấm gây bệnh đốm trắng. Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma với tác nhân gây bệnh đốm trắng thanh long trong in vitro. 2
Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây thanh long 1.1.1. Nguồn gốc (Nguyễn Văn Kế, 2000) Cây thanh long cĩ tên khoa học là Hylocereus undatus Haw thuộc họ xƣơng rồng Cactaceae, tên tiếng Anh là Pitahaya hay cịn gọi là dragon fruit. Thanh long cĩ xuất xứ từ những vùng rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Mehico, Trung và Nam Mỹ (bao gồm miền Nam Mehico, bờ Thái Bình Dƣơng của các nƣớc: Guatemala, Costa Rica, El Salvador, Venezuela, Colombia, Ecuador, Nicaragua, Panama, Brazil và Uruguay). Cây thanh long là cây cĩ khả năng chịu nhiệt nên đƣợc trồng ở vùng nĩng nhƣ vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia. Thanh long đƣợc ngƣời Pháp đem vào trồng ở Việt Nam từ thời Pháp thuộc nhƣng mới đƣợc sản xuất ở quy mơ lớn từ thập niên 1980. Hiện nay, Việt Nam là nƣớc duy nhất ở Đơng Nam Á trồng thanh long tƣơng đối tập trung trên quy mơ thƣơng mại. 1.1.2. Phân loại (Bùi Vũ Thùy Dương, 2013) Việc phân loại các lồi cây xƣơng rồng (cĩ trái ăn đƣợc) dựa trên đặc điểm sinh thái, màu vỏ và màu ruột thịt của trái. Các lồi cây xƣơng rồng cĩ trái ăn đƣợc, đƣợc chia làm 2 nhĩm (dựa trên đặc điểm hình thái): vine cacti (cĩ thân bị trên trụ đỡ) và columnar cacti (cĩ thân cột). Nhĩm vine cacti thuộc về hai chi khác nhau là Hylocereus và Selenicereus. Nhĩm columnar cacti thuộc về ba chi Cereus, Pachycereus và Stenocereus. Ở Việt Nam, dựa theo đặc điểm của trái thanh long đƣợc chia thành ba loại phổ biến: - Thanh long ruột trắng với vỏ hồng (hoặc đỏ): cĩ tên khoa học là Hylocereus undatus thuộc chi Hylocereus. 3
Đồ án tốt nghiệp - Thanh long ruột đỏ với vỏ hồng (hoặc đỏ): cĩ tên khoa học là Hylocereus polyrhizus thuộc chi Hylocereus. - Thanh long ruột trắng với vỏ vàng: cĩ tên khoa học là Hylocereus megalanthus thuộc chi Hylocereus nhƣng trong một nghiên cứu gần đây lồi này cĩ nguồn gốc lai giữa hai chi là Hylocereus Selenicereus. a b c Hình 1.1. Hình quả thanh long (a. Quả thanh long ruột trắng, vỏ đỏ Hylocereus undatus, b. Qủa thanh long ruột đỏ, vỏ đỏ Hylocereus undatus, c. Qủa thanh long ruột trắng, vỏ vàng Hylocereus megalanthus (Trần Thị Hồi Vi, 2011) Bảng 1.1. Phân loại các lồi xƣơng rồng (cĩ trái ăn đƣợc) khác nhau dựa trên đặc điểm sinh thái, màu vỏ và ruột thịt của trái Màu sắc của Lồi Vỏ quả Ruột thịt quả Vine cacti Hylocereus udatus Đỏ Trắng Hylocereus udatus Đỏ Đỏ Hylocereus triangularis Vàng Trắng Hylocereus costaricensis Đỏ Đỏ Hylocereus polyrhizus Đỏ Đỏ (syn H. monacanthus) Hylocereus ocamponic Vàng Đỏ Selenicereus megalanthus Vàng Trắng 4
Đồ án tốt nghiệp (syn H. megalanthus) Columnar cacti Cereus triangular Vàng Trắng Acanthocereus pitajaya Vàng Trắng Cereus ocamponic Đỏ Đỏ (Nguồn: Crane và Balerdi, 2004; Mizrahi và Nerd, 1999) 1.1.3. Đặc điểm phân bố (Nguyễn Văn Kế, 2000) Thanh long là lồi thực vật bản địa tại Mehico và các nƣớc ở khu vực Trung và Nam Mỹ, từ đây thanh long đƣợc du nhập sang các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới ở châu Mỹ, châu Á, châu Đại Dƣơng và vùng Trung Đơng. Thanh long cũng đƣợc trồng ở các nƣớc trong khu vực Đơng Nam Á nhƣ Việt Nam, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Indonesia; ngồi ra chúng cũng hiện diện ở khu vực miền Nam Trung Quốc, Đài Loan và một số khu vực khác. Hiện nay, thanh long đang đƣợc trồng ở ít nhất 22 nƣớc nhiệt đới nhƣ: Australia, Cambodia, China, Colombia, Ecuador, Guatemala, Indonesia, Israel, Philippines, Tây Ban Nha, Sri Lanka, Đài Loan, Thái Lan, miền Nam nƣớc Mỹ và Việt Nam. Ở Việt Nam, thanh long đƣợc trồng đầu tiên ở Nha Trang và Phan Thiết từ thời Pháp thuộc. Sau khi thanh long trở thành hàng hĩa thƣơng mại và xuất khẩu ra nhiều nƣớc trên thế giới, phong trào trồng thanh long phát triển mạnh ở Phan Rang, Phan Thiết, Bình Thuận, Buơn Ma Thuộc và các tỉnh ở đồng bằng sơng Cửu Long nhƣ: Tiền Giang, Long An . Trong những vùng trồng thanh long ở Việt Nam, Bình Thuận cĩ diện tích trồng thanh long thƣơng mại ƣớc tính khoảng 1000 ha trong khi cả nƣớc chiếm khoảng 2000 ha. 1.1.4. Đặc điểm chung của cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000) Thanh long là cây cĩ nguồn gốc nhiệt đới cĩ khả năng chịu hạn nên thƣờng đƣợc trồng ở những vùng nĩng, chúng thích nghi đƣợc với những nơi cĩ cƣờng độ ánh sáng mạnh. Thanh long mọc đƣợc trên nhiều loại đất khác nhau nhƣ đất xám bạc màu 5
Đồ án tốt nghiệp (Bình Thuận), đất phèn (Thành phố Hồ Chí Minh), đất đỏ latosol (Long Khánh) , đồng thời cây thanh long cĩ khả năng thích nghi với các độ chua (pH) khác nhau của đất (thanh long thích nghi tốt với đất hơi acid). Khơng giống nhƣ các lồi xƣơng rồng khác, thanh long tuy cĩ khả năng chịu hạn nhƣng cũng cần một lƣợng nƣớc nhất định cho sự phát triển và tạo quả. Lƣợng mƣa hằng năm từ 500 – 1500 mm thích hợp nhất cho sự phát triển của cây thanh long. Bảng 1.2. Điều kiện phát triển thích hợp của cây thanh long Yếu tố khí hậu Điều kiện tối ƣu Độ cao (m) Lên tới 1700 m Nhiệt độ (0C) 20 – 30 Lƣợng mƣa (mm) 500 – 2000 (với thời tiết nĩng ẩm nhiệt đới cĩ hai mùa mƣa nắng luân phiên) Đất Cĩ khả năng thốt nƣớc tốt pH 5,5 – 6,5 (Nguồn: H. P. M. Gunasena và ctv, 2004) 1.2. Thành phần bệnh hại trong sản xuất thanh long 1.2.1. Tình hình dịch hại trên thanh long (Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hịa, 2014) Thanh long là một loại cây ở vùng nhiệt đới nên chúng dễ dàng bị nhiễm bệnh hoặc dịch hại. Tuy nhiên, so với các loại cây ăn trái khác, cây thanh long cĩ ít đối tƣợng dịch hại nghiêm trọng hơn (Bảng 1.3), ngoại trừ gần đây đã xuất hiện bệnh đốm trắng gây hại nặng nề và diễn tiến bệnh cĩ xu hƣớng ngày càng phức tạp đối với tất cả các vùng trồng thanh long trọng điểm ở phía Nam. Theo số liệu tổng hợp ghi nhận từ Chi cục Bảo vệ thực vật các tỉnh Tiền Giang, Long An và Bình Thuận, trong năm 2013 cĩ khoảng 6000 ha thanh long nhiễm bệnh (chiếm 20 – 25% tổng diện tích), bệnh tấn cơng mạnh vào mùa mƣa và gây thiệt hại nặng nề 20 – 50% năng suất. Các giải pháp kỹ thuật tạm thời đƣợc các địa phƣơng khuyến cáo áp dụng vẫn chƣa đạt đƣợc hiệu quả 6
Đồ án tốt nghiệp nhƣ mong muốn và ngƣời trồng thanh long đã sử dụng nhiều biện pháp khác nhau mà chủ yếu là thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) nhƣng tỷ lệ thành cơng cịn thấp, ngƣợc lại tiềm ẩn nguy cơ mất an tồn do ơ nhiễm thuốc BVTV là rất cao. Trong năm 2011, Bộ mơn Bảo vệ thực vật - Viện Cây ăn quả miền Nam đã giám định một số mẫu bệnh đốm trắng trên cành thanh long do Chi cục Bảo vệ thực vật Bình Thuận gửi đến. Qua kết quả phân lập và giám định đã xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long là do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Kết quả cũng tƣơng tự đối với những mẫu bệnh trên cành và trái thanh long ở Long An, Tiền Giang. Trƣớc đây, nấm Neoscytalidium dimidiatum cĩ nhiều tên gọi khác nhau nhƣ: Fusicoccum dimidiatum, Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea Theo ghi nhận của Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hịa (2014) bệnh đốm trắng chủ yếu xuất hiện và tấn cơng mạnh vào mùa mƣa, nhiệt độ thích hợp cho nấm bệnh phát triển từ 20 - 300C, ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn cơng và lây lan. Bên cạnh đĩ, theo ghi nhận của Viện Cây ăn quả miền Nam cũng cho thấy một số đối tƣợng dịch hại mới khác nhƣ: hiện tƣợng đỏ đầu trái (chín ngƣợc), sâu đục cành hoặc thân, ốc sên trắng cũng bắt đầu gây hại rải rác ở các địa phƣơng trồng thanh long trọng điểm nêu trên. Cùng với sự hội nhập ngày càng sâu rộng, các yêu cầu về mặt chất lƣợng sản phẩm của các quốc gia nhập khẩu càng trở nên khắc khe và cũng là rào cản kỹ thuật đối với trái thanh long Việt Nam, đặc biệt là vấn đề tồn dƣ dƣ lƣợng thuốc BVTV trở nên nĩng bỏng hơn bao giờ hết. 7
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3. Thành phần dịch hại quan trọng trên thanh long Mức Tác nhân gây Bộ phận bị Thời điểm độ TT Dịch hại bệnh hại gây hại phổ biến I. Bệnh hại 1 Bệnh đốm trắng Neoscytalidium Cành, trái Quanh năm +++ (đốm nâu, tắc kè ) dimidiatum non và thu hoạch 2 Bệnh thối trái (ruột Erwinia Bơng, trái Quanh năm +++ đỏ), thối đầu trái chrysanthemi non (ruột trắng) 3 Thán thƣ Colletotrichum Trái, hoa Mùa mƣa +++ gloeosporioides Colletotrichum sp. 4 Rỉ sét (đốm đen) Bipolaris sp. Bơng Mùa mƣa +++ 5 Vàng bẹ rám cành Fusarium equiseti, Cành Mùa nắng +++ Bipolaris crutacea 6 Nấm bồ hĩng Capnodium sp. Cành, hoa, Quanh năm +++ trái 7 Thối trái Fusarium sp. Trái sắp Mùa mƣa ++ chín 8 Thối bẹ Alternaria sp., Cành Cuối mùa ++ Fusarium sp., nắng, đầu bacteria mùa mƣa 9 Đốm nâu Glocosporium Cành Quanh năm + 8
Đồ án tốt nghiệp avages II. Cơn trùng 1 Bọ trĩ Thrip sp. Bơng, trái Mùa nắng + non 2 Ngâu Protaetia sp. và Cành, bơng Quanh năm ++ Hypomeces squamesus 3 Kiến Cành, bơng, trái non Kiến lửa Solenopsis Quanh năm + geminate Kiến riện Cardiocondyla Cành, Quanh năm +++ wroughtoni bơng, trái non Kiến xám Paratrechina Cành, Quanh năm +++ longicornis bơng, trái non 4 Ruồi đục quả Bactrocera Trái chín Mùa mƣa + dorsalis 5 Rệp sáp Pseudococcus sp. Cành, trái Mùa nắng + 6 Ốc sên Achtina sp. Cành, trái Mùa mƣa + thu hoạch 7 Rầy mềm Toxoptera sp. Cành, trái Quanh năm + non (Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hịa, 2014) Ghi chú: + mức độ bệnh thấp, ++ mức độ bệnh trung bình, +++ mức độ bệnh khá phổ biến. 9
Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Các bệnh thường gặp trên cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000) 1.2.2.1. Bệnh thối đầu cành Triệu chứng bệnh: Ngọn cành thanh long chuyển màu vàng, rồi mềm, sau đĩ thối. Cây tăng trƣởng chậm, số cành giảm hẳn. Bệnh hay xảy ra vào cuối mùa nắng. Bệnh xảy ra khơng những trên đất phèn (đất thấp) mà cịn cả trên đất cao nữa. Nguyên nhân chính là do nấm Alternaria sp. gây ra. Biện pháp phịng trị bằng cách phun Rovral 2 lần liên tiếp cách nhau 1 tuần. 1.2.2.2. Bệnh đốm nâu trên cành Triệu chứng bệnh là trên thân cành thanh long cĩ những đốm trịn nhƣ mắt cua màu nâu. Vết bệnh nằm rải rác hoặc tập trung, thƣờng kéo dài thành từng vệt dọc theo thân cành. Cĩ nhiều vết acervulus trịn đen nằm rải rác. Tác nhân là nấm Gloeosporium agavaes. 1.2.2.3. Bệnh rám cành Triệu chứng: Bệnh rám cành làm cho thân, cành thanh long cĩ một lớp màng mỏng màu xám tro, nhám. Tác nhân gây bệnh rám cành là nấm Macssonina agaves Syd và Sphaceloma sp. Họ Nectrioidaceae, Bộ Melanconiales, Lớp Deuteromycetes. Biện pháp phịng trị chung cho các bệnh thanh long là vệ sinh đồng ruộng, chống úng và chống hạn cho cây. Khi bệnh phát triển nhiều thì dùng thuốc Rovral, hoặc Anvil 5sc (30 – 100 g/ha) phối hợp với Topas (10 – 50 g/ha). Ngồi sâu bệnh kể trên thanh long cịn bị dơi, chim, chuột phá hoại quả. 1.2.3. Cơn trùng gây hại trên cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000) 1.2.3.1. Kiến Cắn, đục khoét làm hƣ hỏng giống và các cành thanh long non, cắn mất tai lá trên trái, gây tổn thƣơng vỏ trái, đây là loại cơn trùng dễ phịng trừ. Để phịng trị dùng Basudin (Diazinon) 10H, Padan 4G, 10G trộn đều với cát 2/1000 rải đều quanh gốc hoặc những nơi chúng làm tổ. Khi phun vào các ổ kiến thì dùng Bi 58, Diazinon 10
Đồ án tốt nghiệp 1.2.3.2. Bọ xít Hại thanh long từ khi cĩ nụ hoa đến khi trái hình thành, chúng chích hút nhựa, để lại những vết chích rất nhỏ nhƣng đến khi quả chín nơi các vết chích sẽ xuất hiện một chấm đen, mất giá trị xuất khẩu. Việc phịng trừ dùng Trebon, Applaud, Bassa nồng độ 0,2%. Phun lên khu vƣờn cĩ bọ xít xuất hiện. 1.2.3.3. Ruồi vàng hay ruồi trái cây (Dacus dorsalis) Đây là đối tƣợng nguy hiểm đang đƣợc báo động hiện nay. Chúng trƣởng thành chích và đẻ trứng vào quả gây thối hĩa phần thịt quả và phần nhựa chảy ra ngồi vỏ làm quả thanh long bị hƣ, khơng xuất vƣờn đƣợc. Tuy chúng là đối tƣợng mới xuất hiện trên thanh long nhƣng ruồi trái cây đã gây hại rất nhiều loại quả ở nƣớc ta vì thế cần chú ý phịng trừ. Cần vệ sinh đồng ruộng nhƣ thu dọn và tiêu hủy các quả rụng, rải thuốc diệt nhộng dƣới đất, đặt bả cĩ chứa chất dẫn dụ trích từ cây é tía trộn với thuốc trừ sâu để diệt ruồi. Hiện nay, các thuốc nhƣ Ruvacon 90L và Vizubon D đã cĩ chứa sẵn chất dẫn dụ là Metyl eugenol 75% nên tiện cho nhà vƣờn hơn. 1.2.4. Các hiện tượng sinh lý thường gặp trên cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000) 1.2.4.1. Hiện tượng rụng nụ Xuất hiện khi số nụ trên cành nhiều. Sau khi nụ xuất hiện 5 – 7 ngày thì nụ khơng phát triển nữa, vàng rồi rụng. Tỷ lệ rụng từ 10% đến 20%. Cây thanh long tự quân bình sinh lý để nuơi quả cịn lại trên cây. Để hạn chế sự rụng quả sinh lý cần bĩn phân tƣới nƣớc đầy đủ. 1.2.4.2. Hiện tượng nứt vỏ trái Do thời tiết, trời hạn ở giai đoạn vỏ quả phát triển, sau đĩ mƣa nhiều hoặc tƣới nhiều nƣớc vào lúc ruột đang phát triển nên quả nứt. Mặt khác, do nhà vƣờn treo quả lâu đợi dịp cĩ giá mới bán. Để hạn chế nên kiểm sốt độ ẩm đất, khơng để vƣờn khơ hạn trong thời kỳ cây nuơi quả. 1.3. Một số bệnh hại chính 11
Đồ án tốt nghiệp 1.3.1. Bệnh thán thư 1.3.1.1. Đặc điểm gây hại a. Sự nguy hại của bệnh thán thƣ (Nguyễn Văn Hịa, 2013; Vũ Triệu Mân, 2007) Bệnh thán thƣ do nấm Collectotrichum gloeospoides gây ra trên thanh long là bệnh gây hại quan trọng nhất làm tổn thất đến năng suất và phẩm chất của trái, đặc biệt vào mùa mƣa bão, nấm tấn cơng lên thân, cành, nụ hoa và trên trái ở các giai đoạn khác nhau, nhiễm nặng nhất là giai đoạn sau thu hoạch. b. Triệu chứng bệnh (Nguyễn Văn Hịa, 2013; Vũ Triệu Mân, 2007) Bệnh gây hại chủ yếu trên đọt, hoa và trái, đơi khi trên cành cũng bị tấn cơng. Trên cành: Vết bệnh bắt đầu từ mép cành lan dần vào bên trong. Vết bệnh dạng trịn hay bất định. Khi nấm tấn cơng vào cành làm cho cành thối mềm cĩ màu vàng sáng, sau một thời gian ngắn chuyển sang màu nâu, thối từ phần ngọn vào trong. Trên hoa: Nấm tạo thành những đốm đen nhỏ làm hoa bị thâm đen và rụng. Bệnh tấn cơng cả phần nụ hoa, làm cho nụ hoa biến thành màu nâu, sau đĩ rụng rất nhanh. Trên trái: Ở điều kiện ngồi đồng bệnh ít khi tấn cơng trên trái, tuy nhiên ở giai đoạn trái lớn sắp thu hoạch hoặc đã thu hoạch và tồn trữ. Vết bệnh là những đốm trịn hoặc gần trịn, cĩ tâm màu nâu đỏ, lõm xuống, xung quanh cĩ những vịng đồng tâm nâu sậm, sau đĩ phát triển nhanh thành những mãng thối lõm vào vỏ, gây thất thốt lớn trong quá trình vận chuyển, tồn trữ. c. Đặc điểm phát sinh và phát triển của bệnh (Nguyễn Văn Hịa, 2013; Vũ Triệu Mân, 2007) Bệnh thán thƣ phát triển mạnh ở điều kiện ẩm ƣớt và nhiệt độ khơng khí cao. Nấm cĩ thể sinh trƣởng ở nhiệt độ 40C, nhƣng tối thích là 25 – 290C. Bề mặt mơ bệnh ẩm ƣớt kéo dài cĩ ảnh hƣởng đến sự xâm nhiễm và sinh trƣởng của nấm Collectotrichum gloeosporioides. 12
Đồ án tốt nghiệp Trong điều kiện ngồi đồng: Bệnh bình thƣờng tồn tại trong xác bã thực vật cĩ trong vƣờn hoặc trên cành, trái bệnh. Bệnh phát triển mạnh và bộc phát ở điều kiện ẩm độ cao nhất là vào mùa mƣa. Bệnh phát triển và gây hại nặng ở giai đoạn ra hoa, trái sắp thu hoạch và sau thu hoạch. 1.3.1.2. Phổ ký chủ (Stanley Freeman, 2008; Steven John Mackenzie, 2005) Collectotrichum spp. là tác nhân gây bệnh trên phạm vi rộng, nhiều lồi cĩ thể lây nhiễm một vật chủ duy nhất và lồi duy nhất cĩ thể lây nhiễm vật chủ khác nhau (Freeman và ctv, 1998). Thí dụ một vật chủ cĩ thể bị nhiễm bệnh bởi nhiều lồi Collectotrichum kể cả dâu tây bị nhiễm bệnh bởi 3 lồi Collectotrichum, cụ thể là C. acutatum, C. fragariae, và C. gloeosporioides ; quả bơ và xồi nhiễm bệnh do cả hai loại nấm C. acutatum và C. gloeosporioides ; hạnh nhân và các loại trái cây chín vào một thời kỳ nhất định bị nhiễm bệnh do nấm C. acutatum hoặc C. gloeosporioides gây ra; cam quýt bị bệnh do ảnh hƣởng của các lồi Colletotrichum khác nhau, đĩ là rụng quả và bệnh loét do C. acutatum gây ra, cây chết mầm non do C. gloeosporioides (Freeman và ctv, 1998). Hơn nữa nấm Colletotrichum cịn là ký chủ trên cây cà phê, cây bầu, cây hồ tiêu, cà chua và những cây khác (Bailey và Jeger, 1992). Ở vùng nhiệt đới, nấm Collectotrichum gloeosporioides xuất hiện trên hầu hết các loại cây trồng, giai đoạn tồn tại chủ yếu của nấm là sống hoại sinh trên mơ chết hoặc những tàn dƣ của cây trồng. Theo Mills và ctv (1992), những mẫu nấm bệnh Collectotrichum gloeosprioides thƣờng gây hại trên cây ký chủ nhƣ bơ, đu đủ, xồi, chuối, phong lan và cao su. Ở Australia ngƣời ta phát hiện thấy trên cây cỏ Stylosanthes cĩ hai chủng nấm Collectotrichum gloeosprioides khác nhau. Qua quá trình phân lập mẫu bệnh và phân tích sinh học phân tử đã phát hiện thấy cĩ sự biến động xảy ra trong nhân mặc dù khơng biết do yếu tố nào gây ra. Sự biến động này cũng tìm thấy ở trên cây dâu trồng ở vùng ơn đới (Maner và ctv, 1992). 13
Đồ án tốt nghiệp Nấm Colletotrichum gloeosporioides cũng đƣợc phân lập từ 23 loại cây ăn quả ở Sri Lanka. Tác nhân gây bệnh này đã khơng đƣợc ghi nhận trƣớc đây trên sầu riêng, măng cụt, chơm chơm và Jambu Pini và 11 cây ăn quả ít quan trọng về kinh tế khác ở Sri Lanka. Các triệu chứng của nhiễm C. gloeosporioides trên các giống cây ăn quả, đặc biệt là xồi và chơm chơm cĩ thể gây ra lên đến 40%. 1.3.1.3. Phương pháp phịng trừ Để phịng trừ bệnh thán thƣ, cĩ một số biện pháp nhƣ sau: a. Biện pháp canh tác (Nguyễn Văn Hịa, 2013) Đào mƣơng lên lip (luống): Tùy theo độ cao của đất mà thiết kế líp đơi hay líp đơn, sao cho đảm bảo mực nƣớc ở thời điểm cao nhất là 20 – 30 ci vì rễ rất dễ bị úng và thối. Nên đắp mơ cao để cây phát triển tốt, kích thƣớc mơ 80 × 30 cm, khoảng cách trồng 3 × 3 m hoặc 3 × 3,5 m (mật độ khoảng 100 trụ/1000 m2). Trồng cây chắn giĩ: Nên trồng cây chắn giĩ đối với những vùng chuyên canh để hạn chế mầm bệnh lan vào. Trụ để thanh long phát triển: Tốt nhất là sử dụng trụ xi măng vì trụ bằng cây sống dễ mang mầm bệnh, sâu, khơng bền vững. Trụ xi măng cao 2 – 2,5 m, ngang 12 – 15 cm, phía trên trụ nên cĩ que sắt dài 30 – 40 cm để làm giá đỡ cho thanh long. Bĩn phân cân đối, hợp lý: Nên bĩn phân cân đối và hợp lý theo quy trình kỹ thuật canh tác thanh long, liều lƣợng và phân tùy thuộc vào loại đất và điều kiện sinh trƣởng của cây, khả năng cho trái của vụ trƣớc. Cần bĩn nhiều phân hữu cơ đã đƣợc ủ hoai mục, nên cung cấp thêm vơi cho cây trƣớc và sau mùa mƣa. Tƣới nƣớc: Nên thiết kế hệ thống tới để quản lý tốt nguồn nƣớc, tránh mầm bệnh lây lan, tránh tƣới phun lên tán cây khi trong vƣờn cĩ nhiều mầm bệnh thán thƣ. Tủ gốc giữ ẩm: Tủ gốc giữ ẩm cho cây vào mùa nắng bằng rơm, rạ, cỏ khơ, tủ cách gốc 5 – 10 cm giúp giảm lƣợng cỏ dại, cung cấp dinh dƣỡng cho cây. b. Biện pháp sử dụng giống chống chịu bệnh (Vũ Triệu Mân, 2007) 14
Đồ án tốt nghiệp Tạo ra những giống kháng bệnh đã và đang đƣợc các cơ sở nghiên cứu nơng nghiệp trên thế giới quan tâm, tuy nhiên cơng việc này địi hỏi phải mất nhiều thời gian. Do vậy, hiện nay đối với cây trồng hằng năm mới chỉ tạo một số giống cĩ khả năng chống bệnh do nấm Collectotrichum gloeosporioides gây ra, đặc biệt trên cây trồng lâu năm, số lƣợng những giống kháng với loại nấm này đem lại hiệu quả kinh tế cao cịn chƣa nhiều. c. Biện pháp cơ học (Nguyễn Văn Hịa, 2013) Khi cây cịn nhỏ: Tỉa cành và tạo tán giúp cho cây cĩ tán phân bố đều theo 4 hƣớng, giúp cây thơng thống, quang hợp tốt, loại bỏ đƣợc cành sâu bệnh, cành giáp mặt đất. Sau thu hoạch: Nên cắt bỏ những cành sâu bệnh, cành tiếp đất. Thu gom tất cả tàn dƣ sau khi cắt tỉa hoặc sau thu hoạch để giảm mầm bệnh trong vƣờn. d. Biện pháp sinh học (Nguyễn Văn Hịa, 2013) Đây là một trong những biện pháp phịng trừ tổng hợp dịch hại trên cây trồng. Tùy theo từng loại bệnh trên những cây trồng khác nhau mà hiệu quả của biện pháp này đem lại khác nhau. Cịn rất ít những kết quả nghiên cứu khả năng phịng trừ nấm Collectotrichum gloeosporioides trên đồng ruộng bằng biện pháp phịng trừ sinh học. Để phịng trừ nấm Collectotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thƣ, trong vƣờn nên bĩn nhiều phân hữu cơ và cung cấp nấm đối kháng Trichoderma vừa giúp phân hủy chất hữu cơ nhanh, vừa diệt mầm bệnh hiện diện trên xác bã thực vật cĩ trên và trong đất. Phun thuốc kháng sinh nhƣ Salicylic acid 15 ngày trƣớc khi thu hoạch. Sử dụng biện pháp bao trái sau khi phun thuốc lần cuối (14 – 15 ngày trƣớc khi thu hoạch). e. Biện pháp hĩa học (Nguyễn Văn Hịa, 2013) 15
Đồ án tốt nghiệp Trên thực tế, đối với các bệnh do nấm gây ra nĩi chung và bệnh do nấm Collectotrichum gây hại nĩi riêng thì biện pháp phịng trừ hĩa học vẫn đĩng vai trị cần thiết. Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1998), trong 6 nhĩm thuốc trừ bệnh đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nơng nghiệp, nhĩm thuốc những hợp chất dị vịng cĩ tác dụng hữu hiệu trừ bệnh do nấm Collectotrichum gây ra. Thuốc chứa hợp chất gốc đồng, Benzamidazole, Dithiocarbamates, Triazole và các thuốc trừ nấm nhƣ: Chlorothalonil, Imazalil, Prochloraz cĩ hiệu quả trừ nấm Collectotrichum gloeosporioides do những nhĩm thuốc này cĩ khả năng xâm nhập vào mơ cây ngăn cản và phá hủy sự xâm nhiễm tiềm ẩn của nấm. Tuy nhiên việc dùng Benzamidazole liên tục cĩ thể làm tăng khả năng kháng thuốc của nấm. Nên phun thuốc trừ nấm ngồi đồng sau khi thu hoạch, sau khi cắt tỉa để giảm áp lực mầm bệnh, phun lần hai khi trái cĩ nụ hoa. Phun thuốc gốc Propineb khi vừa đậu trái và Difenoconazole 7 ngày tiếp theo. f. Xử lý sau thu hoạch (Nguyễn Văn Hịa, 2013) Sau khi thu hoạch tiến hành xử lý nƣớc nĩng trái thanh long, ở nhiệt độ 530C trong 10 phút khơng làm tổn thƣơng trái và giảm thiểu đáng kể mầm bệnh sau thu hoạch. Khi thu hoạch thấy cĩ vết sâu bệnh xuất hiện trên trái phải loại ngay, khơng nên để tồn trữ chung với những trái khác để tránh sự lây lan. Đây là loại nấm đa ký chủ và gây hại quan trọng, khĩ quản lý, để phịng trị hiệu quả nên thực hiện phịng trị đồng loạt trên diện rộng thì sẽ mang lại hiệu quả cao. 1.3.2. Bệnh đốm trắng Bệnh đốm trắng trên thanh long hay cịn gọi là bệnh lạ, đốm nâu, tắc kè, bệnh ma là những tên gọi khác nhau mà bà con nơng dân trồng thanh long ở tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang và Long An đặt tên cho một loại dịch hại mới phát sinh, gây thiệt hại nghiêm trọng và cĩ xu hƣớng ngày càng lan rộng. 16
Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.1. Thời gian xuất hiện (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2013) Theo ghi nhận của Viện Nghiên cứu Cây ăn quả miền Nam thì trên thực tế bệnh này đã xuất hiện rải rác đầu tiên vào năm 2008 tại Bình Thuận và Tiền Giang và đến năm 2011 trở lại đây thì bệnh tấn cơng mạnh và lây lan nhanh hơn tại những địa phƣơng này. Theo TS Nguyễn Nhƣ Cƣờng, GĐ Trung tâm Nghiên cứu BVTV Nam bộ, tác nhân gây bệnh là một lồi nấm. Năm 2009, bệnh lần đầu đƣợc ghi nhận ở Đài Loan và Bình Thuận của Việt Nam, bệnh này đƣợc đặt với nhiều tên gọi khác nhau nhƣ “đốm nâu”, “mắt cua”, “đốm trắng”, “tắc kè”. Mức độ bệnh xuất ở các vƣờn dao động từ 20 – 50%, cĩ những vƣờn mất trắng năng suất do quả bị nhiễm bệnh nặng khơng thể thu hoạch đƣợc, thiệt hại rất lớn cho nhà vƣờn trồng thanh long. Bên cạnh đĩ, theo ơng Trần Minh Tiến, Chi Cục trƣởng Chi cục BVTV tỉnh Bình thuận cho biết, bệnh đốm trắng cành và quả thanh long đã xuất hiện từ năm 2009 – 2010 nhƣng chỉ xuất hiện rải rác, cục bộ tại một số vƣờn thanh long ở Hàm Thuận Bắc. Sau khi kiểm tra thực tế tại Cẩm Hang (xã Hàm Hiệp) và một số vƣờn ở Hàm Thuận Nam, Chi cục BVTV Bình Thuận đƣa ra nhận định, hiện tƣợng bệnh đốm trắng trên thanh long chỉ xảy ra vào đầu mùa mƣa. Đồng thời xuất hiện ở những vƣờn cỏ nhiều, chăm sĩc kém, độ pH trong gốc thấp, bộ rễ kém phát triển. Đầu tiên, những đốm chấm trắng xuất hiện trên cành non, trái gần chín và trái chín. Trên cành non sau khi xuất hiện vết chấm thì 7 – 10 ngày lớp biểu bì sẽ chết, nấm và vi khuẩn xâm nhập vào gây thối, cháy cành. Nhƣng đến nay, chỉ sau một thời gian ngắn bệnh đã phát triển mạnh ở hầu hết các vùng trồng thanh long trong tỉnh. 1.3.2.2. Tác hại (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2013) Bệnh thƣờng gây hại trên bẹ non, nụ bơng, trái non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Lúc đầu triệu chứng trên bẹ hoặc trái là những đốm trịn nhỏ màu trắng, vết 17
Đồ án tốt nghiệp bệnh trũng thấp so với bề mặt bẹ, về sau vết bệnh cĩ màu vàng cam và phát triển nhơ lên những vết ghẻ cĩ màu nâu và đơi khi gây thối nhũn nếu bị bệnh tấn cơng nặng. Bệnh cịn tấn cơng trên trái chín chuẩn bị thu hoạch. Những đốm này xuất hiện rõ hơn và nhiều hơn, buộc lịng những trái này bị dạt ra hoặc bán với giá rẻ hơn, làm giảm thu nhập của nhà vƣờn. Theo thống kê đến cuối năm 2013, diện tích thanh long bị nhiễm bệnh đốm trắng nhẹ ở tỉnh Bình Thuận là 800 ha, nặng 400 ha, trong tổng số 21 nghìn ha; Tiền Giang với gần 3 nghìn ha thanh long thì cĩ đến 2420 ha nhiễm bệnh đốm trắng nhẹ, diện tích nhiễm nặng 80 ha; Long An, nhiễm đốm trắng nhẹ 766 ha, nặng 41 ha, trong tổng số gần 2700 ha và đang cĩ xu hƣớng lây lan nhanh. Thanh long Việt Nam đã xuất khẩu tới 40 quốc gia và vùng lãnh thổ. Năm 2013, kim ngạch xuất khẩu (chính ngạch) trái cây tƣơi đạt 307 triệu USD thì thanh long chiếm tới 61,4%. Ngồi một số thị trƣờng truyền thống nhƣ Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Hà Lan thanh long đang từng bƣớc xâm nhập vào một số thị trƣờng mới nhƣ Ấn Độ, New Zealand, Úc, Chi Lê tạo đƣợc sự đa dạng hĩa trong cơ cấu thị trƣờng xuất khẩu thanh long của Việt Nam. Tuy nhiên, với tình hình bệnh đốm trắng trên thanh long đang cĩ xu hƣớng lây lan nhanh, làm giảm năng suất và chất lƣợng quả thanh long, khơng đảm bảo kim ngạch xuất khẩu cĩ nguy cơ mất một số thị trƣờng tiêu thụ lớn. 1.3.2.3. Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên thanh long Trƣớc thực trạng bệnh gây hại nặng trên cây thanh long, Viện Cây ăn quả miền Nam đã tiến hành nghiên cứu, khảo nghiệm bằng nhiều phƣơng pháp khoa học, chuyển giao kỹ thuật và triển khai tập huấn “Quy trình quản lý tổng hợp sâu bệnh hại quan trọng trên thanh long” cho gần 600 nơng dân trồng thanh long tập trung ở Bình Thuận và Tiền Giang. Mặt khác, Viện cịn cử 18 bác sĩ cây trồng từ Viện và sáu chuyên gia đến từ Malaysia đi thăm khám định kỳ tại một số xã cĩ trồng thanh long ở huyện Chợ Gạo, 18
Đồ án tốt nghiệp tỉnh Tiền Giang. Ngồi ra, Viện cũng đã đƣa ra quy trình “Quản lý bệnh đốm trắng trên thanh long tạm thời” trên thơng tin đại chúng để giúp nhà vƣờn trồng thanh long ứng dụng vào sản xuất, bƣớc đầu đã cĩ hiệu quả. Bên cạnh đĩ, một số đề tài nghiên cứu về bệnh trên cây thanh long đã cho một số hiệu quả nhƣ: kết quả phân lập, kiểm chứng và giám định tác nhân gây hiện tƣợng vàng bẹ thanh long đƣợc khẳng định là do 2 loại nấm Bipolaris crustacean và Fusarium equiseti gây hại (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2012). Nấm Bipolaris crustacean cĩ khả năng mọc trên mơi trƣờng PDA. Tản nấm ban dầu cĩ màu trắng sau chuyển sang màu xám đen hoặc nâu đen. Sợi nấm cĩ màu nâu, mịn dày, sợi nấm cĩ cấu trúc giống len. Bào tử nấm cĩ 2 đến 3 vách ngăn, cong hoặc uốn gấp, bào tử tách ra hoặc nằm theo nhĩm. Tuy nhiên, gần đây tác giả này lại cho rằng tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long là do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra trong nghiên cứu xác định tác nhân, đặc điểm hình thái và sinh học của nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014). Nấm Neoscytalidium dimidiatum phát triển khá nhanh trên mơi trƣờng PDA sau 3 ngày nuơi cấy, tản nấm cĩ đƣờng kính 90 mm. Tản nấm trịn, ban đầu cĩ màu trắng sau chuyển sang màu xám đen rất nhanh. Sợi nấm cĩ màu nâu đến nâu sậm, mịn, dày. Sợi nấm phân nhánh, cĩ màu nâu, cĩ vách ngăn và tự tách ra thành bào tử đốt. Bào tử cĩ nhiều hình dạng khác nhau: elip, trứng, que, trịn. Bào tử đốt hình thành rất nhanh chỉ sau 2 ngày nuơi cấy, cĩ màu nâu nhạt đến nâu sẫm, cĩ 1 vách ngăn. Bên cạnh đĩ, trong nghiên cứu của Phan Thị Thu Hiền và ctv (2014) cũng đã cho rằng nấm Neoscytalidium dimiditaum là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long. Đồng thời tác giả cịn đã đƣa ra mơi trƣờng PDA là mơi trƣờng thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của Neoscytalidium dimiditaum với khoảng nhiệt độ thích hợp là 30 – 350C. Điều kiện pH và ánh sáng khơng cĩ ảnh hƣởng lớn đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của Neoscytalidium dimiditaum. Khơng dừng lại ở đĩ, một số đề 19
Đồ án tốt nghiệp tài cịn nghiên cứu biện pháp để trừ bệnh đốm trắng đã cho một số kết quả nhƣ trong tổng số 22 loại thuốc khảo sát ở điều kiện in vitro chỉ cĩ 8 loại thuốc cĩ khả năng ức chế hồn tồn sự phát triển nấm Neoscytalidium dimiditaum là Cyat (Trifloxystrobin), Tilt supper (Propiconazole + Difenoconazole), Map supper (Difenoconazole + Propiconazole), Map Unique (Tebuconazole + Tricyclazole), Sagorain (Difenoconazole + Propiconazole), Viroval (Iprodione), Ridomyl gold (Metalaxyl-M + mancozeb) và Dithan (Mancozeb). Kết quả khảo sát hiệu quả của 20 loại thuốc đối với bệnh đốm trắng trên cành cho thấy Dithan M45 cĩ hiệu quả tốt nhất, kế đến là Riddomyl gold, Saiporra, Vicarben, Map Hero và Viroval. Tƣơng tự, Saipora (Carbendazim + Hexaconazole) cho hiệu quả tốt nhất, làm giảm chỉ số bệnh trên trái dƣới 10%, kế đến là Ridomil gold (Metalaxyl-M + Mancozeb), Dithan (Mancozeb) và Vicarben (Carbendazim) trong đề tài “Đánh giá hiệu quả của một số loại thuốc hĩa học đối với bệnh đốm trắng gây hại trên thanh long” (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014). 1.3.2.4. Một số biện pháp phịng trừ bệnh đốm trắng Bệnh đốm trắng cĩ thể xuất hiện ở nơi cĩ độ ẩm cao, nhiệt độ thấp tùy điều kiện thích hợp mà bệnh phát triển nhanh hay chậm và cũng tùy vào giai đoạn bệnh mà cĩ cách trừ bệnh thích hợp. Tuy nhiên, khi cây đã bị nhiễm bệnh, thƣờng bệnh lây lan rất nhanh. Do đĩ, khi phát hiện vƣờn thanh long cĩ dấu hiệu nhiễm nấm bệnh bà con nên áp dụng các biện pháp sau đây để khắc phục và tránh lây lan bệnh: Bƣớc 1: - Vệ sinh vƣờn, tạo thơng thống cho vƣờn: cắt tỉa cành bệnh, trái bệnh, thu gom tập trung lại một chỗ, đào hố, dùng vơi để xử lý. (Khơng vứt xuống mƣơng, rạch hoặc trong vƣờn vì sẽ tạo điều kiện cho bệnh lây lan nhanh khĩ trị). - Quản lý chặt nguồn nƣớc: đánh rảnh thốt nƣớc, khơng cho ứ đọng trên liếp vƣờn. Bƣớc 2: 20
Đồ án tốt nghiệp - Rãi vơi xung quanh gốc để khử mầm bệnh: 400 – 500 kg/ha (khơng rãi lên cây) - Sau đĩ, phun các loại thuốc trừ nấm phổ rộng trƣớc khi áp dụng biện pháp sinh học bên dƣới 5 – 7 ngày. Lƣu ý: Trong thời gian cây bị bệnh, hạn chế sử dụng phân hĩa học cĩ hàm lƣợng đạm cao và phân gà tƣơi. Bƣớc 3: Sau khi thực hiện bƣớc 2 đƣợc 7 ngày - Bĩn phân hữu cơ vi sinh TRICHOMIX-DT hoặc phân hữu cơ sinh học TRIMIX-N1 (50 kg/bao, liều bĩn: 1 – 2 kg/gốc), bĩn xung quanh gốc và nên ủ cỏ mục, rơm hoặc lấp đất ở gốc để giữ ẩm, bĩn 2 – 3 lần liên tục cách nhau 15 – 20 ngày. - Phun men vi sinh siêu đậm đặc TRICHOMIX-DT (liều phun 01 gĩi 500g/100 lít nƣớc/100 trụ) trên khắp tán cây, thân cây và gốc cây, phun liên tục 4 – 5 ngày/lần. Lƣu ý: Nếu vƣờn khơng bị nhiễm bệnh bà con chỉ áp dụng bƣớc 3. Ngồi ra cịn những biện pháp khác nhƣ ơng Trần Minh Tiến, Chi cục BVTV Bình Thuận đã đƣa ra một số giải pháp để khắc phục đối với một số vƣờn đang bị bệnh đốm trắng. - Cần vệ sinh sạch cỏ dại, thu gom trái, cành bị hƣ hỏng ra khỏi vƣờn - Phun vệ sinh vƣờn khoảng 2 lần, cách nhau 1 tuần/ lần bằng các loại thuốc BVTV nhƣ Agri-life, Actinovate - Bĩn phân chăm sĩc gốc thanh long bằng các loại phân Humix, lân phosphoprite để cây cĩ bộ rễ mới, khỏe. - Giai đoạn từ nụ nhỏ đến nở hoa, quả non, quả chín phải phịng trừ bằng các biện pháp tổng hợp nhƣ quy trình thanh long VietGAP. Lƣu ý: giảm bớt thuốc kích thích sinh trƣởng. - Bên cạnh đĩ, phun bổ sung thêm các loại phân bĩn lá. Đồng thời tập trung thâm canh, bĩn phân cân đối, khai thác vừa phải và khơng lạm dụng chất kích thích 21
Đồ án tốt nghiệp sinh trƣởng. Đây là những điều kiện cần thiết nhằm giúp cây thanh long đủ sức vƣợt qua các yếu tố biến đổi của thời tiết. Theo Trần Thanh Phong (2013) một biện pháp phịng trừ khác là: - Thốt nƣớc tốt cho vƣờn thanh long. - Thƣờng xuyên thăm vƣờn, kịp thời phát hiện các cành trái bị bệnh để cắt bỏ. Gom các cành trái bị bệnh để tiêu hủy. - Tuyệt đối khơng đƣợc vứt bỏ cành, trái bị bệnh xuống nƣớc vì sẽ làm bệnh lây lan nhanh. - Hạn chế tƣới nƣớc mƣơng lên tán thanh long, nhất là sau khi trời mƣa. - Khơng bĩn phân gà tƣơi hay bột xơ dừa cho vƣờn thanh long. - Sử dụng phân chuồng hoai và nấm đối kháng Trichoderma hoặc phân hữu cơ vi sinh. - Bĩn phân cân đối giữa đạm, lân, kali. Khơng bĩn thừa phân đạm. Tuy nhiên, các biện pháp trên khơng thể trừ một cách triệt để đƣợc bệnh đốm trắng, nhƣng nếu chúng ta chủ động thực hiện theo những phƣơng pháp trên sẽ giúp giảm thiểu tác hại và sự lây lan của bệnh đốm trắng. 1.4. Giới thiệu về nấm Cochliobolus lunatus 1.4.1. Phân loại (R. R. Nelson và Haasis, 1964) Nấm Cochliobolus lunatus thuộc: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Dothideomycetes Phân lớp: Pleosporomycetidae Bộ: Pleosporales Họ: Pleosporaceae Giống: Cochliobolus Lồi: C. lunatus 22
Đồ án tốt nghiệp 1.4.2. Đặc điểm hình thái, sinh hĩa Đặc điểm hình thái: Theo nghiên cứu của R. R. Nelson và Haasis (1964), tản nấm C. lunatus phát triển nhanh chĩng trên mơi trƣờng thạch đƣờng khoai tây, ban đầu cĩ màu trắng sau đĩ chuyển sang màu nâu, nâu đen hoặc đen, tản nấm giống len hoặc lơng mƣợt nhƣ nhung và cĩ cấu trúc sắp xếp lỏng lẻo. Sợi nấm chủ yếu mọc trong điều kiện ẩm ƣớt. Bào tử nấm C. lunatus cĩ dạng bào tử đính, cĩ thể đơn nhân hoặc đa nhân nằm riêng lẻ hoặc theo nhĩm, thẳng hoặc cuộn xoắn đơi khi quặp. Bào tử cĩ vách ngăn màu nhạt đến màu nâu sẫm; bào tử cĩ chiều dài lên đến 650 µm, rộng 5 – 9 µm. Nấm C. lunatus đƣợc phân biệt với các lồi khác ở chỗ bào tử cĩ 3 vách ngăn và 4 tế bào, các tế bào đầu và cuối thƣờng nhạt màu hơn tế bào ở giữa. Đặc điểm sinh hĩa: C. lunatus cĩ phân bố rộng rãi nhƣng phần lớn chúng phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nơi cĩ khí hậu ẩm ƣớt thuận lợi cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm bệnh. Bào tử và túi bào tử cĩ khả năng phát tán trong khơng khí. Ngồi ra, chúng cũng cĩ thể tồn tại trong đất. Nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm vào khoảng 24 – 300C, bào tử sẽ bị chết ở nhiệt độ 590C trong vịng 1 phút và 550C trong thời gian 5 phút. Nấm Cochliobolus lunatus cĩ thể tồn tại trong đất ở dạng hạch nấm trong khoảng 2 năm và trong thời gian 3 năm chúng sẽ giải phĩng bào tử lên những cây dễ bị tổn thƣơng (R. R. Nelson và Haasis, 1964). 1.4.3. Phổ ký chủ Nấm Cochliobolus lunatus cĩ phạm vi ký chủ rất rộng. Chúng là một tác nhân gây bệnh trên hạt giống làm hạt giống khơng nảy mầm, làm tàn lụi cây con của những cây khác nhƣ cây mía đƣờng, lúa nƣớc, lúa mì, cây kê. Nĩ cũng gây tổn thƣơng cho thân, cành lá và hoa trên phạm vi ký chủ rộng lớn (R. R. Nelson và Haasis, 1964). Theo Nguyễn Văn Bá và ctv (2005), chi Cochliobolus cũng là tác nhân gây bệnh đốm lá, bệnh rỉ sét (thối khơ), biến dạng hạt, biến dạng màu (bạc màu) hạt và thậm chí thối rễ. 23
Đồ án tốt nghiệp Nấm C. lunatus cịn đƣợc biết đến nhƣ tác nhân gây bệnh vàng lá cây và làm hạt khơng nảy mầm đối với các cây trồng loại đơn tử diệp nhƣ mía, gạo, kê và ngơ. Ngồi ra, chúng cịn gây bệnh đốm lá trên các thực vật hạt kín. Theo Bengyella Louis và ctv (2014), nấm C. lunatus là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm, chúng phát triển mạnh trên các cây trồng quan trọng nhƣ lúa nƣớc, lúa mì, sắn, dâu tây và khoai tây. Ngồi ra, chúng cịn là tác nhân gây bệnh trên các lồi cỏ dại trên ruộng lúa. 1.4.4. Cơ chế xâm nhập và gây bệnh Nấm Cochliobolus lunatus phần lớn sản sinh bào tử và phát tán chủ yếu qua khơng khí, quá trình lây nhiễm vào lá cây khoai tây của nấm Cochliobolus lunatus khá phức tạp (Bengyella Louis và ctv, 2014), cách thức xâm nhiễm nhƣ sau: Cách thức xâm nhập của nấm C. lunatus chủ yếu bằng con đƣờng cơ học. Để xâm nhập đƣợc vào tế bào chủ, bào tử nấm C. lunatus tiếp xúc, bám lên lá cây. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nấm nảy mầm thành ống mầm để xâm nhập vào trong lá. Trong quá trình xâm nhập, nếu pH mơi trƣờng khơng thuận lợi, nấm C. lunatus điều hịa pH của mơi trƣờng tạo điều kiện cho nấm xâm nhập vào tế bào chủ. Sau đĩ, nấm bệnh tiết độc tố melanin (cĩ màu đen) nhằm ức chế và tiêu diệt những tế bào tại vị trí xâm nhập vào cây chủ làm cho vết bệnh sau đĩ cĩ màu đen và lan rộng. Ngồi ra, melanin cịn cĩ khả năng giúp nấm chống lại các tác nhân oxy hĩa và quá trình ly giải trong cơ chế bảo vệ của tế bào chủ (Miguel J. Benltrán-García và ctv, 2014). Thời gian ủ bệnh 4 – 5 ngày sau khi nhiễm bệnh và triệu chứng bắt đầu biểu hiện với sự hình thành bào tử của mầm bệnh trên các vết bệnh xảy ra vào ngày thứ 6. Điều kiện ẩm ƣớt trên bề mặt cây chủ trong khoảng 13 giờ là cần thiết cho việc nhiễm bệnh thành cơng (R. R. Nelson và Haasis, 1964). 1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus 1.4.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 24
Đồ án tốt nghiệp Nhiệt độ cĩ ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển và hình thành bào tử của nấm bệnh. Theo Jyothi G và ctv (2013), nấm Cochliobolus lunatus sản sinh bào tử nhiều nhất ở nhiệt độ 250C. Tuy nhiên, sự sinh trƣởng và phát triển kích thƣớc tản nấm nhanh nhất ở nhiệt độ 300C, nấm bệnh phát triển chậm lại ở nhiệt độ 150C và 400C. Bên cạnh đĩ theo Yasmeen Faiz Kazi và ctv (2013), nấm C. lunatus cĩ khả năng tăng trƣởng ở nhiệt độ 30 – 400C. Ở nhiệt độ 45 – 500C, quá trình sinh trƣởng và phát triển của nấm bị ngừng lại. Một nghiên cứu khác của Gao Ying và ctv (2009) cũng cho rằng nhiệt độ tốt nhất cho các chủng Cochliobolus spp. sinh trƣởng là 25 – 300C. 1.4.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Đối với những nguồn cacbon khác nhau, sự sinh trƣởng và phát triển của nấm C. lunatus cũng khác nhau. Theo Yasmeen Faiz Kazi và ctv (2013), nấm C. lunatus phát triển tốt nhất trong mơi trƣờng cĩ bổ sung đƣờng glucose, sau đĩ là đƣờng maltose và cuối cùng là đƣờng sucrose. Nhƣng đối với mơi trƣờng cĩ bổ sung đƣờng lactose và cellulose, nấm khơng phát triển. Một nghiên cứu khác của Gao Ying và ctv (2009) cũng cho rằng nguồn cacbon tốt nhất cho sự phát triển của các chủng nấm Cochliobolus spp. là glucose và galactose. 1.4.5.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại Các ion kim loại cĩ ảnh hƣởng đến sự phát triển và các hoạt động phân giải protein của nấm C. lunatus. Yasmeen Faiz Kazi và ctv (2013) cho rằng nấm này cĩ thể sinh trƣởng và phát triển trên mơi trƣờng cĩ bổ sung các muối nhƣ NH4Cl, KH2PO4, K2HPO4, NaCl. Tuy nhiên, đối với muối chứa ion kim loại nhƣ là MgSO4 và CaCl2, nấm khơng phát triển đƣợc. 1.4.5.4. Ảnh hưởng của pH Yếu tố pH cĩ ảnh hƣởng khá lớn đến sự phát triển của nấm Cochliobolus lunatus. Theo Gao Ying và ctv (2009), pH tốt nhất cho sự sinh trƣởng của nấm Cochliobolus spp. là khoảng pH 6 – 8, càng xa khoảng pH này sự sinh trƣởng và phát triển của nấm bệnh càng giảm. 25
Đồ án tốt nghiệp 1.4.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Nguồn nitơ là một trong các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ tăng trƣởng của nấm bệnh. Nguồn nitơ thích hợp cho sự phát triển của chủng nấm Cochliobolus spp. là kali nitrate và glycin (Gao Ying và ctv, 2009). 1.5. Sử dụng nấm Trichoderma spp. trong phịng trừ bệnh đốm trắng 1.5.1. Giới thiệu về nấm đối kháng Trichoderma spp. 1.5.1.1. Đặc điểm phân loại (Lê Thị Huệ, 2010) Trichoderma spp. thuộc: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma 1.5.1.2. Nguồn gốc Trichoderma spp. đƣợc tìm thấy ở mọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Hầu hết các dịng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác (Gary J. Samuels, 2004). Trichoderma spp. rất ít tìm thấy trên thực vật sống và khơng sống nội ký sinh với thực vật. Mỗi dịng nấm Trichoderma khác nhau cĩ yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Gary E. Harman, 2000). Nhìn chung các lồi Trichoderma spp. xuất hiện ở các vùng đất acid nhiều hơn ở vùng đất trung tính và kiềm (Papavizas, 1985). 1.5.1.3. Đặc điểm hình thái nấm (Gary J. Samuels, 2004) Khuẩn ty (sợi nấm) của Trichoderma khơng màu, cĩ tốc độ phát triển nhanh trên mơi trƣờng PDA ban đầu cĩ màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang màu xanh đậm, 26
Đồ án tốt nghiệp xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số lồi cịn cĩ khả năng tiết ra một số chất làm thạch của mơi trƣờng PDA hĩa vàng. Ở một số lồi Trichoderma cuống bào tử chƣa đƣợc xác định. Cuống bào tử của một số nấm bệnh xen vào nhau. Một số lồi khác cĩ cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T. koningii), cĩ kích thƣớc từ 1 – 7 µm, cĩ hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng nhƣ bơng khơng rắn chắc, những nốt sần dạng này đƣợc tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động nhƣ chồi mầm. Bào tử đính của Trichoderma là một khối trịn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong khơng cĩ vách ngăn, khơng màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử cĩ màu xanh đặc trƣng, một số ít cĩ màu trắng (nhƣ T. virens), vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình elip hoặc hình ovan (với tỉ lệ dài: rộng từ 1 – 1,1 µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài: rộng là hơn 1,4 µm), đa số các bào tử trơn láng, kích thƣớc khơng quá 5 µm. Nhờ cĩ khả năng tạo thành bào tử chống chịu (chlamydospores) mà T. harzianum cĩ thể tồn tại 110 – 130 ngày dù khơng đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sĩt của Trichoderma trong mơi trƣờng khơng đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng nên chlamydospores cĩ thể đƣợc dùng để tạo chế phẩm phịng trừ sinh học. 1.5.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hĩa Đa số các dịng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất cĩ độ pH từ 2,5 đến 9,5 và phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ƣu thƣờng là 25 – 300C. Một vài dịng phát triển tốt ở 350C. Một số ít phát triển đƣợc ở 400C (Gary J. Samuels, 2004). Theo Prausun K. M. và Kanthadai R. (1997), hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 350C chúng tạo 27
Đồ án tốt nghiệp ra những khuẩn lạc rắn dị thƣờng với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thƣờng, ở 370C khơng tạo ra bào tử sau 7 ngày nuơi cấy. Trichoderma là lồi sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme nhƣ chitinolytic (enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là hai enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với Trichoderma. Một vài lồi Trichoderma cĩ tác động làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Tuy nhiên cơ chế của tác động này chƣa đƣợc biết (Gary J. Samuels, 2004). Trong quá trình sinh sản vơ tính của Trichoderma cĩ thể xảy ra hiện tƣợng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sĩt từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện mơi trƣờng sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen cũng nhƣ kiểu hình của cùng một loại Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo ra những dịng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là những dịng rất cĩ ý nghĩa trong nghiên cứu cũng nhƣ trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểm sốt mầm bệnh thực vật (Gary E. Harman, 2000). 1.5.2. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma (Huỳnh Văn Phục, 2006) Theo Nguyễn Thị Hai (2013), rất nhiều nghiên cứu về vi sinh vật đã cho thấy nấm Trichoderma là một trong những nhĩm đứng đầu của vi sinh vật trong đất cĩ tính đối kháng và đƣợc nghiên cứu rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới. Việc nghiên cứu tính đối kháng, đặc biệt là tính chọn lọc của những chất đặc trƣng do nấm Trichoderma tiết ra đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm và tiến hành nghiên cứu nhằm giải thích cơ chế tác động của nhĩm nấm này đối với các vật gây bệnh cho cây trồng và sử dụng chúng trong phịng chống bệnh hại cây trồng. Đối với Okigbo và Ikediugw (2000), hai nhà khoa học này cho biết những lồi Trichoderma spp. cĩ hệ sợi nấm nhỏ, mảnh là một nhân tố cĩ triển vọng trong phịng trừ sinh học chống bệnh thối hạt, thối rễ và quản lý bệnh hại sau thu hoạch. 28
Đồ án tốt nghiệp Nấm Trichoderma spp. tấn cơng trực tiếp bằng cách cuộn quanh và tiết ra enzyme phân hủy chitin của nấm gây hại thành những phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp cây trồng kháng lại bệnh (Klein và Eveleigh, 1998). Một số loại enzyme do Trichoderma tiết ra bao gồm glucan 1,3 – beta – glucosidase, endochitinase, chitobiosidase, N – acetyl – beta – D – glucosaminidase (NAGase), trypsin, chymotrypsin, cellulose, protease, lipase, khi kết hợp hai enzyme glucan 1,3 – beta – glucosidase và endochitinase sẽ ngăn đƣợc quá trình tăng trƣởng của nhiều loại Ascomycetes trong nuơi cấy, thêm vào đĩ sẽ cĩ hiệu quả cao trong việc ngăn cản sự nảy mầm của bào tử hơn là từng loại enzyme đơn lẻ (Margolles và Clark, 1995). Hầu hết các tác nhân kiểm sốt sinh học đƣợc biết là sản xuất enzyme chitinase và β – 1,3 – glucanase cĩ thể làm rã thành tế bào dẫn đến ly giải sợi nấm của mầm bệnh (Esposito .E, Silva .D.M, 1998). Phát hiện thấy hoạt động của các enzym - chitinase và β - 1,3 glucanase trong Trichoderma spp. mạnh hơn khi ủ với tế bào mầm bệnh. Sản xuất β - 1,3 glucanase cũng đã đƣợc báo cáo là một enzyme quan trọng trong kiểm sốt sinh học của tác nhân gây bệnh vì β - 1,3 glucan là một thành phần cấu trúc của màng tế bào nấm (Denis, C và Webster, 1971). Đối với cơ chế đối kháng nấm bệnh của nấm Trichoderma, các nhà khoa học đƣa ra những cơ chế khác nhau nhƣng nhìn chung thì nấm Trichoderma kiểm sốt sinh học thơng qua 3 cơ chế chính: a. Tiết kháng sinh T. virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự phát triển của các lồi Rhizoctinia solani và Pythium spp. Isonitriles đƣợc sản xuất bởi T. hamatum, harzianum, viride, koningii, polysporum giúp hạn chế sự phát triển của nấm bệnh. Ở một vài lồi T. atroviride và T. viride tiết 6 – pentyl alpha – pyrone (α – pyrone) cĩ hƣơng dừa, hoạt động của loại phytotoxin này cĩ thể ngăn cản sự nảy mầm của những nỗn bào tử nấm bệnh Phytophthrora cinnamomea và bào tử của Botrytis cinnerea. 29
Đồ án tốt nghiệp Peptaibols do T. polysporum, T. harzianum, T. koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. T. virens, T. koningii, T. viride sản xuất sesquiterpenes và polyketides đƣợc T. harzianum sản xuất. Steroids (viridian) là một độc tố thực vật cĩ hiệu lực nhƣ một loại thuốc diệt cỏ giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử, đƣợc sản xuất bởi T. virens. b. Ký sinh Trichoderma cĩ thể nhận ra vật chủ của nĩ nhờ cĩ tính hƣớng hĩa chất, nĩ ký sinh phân nhánh hƣớng về những nấm đã đƣợc định trƣớc (do những nấm này tiết ra các hĩa chất). Ngồi ra, vật ký sinh và vật đối kháng đƣợc Trichoderma nhận dạng qua trung gian là lectin trên bề mặt tế bào của mầm bệnh và vật đối kháng). Đồng thời, Trichoderma ký sinh và cuộn quanh sợi nấm vật chủ thơng qua hình thành các dạng mĩc hay dạng giác bám, tiết enzyme chitinase, β – glucanase, protease những enzyme này cĩ khả năng bào mịn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ, đây là khả năng tấn cơng trực tiếp của Trichoderma. Khơng những thế, Trichoderma cịn cĩ khả năng tiết những enzyme phân giải nhƣ chitinase, glucanase, protease giúp bào mịn thành tế bào sau khi ký sinh và cuộn quanh nấm gây bệnh đối kháng với nĩ. Khi ký sinh vào cây T. asperellum tiết cellulose, cho phép nĩ tấn cơng vào những nấm nhƣ Phytophthora spp. và Pythium spp. khi chúng bám vào cây trồng. 30
Đồ án tốt nghiệp a b Hình 1.2. Hình ký sinh của nấm Trichoderma (a. Trichoderma ký sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở các cây họ đậu. (Trichoderma nhuộm màu; Pythium nhuộm màu xanh), b. Nấm Trichoderma sp. quấn lấy sợi nấm gây bệnh (Tơ Duy Khƣơng, 2007)). c. Cạnh tranh (Nguyễn Ngọc Phúc, 2005) Lockwood (1981, 1982) và Wicklow (1992) đã đƣa ra khái niệm cạnh tranh khai thác và cạnh tranh cản trở vào tƣơng tác giữa quần thể nấm. Sự cạnh tranh cản trở liên quan đến cơ chế hĩa học và tập tính bởi vi sinh vật này giới hạn vi sinh vật khác tiếp xúc cơ chất và xảy ra do sự tƣơng tác giữa hệ sợi nấm trong cùng lồi hoặc khác lồi. Sự cạnh tranh khai thác xảy ra giữa 2 lồi cùng khai thác một nguồn lợi nhƣng khác nhau về tốc độ và hiệu quả khai thác. Trong trƣờng hợp nguồn lợi là nguồn dinh dƣỡng đƣợc xem nhƣ cạnh tranh dinh dƣỡng. - Sự cạnh tranh cho mơ hoại sinh Botrytis và Sclerotinia spp. là mầm bệnh cơ hội tấn cơng vào mơ thực vật lão hĩa hoặc chết coi đĩ nhƣ nguồn dinh dƣỡng, từ đây tiếp tục tấn cơng vào những mơ khỏe mạnh. Khi đã xử lý Trichoderma, chúng làm suy yếu, làm chậm sự hình thành khuẩn lạc của Botrytis vào mơ thực vật. Sau đĩ làm giảm mức độ bệnh trên cây. Trichoderma đã đƣợc ứng dụng thành cơng trong kiểm sốt Botrytis và Sclerotinia trên những loại rau cải, trái cây khác nhau: dâu, dƣa chuột - Sự cạnh tranh cho chất dịch rỉ từ hạt Bệnh chết nhát (Damping - off) gây bởi Pythium ultimum ở một số loại ngũ cốc và rau quả đƣợc xuất phát bởi sự đáp ứng nhanh chĩng của mầm bệnh đối với dịch rỉ từ 31
Đồ án tốt nghiệp hạt. Túi bào tử của Pythium nảy mầm và xâm nhiễm vào hạt giống trong vịng vài giờ khi Pythium đã tràn lan trong đất. Xử lý hạt giống với Trichoderma làm giảm sút sự nảy mầm của túi bào tử Pythium, hiện tƣợng này đƣợc cho là sự cạnh tranh chất kích thích nảy mầm. Sự cạnh tranh dinh dƣỡng cũng đƣợc xem nhƣ cơ chế hữu hiệu nhất sử dụng bởi T. harzianum T-35 trong sự kiểm sốt Fusarium oxysporum trong vùng rễ cây bơng vải và dƣa hấu. - Sự cạnh tranh trên vị trí vết thƣơng Một trong những thí nghiệm thành cơng đầu tiên của sự kiểm sốt sinh học trên vết thƣơng gây do cắt xén là sử dụng T. viride, áp dụng trong phun xịt hoặc dùng kéo lớn cắt, để kiểm sốt mầm bệnh gây bạc lá (Chondrostoreum purpureum). Thể Trichoderma đƣa vào đƣợc chứng minh cĩ khả năng mọc sợi nấm trên cây vừa bị cắt và ngăn ngừa sự xâm nhiễm của mầm bệnh ở rễ (Amillaria luteobubalina). Sự thối thân thƣờng theo cùng sự xâm nhiễm Botrytis vào vết thƣơng bị cắt trên cây cà chua trong nhà kính; căn bệnh này rất khĩ kiểm sốt bởi những biện pháp canh tác. Thể Trichoderma đƣợc chứng minh cĩ khả năng kiểm sốt sự thối thân khi tiêm chủng trƣớc hay cùng lúc với Botrytis, nhƣng khơng cĩ hiệu quả kiểm sốt nếu đƣợc tiêm sau, nhƣ vậy cĩ thể cho rằng sự cạnh tranh mọc sợi nấm trên vết thƣơng là yếu tố xác định sự giảm bệnh. Trong một nghiên cứu sự xâm nhiễm của Pythium vào rễ dƣa chuột đã chỉ ra rằng mặc dù khơng cĩ sự hình thành sợi nấm của chủng T. harzianum T3 trên tồn bộ rễ nhƣng vẫn cĩ sự hình thành sợi nấm tại vết thƣơng. Sự cạnh tranh dinh dƣỡng từ dịch rỉ vết thƣơng của thể cạnh tranh là nguyên nhân giảm sự xâm nhiễm của Pythium. Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết những dƣỡng chất một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores). 32
Đồ án tốt nghiệp Trong hoạt động sống ký sinh của nấm Trichoderma spp. thì enzyme thủy phân chitinase và β – glucanase đĩng vai trị rất quan trọng (Crus và ctv, 1995). Nấm Trichoderma harzianum cĩ khả năng sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào nhƣ chitinase, β – 1,3 – glucanase đây là hai enzyme quan trọng trong quá trình ký sinh lên nấm gây hại (Muhammad và Amusa, 2003). Khả năng tiết enzyme của Trichoderma spp. chịu ảnh hƣởng của độ yếm khí, lƣợng oxy hịa tan, tốc độ lắc (Marco và ctv, 2002). Một vấn đề quan trọng trong sự hình thành cơ chế đối kháng đƣợc trình bày ở nhiều báo cáo là tùy thuộc vào dịng vi sinh vật đối kháng, nguồn gốc của chúng và điều kiện mơi trƣờng, vì thế khi chọn một tác nhân sinh học nên quan tâm đến hƣớng áp dụng, nguồn gốc của mầm bệnh (Kubicek và Harman, 1998). 33
Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian 2.1.1. Địa điểm Phịng Thí Nghiệm Vi Sinh, Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trƣờng, Trƣờng Đại học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 07/04/2014 đến ngày 31/07/2014. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguyên liệu 2.2.1.1. Trái và cành thanh long Trái và cành thanh long bị bệnh đƣợc thu từ huyện Châu Thành, tỉnh Long An. Cành thanh long sạch bệnh đƣợc thu từ huyện Châu Thành, tỉnh Long An. Hình 2.1. Cành thanh long bị bệnh đốm trắng (Nguyễn Thành Hiếu và ctv) 34
Đồ án tốt nghiệp 2.2.1.2. Chủng nấm mốc Chủng nấm mốc Trichoderma đƣợc cung cấp, do bạn Nguyễn Thái Minh Hiếu phân lập từ nấm linh chi, sinh viên Khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi Trƣờng, Trƣờng Đại học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.2.2. Hĩa chất - D – Glucose (Trung Quốc) - Agar (Việt Nam) - Tween 80 (Trung Quốc) - Kháng khuẩn Chloramphenycol - Urê (Trung Quốc) - KNO3 (Trung Quốc) - (NH4)2SO4 (Trung Quốc) - NaCl (Trung Quốc) 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Dụng cụ - Erlen 250ml - Bình mơi trƣờng 250ml, 500ml - Ống đong 100ml, 250ml - Cốc 100ml, 250ml,1000ml, 2000ml - Pipet 1ml, 10ml - Ống nghiệm - Que cấy - Bình tia - Đũa thủy tinh 2.2.3.2. Thiết bị - Cân phân tích (Satorius, Đức) - Cân kỹ thuật (Shimadzu, Nhật) 35
Đồ án tốt nghiệp - Bếp từ - Nồi hấp Autoclave - Tủ hút Các dụng cụ, thiết bị cần thiết trong phịng thí nghiệm 2.2.3.3. Mơi trường nuơi cấy a. Mơi trƣờng WA (Water Agar) Thành phần mơi trƣờng: - Nƣớc cất: 1000 ml - Agar: 20 g/l - Thuốc kháng khuẩn Chloramphenycol: 0,25 g/l Cách nấu: Cho agar và thuốc kháng khuẩn vào nƣớc cất đun sơi, đem hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau khi hấp khử trùng xong, để mơi trƣờng hạ xuống nhiệt độ 600C, đem đổ mơi trƣờng. Mơi trƣờng WA là mơi trƣờng phổ biến để phân lập nấm bệnh. b. Mơi trƣờng PDA (Potato D – Glucose Agar) Thành phần mơi trƣờng: - Khoai tây: 200 g - Đƣờng D – Glucose: 20 g - Agar: 20 g - Nƣớc cất: 1000 ml Cách nấu: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt hạt lựu, cân đủ 200 g cho nƣớc cất vào đun sơi khoảng 20 phút kể từ khi bắt đầu sơi. Lọc bỏ phần bã, đun sơi trở lại, tiếp theo cho lần lƣợt đƣờng và agar vào (Lƣu ý vừa cho vừa khuấy đều để tránh bị vĩn cục). Cho vào bình mơi trƣờng, đem hấp khử trùng ở nhiệt 1210C trong 20 phút. 36
Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. 2.3.1. Phương pháp vi sinh 2.3.1.1. Phương pháp thu thập, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh a. Phƣơng pháp nhận dạng và thu thập mẫu (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009) Bệnh đốm trắng trên thanh long xuất hiện trên bẹ hoặc trái ban đầu là những chấm nhỏ li ti nhƣ kim, phát triển thành những đốm nhỏ màu trắng, vết bệnh trũn thấp so với bẹ, về sau vết bệnh cĩ màu vàng cam và phát triển nhơ lên vết ghẻ màu nâu và đơi khi gây thối nhũn nếu bị bệnh tấn cơng nặng. Chọn mẫu ở giai đoạn khi là những chấm nhỏ li ti, đốm nhỏ màu trắng để phân lập tác nhân gây bệnh. b. Phƣơng pháp phân lập nấm bệnh (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009) Mục đích: nhằm phân lập đƣợc nấm trên mơ bệnh Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị: - Cành thanh long bị bệnh lạ cần phân lập. - Đĩa petri vơ trùng cĩ chứa mơi trƣờng nuơi cấy WA (2%). Các bƣớc phân lập nấm bệnh từ mơ cây bệnh nhƣ sau: - Rửa mẫu bệnh dƣới nƣớc máy để loại bỏ đất và bụi bẩn. - Dùng cồn ethanol 70% lau sạch bụi bẩn xung quanh vết bệnh. - Cắt mẫu bệnh thành từng miếng cấy nhỏ khoảng 2 x 2 mm, cho vào cồn ethanol 96% trong 5 giây, rửa lại bằng nƣớc cất, vớt ra để lên giấy thấm nƣớc sau đĩ đặt lên mơi trƣờng agar - nƣớc cất. Đặt đĩa petri ở nhiệt độ phịng thí nghiệm cho nấm phát triển. c. Phƣơng pháp cấy truyền (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009) 37
Đồ án tốt nghiệp Mục đích của giai đoạn này là giúp xác định vi sinh vật nào đã đƣợc phân lập. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị: - Đĩa nấm bệnh đã nuơi cấy trên mơi trƣờng WA (2%). - Đĩa petri vơ trùng cĩ chứa mơi trƣờng PDA. Quy trình cấy truyền - Kiểm tra các đĩa cấy hàng ngày dƣới kính lúp soi nổi và đánh giá sự phát triển của sợi nấm từ các miếng cấy. - Xác định xem cĩ nhiều hơn một loại nấm mọc lên hay khơng. - Cấy truyền khi sợi nấm mọc đƣợc khoảng 5 mm từ miếng cấy. - Cắt một miếng thạch nhỏ (2 × 2 mm) từ rìa mỗi tản nấm và cấy sang mơi trƣờng PDA Sau khi cấy truyền các mẫu nấm cĩ trong mẫu cấy ban đầu, ta tiến hành làm thuần các mẫu nấm từ các mẫu nấm cấy truyền. d. Phƣơng pháp làm thuần (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009) Mục đích của phƣơng pháp này là đảm bảo nấm đƣợc cấy hồn tồn thuần Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị: - Đĩa nấm bệnh đã đƣợc cấy truyền trên mơi trƣờng PDA. - Đĩa petri vơ trùng cĩ chứa sẵn mơi trƣờng PDA. Cách thực hiện Dùng que cấy dẹp đã khử trùng, lấy một miếng thạch nhỏ chứa phần đỉnh của một sợi nấm duy nhất trên đĩa nấm đã cấy truyền cấy sang đĩa mơi trƣờng PDA. Kí hiệu tên mẫu cấy, ngày cấy. e. Phƣơng pháp làm phịng ẩm (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009; Phạm Minh Nhựt, 2010) 38
Đồ án tốt nghiệp Mục đích của việc quan sát dƣới kính hiển vi là để nhận ra tác nhân gây bệnh và chuẩn đốn bệnh. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị: - Đĩa petri cĩ chứa nấm bệnh đã đƣợc làm thuần. - Đĩa petri vơ trùng cĩ chứa mơi trƣờng PDA. - Đĩa petri cĩ chứa một lớp mỏng bơng gịn thấm nƣớc phía dƣới, đặt giấy lọc lên trên, đem hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. - Lame, lamelle vơ trùng. - Nƣớc cất vơ trùng. Cách thực hiện - Dùng kẹp gắp miếng lame đặt vào giữa đĩa petri vơ trùng cĩ chứa bơng gịn và giấy lọc. - Đĩa petri chứa mơi trƣớng PDA, dùng dao mổ cắt thành những miếng hình vuơng với kích thƣớc 1 × 1 cm. - Dùng kẹp gắp miếng mơi trƣờng PDA (1 × 1 cm) đặt vào giữa miếng lame. - Dùng que cấy thƣớc thợ, lấy một ít sinh khối bào tử nấm bệnh cấy vào bốn bên của miếng thạch, đặt lamelle lên miếng thạch vừa cấy xong. - Đổ nƣớc cất vơ trùng vào miếng giấy lọc trong đĩa vừa cấy. Lƣu ý là khơng đổ nƣớc lên lame sẽ ảnh hƣởng đến việc hình thành bào tử. - Cuối cùng đậy nắp đĩa lại, ghi chú tên mẫu cấy, ngày, giờ cấy. Tùy thuộc vào thời gian sinh bào tử của từng lồi nấm mà sau 3 ngày, 5 ngày hoặc 7 ngày, ta bắt đầu soi bào tử dƣới kính hiển vi. Chuẩn bị: - Đĩa phịng ẩm - Kính hiển vi quang học - Lame, bơng gịn thấm nƣớc vơ trùng 39
Đồ án tốt nghiệp - Cồn 960, methylen blue, dầu soi kính Cách thực hiện - Dùng bơng gịn lau lame bằng cồn 960. - Nhỏ 1 giọt methylen blue lên lame, sau đĩ dùng kẹp gắp lamelle trong đĩa phịng ẩm đặt lên giọt methylen blue, soi ở vật kính 10X để xem hình thái sợi nấm. - Sau đĩ, cho 1 giọt dầu soi kính lên miếng lamelle, soi ở vật kính 100X. f. Phƣơng pháp lây bệnh nhân tạo (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014; Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009) Mục đích: thơng thƣờng mục đích của phƣơng pháp lây bệnh nhân tạo, nhằm khẳng định một vi sinh vật đƣợc phân lập là tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau: - Cơng thức 1: Phun nƣớc cất vơ trùng (đối chứng) - Cơng thức 2: Phun nấm Fusarium - Cơng thức 3: Phun nấm Colletotrichum - Cơng thức 4: Phun chủng nấm N1 Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên cành thanh long khỏe chƣa cĩ dấu vết bị thƣơng. Mỗi cơng thức nhiễm 4 cành, mỗi cành gây 10 vết thƣơng bằng cách dùng kim châm nhẹ lên cành tạo vết thƣơng. Các bƣớc thực hiện - Dùng bơng thấm nƣớc lau sạch vết bụi bẩn trên các cành cây thanh long. Phun nƣớc cất vơ trùng cho ƣớt các cành cây thanh long. - Đối với mẫu thí nghiệm: Một mẫu dùng kim tiêm gây vết thƣơng trên các cành thanh long. Sau đĩ, dùng bình xịt chứa bào tử nấm bệnh phun lên các cành đã gây vết thƣơng. - Đối với mẫu đối chứng: Dùng kim tiêm gây vết thƣơng nhƣng khơng phun dịch bào tử mà phun nƣớc cất vơ trùng. 40
Đồ án tốt nghiệp - Đặt mẫu nơi thống mát cĩ độ ẩm cao, tránh ánh nắng trực tiếp, ghi chú tên mẫu nấm bệnh đƣợc lây bệnh và ngày lây bệnh. Mỗi ngày, tƣới nƣớc 2 lần vào sáng sớm và lúc chiều tối trừ 2 ngày đầu khi mới lây bệnh. - Kiểm tra và so sánh những cành đƣợc lây bệnh với mẫu đối chứng. Quan sát, ghi nhận các triệu chứng và so sánh với các triệu chứng của mẫu thu đƣợc từ đồng ruộng. Lƣu ý: Để làm thí nghiệm này, ta nên chọn những cành thanh long khỏe, khơng bị nhiễm bệnh.Trong dịch bào tử nấm nên cho vài giọt tween 80 giúp tăng khả năng bám dính của bào tử nấm vào vết thƣơng.Thời gian phun tốt nhất là vào buổi chiều tối khoảng 17g. Lúc này khơng cịn ánh sáng mặt trời nên hiệu quả sẽ đạt cao nhất. Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian xuất hiện bệnh, tỷ lệ bệnh và quan sát triệu chứng xuất hiện vết bệnh của từng nghiệm thức ghi nhận bằng hình ảnh sau khi lây bệnh. a b c Hình 2.2. Dịch bào tử sau khi lắc (a. Colletotrichum, b. Chủng nấm N1, c. Fusarium) Hình 2.3. Cành thanh long trƣớc khi lây bệnh nhân tạo 41
Đồ án tốt nghiệp 2.3.1.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm bệnh a. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của nấm bệnh (Phan Thị Thu Hiền và ctv, 2014) Nguyên tắc: Ánh sáng mặt trời là nguồn năng lƣợng chủ yếu của quá trình quang hợp vì vậy rất cần cho các vi sinh vật. Tuy nhiên, mỗi lồi vi sinh vật khác nhau cĩ sự sinh trƣởng và phát triển khác nhau với các mức độ chiếu sáng khác nhau. Do đĩ, việc khảo sát các điều kiện chiếu sáng khác nhau (24 giờ chiếu sáng, 12 giờ sáng: 12 giờ tối) là cần thiết để xác định điều kiện chiếu sáng phù hợp cho việc nuơi cấy vi sinh vật và qua đĩ tìm điều kiện thích hợp phịng trừ một số vi sinh vật gây hại cho vật chủ. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau: - Cơng thức 1: 24 giờ chiếu sáng - Cơng thức 2: 12 giờ sáng: 12 giờ tối Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, đơn yếu tố, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một đĩa petri. Tiến hành thí nghiệm - Dùng cây đục lỗ đƣờng kính 5 mm, đục lỗ thạch trên đĩa petri cĩ chứa sinh khối nấm bệnh. - Dùng dao cấy chuyển cục thạch vừa đục xong sang đĩa mơi trƣờng PDA vơ trùng đã chuẩn bị sẵn. - Ghi chú tên nấm, ngày, giờ cấy và đem ủ ở nhiệt độ phịng. Trong đĩ, 1 mẫu thí nghiệm để nơi cĩ đèn chiếu sáng liên tục, 1 mẫu thí nghiệm để nơi cĩ ánh sáng chiếu 12 giờ và 12 giờ khơng chiếu sáng. Chỉ tiêu theo dõi: - Đo đƣờng kính tản nấm (mm) ở 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy (NSC). d + d - Đƣờng kính trung bình tính theo cơng thức: = 1 2 2 (Trong đĩ, d1 và d2 là hai đƣờng chéo tản nấm phân bố). 42
Đồ án tốt nghiệp b. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của nấm bệnh (Phan Thị Thu Hiền và ctv, 2014; Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014) Nguyên tắc: Độ pH cĩ ảnh hƣởng rõ rệt đối với sự sinh trƣởng của vi sinh vật. Mỗi lồi vi sinh vật đều cĩ một phạm vi pH sinh trƣởng nhất định và pH sinh trƣởng tốt nhất. pH của mơi trƣờng đƣợc quyết định bởi nồng độ ion H+. Nồng độ ion H+ thay đổi sẽ làm thay đổi trạng thái điện tích ở thành tế bào, điều này ảnh hƣởng đến khả năng hấp thụ khống, các acid hữu cơ, làm giảm khả năng sử dụng dinh dƣỡng của vi sinh vật. Bên cạnh đĩ, pH cịn ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme, sự hình thành ATP cũng nhƣ ảnh hƣởng đến sự hình thành bào tử đối với tế bào nấm. Do đĩ, việc khảo sát ảnh hƣởng của pH là cần thiết để xác định khoảng pH phù hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật nhằm tối ƣu hĩa điều kiện nuơi cấy. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau: - Cơng thức 1: pH 5 - Cơng thức 2: pH 6 - Cơng thức 3: pH 7 - Cơng thức 4: pH 8 Thí nghiệm đƣợc thực hiện theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, đơn yếu tố với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một đĩa petri. Tiến hành - Dùng cây đục lỗ đƣờng kính 5 mm khoang lỗ thạch trên sinh khối nấm bệnh. - Dùng dao mỗ cấy truyền lỗ thạch sang đĩa petri chứa mơi trƣờng PDA. Ghi chú tên nấm, ngày giờ cấy và đem ủ ở nhiệt độ phịng. Chỉ tiêu theo dõi: - Đo đƣờng kính tản nấm (mm) ở 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy (NSC). d + d - Đƣờng kính trung bình tính theo cơng thức: = 1 2 2 (Trong đĩ, d1 và d2 là hai đƣờng chéo tản nấm phân bố). 43
Đồ án tốt nghiệp c. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của nấm bệnh (N. Khattabi và ctv, 2004; R. K. Jayaswal và ctv, 2003). Nguyên tắc: Nguồn nitơ cĩ vai trị quan trọng trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật. Chúng là thành phần cấu tạo của các amino acid, ATP, nên cĩ ảnh hƣởng lớn đến tốc độ tăng trƣởng của vi sinh vật cũng nhƣ khả năng hình thành bào tử của nấm sợi. Do đĩ, việc khảo sát ảnh hƣởng của nguồn nitơ là cần thiết để xác định các yếu tố thích hợp cho quá trình nuơi cấy vi sinh vật. Thí nghiệm đƣợc bố trí với các cơng thức nhƣ sau: - Cơng thức 1: Urê ((NH2)2CO) – lƣợng nitơ 0,28 g/l - Cơng thức 2: Kali nitrate (KNO3) – lƣợng nitơ 0,28 g/l - Cơng thức 3: Ammonium sulphate ((NH4)2SO4) – lƣợng nitơ 0,28 g/l - Cơng thức 4: Urê ((NH2)2CO) – lƣợng nitơ 0,14 g/l - Cơng thức 5: Kali nitrate (KNO3) – lƣợng nitơ 0,14 g/l - Cơng thức 6: Ammonium sulphate ((NH4)2SO4) – lƣợng nitơ 0,14 g/l - Cơng thức 7: Khơng bổ sung nitơ Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa. Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên mơi trƣờng WA Cách thực hiện - Dùng cây đục lỗ đƣờng kính 5 mm khoang lỗ thạch trên sinh khối nấm bệnh. - Dùng dao mỗ cấy truyền lỗ thạch sang đĩa petri chứa mơi trƣờng PDA. Ghi chú tên nấm, ngày giờ cấy và đem ủ ở nhiệt độ phịng. Chỉ tiêu theo dõi: Đo đƣờng kính tản nấm sau 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy. d + d Đƣờng kính đƣợc tính theo cơng thức: = 1 2 2 (Trong đĩ, d1 và d2 là hai đƣờng chéo tản nấm phân bố). 44
Đồ án tốt nghiệp 2.3.1.3. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma spp. với nấm Cochliobolus lunatus (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2012; Tơ Duy Khương, 2007) a. Nguyên tắc Trong quần thể vi sinh vật, các lồi vi sinh vật tác động qua lại, lồi này cĩ khả năng kiểm sốt và điều hịa số lƣợng của lồi khác qua cơ chế đối kháng hay cạnh tranh. b. Bố trí thí nghiệm gồm các nghiệm thức sau - Nấm Trichoderma virens đối kháng với nấm Cochliobolus lunatus - Nấm Trichoderma harzianum đối kháng với nấm Cochliobolus lunatus - Mẫu đối chứng nấm Cochliobolus lunatus Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức lăp lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa. c. Tiến hành thí nghiệm - Đối với đĩa cấy đối kháng, dùng khoan thạch hình trụ, đƣờng kính 5 mm, vơ trùng, khoan lấy một phần thạch ở trên khuẩn lạc nấm bệnh, chọn vị trí cĩ nhiều bào tử nấm, đặt vào đĩa petri cĩ đƣờng kính 90 mm trong mơi trƣờng PDA dùng cho nuơi cấy khảo sát tính đối kháng. Đặt khoan thạch cách mép đĩa petri 1,0 cm. - Sau đĩ, hai ngày dùng khoan thạch cĩ đƣờng kính 5 mm, khoan lấy khuẩn lạc nấm Trichoderma đặt vào đĩa petri cũng cách mép đĩa petri 1,0 cm nhƣng ở phía đối diện với nấm bệnh. - Ở đĩa đối chứng, ta cũng khoan thạch nấm bệnh bằng khoan hình trụ với đƣờng kính 5 mm, đặt khoan thạch vào đĩa petri cùng loại chứa mơi trƣờng PDA vơ trùng, khoan thạch cách mép đĩa petri 1,0 cm. d. Chỉ tiêu theo dõi 45
Đồ án tốt nghiệp Chỉ tiêu theo dõi đƣợc thực hiện trong thử nghiệm này là phần trăm ức chế sự phát triển hệ sợi nấm và số ngày đối kháng lại hồn tồn nấm bệnh của Trichoderma: sau 3, 5, 7, 10 ngày và sau khi quan sát thấy sự đối kháng xảy ra hồn tồn. e. Đánh giá hiệu quả đối kháng Hiệu quả đối kháng đƣợc đánh giá bằng cách đo đƣờng kính khuẩn lạc nấm bệnh (R2) và đƣờng kính của khuẩn lạc nấm bệnh trong đĩa đối chứng (R1). Các số liệu R − R đƣợc tính tốn theo cơng thức (Esposito và Silva, 1998) là: 푃 = 1 2 × 100% R1 Sau khi đo và tính phần trăm ức chế sự phát triển hệ sợi nấm sau 3, 5, 7, 10 ngày, việc theo dõi vẫn tiếp tục để ghi nhận thời gian Trichoderma đối kháng lại hồn tồn nấm bệnh thực vật. Thời gian mọc che kín khuẩn lạc nấm bệnh đƣợc ghi nhận cho từng chủng Trichoderma kể cả những chủng mọc che kín sớm nhất và muộn nhất. Tuy nhiên, thời gian tối đa cho thí nghiệm là 10 ngày. R1 R2 R1 Hình 2.4. Phƣơng pháp cấy đối kháng 2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu Tiến hành xử lý số liệu thống kê trong Statgraphics theo trình tự: - Xử lý số liệu của kết quả nghiên cứu - So sánh các tham số đặc trƣng của hai hay nhiều kết quả nghiên cứu 46
Đồ án tốt nghiệp Phép phân tích phƣơng sai ANOVA và giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với độ tin cậy 95%. 47
Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nhận dạng, phân lập và xác định nấm bệnh 3.1.1. Kết quả phân lập Trên cơ sở các mẫu thanh long vừa mới bị bệnh thu thập tại các vƣờn thanh long ở Châu Thành, Long An. Sinh viên đã phân lập đƣợc 3 loại nấm cĩ những đặc điểm hình thái tƣơng đối khác nhau và tần suất xuất hiện (bảng 3.1) cũng hồn tồn khác nhau. Cụ thể nhƣ sau: Bảng 3.1. Thành phần nấm phân lập đƣợc trên cành thanh long bị bệnh đốm trắng Tần suất xuất hiện (%) Trung bình Chủng nấm Lần 1 Lần 2 Lần 3 (%) N1 50 50 100 66,67 N2 20 50 0 23,33 N3 30 0 0 10 3.1.1.1. Chủng nấm N1 Đặc điểm đại thể: Khi quan sát hình thái đại thể của chủng nấm N1, tản nấm trịn, khi mới mọc mặt trên tản nấm cĩ màu trắng, sau đĩ cĩ màu nâu, từ nâu sang nâu đen, giống lơng, mịn nhƣ nhung, kết cấu giống len, sắp xếp lỏng lẻo, sợi nấm phát triển nhanh trên mơi trƣờng thạch khoai tây (PDA). Mặt dƣới tản nấm cĩ màu đen. Đặc điểm vi thể: Khi quan sát dƣới kính hiển vi quang học ở vật kính 100X, bào tử của chúng cĩ vách ngăn, bào tử tách ra hoặc nằm theo nhĩm, thẳng hoặc uốn cong, cĩ màu nhạt đến màu nâu sẫm. Bào tử cĩ khoảng 3 vách ngăn, 4 tế bào. Các tế bào đầu tiên và cuối cùng thƣờng cĩ màu nâu nhạt hơn ở giữa. 48
Đồ án tốt nghiệp a b c d e f Hình 3.1. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N1 (a. Mặt trƣớc tản nấm, b. Mặt sau tản nấm, c. Hình thái sợi nấm vật kính 10X, d, e, f. Hình thái sợi nấm, bào tử vật kính 100X) Sau khi phân lập vết bệnh từ cành thanh long ruột trắng bị bệnh đốm trắng, tần suất xuất hiện trung bình của chủng nấm N1 ở cả 3 lần phân lập là 66,67% (bảng 3.1). Chủng nấm này tăng trƣởng nhanh trên mơi trƣờng PDA. Đƣờng kính trung bình tản 49
Đồ án tốt nghiệp nấm ở 3, 5, 7 ngày sau cấy lần lƣợt là 50,67 ± 2,08 (mm), 81,67 ± 1,53 (mm), 89 ± 1 (mm) (bảng 3.2). Bảng 3.2. Đƣờng kính trung bình (mm) của tản nấm N1 trƣớc Koch Ngày sau cấy Mẫu nấm 3NSC 5NSC 7NSC 49 83 90 53 82 88 N1 50 80 89 Đƣờng kính trung 50,67 ± 2,08 81,67 ± 1,53 89 ± 1 bình Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, NSC: Ngày sau cấy a b c Hình 3.2. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N1 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b), 7NSC (c) Về đặc điểm đại thể nhƣ hình dạng, màu sắc tản nấm, sự phát triển của sợi nấm trên mơi trƣờng PDA, chủng nấm N1 rất giống với nghiên cứu của Nguyễn Thành Hiếu và ctv (2014).Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thành Hiếu và ctv (2014), chủng nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long thuộc lồi Neoscytalidium dimidiatum. Hình thái bào tử của nấm Neoscytalidium dimidiatum ban đầu cĩ màu trắng sau đĩ chuyển sang màu xám đen rất nhanh. Sợi nấm cĩ màu nâu đến nâu sậm. Tản nấm trịn, phát triển nhanh trên mơi trƣờng PDA. Tuy nhiên, về đặc điểm vi thể lại cĩ sự khác biệt. Đặc điểm vi thể giống lồi Bipolaris crustacean trong nghiên cứu của Nguyễn Thành Hiếu và ctv (2012). Trong nghiên cứu của Nguyễn Thành Hiếu và ctv (2012) cho rằng 50
Đồ án tốt nghiệp lồi này cĩ đặc điểm vi thể, bào tử cĩ màu nhạt đến nâu, cĩ vách ngăn, hơi cong hoặc uốn quặp. Sau khi so sánh đặc điểm đại thể, vi thể của chủng nấm N1 với các nghiên cứu trƣớc, chủng nấm N1 giống với lồi Neoscytalidium dimidiatum về đặc điểm đại thể (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014) nhƣng lại giống với lồi Bipolaris crustacean về đặc điểm vi thể (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2012), chƣa thể khẳng định chủng nấm N1 thuộc lồi nào trong 2 lồi kể trên. 3.1.1.2. Chủng nấm N2 Đặc điểm đại thể: Khi quan sát hình thái tản nấm chủng nấm N2, mặt trên tản nấm cĩ màu trắng hơi ngả sang màu kem, hình thể tơi xốp, ở giữa phồng lên nhƣ bơng gịn. Sợi nấm đan xen vào nhau và phát triển rất nhanh trên mơi trƣờng PDA. Mặt dƣới tản nấm cĩ vịng trịn đồng tâm, cĩ màu vàng nhạt đến vàng cam hơi hồng. Đặc điểm vi thể: Qua quá trình quan sát bằng kính hiển vi quang học ở vật kính 100X, bào tử nấm cĩ kích thƣớc lớn, cĩ hình dạng lƣỡi liềm, dạng cong quẹo hoặc thon dài. Bào tử cĩ 3 đến 5 vách ngăn đƣợc hình thành trên bọc giả gắn trên các tế bào sinh bào tử rất dài hoặc trên các cành bào phân sinh nhánh. 51
Đồ án tốt nghiệp a b c d Hình 3.3. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N2 (a. Mặt trên tản nấm, b. Mặt dƣới tản nấm) Khi phân lập tác nhân gây bệnh trên cành thanh long ruột trắng bị bệnh đốm trắng, phân lập đƣợc chủng nấm N2 với tần suất xuất hiện trung bình là 23,33% qua 3 lần phân lập. Chủng nấm N2 phát triển nhanh trên mơi trƣờng PDA với đƣờng kính trung bình tản nấm qua 3, 5, 7 ngày sau cấy lần lƣợt là: 42,67 ± 2,52 (mm), 74,5 ± 0,5 (mm), 89,67 ± 0,58 (mm) (bảng 3.3). 52
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Đƣờng kính trung bình (mm) của tản nấm N2 Ngày sau cấy Mẫu nấm 3NSC 5NSC 7NSC 43 75 90 45 74 89 N2 40 74,5 90 Đƣờng kính trung 42,67 ± 2,52 74,5 ± 0,5 89,67 ± 0,58 bình Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, NSC: Ngày sau cấy a b c Hình 3.4. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N2 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b), 7NSC (c) Đối chứng với tài liệu của Nguyễn Văn Bá và ctv (2005), Vũ Triệu Mân (2012) và Agrios (2005), đặc điểm hình thái và đặc điểm vi thể đặc trƣng nhƣ tản nấm phồng lên ở giữa giống bơng gịn, tản nấm cĩ màu trắng tới màu kem. Bào tử cĩ kích thƣớc lớn cĩ vách ngăn thuộc chi Fusarium. Chủng nấm N2 cĩ đặc điểm đại thể và vi thể mơ tả hồn tồn giống với chi Fusarium. Tuy nhiên, chủng nấm Fusarium cĩ thể khơng phải là tác nhân gây bệnh chính trên cành thanh long, bởi vì tần suất xuất hiện chỉ cĩ 23,33% qua 3 lần phân lập. 3.1.1.3. Chủng nấm N3 Đặc điểm đại thể: Khi quan sát hình thái đại thể tản nấm N3, mặt trên tản nấm cĩ màu trắng đến trắng xám nhạt hoặc xám đậm, ở giữa hơi phồng lên và phát triển nhanh 53
Đồ án tốt nghiệp trên mơi trƣờng thạch khoai tây PDA. Mặt dƣới cĩ màu vàng nhạt đến cam nhạt với những đốm trịn nhỏ cĩ màu đen nằm rãi rác. Đặc điểm vi thể: Khi quan sát qua kính hiển vi quang học ở vật kính 100X, bào tử chủng nấm 3 cĩ hình que, khuẩn ty phân nhánh, cĩ vách ngăn. Cuống bào tử khơng cĩ vách ngăn, bào tử cĩ hình que, trong suốt. a b c d Hình 3.5. Hình thái đại thể và vi thể của chủng nấm N3 (a. Mặt trƣớc tản nấm, b. Mặt sau tản nấm, c, d. Bào tử nấm) Qua quá trình phân lập tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long, tần suất xuất hiện trung bình của chủng nấm N3 sau 3 lần phân lập là 10%. Tần suất xuất hiện thấp nhất trong 3 chủng phân lập đƣợc. Chủng nấm N3 sinh trƣởng và phát triển trên mơi trƣờng PDA với đƣờng kính trung bình tản nấm ở 3, 5, 7 ngày sau cấy lần lƣợt là: 43,67 ± 2,08 (mm), 73,67 ± 0,29 (mm), 89,33 ± 1,15 (mm) (bảng 3.4). 54
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Đƣờng kính trung bình (mm) tản nấm N3 Ngày sau cấy Mẫu nấm 3NSC 5NSC 7NSC 46 73,5 90 43 74 90 N3 42 73,5 88 Đƣờng kính trung 43,67 ± 2,08 73,67 ± 0,29 89,33 ± 1,15 bình Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa ± SD, NSC: Ngày sau cấy. a b c Hình 3.6. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N3 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b), 7NSC (c) Đối chứng với tài liệu của Nguyễn Văn Bá và ctv (2005), Vũ Triệu Mân (2012) và Agrios (2005), tản nấm Colletotrichum cĩ màu trắng đến xám nhạt, giống bơng gịn, sợi nấm mảnh, phân nhánh, khơng màu, cĩ vách ngăn. Nấm này sinh sản bằng bào tử, bào tử khơng cĩ vách ngăn, bào tử thon nhọn khơng phân nhánh. Chủng nấm N3 cĩ những đặc điểm giống với mơ tả của tác giả nên kết luận chủng nấm N3 là nấm Colletotrichum. Tuy nhiên, chủng nấm Colletotrichum khơng phải là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long do qua 3 lần phân lập tần suất xuất hiện chỉ cĩ 10%. 3.1.2. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch Qua quá trình phân lập, kết quả phân lập đƣợc 3 loại nấm với tần suất xuất hiện khác nhau. Vì vậy để xác định 3 loại nấm là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cành 55
Đồ án tốt nghiệp thanh long. Sinh viên đã tiến hành nhiễm lại các nấm phân lập đƣợc từ cành thanh long bị bệnh đốm trắng lên cành thanh long khỏe. Kết quả đƣợc thể hiện nhƣ sau: Bảng 3.5. Tỷ lệ bệnh của 3 loại nấm trên cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo Số cành Tỷ lệ các Số vết Tỷ lệ vết thanh long cành Cơng thức bệnh bị bệnh xuất nhiễm nhiễm nhiễm hiện bệnh bệnh Đối chứng (nƣớc cất) 4 cành 40 0 0 Fusarium 4 cành 40 0 0 Colletotrichum 4 cành 40 0 0 Chủng nấm N1 4 cành 40 100% 90% a b c d e Hình 3.7. Cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo (a. Đối chứng, b. Fusarium, c. Colletotrichum, d và e. Chủng nấm N1) Từ số liệu bảng 3.5 cho thấy, nấm Fusarium và Colletotrichum cĩ tỷ lệ vết bệnh xuất hiện giống cơng thức đối chứng là khơng cĩ vết bệnh nào xuất hiện sau khi lây bệnh nhân tạo. Chẳng những khơng xuất hiện vết bệnh mà ở cả 3 cơng thức: đối chứng, nhiễm nấm Fusarium và nhiễm nấm Colletotrichum cành thanh long vẫn phát triển bình thƣờng và lên chồi mới. Chứng tỏ nấm Fusarium và Colletotrichum hồn tồn khơng gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long ruột trắng. Đồng thời, ở kết quả phân 56
Đồ án tốt nghiệp lập tác nhân gây bệnh đốm trắng, tần suất xuất hiện của hai chủng nấm Fusarium và Colletotrichum lần lƣợt là 23,33% và 10% sau 3 lần phân lập. Nấm Fusarium cĩ thể là nấm hoại sinh do nấm Fusarium phân lập đƣợc khi vết bệnh đem cấy đã cũ hoặc lâu ngày. Khi đĩ, vết bệnh cĩ dấu hiệu bị hỏng nên nấm Fusarium dễ xuất hiện hơn. Sở dĩ, chúng xuất hiện ở vết bệnh hỏng là do nấm Fusarium thuộc loại nấm ký sinh cơ hội, khi đối tƣợng ký chủ cĩ dấu hiệu hỏng thì nấm Fusarium sẽ tấn cơng và ký sinh lên trên vất bệnh đĩ. Theo Nguyễn Văn Bá và ctv (2005), nấm Fusarium thuộc lớp phụ Hypomycetes. Lớp này phần lớn là nấm hoại sinh hoặc ký sinh trên thực vật. Đối với nấm Colletotrichum, nấm này cĩ thể là nấm gây bệnh thán thƣ trên thanh long do nấm này cĩ phổ ký chủ rộng, chúng cĩ thể tồn tại trong xác bã thực vật trong vƣờn. Sở dĩ phân lập đƣợc nấm Colletotrichum cĩ thể do trong quá trình phân lập lấy ở vị trí gần vết đốm vàng gần mép cành. Đối với chủng nấm N1, đây là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long, sau khi lây bệnh nhân tạo theo phƣơng pháp Koch, tỷ lệ các cành nhiễm bệnh là 100% và tỷ lệ vết bệnh xuất hiện là 90%. Ngồi ra, ở những vị trí vết bệnh xuất hiện, qua thời gian dài, vết bệnh bắt đầu lan rộng về diện tích và chuyển sang màu đen, cĩ thể là do cĩ những sợi nấm mọc trên vết bệnh. Với kết quả này, lại một lần nữa khẳng định chủng nấm N1 là tác nhân chính gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long. Tuy nhiên, để xác định chính xác tác nhân cũng nhƣ để chứng minh những nghi ngờ trên đúng là tác nhân chính gây bệnh đốm trắng trên thanh long, một căn bệnh đang là nổi lo, nổi bức xúc của các nhà vƣờn, sinh viên tiến hành phân lập lại tác nhân gây từ vết bệnh ở những cành thanh long bị nhiễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo theo phƣơng thức Koch. Kết quả phân lập lại đƣợc thể hiện trong bảng 3.6 57
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6. Hình thái chủng nấm N1 trƣớc Koch và sau Koch Chỉ tiêu quan sát Trƣớc Koch Sau Koch Tản nấm khi mới mọc, Tản nấm trịn cĩ hình thể mặt trƣớc cĩ màu trắng, giống nhƣ lơng, mịn, dày, sau đĩ cĩ màu nâu, từ màu ban đầu cĩ màu trắng sau Hình thái tản nấm nâu sang nâu đen, giống đĩ chuyển qua màu nâu lơng, min nhƣ nhung hoặc đến nâu đen. Mặt sau tản kết cấu lỏng lẻo. Mặt dƣới nấm cĩ màu đen khơng cĩ tản nấm cĩ màu đen vịng trịn đồng tâm. Sợi nấm cĩ vách ngăn, Sợi nấm cĩ màu xám đến khơng màu chuyển thành Hình thái sợi nấm nâu, cĩ vách ngăn màu nâu hoặc nâu sậm khi già Bào tử của chúng cĩ vách ngăn, bào tử tách ra hoặc Bào tử cĩ 3 vách ngăn, 4 nằm theo nhĩm, thẳng tế bào, bào tử tách ra hoặc Hình dạng bào tử hoặc uốn cong. Bào tử cĩ nằm theo nhĩm, thẳng 3 vách ngăn, 4 tế bào, hoặc cong, cĩ màu từ nhạt hiếm khi cĩ 4 vách ngăn, đến sậm khi già. cĩ màu nhạt đến nâu sậm. Đƣờng kính tản nấm (mm) 81,67 ± 1,53 82,33 ± 3,79 sau 5 ngày nuơi cấy Nhƣ vậy, sau khi so sánh các đặc điểm đặc trƣng về hình thái tản nấm, sợi nấm, bào tử và đƣờng kính tản nấm ở 5 ngày sau cấy của chủng nấm N1 trƣớc Koch và sau Koch đều cĩ những đặc điểm mơ tả hồn tồn giống nhau. Điều này cĩ thể khẳng định chắc chắn rằng tác nhân gây bệnh trên cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo chính 58
Đồ án tốt nghiệp là nấm gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long thu thập đƣợc trong vƣờn của nơng dân. Để xác định tên khoa học của chủng nấm N1 gây bệnh đốm trắng trên thanh long, sinh viên đã gửi chủng nấm đi định danh tại phịng xét nghiệm của Cơng ty Nam Khoa – Biotek. Kết quả định danh bằng sinh học phân tử sau khi giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH, cho kết quả hồn tồn khác với kết quả nghi ngờ của chúng tơi. Kết quả này cho thấy chủng nấm Cochliobolus lunatus mới chính là tác nhân chính gây bệnh đốm trắng trên thanh long. Kết quả này cĩ phần khác với kết quả của Nguyễn Thành Hiếu và ctv (2014). Trong nghiên cứu của Nguyễn Thành Hiếu và ctv (2014), tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long là do nấm Neoscytalidium dimidiatum. Hình 3.8. Kết quả giải trình tự gen 28S rRNA 59
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.9. Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH 3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus 3.2.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus Ánh sáng là một trong những yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuơi cấy vi sinh vật. Đối với các điều kiện chiếu sáng khác nhau, sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật cũng khác nhau. Do đĩ, việc khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện chiếu sáng khác nhau là cần thiết nhằm tìm ra điều kiện, nguyên nhân phát triển của nấm bệnh và phƣơng pháp phịng trừ bệnh thích hợp. Thế nên sinh viên đã khảo sát ảnh hƣởng của 2 điều kiện chiếu sáng (24 giờ chiếu sáng, 12 giờ sáng: 12 giờ tối). Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.7. 60
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên mơi trƣờng PDA với các điều kiện chiếu sáng khác nhau khi nuơi cấy ở nhiệt độ phịng Mẫu Đƣờng kính tản nấm Ánh sáng nấm 1NSC 2NSC 3NSC 4NSC b b b SLT 17,17 ± 0,72 23,33 ± 0,76 28 ± 1 30,75 ± 0,66 TL a a a trƣớc 12S: 12T 17,25 ± 0,43 27,33 ± 0,29 36,83 ± 0,76 45,33 ± 0,58 Koch CV % 3,10 9,27 15,13 15,96 b b b b SLT 17,09 ± 0,87 31,25 ± 1,30 39,08 ± 2,79 45,33 ± 2,89 TL sau a a a a 12S: 12T 19,25 ± 0,43 40,17 ± 0,38 53,08 ± 0,88 68,67 ± 1,26 Koch CV % 7,37 13,89 17,11 22,69 Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, NSC: Ngày sau cấy, TL trước Koch: Mẫu nấm Cochliobolus lunatus phân lập trên cành thanh long bị bệnh, TL sau Koch: Mẫu nấm Cochliobolus lunatus phân lập từ cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo, CV: Hệ số biến thiên, SLT: Sáng liên tục (hay 24 giờ chiếu sáng), 12S:12T: 12 giờ sáng: 12 giờ tối, các chữ cái trên cùng 1 cột cĩ sự khác biệt với mức ý nghĩa 95%. Kết quả nghiên cứu với điều kiện chiếu sáng (24 giờ chiếu sáng và 12 giờ sáng: 12 giờ tối) đƣợc trình bày ở bảng 3.7 cho thấy các mẫu nấm Cochliobolus lunatus đều cĩ khả năng sinh trƣởng và phát triển. Mẫu nấm Cochliobolus lunatus trƣớc Koch đƣờng kính trung bình ở 2 điều kiện chiếu sáng khác biệt khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê ở 1NSC. Tuy nhiên ở 2NSC, 3NSC, 4NSC đƣờng kính trung bình lại cĩ sự khác biệt về mặt thống kê, đƣờng kính trung bình của mẫu nấm ở điều kiện chiếu sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối lớn hơn so với điều kiện 24 giờ chiếu sáng. Mức ánh sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối nấm sinh trƣởng và phát triển tốt hơn với đƣờng kính trung bình tản nấm sau 2NSC, 3NSC, 4NSC lần lƣợt là 27,33 (mm), 36,83(mm), 45,33 (mm). Đối với mẫu nấm Cochliobolus lunatus sau Koch, đƣờng kính trung bình ở 2 điều kiện chiếu sáng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê qua các ngày sau cấy. Điều kiện chiếu sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối, nấm sinh trƣởng và phát triển tốt hơn điều kiện 61
Đồ án tốt nghiệp chiếu sáng 24 giờ với đƣờng kính trung bình tản nấm qua 1NSC, 2NSC, 3NSC, 4NSC lần lƣợt là 19,25 (mm), 40,17 (mm), 53,08 (mm), 68,67 (mm). So sánh với kết quả nghiên cứu của Adeniyi, D.O. và ctv (2011), Y. K. Kim và ctv (2005), kết quả của sinh viên phù hợp với kết quả của các tác giả. Nhìn chung, ở điều kiện chiếu sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus. Điều này cĩ thể giải thích vì sao nấm gây bệnh đốm trắng trong vụ khơ phát triển thấp hơn trong vụ mƣa. Giải thích điều này là vì trong mùa khơ ẩm độ thấp và lƣợng mƣa ít hơn nên ít thuận lợi cho sự phát triển của nấm so với trong mùa mƣa. Mặt khác trong mùa khơ ngƣời nơng dân thƣờng chong đèn nên điều này cũng làm hạn chế sự phát triển của nấm. a b c d Hình 3.10. Đƣờng kính trung bình của nấm Cochliobolus lunatus ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau qua 4 ngày sau cấy (a. SLT trƣớc Koch, b. 12S:12T trƣớc Koch, c. SLT sau Koch, d. 12S:12T sau Koch) 3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng kích thước của nấm Cochliobolus lunatus Các yếu tố mơi trƣờng đặc biệt là pH ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm bệnh. Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hƣởng của yếu tố pH mơi trƣờng tới sự sinh trƣởng của nấm Cochliobolus lunatus là điều rất cần thiết để từ đĩ biết đƣợc khả năng sinh trƣởng thích hợp của lồi nấm này ở khoảng pH nào, từ đĩ đƣa biện pháp phịng trừ hiệu quả nhất. 62