Đồ án Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu

92 trang thiennha21 12/04/2022 2550

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_khao_sat_va_so_sanh_kha_nang_tiet_enzyme_ngoai_bao_va.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KÝ SINH TUYẾN TRÙNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum PHÂN LẬP TỪ ĐẤT RỪNG VÀ ĐẤT CANH TÁC Ở VŨNG TÀU Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Lê Thị Mai Châm Sinh viên thực hiện : Trần Thị Ngọc Hạnh MSSV: 1151110125 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố HCM nói chung và các anh chị công tác tại phòng Vi sinh nói riêng, đã tạo điều kiện cho em tham gia làm đồ án tốt nghiệp tại đây. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Lê Thị Mai Châm, chị Nguyễn Thị Thùy Dương đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp của em tại Trung tâm. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại Học Công Nghệ Tp.HCM và quý thầy cô đã tận tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức cần thiết, bổ ích để chúng em có thể hoàn thành tốt quá trình học tập của mình. Cuối cùng em xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn đồng hành và ủng hộ em trong suốt quá trình này. XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN TP.HCM, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện Trần Thị Ngọc Hạnh
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của cá nhân. Các kết quả và số liệu trong đồ án là trung thực. Ngƣời cam đoan Trần Thị Ngọc Hạnh
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. 3 1.1.1 Phân loại 3 1.1.2 Vòng đời 3 1.1.3 Cấu tạo trứng của tuyến trùng 4 1.1.4 Cấu tạo thành cơ thể con cái của tuyến trùng 5 1.2 Nấm Purpureocillium lilacinum 5 1.2.1 Phân loại 5 1.2.2 Điều kiện sống 6 1.2.3 Đặc điểm hình thái 7 1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng 8 1.2.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào 8 1.2.6 Độc tố của P. lilacinum 10 1.2.7 Quá trình kí sinh 11 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 12 2.2 Thiết bị, hóa chất, vật liệu nghiên cứu 12 2.2.1 Dụng cụ, thiết bị 12 2.2.2 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu 12 2.2.3 Hóa chất 14 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào protease, chitinase của nấm P. lilacinum 16 2.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng xâm nhập trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của nấm P. lilacinum 18 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 19 i
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum 20 3.1.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease 20 3.1.2 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào chitinase của các chủng nấm P. lilacinum 26 3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum 30 3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum 31 3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên tuyến trùng cái Meloidogyne spp. 36 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 ii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu 12 Bảng 3.1 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất rừng ở Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau 20 Bảng 3.2 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất canh tác ở Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau 22 Bảng 3.3 Mức độ tiết enzyme protease của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau 25 Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất rừng ở Vũng Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau 26 Bảng 3.5 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất canh tác ở Vũng Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau 27 Bảng 3.6 Mức độ tiết enzyme chitinase của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau 30 Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh trên khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu 32 Bảng 3.8 Mức độ ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau 35 Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh trên con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu 36 Bảng 3.10 Mức độ ký sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau 38 iii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian. 24 Biểu đồ 3.2 Vòng phân giải chitin trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian. 29 Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh khối trứng trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập ở đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau. 34 Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau. 37 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh thực vật. 3 Hình 1.2 Hình thái tuyến trùng cái Meloidogyne sp 5 Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc P. lilacinum sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA. 7 Hình 1.4 Hình thái cơ quan mang bào tử và bào tử nấm P. lilacinum. 7 Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin. 11 Hình 3.1 Vòng phân giải casein của chủng PB 2.10 trong các khoảng thời gian 24 giờ; 48 giờ và 72 giờ 21 Hình 3.2 Vòng phân giải casein của chủng PB 1.1, PB 1.10, PB 3.1 ở 48 giờ 21 Hình 3.3 Vòng phân giải casein của chủng KL 5.3 và KL 6.2 và KL 5.2 ở 72 giờ. 24 Hình 3.4 Vòng phân giải casein của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác sau 24 giờ , 48 giờ, 72 giờ. 25 Hình 3.5 Vòng phân giải chitin của chủng PB 3.3 sau 24 giờ , 48 giờ , 72 giờ. 27 Hình 3.6 Vòng phân giải chitin của chủng HT 5.1 sau 24 giờ , 48 giờ, 72 giờ . 29 Hình 3.7 Quá trình khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh. hình dạng khối trứng ban đầu, nấm tiếp xúc khối trứng, khối trứng bị kí sinh. 33 Hình 3.8 Quá trình tuyến trùng cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh. hình dạng con cái ban đầu, nấm bắt đầu ký sinh, con cái bị kí sinh. 37 v
Đồ án tốt nghiệp TÓM TẮT Khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào của 38 chủng nấm Purpureocillium lilacinum bằng phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch. Sau thử nghiệm, chọn lọc ra các chủng nấm tiêu biểu có khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase mạnh để thử nghiệm khả năng ký sinh con cái và khối trứng Meloidogyne spp. trực tiếp trên đĩa Petri. Kết quả, tất cả các chủng nấm Purpureocillium lilacinum đều có khả năng tiết enzyme ngoại bào và khả năng tiết enzyme protease mạnh hơn so với chitinase. Đối với enzyme chitinase, đường kính vòng phân giải cơ chất tối ưu nhất đạt được sau 48 giờ. Các chủng có khả năng phân hủy chitin mạnh là PB 3.3, HT 5.1, KL 6.2 và KL 5.3. Đối với enzyme protease thì các chủng nấm khảo sát có khả năng tiết mạnh nhất sau 72 giờ. Các chủng có khả năng phân hủy casein mạnh là PB 2.10, PB 1.3, KL 5.3 và KL 6.2. Không có sự khác biệt về mặt thống kê khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập từ đất rừng và đất canh tác. Kết quả thử nghiệm ký sinh tuyến trùng cho thấy, tất cả các chủng nấm khảo sát PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10, PB 3.3 đều có thể ký sinh con cái Meloidogyne spp. nhanh và mạnh hơn so với khối trứng của nó. vi
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Tuyến trùng ký sinh trên thực vật gây ra thiệt hại đáng kể về mặt kinh tế đối với nhiều loại cây trồng có giá trị thương nghiệp. Hàng năm, tuyến trùng gây tổn thất 11% năng suất các loại cây ngũ cốc, rau ăn lá, chuối, khoai mì, dừa, khoai tây, củ cải đường, mía đường, khoai lang, làm giảm 15% năng suất các loại cây trồng kinh tế quan trọng (Agrios, 2005). Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, tuyến trùng phát triển khá mạnh và gây tác hại nặng nề cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều vùng, đặc biệt là rau và các loại cây công nghiệp trong đó có cây hồ tiêu. Cây hồ tiêu là cây công nghiệp dài ngày, có giá trị kinh tế, được trồng ở nhiều nơi và có giá trị xuất khẩu cao trên thế giới. Diện tích đất canh tác ở Vũng Tàu chiếm 9047 ha, trong đó có khoảng gần 0,5% diện tích đất trồng bị nhiễm bệnh nguyên nhân là do tuyến trùng gây nên.Việc dùng thuốc hóa học để tiêu diệt tuyến trùng hại thực vật kéo theo các tác động tiêu cực đến môi trường và an toàn sức khỏe cho con người và vật nuôi. Bên cạnh đó, nó còn tăng tính kháng thuốc của sâu hại, làm cho việc phòng trừ ngày càng khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay người ta đang tìm kiếm các tác nhân sinh học để sử dụng thay thế một phần hoặc hoàn toàn thuốc hóa học trong kiểm soát tuyến trùng gây hại. Do đó việc nghiên cứu tìm ra các chủng nấm có khả năng ký sinh tuyến trùng là vấn đề đang được quan tâm hiện nay. Nấm Purpureocillium đã được chứng minh có khả năng ký sinh tuyến trùng hiệu quả và sống hoại sinh trong vùng rễ nhiều loại cây trồng. Chúng đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phân lập hay xác định khả năng ký sinh tuyến trùng của nấm Purpureocillium còn rất hạn chế đặc biệt là các chủng nấm được phân lập ở vùng Đông Nam Bộ. Do đó, năm 2014, Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp. Hồ Chí Minh đã xác định sự phân bố của nấm này ở các hệ sinh thái đất (đất tự nhiên-đất rừng, đất canh tác-đất trồng) ở vùng này. Kết quả cho thấy nấm xuất hiện ở hầu hết các vùng, trong đó có hệ sinh thái rừng ngập mặn ở Vũng Tàu. Việc xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm này là rất cần thiết có thể giúp ích trong việc kiểm 1
Đồ án tốt nghiệp soát bệnh do tuyến trùng gây ra trong tương lai. Do đó dẫn đến lý do chọn đề tài: “Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm Purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu”. Mục tiêu nghiên cứu: So sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào, xâm nhập con cái và khối trứng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacium (P. lilacinum) phân lập được từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học Đây là nghiên cứu đầu tiên về xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào cũng như kí sinh tuyến trùng của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng ngập mặn và đất canh tác ở Vũng Tàu. Từ đó, xác định được hệ sinh thái đất (đất rừng hay đất canh tác) tồn tại những chủng nấm P. lilacinum có đặc tính tốt. Ý nghĩa thực tiễn So sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và khả năng xâm nhập tuyến trùng của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác giúp chọn lọc được chủng nấm kí sinh tuyến trùng hiệu quả nhằm ứng dụng chúng để phòng trừ tuyến trùng gây hại cây trồng. 2
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. 1.1.1 Phân loại Meloidogyne spp. là tuyến trùng ký sinh thực vật. Chúng tồn tại trong đất ở nơi có khí hậu nóng hay có mùa đông ngắn. Khoảng 2000 loài thực vật bị nhiễm loại tuyến trùng này, nó chiếm 5% trong nguyên nhân gây mất mùa trên thế giới (Sasser, 1985). Ấu trùng xâm nhập vào rễ cây, hình thành những nốt sần ở rễ, hấp thụ chất dinh dưỡng của thực vật. Gây ra hiện tượng chết ở cây con và giảm năng suất ở cây trưởng thành khi xâm nhập vào cây. Phân loại theo Goeldi (1889) như sau: Giới: Animalia Nghành: Nematoda Lớp: Secernentea Bộ : Tylenchida Họ: Meloidogynidae Chi: Meloidogyne 1.1.2 Vòng đời Hình 1.1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh thực vật. (Nguồn: www.daf.qld.gov.au) 3
Đồ án tốt nghiệp Tuyến trùng rễ bắt đầu vòng đời ở giai đoạn trứng phát triển thành ấu trùng tuổi 1. Giai đoạn này ấu trùng sống trong túi trứng và lột xác chuyển sang giai đoạn ấu trùng tuổi 2. Ấu trùng ở thời kỳ này có thể bắt đầu xâm nhập vào rễ thực vật, chúng tấn công vào chóp rễ rồi đi vào các gian bào. Ấu trùng di chuyển đến các tế bào đang phân chia để tạo vị trí lấy thức ăn bằng cách tiêm dịch tiết của tuyến thực quản vào trong các tế bào rễ. Những dịch được tiết ra này là nguyên nhân gây ra sự thay đổi các chức năng sinh lý của tế bào ký sinh. Ấu trùng tuổi 2 chưa có cơ quan sinh sản. Giống với giun tròn, tuyến trùng rễ trải qua 4 giai đoạn ấu trùng, trong mỗi giai đoạn chúng lột xác giống như côn trùng. Nhờ vậy ấu trùng có một vài nét tương đồng với tuyến trùng đực và cái ở giai đoạn trưởng thành. Ở giai đoạn tuổi 4, là quá trình từ ấu trùng chuyển sang dạng hình cầu ở con cái trưởng thành hay dạng giun của con đực trưởng thành có thể nhìn thấy rõ ràng hơn. Con cái trưởng thành có thể đẻ từ 500 đến hơn 1000 trứng. Chiều dài của vòng đời tuyến trùng rễ khác nhau tùy theo mỗi loài, nhưng ngắn nhất là trong khoảng 2 tuần. Các loài ở những vùng lạnh hơn thì vòng đời sẽ dài hơn. Trứng của tuyến trùng có thể ở nguyên trong rễ hay lẫn vào trong đất. Trứng nở một cách ngẫu nhiên, không cần tiếp xúc với các dịch chiết ở rễ. Trong điều kiện thuận lợi, trứng có thể tồn tại trong đất ít nhất trong vòng 1 năm (Mitkowski và cộng sự, 2003). 1.1.3 Cấu tạo trứng của tuyến trùng Tuyến trùng cái đẻ trứng vào chất nền gelatin được sản xuất bởi 6 tuyến trực tràng, và được tiết ra trước và trong suốt quá trình đẻ trứng. Hình dạng chất nền ban đầu là ống thông qua các lớp ngoài của mô rễ bao quanh trứng, tạo thành một lớp bảo vệ chống mất nước bằng cách duy trì một mức độ ẩm cao quanh trứng (Bird, 1887). Cấu tạo của trứng tuyến trùng: lớp vỏ trứng là phần bền nhất của trứng tuyến trùng, có vai trò trong việc chống lại các tác nhân bất lợi về mặt hóa học và sinh học (Wharton, 1980). Vỏ trứng của tuyến trùng có thể bao gồm từ một đến năm lớp tùy thuộc theo từng bộ tuyến trùng. Cấu trúc thường thấy nhất của vỏ trứng gồm: lớp 4
Đồ án tốt nghiệp trong cùng là lớp lipid, một lớp chitin ở chính giữa (thành phần chính) và lớp màng vitelline ở ngoài cùng (Bird và cộng sự, 1976). Lớp chitin đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra một cấu trúc bền vững để bảo vệ cho lớp lipid trong cùng. Lớp lipid bao gồm một chuỗi màng lipoprotein và dày nhất trong khoảng 0,02 – 0,04 µm, có vai trò trong việc chống thấm để bảo vệ trứng khỏi các tác nhân hóa học bất lợi (Wharton, 1980). Nếu lớp chitin bị loại bỏ thì lớp lipid cũng dễ dàng bị phá hủy. 1.1.4 Cấu tạo thành cơ thể con cái của tuyến trùng Hình 1.2 Hình thái tuyến trùng cái Meloidogyne sp (Nguồn: www.lsuagcenter.com) Con cái của tuyến trùng Meloidogyne spp. hình cầu với cổ ngắn chứa kim hút (nên gần giống với hình quả lê), diều giữa và tuyến thực quản (Mitkowski và cộng sự, 2003). Thành cơ thể của tuyến trùng cái được bao bọc bởi lớp cutin chứa rất ít chitin mà chủ yếu là protein và collagen (Watson, 1965). Lớp cutin Meloidogyne incognita dày khoảng 1,5 µm bao gồm lớp vỏ, lớp trung gian và lớp cơ bản. Lớp vỏ được phân tối thiểu thành 5 lớp và có dộ dày khoảng 0,1 µm, lớp giữa thì khoảng 0,4 µm và lớp cơ bản là 0,5 µm (Baldwin và cộng sự, 1975). 1.2 Nấm Purpureocillium lilacinum 1.2.1 Phân loại P. lilacinum được mô tả lần đầu bởi nhà nghiên cứu nấm người Mỹ Charles Thom vào năm 1910, dưới tên gọi Penicillium lilacinum (Thom, 1910). Phân loại giống với chủng Penicillium amethystinum của Wehmer và Spicaria rubidopurpurea 5
Đồ án tốt nghiệp của Aoki (Thom, 1974). Năm 1974, Robert A. Samson chuyển tên Penicillium lilacinum thành Paecilomyces (Samson, 1974). Các ấn phẩm được xuất bản trong những năm thập niên 20, chỉ ra rằng chi Paecilomyces không phải là một đơn ngành (Inglis và cộng sự, 2006), và có họ hàng gần với các chủng Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis và Nomuraea atypicola. Chi mới Purpureocillium được tạo ra để giữ sự phân loại này (Sung và cộng sự, 2007). là tên chung dùng để chỉ các loại nấm sản sinh bào tử tím (Luangsa-Ard và cộng sự, 2011). P. lilacinum được phân loại là nấm sinh sản vô tính bằng bào tử theo loài Isarioidea, và đã được chấp nhận ở khắp nơi trên thế giới, do dạng sinh sản hữu tính hiếm khi được tìm thấy. Phân tích phát sinh loài cho thấy P. lilacinum phân lập được có mối quan hệ gần với Trichoderma, Gliocladium và Hypocrea hơn các loài Paecilomyces kí sinh côn trùng khác trong bộ Hypocreales (Inglis và cộng sự, 2006). Nấm này được phân loại theo Samson và cộng sự (2011) như sau: Giới: Fungi Nghành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Ophiocordycipitaceae Chi: Purpureocillium Loài: Purpureocillium lilacinum 1.2.2 Điều kiện sống Nấm P. lilacinum là nấm sợi hoại sinh phổ biến, đã được phân lập từ một loạt các môi trường sống như đất trồng trọt, đất bỏ hoang, rừng đồng cỏ, sa mạc, trầm tích ở cửa sông và bùn thải. Nó cũng được tìm thấy trên trứng của tuyến trùng và con cái của tuyến trùng gây nốt sần ở rễ cây. Bên cạnh đó, nó cũng được tìm thấy ở vùng rễ của nhiều loại cây trồng. Nhiều loài có thể phát triển trên một phạm vi nhiệt độ rộng trong khoảng từ 8oC đến 38oC và phát triển tối ưu ở nhiệt độ từ 26oC đến 30oC. Nấm này có thể chịu 6
Đồ án tốt nghiệp được một khoảng pH rộng và có thể phát triển trên nhiều loại môi trường tự nhiên (Samson, 1974; Anderson và cộng sự, 1995). 1.2.3 Đặc điểm hình thái Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc P. lilacinum sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA. (Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp) Khuẩn lạc của P. lilacinum trên môi trường thạch Malt tăng trưởng khá nhanh đạt đường kính 5 – 7 cm trong vòng 14 ngày ở 25oC (77oF), gồm dạng nền bông với hệ sợi nấm dinh dưỡng tăng trưởng nhanh, ban đầu màu trắng nhưng khi hình thành bào tử thì chuyển sang màu tím. Mặt khác, có một số chủng đôi khi không có màu nhưng thường thì đều có màu tím (Samson, 1974). Hình 1.4 Hình thái cơ quan mang bào tử và bào tử nấm P. lilacinum. (Nguồn: P. lilacinum tạo thành một hệ sợi nấm dày đặc sản sinh ra cuống bào tử đính. Sợi nấm sinh dưỡng có vách trơn, trong suốt, rộng từ 2,5 – 4 µm. Cuống bào tử được sinh ra từ các sợi nấm cơ chất, hoặc những sợi nấm dinh dưỡng, dài khoảng 400 – 600 µm. Thể bình phình ra ở gốc và thon dần về phía ngọn. Bào tử trần được 7
Đồ án tốt nghiệp sinh ra tạo thành chuỗi dài, ở phía cuối thể bình gắn trên cuống bào tử. Bào tử nảy mầm khi có đủ độ ẩm và dinh dưỡng thích hợp. Bào tử trần có dạng elip đến hình thoi, có vách trơn hơi nhám. Không xuất hiện bào tử đảm (Samson, 1974). 1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng Nấm không có diệp lục tố nên cần cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (dị dưỡng) sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong trứng và tuyến trùng Meloidogyne spp.) hay hoại sinh trên xác bã hữu cơ. Do trứng và tuyến trùng là nguồn hữu cơ phức tạp nên nấm sẽ tiết ra enzyme ngoại bào (protease, chitinase) để phân giải các chất khó hấp thụ thành những chất đơn giản dễ sử dụng (Nguyễn Văn Bá và cộng sự, 2005). 1.2.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào Vỏ trứng được cấu tạo từ 3 lớp khác biệt và thành phần chính gồm protein và chitin, đã tạo thành cấu trúc dạng sợi nhỏ chứa glycoprotein ở dạng vô định hình (Perry, 2002). Chitinase và proteases đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình xâm nhập vào vỏ trứng, và tác động vào sự phân hủy của vỏ trứng (Morton, 2003; Segers, 1996). Nấm có khả năng tiết enzyme ngoại bào (đặt biệt là enzyme protease, chitinase và collagenase) có ảnh hưởng nhiều trong việc ký sinh lên trứng của tuyến trùng (Huang, 2004). P. lilacinum có khả năng tiết enzyme serine protease và chitinase để tham gia vào quá trình phá hủy vỏ trứng của tuyến trùng (Morgan và cộng sự, 1984; Khan và cộng sự, 2004). Nhiều enzyme được tiết bởi P. lilacinum đã được nghiên cứu. Enzyme serine protease cơ bản có khả năng phân hủy sinh học trứng Meloidogyne hapha (Bonants và cộng sự, 1995). Một chủng P. lilacinum đã được phân lập và nghiên cứu có khả năng tiết enzyme protease và chitinase làm mỏng vỏ trứng tuyến trùng Meloidogyne javanica để cho móc xâm nhiễm có thể đâm xuyên qua vỏ trứng (Khan và cộng sự, 2004). 8
Đồ án tốt nghiệp Enzyme protease Enzyme protease (còn gọi là peptidase hay proteinase) là nhóm enzyme có khả năng phân giải protein. Đó là quá trình chuyển hóa protein bằng cách cắt các liên kết peptide (-CO-NH-) liên kết các acid amin trong một chuỗi polypeptide. Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin proteinase - những proteinase chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cysteine proteinase - chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspartic proteinase - chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động. Các aspartic thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. Metallo proteinase - được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA (Trần Thị Nhã Uyên, 2010). Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994). Bước 1 - hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử carbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. Bước 2 (khử acyl hóa) phức hệ acyl-enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme. Enzyme chitinase Chitinase là enzyme thủy phân liên kết glycoside trong chitin (Jolles, 1999). Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, 1-4-β- chitobiosidase, N-acetyl-β- D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase. Endochitinase là enzyme phân cắt 9
Đồ án tốt nghiệp nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn olygosaccharides. Chitin 1,4-β- chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các dimer chitobiose. N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine. Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D- glucosamine. Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa. Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2, β-N-acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc). Endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm (Lê Thị Huệ, 2010). 1.2.6 Độc tố của P. lilacinum Ngoài khả năng tiết enzyme ngoại bào P. lilacinum còn có khả năng sinh độc tố. Độc tố chính của nấm P. lilacinum là paecilotoxin (leucinostatins), là một trong các tác nhân gây ra cái chết cho kí chủ. Paecilotoxin có cấu trúc cực kỳ phức tạp, là một chuỗi peptide thẳng gồm nhiều acid béo chưa bão hòa ở đầu N và amine ở đầu C. Paecilotoxin có pháp danh hóa học là (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[2[2-(3- arbamoylpropylcarbomoyl)propan-2-ylcarbamoyl]propan-2-ylcarbamoy]-3- methylbutyl]carbomoyl]-3-methyl-butyl]carbomoyl]propan-2-ycarbomoyl]-2- hydroxy-3-methyl-butul] carbomyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo-nonyl]-4-methyl-1- [(E.4S)-4-methylhex-2-enoyl]pyrrolidin-2-carboxamide (Nevalainen và cộng sự, 1977). Sản phẩm của paecilotoxin có rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B. Tùy từng loài 10
Đồ án tốt nghiệp khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hoá thứ cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng. Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin. 1.2.7 Quá trình kí sinh Nấm xâm nhập vào trứng và con cái của tuyến trùng thông qua chất nền gelatin của trứng và lỗ sinh dục hay cổ của tuyến trùng cái. Một khi vào bên trong, sợi nấm sẽ phân nhánh và đâm xuyên qua bề mặt vỏ trứng. Chỗ phình ra ở đầu sợi nấm sẽ tạo ra những đĩa áp tiếp xúc với bề mặt trứng. Móc xâm nhập được tạo nên bên dưới sợi áp sẽ đâm xuyên và mọc bên trong vỏ trứng. Trứng bị xâm nhiễm sẽ phình ra và biến dạng. Sau đó, lớp màng vitelline chia thành ba vùng, xuất hiện một lượng lớn không bào và lớp lipid hầu như biến mất (Esser và cộng sự, 1993). Khi sợi nấm đã xâm nhập vào trứng, nó nhanh chóng tiêu diệt các ấu trùng bên trong trước khi tiến ra khỏi vỏ trứng rỗng để sản sinh bào tử đỉnh và mọc về phía các trứng liền kề. Ở con cái trưởng thành giai đoạn bị nhiễm nấm là khi sợi nấm tiến vào lỗ sinh dục hoặc hậu môn (Jatala và cộng sự, 1979). 11
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 4 – tháng 8 năm 2015 Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Vi sinh – Trung tâm công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh. 2.2 Thiết bị, hóa chất, vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Dụng cụ, thiết bị Nồi hấp khử trùng Que cấy điểm Dao cấy Đĩa Petri Ống ngiệm Đèn cồn Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm Micropipette 2.2.2 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu Vật liệu: Khối trứng và tuyến trùng cái Meloidogyne spp. được thu nhận từ rễ cây. Đối tượng: 38 chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu do Phòng Công nghệ Vi sinh của Trung Tâm Công nghệ sinh học cung cấp. Bảng 2.1 Các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu STT TÊN NGUỒN GỐC 1 PB 1.1 2 PB 1.3 Đất rừng Bình Châu - Phước Bửu 3 PB 1.7 ở Vũng Tàu 4 PB 1.10 12
Đồ án tốt nghiệp 5 PB 2.9 6 PB 2.10 7 PB 3.1 8 PB 3.3 9 PB 3.4 10 KL 1.2 11 KL 1.3 12 KL 1.4 13 KL 3.1 14 KL 4.1 15 KL 5.1 16 KL 5.2 17 KL 5.3 18 KL 6.1 19 KL 6.2 20 KL 8.2 21 HT 1.1 22 HT 1.2 23 HT 1.3 Đất canh tác ở 24 HT 2.1 Vũng Tàu 25 HT 2.2 26 HT 2.3 27 HT 3.1 28 HT 3.2 29 HT 3.3 30 HT 4.1 31 HT 4.2 32 HT 4.3 33 HT 5.1 34 HT 5.2 35 HT 6.1 36 HT 6.3 37 HT 7.2 38 HT 7.3 13
Đồ án tốt nghiệp 2.2.3 Hóa chất Các môi trường sử dụng Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) PDA 39 g Nước cất 1000 ml pH = 6,1 – 6,5 Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút. Môi trường cảm ứng enzyme protease KH2PO4 1,5 g K2HPO4.3H2O 1,4 g CaCl2.2H2O 0,4 g MgSO4.7H2O 0,41 g NaCl 0,2 g Agar 16 g Casein 1% Nước cất 1000 ml pH = 6,1 – 6,5 Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút. Cách pha dung dịch casein 1%: Đun sôi cách thủy 1g casein trong dung dịch đệm sorensen đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng sorensen cho đủ 100 ml. Chuẩn bị dung dịch đệm casein 1%: Dung dịch Na2HPO4 1/15 M: Hoà tan 5,96 g Na2HPO4 trong nước cất thành 250 ml. Dung dịch KH2PO4 1/15 M: Hòa tan 0,9072 g KH2PO4 trong nước cất thành 100 ml. Dung dịch đệm sorensen 1/15 M: Trộn 177 ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4, đo và chỉnh lại pH = 7,6. Môi trường cảm ứng enzyme chitinase KH2PO4 1,5 g K2HPO4.3H2O 1,4 g CaCl2.2H2O 0,4 g MgSO4.7H2O 0,41 g 14
Đồ án tốt nghiệp NaCl 0,2 g NaNO3 15 g Chitin huyền phù 1% Agar 16 g Nước cất 1000 ml pH = 6,1 - 6,5 Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút. Cách chuẩn bị chitin huyền phù 1%: 1g bột vỏ tôm được cho dần vào 20 ml HCl đậm đặc, để ở 4oC và khuấy đều qua đêm. Thêm vào hỗn hợp 200 ml ethanol lạnh (-20oC) khuấy đều thật nhanh và ủ qua đêm. Ly tâm hỗn hợp ở 5000 vòng/ phút, trong 20 phút, thu lấy kết tủa và rửa bằng nước cất cho đến khi pH trung tính. Thêm nước cất vào tủa cho đến thể tích 100 ml (Dai và cộng sự, 2011). Môi trường Water Agar (WA) Agar 16 g Nước cất 1000 ml pH = 6,1 - 6,5 Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút. Môi trường Water Agar (WA) mềm Agar 14 g Nước cất 1000 ml pH = 6,1 - 6,5 Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút. Các thuốc thử sử dụng Thuốc thử Trichloroacetic acid (TCA) 10% TCA 10 g Nước cất 100 ml Thuốc thử lugol Iod tinh thể 1 g KI 2 g Nước cất 300 ml 15
Đồ án tốt nghiệp Cách pha: Hòa tan KI trong cối với 5 - 10 ml nước cất. Thêm Iod tinh thể vào và nghiền cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Cho dung dịch nghiền vào cốc đong và thêm nước cất đến 300 ml. Bảo quản trong lọ màu và chỉ trong vòng 30 ngày trước khi sử dụng (Nguyễn Đức Lượng, 2003). Thuốc nhuộm Thuốc nhuộm lactophenol cotton blue (LPCB) Phenol tinh thể 20 g Cotton blue (Aniline blue) 0,05 g Glycerol 40 ml Acid lactic 20 ml Nước cất 20 ml Cách pha: Hòa tan phenol tinh thể, glycerol và acid lactic với nước cất trong cốc thủy tinh đem đun cách thủy, sau đó cho thuốc nhuộm cotton blue rồi trộn đều. Bảo quản trong lọ thủy tinh tối màu (TCVN). 2.3 Nội dung nghiên cứu - Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu. - So sánh khả năng xâm nhập con cái và khối trứng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum này. 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào protease, chitinase của nấm P. lilacinum Nguyên tắc Đối với enzyme protease: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung casein 1%, nấm sẽ tiết ra enzyme protease phân giải casein thành các amino acid. Các dạng amino acid được tạo thành sẽ không phản ứng với thuốc thử TCA 10%, chỉ có casein mới tạo tủa trắng đục với TCA 10%. Đối với enzyme chitinase: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung chitin, nấm sẽ tiết ra enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc 16
Đồ án tốt nghiệp mạch ngắn hơn và N-acetyl- D- glucosamine. Các dạng này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol, do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt phản ánh khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm sợi. Phương pháp này chỉ định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng tổng hợp chitinase chứ chưa xác định chính xác hoạt độ chitinase (Lê Thị Huệ, 2010). Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 38 chủng nấm khảo sát. Thực hiện trên đĩa Petri chứa môi trường có chứa cơ chất cảm ứng enzyme cần khảo sát và lặp lại 3 lần cho mỗi chủng nấm ứng với mỗi mốc thời gian khảo sát (24, 48, 72 giờ). Thực hiện Cấy nấm từ ống giống vào môi trường thạch PDA trong đĩa Petri bằng phương pháp cấy điểm rồi đem ủ trong 7 ngày. Sau đó, cấy chuyển nấm từ môi trường PDA qua môi trường thạch WA trong đĩa Petri đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày để sợi nấm phát triển. Tiếp theo, đổ môi trường đã hấp khử trùng có chứa cơ chất cảm ứng phù hợp với enzyme cần khảo sát vào đĩa Petri (9 ml môi trường / đĩa) và để nguội. Sử dụng dụng cụ khoan thạch 5 mm để đục các tản thạch có chứa tơ nấm trên môi trường WA, rồi dùng dao cấy chuyển các tản thạch này vào môi trường có chứa cơ chất cảm ứng bằng phương pháp cấy úp ngược đĩa thạch để tránh hiện tượng phát tán bào tử ra xung quanh môi trường. Đem ủ ở nhiệt độ phòng, rồi nhỏ thuốc thử phù hợp với từng loại enzyme cần khảo sát (TCA 10% đối với enzyme protease và lugol đối với enzyme chitinase) sau 24, 48, 72 giờ để xác định vòng phân giải cơ chất. Chỉ tiêu theo dõi Đo đường kính khuẩn lạc (d, mm) và đường kính vòng phân giải cơ chất (D, mm) sau các khoảng thời gian 24, 48, 72 giờ sau khi cấy. Xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng nấm dựa vào hiệu D - d (mm). 17
Đồ án tốt nghiệp Đối với enzyme protease: D - d ≥ 9: mạnh 7≤ D - d < 9: khá 5 ≤ D - d < 7: trung bình D - d < 5: yếu Đối với enzyme chitinase: D - d ≥ 5: mạnh 4 ≤ D - d < 5: khá 3 ≤ D - d < 4: trung bình D - d < 3: yếu 2.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng xâm nhập trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của nấm P. lilacinum Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với nghiệm thức là số chủng nấm P. lilacinum có khả năng tiết enzyme ngoại bào mạnh ở hai vùng và được lặp lại 3 lần cho mỗi nghiệm thức. Mỗi lần lặp lại tiến hành trên 3 - 4 con cái hay khối trứng đặt trong đĩa Petri chứa môi trường WA mềm. Thực hiện Theo phương pháp cải tiến của Stirling và West (1991), thu nhận trứng và con cái từ các nốt sần của rễ tiêu. Rửa qua trứng và con cái vài lần bằng nước cất đã được hấp khử trùng để loại bỏ chất bẩn, rồi đặt chúng lên khăn giấy vô trùng. Sử dụng dụng cụ khoan lỗ thạch đục các tản thạch có chứa sinh khối nấm đã được nuôi cấy sau 7 ngày trên môi trường PDA sao cho các tản nấm được đục nằm trên cùng một vòng tròn để nấm trên các miếng thạch được tương đồng với nhau. Rồi, dùng dao cấy chuyển các tản nấm lên môi trường WA mềm chứa trong đĩa Petri đã chuẩn bị trước đó. Đồng thời, đặt các khối trứng hoặc con cái xung quanh tản nấm này. Đem để ở nhiệt độ phòng và tiến hành quan sát để kiểm tra khả năng ký sinh (Stirling và cộng sự, 1991). 18
Đồ án tốt nghiệp Chỉ tiêu theo dõi Tính số con cái hay khối trứng bị nấm ký sinh sau mỗi 24 giờ. Thí nghiệm này sẽ kết thúc khi có một chủng nấm ký sinh hoàn toàn số con cái hay khối trứng trong một thí nghiệm. Dùng thuốc nhuộm LPCB để quan sát sự xâm nhập của sợi nấm vào trứng và con cái. Xác định khả năng ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm theo công thức: Tỷ lệ con cái hay khối trứng được ký sinh trên tổng số con cái hay khối trứng có trong một đĩa. Theo đó, Tỷ lệ ký sinh trên 75%: ký sinh mạnh Tỷ lệ ký sinh từ 50 - 75%: ký sinh khá Tỷ lệ ký sinh từ 25 - 50%: ký sinh trung bình Tỷ lệ ký sinh nhỏ hơn 25%: ký sinh yếu 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu Tính hiệu D-d và tỷ lệ ký sinh tuyến trùng bằng chương trình Excel 2007. Sau đó xử lý số liệu bằng phần mềm xử lý thống kê SAS 9.0. Phân loại số liệu theo LSD0,05. 19
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum 3.1.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease Để đánh giá sơ bộ khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu, ta sử dụng phương pháp 2.3.1. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.1 và bảng 3.2 Bảng 3.1 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất rừng ở Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau Vòng phân giải casein theo thời gian (D-d (mm)) Chủng TB 24h 48h 72h (chủng) PB 1.1 6,203i-l 9,347abc 7,070f-j 7,540C PB 1.3 8,770a-e 8,130c-g 8,443b-f 8,448AB PB 1.7 6,820g-k 6,243h-k 5,800j-m 6,288D PB 1.10 8,790a-e 8,847a-d 6,143j-l 7,927BC PB 2.9 4,720lmn 4,957l-n 7,013f-j 5,564D PB 2.10 7,125f-j 9,907ab 10,003a 9,012A PB 3.1 7,247e-j 8,28c-g 7,787d-h 7,771BC PB 3.3 4,130n 5,393k-n 7,753d-i 5,759D PB 3.4 4,517mn 5,980j-m 7,790d-h 6,096D TB (thời gian) 6,481B 7,454A 7,534A CV(%)=13,261 F* = 15,73 F* = 10,31 F = 5,37 A B AB Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01). 20
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào bảng kết quả 3.1, có thể thấy các chủng nấm phân lập ở đất rừng Vũng Tàu đều có khả năng tiết enzyme protease. Xét theo thời gian, thấy không có sự khác biệt về khả năng tiết enzyme ngoại bào ở 48 giờ và 72 giờ. Ở thời gian đầu nuôi cấy, các chủng nấm này phân hủy cơ chất yếu nên vòng phân giải chỉ đạt 6,481 mm do đây là giai đoạn thích nghi khi nấm mới vừa được cấy vào môi trường có chứa cơ chất cảm ứng nên lượng enzyme được tiết ra để phân giải casein còn ít. Xét riêng theo từng chủng, có thể thấy PB 2.10 có khả năng tiết enzyme protease mạnh nhất, tiếp theo là chủng PB 1.3 và yếu nhất là chủng PB 2.9. Và chủng PB 2.10 cũng là chủng có khả năng phân giải cao nhất sau 48 và 72 giờ. Ngoài ra ở 48 giờ chủng PB 1.1 và PB 1.10 cũng tiết enzyme mạnh. Nhìn chung, chủng PB 3.3 phân hủy cơ chất yếu nhất ở 24 giờ. A B C Hình 3.1 Vòng phân giải casein của chủng PB 2.10 trong các khoảng thời gian 24 giờ (A); 48 giờ (B) và 72 giờ (C). A B C Hình 3.2 Vòng phân giải casein của chủng PB 1.1 (A), PB 1.10 (B), PB 3.1 (C) ở 48 giờ 21
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất canh tác ở Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau Vòng phân giải casein theo thời gian (D-d (mm)) Chủng 24h 48h 72h TB (chủng) KL 1.2 6,940q-e 7,917i-w 8,173h-t 7,697D-H KL 1.3 5,017g-k 5,397d-k 6,680t-f 5,698LM KL 1.4 6,910r-e 6,637t-f 9,410b-j 7,652E-H KL 3.1 6,643t-f 6,753t-e 8,930c-m 7,442F-I KL 4.1 6,883r-e 5,8933a-j 8,213g-t 6,997H-K KL 5.1 8,000h-v 7,247n-b 8,770d-n 8,006C-G KL 5.2 7,413m-b 8,167h-t 3,780k 6,453JKL KL 5.3 7,480m-a 9,523b-i 11,233a 9,412A KL 6.1 6,953q-e 9,343b-k 6,227x-h 7,508E-H KL 6.2 9,950a-f 8,093h-u 10,150a-e 9,398A KL 8.2 6,730t-f 5,130f-k 7,830j-x 6,563I-L HT 1.1 7,993h-v 9,347b-k 7,350m-b 8,230B-F HT 1.2 8,030h-v 8,777d-m 4,760h-k 7,189G-J HT 1.3 7,687l-y 10,290a-d 7,333m-b 8,437B-E HT 2.1 5,370e-k 6,066z-i 6,790s-e 6,076KLM HT 2.2 6,197y-h 7,013p-d 7,530l-z 6,913H-K HT 2.3 8,373f-s 7,223n-b 10,363a-d 8,653ABC HT 3.1 7,507a-z 9,600b-h 6,967q-e 8,024C-G HT 3.2 6,943q-e 4,370jk 4,500ijk 5,271M 22
Đồ án tốt nghiệp HT 3.3 8,553e-q 10,370a-d 6,950q-e 8,624A-D HT 4.1 6,680t-f 7,413m-b 10,467abc 8,187C-F HT 4.2 6,443v-g 7,807j-y 8,633e-o 7,628E-H HT 4.3 7,077o-c 6,990p-d 6,520u-g 6,862H-K HT 5.1 6,713t-f 4,547ijk 5,860b-j 5,707LM HT 5.2 7,767k-y 9,147b-l 10,557ab 9,157AB HT 6.1 5,553c-j 7,163n-c 9,533b-i 7,417F-I HT 6.3 6,927r-e 8,593e-p 7,570l-z 7,697D-H HT 7.2 6,447v-g 6,470v-g 8,480f-r 7,132G-J HT 7.3 6,343w-h 7,180n-b 9,820a-g 7,781C-H TB (thời gian) 7,087C 7,533B 7,910A CV(%)= 13,372 F* =10,16 F* =14,63 F =5,69 A B AB Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01). Theo bảng kết quả 3.2, có thể thấy các chủng nấm phân lập được từ đất canh tác cũng đều có khả năng tiết enzyme protease. Xét theo thời gian, thấy các chủng tiết enzyme tốt nhất ở 72 giờ do giai đoạn từ 24 và 48 giờ nấm cần thích nghi với môi trường. Xét riêng theo từng chủng thì KL 5.3 và KL 6.2 có khả năng tiết enzyme mạnh nhất và yếu nhất là chủng HT 3.2. Chủng KL 5.3 và KL 6.2 cũng phân giải casein mạnh ở thời gian 72 giờ, bên cạnh đó còn có thêm các chủng HT 2.3, HT 4.1 và HT 5.2. Ở 24 giờ, chủng KL 6.2 có khả năng phân giải cơ chất mạnh. Còn chủng HT 1.3 và HT 3.3 có vòng phân giải lớn nhất ở 48 giờ. Nhìn chung, thì chủng KL 5.2 phân hủy cơ chất yếu nhất ở 72 giờ. 23
Đồ án tốt nghiệp C A B Hình 3.3 Vòng phân giải casein của chủng KL 5.3 (A) và KL 6.2 (B) và KL 5.2 (C) ở 72 giờ. 10 9 8 7 6 5 Đất rừng 4 Đất canh tác 3 2 1 0 24h 48h 72h Biểu đồ 3.1 Vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian. Theo biểu đồ 3.1, nhìn chung, có thể thấy ở các mốc thời gian khảo sát, vòng phân giải casein trung bình của các chủng phân lập từ đất canh tác lớn hơn so với đất rừng nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Nguyên nhân là do khả năng tiết enzyme ngoại bào protease giữa các chủng trong cùng một vùng không đồng đều. Cụ thể, ở thời gian 24 giờ có 3,45% các chủng phân lập từ đất canh tác có khả năng tiết enzyme mạnh, 37,93% có khả năng tiết enzyme khá và không có chủng nào tiết enzyme yếu. Trong khi đó, hầu hết các chủng phân lập từ đất rừng có khả năng phân hủy cơ chất ở mức độ khá (bảng 3.3). Sự khác biệt này có thể là do các chủng nấm phân lập từ đất canh tác đã quen với môi trường có chứa các hợp chất có bản chất protein. Ở mốc thời gian 48 giờ, số chủng nấm phân hủy 24
Đồ án tốt nghiệp cơ chất ở mức độ mạnh, khá, trung bình tương đương nhau ở cả hai vùng. Tuy nhiên, tỷ lệ phần trăm số chủng tiết enzyme ở mức độ yếu ở đất canh tác ít hơn so với đất rừng. Ở 72 giờ, hầu hết các chủng phân lập ở đất rừng có khả năng tiết enzyme khá và không có chủng nào tiết enzyme yếu. Trong khi đó, khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng ở đất canh tác yếu hơn so với thời gian 48 giờ. Sự khác biệt này có thể là do các chủng nấm phân lập từ đất canh tác đã quen với môi trường có chứa cơ chất bản chất là protein nên khi phát triển qua một thời gian nấm đã điều tiết lượng enzyme vừa đủ để phân giải cơ chất, còn các chủng phân lập từ đất rừng đã qua giai đoạn thích nghi nên phân hủy cơ chất mạnh hơn. Bảng 3.3 Mức độ tiết enzyme protease của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau Tỷ lệ (%) chủng nấm tiết enzyme Thời gian Vùng lấy mẫu Số chủng Yếu Trung bình Khá Mạnh Đất rừng 9 33,33 22,22 44,45 0 24 giờ Đất canh tác 29 0 58,62 37,93 3,45 Đất rừng 9 11,11 33,33 33.33 22,23 48 giờ Đất canh tác 29 3,45 27,59 41,38 27,58 Đất rừng 9 0 22,22 66,67 11,11 72 giờ Đất canh tác 29 10,34 24,14 37,93 27,59 A PB 3.1 A KL 1.2 B KL 5.1 B PB 1.7 C PB 3.4 C KL 5.2 Hình 3.4 Vòng phân giải casein của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác sau 24 giờ (A), 48 giờ (B), 72 giờ (C). 25
Đồ án tốt nghiệp 3.1.2 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào chitinase của các chủng nấm P. lilacinum Để đánh giá sơ bộ khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase của các chủng nấm được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ta sử dụng phương pháp 2.3.1. Kết quả thu được tương ứng với bảng 3.3 và 3.4 Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất rừng ở Vũng Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau Vòng phân giải chitin theo thời gian (D-d (mm)) Chủng 24h 48h 72h TB (chủng) PB 1.1 2,470def 4,620c 2,700de 3,263C PB 1.3 1,953fgh 4,617c 1,193ij 2,588D PB 1.7 1,560ghi 3,060d 1,260hij 1,960F PB 1.10 2,170efg 4,263c 0,943ijk 2,460DE PB 2.9 2,683def 5,680b 3,110d 3,824B PB 2.10 2,037efg 4,503c 0,750jk 2,430DE PB 3.1 2,023efg 4,057c 0,273k 2,118DE PB 3.3 2,530def 6,550a 4,473c 4,518A PB 3.4 2,490def 4,320c 0,983ijk 2,598D TB (thời gian) 2,213B 4,630A 1,743C CV(%)= 15,848 F*A=31,12 F*B=314,94 F AB= 6,31 Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01). Dựa vào bảng kết quả 3.4, có thể nhận thấy rõ ràng các chủng nấm thu được từ đất rừng ở Vũng Tàu có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase, và phân giải chitin mạnh ở thời gian 48 giờ và giảm dần khi thời gian nuôi cấy tăng lên. Nhìn 26
Đồ án tốt nghiệp chung, chủng PB 3.3 có khả năng tiết enzyme mạnh nhất và thấp nhất là chủng PB 1.7. Và chủng PB 3.3 cũng phân giải cơ chất mạnh nhất ở 48 giờ, tiếp theo là chủng PB 2.9 và thấp nhất là chủng PB 3.1 ở 72 giờ. A B C Hình 3.5 Vòng phân giải chitin của chủ ng PB 3.3 sau 24 gi ờ (A), 48 giờ (B), 72 giờ (C). Bảng 3.5 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất canh tác ở Vũng Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau Vòng phân giải chitin theo thời gian (D-d (mm)) Chủng 24h 48h 72h TB (chủng) KL 1.2 5,537y-h 5,293i-n 1,770g-l 3,200J-N KL 1.3 2,447y-h 5,360h-n 0,883lmn 2,897K-O KL 1.4 1,680h-l 3,813p-u 1,037k-n 2,177P KL 3.1 3,593q-v 6,097e-k 1,307j-m 3,666G-J KL 4.1 2,557x-h 4,597m-q 3,230s-a 3,461H-K KL 5.1 2,327z-y 3,457s-y 2,137c-j 2,64NOP KL 5.2 2,527y-h 4,817l-p 0,270n 2,538OP KL 5.3 3,877p-t 6,907cde 4,153o-s 4,979BC KL 6.1 1,953e-k 5,443g-n 0,640mn 2,679M-P KL 6.2 2,60w-h 6,357d-h 1,363i-m 3,440H-L KL 8.2 2,677v-h 5,017l-o 1,977e-k 3,223J-M HT 1.1 3,333s-z 8,213ab 2,253a-j 4,600BCD HT 1.2 2,950t-e 6,883cde 2,683v-h 4,172D-G HT 1.3 3,003t-d 4,710l-p 1,800f-l 3,171J-N HT 2.1 3,627q-v 6,170e-j 2,753v-g 4,183D-G 27
Đồ án tốt nghiệp HT 2.2 2,843u-e 6,977cde 5,710f-l 5,177B HT 2.3 3,890p-t 5,330i-n 3,557r-x 4,259DEF HT 3.1 3,370s-y 7,183cd 1,783f-l 4,112D-G HT 3.2 3,237s-a 5,023l-o 1,087k-n 3,116J-O HT 3.3 2,693v-g 5,577f-m 1,070k-n 3,113J-O HT 4.1 3,113t-b 6,577c-f 1,750g-l 3,813F-I HT 4.2 3,173s-b 6,413c-g 2,693v-g 4,093D-G HT 4.3 3,263s-a 6,303d-i 2,180b-j 3,916E-H HT 5.1 6,300d-i 6,937cde 9,150a 7,462A HT 5.2 2,107c-j 5,480g-n 1,027k-n 2,871L-O HT 6.1 3,927p-t 5,110k-o 2,037d-k 3,691F-J HT 6.3 3,027t-d 7,377bc 2,787v-f 4,397CDE HT 7.2 2,323z-i 4,520n-r 5,207j-n 4,017E-H HT 7.3 2,263a-j 5,040l-o 2,447y-h 3,250I-M TB (thời gian) 3,007B 5,758A 2,439C CV(%)= 16,784 F* =24,07 F* =697,4 F =8,03 A B AB Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01). Tương tự các chủng phân lập từ đất rừng, các chủng nấm từ đất canh tác ở Vũng Tàu đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase. Ban đầu, các chủng nấm này tiết enzyme trung bình 3,007, mạnh nhất ở thời gian 48 giờ và yếu dần khi thời gian nuôi cấy tăng dần (bảng 3.5). Ở bảng 3.5, khi xét theo trung bình, chủng HT 5.1 tiết enzyme chitinase mạnh nhất (7,462 mm), tiếp theo là HT 2.2 (5,177 mm) và thấp nhất là chủng KL 1.4 (2,177 mm). Xét theo thời gian khảo sát, chủng có đường kính vòng phân giải cơ chất lớn nhất là HT 5.1 ở thời gian 72 giờ, tiếp theo là HT 1.1 ở 48 giờ và thấp nhất là KL 5.2 ở 72 giờ. 28
Đồ án tốt nghiệp A B C Hình 3.6 Vòng phân giải chitin của chủng HT 5.1 sau 24 giờ (A), 48 giờ (B), 72 giờ (C). 8 7 6 5 4 Đất rừng 3 Đất canh tác 2 1 0 24h 48h 72h Biểu đồ 3.2 Vòng phân giải chitin trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian. Dựa theo biểu đồ 3.2, nhìn chung, vòng phân giải chitin trung bình của các chủng nấm phân lập ở đất canh tác lớn hơn so với các chủng ở đất rừng. Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê là do khả năng tiết enzyme của các chủng trong từng vùng không đồng đều. Sau 24 giờ nuôi cấy, tất cả các chủng phân lập ở đất rừng chỉ tiết enzyme ở mức độ yếu (bảng 3.6). Còn các chủng ở đất canh tác tiết enzyme mạnh đạt 6,89%, trung bình là 44,83% còn lại là ở mức độ yếu. Ở 48 giờ, không có chủng nấm nào tiết enzyme yếu. Hầu hết các chủng phân lập từ đất canh tác tiết enzyme mạnh, trong khi các chủng ở đất rừng có mức độ tiết enzyme khá. Sau 72 giờ, hầu hết các 29
Đồ án tốt nghiệp chủng điều phân giải cơ chất ở mức độ yếu. Trong đó, không có chủng nào ở đất rừng tiết enzyme mạnh, còn tỷ lệ các chủng mạnh ở đất canh tác chiếm 10,34%. Bảng 3.6 Mức độ tiết enzyme chitinase của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau Tỷ lệ (%) chủng nấm tiết enzyme Thời gian Vùng lấy mẫu Số chủng Yếu Trung bình Khá Mạnh Đất rừng 9 100 0 0 0 24 giờ Đất canh tác 29 48,28 44,83 0 6,89 Đất rừng 9 0 11,11 66,67 22,22 48 giờ Đất canh tác 29 0 6,9 13.79 79,31 Đất rừng 9 77,78 11,11 11,11 0 72 giờ Đất canh tác 29 79,31 6,9 3,45 10,34 Tuyển chọn các chủng P. lilacinum có khả năng tiết enzyme ngoại bào mạnh Qua kết quả thu được từ các bảng trên, có thể thấy được các chủng nấm phân lập từ đất rừng hay đất canh tác đều có khả năng tiết enzyme protease và chitinase. Tuy nhiên khả năng tiết enzyme protease mạnh hơn so với chitinase. Tiêu chí chọn chủng là phải có khả năng tiết enzyme protease hoặc chitinase mạnh nhất hay tiết hai loại enzyme này đều mạnh. Theo đó, các chủng nấm phân lập từ đất rừng được tuyển chọn: PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10 và PB 3.3. Trong đó, chủng tiết enzyme chitinase mạnh nhất là PB 3.3 và chủng tiết enzyme protease mạnh nhất là PB 2.10. Các chủng nấm được phân lập từ đất canh tác được tuyển chọn: KL 5.3, KL 6.2, HT 3.3 và HT 5.1. Trong đó, chủng HT 5.1 có khả năng tiết enzyme chitinase mạnh nhất, chủng KL 5.3 và KL 6.2 tiết enzyme protease mạnh nhất. 3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum Chúng tôi chọn các chủng nấm PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10, PB 3.3, KL 5.3, KL 6.2, HT 3.3 và HT 5.1 có khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và 30
Đồ án tốt nghiệp chitinase mạnh để khảo sát khả năng ký sinh con cái và khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. 3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum 31
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh trên khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu Tỷ lệ ký sinh (%) trên trứng Chủng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Ngày 8 Ngày 9 Ngày 10 Ngày 11 Ngày 12 Ngày 13 Ngày 14 PB 1.1 2,67c 3,67c 6c 7,67b 9,33c 11bc 12,67d 16d 23,67d 32b 39c 44,33ab 48,67ab 50,33ab PB 1.3 17,67ab 27,67ab 33,33ab 39,67a 45,33ab 51a 56ab 61ab 66,67ab 74a 78,33a 80,33a 82a 82,33a PB 1.10 9bc 13,33abc 17abc 20ab 23,33abc 27abc 30,67a-d 34,33a-d 40,67a-d 49ab 52,67abc 54ab 55ab 56,67ab PB 2.10 11,67abc 15,33abc 20abc 24ab 29abc 34ab 38,67abc 44,67abc 58,33abc 73,67a 76,67a 78,33a 79,33a 80,33a PB 3.3 4,67bc 7bc 9,33bc 12,33b 16,33bc 19bc 22,67bcd 26,67bcd 33bcd 36,67ab 39,33bc 42ab 44,33ab 46ab KL 5.3 3,33c 4,33c 6c 7,67b 10c 12,33c 13,33d 14,67d 17,33d 19,67b 23c 24,67b 25,67b 27b KL 6.2 2c 4c 5,33c 7,33b 8,67c 10c 12,67d 15d 23,67d 28b 32,33c 34,33b 36b 37,67b HT 3.3 2,67c 4c 7c 9,33b 11,33c 13,33bc 17cd 19cd 27cd 33b 35c 37,33b 39b 41b HT 5.1 23,33a 29a 33,33a 38,33a 44a 50a 54a 60a 67,67a 72a 76ab 79,33a 82a 83,67a F 3,38* 3,08* 2,75* 2,9* 2,95* 3,26* 3,2* 3,44* 3,33* 3,39* 3,36* 3,24* 3,09* 3,06* CV(%) 42,97 43,09 40,48 36,3 34,15 31,77 30,11 27,89 24,3 22,94 21,12 20,43 20,28 19,57 Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01). 32
Đồ án tốt nghiệp Theo số liệu của bảng 3.7, có thể thấy nấm ký sinh trên trứng diễn ra trong vòng 14 ngày. Và nấm xâm nhiễm trên 50% các khối trứng trong 1 đĩa sau ngày thứ 5, điều này phù hợp với nghiên cứu của Jatala và cộng sự (1979). Trong 5 ngày đầu tiên, hầu hết các chủng nấm phân lập được đều có khả năng ký sinh yếu, do ở giai đoạn này sợi nấm chỉ mới bắt đầu tiếp xúc với bề mặt khối trứng chứ chưa đâm xuyên vào chúng. Ngày thứ 6, hầu hết các chủng nấm đều ký sinh khối trứng tuyến trùng ở mức dưới trung bình, chỉ có chủng PB 1.3 và HT 5.1 đạt mức trung bình. Ở ngày thứ 7 và thứ 8 kết quả cũng tương tự như vậy. Vào ngày thứ 9, ngoài hai chủng PB 1.3 và HT 5.1 còn có thêm chủng PB 2.10 có mức độ xâm nhiễm tuyến trùng trong khoảng 50 - 75%. Kết quả tương tự cho đến ngày thứ 11, nhưng có thêm chủng PB 1.10 ký sinh ở mức khá. Ở ba ngày cuối, các chủng PB 1.3, PB 2.10, HT 5.1 có khả năng ký sinh mạnh, còn chủng PB 3.3, KL 5.3, KL 6.2 và HT 3.3 ở mức trung bình và ở mức độ khá là chủng PB 1.10. Có thể thấy rằng, việc ký sinh lên khối trứng của các chủng phụ thuộc vào khả năng tiết enzyme ngoại bào protease hoặc chitinase mạnh, trong đó chủng PB 2.10 có khả năng tiết protease mạnh và tỷ lệ ký sinh đạt 80,33% ở ngày thứ 14. Còn tỷ lệ ký sinh khối trứng tuyến trùng của chủng HT 5.1 đạt 83,67% (ở ngày 14) tiết enzyme chitinase mạnh nhất. A B C A AHình 3.7 Quá trình khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh. (A) hình dạng khối trứng ban đầu, (B) nấm tiếp xúc khối trứng, (C) khối trứng bị kí sinh. 33
Đồ án tốt nghiệp 100 90 80 70 60 50 Đất rừng 40 đất canh tác 30 20 10 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Ngày 8 Ngày 9 Ngày 10Ngày 11Ngày 12Ngày 13Ngày 14 Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh khối trứng trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập ở đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau. Nhìn chung các chủng nấm phân lập từ đất rừng có khả năng ký sinh khối trứng cao hơn so với đất canh tác ở tất cả các khoảng thời gian khảo sát, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê do khả năng ký sinh khối trứng của các chủng không đồng đều trong cùng một vùng. Tỷ lệ ký sinh khối trứng tuyến trùng của các chủng nấm ở ngày đầu hầu hết dưới 25% (bảng 3.8). Ngày thứ 2, 3, 4, 5, dưới 40% chủng có khả năng ký sinh khối trứng ở mức độ trung bình, còn lại là yếu. Từ ngày 6 đến ngày 10, khả năng ký sinh khối trứng của các chủng phân lập từ hai vùng tương đương nhau ở mức độ khá, khả năng ký sinh ở mức độ yếu và trung bình của các chủng từ đất rừng là tương đương nhau. Khả năng ký sinh khối trứng của các chủng nấm ở ngày thứ 11,12,13,14 có sự khác biệt nhau rõ rệt. Cụ thể, có 40% các chủng nấm ở đất rừng có mức độ ký sinh mạnh (trong khi, chỉ 25 % chủng từ đất canh tác). 34
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8 Mức độ ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau Số Tỷ lệ (%) chủng nấm ký sinh Thời gian Vùng lấy mẫu chủng Yếu Trung bình Khá Mạnh Đất rừng 5 100 0 0 0 Ngày 1 đất canh tác 4 100 0 0 0 Đất rừng 5 80 20 0 0 Ngày 2 đất canh tác 4 75 25 0 0 Đất rừng 5 80 20 0 0 Ngày 3 đất canh tác 4 75 25 0 0 Đất rừng 5 80 20 0 0 Ngày 4 đất canh tác 4 75 25 0 0 Đất rừng 5 60 40 0 0 Ngày 5 đất canh tác 4 75 25 0 0 Đất rừng 5 40 40 20 0 Ngày 6 đất canh tác 4 75 0 25 0 Đất rừng 5 40 40 20 0 Ngày 7 đất canh tác 4 75 0 25 0 Đất rừng 5 20 60 20 0 Ngày 8 đất canh tác 4 75 0 25 0 Đất rừng 5 20 40 40 0 Ngày 9 đất canh tác 4 50 25 25 0 Đất rừng 5 0 60 40 0 Ngày 10 đất canh tác 4 25 50 25 0 Đất rừng 5 0 40 20 40 Ngày 11 đất canh tác 4 25 50 0 25 Đất rừng 5 0 40 20 40 Ngày 12 đất canh tác 4 25 50 0 25 Đất rừng 5 0 40 20 40 Ngày 13 đất canh tác 4 0 75 0 25 Đất rừng 5 0 20 40 40 Ngày 14 đất canh tác 4 0 75 0 25 35
Đồ án tốt nghiệp 3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên tuyến trùng cái Meloidogyne spp. Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh trên con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu Tỷ lệ ký sinh (%) trên con cái Chủng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 PB 1.1 49,33ab 72,67d 84,67abc 87,67ab PB 1.3 51,33ab 76,67a-d 88abc 91,33ab PB 1.10 50,67ab 81,33abc 88,33abc 91ab PB 2.10 54,33a 83a 90,67a 93,33a PB 3.3 37,67c 74,33cd 81,33c 85,33b KL 5.3 43,33bc 75,67bcd 82bc 86,33ab KL 6.2 53a 82,33ab 87,67abc 92ab HT 3.3 46abc 82ab 89,67ab 92,67ab HT 5.1 52,33ab 82ab 88,33abc 91ab F 2,99* 2,77* 1,57* 1,31* CV(%) 11,09 5,29 5,27 4,85 Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01). Dựa vào bảng 3.9, có thể thấy các chủng nấm phân lập từ đất rừng và đất canh tác đều có khả năng ký sinh mạnh trên con cái. Sau 1 ngày, các chủng PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10, KL 6.2, HT 5.1 đều có khả năng tiếp xúc và kí sinh trên 50% số con cái thử nghiệm. Từ ngày thứ 2 trở đi, tất cả các chủng nấm thử nghiệm đều có khả năng xâm nhiễm ở mức độ mạnh tuyến trùng cái, ngoại trừ chủng PB 1.1 và PB 3.3 ở ngày thứ 2. 36
Đồ án tốt nghiệp A B C Hình 3.8 Quá trình tuyến trùng cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh. (A) hình dạng con cái ban đầu, (B) nấm bắt đầu ký sinh, (C) con cái bị kí sinh. 100 90 80 70 60 50 Đất rừng 40 đất canh tác 30 20 10 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau. Nhìn chung, tỷ lệ ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm phân lập từ đất canh tác và đất rừng ở các mốc thời gian khác nhau không khác biệt về mặt thống kê (biểu đồ 3.4) do khả năng ký sinh không đồng đều giữa các chủng ở các vùng. Từ đó có thể thấy việc ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm không phụ thuộc vào nguồn gốc phân lập. Điều này cũng được chứng minh ở bảng 3.10. Mức độ ký sinh con cái tuyến trùng của các chủng nấm từ đất rừng và đất canh tác đạt khá, trung bình và tương đương nhau ở ngày thứ 1. Ở ngày thử nghiệm thứ 2, 100% các chủng từ đất canh tác ký sinh mạnh tuyến trùng cái, còn đối với các chủng từ đất rừng thì 37
Đồ án tốt nghiệp chỉ có 60% trên tổng số ký sinh đạt mức độ mạnh. Tuy nhiên, sau đó, tất cả các chủng nấm khảo sát đều có khả năng xâm nhiễm mạnh tuyến trùng cái. Như vậy, có thể thấy rằng khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. cái mạnh hay yếu không phụ thuộc vào nguồn gốc của chủng phân lập mà phụ thuộc vào hệ enzyme ngoại bào được tiết ra bởi chúng. Các chủng có khả năng tiết enzyme ngoại bào (protease hay chitinase) mạnh thì ký sinh tuyến trùng mạnh. Bảng 3.10 Mức độ ký sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau Thời Vùng lấy Số Tỷ lệ (%) chủng nấm ký sinh gian mẫu chủng Yếu Trung bình Khá Mạnh Đất rừng 5 0 40 60 0 Ngày 1 Đất canh tác 4 0 50 50 0 Đất rừng 5 0 0 40 60 Ngày 2 Đất canh tác 4 0 0 0 100 Đất rừng 5 0 0 0 100 Ngày 3 Đất canh tác 4 0 0 0 100 Đất rừng 5 0 0 0 100 Ngày 4 Đất canh tác 4 0 0 0 100 38
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Tất cả các chủng nấm P. lilacinum khảo sát đều có khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase. Trong đó, khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm mạnh hơn so với tiết enzyme chitinase. Và đường kính vòng phân giải casein lớn nhất sau 72 giờ, trong khi đường kính vòng phân giải chitin đạt cực đại sau 48 giờ. Không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê về khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập từ đất rừng và đất canh tác. Xét riêng theo vùng đất rừng, chủng PB 2.10 và PB 3.3 tiết enzyme protease và chitinase mạnh nhất; còn đối với đất canh tác thì các chủng KL 5.3, KL 6.2 và HT 5.1 tối ưu nhất. Khả năng ký sinh con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum nhanh và mạnh hơn so với ký sinh khối trứng. Và việc ký sinh tuyến trùng mạnh hay yếu cũng không phụ thuộc vào nguồn gốc mẫu phân lập mà phụ thuộc vào khả năng tiết enzyme ngoại bào, chủng có khả năng tiết enzyme ngoại bào phân hủy cơ chất mạnh là chủng có thể ký sinh tuyến trùng mạnh. 4.2 Đề nghị Việc đánh giá các chủng nấm P. lilacinum dựa vào định tính hệ enzyme ngoại bào thường ít chính xác nên tiến hành định lượng enzyme ngoại bào protease và chitinase để việc chọn chủng được đầy đủ và chính xác hơn. Cần tiến hành thử nghiệm ký sinh tuyến trùng cái và trứng trên sần rễ để có thể đánh giá chính xác hơn bởi vì thực tế tuyến trùng sống và ký sinh bên trong rễ cây. 39
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Thị Huệ (2010). Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus. Trichoderma và ứng dụng. Luận văn thạc sĩ. Chuyên ngành vi sinh vật. Trường đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2. Nxb ĐHQG Tp.Hồ Chí Minh. Trần Thị Nhã Uyên (2010). Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ các chủng nấm sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ. Luận văn thạc sĩ. Chuyên ngành vi sinh vật. Trường đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh. Tài liệu tiếng Anh Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th ed., Academic Press, America. Anderson, T.H., Domsch, K.H. and Gams, W. (1995). Compendium of Soil Fungi. Lubrecht & Cramer Ltd, New York. Baldwin, J.G. and Hedwig, H. (1975). “Body Wall Fine Structure of the Anterior Region of Meloidogyne incognita and Heterodera glycines Males”. Journal of Nematology, 7 (2), 175 – 193. Bird, A. F. (1958). “The adult female cuticle and egg sac of the genus Meloidogyne Goeldi, 1887”. Nematologica, 3 (3), 205 - 212. Bird, A.F. and McClure, M.A. (1976). “The tylenchid (Nematoda) egg shell: structure, composition and permeability”. Parasitology, 72 (1), 19 - 28. Bonants, P.J., Fitters, P.F., Thijs, H., Belder, D.E., Waalwijk, C. and Henfling, J.W. (1995). “A basic serine protease from Paecilomyces lilacinus with biological activity against Meloidogyne hapla eggs”. Microbiology, 141 (4), 775 - 784. De-hui Dai, Wei-lian Hu, Guang-rong Huang and Wei Li (2011). “Purification and characterization of a novel extracellular chitinase from thermophilic Bacillus sp. Hu1”. African Journal of Biotechnology, 10 (13), 2476 - 2485. 40
Đồ án tốt nghiệp Huang, X., Zhao, N. and Zang, K. (2004). “Extracellular enzymes serving as virulence factors in nematophagous fungi involved in infection of the host”. Research in Microbiology, 155, 811-816. Inglis, P.W. and Tigano, M.S. (2006). “Identification and taxonomy of some entomopathogenic Paecilomyces spp. (Ascomycota) isolates using rDNA-ITS Sequences”. Genetics and Molecular Biology, 29 (1), 132-136. Jatala, P., R. Kaltenbach, and Bocangel, M. (1979). “Biological control of Meloidogyne incognita acrita and Globoderra pallid on potatoes”. Journal of Nematology, 11, 303. Jolles, P. & Muzzarelli, R.A.A. (1999). Chitin and Chitinases. Springer, America. Khan, A., Williams, K.L. and Helena, K.M.N. (2004). “Effects of Paecilomyces lilacinus protease and chitinase on the eggshell structures and hatching of Meloidogyne javanica juveniles”. Biol Control, 31 (3), 346-352. Luangsa, A.J., Jos, H., Tineke-van, D., Seung-Beom, H., Andrew, M.B., Jones, N.L.H. and Robert A. S. (2011). “Purpureocillium, a new genus for the medically important Paecilomyces lilacinus”. FEMS Microbiology Letters, 321 (2), 141-149. Morgan, J.G., White, J.F. and Rodriguez, K.R. (1984). “Phytonematode pathology: ultra structural studies II. Parasitism of Meloidogyne arenaria eggs and larvae by Paecilomyces lilacinus”. Nematropica, 14 (1), 57-71. Morton, C.O., Tim, H.M., Kerry, R. and Penny, R.H. (2003). “PCR-based DNA fingerprinting indicates host-related genetic variation in the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia”. Mycological Research, 107 (2), 198-205. Nevalainen, H., Khan, A. and Williams, K. (2003). “Testing the nematophagous biological control strain Paecilomyces lilacinus 251 for the Paecilotoxin Production”. FEMS microbiology letter, 227 (1), 107-111. Perry, R.N. (2002). “Hatching”. In: Lee, D.L. (ed), The biology of nematodes, Taylor & Francis, London, 147 - 170. 41
Đồ án tốt nghiệp Samson, R.A. (1974). “Paecilomyces and some allied hyphomycetes”. Studies in Mycology (Baarn: Centralbureau voor Schimmelcultures), 6, 1-119. Sasser, J.N. and Carter C.C. (1985). “An Advanced Treatise on Meloidogyne”. North Carolina State University, 1, 19-24. Segers, R. (1996). “The role of the proteinase VCP1 produced by the nematophagous Verticillium chlamydosporium in the infection process of nematode eggs”. Mycological Research, 100, 421-428. Stirling, G.R. and West, L.M. (1991). “Fungal parasites of root-knot nematode eggs from tropical and sub-tropical regions of Australia”. Australasian Plant Pathology, 20 (4), 149-154. Sung, G.H., Hywel-Jones, N.L., Sung, J.M., Luangsa-ard, J.J., Sherstha, B. and Spatafora, J.W. (2007). “Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi”. Studies in Mycology, 57 (1), 5-59. Thom, C. (1910). “Cultural studies of species of Penicillium”. USDA Bureau of Animal Industry Bulletin, 118, 1-109. Watson, B.D. (1965). “The fine structure of the body-wall and the growth of the cuticle in the adult nematode Ascaris lumbricoides”. Journal of Cell Science, 106 (1), 83-91. Wharton, D. (1980). “Nematode eggshells”. Parasitology, 81, 447-463. Tài liệu từ Internet Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Diệp và Nguyễn Văn Thành (2005). Giáo trình môn nấm học (online), 10/07/2015, van-ba-bien-soan-dh-can-tho-293739.htm Esser, R.P.and El-Gholl, E Paecilomyces lilacinus, a fungus that parasitizes nematode eggs, 7/2015, Mitkowski, N.A. and Abawi, G.S. (2003). Root-knot nematodes, 5 July 2015, de.aspx 42
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME NGOẠI BÀO CỦA CÁC CHỦNG NẤM P. lilacinum Phụ lục A.1: Khả năng tiết enzyme ngoại bào protease Khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng Bảng số liệu thô đường kính vòng phân giải cơ chất casein Đƣờng kính vòng phân giải casein ( D - d (mm)) 24 giờ 48 giờ 72giờ STT Chủng LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 A1 PB 1.1 6,47 6,1 6,04 9,68 8,1 10,26 7,53 6,22 7,46 A2 PB 1.3 9,19 8,17 8,95 7,3 8,18 8,91 9,26 8,57 7,5 A3 PB 1.7 7,94 6,7 5,82 7,27 5,46 6 6 5,22 6,18 A4 PB 1.10 9,64 8,27 8,46 6,74 10,14 9,66 5,94 5,44 7,05 A5 PB 2.9 3,32 3,76 7,09 4,72 5,44 4,71 7,56 6,42 7,06 A6 PB 2.10 8,23 7,075 6,07 8,94 10,63 10,15 11,53 9,7 8,78 A7 PB 3.1 7 6,8 7,94 8,58 8,78 7,48 7,89 7,47 8 A8 PB 3.3 2,84 4,72 4,83 5,18 5,68 5,32 7,47 7,94 7,85 A9 PB 3.4 3,41 6,28 3,86 6,5 5,96 5,48 8,28 7,24 6,6 Kết quả xử lý thống kê số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất casein theo thời gian A: Tên chủng. Tương ứng với STT chủng trên bảng số liệu thô. B: Thời gian đo. Tương ứng: B1: 24 giờ, B2: 48 giờ, B3: 72 giờ AB: Tên chủng theo thời gian Class Level Information Class Levels Values A 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 B 3 1 2 3 Number of Observations Read 81 Number of Observations Used 81 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.811437 13.26107 0.948961 7.155988 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 1
Đồ án tốt nghiệp A 8 113.3572877 14.1696610 15.73 <.0001 B 2 18.5628451 9.2814225 10.31 0.0002 A*B 16 77.3413716 4.8338357 5.37 <.0001 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 54 Error Mean Square 0.900526 Critical Value of t 2.00488 Least Significant Difference 0.8969 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N A A 9.0117 9 6 A B A 8.4478 9 2 B B C 7.9267 9 4 B C B C 7.7711 9 7 C C 7.5400 9 1 D 6.2878 9 3 D D 6.0956 9 9 D D 5.7589 9 8 D D 5.5644 9 5 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 54 Error Mean Square 0.900526 Critical Value of t 2.00488 Least Significant Difference 0.5178 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N B A 7.5337 27 3 2
Đồ án tốt nghiệp A A 7.4537 27 2 B 6.4806 27 1 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 54 Error Mean Square 0.900526 Critical Value of t 2.00488 Least Significant Difference 1.5534 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N A A 10.0033 3 A6B3 A B A 9.9067 3 A6B2 B A B A C 9.3467 3 A1B2 B A C B D A C 8.8467 3 A4B2 B D A C E B D A C 8.7900 3 A4B1 E B D A C E B D A C 8.7700 3 A2B1 E B D C E B D F C 8.4433 3 A2B3 E D F C E G D F C 8.2800 3 A7B2 E G D F C E G D F C 8.1300 3 A2B2 E G D F E G D F H 7.7900 3 A9B3 E G D F H E G D F H 7.7867 3 A7B3 E G D F H E G D F H I 7.7533 3 A8B3 E G F H I 3
Đồ án tốt nghiệp E G J F H I 7.2467 3 A7B1 G J F H I G J F H I 7.1250 3 A6B1 G J F H I G J F H I 7.0700 3 A1B3 G J F H I G J F H I 7.0133 3 A5B3 G J H I G J K H I 6.8200 3 A3B1 J K H I L J K H I 6.2433 3 A3B2 L J K I L J K I 6.2033 3 A1B1 L J K L J K 6.1433 3 A4B3 L J K L J K M 5.9800 3 A9B2 L J K M L J K M 5.8000 3 A3B3 L K M L N K M 5.3933 3 A8B2 L N M L N M 4.9567 3 A5B2 L N M L N M 4.7233 3 A5B1 N M N M 4.5167 3 A9B1 N N 4.1300 3 A8B1 Khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất canh tác Bảng số liệu thô đường kính vòng phân giải cơ chất casein 4
Đồ án tốt nghiệp Đƣờng kính vòng phân giải casein ( D - d (mm)) 24h 48h 72h STT Chủng LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 A1 KL 1.2 5,69 7,8 7,33 7,99 8,08 7,68 8,12 7,7 8,7 A2 KL 1.3 3,92 5,12 6,01 5,6 5,84 4,75 6,28 7,02 6,74 A3 KL 1.4 7,02 7,61 6,1 7,31 6,35 6,25 9,62 9,5 9,11 A4 KL 3.1 6,92 5,41 7,6 7,97 6,4 5,89 7,9 9,29 9,6 A5 KL 4.1 6,57 6,76 7,32 4,9 6,19 6,59 7,85 8,21 8,58 A6 KL 5.1 8,36 7,58 8,06 6,91 8,09 6,74 8,42 9,48 8,41 A7 KL 5.2 7,21 7,85 7,18 8,64 8,17 7,69 3,94 3,62 3,78 A8 KL 5.3 7,9 7,18 7,36 8,98 10,05 9,54 12,82 12,03 8,85 A9 KL 6.1 4,95 8,51 7,4 8,28 10,15 9,6 5,67 6,91 6,1 A10 KL 6.2 10,92 10,17 8,76 6,35 8,49 9,44 10,36 10,86 9,23 A11 KL 8.2 6,57 7,3 6,32 2,87 5,9 6,62 7,29 6,54 9,66 A12 HT 1.1 7,9 7,56 8,52 8,28 9,36 10,4 7,59 6,52 7,94 A13 HT 1.2 8,12 8,06 7,91 9,35 8,2 8,78 6,31 3,72 4,25 A14 HT 1.3 7,69 8,23 7,14 10,99 10,36 9,52 7,21 5,43 9,36 A15 HT 2.1 6,68 3,95 5,48 5,25 6,77 6,18 7,18 6,86 6,33 A16 HT 2.2 5,77 6,17 6,65 7,4 5,87 7,77 8,19 8,27 6,13 A17 HT 2.3 8,4 8,06 8,66 7,5 7,02 7,15 10,38 10,69 10,02 A18 HT 3.1 7,9 6,9 7,72 9,17 10,47 9,16 7,52 5,36 8,02 A19 HT 3.2 6,89 6,77 7,17 4,1 4,37 4,64 4,47 4,5 4,53 A20 HT 3.3 10,07 8,41 7,18 11,33 10,21 9,57 7,54 7,06 6,25 A21 HT 4.1 6,09 7,24 6,71 7,88 7,37 6,99 0,83 10,24 10,33 A22 HT 4.2 6,98 5,67 6,68 7,05 7,65 8,72 9,17 9,84 6,89 A23 HT 4.3 6,96 6,96 7,31 8,61 7,08 5,28 6,01 5,7 7,85 A24 HT 5.1 6,88 7,15 6,11 3,99 3,7 5,95 4,47 6,12 6,99 A25 HT 5.2 8,22 7,07 8,01 8,84 8,95 9,65 8,2 12,18 11,29 A26 HT 6.1 5,88 6,19 4,59 7,82 7,41 6,26 9,23 9,72 9,65 A27 HT 6.3 8,36 6,1 5,82 8,28 8,94 8,56 7,35 7,25 8,11 A28 HT 7.2 6,94 5,75 5,91 7,65 8,52 3,24 8,14 9,13 8,17 A29 HT 7.3 5,61 6,23 5,17 6,65 6,22 8,67 11,22 10,4 7,84 Kết quả xử lý thống kê số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất casein theo thời gian A: Tên chủng. Tương ứng với STT chủng trên bảng số liệu thô. B: Thời gian đo. Tương ứng: B1: 24 giờ, B2: 48 giờ, B3: 72 giờ AB: Tên chủng theo thời gian 5
Đồ án tốt nghiệp R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.784170 13.37202 1.004238 7.510000 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 28 286.8814444 10.2457659 10.16 <.0001 B 2 29.5093540 14.7546770 14.63 <.0001 A*B 56 321.1693349 5.7351667 5.69 <.0001 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 174 Error Mean Square 1.008495 Critical Value of t 1.97369 Least Significant Difference 0.9344 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N A A 9.4122 9 8 A A 9.3978 9 10 A B A 9.1567 9 25 B A B A C 8.6533 9 17 B A C B D A C 8.6244 9 20 B D C B D E C 8.4367 9 14 B D E C F B D E C 8.2300 9 12 F D E C F D E C 8.1867 9 21 F D E C F G D E C 8.0244 9 18 F G D E C F G D E C 8.0056 9 6 F G D E C F G D E C H 7.7811 9 29 6
Đồ án tốt nghiệp F G D E H F G D E H 7.6967 9 27 F G E H F G E H 7.6767 9 1 F G E H F G E H 7.6522 9 3 F G E H F G E H 7.6278 9 22 F G E H F G E H 7.5078 9 9 F G H F G I H 7.4422 9 4 F G I H F G I H 7.4167 9 26 G I H G I J H 7.1889 9 13 G I J H G I J H 7.1322 9 28 I J H K I J H 6.9967 9 5 K I J H K I J H 6.9133 9 16 K I J H K I J H 6.8622 9 23 K I J K L I J 6.5633 9 11 K L J K L J 6.4533 9 7 K L K L M 6.0756 9 15 L M L M 5.7067 9 24 L M L M 5.6978 9 2 7
Đồ án tốt nghiệp M M 5.2711 9 19 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 174 Error Mean Square 1.008495 Critical Value of t 1.97369 Least Significant Difference 0.3005 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N B A 7.9097 87 3 B 7.5333 87 2 C 7.0870 87 1 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 174 Error Mean Square 1.008495 Critical Value of t 1.97369 Least Significant Difference 1.6183 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N AB A 11.2333 3 A8B3 A B A 10.5567 3 A25B3 B A B A C 10.4667 3 A21B3 B A C B D A C 10.3700 3 A20B2 B D A C B D A C 10.3633 3 A17B3 B D A C B D A C 10.2900 3 A14B2 B D A C E B D A C 10.1500 3 A10B3 E B D A C E B D A C F 9.9500 3 A10B1 8
Đồ án tốt nghiệp E B D A C F E B D A G C F 9.8200 3 A29B3 E B D G C F E B D H G C F 9.6000 3 A18B2 E B D H G C F E B D I H G C F 9.5333 3 A26B3 E B D I H G C F E B D I H G C F 9.5233 3 A8B2 E B D I H G C F E B J D I H G C F 9.4100 3 A3B3 E B J D I H G C F E K B J D I H G C F 9.3467 3 A12B2 E K B J D I H G C F E K B J D I H G C F 9.3433 3 A9B2 E K B J D I H G C F L E K B J D I H G C F 9.1467 3 A25B2 L E K J D I H G C F L E K M J D I H G C F 8.9300 3 A4B3 L E K M J D I H G F L E K M J D I H G N F 8.7767 3 A13B2 L E K M J D I H G N F L E K M J D I H G N F 8.7700 3 A6B3 L E K M J I H G N F L E K M J O I H G N F 8.6333 3 A22B3 L E K M J O I H G N F L E K M J O I H G N F P 8.5933 3 A27B2 L E K M J O I H G N F P L E K M J O I H G N Q F P 8.5533 3 A20B1 L K M J O I H G N Q F P L R K M J O I H G N Q F P 8.4800 3 A28B3 L R K M J O I H G N Q F P L R K M J O I H G S N Q F P 8.3733 3 A17B1 L R K M J O I H G S N Q P L R K M J O I H G S N Q T P 8.2133 3 A5B3 9
Đồ án tốt nghiệp L R K M J O I H S N Q T P L R K M J O I H S N Q T P 8.1733 3 A1B3 L R K M J O I H S N Q T P L R K M J O I H S N Q T P 8.1667 3 A7B2 L R K M J O I H S N Q T P L R K M J O I H U S N Q T P 8.0933 3 A10B2 L R K M J O I H U S N Q T P L R K M J O I H V U S N Q T P 8.0300 3 A13B1 L R K M J O I H V U S N Q T P L R K M J O I H V U S N Q T P 8.0000 3 A6B1 L R K M J O I H V U S N Q T P L R K M J O I H V U S N Q T P 7.9933 3 A12B1 L R K M J O I V U S N Q T P L R K M J O I W V U S N Q T P 7.9167 3 A1B2 L R K M J O W V U S N Q T P L R K M J O X W V U S N Q T P 7.8300 3 A11B3 L R K M J O X W V U S N Q T P L R K M J O X Y W V U S N Q T P 7.8067 3 A22B2 L R K M O X Y W V U S N Q T P L R K M O X Y W V U S N Q T P 7.7667 3 A25B1 L R M O X Y W V U S N Q T P L R M O X Y W V U S N Q T P 7.6867 3 A14B1 L R M O X Y W V U S N Q T P L R M Z O X Y W V U S N Q T P 7.5700 3 A27B3 L R M Z O X Y W V U S N Q T P L R M Z O X Y W V U S N Q T P 7.5300 3 A16B3 R M Z O X Y W V U S N Q T P R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.5067 3 A18B1 R A M Z O X Y W V U S N Q T P R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.4800 3 A8B1 R A M Z O X Y W V U S N Q T P B R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.4133 3 A21B2 B R A M Z O X Y W V U S N Q T P B R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.4133 3 A7B1 10
Đồ án tốt nghiệp B R A M Z O X Y W V U S N Q T P B R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.3500 3 A12B3 B R A M Z O X Y W V U S N Q T P B R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.3333 3 A14B3 B R A Z O X Y W V U S N Q T P B R A Z O X Y W V U S N Q T P 7.2467 3 A6B2 B R A Z O X Y W V U S N Q T P B R A Z O X Y W V U S N Q T P 7.2233 3 A17B2 B R A Z O X Y W V U S N Q T P B R A Z O X Y W V U S N Q T P 7.1800 3 A29B2 B R A Z O X Y W V U S N Q T P B R A C Z O X Y W V U S N Q T P 7.1633 3 A26B2 B R A C Z O X Y W V U S Q T P B R A C Z O X Y W V U S Q T P 7.0767 3 A23B1 B R A C Z X Y W V U S Q T P B R A C Z X Y W V U S D Q T P 7.0133 3 A16B2 B R A C Z X Y W V U S D Q T P B R A C Z X Y W V U S D Q T P 6.9900 3 A23B2 B R A C Z X Y W V U S D Q T B R A C Z E X Y W V U S D Q T 6.9667 3 A18B3 B R A C Z E X Y W V U S D Q T B R A C Z E X Y W V U S D Q T 6.9533 3 A9B1 B R A C Z E X Y W V U S D Q T B R A C Z E X Y W V U S D Q T 6.9500 3 A20B3 B R A C Z E X Y W V U S D Q T B R A C Z E X Y W V U S D Q T 6.9433 3 A19B1 B R A C Z E X Y W V U S D Q T B R A C Z E X Y W V U S D Q T 6.9400 3 A1B1 B R A C Z E X Y W V U S D T B R A C Z E X Y W V U S D T 6.9267 3 A27B1 B R A C Z E X Y W V U S D T B R A C Z E X Y W V U S D T 6.9100 3 A3B1 B R A C Z E X Y W V U S D T B R A C Z E X Y W V U S D T 6.8833 3 A5B1 11
Đồ án tốt nghiệp B A C Z E X Y W V U S D T B A C Z E X Y W V U S D T 6.7900 3 A15B3 B A C Z E X Y W V U D T B A C Z E X Y W V U D T 6.7533 3 A4B2 B A C Z E X Y W V U D T B F A C Z E X Y W V U D T 6.7300 3 A11B1 B F A C Z E X Y W V U D T B F A C Z E X Y W V U D T 6.7133 3 A24B1 B F A C Z E X Y W V U D T B F A C Z E X Y W V U D T 6.6800 3 A2B3 B F A C Z E X Y W V U D T B F A C Z E X Y W V U D T 6.6800 3 A21B1 B F A C Z E X Y W V U D T B F A C Z E X Y W V U D T 6.6433 3 A4B1 B F A C Z E X Y W V U D T B F A C Z E X Y W V U D T 6.6367 3 A3B2 B F A C Z E X Y W V U D B F A C Z E X Y W V U D G 6.5200 3 A23B3 B F A C Z E X Y W V D G B F A C Z E X Y W V D G 6.4700 3 A28B2 B F A C Z E X Y W V D G B F A C Z E X Y W V D G 6.4467 3 A28B1 B F A C Z E X Y W V D G B F A C Z E X Y W V D G 6.4433 3 A22B1 B F A C Z E X Y W D G B F A C Z E X Y W H D G 6.3433 3 A29B1 B F A C Z E X Y H D G B F A C Z E X Y H D G 6.2267 3 A9B3 B F A C Z E Y H D G B F A C Z E Y H D G 6.1967 3 A16B1 B F A C Z E H D G B F A C Z E I H D G 6.0667 3 A15B2 B F A C E I H D G B F A C E J I H D G 5.8933 3 A5B2 12
Đồ án tốt nghiệp B F C E J I H D G B F C E J I H D G 5.8600 3 A24B3 F C E J I H D G F C E J I H D G 5.5533 3 A26B1 F E J I H D G F K E J I H D G 5.3967 3 A2B2 F K E J I H G F K E J I H G 5.3700 3 A15B1 F K J I H G F K J I H G 5.1300 3 A11B2 K J I H G K J I H G 5.0167 3 A2B1 K J I H K J I H 4.7600 3 A13B3 K J I K J I 4.5467 3 A24B2 K J I K J I 4.5000 3 A19B3 K J K J 4.3700 3 A19B2 K K 3.7800 3 A7B3 Phụ lục A.2: Khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase Khả năng tiết enzyme chitinase của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng Bảng số liệu thô đường kính vòng phân giải cơ chất chitin Đƣờng kính vòng phân giải chitin (D-d (mm)) STT Chủng 24h 48h 72h LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 A1 PB 1.1 2,3 2,14 2,97 4,92 4,32 4,62 3,19 2,21 2,7 A2 PB 1.3 1,98 1,77 2,11 4,54 4,97 4,34 1,07 1,39 1,12 A3 PB 1.7 1,56 1,6 1,52 3,12 3 3,06 0,88 1,52 1,38 A4 PB 1.10 2,17 1,71 2,63 3,59 4,92 4,28 1,1 0,86 0,87 A5 PB 2.9 3,12 1,81 3,12 5,21 6,02 5,81 2,93 3 3,4 13
Đồ án tốt nghiệp A6 PB 2.10 1,49 2,36 2,26 4,83 3,48 5,2 1,08 0,77 0,4 A7 PB 3.1 1,6 2,41 2,06 3,79 4,67 3,71 0,04 0,65 0,13 A8 PB 3.3 2,57 2,52 2,5 6,05 6,64 6,96 4,28 3,9 5,24 A9 PB 3.4 2,09 2,82 2,56 4,34 4,76 3,86 1,79 0,74 0,42 Kết quả xử lý thống kê số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất chitin theo thời gian A: Tên chủng. Tương ứng với STT chủng trên bảng số liệu thô. B: Thời gian đo. Tương ứng: B1: 24 giờ, B2: 48 giờ, B3: 72 giờ AB: Tên chủng theo thời gian Class Level Information Class Levels Values A 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 B 3 1 2 3 Number of Observations Read 81 Number of Observations Used 81 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.947763 15.84820 0.453572 2.861975 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 8 51.2151506 6.4018938 31.12 <.0001 B 2 129.5815580 64.7907790 314.94 <.0001 A*B 16 20.7663086 1.2978943 6.31 <.0001 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 54 Error Mean Square 0.205727 Critical Value of t 2.00488 Least Significant Difference 0.4287 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N A A 4.5178 9 8 B 3.8244 9 5 C 3.2633 9 1 D 2.5978 9 9 14
Đồ án tốt nghiệp D D 2.5878 9 2 D E D 2.4589 9 4 E D E D 2.4300 9 6 E E F 2.1178 9 7 F F 1.9600 9 3 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 54 Error Mean Square 0.205727 Critical Value of t 2.00488 Least Significant Difference 0.2475 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N B A 4.6300 27 2 B 2.2130 27 1 C 1.7430 27 3 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 54 Error Mean Square 0.205727 Critical Value of t 2.00488 Least Significant Difference 0.7425 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N AB A 6.5500 3 A8B2 B 5.6800 3 A5B2 C 4.6200 3 A1B2 C C 4.6167 3 A2B2 C C 4.5033 3 A6B2 15
Đồ án tốt nghiệp C C 4.4733 3 A8B3 C C 4.3200 3 A9B2 C C 4.2633 3 A4B2 C C 4.0567 3 A7B2 D 3.1100 3 A5B3 D D 3.0600 3 A3B2 D E D 2.7000 3 A1B3 E D E D F 2.6833 3 A5B1 E D F E D F 2.5300 3 A8B1 E D F E D F 2.4900 3 A9B1 E D F E D F 2.4700 3 A1B1 E F E G F 2.1700 3 A4B1 E G F E G F 2.0367 3 A6B1 E G F E G F 2.0233 3 A7B1 G F H G F 1.9533 3 A2B1 H G H G I 1.5600 3 A3B1 H I H J I 1.2600 3 A3B3 J I 16
Đồ án tốt nghiệp J I 1.1933 3 A2B3 J I K J I 0.9833 3 A9B3 K J I K J I 0.9433 3 A4B3 K J K J 0.7500 3 A6B3 K K 0.2733 3 A7B3 Khả năng tiết enzyme chitinase của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất canh tác Bảng số liệu thô đường kính vòng phân giải cơ chất chitin Đƣờng kính vòng phân giải chitin (D-d (mm)) 24h 48h 72h STT Chủng LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 A1 KL 1.2 2,49 2,44 2,68 5,55 5,09 5,24 1,94 1,84 1,53 A2 KL 1.3 2,18 2,9 2,26 4,71 4,73 6,64 0,14 0,73 0,95 A3 KL 1.4 1,7 1,6 1,74 3,75 3,96 3,73 0,97 1,11 1,03 A4 KL 3.1 3,76 4,4 2,62 6,47 5,58 6,24 0,84 1,07 2,01 A5 KL 4.1 2,34 2,58 2,75 4,11 5,31 4,37 2,65 3,78 3,26 A6 KL 5.1 2,03 2,46 2,49 3,15 4,92 2,3 3,36 1,94 1,11 A7 KL 5.2 2,75 2,26 2,57 4,02 4,85 5,58 0,32 0,22 0,27 A8 KL 5.3 2,98 4,63 4,02 7,19 6,23 7,3 4,43 3,67 4,36 A9 KL 6.1 1,49 2,37 2 5,63 5,66 5,04 1,13 0,51 0,28 A10 KL 6.2 2,75 2,3 2,75 7,69 5,98 5,4 1,87 1,35 0,87 A11 KL 8.2 2,57 2,5 2,96 5,94 4,2 4,91 1 1,89 3,04 A12 HT 1.1 3,12 3,41 3,47 8,03 6,82 9,79 2,48 2,13 2,15 A13 HT 1.2 3,32 2,84 2,69 7,49 5,98 7,18 2,43 3,19 2,43 A14 HT 1.3 2,02 2,74 4,25 4,86 4,76 4,51 1,8 2,41 1,19 A15 HT 2.1 3,05 3,23 4,6 5,82 5,48 7,21 3,47 3,32 1,47 A16 HT 2.2 2,78 3,12 2,63 6,27 7,52 7,14 5,21 6,72 5,2 A17 HT 2.3 3,42 4,35 3,9 5,39 5,43 5,17 2,42 4,16 4,09 A18 HT 3.1 3,17 3,55 3,39 8,23 7,22 6,1 2,29 0,87 2,19 A19 HT 3.2 3,51 3,19 3,01 4,61 4,82 5,64 1,74 0,66 0,86 A20 HT 3.3 2,98 2,76 2,34 5,46 4,56 6,71 1,27 0,96 0,98 A21 HT 4.1 3,11 3,05 3,18 7,52 6,3 5,91 1,96 1,82 1,47 17
Đồ án tốt nghiệp A22 HT 4.2 2,62 3,95 2,95 7,17 5,87 6,2 3,21 2,12 2,75 A23 HT 4.3 3,1 3,39 3,3 5,98 6,41 6,52 2,83 2,03 1,68 A24 HT 5.1 6,22 6,25 6,43 6,86 6,94 7,01 8,82 8,54 8,68 A25 HT 5.2 2,09 1,93 2,3 5,52 4,99 5,93 1,02 1,31 0,75 A26 HT 6.1 4,17 3,82 3,79 5,1 6,31 3,92 1,09 2,81 2,21 A27 HT 6.3 2,85 3,34 2,89 7,51 7,05 7,57 2,16 3,12 3,08 A28 HT 7.2 2,06 2,02 2,89 3,82 4,64 5,1 5,15 4,92 5,55 A29 HT 7.3 1,81 2,46 2,52 5,04 5,27 4,81 1,95 2,7 2,69 Kết quả xử lý thống kê số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất chitin theo thời gian A: Tên chủng. Tương ứng với STT chủng trên bảng số liệu thô. B: Thời gian đo. Tương ứng: B1: 24 giờ, B2: 48 giờ, B3: 72 giờ AB: Tên chủng theo thời gian Class Level Information Class Levels Values A 29 1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 4 5 6 7 8 9 B 3 1 2 3 Number of Observations Read 261 Number of Observations Used 261 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.935368 16.78441 0.626882 3.734904 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 28 264.8224115 9.4579433 24.07 <.0001 B 2 548.1312927 274.0656464 697.40 <.0001 A*B 56 176.6286184 3.1540825 8.03 <.0001 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 174 Error Mean Square 0.39298 Critical Value of t 1.97369 Least Significant Difference 0.5833 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N A A 7.4622 9 24 B 5.1767 9 16 B C B 4.9789 9 8 C B C B D 4.6000 9 12 C D C E D 4.3967 9 27 E D F E D 4.2589 9 17 F E D F G E D 4.1833 9 15 F G E D F G E D 4.1722 9 13 F G E D F G E D 4.1122 9 18 F G E D 18
Đồ án tốt nghiệp F G E D 4.0933 9 22 F G E F G E H 4.0167 9 28 F G E H F G E H 3.9156 9 23 F G H F G I H 3.8133 9 21 F G I H J F G I H 3.6911 9 26 J G I H J G I H 3.6656 9 4 J I H J K I H 3.4611 9 5 J K I H J K L I H 3.4400 9 10 J K L I J K L I M 3.2500 9 29 J K L M J K L M 3.2233 9 11 J K L M J K L N M 3.2000 9 1 J K L N M J K L N M 3.1711 9 14 J K L N M J K L N M O 3.1156 9 19 J K L N M O J K L N M O 3.1133 9 20 K L N M O K L N M O 2.8967 9 2 L N M O L N M O 2.8711 9 25 N M O P N M O 2.6789 9 9 P N O P N O 2.6400 9 6 P O P O 2.5378 9 7 P P 2.1767 9 3 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 174 Error Mean Square 0.39298 Critical Value of t 1.97369 Least Significant Difference 0.1876 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N B A 5.75793 87 2 B 3.00747 87 1 C 2.43931 87 3 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 174 Error Mean Square 0.39298 Critical Value of t 1.97369 Least Significant Difference 1.0102 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N AB A 9.1500 3 A24B3 A B A 8.2133 3 A12B2 B B C 7.3767 3 A27B2 C D C 7.1833 3 A18B2 D C D C E 6.9767 3 A16B2 D C E D C E 6.9367 3 A24B2 D C E D C E 6.9067 3 A8B2 D C E 19
Đồ án tốt nghiệp D C E 6.8833 3 A13B2 D C E D F C E 6.5767 3 A21B2 D F C E G D F C E 6.4133 3 A22B2 G D F E G D F H E 6.3567 3 A10B2 G D F H E G D F H E I 6.3033 3 A23B2 G D F H E I G D F H E I 6.3000 3 A24B1 G F H E I G J F H E I 6.1700 3 A15B2 G J F H E I G J F H K E I 6.0967 3 A4B2 G J F H K I G J F H K L I 5.7100 3 A16B3 G J F H K L I G J F M H K L I 5.5767 3 A20B2 G J M H K L I G J N M H K L I 5.4800 3 A25B2 G J N M H K L I G J N M H K L I 5.4433 3 A9B2 J N M H K L I J N M H K L I 5.3600 3 A2B2 J N M K L I J N M K L I 5.3300 3 A17B2 J N M K L I J N M K L I 5.2933 3 A1B2 J N M K L J N M K L 5.2067 3 A28B3 N M K L N M O K L 5.1100 3 A26B2 N M O L N M O L 5.0400 3 A29B2 N M O L N M O L 5.0233 3 A19B2 N M O L N M O L 5.0167 3 A11B2 N M O L P N M O L 4.8167 3 A7B2 P N M O L P N M O L 4.7100 3 A14B2 P N M O P N M O Q 4.5967 3 A5B2 P N O Q R P N O Q 4.5200 3 A28B2 R P O Q R P S O Q 4.1533 3 A8B3 R P S Q R P S T Q 3.9267 3 A26B1 R P S T Q R P S T Q 3.8900 3 A17B1 R P S T Q R P S T Q 3.8767 3 A8B1 R P S T Q R P S T Q U 3.8133 3 A3B2 R S T Q U R V S T Q U 3.6267 3 A15B1 R V S T Q U R V S T W Q U 3.5933 3 A4B1 R V S T W U R V S T W X U 3.5567 3 A17B3 V S T W X U Y V S T W X U 3.4567 3 A6B2 Y V S T W X U Y V S T W X U 3.3700 3 A18B1 Y V S T W X U Y V S Z T W X U 3.3333 3 A12B1 Y V S Z T W X U 20
Đồ án tốt nghiệp Y V A S Z T W X U 3.2633 3 A23B1 Y V A S Z T W X U Y V A S Z T W X U 3.2367 3 A19B1 Y V A S Z T W X U Y V A S Z T W X U 3.2300 3 A5B3 Y V A S Z T W X U Y B V A S Z T W X U 3.1733 3 A22B1 Y B V A Z T W X U Y B V A C Z T W X U 3.1133 3 A21B1 Y B V A C Z T W X U D Y B V A C Z T W X U 3.0267 3 A27B1 D Y B V A C Z T W X U D Y B V A C Z T W X U 3.0033 3 A14B1 D Y B V A C Z T W X U D Y B V A C Z T W X U E 2.9500 3 A13B1 D Y B V A C Z W X U E D Y B V A C Z W X U E 2.8433 3 A16B1 D Y B V A C Z W X E D Y B V A C Z F W X E 2.7867 3 A27B3 D Y B V A C Z F W X E D Y B V A C Z F W X G E 2.7533 3 A15B3 D Y B V A C Z F W X G E D Y B V A C Z F W X G E 2.6933 3 A22B3 D Y B V A C Z F W X G E D Y B V A C Z F W X G E 2.6933 3 A20B1 D Y B V A C Z F W X G E D Y B V A C Z F W X H G E 2.6833 3 A13B3 D Y B V A C Z F W X H G E D Y B V A C Z F W X H G E 2.6767 3 A11B1 D Y B A C Z F W X H G E D Y B A C Z F W X H G E 2.6000 3 A10B1 D Y B A C Z F X H G E D Y B A C Z F X H G E 2.5567 3 A5B1 D Y B A C Z F H G E D Y B A C Z F H G E 2.5367 3 A1B1 D Y B A C Z F H G E D Y B A C Z F H G E 2.5267 3 A7B1 D Y B A C Z F H G E D Y B A C Z F H G E 2.4467 3 A29B3 D Y B A C Z F H G E D Y B A C Z F H G E 2.4467 3 A2B1 D B A C Z F H G E D B I A C Z F H G E 2.3267 3 A6B1 D B I A C Z F H G E D B I A C Z F H G E 2.3233 3 A28B1 D B I A C F H G E D B I A C F J H G E 2.2633 3 A29B1 D B I A C F J H G E D B I A C F J H G E 2.2533 3 A12B3 D B I C F J H G E D B I C F J H G E 2.1800 3 A23B3 D I C F J H G E D I C F J H G E 2.1367 3 A6B3 D I C F J H G E D I C F J H G E 2.1067 3 A25B1 D I F J H G E D I K F J H G E 2.0367 3 A26B3 I K F J H G E I K F J H G E 1.9767 3 A11B3 I K F J H G E I K F J H G E 1.9533 3 A9B1 I K F J H G L I K F J H G 1.8000 3 A14B3 L I K F J H G L I K F J H G 1.7833 3 A18B3 L I K J H G L I K J H G 1.7700 3 A1B3 L I K J H G L I K J H G 1.7500 3 A21B3 L I K J H 21
Đồ án tốt nghiệp L I K J H 1.6800 3 A3B1 L I K J L I K M J 1.3633 3 A10B3 L K M J L K M J 1.3067 3 A4B3 L K M L N K M 1.0867 3 A19B3 L N K M L N K M 1.0700 3 A20B3 L N K M L N K M 1.0367 3 A3B3 L N K M L N K M 1.0267 3 A25B3 L N M L N M 0.8833 3 A2B3 N M N M 0.6400 3 A9B3 N N 0.2700 3 A7B3 PHỤ LỤC B: KHẢ NĂNG KÝ SINH TUYẾN TRÙNG CỦA CÁC CHỦNG NẤM P. lilacinum Phụ lục B.1: Khả năng ký sinh khối trứng của các chủng nấm P. lilacinum Bảng số liệu thô tỷ lệ ký sinh(%) khối trứng TỶ LỆ KÝ SINH TRÊN KHỐI TRỨNG (%) STT Chủng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 T1 PB 1.1 5 6 9 11 13 15 17 T2 PB 1.3 30 43 50 59 65 70 77 T3 PB 1.10 12 17 23 27 32 38 43 T4 PB 2.10 6 10 13 16 21 25 29 T5 PB 3.3 3 5 7 9 12 14 16 T6 KL 5.3 10 13 17 20 25 30 31 T7 KL 6.2 1 2 3 4 5 6 8 T8 HT 3.3 3 5 8 10 13 15 19 T9 HT 5.1 23 28 33 37 42 47 51 STT Chủng Ngày 8 Ngày 9 Ngày 10 Ngày 11 Ngày 12 Ngày 13 Ngày 14 T1 PB 1.1 20 33 48 56 68 79 61 T2 PB 1.3 83 91 95 97 98 99 100 T3 PB 1.10 48 53 64 68 70 71 73 T4 PB 2.10 35 51 61 65 68 69 70 T5 PB 3.3 20 21 24 26 30 33 34 T6 KL 5.3 33 36 40 45 46 47 48 T7 KL 6.2 10 15 17 19 20 21 23 T8 HT 3.3 21 27 33 35 37 39 41 T9 HT 5.1 56 65 70 75 77 79 81 22
Đồ án tốt nghiệp Kết quả xử lý thống kê tỷ lệ ký sinh khối trứng theo từng ngày T: Tên chủng. Ngày 1 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.600108 42.96735 1.130651 2.631418 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 34.53159433 4.31644929 3.38 0.0152 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 1.278371 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 1.9395 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 4.8512 3 9 A B A 3.9737 3 2 B A B A C 3.3865 3 4 B C B C 2.7265 3 3 B C B C 2.2190 3 5 C C 1.7743 3 8 C C 1.6410 3 1 C 23
Đồ án tốt nghiệp C 1.5589 3 7 C C 1.5515 3 6 Ngày 2 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.577918 43.09221 1.341674 3.113495 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 44.36450181 5.54556273 3.08 0.0226 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 1.800088 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.3015 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 5.384 3 9 A B A 4.966 3 2 B A B A C 3.894 3 4 B A C B A C 3.246 3 3 B C B C 2.667 3 5 C C 2.112 3 8 C C 2.091 3 7 C 24
Đồ án tốt nghiệp C 1.965 3 1 C C 1.696 3 6 Ngày 3 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.549684 40.48484 1.441738 3.561180 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 45.67104899 5.70888112 2.75 0.0358 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 2.078608 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.4732 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 5.778 3 9 A B A 5.480 3 2 B A B A C 4.460 3 4 B A C B A C 3.631 3 3 B C B C 3.075 3 5 C C 2.735 3 8 C 25
Đồ án tốt nghiệp C 2.467 3 1 C C 2.386 3 7 C C 2.038 3 6 Ngày 4 Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.562841 36.30116 1.443183 3.975582 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 48.26821376 6.03352672 2.90 0.0290 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 2.082776 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.4756 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 6.190 3 9 A A 6.020 3 2 A B A 4.886 3 4 B A B A 4.057 3 3 B B 3.508 3 5 B B 3.132 3 8 B 26
Đồ án tốt nghiệp B 2.781 3 1 B B 2.762 3 7 B B 2.445 3 6 Ngày 5 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.567719 34.15480 1.489029 4.359649 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 52.41375770 6.55171971 2.95 0.0268 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 2.217208 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.5543 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 6.615 3 9 A B A 6.472 3 2 B A B A C 5.383 3 4 B A C B A C 4.441 3 3 B C B C 4.007 3 5 C C 3.431 3 8 C 27
Đồ án tốt nghiệp C 3.062 3 1 C C 2.992 3 7 C C 2.834 3 6 Ngày 6 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.591563 31.77370 1.495283 4.706041 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 58.29018811 7.28627351 3.26 0.0178 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 2.235873 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.565 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 7.063 3 9 A A 6.930 3 2 A B A 5.821 3 4 B A B A C 4.813 3 3 B C B C 4.319 3 5 B C B C 3.712 3 8 B C 28
Đồ án tốt nghiệp B C 3.319 3 1 C C 3.205 3 7 C C 3.172 3 6 Ngày 7 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.586999 30.11390 1.517992 5.040836 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 58.95195928 7.36899491 3.20 0.0193 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 2.3043 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.604 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 7.338 3 9 A B A 7.279 3 2 B A B A C 6.206 3 4 B A C B D A C 5.154 3 3 B D C B D C 4.708 3 5 D C D C 4.175 3 8 D 29
Đồ án tốt nghiệp D 3.591 3 7 D D 3.557 3 1 D D 3.360 3 6 Ngày 8 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.604516 27.88746 1.503353 5.390786 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 62.18321375 7.77290172 3.44 0.0140 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 2.260071 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.5788 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 7.726 3 9 A B A 7.639 3 2 B A B A C 6.679 3 4 B A C B D A C 5.472 3 3 B D C B D C 5.140 3 5 D C D C 4.409 3 8 D 30
Đồ án tốt nghiệp D 3.990 3 1 D D 3.902 3 7 D D 3.561 3 6 Ngày 9 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.596759 24.30553 1.472320 6.057552 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 57.74447379 7.21805922 3.33 0.0162 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 2.167727 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.5256 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 8.227 3 9 A B A 8.002 3 2 B A B A C 7.649 3 4 B A C B D A C 6.089 3 3 B D C B D C 5.694 3 5 D C D C 5.242 3 8 D 31
Đồ án tốt nghiệp D 4.869 3 7 D D 4.789 3 1 D D 3.957 3 6 Ngày 10 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.601380 22.93560 1.506581 6.568742 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 61.63771251 7.70471406 3.39 0.0149 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 2.269785 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.5844 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 8.594 3 4 A A 8.488 3 2 A A 8.488 3 9 A B A 6.674 3 3 B A B A 6.017 3 5 B B 5.786 3 8 B 32
Đồ án tốt nghiệp B 5.563 3 1 B B 5.279 3 7 B B 4.229 3 6 Ngày 11 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.598860 21.12193 1.451977 6.874265 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 56.65271159 7.08158895 3.36 0.0156 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 2.108238 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.4907 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 8.768 3 4 A A 8.755 3 2 A B A 8.724 3 9 B A B A C 6.968 3 3 B C B C 6.240 3 5 C C 6.190 3 1 C 33
Đồ án tốt nghiệp C 5.957 3 8 C C 5.662 3 7 C C 4.605 3 6 Ngày 12 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.590240 20.43370 1.442771 7.060741 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 53.97176831 6.74647104 3.24 0.0182 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 2.081588 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.4749 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 8.910 3 9 A A 8.880 3 2 A A 8.866 3 4 A B A 7.068 3 3 B A B A 6.563 3 1 B A B A 6.468 3 5 B 34
Đồ án tốt nghiệp B 6.150 3 8 B B 5.830 3 7 B B 4.812 3 6 Ngày 13 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.578880 20.27613 1.459256 7.196917 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 52.68881498 6.58610187 3.09 0.0222 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 2.129428 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.5032 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 9.059 3 9 A A 8.978 3 2 A A 8.922 3 4 A B A 7.147 3 3 B A B A 6.835 3 1 B A B A 6.655 3 5 B 35
Đồ án tốt nghiệp B 6.285 3 8 B B 5.968 3 7 B B 4.922 3 6 Ngày 14 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.575967 19.56663 1.429798 7.307326 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 49.98272883 6.24784110 3.06 0.0233 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 2.044321 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.4527 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 9.150 3 9 A A 9.008 3 2 A A 8.978 3 4 A B A 7.264 3 3 B A B A 6.962 3 1 B A B A 6.780 3 5 B 36
Đồ án tốt nghiệp B 6.442 3 8 B B 6.113 3 7 B B 5.070 3 6 Phụ lục B.2: Khả năng ký sinh con cái của các chủng nấm P. lilacinum Bảng số liệu thô tỷ lệ ký sinh(%) con cái TỶ LỆ KÝ SINH TRÊN CON CÁI (%) STT Chủng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 T1 PB 1.1 75 88 90 91 T2 PB 1.3 72 81 85 87 T3 PB 1.10 79 86 89 91 T4 PB 2.10 76 84 87 90 T5 PB 3.3 75 83 88 90 T6 KL 5.3 77 82 86 89 T7 KL 6.2 86 91 95 97 T8 HT 3.3 87 95 98 100 T9 HT 5.1 82 89 90 91 Kết quả xử lý thống kê tỷ lệ ký sinh con cái theo từng ngày T: Tên chủng. Ngày 1 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.570649 11.09364 5.398902 48.66667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 697.3333333 87.1666667 2.99 0.0255 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 29.14815 37
Đồ án tốt nghiệp Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 9.2613 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 54.333 3 4 A A 53.000 3 7 A B A 52.333 3 9 B A B A 51.333 3 2 B A B A 50.667 3 3 B A B A 49.333 3 1 B A B A C 46.000 3 8 B C B C 43.333 3 6 C C 37.667 3 5 Ngày 2 Class Level Information Class Levels Values T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.551855 5.294351 4.176655 78.88889 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 8 386.6666667 48.3333333 2.77 0.0346 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 17.44444 38