Đồ án Tối ưu hóa quá trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria spp.

97 trang thiennha21 12/04/2022 5680

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Tối ưu hóa quá trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria spp.", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_toi_uu_hoa_qua_trinh_thuy_phan_tao_duong_glucose_tu_ro.pdf

Nội dung text: Đồ án Tối ưu hóa quá trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria spp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TẠO ĐƯỜNG GLUCOSE TỪ RONG VAUCHERIA SPP Ngành : MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD : CN ĐỖ THỊ TUYẾN SVTH : PHAN CẨM BÌNH MSSV : 0851110016 - LỚP: 08DSH3 TP. Hồ Chí Minh, 2012
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài: Việt Nam có đường bờ biển dài 3.260 km và vùng đặc quyền kinh tế rộng trên 1 triệu km2 với nguồn tài nguyên sinh vật biển khá phong phú. Trong đó, nguồn kinh tế khai khác từ rong, tảo mang lại lơi nhuận khá lớn của ngành kinh tế biển. Tảo được ứng dụng rộng rãi và rất nhiều trên thế giới trên quy mô công nghiệp với nhiều sản phẩm được chiết xuất từ tảo phục vụ trong nhiều lĩnh vực như : trong y học, công nghệ mỹ phẩm, công nghiệp thực phẩm, năng lượng xanh Hiện nay nước ta có khoảng 700 loài rong tảo thuộc 3 ngành Chlorophyta, Heterkontophyta, Rhodophyta. Nhiều loài mang lại giá trị kinh tế cao, có khoảng 121 loài đang được khai thác phục vụ nhu cầu con người. Với lợi thế về khí hậu nóng ẩm, và diện tích nước mặt nhiều nên rong tảo tại Việt Nam phát triển khá cao. Trong những năm gần đây, nguồn lợi từ rong tảo mang lại cho nước ta khá lớn. Nên như cầu khai thác cũng như tìm tòi, nghiên cứu những loài mới có ý nghĩa hết sức quan trọng. Tảo lục (Chlorphyta) là ngành lớn và rất đa dạng, phân biệt với các ngành tảo khác ở chỗ luôn có màu lục giống như ở thực vật. Đến nay trên toàn thế giới biết khoảng 500 chi và 8000 loài. Phần lớn chúng sống trong nước ngọt gần 90%, còn lại ở biển và đại dương hơn 10%. Trong các biển và đại dương thế giới đã biết 984 loài thuộc 112 chi , 18 họ và 8 bộ. Hiện nay có một số loại rong thuộc ngành rong lục Chlorophyta như Vaucheria Spp. là một loài mới đang trong quá trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học, thuộc ngành tảo vàng lục có phân bố nhiều ở những vùng nước ngọt nghèo chất dinh dưỡng phát triển tự nhiên khá nhiều ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long đã được khai thác và nuôi trồng rộng rãi. Một số loại rong cũng được nghiên cứu nuôi trồng kết hợp với thủy sản nhằm cải thiện môi trường nước và tăng năng suất tôm nuôi. Lợi ích mà nó mang lại khá lớn, không chỉ phục vụ như cầu sản xuất thực phẩm, y học, ngành công nghệ mỹ phẩm, chăn nuôi mà còn là nguồn nhiên liệu mới trong ngành công nghệ năng lượng, sản xuất xăng sinh học. Tuy nhiên, khả năng sử dụng tất cả các loài rong nói trên hay một trong số chúng làm nguyên liệu đầu vào để sản xuất Trang 1
Đồ án tốt nghiệp nhiên liệu sinh học lại phụ thuộc rất nhiều vào thành phần hóa sinh và khả năng đường hóa. Hiện nay, các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu về tiềm năng của việc sản xuất sinh nhiên liệu sinh học từ tảo và đã thu được nhiều kết quả khả quan từ nguồn nguyên liệu này. Và việc xác định các thành phần hóa sinh của rong tảo cũng như tối ưu hóa quá trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria Spp đóng vai trò quan trọng trong bước khởi đầu của việc tìm ra nguồn nguyên liệu phù hợp sản xuất xăng sinh học từ tảo. Đề tài “Tối ưu hóa quá trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria spp.” là nhu cầu cấp thiết giải quyết vấn đề trên. 2. Tình hình nghiên cứu: Tình hình nghiên cứu rong biển trên thế giới: Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu thực hiện theo nhiều khiá cạnh đa dạng sinh học, nguồn lợi, chế biến, nuôi trồng và tạo giống rong biển. Rong biển đã được nghiên cứu sử dụng trong thực phẩm, công nghiệp và dược phẩm ở nhiều nước trên thế giới. Các thành phần chiết xuất từ rong có giá trị sinh học như β- caroten, các chất chống oxy hóa cũng đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Rong biển rất giàu protein và khoáng chất, có thể tận dụng sử dựng thực phẩm và thức ăn gia súc. ( Akiko Isa et al., 2009) Một số nghiên cứu đề cập tới ảnh hưởng của các điều kiện nuôi tới thành phần hóa sinh của rong. Hàm lượng protein trong rong biển khá cao và chịu ảnh hưởng bởi các điều kiện nuôi như ánh sáng và dưỡng chất ( Evan &Langdon 2000; Rosen et al. 2000) Một số tác giả cũng đã tìm hiểu về cấu tạo thành phần các polysaccharide của tế bào rong Ulva spp, Enteromorpha sp (Kausik Chattopadhyay, 2006; Bimalendu Ray, 2006). Kết quả cho thấy các thành phần carbonhydrat có thể chiếm tới 29% tổng lượng chất khô của rong. Polysacchride thành tế bào của rong thường chứa các thành phần cellulose và hemicellulose có cấu trúc phân nhánh khá phức tạp với các đường monosaccharide như rhamnose, xylose, glucose, galactose, Trang 2
Đồ án tốt nghiệp chiếm tỉ lệ chính và một lượng nhỏ hơn protein và sulphate. Khác với tảo đỏ hay tảo nâu, các loài tảo lục thường không chứa thành phần polysaccharide có tính nhầy nhưa agar và alginic acid (Akiki Asa at el., 2009) . Hàm lượng lignin cũng rất thấp trong tế bào. Những đặc tính về hóa lý, tính chất lưu biến và sinh học đặc biệt của các thành phần carbonhydrat thành tế bào rong biển đã và đang mở ra nhiều cơ hội sử dụng chúng trong tương lai. Tình hình nghiên cứu rong biển trong nước: Ở Việt Nam các nghiên cứu nuôi trồng rong cũng được thực hiện khá nhiều nhưng chủ yếu ở các giống rong câu Gracilariace và rong sụn Kappaphycus.Một số loài rong như G. Bailinae cũng đã được nuôi trồng thử nghiệm ở miền Trung Việt Nam năng suất có thể đạt 8-10 tấn khô/ha trong thời gian nuôi 6 tháng (Huỳnh Quang Năng & Nguyễn Hữu Dinh, 1999). Một số nghiên cứu nuôi trồng kết hợp rong với các loài thủy sảnh khác cũng đã được thực hiện. Nguyễn Hữu Khánh và cộng sự (2005) đã thử nghiệm nuôi trồng kết hợp tôm hùm với bào ngư , rong sụn và vẹm xanh. Huỳnh Quang Năng (2005) Đã xây dựng mô hình trồng rong sụn Kappaphycus alvarezii luân canh trong ao đìa nuôi tôm ven biển. Kết quả thu được rất là khả thi trong việc khai thác tiềm năng nước mặt. Một số tác giả cũng đã nghiên cứu về tác động môi trường, khả năng xử lý ô nhiễm và sinh trưởng của rong trong những điều kiện khác nhau. Ngô Quốc Bưu và cộng sự (2000) đã nghiên cứu về sử dụng rong biển để xử lý nhiễm bẩn hữu cơ trong nước thải ao nuôi tôm. Kết quả cho thấy 2 loài nghiên cứu là Gracilacia hecteroclada và rong sụn Kappaphycus alvarezii đều thể hiện khả năng hấp thụ nitơ và phosphor trong nước thải. Đối với rong bún (Enteromorpha or Ulva) và rong Tóc Đốt Chaetomorpha những nghiên cứu đầu tiên về sinh hóa và tiềm năng ứng dựng của chúng được thực hiện bởi nhóm nghiên cứu của Viện Sinh học nhiêt đới trong khuôn khổ dự án FSPSII/SUDA 3.3.4 năm 2009 (do DANIDA tài trợ). Các loài rong này lọc tự nhiên trong các ao nuôi tôm ở Đồng bằng sông Cửu Long . Kết quả khảo sát sơ bộ cho Trang 3
Đồ án tốt nghiệp thấy, người nuôi tôm rất thích sự hiện diện của các loại rong này so với các loại rong khác và cho rằng sự xuất hiện của chúng đã cải thiện môi trường ao nuôi, làm thức ăn cho tôm và cải thiên năng suất tôm. Mặc dù rong có tiềm năng rất lớn để nuôi kết hợp tôm ở các vùng nước lợ, tuy nhiên, hiện nay, chưa có công trình nghiên cứu sâu nào để đánh giá hết vai trò của rong đối với môi trường ao nuôi, sức khỏe tăng trưởng của tôm. Tình hình nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học từ rong biển: Rong biển được coi là một trong những ứng viên tốt nhất cho con người trong việc tận dụng tài nguyên mặt nước và là đối tượng phù hợp để chuyển đổi cơ cấu nông nghiệp – thủy sản trong bối cảnh biến đổi khí hậu ở các vùng ven bờ và các vùng đất ngập mặn. Thực vật thủy sinh chưa bao giờ được xem xét một cách nghiêm túc làm nguồn cung cấp nhiên liệu sinh học cho mãi tới thời gian gần đây. Nhiều dự án khác nhau bắt đầu được thực hiện trong ba năm trời lại đây, là kết quả của yêu cầu giảm phụ thuộc vào lượng nước ngọt cho trồng trọt và chuyển hoá thực vật trên cạn. Nhật Bản là nước đi đầu trong nghiên cứu sử dụng rong lục (green algae) làm nguyên liệu đầu vào để sản xuất nhiên liệu sinh học. Akiko Isa (2009) đã xác định thành phần Carbonhydrate của một số loài rong Enteromorpha sp., Cheatomorpha sp., Cladophora sp., Ulva sp. Mọc tự nhiên ở Thái Lan, Việt Nam và Nhật. Kết quả cho thấy rong ở Việt Nam chứa hàm lượng glucose cao nhất (300mg/g sinh khối) và sử dụng cellulase có thể chuyển 95% carbonhydrate thành đường. Mặc dù rong biển đã bắt đầu được nghiên cứu sử dụng làm nguyên liệu đầu vào cho quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học tại nhiều nước trên thế giới nhưng hiện nay ở Việt Nam mới chỉ có đề tài của TS. Nguyễn Như Hậu – NITRA“Nghiên cứu đánh giá tiềm năng rong biển Việt Nam sử dụng làm nguyên liệu sản xuất ethanol nhiên liệu (Biofuel) đang được triển khai trong ba năm từ 2009 -2011, trong khuôn khổ đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm 2025 (Bộ Công Thương). Trang 4
Đồ án tốt nghiệp Ở Việt Nam, nhìn chung đã có nhiều công trình nghiên cứu về rong biển và nuôi trồng rong biển, tuy nhiên chưa có công trình nào về phát triển sinh khối rong biển tại vùng nuôi tôm trọng điểm ở ĐBSCL và dùng nguồn sinh khối này làm nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học và các sản phẩm có giá trị khác. Việc chuyển hóa nguồn carbohydrat thành đường có thể lên men và sau đó thành ethanol và butanol là một cách tiếp cận mới mẻ và có triển vọng. 3. Mục đích nghiên cứu: Tìm ra nguồn vật liệu khởi đầu thích hợp cho việc nghiên cứu chuyển hóa nguồn carbohydrat thành đường có thể lên men và sau đó thành ethanol và butanol từ rong biển thông qua hàm lượng đường khử sau quá trình thủy phân tạo glucose. Giải quyết vấn đề năng lượng mới. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu: Xác định thành phần hóa sinh của rong Vaucheria spp. Xác định các thông số thích hợp cho quá trình tiền xử lý mẫu rong trước khi tiến hành thủy phân tạo đường. Xác định các yếu tố ảnh hưởng quá trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân. 5. Phương pháp nghiên cứu: Các thành phần hóa sinh của rong được xác định theo phương pháp LAPS ( Standard compositional laboratory analytical procedure ) được mô tả bởi Dien et al. 2010. Theo đó thì Protein dược xác định bằng phương pháp Kjeldahl, Lipid được xác định bằng phương pháp Soxhlet; Các chỉ tiêu Carbohydrat tổng, đường tổng, tinh bột, chất xơ , hàm lượng tro và ẩm dược xác định theo phương pháp của FAO và AOAC. Xác định các yếu tố thích hợp cho quá trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp như nồng độ H2SO4 trong giai đoạn tiền xử lý mẫu, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, pH, thời gian, nhiệt độ trong quá trình ủ mẫu. Trang 5
Đồ án tốt nghiệp Định lượng hàm lượng glucose sau quá trình ủ mẫu được xác định theo phương pháp của Miller dựa trên việc đo mật độ quang của phức màu đỏ sậm đặc trưng được tạo ra giữa đường khử với thuốc thử DNS ở bước sóng 540nm. Định lượng hàm lượng HMF của mẫu sau khi ủ bằng phương pháp so màu quang phổ kế. Định lượng độ brix của mẫu bằng thiết bị khúc xạ kế. Các quá trình tối ưu hóa được tiến hành theo quy hoạch thực nghiệm bậc 2. Các thí nghiệm được lặp lại 2- 3 lần để đảm bảo độ tin cậy. Kết quả được tính toán, xử lý trên phần mềm excel 2007 và Statgraphics . 6. Dự kiến kết quả đạt được của đề tài Kết quả cho được các số liệu cụ thể về các chỉ tiêu sinh hóa của rong Vaucheria spp. Xác định được các yếu tố thích hợp để sử dụng cho quá trình thủy phân như nồng độ Enzyme, nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ, thời gian phản ứng. Xác định được hàm lượng carbohydrate, hàm lượng HMF, và độ brix có trong rong sau quá trình thủy phân. Trang 6
Đồ án tốt nghiệp Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát chung về rong, tảo: Rong tảo là những sinh vật có nhân thật, trong tế bào luôn có chất diệp lục nên chủ yếu sống tự dưỡng. Một số ít cộng sinh với Nấm thành Địa y. Rong tảo sống chủ yếu trong nước, một số ít sống trên đất ẩm hoặc trên vỏ cây. Từ thời Linné (1753), Tảo được coi như một nhóm tập hợp tất cả các “Thực vật bậc thấp” có diệp lục. Phần lớn các hệ thống phân loại công nhận quan điểm này. Theo quan điểm này, Tảo lam cũng nằm trong nhóm Tảo. Tuy nhiên, khi xét các đặc điểm về tế bào học và đặc biệt là sự có mặt của nhân thật dấu hiệu cơ bản nhất của sự tiến hóa, tảo lam vì chưa có nhân thật đã được tách khỏi nhóm tảo. Theo hệ thống sinh giới gồm 4 giới: nhóm tảo được xếp vào giới thực vật làm thành phân giới thực vật bậc thấp (theo P. Raven & G. Johnson (1989)) sự phân chia sinh giới nhất là nhóm có nhân chuẩn thành các giới đôi khi tùy tiện. Không có một hệ thống phân loại nào được toàn thế giới chấp nhận. Ngày nay, một số các nhà sinh học chấp nhận hệ thống sinh giới gồm 5 giới. Theo hệ thống này thì tảo được tách khỏi giới thực vật và được xếp vào giới Nguyên sinh (Protista). 1.1.1. Tổ chức cơ thể Tảo có cấu trúc rất đa dạng: đơn bào, tập đoàn hay đa bào. Mặc dù về cấu tạo, hình dạng, kích thước và màu sắc của tảo rất khác nhau nhưng các tảo cũng có 1 số điểm chung nhau như: Tảo có cơ thể dạng tản chưa phân hóa thành thân, rễ, lá gọi là tản thực vật (Thallophyta) và cũng chưa có các loại mô điển hình trong cấu trúc của tản. Tảo có một vài hình thức sinh sản cũng như môi trường phân bố gần giống nhau nên người ta thường gộp chúng thành một nhóm có ý nghĩa sinh học. 1.1.2. Cấu tạo tế bào Vách tế bào bằng cellulose và pectin. Một vài ngành tảo: Tảo silic, tảo vàng ánh: vách thấm thêm silic, hoặc tảo vòng, tảo đỏ: vách có thêm canxi cacbonat. Mỗi tế bào có 1 nhân, đôi khi nhiều nhân (ở tảo thông tâm). Trong chất nguyên sinh có những bản chứa chất màu (diệp lục và các chất màu phụ khác) gọi là Trang 7
Đồ án tốt nghiệp thể màu. Thể màu có hình dạng khác nhau: hình bản, sao, dải, hình mạng lưới, đĩa, hạt và ổn định với từng chi. Trong thể màu có những thể nhỏ là hạch tạo bột, chung quanh có các hạt tinh bột lắng tụ (ở tảo lục, tảo vòng). Những chất dự trữ khác là các hydratcacbon đặc biệt (laminarin, amylodextrin ) ở trong hoặc ngoài thể màu. Nhiều dạng tảo đơn bào còn có roi, số lượng có thể là 1, 2 hoặc nhiều. Các roi này xuất phát từ đầu cùng của tế bào, có chức năng vận chuyển. Roi có cấu tạo giống với roi của các sinh vật có nhân thật. Một số tảo còn có một chấm đỏ ở gốc roi gọi là điểm mắt là cơ quan thụ cảm ánh sáng. Một số tảo đơn bào nước ngọt có không bào co bóp. 1.1.3. Sinh sản Tảo cũng rất đa dạng trong sinh sản. Các hình thức sinh sản: sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính, nhiều tảo có sự xen kẽ thế hệ. 1.1.3.1. Sinh sản sinh dưỡng Được thực hiện bằng những phần riêng rẽ của cơ thể, không chuyên hóa về chức phận sinh sản. Ở các tảo đơn bào, sinh sản sinh dưỡng thực hiện bằng cách phân đôi tế bào. Ở các tảo tập đoàn có một số tế bào phân chia nhanh hình thành những tập đoàn nhỏ bên trong tập đoàn mẹ (ở tảo Volvox, tảo lưới). Ở các tảo dạng sợi thực hiện bằng cách đứt đoạn gọi là tảo đoạn hay hình thành chồi ở Tảo vòng (Chara). 1.1.3.2. Sinh sản vô tính Được thực hiện bằng các bào tử chuyên hóa, có roi (bào tử động) hay không roi (bào tử bất động), hình thành trong túi bào tử, về sau bào tử nảy mầm thành tản mới. 1.1.3.3. Sinh sản hữu tính Được thực hiện bằng sự kết hợp của những tế bào chuyên hóa là giao tử, hình thành trong các túi giao tử đơn bào. Trang 8
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào mức độ giống hay khác nhau của các giao tử mà có 3 hình thức sinh sản hữu tính: đẳng giao, dị giao và noãn giao. Ở một số tảo còn có quá trình sinh sản hữu tính đặc biệt theo lối tiếp hợp giữa hai tế bào sinh dưỡng và không tạo thành giao tử (ở Tảo xoắn). Một số tảo có sự xen kẽ thế hệ trong quá trình sống. Sự xen kẽ thế hệ có thể là đẳng hình hay dị hình. 1.1.4. Phân loại Hiện nay trên thế giới có rất nhiều hệ thống phân loại tảo của nhiều tác giả: hệ thống của Pascher (1931), hệ thống của West & Fritsch (1927) và Fritsch (1935), hệ thống của Chadefaud (1960), hệ thống của Chadefaud được Fett sửa đổi (1967). Các hệ thống phân loại này đều dựa vào màu sắc và cấu trúc tản để phân loại. Hiện nay con số các ngành Tảo vẫn chưa thống nhất. Gần đây nhiều tác giả thường xếp nhóm tảo vào 9 ngành sau đây: Tảo giáp (Pyrrhophyta), Tảo vàng ánh (Chrysophyta), Tảo vàng lục (Xanthophyta), Tảo mắt (Euglenophyta), Tảo silic (Bacillariophyta), Tảo lục (Chlorophyta), Tảo vòng (Charophyta), Tảo nâu (Phaeophyta) và Tảo đỏ (Rhodophyta). 1.1.5. Khái quát ngành Tảo lục (Chlorophyta) Tảo lục là ngành lớn và rất đa dạng, phân biệt với các ngành tảo khác ở chỗ luôn có màu lục giống như ở thực vật. Tổ chức cơ thể: Đơn bào, tập đoàn hay đa bào hình sợi đơn, phân nhánh hay hình bản mỏng, có khi có cấu tạo cộng bào (tản hình ống thông trong chứa nhiều nhân). Cấu tạo tế bào: Vách tế bào bằng cellulose, pectin hóa nhày, một số dạng nguyên thủy có tế bào trần. Thể màu có nhiều hình dạng khác nhau: hình bản, dải xoắn, sao, hạt chứa diệp lục a và b, carotin, xantophin, trong đó diệp lục a và b chiếm ưu thế so với các chất màu phụ khác nên tản luôn có màu lục. Trang 9
Đồ án tốt nghiệp Chất dự trữ là tinh bột tập trung quanh hạch tạo bột nằm trong thể màu, đôi khi chất dự trữ là những giọt dầu. Một số Tảo lục đơn bào hay tập đoàn có thể di động được ở trạng thái dinh dưỡng nhờ có roi, còn các tảo lục khác chỉ có bào tử hay giao tử có roi mới di động được. Sinh sản ở Tảo lục: Sinh sản sinh dưỡng: Tảo lục đơn bào sinh sản sinh dưỡng bằng phân đôi tế bào, tảo lục dạng sợi sinh sản sinh dưỡng bằng tảo đoạn. Sinh sản vô tính bằng động bào tử có 2 roi bằng nhau hay bào tử bất động. Sinh sản hữu tính bằng cả 3 hình thức: đẳng giao, dị giao và noãn giao, một số tảo lục Sinh sản hữu tính theo kiểu tiếp hợp. Phân bố và sinh thái: Tảo lục có khoảng 8.000 loài, phân bố rộng rãi khắp mọi nơi có ánh sáng, chủ yếu sống trong nước ngọt, một số trong nước mặn, trên đất ẩm, có khi trên thân cây hoặc bờ tường, vách đá ẩm; còn gặp những dạng kí sinh và cộng sinh. Một số đại diện thường gặp: Tảo lục đơn bào (chi Chlamydomonas): Tế bào hình trứng với 2 roi bằng nhau ở đầu, có điểm mắt ở gốc roi, trong chứa 1 thể màu lớn hình chén sống ở các ao hồ. Tảo tiểu cầu (chi Chlorella): Tảo đơn bào, hình cầu nhỏ, thể màu lõm hình chữ U chiếm gần hết khoang tế bào. Tế bào chứa lượng mỡ và đạm cao nên có giá trị trong chăn nuôi. Sống trong nước ngọt. Hiện nay có nhiều cơ sở đang nuôi loại tảo này để sản xuất thức ăn gia súc. Tảo cầu (chi Chlorococcus): Dạng cầu, lớn hơn loài trên, thể màu hình chén. Sống trong nước ngọt, trên vỏ cây, làm thành một lớp màu lục tươi. Tảo lưỡi liềm (chi Closterium): Tảo đơn bào, hình lưỡi liềm, nhân nằm giữa 2 thể màu hình bản, 2 đầu tế bào có 2 không bào co bóp. Thường gặp ở các ao hoặc rãnh nước bẩn, có khi sống với khuẩn lam dao động trân mặt đất ẩm. Trang 10
Đồ án tốt nghiệp Đoàn tảo (chi Volvox): Tập đoàn hình cầu, đường kính 0,52mm, gồm tới 2 vạn tế bào dàn ra ở phía ngoài, phía trong chứa chất nhầy. Gặp ở các ao tù nước ngọt. Tảo mắt lưới (chi Hydrodyction): Tập đoàn hình mạng lưới, các tế bào kết hợp với nhau thành những mắt lưới 4-6 cạnh, mỗi cạnh là một tế bào có nhiều nhân, ở giữa có 1 không bào lớn. Tảo xoắn (chi Spirogyra): Tảo dạng sợi, gồm nhiều tế bào hình chữ nhật dài, thể màu hình dải xoắn, trong thể màu chứa nhiều hạch tạo bột. Sinh sản hữu tính theo lối tiếp hợp. Tảo xoắn rất phổ biến ở nước ngọt, mọc thành đám ở mương rãnh hoặc ruộng lúa. Rau diếp biển (chi Ulva): Tản có dạng "lá" do 2 lớp tế bào tạo thành. Tản lớn, mép nguyên hay xẻ thành nhiều phiến. Phần gốc do những tế bào sinh dưỡng mất diệp lục kéo dài tạo thành rễ giả. Trong chu trình sống của tảo có xen kẽ thế hệ giống nhau (đẳng hình). Tảo thông tâm (chi Caulerpa): Tản khá lớn, phân hóa giống như "thân", "lá", "rễ" tuy chỉ là một ống liên tục, thường bám vào vách đá ven biển. 1.1.6. Khái quát về chi tảo Vaucheria spp Vaucheria thuộc lớp Tảo vàng lục (Xanthophyceae) Trang 11
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. phân loại sinh giới của chi Vaucheria spp Vaucheria Scientific classification Domain (Giới): Eukaryote Phylum (Ngành): Heterokontophyta Class ( Lớp ) : Xanthophyceae Order ( Bộ ) : heterosiphonales Family ( Họ ) : Vaucheriaceae Genus ( Chi ) : Vaucheria Tảo vàng lục khác với Tảo lục ở chỗ không có chlorophyll b và sản phẩm đồng hóa CO2 không phải là tinh bột mà là leucosin và lipid. Tảo vàng lục khác với Tảo vàng ánh và Tảo silic ở chỗ không có sắc tố Fucoxanthin và nhiều đặc điểm khác nữa. Hình thái tảo vàng lục rất đa dạng: hình monad, hình amíp, hình hạt Sống đơn độc hay thành tập đoàn. Một số có dạng sợi đơn hay phân nhánh, dạng ống thông suốt chứa nhiều nhân. Thành tế bào cấu tạo bởi cellulose. Các dạng monad và động bào tử của các dạng khác thường có 2 lông roi không đều nhau, cũng có khi có 1 hay nhiều lông roi (xếp thành từng đôi không đều, đính ở phía cực tế bào). Lông roi dài thường có lông và dài gấp 4-6 lần lông roi ngắn . Lông roi dài hướng về phía trước còn lông roi ngắn trơn nhẵn hướng xiên so với trục dọc hay hướng hẳn về phía sau. Thành tế bào nguyên vẹn, trừ chi Tribonema thành tế bào gồm hai mảnh. Sắc lạp có từ 2 dến 6 trong mỗi tế bào, có hình khay. Thành phần sắc tố gồm có chlorophyll a, c, carotenoid, xanthophyll. Tản thường có màu vàng lục. Sinh sản sinh dưỡng theo cách phân đôi tế bào hay từ một phần của tập đoàn. Sinh sản vô tính bằng động bào tử. Động bào tử có hai lông roi lệch nhau, có khi chỉ Trang 12
Đồ án tốt nghiệp có 1 lông roi. Thường động bào tử được sinh ra từ nang động bào tử (zoosporangium). Có loài sinh sản vô tính bằng bào tử bất động. Có loài sinh sản vô tính bằng tự thân bào tử (autospore) hay bằng bào tử màng dầy. Sinh sản hữu tính rất ít khi gặp ở Tảo vàng lục. Tribonema có hai loại giao tử- bất động và di động. Botrydium có giao tử chuyển động, đẳng giao hay dị giao. Tảo vàng lục thường gặp trong các thủy vực nước ngọt có độ dinh dưỡng trung bình hay nghèo. Chúng có đời sống phù du hay sống bám. Một số loài sống trên đất hay trên thân cây ẩm ướt. Tảo vàng lục có các chi phổ biến sau đây: Hình 1.1. Chi tảo Vaucheria (noãn giao) 1.2. Tổng quan về enzyme 1.2.1. Khái quát chung Enzyme theo tiếng Hi Lạp là chất trong nấm men, là một chất xúc tác sinh học chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật. Enzyme đóng một vai trò rất quan trọng trong việc tham gia xúc tác cho các phản ứng sinh hóa của tế bào cơ thể trong điều kiện đẳng nhiệt, đẳng áp“sự sống có thể được định nghĩa là được điều phối của các phản ứng enzyme” Enzyme tham gia xúc tác cho các phản ứng trong hoặc ngoài tế bào, với đặc điểm này đã được con người chúng ta ứng dụng enzyme vào cuộc sống. Mỗi enzyme có tính đặc hiệu riêng biệt với một phản ứng nhất định. Dưới tác dụng của enzyme các phản ứng sinh hóa xảy ra đạt hiệu quả cao, nhiều phản ứng xảy ra đồng thời theo dây chuyền, ít tiêu tốn năng lượng. Enzyme là protein có tính đặc hiệu cao và có hiệu quả hơn gấp nhiều lần so với các chất xúc tác vô cơ. Trang 13
Đồ án tốt nghiệp Enzyme là chất rất khó chế biến bằng phương pháp tổng hợp hóa học mà nó được thu từ các nguồn vi sinh vật, thực vật, động vật vì vậy việc sử dụng chúng an toàn. Enzyme được thu từ nhiều nguồn khác nhau nhưng chỉ có nguồn enzyme từ vi sinh vật mới đáp ứng được nhu cầu và sản xuất trên quy mô công nghiệp. Các enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính cao, đa dạng, dễ thu nhận. Đặc biệt là nguyên liệu sản xuất enzyme từ nguồn vi sinh vật đa dạng, phong phú, dễ kiếm và rẻ tiền. Hiện nay người ta khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme thu được ở dạng tinh thể. Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc biệt như công nghiệp chế biến thực phẩm như bia, rượu, nước chấm,bánh mỳ 1.2.2. Lịch sử phát triển Trang 14
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2. Tóm tắt lịch sử phát triển của enzyme stt Năm Nội dung nghiên cứu, phát triển 1 1833 Payen và peoz tách được diatase từ malt. 2 1874 Hansen là người đầu tiên tách được gen từ bào tử cừu. 3 1876 Kiihne đầu tiên gọi chất xúc tác sinh học là enzyme. 4 1897 Hai anh em Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men có thể chuyển hóa đường glucose thành cồn và CO2. 5 1900 Rohm sử dụng protease vào công nghiệp thuộc da và tẩy rửa. 6 1926 Samner kết tinh được uerase và Northrop kết tinh được protease. Fleming phát hiện ra penicilline. 7 1928 Bắt đầu sản xuất kháng sinh theo quy mô công nghiệp. Sử dụng 8 1930 – 1945 glucoamylase thủy phân tinh bột. Boyeretal đưa ra kỹ thuật di truyền và được ứng dụng vào công 9 1972 nghệ enzyme sau này. Nito xác lập quy trình cơ bản tạo acrylamide và một loạt các quá 10 1984 trình sản xuất có sự tham gia của enzyme. Là giai đoạn của việc tạo ra hàng trăm loại enzyme khác nhau. 11 1984 - nay Enzyme được ứng dụng rộng rãi trong đời sống con người. Kỹ thuật enzyme cố định ra đời đã đưa công nghệ enzyme lên tầm cao mới 1.2.3. Tính chất của enzyme Bản chất sinh học Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen. Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản ứng cả trong và ngoài tế bào. Một gen một enzyme một phản ứng Trang 15
Đồ án tốt nghiệp Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau từ sinh vật, các enzyme thu nhận từ nguồn sinh vật như rau quả thông dụng không có tính chất gây độc. Đa số enzyme hoạt động xúc tác phản ứng trong điều kiện nhiệt độ 20 – 450C, 1atm, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính. Mỗi enzyme tham gia xúc tác đặc hiệu với một cơ chất nhất định, vận tốc phản ứng tăng gấp nhiều lần so với chất xúc tác sinh học vì vậy enzyme cần dùng với lượng rất nhỏ. Có thể điều chỉnh hay ngừng phản ứng bằng nhiệt độ, pH, thời gian xúc tác Bản chất hóa học Gồm hai nhóm: Nhóm enzyme đơn cấu tử: Enzyme chỉ được cấu tạo bởi một thành phần duy nhất là protein. Nhóm enzyme đa cấu tử: Là những loại enzyme mà được cấu tạo bởi hai thành phần gồm: Một thành phần là protein. Thành phần không phải protein. Thành phần này là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác 1.2.4. Nguồn thu nhận enzyme Hiện nay người ta có nhiều cách thu nhận enzyme từ các nguồn sau: Nguồn enzyme từ động vật Enzyme có thể lấy từ các tuyến dịch hoặc trên các bộ phận khác trên cơ quan tiêu hóa như: Tuyến tụy, dạ dày, màng nhầy, tim chủ yếu cho enzyme protease. Ưu điểm: Các enzyme lấy từ nguồn động vật có hoạt tính khá cao và ổn định Nhược điểm: Thu nhận khó, hiệu quả thu nhận và hiệu quả kinh tế không cao. Có nhiều rủi ro và không ổn định về nguồn nguyên liệu. Trang 16
Đồ án tốt nghiệp Chưa có nghiên cứu nào nhằm tạo ra giống động vật với mục đích thu nhận enzyme Nguồn enzyme từ thực vật Trong các bộ phận của thực vật có chứa rất nhiều enzyme và có hoạt tính rất cao. Phần lớn gồm các loại sau: Enzyme amylase: Từ đại mạch nảy mầm (malt). Enzyme papain: Từ quả đu đủ. Enzyme bromelin: Từ cây dứa. Enzyme ficin: Từ quả sung. Nhược điểm: Tuy các loài thực vật cho enzyme có hoạt tính cao nhưng cũng gặp rất nhiều khó khăn do lệ thuộc vào điều kiện thiên nhiên và thời gian thu hoạch dài, khó đáp ứng nhu cầu sử dụng. Nguồn enzyme từ vi sinh vật Đây là nguồn enzyme duy nhất được sử dụng để sản xuất enzyme trên quy mô công nghiệp, nó được quan tâm nhiều để phát triển về khối lượng và số lượng enzyme. Khác với nguồn động thực vật, các loài vi sinh vật là động vật đơn bào nên có những ưu điểm hơn hẳn như: Thời gian thu nhận enzyme tương đối ngắn, số lượng enzyme lớn Hoạt tính của enzyme từ nguồn vi sinh vật cao hơn các nguồn động vật, thực vật. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật cao trong thời gian ngắn nên có thể thu được lượng sinh khối sau nuôi cấy lớn. Từ đó ta có thể chiết xuất ra lượng lớn enzyme. Ưu điểm lớn nhất của vi sinh vật là chúng rất nhỏ nên dễ dàng được đưa vào các thiết bị lên men, từ đó sẽ rất dễ dàng điều khiển và kiểm soát các điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, ánh sáng, lưu thông khí nên ta có thể điều khiển được tốc độ sinh tổng hợp enzyme. Nguyên liệu dùng để nuôi vi sinh vật sản xuất enzyme là nguồn nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm, thường là các phế liệu của các ngành công nghiệp. Trang 17
Đồ án tốt nghiệp Có nhiều phương pháp để nuôi cấy và thu nhận enzyme từ vi sinh vật tùy vào điều kiện khác nhau như: Nuôi cấy trong môi trường lỏng, nuôi trên môi trường bán rắn, nuôi trên môi trường rắn. Hiện nay việc nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường bán rắn đang được tập trung nghiên cứu và được đánh giá là mang lại hiệu quả cao trong việc thu nhận enzyme 1.2.5. Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β -1, 4-O- glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác. Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1, 4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1, 4- glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất. Hình 1.2. Cấu trúc không gian của enzyme cellulase Trang 18
Đồ án tốt nghiệp Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase Một phức hệ enzyme cellulase gồm: endo-β-1,4-glucanase, exo-β-1,4- glucanase, β-glucosidase. Trong đó: Endo- β-1, 4-glucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose. Exo- β-1, 4-glucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cellulose. β -Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose. Hình 1.3. Cơ cấu chi tiết của các hoạt động beta-glucosidase của cellulase Tính chất lý hóa của enzyme cellulase Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định. Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-500C. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp. Hoạt tính của enzyme cellulase từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 550C. Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trường phản ứng. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ Trichoderma reesei là 4,0-5,0. Trang 19
Đồ án tốt nghiệp Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme. Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau. Các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X- 100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%. Ứng dụng của enzyme cellulase Enzym cellulase được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất cồn, trong xử lý môi trường. Enzym cellulase được ứng dụng rất ít trong thực phẩm (khoảng 1%) nhưng hầu như quá trình chế biến nào liên quan đến nguồn nguyên liệu là thực vật nếu có enzym cellulase đều cho hiệu suất cao hơn. Hơn nữa cellulase được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dệt, bột giặt, ngành công nghiệp giấy, cellulase còn được sử dụng cho các ứng dụng dược phẩm. 1.2.6. Giới thiệu sơ lược về enzyme Amylase Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước. RR’ + H-OH RH + R’OH Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế. Các enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Trong nước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loại động vật có vú thì không có như ngựa, chó, mèo Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ Amylase của tuyến tụy (còn Trang 20
Đồ án tốt nghiệp được gọi là amylopsin). Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men. Amylase là một trong những loại enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Đến nay người ta đã biết rất rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase là taka-Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình thể không gian cấu trúc bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau. Hình 1.4. Cấu trúc không gian của α-Amylase Cơ chế tác dụng của α-Amylase: Trang 21
Đồ án tốt nghiệp α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-Amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình đa giai đoạn: Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ). Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-Amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-Amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose ( vì vậy, người ta cho rằng α-Amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1 ). Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-Amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α- Amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại Amylase này là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch hóa. Trang 22
Đồ án tốt nghiệp Tính chất của α-Amylase α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-Amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme: α-Amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine. Trọng lượng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956; Fisher, Stein, 1960 ). Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 ). α-Amylase là một metalo Enzyme. Mỗi phân tử α-Amylase đều có chứa 1- 30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme ( Modolova, 1965 ). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các Enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-Amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-Amylase bền với nhiệt độ hơn các Enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các Amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại như : Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α-Amylase. Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết α-Amylase khá bền với tác động của protease như pepsin, trypsin, papain Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của Amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Nồng độ α-Amylase của VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α- Amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84 - 87%. Trang 23
Đồ án tốt nghiệp Điều kiện hoạt động của α-Amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-Amylase từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 ( có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5 - 5,8 ). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm Amylase từ Asp.orysee trong vùng 5,6 - 6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0 - 7,0. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-Amylase của Asp.orysee bền vững đối với acid tốt hơn là α-Amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH= 3,6 và 0oC, α-Amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút; α-Amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α- Amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ). Trong dung dịch α-Amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH= 5,0 - 5,5 ; α-Amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5-2,8. Ở 0oC và pH= 2,5 , nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-Amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-Amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 700C ( Kozmina, 1991 ). Trong dung dịch đệm pH = 4,7 , α-Amylase của Asp.orysee rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 - 85%. Ở 500C trong 2 giờ, α-Amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và cộng sự ). 1.2.7. Giới thiệu sơ lược về Enzyme Glucoamylase Cấu tạo: γ-Amylase ( glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase ) là những Enzyme có thể thuỷ phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch α-glucan để giải phóng ra ở dạng β. Glucoamylase hay γ-Amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật. Đặc biệt là kiểu nấm mốc aspergillus, penicillium và Rhizopus Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của Enzyme Trang 24
Đồ án tốt nghiệp Nói chung thì các amyloglucosidase đều chứa các gốc mêthioni, tritophan, và một nửa gốc cystein. Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt động của Enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ tất cả các amyloglucosidase từ nấm mốc đều là glucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong đó chủ yếu là các mono saccharid glucose mannose, galactose và glucosamin Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai isoEnzyme I và II khác nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng. Amyloglucosidase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại amyloglucosidase II không có cả hai tinh chất này . Cơ chế hoạt động: Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ phân được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ). Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thuỷ phân , cũng như kích thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân . Nhất là với các α-glucan mạch dài ( amylose và amylopectin ) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit. Tính chất: Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside. Khi thuỷ phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Enzyme này có nhiều tên gọi khác nhau: α-1,4 ,α-1,6-glucan-4; 6-glucohydrolase; glucoamylase; amyloglucosidase; taka-Amylase B; γ-Amylase Là Enzyme ngoại bào. Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside , glucoamylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside . Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột , glucogen , amylopectin , dextrin , panose , iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có sự tham gia cuả các loại Enzyme khác. Glucoamylase thuỷ giải các Trang 25
Đồ án tốt nghiệp polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ. Các polisaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh. Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ 500C . Nó bền với acid hơn α-Amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo vệ bởi Ca2+. 1.2.8. Giới thiệu sơ lược về enzyme Pectinase Pectin là một phân tử tương tự như tinh bột, khác ở chỗ đơn vị tuần hoàn của pectin là acid galacturonic thay vì glucose ở tinh bột. Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid galacturonic qua các liên kết -1,4- glucoside. Trong thực vật, pectin có chức năng tự nhiên như một chất keo để giữ thành tế bào cũng như các tế bào lại với nhau. Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80.000 – 200.000 Da. Pectin không hòa tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác. Pectin tan trong nước, NH3, dung dịch kiềm, Na2CO3 và trong glycerin nóng. Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả. Ứng dụng Pectinase được tạo ra trong suốt quá trình chín tự nhiên của một số quả (cùng với cellulase), chúng giúp làm mềm thành tế bào của quả. Phân loại Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Polygalacturonase: còn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết -1,4-glycoside. Trang 26
Đồ án tốt nghiệp Polymethylgalacturonase: hay còn gọi là -1,4-galacturonite- methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalacturonic acid đã được methoxyl hóa. Enzyme này lại được phân thành 2 nhóm nhỏ là endo-glucosidase- polymethylgalacturonase kiểu I và exo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu III. Polygalacturonase: enzyme tác dụng trên pectic acid (hoặc pectinic), cũng được chia thành 2 nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và exo- glucosidase-polygalacturonase kiểu IV. Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hóa. Các enzyme vi sinh vật ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật. Ngoài ra còn có: Pectin-transeliminase Polygalacturonate-transeliminase Pectin lyase (PNL) Chức năng Pectinase làm đứt trạng thái gắn chặt giữa những phân tử acid galacturonic để làm ngắn chuỗi pectin từ những đoạn lớn thành những đoạn nhỏ hơn. Cơ chế xúc tác của pectinase sử dụng nước, vì thế pectinase được xem là một enzyme thủy phân. Nó cắt đứt phân tử nước, gắn –H vào một C và gắn –OH vào một C khác. 1.2.9. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng enzyme Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Trang 27
Đồ án tốt nghiệp Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Nhưng khi tăng nồng độ cơ chất đến một mức độ nào đó, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất, nồng độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng. Vì vậy, với từng enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme Ảnh hưởng của chất kiềm hãm và chất hoạt hóa Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ hay hữu cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hóa) hoặc làm giảm (tính kìm hãm) hoạt độ của enzyme. Tác dụng của chúng có thể là đặc hiệu hay không đặc hiệu và thay đổi theo từng chất, tuy từng enzyme Chất kìm hãm (chất ức chế) là chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme. Các chất này có thể là các ion, các phân tử vô cơ hay hữu cơ, kể cả protein Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme chuyển thành hoạt động từ dạng không hoạt động. Các chất này thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại hoặc các chất hữu cơ. Chất hữu cơ làm tăng hay hồi phục họat tính của enzyme một cách trực tiếp hay gián tiếp Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng của enzyme và tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng tới một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ giới hạn đó sẽ giảm và dẫn đến mức bị triệt tiêu Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không còn khả năng phục hồi lại hoạt tính Ngược lại, ở nhiệt đô 00C, enzyme sẽ bị hạn chế rất mạnh nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ thì hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp Trang 28
Đồ án tốt nghiệp Ở nhiệt độ thấp (0 - 500C) vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Sự tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng Ở nhiệt độ sau đó (tùy thuộc vào từng loại enzyme, khoảng 550C) vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80 - 1000C Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trường Ảnh hưởng của pH môi trường pH của môi trường ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein- enzyme. Đa số enzyme bền trong khoảng pH 5-9, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có các yếu tố bền như: cơ chất, coenzyme, Ca2+ mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng vẫn có một số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepsin, protease acid của vi sinh vật ) hoặc khá cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. Khi cơ chất cần thủy phân đã hết quá trình thủy phân kết thúc. Thời gian thủy phân phải thích hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt Ảnh hưởng của lượng nước Với phản ứng thủy phân bởi enzyme thì nước vừa là môi trường để phân tán enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng. Nước ảnh hưởng đến tốc độ và chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme. Vì thế, nước là một yếu tố Trang 29
Đồ án tốt nghiệp điều chỉnh phản ứng thủy phân bằng enzyme, nó có thể tăng cường hoặc ức chế của các phản ứng do enzyme xúc tác. Trang 30
Đồ án tốt nghiệp Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Cơ chất: Rong Vaucheria spp được thu từ Đồng bằng sông Cửu Long tại các ao nuôi tôm, vùng nước lợ ở Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh đã được phơi khô và xay nhuyễn. 2.1.2. Các Enzyme thương phẩm: Cellulase, Pectinase, Glucose-Amylase, Amylase được cung cấp tại Viện sinh học nhiệt đới. 2.1.3. Hoá chất và thiết bị 2.1.3.1. Hóa chất Các hóa chất phục vụ cho việc xác định thành phần sinh hóa của rong như: HCl 4N, HNO3 đậm đặc, AgNO3 0.1N, Petroleum ether, H2SO4 72% , DNS, H3BO4 4%, HCl 0.25N, H2SO4 đậm đặc, NaOH 32%, Hỗn hợp thuốc thử ( Methyl đỏ + Bromocresol lục + cồn 960), HCL đậm đặc, Amoni molybdate. Hydroquinone [C6H4(OH)2], Sodium sunphie (Na2SO3), Dung dịch CH3COONa 0.2M, Dung dịch orthophenaltrolin 0.5% trong nước, Dung dịch đệm pH= 3.5 – 4.5 gồm ( CH3COOH 0.1M 650ml, CH3COONa 0.1M 350ml), Dung dịch hydroquimon trong dung dịch đệm pH=4.5, Dung dịch acid nitric (HNO3) đặc, Dung dịch acid acetic (CH3COOH) đặc, Rượu ethylic 96%, dung dịch KCN 3%, dung dịch ammonium pH 10, dung dịch Trilon B 0.02N, chỉ thị Đen Eriochrom T, chỉ thị Murexid, dung dịch Trilon B 0.02N, nước cất. Các hóa chất phục vụ cho quá trình thủy phân: H2SO4 đậm đặc, Ca(OH)2, Nước cất, DNS. 2.1.3.2. thiết bị. Dụng cụ; Ống nghiệm, becher, erlen, bình định mức, ống đong, đĩa petri, chén sứ, pipette, bình đựng mẫu, ống bóp cao su, giá đỡ ống nghiệm, giấy lọc, giấy bạc, phễu, đũa thủy tinh, giấy quỳ (với các thể tích khác nhau) Trang 31
Đồ án tốt nghiệp Thiết bị: Tủ sấy, bếp điện, cân phân tích, cân điện tử, nồi hấp, máy votex, bộ chưng cất mẫu kjeldahl, bộ chiết rút lipid, máy đo quang phổ, nồi hấp vô trùng, máy ly tâm, tủ lạnh. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp xác định thành phần sinh hóa của rong Vaucheria Spp Các thành phần hóa sinh của rong được xác định theo phương pháp LAPS ( Standard compositional laboratory analytical procedure ) được mô tả bởi Dien et al. 2010. Theo đó thì Protein dược xác định bằng phương pháp Kjeldahl, Lipid được xác định bằng phương pháp Soxhlet; Các chỉ tiêu Carbohydrat tổng, đường tổng, tinh bột, chất xơ , hàm lượng tro và ẩm dược xác định theo phương pháp của FAO và AOAC. 2.2.1.1. Phương pháp xác định độ ẩm Nội dung: Xác định độ ẩm của rong bằng cách sấy trong tủ cho đến trạng thái khô không khí và xác định mức tiêu hao khối lượng trong quá trình đó. Dụng cụ: Cân phân tích có độ chính xác tới 0,001g Giấy bạc ( dùng để cân mẫu) Đĩa petri Tủ sấy được điều chỉnh nhiệt độ đến ± 20C Các bước tiến hành: Cân mẫu giấy bạc , sau đó cân chính xác 2g mẫu trên giấy, đặt vào đĩa petri cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 1050C , sấy trong vòng 4 giờ. Lấy ra hút ẩm 15 phút, rồi cân trên cân phân tích . Tiếp tục sấy thêm từ 1- 2 giờ, và cân cho đến khi trọng lượng không đổi. Trang 32
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. Mẫu rong được đặt trong tủ sấy Tính toán kết quả: Hàm lượng nước ban đầu ( X ) tính bằng phần trăm theo công thức: Độ ẩm theo phần trăm được tính bằng công thức: 1− 2 X = x 100% Trong đó G : khối lượng của mẫu tính bằng g G1: Khối lượng giấy và mẫu trước khi sấy, g G2: : Khối lượng giấy và mẫu sau khi sấy, g Kết quả cuối cùng là trung bình cộng số học của 2 kết quả xác định được khi chúng chênh lệch nhau không quá 2% so với trung bình cộng của chúng. 2.2.1.2. Phương pháp xác định khoáng tổng số. Nội dung: - Tro thô là phần chất còn lại của mẫu sau khi nung ( vô cơ hóa) ở nhiệt độ 5500C – 7000C trong 4 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm. Cân tính sự chênh lệch trước và sau khi nung, ta có được hàm lượng tro trong mẫu. - Tính hàm lượng tro không tan trong nước và tro không tan trong HCl. Dụng cụ và hóa chất: Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g Trang 33
Đồ án tốt nghiệp Chén nung bằng sứ chịu nhiệt có dung tích từ 30-50ml. Chén nung đã được nung ở nhiệt độ 500- 5500C trong 1 giờ, để nguội trong bình hút ẩm , cân khối lượng chén Po. Lò nung điều chỉnh nhiệt độ ( ±100C) Bình hút ẩm, nước cất. HCl 4N HNO3 đậm đặc AgNO3 0.1N Các bước tiến hành: Xác định hàm lượng khoáng tổng số trong mẫu. Mẫu rong đã được sấy khô đến trọng lượng tuyệt đối, cân 2g mẫu cho vào mỗi cốc sứ. Đặt chén sứ có mẫu vào lò nung ( t = 1000C ) để mẫu cháy hết khói đen, đóng cửa lò nung điều chỉnh đến nhiêt độ 6000C và nung trong 4 giờ đến khi mẫu có màu trắng xám hay xám xanh là được. Để hạ nhiệt độ khoảng 2000C. Làm nguội trong bình hút ẩm 15 phút và đem cân P2. Lặp lại quá trình nung mẫu cho đến khi trọng lượng không đổi. - Xác định hàm luợng tro không tan trong HCl: Hòa tan tro toàn toàn phần hoặc tro không tan trong nước cất vào 25ml HCL 4N. Để nóng trong nồi cách thủy sôi từ 10 đến 15 phút. - Lọc tro, rửa tro bằng nước sôi khi lọc không còn chứa Cl ( thử HNO3 2 giọt + AgNO3 0.1N không thấy tủa). Cho toàn bộ vào chén sứ đem sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 100 – 1050C . để nguội trong bình hút ẩm rồi cân . - Xác định hàm lượng tro không tan trong nước. Sau khi hòa tan tro trong nước bằng nước cất sôi rửa phần không còn lại, lọc – lấy toàn bộ đi sấy ở 1050C cho đến trọng lượng không đổi. Tính kết quả: - Hàm lượng khoáng tổng số: Trang 34
Đồ án tốt nghiệp X % chất mất khi nung = (P1 – P2 ) x 100/m g mẫu Y % khoáng tổng số = (P2 – P0 ) x 100/m g mẫu Trong đó: P0 : khối lượng chén nung trước khi nung P1 : Khối lượng mẫu và chén trước khi nung (g) P2 : Khối lượng mẫu và chén sau khi nung. (g) - Tính hàm lượng tro không tan trong HCl 1 − = x 100 푃 Trong đó: G: trọng lượng của chén (g) G1: Trọng lượng của chén và mẫu tro không tan (g) P : trọng lượng của mẫu thử ( g ): - Tính hàm lượng tro không tan trong nước 3 − Y = 100% 푃 Trong đó: G: trọng lượng của chén ( g ) G2: trọng lượng của chén và tro ( g ) P : trọng lượng của mẫu ( g ) 2.2.1.3. Phương pháp định lượng Lipid theo phương pháp Soxhlet. Nội dung: Dựa vào tính chất hòa tan của lipid trong dung môi hữu cơ ( ether) để chiết rút lipid ra khỏi nguyên liệu. Dụng cụ, hóa chất: Giấy lọc không tro kích thước 10 x 15cm đã được sấy khô đến trọng lượng tuyệt đối. Petroleum ether Máy Soxhlet: các bộ phận của máy gồm: Bình đun Bình chiết Xi phông dẫn dung môi lên hệ thống sinh hàn Xi phông dẫn dung môi đến bình đun. Trang 35
Đồ án tốt nghiệp Hệ thống sinh hàn. Nồi cách thủy. Các bước tiến hành: Chuẩn bị mẫu: Sấy giấy gói mẫu đến trọng lượng khô tuyệt đối . Sau đó lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cân bao giấy ta có trọng lượng ( m1 ). Cân chính xác 1g mẫu đã nghiền nhỏ và đồng nhất. Chuyển mẫu sang giấy gói đã sấy, gói kín lại. Cân trọng lượng giấy chứa mẫu ta có ( m2 ) Chuẩn bị mẫu trên máy Soxhlet: Cho gói mẫu vào ống hình trụ đựng mẫu một cách thận trọng để tránh rơi rớt. Đặt bình cầu đựng dung môi lên bếp đun. Lắp ống đựng mẫu với bình cầu đựng dung môi theo nguyên tắc bình thông nhau. Mở nước để nước chảy vào hệ thống sinh hàn. Sau cùng đổ dung môi chiết lipid qua phễu thủy tinh sao cho lượng dung môi đủ ngập mẫu và chiếm 2/3 dung tích của bình đựng dung môi. Chiết rút Lipid trên máy Soxhlet: Đặt lên bếp cách thủy chỉnh nhiệt độ 450C – 500C . Đun cách thủy để chiết lipid trong thời gian từ 10h – 12h. Dung môi hữu cơ sôi 450C – 500C Được chuyển sang dạng hơi theo xi phông được dẫn phía trên của bình chiết vào ống sinh hàn gặp lạnh ngưng thành giọt chảy xuống bình chiết ngập xi phông, ether chảy xuống bình đun. Sau khi chiết rút hết lượng Lipid đem sấy khô ở nhiệt độ 1050C khoảng 3h. Để nguội trong bình hút ẩm, cân lại tính đến trọng lượng tuyệt đối. Tính toán kết quả: 2 − 3 T = 100 Với T: % Lipid có trong mẫu b = m2 – m1 (g) m1 : Trọng lượng giấy gói trước sấy (g) m2: trọng lượng giấy + mẫu trước khi chiết(g) m3: trọng lượng giấy + mẫu sau khi chiết(g) Trang 36
Đồ án tốt nghiệp 2.2.1.4. Phương pháp định lượng carbohydrate tổng số: Nội dung: Sự định phân này căn cứ vào phản ứng đặc trưng của đường và nhiều chất hữu cơ ( Phenol) với sự hiện diện của H2SO4. Dụng cụ, hóa chất: H2SO4 72% DNS Nước cất Giấy lọc vô trùng Nồi hấp Autoclave Máy đo quang phổ Các bước tiến hành: Dựng đường chuẩn Glucose. Hòa tam 100mg Glucose với 80ml nước cất chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất cho đến vạch và lắc đều. Thực hiện dựng đường chuẩn theo bố trí của bảng 2.1 Bảng 2.1. Dựng đường chuẩn glucose Ống số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ Glucose 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 V dd Glucose ( ml ) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 V nước cất ( ml ) 0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 V DNS ( ml ) 2 2 2 2 2 2 Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 10 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. So màu ở bước sóng 540nm. Xác định lượng đường của mẫu: Cân chính xác 0.3g = 300mg mẫu cho vào bình tam giác, thêm 3ml H2SO4 72% vào, khuấy đều, sau đó ủ ở 300C trong 30 phút. Thêm vào 80ml nước cất đưa vào nồi hấp vô trùng ở 1210C. 1atm. 20 phút. Trang 37
Đồ án tốt nghiệp Sau đó để nguội, rồi lọc bằng giấy lọc vô trùng, đong thể tích cuối bằng 100ml. Từ đó pha loãng ra 5 lần rồi hút 1ml mẫu + 2mlDNS, đun sôi 10 phút và so màu ở bước sóng 540nm. Tính kết quả: Từ phương trình đường chuẩn Glucose y = ax +b, ta có số OD của mẫu thế vào y tìm được x Hàm lượng glucose có trong mẫu là : X = (x * V)/m *HSPL 2.2.1.5. Phương pháp định lượng Nito tổng số Kjeldahl Nội dung: Dưới tác dụng của H2SO4 đặc và các chất xúc tác, tất cả các dạng đạm hữu + cơ được chuyển thành NH4 + Đẩy NH4 bằng dung dịch kiềm và hứng NH3 thoát ra bằng dung dịch axit. Dụng cụ, hóa chất. H3BO4 4% HCl 0.25N H2SO4 đậm đặc. NaOH 32% Hỗn hợp thuốc thử ( Methyl đỏ + Bromocresol lục + cồn 960) Nước cất Bộ phá mẫu Kjeldahl cổ điển. Bếp đun Bình định mức, bình tam giác, ống hút. Các bước tiến hành Phá mẫu Cân 0.2g mẫu đã sấy khô, nghiền kỹ cho vào bình tam giác, bổ sung 1g chất xúc tác và 5ml H2SO4 đậm đặc, đậy lại bằng phễu để tránh bay hơi mẫu, đun trên bếp điện cho đến khi trắng trong , tráng bằng nước cất khoảng 10ml đun tiếp trong Trang 38
Đồ án tốt nghiệp vòng 1h cho đến khi phá mẫu hoàn toàn ( dịch trong, không có vết đen của mẫu ). Lưu ý: trong quá trình đun tránh nơi có người để không bị ảnh hưởng bởi hơi axit Chưng cất mẫu. Mẫu sau khi phá để nguội, lắp vào máy chưng cất. Bổ sung thêm 30ml dung dịch NaOH 32%. Dịch chưng cất được thư nhờ bình thu có bổ sung trước axit boric H3BO4 4% và hỗn hợp chất chỉ thị. Ngừng cất khi thu được khoảng 125 – 150ml dịch chưng cất ( tương đương với 15 phút chưng cất ) Hình 2.2. Mẫu đang được chưng cất đạm theo phương pháp cổ điển Chuẩn độ. Chuẩn độ bằng HCl 0.24N. Dừng chuẩn độ khi dung dịch có màu phớt đỏ. Trang 39
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3. Mẫu từ màu xanh chuyển sang phớt đỏ khi được chuẩn độ trong phương pháp Kjeldahl Tính toán kết quả. Thông qua số HCl 0.25N, người ta biết được lượng axit boric kết hợp với NH3 và do vậy biết được số lượng NH3 giải phóng từ mẫu. Trung bình cứ 1ml HCl 0.25N tương ứng với 0.003 nitơ hữu cơ. Kết quả tính toán thể hiện theo nitơ hữu cơ hoặc nitơ tổng số. Thể tích HCl x Hệ số quy đổi x 0.0035 Phần trăm nitơ hữu cơ (%) = Trọng lượng mẫu Phần trăm nitơ tổng số ( % ) : Thông thường protein chứa khoảng 16% N. Khí NH3 nhận được khi chưng cất nhân với hệ số quy đổi là 6.25 sẽ cho ta biết giá trị protein tương đương hay NH3 tổng. 2.2.1.6. Phương pháp định lượng Phosphor tổng số bằng quang phổ kế: Nội dung: Xác định hàm lượng phosphor trong giới hạn nồng độ 1 – 20mg/cm3 Phương pháp này dựa vào khả năng của ion orthophosphate phản ứng với amonium molybdate tạo thành phosphomolybdate, phức chất có màu xanh lơ. 2MoO2.4MoO3 + H3PO4 (MoO2.4MoO3)2H3PO4.4H2O Trang 40
Đồ án tốt nghiệp Hàm lượng phosphor phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu đo ở bước sóng hấp thu cực đại 650 nm với cuvet có chiều dài 10mm. Dung dịch đối chứng là dung dịch không. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ: do phương pháp có độ nhạy cao nên các dụng cụ thủy tinh đòi hỏi phải thật sạch. Bình định mức 50ml, 100ml. Ống nghiệm có chiều dài 150mm và đường kính 15mm. Máy quang phổ kế và cuvet 10mm. Hóa chất : tất cả các hóa chất sử dụng trong thử nghiệm này phải đạt độ tinh khiết phân tích. Nước sử dụng phải là nước cất 2 lần. HCL đậm đặc. HNO3 đậm đặc. Amoni molybdate. Hydroquinone [C6H4(OH)2], pha khi sử dụng. Sodium sunphie (Na2SO3) Các bước tiến hành Lấy mẫu thử và chuẩn bị mẩu thử theo TCVN 4325-86. Nếu mẩu khô không khí, xử lý sơ bộ và bảo quản. Nấu mẩu tươi, xử lý sơ bộ, cô cạn, sấy 60oC, sấy 105oC, nghiền lấy mẫu trung bình. Chuẩn bị dung dịch thuốc thử : Dung dịch 1: dung dịch chuẩn gốc (chứa 100  g phosphor/ml). Hòa tan 0,144g KH2F Trong bình định mức 100ml bằng nước cất và định mức đúng 100ml. Chuẩn bị dung di6ch chuẩn để lập thang chuẩn (chứa 25 g phosphor/ml). Lấy 25ml dung dịch cho vào bình định mức 100ml và định mức bằng nước cất đúng 100ml, ta có dung dịch 1A. Trang 41
Đồ án tốt nghiệp Dung dịch HCL 10%: 250ml HCL đậm đặc cộng với 750ml nước cất. Dung dịch 2: dung dịch Na2SO3 20%: cân 10g Na2SO3 hòa vào trong 50ml nước cất. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng. Dung dịch 3: dung dịch hydroquinone 0,5 %. Hòa tan 0,25g hydroquinone trong một ít nước và 3 giọt H2SO3, thêm nước cho đủ 50ml. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng. Dung dịch 4: thuốc thử Briggs hay dung dịch amoni molybdate 5%. Hòa tan 5g amoni molybdate trong 10ml nước cất. Cho 15 ml H2SO4 đậm đặc vào trong 40ml nước. Để nguội thêm tiếp dung dịch amoni molybdate 5% đã chuẩn bị vào hổn hợp, để nguội thêm nước cho đủ 100ml. Hỗn hợp thuốc thử: trộn các dung dịch 2, 3, 4 theo tỷ lệ 1:1:1. Chuẩn bị dung dịch tro phân tích Cân chính xác 1-5g mẫu (tùy theo mẫu có phosphor nhiều hay ít). Vô cơ mẫu ở 550oC trong 4 giờ. Để nguội. Thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất và thêm 10ml dung dịch HCL 10% và 0,5ml HNO3 đậm đặc. Đun nhẹ trong 5 phút (đến khi thấy bay hơi), để nguội đến nhiệt độ phòng. Rửa sạch chất nung và định mức thể tích dung dịch tro đến 29ml bằng nước cất. Phản ứng lên màu Lấy 10ml dung dịch tro cho vào bình hình nón dung tích 100ml, định mức cho đủ 100ml ta có dung dịch thứ 2. Lấy 1m dung dịch 2 cho vào ống nghiệm. Thêm 3ml hỗn hợp thuốc thử + nước cất cho đả 10ml. Trộn đều hỗn hợp, để 30 phút. Đo ở bước sóng 650 nm. Tiến hành dựng đồ thị đường chuẩn theo bảng 2.2 Bảng 2.2. Dựng đường chuẩn phosphor Số ống Đối chứng 1 2 3 4 5 Mật độ (  g) 0 100 200 300 400 500 Vml (P) 0 1 1 1 1 1 Nước cất 5 4 4 4 4 4 Hỗn hợp thuốc thử 3 3 3 3 3 3 Trang 42
Đồ án tốt nghiệp Thêm nước cất 2 2 2 2 2 2 Nồng độ phosphor (dung dịch 1) dịch thử được ước tính theo phương trình: X(mgP)=(Abs * 0.0057)/0.0109 Abs : là giá trị mật độ quang của dịch thử đo ở bước sóng 650 nm Tính toán kết quả Ta có phương trình đường chuẩn y = ax + b Và OD của mẫu thử ta có y Suy ra mật độ quang trong mẫu thử x Nồng độ phosphor (dung dịch 1) dịch thử được ước tính theo phương trình: X(mgP)= (x * 0.0057)/0.0109 = X mgP 2.2.1.7. Phương pháp định lượng sắt. Nội dung Fe2+ trong dung dịch kết hợp với orthophenaltrolin thành một phức chất có màu đỏ khá bền vững trong môi trường pH= 3 – 9. Nấu muốn màu này không bị ảnh hưởng của thuốc thử thừa và sự có mặt của các ion khác, phản ứng cần tiến hành ở pH= 3.5 – 4.5. Phức này gồm có 3 phân tử orthophenaltrolin kết hợp với một ion Fe2+. Phản ứng đặc hiệu cho Fe2+ nên phải chuyển hết Fe3+ thành Fe2+ bằng cách khử với hydroquimon hay Hydroxylamin chlohydrat. Nguyên liệu và hóa chất HCl đậm đặc. HCl 20%. Dung dịch CH3COONa 0.2M. Dung dịch orthophenaltrolin 0.5% trong nước. Dung dịch đệm pH= 3.5 – 4.5 gồm: CH3COOH 0.1M 650ml CH3COONa 0.1M 350ml Dung dịch hydroquimon trong dung dịch đệm pH=4.5 Trang 43
Đồ án tốt nghiệp Dung dịch chuẩn Fe: cân 0.7203g (NH4)2Fe(SO4)26H2O, thêm nước cất cho đủ một lít. Như vậy dung dịch này sẽ chứa 10 Fe2+/ml. Các bước tiến hành Chuẩn bị mẩu thử: cân chính xác 2g mẫu đã sấy khô ở dạng bột mịn. Nung thành tro trắng, hòa tan tro với 5ml HCl đậm đặc, đun trên bếp cách thủy cho đến khô, lặp lại lần thứ hai như trên. Lần thứ ba hòa tan tro trong 5ml HCl 20%, lọc, rửa cặn, giấy và phễu nhiều lần bằng nước cất nóng, định mức đến 50ml bằng nước cất. Ta được dịch thử. Để yên 2 phút cho 1ml orthophenatrolin và lắc đều. Sau đó, để yên trong 1 giờ. Đo bước sóng 485 nm. Dựng đồ thị chuẩn: Pha loãng dung dịch Fe có nồng độ biết trước (10Fe2+/ml), thực hiện như bảng 2.3. Vẽ đồ thị mẫu sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ Fe. Bảng 2.3. Dựng đường chuẩn Fe Số ống Đối chứng 1 2 3 4 5 Nồng độ 0 100 200 300 400 500 Vml Fe (ml) 0 10 10 10 10 10 Nước cất (ml) 10 0 0 0 0 0 Dung dịch 1 1 1 1 1 1 Hydroquimon (ml) 2.2.1.8. Phương pháp định lượng cellulose ( xơ thô ) Nội dung Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất biến đổi với tác dụng của acid mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu, còn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose nhhu7 hemicellulose, lignin ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxy hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu và dung dịch kiềm hoặc bằng hổn hợp acid nitric với acetic. Hóa chất Trang 44
Đồ án tốt nghiệp Dung dịch acid nitric (HNO3) đặc. Dung dịch acid acetic (CH3COOH) đặc. Rượu ethylic 96%. Cách tiến hành Cân 1,5g mẫu đã nghiền nhỏ ( sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 100- 105oC). Cho vào bình nón dung tích 250ml. Thêm vào bình 16,5ml hổn hợp gồm 15ml acid nitric đặc và 15ml acid acetic đặc. Lắp ống sinh hàn làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hổn hợp 30 phút. Để nguội. Rửa kết tủa cellulose nhiều lần bằng nước cất nóng (mỗi lần 10-15ml). Rửa rượu ethylic 96% 1-2 lần. Rửa bằng ether ethylic. Sấy giấy lọc có chứa cenllulose ở nhiệt độ 100-105oC đến trọng lượng không đổi, thời gian 2-3 giờ. Tính kết quả Hàm lượng cenllulose được tính bằng công thức: X= a*100/w Trong đó: X : Hàm lượng cenllulose tính bằng (%). a: Trọng lượng cenllulose (g). w: Trong lượng mẩu làm thí nghiệm. 100: Hệ số chuyển thành %. 2.2.1.9. Phương pháp định lượng canxi và Magie theo Complexon Nội dung Trước hết ta phải xác định tổng lượng canxi và magie, sau đó xác định hàm lượng canxi. Hiệu số giữa tổng lượng Ca và Mg với hàm lượng Ca sẽ cho biết hàm lượng Mg. Xác định tổng lượng Ca và Mg Nguyên tắc Trang 45
Đồ án tốt nghiệp Để xác định tổng lượng Ca và Mg, thông thường người ta sử dụng phương pháp xác định tổng độ cứng toàn phần của nước ( độ cứng toàn phần của nước là tổng lượng muối bicarbonate, clorur, sulfat, nitrat của chất khoáng ). Nguyên tắc của phương pháp này là dung trilon B ( EDTA C10H14N2O8Na2 ) để chuẩn độ và chất chỉ thị màu là Đen Eriochrom T ( C20H12N2O7SNa ). Tùy theo pH môi trường, chất này sẽ ở những dạng ion khác nhau. PH Dạng ion Màu - 7 H2I Đỏ 7 - 12 HI2+ Xanh lam 12 I3- Da cam Trong môi trường pH = 10 các ion Ca và Mg tác dụng với chất chỉ thị màu sẽ cho chất phức tạp có màu đỏ tím. Mg2+ + HI2-  MgI- + H+ Xanh lam Đỏ tím Chất phức tạp này bền hơn hơn phức tạp của Ca và Mg với Trilon B. Do đó, Trilon B sẽ chiếm lấy Ca và Mg để tạo thành chất phức tạp bền hơn. Chất chỉ thị màu được phóng thích tự do và trở lại màu xanh lam của nó. Nếu ký hiệu Trilon B 2- là H2Y thì có phản ứng: - 2- 2- 2- + MgI + H2Y  MgY + HI + 2H Đỏ tím Không màu Không nào Xanh lam Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Bình tam giác 100ml Ống chuẩn độ 25 ml Ống hút 2,5,10 ml Cốc đốt 250ml Hóa chất dung dịch KCN 3%, Trang 46
Đồ án tốt nghiệp dung dịch ammonium pH 10 : cân 6,7g NH4Cl + 30ml nước cất, khuấy cho tan, thêm 57ml NH4OH và nước cất cho đủ 10ml. dung dịch Trilon B 0.02N : cân 3.73g trilon B + nước chất cho đủ 1000ml ( nếu đục có thể lọc ), chỉ thị Đen Eriochrom T : cân 0,1g Đen Eriochrom T + 50g NaCl tinh khiết, nghiền nhuyễn trong cối, cất vào chai thủy tinh đậy nút thật kín. Giấy đo pH Các bước tiến hành Hút 20 ml dung dịch A cho vào bình tam giác 100 ml khô và sạch, nhỏ vào bình 5 giọt KCN 3% (để ngăn cản một số ion như Fe3+, Fe2+, Cu2+, v.v. tác dụng với Trilon B). Sau đó thêm vào bình khoảng nửa hạt gạo chất chỉ thị đen Eriochrom T, dung dịch có màu đỏ tím, dùng dung dịch Trilon B chuẩn độ cho đến khi chuyển sang màu xanh lam. Thể tích Trilon B 0.02N chuẩn độ dung dịch có giá trị tương đương với hàm lượng Ca và Mg. Cần thực hiện song song một sự thử không (thay dung dịch A bằng nước cất). Kết quả: Hàm lượng canxi – magie ( pha loãng 20 lần) Thể tích Trilon B 0.02N được tính theo công thức sau : v V *100 a Trong đó: v: thể tích dung dịch Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ. 1.5ml v0: thể tích dung dịch Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ sự thử không. Δv = v - v0 a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ. 2g V: thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ dung dịch mẫu tương đương với 100 g mẫu khô tính bằng ml/100 g mẫu khô. Trang 47
Đồ án tốt nghiệp Xác định hàm lượng canxi Nguyên Tắc: dùng Trilon B xác định Calcium trong dung dịch với chỉ thị là Murexid (C8H506N5) trong môi trường có pH = 12. Ký hiệu chất chỉ thị Murexid là H3I trong môi trường pH = 12, H3I có màu tím và khi kết hợp với Calcium tạo thành phức tạp có màu hồng 2+ + H3I + Ca  CaH3I Tím Hồng Chất phức hợp của Ca với Murexid không bền bằng chất phức tạp tạo bởi Ca và Trilon B. Vì vậy, Trilon B đẩy chỉ thị Murexid ra khỏi phức tạp dưới dạng tự do có màu tím + 2- 2- - + CaH3I + H2Y  CaY + H3I + 2H Hồng Tím Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ : Bình tam giác 100ml Ống chuẩn độ 25 ml Ống hút 2,5,10 ml Hóa chất: dung dịch NaOH 10%, dung dịch KCN 3%, chỉ thị Murexid : cân 0,1g murexid + 50g NaCl tinh khiết, nghiền nhuyễn bằng cối, cất vào chai thủy tinh đậy nút thật kín. dung dịch Trilon B 0.02N. Các bước tiến hành : Hút 20 ml dung dịch A vào bình tam giác 100 ml ( lấy bằng thể tích dung dịch A khi xác định tổng hàm lượng Ca và Mg ). Thêm 2 ml dung dịch NaOH 10%, 5 giọt KCN 3% và khoảng nửa hạt gạo chỉ thị Murexid. Chuẩn độ bằng dung dịch Trilon B 0.02N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím. Cần thực hiện song song một sự thử không Trang 48
Đồ án tốt nghiệp Kết quả : Kết quả được tính theo các công thức sau a. Tính thể tích Trilon B cần chuẩn độ v (ml/100g mẫu khô ) V 1 *100 1 a Trong đó : v1: thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ C: độ nguyên chuẩn của dung dịch Trilon B 0.02N a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ 2g 20,04: đương lượng của Canxi V1: thể tích Trilon B cần để chuẩn độ khi xác định lượng Canxi trong dung dịch mẫu tương đương với 100 g mẫu khô. Xác định lượng magie Sau khi đã biết V, thể tích trilon B dung để chuẩn độ khi xác định tổng lượng Ca và Mg trong 100g mẫu khô, và V1 thể tích trilon B dùng để xác định lượng Ca trong 100g mẫu khô, ta sẽ xác định được lượng magne. Lượng Mg ( tính bằng mg ) trong 100g mẫu khô là: m2=(V – V1)*C*12,16 2.2.2. Khảo sát các thông số ảnh hưởng tới quá trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria Spp 2.2.2.1. Phương pháp định lượng đường khử Hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp của Miller dựa trên việc đo mật độ quang của phức màu đỏ sậm đặc trưng được tạo ra giữa đường khử với thuốc thử DNS ở bước sóng 540nm. Dựng đường chuẩn Glucose. Hòa tam 100mg Glucose với 80ml nước cất chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất cho đến vạch và lắc đều. Thực hiện theo bảng 2.1. Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 10 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. So màu ở bước sóng 540nm. Trang 49
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào đồ thị glucose chuẩn để suy ra hàm lượng đường khử có trong dung dịch mẫu. 2.2.2.2. Phương pháp định lượng HMF HMF là 5-hydroxymethyl furfural là 1 chất ức chế được hình thành trong quá trình tiền xử lý bung hơi nước áp suất cao là sự thoái biến một phần hemicellulose và hình thành một số chất độc có thể ảnh hưởng đến sự thủy phân và các bước lên men tiếp theo. Các chất độc được tạo thành và số lượng của chúng phụ thuộc vào nguyên liệu và sự khắc nghiệt của tiền xử lý. Bởi thế cần sử dụng chúng ổn định trong bước lên men tiếp theo. Các yếu tố ức chế chính là các dẫn xuất của furan, các axit yếu và các hợp chất phenol. Các dẫn xuất chính của furan là furfural và 5-hydroxymethyl furfural được tạo ra lần lượt từ sự thoái biến pentose và hexose. Cả hai đều được biết đến là các chất ức chế bằng cách kéo dài pha thích nghi trong quá trình lên men. Xác định hàm lượng HMF bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 283nm. Dịch mẫu sau khi thu được pha loãng 30 lần và đem đo OD Hàm lượng HMF được tính theo công thức: 0.749 ∗ X = 푆푃퐿 3 Trong đó: 0.749: là trọng lượng phân tử A : OD của mẫu C3 : nồng độ dung dịch (mg/ml) 2.2.2.3. Phương pháp xác định độ brix Độ brix hay còn gọi là độ đường, hàm lượng chất khô được biểu thị bằng độ brix (oBx), biểu thị phần khối lượng của chất rắn hòa tan trong 100 phần khối lượng dung dịch thường được đo bằng phù kế hay tỉ trọng kế. Ở đây, người thực hiện đề tài sử dụng khúc xạ kế . Mật độ trên khúc xạ kế tương đương với 10g đường sucrose trong 100ml dung dịch. Cách đo: dùng nước cất rửa sạch và lau khô mặt kính của khúc xạ kế. Cho 1 giọt nước cất lên mặt kính và kiểm tra xem khúc xạ kính đã chỉ đúng 0oBx chưa. Sau đó Trang 50
Đồ án tốt nghiệp lau khô mặt kính, khuấy đều dung dịch cần đo rồi cho 1 giọt lên mặt kính, đậy nắp không cho có bọt khí rồi quan sát đọc kết quả trên khúc xạ kế. Đo ba lần để có kết quả chính xác. 2.2.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình tiền xử lý mẫu Nội dung: Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của các yếu tố gồm nồng độ hóa chất (H2SO4) nhiệt độ, thời gian xử lý nhiệt tới quá trình đã chọn. Khả năng xử lý nguyên liệu ( thủy phân tinh bột, hemicellulose và phân cắt một phần cellulose) được đánh giá dựa trên thành phần đường đơn tạo ra trong dịch lỏng, tỷ lệ dịch lỏng và phần bã rắn thu được. Nguyên liệu: Mẫu rong Vaucheria spp đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi. Dụng cụ, hóa chất: Cân phân tích, tủ ủ ấm, chai đựng mẫu, pipet 10ml, H2SO4 đậm đặc, nước cất. 4 enzyme thương phẩm: Cellulase , Pectinase, Glucose-Amylase, Amylase Các bước tiến hành: 2.2.3.1. Khảo sát hàm lượng glucose ở nhiệt độ hấp 120oC với sự thay đổi của các yếu tố thời gian và nồng độ H2SO4 Chuẩn bị dung dịch H2SO4 với các nồng độ 1%, 1,5% và 2%, 2,5% Cân chính xác 1g mẫu cho vào các bình đựng, sau đó hút 1ml dung dịch H2SO4 ở các nồng độ khác nhau cho vào bình, đậy nút bông kín và đem hấp khử trùng ở các nhiệt độ 120oC.Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ hình 2.4. Trang 51
Đồ án tốt nghiệp 1g mẫu V (ml) H2SO4 1% 1,5% 2% 2,5% Hấp khử trùng ở 120oC với các thời gian 20 phút 30 phút 40 phút Sau khi hấp khử trùng, thu mẫu và lọc lấy dịch Pha loãng ra 50 Ly tâm dịch lần , tiến hành Ly tâm dịch mẫu, pha loãng phần dịch thu mẫu, đo độ Brix phân tích hàm được 30 phần, phân tích hàm lượng HMF lượng DNS Xác định các yếu tố thời gian và nồng độ H2SO4 thích hợp trong trình tiền xử lý mẫu cho hàm lượng đường tối ưu ở 120oC Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ H2SO4 và thời gian đến quá trình tiền xử lý ở điều kiện 120oC Trang 52
Đồ án tốt nghiệp Sau khi hấp khử trùng, lấy các mẫu ra để nguội, và tiến hành kiểm tra hàm lượng đường và chất ức chế của mẫu. Từ kết quả xác định yếu tố tiền xử lý cho hàm lượng đường cao nhất của mẫu ở 120oC. 2.2.3.2. Khảo sát hàm lượng glucose ở nhiệt độ hấp 130oC với sự thay đổi của các yếu tố thời gian và nồng độ H2SO4 Chuẩn bị dung dịch H2SO4 với các nồng độ 1%, 1,5% và 2%, 2,5% Cân chính xác 1g mẫu cho vào các bình đựng, sau đó hút 1ml dung dịch H2SO4 ở các nồng độ khác nhau cho vào bình, đậy nút bông kín và đem hấp khử trùng ở các nhiệt độ 130oC.Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ hình 2.5. Trang 53
Đồ án tốt nghiệp 1g mẫu V (ml) H2SO4 1% 1,5% 2% 2,5% Hấp khử trùng ở 130oC với các thời gian 20 phút 30 phút 40 phút Sau khi hấp khử trùng, thu mẫu và lọc lấy dịch Pha loãng ra 50 Ly tâm dịch lần , tiến hành Ly tâm dịch mẫu, pha loãng phần dịch thu mẫu, đo độ Brix phân tích hàm được 30 phần, phân tích hàm lượng HMF lượng DNS Xác định các yếu tố thời gian và nồng độ H2SO4 thích hợp trong trình tiền xử lý mẫu cho hàm lượng đường tối ưu ở 130oC Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ H2SO4 và thời gian đến quá trình tiền xử lý ở điều kiện 130oC Trang 54
Đồ án tốt nghiệp Sau khi hấp khử trùng, lấy các mẫu ra để nguội, và tiến hành kiểm tra hàm lượng đường và chất ức chế của mẫu. Từ kết quả xác định yếu tố tiền xử lý cho hàm lượng đường cao nhất của mẫu ở 130oC. 2.2.3.3. Khảo sát hàm lượng glucose ở nhiệt độ hấp 140oC với sự thay đổi của các yếu tố thời gian và nồng độ H2SO4 Chuẩn bị dung dịch H2SO4 với các nồng độ 1%, 1,5% và 2%, 2,5% Cân chính xác 1g mẫu cho vào các bình đựng, sau đó hút 1ml dung dịch H2SO4 ở các nồng độ khác nhau cho vào bình, đậy nút bông kín và đem hấp khử trùng ở các nhiệt độ 140oC. Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ hình 2.6. Trang 55
Đồ án tốt nghiệp 1g mẫu V (ml) H2SO4 1% 1,5% 2% 2,5% Hấp khử trùng ở 140oC với các thời gian 20 phút 30 phút 40 phút Sau khi hấp khử trùng, thu mẫu và lọc lấy dịch Pha loãng ra 50 Ly tâm dịch lần , tiến hành Ly tâm dịch mẫu, pha loãng phần dịch thu mẫu, đo độ Brix phân tích hàm được 30 phần, phân tích hàm lượng HMF lượng DNS Xác định các yếu tố thời gian và nồng độ H2SO4 thích hợp trong trình tiền xử lý mẫu cho hàm lượng đường tối ưu ở 140oC Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ H2SO4 và thời gian đến quá trình tiền xử lý ở điều kiện 140oC Sau khi hấp khử trùng, lấy các mẫu ra để nguội, và tiến hành kiểm tra hàm lượng Trang 56
Đồ án tốt nghiệp đường và chất ức chế của mẫu. Từ kết quả xác định yếu tố tiền xử lý cho hàm lượng đường cao nhất của mẫu ở 130oC 2.2.3.4. Tổng kết các kết quả khảo sát các yếu tố tối ưu cho ảnh hưởng quá trình tiền xử lý mẫu rong Vaucheria spp. Từ kết quả xác định hàm lượng đường của các thí nghiệm 2.2.3.1; 2.2.3.2; 2.2.3.3 để xác định được yếu tố nồng độ H2SO4, thời gian và nhiệt độ nào là tối ưu để làm cơ sở cho quá trình xử lý mẫu ở các bước khảo sát các yếu tố trong quá trình thủy phân. 2.2.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình thủy phân Bố trí các thí nghiệm để xác định được nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, nhiệt độ pH và thời gian tối ưu để thủy phân enzyme tốt nhất 2.2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân Nội dung: Enzyme được sử dụng trong quá trình thủy phân mẫu tạo đường glucose là các enzyme thương phẩm. Đây là những hệ enzyme cellulase, hemicellulase và pectinase với nhiều hoạt tính enzyme khác nhau, có thể thủy phân hoàn toàn thành tế bào thực vậy. Việc bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân dựa trên khuyến cáo của nhà sản xuất enzyme. Nguyên liệu: Mẫu rong Vaucheria spp đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi. Dụng cụ, hóa chất: Cân phân tích, tủ ủ ấm, chai đựng mẫu, pipet 10ml, H2SO4 đậm đặc, nước cất. 4 enzyme thương phẩm: Cellulase , Pectinase, Glucose-Amylase, Amylase Các bước tiến hành: Ở thí nghiệm này cố định các yếu tố : 1g cơ chất, pH5, nhiệt độ và thời gian ủ mẫu, chỉ thay đổi yếu tố nồng độ các enzyme. Tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ bố trí hình 2.7. Trang 57
Đồ án tốt nghiệp Sau khi thu mẫu, tiến hành lọc dịch mẫu, đong thể tích cuối và đo hàm lượng glucose, HMF và độ brix của mẫu. Từ kết quả đo xác định được nồng độ enzyme nào là thích hợp nhất cho quá trình xử lý mẫu trước khi enzyme thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp. Thí nghiệm khảo sát được bố trí lặp lại 3 lần để có độ tin cậy. 1g mẫu rong Xử lý bằng nồng độ H2SO4 1,5% ,Hấp khử trùng ở 130oC, 1atm, 30 phút Thêm 10ml nước, trung hòa đến pH5 bằng Ca(OH)2 Bổ sung hỗn hợp enzyme với các nồng độ Cellulase : 0,8% Cellulase : 1,2% Cellulase : 2% Cellulase : 1,2% Cellulase : 1,2% Cellulase : 2% Cellulase : 3% Pectinase : 1,2% Pectinase : 0,8% Pectinase : 1,2% Pectinase : 0,8% Pectinase : 1,4% Pectinase : 1,4% Pectinase : 1,6% GA : 2% GA : 1,4% GA : 1% GA : 1,6% GA : 0,8% GA : 0,8% GA : 1,8% Amylase : 0,6% Amylase : 0,6% Amylase : 0,6% Amylase : 0,6% Amylase : 0,6% Amylase : 0,6% Amylase : 0,6% o Đem ủ ở nhiệt độ50 C, trong vòng 72h Lọc mẫu, thu dịch, đong thể tích cuối Xác định: Hàm lượng DNS, hàm lượng HMF, độ brix Chọn hỗn hợp enzyme có nồng độ tối ưu Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân 2.2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân Nội dung: Trang 58
Đồ án tốt nghiệp Khảo sát khối lượng cơ chất thích hợp cho quá trình thủy phân tạo đường glucose. Nguyên liệu: Mẫu rong Vaucheria spp đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi. Dụng cụ, hóa chất: Cân phân tích, tủ ủ ấm, chai đựng mẫu, pipet 10ml, H2SO4 đậm đặc, nước cất. 4 enzyme thương phẩm: Cellulase , Pectinase, Glucose-Amylase, Amylase Các bước tiến hành: Ở thí nghiệm này cố định các yếu tố : nồng độ enzyme thích hợp thu được từ kết quả thí nghiệm 2.2.4.1, pH5, nhiệt độ và thời gian ủ mẫu, chỉ thay đổi yếu tố cơ chất từ 1g, 1,25g, 1,5g, 1,75g và 2g mẫu Tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ bố trí hình 2.6. Sau khi thu mẫu, tiến hành lọc dịch mẫu, đong thể tích cuối và đo hàm lượng glucose, HMF và độ brix của mẫu. Từ kết quả đo xác định được khối lượng cơ chất nào là thích hợp nhất cho quá trình xử lý mẫu trước khi enzyme thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp. Thí nghiệm khảo sát được bố trí lặp lại 3 lần để có độ tin cậy. Trang 59
Đồ án tốt nghiệp Mẫu rong 1g 1,25g 1,5g 1,75g 2g Xử lý bằng nồng độ H2SO41,5% ,Hấp khử trùng ở 130oC, 1atm, 30 phút Thêm 10ml nước, trung hòa đến pH5 bằng Ca(OH)2 Bổ sung hỗn hợp enzyme với nồng độ thích hợp từ thí nghiệm 2.2.4.2 Đem ủ ở nhiệt độ 50oC, trong vòng 72h Lọc mẫu, thu dịch, đong thể tích cuối Xác định: Hàm lượng DNS, hàm lượng HMF, độ brix Chọn hỗn hợp enzyme có nồng độ tối ưu Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân 2.2.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân Nội dung: Khảo sát thời gian ủ mẫu thích hợp cho quá trình thủy phân tạo đường glucose. Nguyên liệu: Mẫu rong Vaucheria spp đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi. Trang 60
Đồ án tốt nghiệp Dụng cụ, hóa chất: Cân phân tích, tủ ủ ấm, chai đựng mẫu, pipet 10ml, H2SO4 đậm đặc, nước cất. 4 enzyme thương phẩm: Cellulase , Pectinase, Glucose-Amylase, Amylase Các bước tiến hành: Ở thí nghiệm này cố định các yếu tố :, khối lượng cơ chất thích hợp thu được từ kết quả thí nghiệm 2.2.4.2, nồng độ enzyme thích hợp thu được từ kết quả thí nghiệm 2.2.4.1, pH5, nhiệt độ cố định ờ 50oC, chỉ thay đổi yếu tố thời gian ủ mẫu từ 12h, 24h,36h, 48h, 60h, 72h, 84h. Tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ bố trí hình 2.9. Sau khi thu mẫu, tiến hành lọc dịch mẫu, đong thể tích cuối và đo hàm lượng glucose, HMF và độ brix của mẫu. Từ kết quả đo xác định được thời gian ủ mẫu nào là thích hợp nhất cho quá trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp. Thí nghiệm khảo sát được bố trí lặp lại 3 lần để có độ tin cậy. Trang 61
Đồ án tốt nghiệp Khối lượng mẫu rong tối ưu ở thí nghiệm 2.2.4.3 Xử lý bằng nồng độ H2SO4 1,5%, Hấp khử trùng ở 130oC, 1atm, 30 phút Thêm 10ml nước, trung hòa bằng Ca(OH)2 đến pH =5 Bổ sung hỗn hợp enzyme với nồng độ thích hợp từ thí nghiệm 2.2.4.2 Đem ủ ở 50oC với các thời gian sau 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h Lọc mẫu, thu dịch, đong thể tích cuối Xác định: Hàm lượng DNS, hàm lượng HMF, độ brix Chọn thời gian ủ mẫu tối ưu Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu đến quá trình thủy phân 2.2.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH tới quá trình thủy phân Nội dung: Khảo sát pH thích hợp cho quá trình thủy phân tạo đường glucose. Nguyên liệu: Mẫu rong Vaucheria spp đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi. Dụng cụ, hóa chất: Cân phân tích, tủ ủ ấm, chai đựng mẫu, pipet 10ml, H2SO4 đậm đặc, nước cất. Trang 62
Đồ án tốt nghiệp 4 enzyme thương phẩm: Cellulase , Pectinase, Glucose-Amylase, Amylase Các bước tiến hành: Ở thí nghiệm này cố định các yếu tố : n, khối lượng cơ chất thích hợp từ kết quả của thí nghiệm 2.2.4.2, nồng độ enzyme thích hợp thu được từ kết quả thí nghiệm 2.2.4.1, thời gian thích hợp từ kết quả của thí nghiệm 2.2.4.3, nhiệt độ ủ mẫu cố định ở 50oC, chỉ thay đổi yếu tố pH từ pH3, pH4, pH5, pH6. Tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ bố trí hình 2.9. Sau khi thu mẫu, tiến hành lọc dịch mẫu, đong thể tích cuối và đo hàm lượng glucose, HMF và độ brix của mẫu. Từ kết quả đo xác định được độ pH thích hợp nhất cho quá trình xử lý mẫu trước khi enzyme thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp. Thí nghiệm khảo sát được bố trí lặp lại 3 lần để có độ tin cậy. Trang 63
Đồ án tốt nghiệp Khối lượng mẫu rong tối ưu ở thí nghiệm 2.2.4.3 Xử lý bằng nồng độ H2SO4 1,5% ,Hấp khử trùng ở 130oC, 1atm, 30 phút Thêm 10ml nước, trung hòa bằng Ca(OH)2 đến các pH sau pH3 pH4 pH5 pH6 Bổ sung hỗn hợp enzyme với nồng độ thích hợp từ thí nghiệm 2.2.4.2 Đem ủ ở 50oCvới các thời gian tối ưu từ thí nghiệm 2.2.4.4 Lọc mẫu, thu dịch, đong thể tích cuối Xác định: Hàm lượng DNS, hàm lượng HMF, độ brix Chọn độ pH tối ưu Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân 2.2.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thủy phân Nội dung: Khảo sát nhiệt độ ủ thích hợp cho quá trình thủy phân tạo đường glucose. Trang 64
Đồ án tốt nghiệp Nguyên liệu: Mẫu rong Vaucheria spp đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi. Dụng cụ, hóa chất: Cân phân tích, tủ ủ ấm, chai đựng mẫu, pipet 10ml, H2SO4 đậm đặc, nước cất. 4 enzyme thương phẩm: Cellulase , Pectinase, Glucose-Amylase, Amylase Các bước tiến hành: Ở thí nghiệm này cố định các yếu tố :, khối lượng cơ chất thích hợp từ kết quả của thí nghiệm 2.2.4.2, nồng độ enzyme thích hợp thu được từ kết quả thí nghiệm 2.2.4.1, thời gian thích hợp từ kết quả của thí nghiệm 2.2.4.3, pH tối ưu từ kết quả thí nghiệm 2.2.4.4, chỉ thay đổi yếu tố nhiệt độ ủ mẫu từ 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, Tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ bố trí hình 2.10. Sau khi thu mẫu, tiến hành lọc dịch mẫu, đong thể tích cuối và đo hàm lượng glucose, HMF và độ brix của mẫu. Từ kết quả đo xác định được nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp. Thí nghiệm khảo sát được bố trí lặp lại 3 lần để có độ tin cậy. Trang 65
Đồ án tốt nghiệp Khối lượng mẫu rong tối ưu ở thí nghiệm 2.2.4.3 Xử lý bằng nồng độ H2SO41,5%. Hấp khử trùng ở 130oC, 1atm, 30 phút Thêm 10ml nước, trung hòa bằng Ca(OH)2 đến pH tối ưu ở thí nghiệm 2.2.4.5 Bổ sung hỗn hợp enzyme với nồng độ thích hợp từ thí nghiệm 2.2.4.2 Đem ủ ở các nhiệt độ sau trong thời gian tối ưu từ thí nghiệm 2.2.4.4 30oC 40oC 50oC 60oC Lọc mẫu, thu dịch, đong thể tích cuối Xác định: Hàm lượng DNS, hàm lượng HMF, độ brix Chọn nhiệt độ tối ưu Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân 2.2.5. Phương pháp bố trí và xử lý số liệu thí nghiệm xác định giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp Trang 66
Đồ án tốt nghiệp 2.2.5.1. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm Phương pháp qui hoạch thực nghiệm không chỉ cho phép nghiên cứu tác dộng đồng thời của nhiều yếu tố lên quá trình mà còn cho phép đánh giá một cách định lượng mức độ ảnh hưởng của từng yếu tố đó. Sau khi thực hiện các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như nồng độ acid H2SO4, nồng độ enzyme, cơ chất, thời gian ủ, pH, nhiệt độ để xác định thành phần phần trăm đường (%DNS), HMF, độ brix của rong Vaucheria spp, xác định được yếu tố cơ sở cho quá trình thủy phân tạo đường glucose. Tuy nhiên các yếu tố chỉ mới dược nghiên cứu ảnh hưởng ở mức độ riêng rẽ. Từ các yếu tố thích hợp, tiến hành tối ưu hóa các yếu tố trên qua hai giai đoạn cơ bản. Ở giai đoạn đầu, làm các thí nghiệm theo kế hoạch thực nghiệm đầy đủ các yếu tố (gọi tắc là TĐY). Cơ sở của việc quy hoạch thực nghiệm theo yếu tố 2n là việc thể hiện tất cả các tổ hợp có thể có giữa n các yếu tố nghiên cứu. Mỗi yếu tố đều được kiểm tra đồng thời và không phụ thuộc lẫn nhau ở hai mức độ là trên (+) và dưới (-). Trung tâm của thực nghiệm là yếu tố thích hợp đã xác định được. Giai đoạn thứ hai là bố trí quá trình tối ưu theo phương pháp leo dốc. Trong giai đoạn này, nhiệm vụ của việc tối ưu hóa là tìm một tương quan tối ưu cho các yếu tố quan trọng nhất ( có ý nghĩa nhất) trên cơ sở cố định các yếu tố còn lại. Bảng 2.4. Mã hóa biến số thực nghiệm theo các yếu tố khảo sát (ảnh hưởng đến sự thủy phân tạo đường của rong Vaucheria spp) Mức dưới Mức cơ sở Mức trên Mức biến thiên Các biến số (-) (0) (+) (λ) X1: Cơ chất (g) 1,50 1,75 2,00 0,25 X2: Thời gian (h) 50 60 70 10 0 X3: Nhiệt độ ( C) 45 50 55 5 X4: pH 4 5 6 1 Trang 67
Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.5: Ma trận kế hoạch hóa đối với 4 yếu tố ảnh hưởng Số thí Biến số mã hóa Ký hiệu nghiệm X1 X2 X3 X4 hàng 1 - - - - “1” 2 + - - - X1 3 - + - - X2 4 + + - - X1X2 5 - - + - X3 6 + - + - X1X3 7 - + + - X2X3 8 + + + - X1X2X3 9 - - - + X4 10 + - - + X1X4 11 - + - + X2X4 12 + + - + X1X2X4 13 - - + + X3X4 14 + - + + X1X3X4 15 - + + + X2X3X4 16 + + + + X1X2X3X4 17 0 0 0 0 18 0 0 0 0 19 0 0 0 0 Từ bảng 2.5. chuẩn bị 19 thí nghiệm trong đó có 3 thí nghiệm trung tâm, 16 thí nghiệm bố trí theo mức biến thiên của từng yếu tố. Lưu ý, phải đánh số thứ tự cho các bình đựng mẫu trước khi cho cơ chất vào. Đợi thời gian khảo sát theo 3 mức, lấy dịch thu được mang đi xác định %DNS, HMF và chất khô. Xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2007 và Statgraphics centurion. Có kết quả xem xét tiến hành bố trí thí nghiệm leo dốc. Trang 68
Đồ án tốt nghiệp Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Các chỉ tiêu sinh hóa của rong Vaucheria spp 3.1.1. Chỉ tiêu độ ẩm Thí nghiệm được lặp lại 3 lần nên ta có: Bảng 3.1. Kết quả độ ẩm của mẫu rong Lặp G (g) G1 (g) G2 (g) X (%) 1 2.0000 2.5104 2.4218 4.4300 2 2.0000 2.5049 2.4344 3.5250 3 2.0000 2.4974 2.4340 3.1700 Vậy độ ẩm trung bình là: X = (4.4300+3.5250+3.1700)/3 = 3.7083% ~ 3,7g/mg 3.1.2. Chỉ tiêu khoáng tổng số Thí nghiệm được lặp lại 5 lần và ta có kết quả: Bảng 3.2. Kết quả khoáng tổng số Po (g) mẫu (g) P1 (g) P2 (g) X (%) Y (%) 22.7514 2.0000 24.7506 23.2342 75.8200 24.1400 20.6445 2.0000 22.6437 21.0870 77.8350 22.1250 21.2984 2.0000 23.2920 21.7646 76.3700 23.3100 19.7652 2.0000 21.7645 20.2440 76.0250 23.9400 40.2026 2.0000 42.2005 40.6625 76.9000 22.9950 Phần trăm chất mất khi khi nung: X = (75.82+77.84+76.37+76.025+76.9)/5 = 76.59% Phần trăm khoáng tổng số: Y = (24.14+22.13+23.31+23.94+23)/5 = 23.3% Phần trăm hàm lượng tro không tan trong HCl là: X = (21.1658-21.1265)/0.3378 *100 = 11.63% Trong đó: G: trọng lượng của chén (g) 21.1265g G1: Trọng lượng của chén và mẫu tro không tan (g) 21.1658g P : trọng lượng của mẫu thử ( g ): 0.3378g Trang 69
Đồ án tốt nghiệp Phần trăm hàm lượng tro không tan trong H2O là: Y = (41.2553-41.1231)/ 0.1927*100 = 68.60% Trong đó: G: trọng lượng của chén ( g ): 41.1231g G2: trọng lượng của chén và tro ( g ) : 41.2553g P : trọng lượng của mẫu ( g ) 0.1927g 3.1.3. Chỉ tiêu lipid Bảng 3.3. Kết quả lipid của mẫu T (%) b m1 m2 m3 4.1375 1.0006 1.4265 2.4271 2.3857 2.4271 − 2.3857 T = 100 1.0006 Vậy hàm lượng lipid có trong mẫu rong là T = 4,14% 3.1.4. Chỉ tiêu carbohydrate tổng số Bảng 3.4. Kết quả đường chuẩn glucose Ống nồng độ đường OD nghiệm (mg/ml) (540nm) 0 0 0 1 0.1 0.182 2 0.2 0.412 3 0.3 0.646 4 0.4 0.854 5 0.5 1.062 Mẫu thử 0.24 0.502 Trang 70
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1. các dịch mẫu dựng đường chuẩn Glucose 1.2 y = 2.16x - 0.014 1 R² = 0.999 0.8 0.6 Series1 0.4 Linear (Series1) 0.2 0 0 0.2 0.4 0.6 -0.2 Đồ thị 3.1. Đường chuẩn glucose Phương trình đường chuẩn glucose y = 2.16x – 0.014 Ta có OD của mẫu thử là y = 0.527, vậy nồng độ dường của mẫu thử x thế vào phương trình ta có : x = (0.502 + 0.014)/2.16 = 0.24 mg/ml Hàm lượng carbohydrate có trong mẫu rong là: X = (x * V)/m *HSPL = (0.24*100)/300*5*100% = 39 % 3.1.5. Hàm lượng Nito tổng số Bảng 3.5. Kết quả ni tơ tổng của mẫu Trang 71
Đồ án tốt nghiệp % nito tổng số Thể tích HCl Hệ số quy đổi Trọng lượng mẫu 24.1% 2.2 0.0035 0.2 Vậy hàm lượng nito tổng số trong mẫu rong là 24.1% 3.1.6. Phosphor tổng số Bảng 3.6. kết quả phosphor của mẫu Ống số Nồng Độ OD (650nm) 1 0.00 0.0000 2 10.00 0.3370 3 20.00 0.6840 4 30.00 1.0940 5 40.00 1.4550 6 50.00 1.9180 Mẫu thử 15.13 0.5360 Hình 3.2. Đường chuẩn phosphor Trang 72
Đồ án tốt nghiệp 2.5000 y = 0.0382x - 0.0392 2.0000 R² = 0.9974 1.5000 Series1 1.0000 Linear (Series1) 0.5000 0.0000 0.00 20.00 40.00 60.00 -0.5000 Đồ thị 3.2. Đường chuẩn phosphor Từ phương trình đường chuẩn y = 0.038x – 0.039 Và OD của mẫu thử ta có y = 0.536 Suy ra mật độ quang trong mẫu thử x = (0.536 + 0.039)/0.038 = 15.13 μg/ml Nồng độ phosphor (dung dịch 1) dịch thử được ước tính theo phương trình: X(mgP)= (15.13 * 0.0057)/0.0109 = 7.9 mgP Hàm lượng phosphor có trong mẫu là: ( có HSPL là5 lần) X (gP)*V %P ddtro *100% V *106 *m 7.9*20 = *100%*5 1*10^6*2 = 0.004% Trong đó: X: số  g P có trong dịch thử. Vddtro: thể tích dung dịch sau khi tro hóa. (20ml pha loãng 4 lần) m: khối lượng mẩu thử. 2g V:thể tích thử 1ml Sai số giữa hai lần phân tích song song với độ tin cậy p=0.95 không vượt qua d=28*(0.05+0.031X)% 3.1.7. Hàm lượng Fe Bảng 3.7. Kết quả đường chuẩn Fe Ống Nghiệm OD(485nm) Trang 73
Đồ án tốt nghiệp 0 0 1 0.113 2 0.237 3 0.343 4 0.493 5 0.638 Mẫu thử 1.645 0.8 y = 0.1267x - 0.0129 0.6 R² = 0.9962 0.4 Series1 0.2 Linear (Series1) 0 0 2 4 6 -0.2 Đồ thị 3.3. Đường chuẩn Fe So sánh kết quả đọc được trên biểu đồ mẩu va từ độ pha loãng dung dịch chuẩn, tính hàm lượng Fe (mg) trong 100g mẩu khô. Ta có phương trình đường chuẩn y = 0.0123x – 0.012  x = ( y + 0.012)/0.126  x = (1.645 + 0.012)/0.126 = 13.15 γ/ ml Hàm lượng Fe trong mẫu thử là X = (x*V)/m = (13.15*50)/2 = 328.75*10^-3 mg  % Fe = 0.000329% 3.1.8. Hàm lượng Cellulose Hàm lượng cenllulose được tính bằng công thức: X= a*100/w X = 0.27*100/1.5 X = 18% Trong đó: X : Hàm lượng cenllulose tính bằng (%). Trang 74
Đồ án tốt nghiệp a: Trọng lượng cenllulose (g). w: Trong lượng mẩu làm thí nghiệm. 100: Hệ số chuyển thành %. 3.1.9. Hàm lượng canxi và magiê Hàm lượng canxi – magie ( pha loãng 20 lần) Thể tích Trilon B 0.02N được tính theo công thức sau : v V *100 a v = v – vo = 1.5 – 0 = 1.5ml  V = (1.5/2)*100*20 = 1500ml Trong đó: v: thể tích dung dịch Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ. 1.5ml v0: thể tích dung dịch Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ sự thử không. Δv = v - v0 a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ. 2g V: thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ dung dịch mẫu tương đương với 100 g mẫu khô tính bằng ml/100 g mẫu khô. Xác định hàm lượng canxi Kết quả được tính theo các công thức sau a. Tính thể tích Trilon B cần chuẩn độ v (ml/100g mẫu khô ) V 1 *100 1 a V1 = (0.4/2)*100*20 = 400ml Lượng canxi trong 100g mẫu khô m1 = V1 * C * 20.04 = 400*0.02*20.04 = 160.32 mg %Ca = 0.16% Trong đó : v1: thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ Trang 75
Đồ án tốt nghiệp C: độ nguyên chuẩn của dung dịch Trilon B 0.02N a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ 2g 20,04: đương lượng của Canxi V1: thể tích Trilon B cần để chuẩn độ khi xác định lượng Canxi trong dung dịch mẫu tương đương với 100 g mẫu khô. Xác định lượng magie Sau khi đã biết V, thể tích trilon B dung để chuẩn độ khi xác định tổng lượng Ca và Mg trong 100g mẫu khô, và V1 thể tích trilon B dùng để xác định lượng Ca trong 100g mẫu khô, ta sẽ xác định được lượng magne. Lượng Mg ( tính bằng mg ) trong 100g mẫu khô là: m2=(V – V1)*C*12,16 m2 = (1500 – 400)*0.02*12.16 = 267.52mg = 0.268% 3.1.10. Tổng hợp các chỉ tiêu hóa sinh của rong Vaucheria spp Sau khi tiến hành đầy đủ các thí nghiệm ta có bảng số liệu các chỉ tiêu sinh hóa của rong vaucheria spp là bước khởi đầu cho việc tìm ra nguồn nguyên liệu thích hợp để lên men sản xuất ethanol. Sau khi có kết quả các số liệu, ta sẽ tiến hành so sánh với các chỉ tiêu của rong đã được áp dụng trước đó, và khảo nghiệm các khả năng thủy phân của để xem có phù hợp với mục tiêu đang nghiên cứu hay không. Bảng 3.8. Kết quả các chỉ tiêu sinh hóa của mẫu rong Vaucheria spp STT Nội dung Kết quả 1 Độ ẩm 3.7083% 2 Khoáng tổng số 23.3% 3 Hàm lượng tro không tan trong nước 68.60% 4 Hàm lượng tro không tan trong HCl 11.63% 5 Carbohydrate tổng số 39% 6 Nitơ tổng số 24.1% 7 Phosphor tổng số 0.004% 8 Hàm lượng sắt 0.00033% 9 Hàm lượng cellulose 18% 10 Hàm lượng riêng canxi 0.16% 11 Hàm lượng riêng magie 0.268% Trang 76
Đồ án tốt nghiệp Qua số liệu về các chỉ tiêu sinh hóa của rong , nhận thấy hàm lượng carbonhydrate cao và hiện nay rong này đang được nuôi trồng nhiều ở các tỉnh miền đồng bằng sông Cửu Long nên là điều kiện thích hợp nhất để sử dụng rong Vaucheria spp làm nguồn cơ chất cho quá trình thủy phân tạo đường glucose trong bước khởi đầu tạo sản phẩm xăng sinh học từ rong tảo. 3.2. Ảnh hưởng của các yếu tố trong giai đoạn tiền xử lý mẫu đến quá trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria spp 3.2.1. Kết quả khảo sát hàm lượng glucose ở nhiệt độ hấp 120oC với sự thay đổi của các yếu tố thời gian và nồng độ H2SO4 6.00 35.00 5.15 28.85 5.02 5.00 30.00 4.22 25.00 4.00 19.99 20.00 % HMF 3.00 15.20 BRIX 2.33 15.00 % DNS 2.00 10.00 1.20 0.98 0.95 1.00 0.66 5.00 1.06 0.00 0.00 NT1 NT2 NT3 NT4 Đồ thị 3.4. biểu diễn hàm lượng đường, hàm lượng HMF , độ brix dưới ảnh hưởng o của nồng độ H2SO4 trong giai đoạn tiền xử lý mẫu ở 120 C , thời gian 20 phút. Ở đồ thị trên khảo sát các nồng độ H2SO4 lần lượt là 1%, 1,5%, 2%, 2.5% tương ứng với các nghiệm thức (NT) 1, 2,3,4. Trang 77
Đồ án tốt nghiệp 6.00 33.29 35.00 4.97 30.00 5.00 26.81 4.33 4.08 25.00 4.00 20.00 17.27 % HMF 3.00 2.75 ĐỘ BRIX 15.00 % DNS 2.00 10.00 0.95 0.82 1.00 3.64 0.57 0.67 5.00 0.00 0.00 NT5 NT6 NT7 NT8 Đồ thị 3.5. biểu diễn hàm lượng đường, hàm lượng HMF , độ brix dưới ảnh hưởng o của nồng độ H2SO4 trong giai đoạn tiền xử lý mẫu ở 120 C , thời gian 30 phút. Ở đồ thị trên khảo sát các nồng độ H2SO4 lần lượt là 1%, 1,5%, 2%, 2.5% tương ứng với các nghiệm thức (NT) 5,6,7,8 5.00 4.65 35.00 4.41 4.52 4.50 29.95 30.00 4.00 3.76 24.21 3.50 25.00 3.00 17.64 20.00 % HMF 2.50 ĐỘ BRIX 15.00 2.00 % DNS 1.50 8.40 1.12 10.00 1.02 0.90 0.94 1.00 5.00 0.50 0.00 0.00 NT9 NT10 NT11 NT12 Đồ thị 3.6. biểu diễn hàm lượng đường, hàm lượng HMF , độ brix dưới ảnh hưởng o của nồng độ H2SO4 trong giai đoạn tiền xử lý mẫu ở 120 C , thời gian 40 phút. Ở đồ thị trên khảo sát các nồng độ H2SO4 lần lượt là 1%, 1,5%, 2%, 2.5% tương ứng với các nghiệm thức (NT) 9,10,11,12. Trang 78