Khóa luận Nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) từ phôi bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

56 trang thiennha21 13/04/2022 4650

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) từ phôi bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_kha_nang_nhan_giong_lan_hai_van_nam_pap.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) từ phôi bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN THỊ THU HẰNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG LAN HÀI VÂN NAM (Paphiopedilum callosum) TỪ PHÔI BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2015 - 2020 Thái Nguyên, năm 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN THỊ THU HẰNG Tên đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG LAN HÀI VÂN NAM (Paphiopedilum callosum) TỪ PHÔI BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K47 CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2015 - 2019 Giảng viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2020
i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoaCông nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp emđã thực hiện đề tài:“Nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) từ phôi bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro”. Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệunhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Đặc biệt, em xin cám ơn ThS. Nguyễn Thị Tình đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòngđộng viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian có hạn không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiệnhơn. Lời cuối em xin kính chúc các thầy,giáo cô trong nhà trường, trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ, thành công trong cuộc sống. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thu Hằng
ii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 21 Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năngnhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) 28 Bảng 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồicủa cây lan hài Vân Nam 30 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 33 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng rarễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 36 Bảng 4.5. ếtK quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kếthợ p với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 38
iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) 10 Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi từ phôi và ra rễ của cây lan hài Vân Nam 23 Hình 4.1. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanhchồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) 30 Hình 4.2. Hình ảnh BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam 32 Hình 4.3. Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) . 35 Hình 4.4. Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 37 Hình 4.5. Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tínhđến khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 40
iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi lanhài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) 28 Biểu đồ 4.2. BA kết hợp với Kinetinđến khả năng nhân nhanh chồicủa cây lan hài Vân Nam 31 Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 33 Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 36 Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 39
v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BIỂU ĐỒ iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1.1.Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 1 1.3. Yêu cầu của đề tài 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan về lan Hài (Paphiopedilum) 3 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 3 2.1.2. Đặc điểm hình thái 4 2.1.3. Sinh thái 5 2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam 6 2.2. Giới thiệu về giống lan hài Vân Nam 8 2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố 8 2.2.2. Hình thái 8 2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hài Vân Nam 10 2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 2.3.1. Sự phân hoá tế bào 12
vi 2.3.2. Sự phản phân hoá tế bào 12 2.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấymô tế bào thực vật 12 2.3.4. Môi trường dinh dưỡng 13 2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước 17 2.4.1. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới 17 2.4.2. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trong nước 19 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ỨC U . 21 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 21 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 21 3.1.2. Hoá chất sử dụng 21 3.1.3. Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu 21 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu 22 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu 22 3.2.2. Thời gian nghiên cứu 22 3.3. Nội dungnghiên cứu 22 3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam 22 3.3.2. Nội dung 2: Xác ịđ nh môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Vân Nam. 22 3.4. Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô 22 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu 23 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 23 3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 26 3.5.1. Thu thập số liệu 26 3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi 26 3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu 27
vii Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 4.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam. 28 4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) 28 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khảnăng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam 30 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZđến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam 32 4.4. Kết quả nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Vân Nam. 35 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễcủa cây lan hài Vân Nam 35 4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tínhđến khả năng nhân nhanh cây lan hài Vân Nam 38 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1. Kết luận 41 5.2. Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢ0 42 PHỤ LỤC
viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TDZ : Thidiazol BA : 6-Benzyl amino purine CS : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/C : Đối chứng Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashighe và Skoog, 1962 MT : Môi trường NAA : α-Napthalene acetic acid P. malipoens : Paphiopedilum malipones THT : Than hoạt tính TN : Thí nghiệm RE : Robert Ernst
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Lan Hài thuộc họ lan Orchidaceae, là một trong những họ lớn nhất và cũng mang lại nhiều giá trị kinh tế, khoa học trong ngành thực vật hạtkín. Hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) là một trong những loài lan đặc hữu quý hiếm của Việt Nam. Đặc điểm của giống lan này là cánh hoa hình trứng hơi nhọn, có lông tơ trắng ở gốc, lông nhung ở mặt trong. Hoa có mùi thơm ngọt dịu, lá đài và cánh hoacómàu xanh táo, có đốm và sọc- tím hồng. Cánh môi nằm ngang, màu xanh nhạt có đốm tím hồng ở mặt trong, hình túi sâu nhìn như chiếc hài [5]. Hiện nay, trong quá trình phát triển kinh tế xã hội có nhiều loài lan quý hiếm đang bị đe doạ tuyệt chủng. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việcứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy mô tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều cao vàhệsố nhân lớntrong thời gian ngắn. Đồng thời góp phần giảm tốc độ tuyệt chủng của chúng trong tự nhiên rất cần những nghiên cứu một cách có hệ thống [6]. Việt Nam là một quốc gia có trữ lượng hoa lan và các loài lan đặc hữu vàobậc nhất thế giới. Tuy nhiên hiện nay rất nhiều loài đã không còn xuất hiện ngoài tựnhiên nếu Việt Nam không có chính sách bảo tồn nhanh các loài thực vật bản địa, cácloài hoang dã thì tương lai rất gần Việt Nam sẽ mất hẳn những nguồn vật liệu quý [5]. Xuất phát từ cơ sở khoa học và yêu cầu thực tế khách quan trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) từ phôi bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”. 1.2. Mục tiêu của đề tài - Nghiên cứu khả năng ra rễ đượcloài lan hài Vân Nam có giá trị từ phôi bằng phương pháp nuôi cấy mô.
2 1.3. Yêu cầu của đề tài - Xác định được môi trường nhân nhanh lan hài Vân Nam tái sinh chồi từ quả. - Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh cho lan hài Vân Nam. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổsungvào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn. - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tếcũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác. saunày - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữliệu khoa học mới về nhân giống lan hài Vân Nam bằng phương pháp nuôi cấy mô, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Đề xuất được quy trình nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô, tạo ra số lượng giống lan hài Vân Nam góp phần bảo tồn giống đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học.
3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về lan Hài (Paphiopedilum) 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 2.1.1.1. Phân loại Chi lan Paphiopedilum gồm khoảng 80 loài lan, nguồn gốc tại vùng Ấn-Mã Lai (Nam Trung Hoa, Đông Nam Á, hải đảo Thái Bình Dương ), Ấn độ. Việt Nam có nhiều loài được xem là đặc hữu, nổi tiếng khắp thếgiới. Các nhà nghiên cứu về lan, dựa theo hình dạng của cánh hoa, còn Paphiopedilumchia thành năm chi phụ, và sau đó từ các chi phụ còn chia thêm thành những nhóm khác nhau. chúng có thể dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa hình túi sâu trông giống một chiếc hài nằm vị trí thấp nhất của hoa, tạo nênmộtvẻ bề ngoài rất đặc sắc. Và do vậy, “Hài” trở thành tên chung của nhóm lan .này Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5chilà: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là hài Vệ nữ, phân bốở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc. - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chiSelenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ. - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Átừ Nam Ấn Độ và Đông malayaHy đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon. Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộcchi Paphipedilum, thuộc tông Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ lan (Orchidaceae), bộ lan(Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp ột m lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [1],[9]. 2.1.1.2. Nguồn gốc Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất củachi này được tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốc và Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất hạnchế.
4 Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis cósáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đựcởvòng trong). Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liềngiữa nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoácủahọ Lan. Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lancóba, hai hay một nhị đực tồn tại trong hoa. Tronghọ Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa [1]. 2.1.2. Đặc điểm hình thái Lan Hài là nhóm lan đã tách riêng khỏi các dòng lan chính qua tiến trình tiến hóa, tạo ra những túi nhỏ trên hoa và những túi này đã trở thành đặc điểm riêng cho nhóm lan hài. Túi hay “hài” là một biến thể của cánh hoa thứ ba. Khi thay đổihình dạng, các phần khác của hoa Paphiopedilum cũng biến đổi một cách tương xứng: hai đài hoa hai bên gần như chập lại và nằm ẩn vào phía sau của chiếc túi. Túi được xem như một cấu tạo của hoa để giúp sự thụ phấn: côn trùng bị dẫn dụ để đến bámvàobờ túi, mất thăng bằng và rơi vào bên trong túi. Bên trong túi có những lông nhỏ sắp xếp kiểu bậc thang, côn trùng sẽ ra khỏi hoa theo hai cạnh của túi và trụ, mang theo phấn hoa trên người [1]. Các loài lan Hài( Paphiopedilum) ởViệt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả cácloài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn [1]. - Lá chia thành 2 nhóm: nhóm lá có đốm xanh bạc,xanh trắng hoặc xậm và nhóm có lá một màu toàn xanh lục không đốm. Sự khác biệt của lá có thể làdođiều kiện nhiệt độ sinh sống của loài lan hài Paphiopedilum có thể là xanh hoặc là lá gấm (khảm) là loài có lá kết thành hình quạt hoặc lá xuất phátthan từcác ngắn của nó. Dù chúng thuộc loài có kích cấu lá như thế nào, tồn tại trong vài năm; nhưng chúng chỉ ra hoa một lần. Không có gì trong việc phân biệt là cây non, cây trưởng
5 thành (đã có chồi mới và đã ra hoa), hoặc những cây đã già ta thấy ngay những cuống hoa cũ vẫn còn ở trên thân. Lá của loài này được mô tả là loại lá gậpđôihoặc lá có gân nổi, sống trâu, và được sắp xếp đối xứng sang hai bên trông giống cáiquạt. Độ dài của lá có thể từ3- 5 cm, lá thường xanh có đốm trắng điếm xuyến [1]. - Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầunhư các loài đều có cuống hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên cũngcóloài có cụm hoa mang hai hoa, song rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùytừng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hìnhbầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường cólông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá,ở một số loài có lá hoa nhẵn [1]. - Hoa: mỗi cành chỉ có một đến hai hoa, kích thước bông hoa lớn từ12-15cm. Cụm hoa thẳng, dài 20-25 cm. môi hoa hình túi, cánh lung thường có dạng hình tim ngược đầu có sọc hay đốm. Hai cánh bên phía sau kết hợp liền với nhau. Cònhai cánh bên phía trước có thể xòe hai bên hay thả xuống. Chúng thường nở vàomùa đông, thời gian hoa nở rất lâu tàn có thể từ2-3 tháng [1]. - Nhị: bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cộtnhị- nhuỵ. Hai nhị đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵvà hai bên cuốn cột [7]. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này. Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn [1]. 2.1.3. Sinh thái Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độcaotừ700-2200m. Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe nứt hay rìacủa các vách núi dựng đứng đá granit.
6 Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Cácloài sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn núi dốc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn. Các loài lanHàimọc trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là cácmỏmđá và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám trênvỏ cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m. Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độcao. Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúngsẽnhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sựcómặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quantrọng trong sự hình thành và phát triển của quần thể lan Hài. Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn núi. Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triểnở các sườn núi phía Bắc, Đông Bắc và Tây Bắc của núi.Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi con người,sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam [1]. 2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưu tầm, tìm kiếm nhiều nhất thế giới. Với sự hiện hữu của hơn 20 loài thuộcchi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất. Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng. Điều này đãtạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách ồ ạt, không kiểmsoát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên. Đồng thời với tình trạng môitrường
7 tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng [1]. Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng. Mộtcông trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam củanhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1]. Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam.Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hàinhư: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà (Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum. - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn loài P. callosum. - Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P.dalatensis. - Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum. - Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii, P.hangianum, P. malipoense varijackii. - Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loàiP.gratrixianum. - Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae. - Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha đang bảo tồn loài P. malipoense Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài. Đầu tiên phải kế đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng năm 2005 [27], [28]. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấy
8 in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau, Khoa CNSH– CNTP trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên bước đầu đã thành công nhân giống bằng phương phápin vitro một số loài lan Hài như: Hài Vệ Nữ, Hài Hằng, Hài Helen. 2.2. Giới thiệu về giống lan hài Vân Nam 2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố Năm 1954, hai nhà thực vật học Trung Quốc là S.C. Chen và Z.H. Tsi đã đưara bản mô tả vềPaphipedilum callosum dựa trên tiêu bản thực vật do K.M.Feng thu thập được năm 1947 ở gần Malipo, đông nam tỉnh Vân Nam, sát biên giới Việt Nam. Tiêu bản gốc được lưu giữ tại phòng Tiêu bản thực vật thuộc Viện Thực vật Bắc Kinh [16], [17]. Tuy P. callosum được mô tả năm 1954 nhưng chỉ được đưa vào trồng từ năm 1984. Từ đó P. callosum được xuất đi khỏi Trung Quốc và được trồng phổ biến từ năm 1984. Mặc dù đã có một lượng lớn được xuất ra khỏi Trung Quốc nhưng trong một thời gian dài sự phân bố tự nhiên và nơi sống của chúng vẫn chưa được biết rõ ràng. Ban đầu nó được thu từ những ngọn núi gần thị trấn Malipo. Bên cạnh địa điểmthu mẫu chuẩn này, quần thể tự nhiên của loài này cũng được quan sát thấy dọc theoranh giới nam của cao nguyên đá vôi Quý Châu ở độ cao 800-1100 m, về phía tây của tỉnh Quảng Tây. Rất nhiều quần thể của loài lan này được phát hiện ở Bắc Việt Namthông qua các đợt nghien cứu thực địa năm 1994-1997. Lan hài P. callosum phân bố ở phía bắc Việt Nam(Sơn La, Hà Giang, Cao Bằng, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Lạng Sơn, Hòa Bình, Thanh Hóa và Quảng Bình). Trong 3 thứ kể trên thìvar. callosum có sự phân bố rộngnhất vàgặp từ 450 đến 1450 m, còn 2 thứ kia chỉ mới gặp ở một hai địa điểm của huyện Na Hang, tỉnh Tuyên Quang, và chỉ ở độ cao 450 – 650 m [1]. 2.2.2. Hình thái - Dạng thân: Thân cỏ mọc trên đất hay đá, có thân rễ ít nhiều kéo dài với đường kính 2-3,5 mm [III].
9 - Dạng lá: Lá hình thuôn hay bầu dục hẹp, cỡdài 10 – 16 cm rộng 2,5 - 5 cm, dài, ở mặt trên có những khoang màu lục nhạt - lục thẫm xen kẽ nhau, mặt dưới có nhiều chấm màu nâu – tía, có đốm tím dày và gờ ở mặt dưới của lá, cuống ládài2-4 cm, có lông rìa trắng ở mép gốc [III]. - Dạng hoa: Cụm hoa có cuống mảnh và dài đến30 - 50 cm, có lông, thường mang 1 hoa ở đỉnh. Hoa có mùi thơm dịu, lá đài và cánh hoa có màu xanh táo, có đốm và sọc -tím hồng; môi vàng-xám xanh nhạt, có những đốm tím hồng ở mặt trong, nhị lép trắng tuyền, nâu thẫm hạt dẻ ở nửa trên; cuống hoa vàbầudài khoảng 4 cm, có lông trắng và mở ở chóp, rộng đến 8- 12 cm [III]. Lá đài ở gần trục hoa từ hình trứng rộng đến bầu dục, dài4– 7 cm, rộng 1,8 - 4,5 cm, có lông tơ trằng lưa thưa ở mặt trong, không có ở bên ngoài [III]. Lá đài kia từ hình trứng rộng đến trứng - mũi mác, dài 3,8 - 5,3 cm, rộng 2,4 - 4,8 cm. Cánh hoa hình trứng, hơi nhọn, dài 4 – 7 cm, rộng 3,4 - 5 cm, có lông tơ trắng ở gốc, lông nhung trắng ở mặt trong. Môi là túi gần hình cầu, to, nằm ngang, hình túi sâu, dài 4,5 - 6,5 cm rộng 3,8 - 5,4 cm, mép cuốn vào trong. Nhị lép lồi, hình trứng thuôn - rộng, dài 13 – 14 cm, rộng 11 - 13 mm, cụt ở chóp, gần như không có cuống, có lông mép trắng và lông nhung ở nửa dưới, có gờ ở lưng, có bướu lồi tròn trên bề mặt ở nửa trên lưng, có bướu lồi tròn trên bề mặt ở nửa trên. - Quả: Dạng quả nang dài, 3 gờ, hình trụ, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt.Quả chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng [III]. - Rễ: Rễ chùm, màu nâu [31].
10 Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) 2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hàiVân Nam 2.2.3.1. Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng - Nhiệt độ: Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật chung, những cây có lá màu xanh thường thích sống ở nơi có nhiệt đô lạnh đến trung bình, ban đêm là từ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C. Các loài Hài có lá vằn thích hợpvới điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm, ban đêm là 16-18°C, ban ngày là 21-25°C. - Ánh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mặt trời đầy đủ. Hầu hết lan Hàiưa ánh sáng yếu, điều kiện ánh sáng nhân tạo cho các loài lantừ11.000-22.000 lux [21]. Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn chứng tỏ chúng đang dư ánh sáng, nếu lámàu xanh đậm và mềm hoặc phát hoa dài, yếu, chúng đang thiếu ánh sáng.
11 - Độ ẩm không khí: Không khí ẩm và lưu thông tốt làrất cần thiết, nhất là trong mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây không bị khôquá nhanh. Độ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên các khay sỏinhẹ với 50% độ ẩm là lý tưởng. 2.2.3.2. Nhu cầu bón phân Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổ sung khoáng Ca2+ 40mg/l và Mg2+ 20-30mg/l. Tưới nước đậm trước và sau khi bón phân, nếu thấy đầu lá bị nâu khô thì nên dừng hẳn việc tưới phân. Sang chậu khi giá thể trồng có dấu hiệu mục nát [7]. 2.2.3.3. Giá thể trồng P. callosum có thể trồng trên giá thể gồm đá vôi trộn thêm chất lá mục, than củi, xỉ than tổ ong, sỏi, vỏ thông và có thể tưới thêm phân bón 2lần/ tuần trong suốt mùa sinh trưởng của cây lan [7]. 2.2.3.4.Các phương pháp nhân giống vô tính lan hài Vân Nam - Phương pháp tách chiết thông thường: Lan hài Vân Nam là loài đơn thân nên chỉ có thể tách chồi non ra khỏi cây mẹ, trồng vào chính giữa chậu mới. Cần cộtchặt cây vào chậu bằng một cây tựa sau đó phun một dung dịch NAA 0,1 ppm và vitamin B1 và treo cây vào nơi ẩm mát, thoáng. Sau khi cây bén rễ thì bổ sung thêm chất trồng vào chậu sau đó đặt cây vào nơi có điều kiện ánh sáng thích hợpchosự phát triển lâu dài của cây [7]. - Phương pháp cấy mô: Đây là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống lan Hài trên quy mô công nghiệp, cây con được sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố mẹ. So với phương pháp tách chiết thông thường có tốc độphát triển 1cây/năm thì phương pháp nuôi cấy mô sẽ sản xuất được khoảng 4triệu cây/năm. Các loài lan Hài thường được nuôi cấy trên môi trường Murashige & Skoog 1962, Heller, Vacin & Went có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng như NAA, 2,4D, BA, TDZ, Kinetin trong điều kiện vô trùng hoàn toàn. Nhờ tiến bộ khoa học, ngày nay người ta có thể cấy nhiều bộ phận khác nhau của cây lanđể
12 hình thành các thể giống protocorm như đỉnh sinh trưởng hay chồi bên, cọng hoa, lá, đốt thân hoặc rễ [7]. 2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật Gottlieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức là người đầu tiên khởi xướng ý tưởng nuôi cấy mô– tế bào thực vật. Ông đưa giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách“ Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời”. Theo ông, mỗi tế bất kì của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triểnthành một cơ thể hoàn chỉnh [15].Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cảsinh vật đó. Khi gặp điều kiện thuận lợi, mỗi tế bào đều có thể phát triển thànhmộtcá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào và là cơ sở lý luận của phươngphápnuôi cấy mô tế bào thực vật [2]. 2.3.1. Sự phân hoá tế bào Sự sinh trưởng của tế bào gồm hai giai đoạn: Giai đoạn phân chia tế bàovà giai đoạn dãn của tế bào. Trong hai giai đoạn này tế bào chưa có những đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng . Sau đó các tế bào bắt đầu phân hoá thành các môchuyên hoá để đảm nhận các chức năng khác nhau, các tếbào trong giai đoạn này có đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng. Có thể nói rằng sự phân hoá tế bào là sựchuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá [11]. 2.3.2. Sự phản phân hoá tế bào Sự phản phân hoá tế bào là qua trình ngược lại với sự phân hoá tế bào. Cáctế bào đã phân hoá trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia của mình, trong những điều kiện thích hợp, chúng có thể quay lại đóng vai trò như các môphân sinh và có khả năng phân chia để tạo ra các tế bào mới [11]. 2.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.3.1. Vật liệu nuôi cấy Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bàothực vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô– tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơquan
13 hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá ), cáccấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm ), các cơ quan dự trữ (củ, thân, rễ ) [15]. Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau, trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi củamẫu, chất lượng cây lấy mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấymẫu,mục đích và khả năng nuôi cấy [15]. Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năng tiêudiệt vi sinh vật. Hoá chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảmbảo 2 điều kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối vớimẫu. Hiệu 1quả vô trùng tuỳ thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinhvật của hoá chất. Một số hoá chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaClO-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2- thuỷ ngân clorua, chất kháng sinh(gentamicin, ampixilin ) [15]. 2.3.3.2. Điều kiện nuôi cấy - Điều kiện vô trùng: Trongnuôi cấy mô– tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng gồm buồng cấy vô trùng, các dụngcụ cấy vô trùng và môi trường cấy vô trùng nhằm đảm bảo mẫu cấy sẽ không bị nhiễm vi sinh vật. Để tạo điều kiện vô trùng, buồng cấy phải dùng đèn tử ngoại chiếutrong 30 phút sau đó được lau sạch bằng cồn 90°, dụng cụ và môi trường nuôi cấy thường được khử trùng ở 121°C trong 25-30 phút. - Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về ánh sáng và nhiệt độ [15]. 2.3.4. Môi trường dinh dưỡng Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận, các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấy như duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [12].
14 Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồmcác thành phần chính sau: 2.3.4.1. Nguồn Cacbon Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không có khả năng tự dưỡng do không tiến hành quang hợp đầy đủ. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôicấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. CacbonNguồn cung cấp cho môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với hàm lượngtừ20- 30 g/l. Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như fructose, rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose, những loại đường này chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt [13]. 2.3.4.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng có trong môi trường nuôi cấy mô tếbào thực vật được sử dụng như là thành phần cơbản để tổng hợp chất hữu cơ [12]. Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suấtthẩm thấu và điện thế màng [14]. - Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S. - + + Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3 hoặc NH4 , hầu hết các loại thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên cácsảnphẩm hữu cơ. + Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường. + Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O + Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O + Magie: Sử dụng chủ yếu là MgSO4 + Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4 - Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni các nguyên tố vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối
15 với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô,tế bào nuôi cấy. 2.3.4.3. Vitamin Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không đủvề lượng nên cần bổ sung, nhất là nhóm vitamin B [15]. - Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid [15]. - Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất. - Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp [15]. - Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tốkhoáng, trao đổi hyđratcacbon [15]. 2.3.4.4. Các chất hữu cơ tự nhiên - Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin [15]. - Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid [15]. - Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B [15]. - Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh [15]. 2.3.4.5. Các thành phần khác - Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữucơ như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấpsố một chất dinh dưỡng cho tế bào, mô nuôi cấy [15]. - Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gâyứcchế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxyhoá khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic [15]. 2.3.4.6. pH của môi trường Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong
16 khoảng từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ [15]. 2.3.4.7. Các chất điều hoà sinh trưởng Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môitrường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật. Hiệu quả của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điềuhoà sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy [15]. Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấymô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng [15]. - Nhóm Auxin: Được phát hiệ lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch, Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chấtnày. Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảymầm, trong phấn hoa. Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng độngcủa thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất. Auxin gây ra hiện tượng ưuthế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụbì– nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì. Ngoài ra, auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá [15]. Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (các auxin tự nhiên). Hoạt tính bcuat các chất này được xếp theo thứu tự từ yếuđến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA, 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân huỷ trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy môi. NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễgây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tếbào và hình thành callus [6].
17 - Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách từ nộinhũcủa hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim. Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn. Trong thục vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh. Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đỏi chất. Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thànhchồi. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chếưu thế đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin. Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá [8]. Trong các chất thuộc nhómcytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp có khả năngkích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thể sửdụng TDZ, Diphenylurea [8]. - Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nâm bởi cácnhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Giberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Giberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi nuôi cấy.GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [8]. 2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước 2.4.1. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới Thông thường Paphiopedilum có thể được nhân giống bằng gieo trồng hạthay tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây mẹ. Tuy nhiên, các phương pháp này cho hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhu cầucủa thị trường. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tạo ra một lượng lớn cây con trong thời gian ngắn đã trở thành một giả pháp lý tưởng để bảo vệ lan Hài thoát khỏinguycơ tuyệt chủng.
18 Các nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy mô lan Hài được thực hiện bởi Bubeck năm 1973 [16]. Kể từ đó nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng nhân giống lan Hài bằng nhiều phương pháp nuôi cấy sử dụng các bộ phận khác nhau của cây. Một sốnghiên cứu đã thành công: Năm 1975, Stewart và cs tiến hành cảm ứng chồi bên để tạo ra mô sẹo, đôikhi có sự hình thành một vài cây con trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các mô sẹo rất khó tái sinh, sau một thời gian nuôi cấy những mô sẹo này sẽ chết. Vì lý do này, hầu hết các nghiên cứu về nuôi cấy mô Paphiopedilum đều sử dụng nguồn vật liệu ban đầu từ hạt [30]. Năm 1980, Nieman đã tiến hành nuôi cấy chồi bên và cây con và phương pháp này cũng được Sampolinski sử dụng cho nghiên cứu năm1983 [26]. Năm 1988, Huang đã tiến hành nuôi cấy kéo dài cây in vitro, sau đó cảm ứng tạo chồi từ chồi nách của câyinvtro được nuôi cấy kéo dài [20]. Năm 2000, Lin và cs đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo từ nguồn protocorm của hạt một loài lan Hài lai và đã thu được một vài câycon trong ống nghiệm [24]. Năm 2001, Huang đã tiến hành nhân nhanh hạt giống lan Hài lai giữa P. philippinese và P. susan trong môi trường MS bổ sung với BAP 13 mM [20]. Ở Ấn Độ Chyuam-Yih Ng và Norihan Mohd (2011), đã nghiên cứu nhân giống Paphiopedilum trong in vitro thông qua phương pháp hình thành các thể protocorm thứ cấp từ thể protocorm sơ cấp được phát triển từ callus có nguồn gốc từ thân. Cácthể protocorm được nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung các nồng độ BA và Kinetin khác nhau (1.0, 2.0, 3.0, và 4.0 μM) để cảm ứng các PLB thứ cấp. Số lượng PLB thứ cấp được hình thành nhiều nhất trên môi trường ½ MS có bổ sung 4.0 μM Kinetin, trung bình có 4.1 PLB được hình thành trên mỗi mẫu sau 8 tuần nuôi cấy.Các PLB thứ cấp được nhân lên từ 9,5-12,1 PLBs mới. Mỗi PLB thứ cấp sau khi được cấy chuyển trên môi trường ½ MS không có chất điều hòa sinh trưởng và được bổ sung60 g/l dịch chiết chuối. Các PLB thành thục này sẽ được nuôi cấy trên môi trường có chứa các chấthữu cơ khác nhau như nước dừa, dịch chiết chuối, khoai tây, cà chua để tái sinh hình thành cây con. Trong số các chất hữu cơ được thử nghiệm,việc bổ sung
19 20% CW trên môi trường ½MS có kết quảtỷ lệ tái sinh trunglà bình 67,9% PLBs, sau 8 tuầnnuôi cấy.Trong những năm gần đây,nhờ các thành tựu khoa học và sự phát triển về công nghệ sinh học được ứng dụng rộng rãi cùng với phương tiện giaothông phát triển mạnh mẽ, việc xuất, nhập khẩu hoa lan ngày càng tăng với quy môrộng lớn. Vì có giá trị kinh tế cao nên rất nhiều nước đãtập trung vào việc nghiên cứu hoa lan có chất lượng cao để phục vụ cho thị trường trong nước và xuất khẩu. Năm 2002 và1982, Chen và các cộng sự cũng báo cáo rằng có thể cảm ứngtạo chồi từ thân và lá của lan Hài P. philippinese khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4D 4,52 mM và TDZ 4,54 mM [17] [18]. 2.4.2. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trong nước Tại Việt Nam cũng đã có nhiều nhà khoa học tiến hành nuôi cấy mô lanHài nhằm nhân giống một số loài lan Hài quý hiếm góp phần bảo tồn loài lan Hàikhỏi nguy cơ tuyệt chủng như: Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan HàiP. hangianum perner Gurss (Hài Hằng). Kết quả nghiên cứu cho thấy, môi trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi là môi trường RE có bổ sung nước dừa 150ml/l và chuối chín 100g/l cho hệ số nhân cao nhất (4,3 lần). Bổ sungα- NAA 0,4 mg/l - 0,6mg/l vào môi trường cho khả năng ra rễ tốt nhất. Các kết quả thí nghiệm ngoài vườn ươm cho thấy, cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm cao 3- 4 cm, có từ 3 - 4 lá, 4 - 5 rễ [3]. Năm 2005, Dương Tấn Nhựt đã nghiên cứu thành công phương pháp nhân nhanh giống lan hàiP. delenatii bằng phương pháp sử dụng hạt nảyin mầm vitro. Từ cây con in vitro, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồ gốc từ hạt, được nuôi cấy trên môi trường có chứa 2,4D và TDZ với nồng độ cao, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua bước hình thành PLB. Một phần mô sẹo có thể tái sinh được 3 - 7 chồi trong 3 tháng và chúng có thể tồn tại trên môi trường nuôi cấy trong 3 năm mà kmất đi khả năng tái sinh. Ngoài ra, Dương Tấn Nhựt còn nghiên cứu thành công một phương pháp mới cho phép nhân nhanh giống lan P. delenatii là phương pháp gây vết thương trên phần gốc thân của
20 cây con in vitro. Phần gốc sau khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm TDZ, NAA, 2,4D sẽ hình thành mô sẹo và một số ít xuất hiện protocorm [27]. Năm 2011, Liao và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của câycon hoàn chỉnh từ nụ hoa của P. deperle và P. armeni. Tuy nhiên, cần rất nhiều thời gian để cho cây lan Hài ra hoa vì vậy phương pháp này kém hiệu quả hơn các phương pháp khác [22]. Ở Việt Nam, nhóm tác giả Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp đã có những nghiên về mặt thực vật học đối với lan Hài Việt Namthông qua những chuyến khảo sát thực tế. Trong cuốn sách “Lan Hài Việt Nam” nhóm tác giả đã giới thiệu khá đầy đủ và chi tiết các loài lan Hài có ở Việt Nam cùngcácđánh giá về thực trạng của các loài này [1].
21 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) trồng tại vườn cây của Khoa -CNSH CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên. - Vật liệu: từ quả hài Vân Nam. 3.1.2. Hoá chất sử dụng - Môi trường MS, đường sacharose, agar, than hoạt tính - Một số chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin (IBA, NAA, ), nhóm cytokinin (BA, ), nhóm gibberellin (GA3). 3.1.3. Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu Thiết bị Dụng cụ Cân phân tích Pank cấy Máy khuấy từ Dao kéo Máy đo PH Đèn cồn Lò vi sóng Cốc đong, ống đong Nồi hấp vô trùng Bình tam giác Hệ thống giàn đèn Chun nịt Box cấy vô trùng Giấy thấm Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thínghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm.
22 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam. 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu - Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật,Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên. 3.2.2. Thời gian nghiên cứu - Thời gian: từ 3/1/2020 đến 10/7/2020. 3.3. Nội dung nghiên cứu 3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam - Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam. - Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam. - Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam 3.3.2. Nội dung 2: Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Vân Nam. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô - Sử dụng môi trường MS, RE bổ sung Agar 5,5 g/l, Đường 30g/l, Nước dừa 150ml/l, Inositol 100mg/l, 0,5 g/l THT, pH: 5,6 - 5,8. - Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấycó hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm. - Môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,0 atm trong 20 phút
23 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng môi trường MS Nhân nhanh chồi ( môi trường nền có bổ sung BA,kinetin,TDZ ) Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh (Môi trường nền bổ sung lần lượt NAA và THT ) Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi từ phôi và ra rễ của cây lan hài Vân Nam 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm - Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Côngnghệ sinh học thực vật (Khoa CNSH-CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC ± 2, độ ẩm 60 – 65%, 14h sáng/10h tối, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux. Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu. 3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam. - Quả tái sinh từ phôi sẽ hình thành chồi được tách và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền, có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetin, TDZ) để theo dõi khả năng nhân quả của mẫu. - Theo dõi, quan sát số chồi, chất lượng chồi. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi từ phôi của cây lan hài Vân Nam. - Chồi tái sinh được tách và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền (Môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng,
24 vitamin là thành phần của môi trường MS bổ sung: Đường 30 g/l + Nước dừa 150 ml/l + Agar 5,5 g/l + Inositol 100mg/l + 0,5g/l THT , pH 5,6 – 5,8.), có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (BA) để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. - Theo dõi, quan sát số chồi, chất lượng chồi. Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + BA ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + BA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + BA 0,5 mg/l CT 3: MT nền + BA 1 mg/l CT 4: MT nền + BA 1,5mg/l CT 5: MT nền + BA 2 mg/l Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A (nồng độ BA thích hợp nhất cho quá trình tái sinh phôi ở thí nghiệm 3) + Kinetin ở các nồng độ khácnhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1(Đ/c): MT nền + A + Kinetin 0,0 mg/l CT 2: MT nền + A + Kinetin 0,5 mg/l CT 3: MT nền + A + Kinetin 1,0 mg/l CT 4: MT nền + A + Kinetin 1,5 mg/l CT 5: MT nền + A + Kinetin 2,0 mg/l Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam. Các chổi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A + B (nồng độ Kinetin thích
25 hợp nhất cho nhân nhanh chồi đã xác định ở thí nghiệm 4) + TDZởcác nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + A + B + TDZ 0,0 mg/l CT 2: MT nền + A + B + TDZ 0,5 mg/l CT 3: MT nền + A + B + TDZ 1,0 mg/l CT 4: MT nền + A + B + TDZ 1,5 mg/l CT 5: MT nền + A + B + TDZ 2,0 mg/l 3.4.3.2. Nội dung 2: Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Vân Nam. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của lan hài Vân Nam. - Chồi sinh trưởngt ốt và có từ 2 - 3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm: MT nền có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau để theo dõi khảnăng tạo rễ của mẫu. - Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0 mg/l NAA CT 2: MT nền + 0.3 mg/l NAA CT 3: MT nền + 0,5 mg/lNAA CT 4: MT nền + 1,0mg/l NAA CT 5: MT nền + 1,5 mg/l NAA Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đếnkhả năng ra rễ của cây lan hài Vân Nam. Chồi sinh trưởng và có lá từ 2 - 3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm : MT nền + C (nồng độ NAA thích hợp nhất cho ra rễ đã xác định ở thí nghiệm 6) + THT ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng ra rễ của mẫu. Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + C +0,0 g/l THT
26 CT 2: MT nền + C + 0,5 g/l THT CT 3: MT nền + C + 1,0 g/l THT CT4: MT nền + C + 1,5 g/l THT CT 5: MT nền + C + 2 g/l THT 3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 3.5.1. Thu thập số liệu - Đếm số mẫu sống không nhiễm, số mẫu sống nhiễm, số mẫu sống nhiễm. - Đếm số chồi: Đếm tổng sốhình chồi thành trên các mẫu cây ban đầuvà nhánh trên một mẫu nuôi cấy ban đầu. - Đếm số lượng rễ, độ dài của rễ. 3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi - Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu + Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm: Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%)= × 100 Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) + Tỷ lệ mẫu sống nhiễm: Tổng số mẫu sống bị nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) +Tỷ lệ mẫu chết: Tổng số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ mẫu chết (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Chỉ tiêu theo dõi chồi: Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Tổng chồi thu được Hệ số nhân chồi (lần) = × 100% Tổng chồi nuôi cấy
27 Chất lượng chồi: + Sinh trưởng tốt: Chồi mập, khỏe, xanh. + Sinh trưởng trung bình: Chồi mập, khỏe, xanh nhạt. + Sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, yếu, trắng vàng. - Chỉ tiêu theo dõi ra rễ: Tổng số chồi ra rễ (chồi) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = × 100% Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu) Tổng số rễ thu được Số rễ trung bình/chồi (rễ) = Tổng số mẫu cấy Chất lượng rễ: + Rễ tốt: Rễ khỏe, dài, có màu trắng. + Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn, có màu trắng hơi vàng. + Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ,màu vàng hoặc màu đen. 3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kêtoán học bằng phần mềm Microsoft office Excel 2010 và phần mềm IRRISTAT 5.0
28 Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năngnhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam. 4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) Số bình Số bình tái Hệ số nhân Công Nồng độ BA mẫu nuôi sinh nhanh chồi Chất lượng chồi thức (mg/l) cấy (bình) chồi(bình) (lần) Mới nhú, chiều 1 (Đ/c) 0,0 30 6 0,2 cao chồi thấp. 2 0,5 30 56 1,87 Xanh đậm, mập 3 1 30 20 0,67 Xanh, gầy,dài 4 1,5 30 45 1,5 Xanh nhạt, mập 5 2,0 30 21 0,7 Xanh, ngắn LSD05 0,24 CV% 8,5 Kết quả thí nghiêm được biểu thị qua biểu đồ 4.1: hệ số nhân nhanh chồi (lần) 2 1.87 1.8 1.6 1.5 1.4 1.2 1 hệ số nhân nhanh chồi (lần) 0.8 0.67 0.7 0.6 0.4 0.2 0.2 0 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy)
29 Kết quả bảng 4.1.1 và biểu đồ 4.1 cho ta thấy giá trị CV (%):8,5 % và LSD05 đạt 0,24 thì các công thức khác nhau có sựsai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Điều này cho thấy BA có sự ảnh hưởng tích cực tới khả năng tái sinhchồi lan Hài Vân Nam. Ở chỉ tiêu tỷ lệ tái sinh chồi: CT2 có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là 1,87 lần cho chất lượng chồi xanh đâm và mập (kết quả đem lại tốt nhất). Tiếp theo là CT4 đạt 1,5% chất lượng chồi thu được xanh nhạt, mập; CT3 đạt 0,67 lần chất lượng chồi thu được là xanh, gầy, dài; CT5 đạt 0,7 lần chất lượng chồi thu dược xanh, ngắn. Kết quả trên được giải thích như sau: BA là cytokinin có vai trò trong việc hoạt hóa quá trình phân bào, nhờ đó sẽ có tác dụng cảm ứng cho việc hìnhthành chồi và phân hóa chồi. Nồng độ BA 0,5 mg/l (CT2) cho nhiều chồi và có số chồi lớn nhất là do BA ở nồng độ này có tác dụng kích thích sự nhân nhanh chồi lan mạnh nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốtnhất. Ở CT3; CT4; CT5; nồng độ BA lần lượt là 1mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l cho tỷ lệ tái sinh có xu hướng giảm dần. Tác giả Dương Tấn Nhựt (2007) [31], Nồng độ BA thích hợp nhất cho tái sinh chồi của lan hài P. delenatii khi nuôi cấy trên môi trường MS là 2,0 mg/l, tỷ lệ tái sinh chồi là 75% sau 30 ngày nuôi cấy. So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với kết quả nghiên cứu của tácgiả trên thấy kết quả nghiên cứu của tôi hoàn toàn phù hợp. Điều này chứng tỏ BAcótác dụng tích cực trong việc nhân nhanh chồi lan Hài nói chung và kích thích nhân nhanh chồi lan Hài Vân Nam nói riêng. Vì vậy công thức bổ sung BA nồng độ 0,5mg/l vào môi trường nền được chọn để sử dụng trong nghiên cứu các thí nghiệm nhân nhanh tiếp theo BA kết hợp với Kinetin.
30 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (xanh gầy, ngắn) (xanh đậm, mập) (xanh gầy, ngắn) (xanh nhạt, mập) (xanh, gầy) Hình 4.1. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) CT1: 0 mg/l ; CT2: 0,5 mg/l BA; CT3: 1 mg/l BA; CT4: 1,5 mg/l BA; CT5: 2 mg/l BA. 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam BA có vai trò trong việc hoạt hóa quá trình phân bào, có tác dụng cảm ứngcho việc tạo thành chồi và phân hóa chồi vì vậy chúng có khả năng tăng hệ số nhânchồi trong nuôi cấy in vitro. Kinetin là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenin có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào, duy trì sự sống của mô, định hướng tế bào trong con đường phân hoá và tăng cường tổng hợp chất diệp lục ở lá cây. Do đó trong thí nghiệm này,tôi sử dụng nồng độ BA 0,5 mg/l thích hợp nhất trong quá trình tái sinh (công thức thích hợp nhất ở thí nghiệm trước kết hợp với kinetin ở các nồng độ để thử nghiệm khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam. Bảng 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam Nồng độ Nồng độ Số mẫu Tổng số chồi Công Hệ số nhân Chất BA Kinetin nuôi cấy thu được thức chồi (lần) lượng chồi (mg/l) (mg/l) (mẫu) (chồi) CT 1 0,0 30 47 1,87 Xanh đậm, mập CT 2 0,5 30 48 1,9 Xanh đậm, mập CT 3 1,0 30 57 1,96 Xanh đậm, mập 0,5 CT 4 1,5 30 67 2,23 Xanh đậm, mập CT 5 2,0 30 56 1,93 Xanh nhạt, mập LSD05 0,2 CV (%) 6,8
31 Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ 4.2: Hệ số nhân chồi (lần) 2.3 2.23 2.2 2.1 2 1.96 1.93 1.9 Hệ số nhân chồi (lần) 1.9 1.87 1.8 1.7 1.6 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 Biểu đồ 4.2. BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam Qua bảng 4.2 và biểu đồ 4.2 ta nhận thấy: Khi bổ sung thêm kinetin vào môi trường nuôi cấy thì kinetin có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài. Khi bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ từ 0,5 đến 2 mg/l thì hệ số nhân chồi dao động từ 1,87 lần đến1,93 lần, chất lượng chồi cũng tốt hơn so với khi không bổ sung. Trong thí nghiệm này nồng độ Kinetin 1,5 mg/l cho tổng số chồi thu được là67 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,23 lần, chồi thu được xanh đậm, mập. Tuy nhiên, nồng độ Kinetin từ 0,5; 1,0 mg/l thu được tổng số chồi vàhệ số nhân giảm với CT2, CT3, lần lượt là 47 chồi, 48 chồi, tương ứng vợi hệ số nhân là 1,9 ; 1,96 lần, chất lượng chồi xanh đậm, mập; nồng độ Kinetin 2 mg/l cho tổng số chồi thu được là57 chồi và hệ số là 1,93 chồi thu được xanh nhạt, mập. Kết quả thí nghiệm thu được được giải thích như sau: Ở CT đối chứng (CT1) do môi trường nuôi cấy không bổ sung Kinetin nên khả năng tạo chồi thấp hơn so với các công thức có bổ sung Kinetin. Ở CT2, CT3, Kinetin có nồng độ là0,5– 1,0 mg/l làm tăng hệ số nhân chồi nhưng không đáng kể, do nồng độ thấp nên các chồi mẫu hầu như không tiếp xúc với Kinetin trong môi trường nuôi cấy, vì vậy nên mẫu phân chia yếu nên chỉ tạo ít chồi mới. Khi nồng độ Kinetin đạt 1,5 mg/l (CT4), Kinetin
32 kích thích mẫu phân chia mạnh nhất nên số chồi mới sinh ra nhiều nhất. Ở CT5 tương ứng với nồng độ 2,0 mg/l Kinetin hệ số nhân chồi thấp hơn so với CT4. Nồngđộ Kinetin thích hợp sẽ kích thích chồi sinh trưởng, tuy nhiên khi nồng độ Kinetin tăng cao, vượt quá ngưỡng cần thiết có thể ức chế khả năng tạochồi. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh nhạt, gầy) Hình 4.2. Hình ảnh BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam CT1: 0,5 mg/l BA+ 0mg/l Kinetin ; 0,5 mg/l BA+ 0,5mg/l Kinetin CT3: 0,5 mg/l BA+ 1mg/l Kinetin; CT4: 0,5 mg/l BA+ 1,5mg/l Kinetin;CT5: 0,5 mg/l BA+ 2mg/l Kinetin. 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam TDZ là cytokinin ít bị phân huỷ bởi emzyme nội sinh so với các cytokinin khác, do đó nó có hoạt tính cao và có thể cho hệ số nhân chồi cao hơn các cytokinin khác. Vì vậy trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng nồng độ BA kết hợp với Kinetin thích hợp nhất trong quá trình nhân nhanh (công thức thích hợp nhất ởthí nghiệm trước) kết hợp với TDZ ở các nồng độ để nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Kinetin, TDZđến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam.
33 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) Tổng số Hệ số Nồng độNồng độ Số mẫu Công Nồng độ chồi thu nhân Chât lượng Kinetin TDZ nuôi cấy thức BA (mg/l) được chồi chồi (mg/l) (mg/l) (mẫu) (chồi) (lần) CT 1 0,0 30 65 2,17 Xanh đậm, mập CT 2 0,5 30 73 2,43 Xanh đậm, mập CT 3 0,5 1,5 1,0 30 85 2,83 Xanh đậm, mập CT 4 1,5 30 62 2,07 Xanh, bé CT 5 2,0 30 59 1,19 Xanh, bé LSD05 0,17 CV (%) 4,0 Kết quả thí nghiệm được biểu thị qua biểu đồ 4.3: Hệ số nhân chồi (lần) 3 2.83 2.43 2.5 2.17 2.07 2 1.5 1.19 Hệ số nhân chồi (lần) 1 0.5 0 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)
34 Từ kết quả bảng 4.3 và biểu đồ 4.3 ta nhận thấy: Ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 đạt 0,17 các công thức trong thí nghiệm có sự sai khác có ý so với công thức đối chứng ở mức độ tin cậy95%. Khi bổ sung BA 0,5 mg/l, Kinetin 1,5 mg/l và TDZ từ 0,0 - 2,0 mg/l vào môi trường nuôi cấycho thấy ảnh hưởng đến khả năng nhânchồi cây lan hài Vân Nam. Các công thức có bổ sung TDZ đều cho hệ số nhân chồi cao hơn công thức đối chứng không bổ sung TDZ (công thức đối chứng có hệ số nhân chồi đạt 2,17 lần). Khităng nồng độ TDZ từ 0,0 - 1,0 mg/l tổng số chồi thu được và hệ số nhân chồi có xu hướng tăng lên, ở công thức đối chứng TDZ nồng độ 0,5 mg/l cho tổng số chồi thu được là 73 chồi và hệ số nhân là 2,43lần. Trong thí nghiệm này, nồng độ TDZ 1,0mg/l cho tổng số chồi thu được là 85 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,83 lần. Tuy nhiên, nồng độ TDZ từ 1,5 - 2,0 mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm, ởCT4 tổng số chồi thu được là 62 chồi và hệ số nhân là 2,07 lần; CT5 tổng số chồithu được là 59 chồi và hệ số chồi là 1,19 lần. Chất lượng chồi: Với CT đối chứng (TDZ 0,0 mg/l) cho chất lượng chồi thu được xanh nhạt, mập. Khi tăng dần nồng độ TDZ từ0,5 - 1,0 mg/l thì chất lượng chồi xanh nhạt, mập lên chồi xanh đậm mập, trong khuôn khổ thí nghiệm này, CT bổ sung TDZ từ 0,5 - 1,0 mg/l cho chất lượng chồi tốt nhất. Tăng nồng độ TDZ từ 1,5 - 2,0 mg/l thì chất lượng chồi giảm xuống, chồi thu được xanh, bé. Kết quả thí nghiệm được giải thích như sau: TDZ là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kích thích tế bào phân chia hình thành chồi mới. Ở côngthức đối chứng không có TDZ trong môi trường nuôi cấy nên khả năng tạo chồi thấp hơn các công thức bổ sung TDZ. Ở CT2 với nồng độ TDZ 0,5 mg/l có tác dụng kích thích phát triển chồi mới nhưng do nồng độ TDZ thấp nên mẫu ít chịutác động kích thích phân chia tế bào của chất này. Ở CT3 cho hệ số nhân chồi cao nhất là do TDZ 1,0 mg/l kích thích mẫu sinh trưởng và phát triểntốt nhất, đồng thời tế bào phân chia mạnh mẽ nhất. Khi nồng độ TDZ tăng dần từ1,5– 2,0 mg/l ứng với CT4, CT5 cho thấy chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài hoặc bị biến dạng, nồng độ TDZ càng cao thì hệ số nhânchồi càng giảm dần.
35 Kết luận trong khuôn khổ thí nghiệm này, để nâng cao hệ số nhân chồi cần bổ sung BA 0,5 mg/l; Kinetin 1,5 mg/l, TDZ 1,0 mg/l sẽ thu được số chồi lớn nhất là 85 với hệ số nhân chồi là 2,83. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm , mập) ( xanh ,bé ) (xanh, bé) Hình 4.3. Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) CT1: 0,5 mg/l BA+ 0mg/l Kinetin + 0mg/lTDZ+ ; CT2 0,5 mg/l BA+ 0,5mg/l Kinetin + 0,5mg/lTDZ ; CT3: 0,5 mg/l BA+ 1mg/l Kinetin + 1mg/lTDZ; CT4: 0,5 mg/l BA+ 1,5mg/l Kinetin + 1,5mg/lTDZ;CT5: 0,5 mg/l BA+ 2mg/l Kinetin + 2mg/lTDZ 4.4. Kết quả nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Vân Nam. 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây lan hài Vân Nam Bộ rễ là cơ quan rất quan trọng đối với tất cả các loài thực vật. Trong nuôicấy mô, sau khi nhân chồi với số lượng lớn, giai đoạn tiếp theo là tạo cây hoàn chỉnhđể đưa ra ngoài vườn ươm. Khi một cây muốn chuyển ra tự nhiên thì có một bộ rễ khỏe mạnh, hoàn chỉnh giúp cây có khả năng hút nước và dinh dưỡng khoáng tốt, làm tiềnđề cho sự sinh trưởng và phát triển sau này. Vì vậy, giai đoạn kích thích tạo rễ của các chồi là giai đoạn quan trọng và không thể thiếu. Sau khi kếtc thú giai đoạn nhân nhanh tạo ra
36 số lượng chồi lan hài Vân Nam đồng nhất và khỏe mạnh, các chồi tạo thành đạt tiêu chuẩn sẽ được tách ra đưa vào mỗi trường kích thích rarễ. NAA là chất điều tiết sinh trưởng thực vật có tácdụng thúc đẩy sự phân bào và hình thành rễ nhánh, rễ lá. Với những ưu điểm như vậy, chúng tôi đã chọn NAA để thử nghiệm khả năng ra rễ của cây lan hài Vân Nam. Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) Nồng độ Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ Công Chất lượng NAA nuôi cấy ra rễ mẫu ra thức rễ (mg/l) (mẫu) (mẫu) rễ (%) CT1(Đ/c) 0,0 30 5 16,67 Ngắn, nhỏ, đen CT 2 0,3 30 26 86,67 Dài, mập, trắng CT 3 0,5 30 21 70 Ngắn, nhỏ,đen CT 4 1,0 30 18 60 Ngắn, nhỏ,đen CT 5 1,5 30 23 76,67 Ngắn, nhỏ,đen LSD05 2,92 CV(%) 8,2 Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ 4.4: Tỷ lệ mẫu ra rễ (%) 100 90 86.67 80 76.67 70 70 60 60 50 Tỷ lệ mẫu ra rễ (%) 40 30 20 16.67 10 0 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)
37 Từ bảng kết quả 4.4 và biểu đồ 4.4 cho ta thấy: giá trị CV (%) là 8,2 và LSD05 đạt2,92 ; các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tinNồng cậy95%. độ NAA có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành rễ đối với cây lanHàiP.callusum. Xét về tỷ lệ mẫu ra rễ thì CT2 chiếm tỷ lệ cao nhất 86,67%, tiếp theo CT5 đạt được 76,67%, CT3 đạt được 70%, CT4 60%. Xét về chất lượng rễ thì CT2 thu được rễ có chất lượng tốt:dài rễ , mập, có màu trắng. Kết quả trên được giả thích như sau: NAA là chất kich thích chồi tạo ra rễ.Công thức đối chứng 1 (CT1) chưa bổ sung NAA nên số mẫu ra rễ thấp, nhỏ. Nồng độ NAA 0,3 mg/l CT2 thì tỷ lệ chồi ra rễ cao nhất, khỏe nhất; đồng thời tạo điều kiện cây phát triển. Còn CT3, CT4, CT5 nồng độ NAA từ 0,5; 1,0; 1,5; chất lượng ra rễ thu được giảm dần, bởi vì nồng độ NAA cao có khả năng gây ức chế chồi rarễ,số lượng rễ hình thành cũng giảm, ngắn và nhỏ. Vì vậy, trong khuôn khổ thí nghiệm này để kích thích ra rễ cây lan hài Vân Nam cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy NAA 0,3 mg/l. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Ngắn, nhỏ, đen) (Dài, mập, trắng) (Ngắn, nhỏ, đen) (Ngắn, nhỏ, đen) (Ngắn, nhỏ) Hình 4.4. Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) CT1: 0 mg/l NAA; CT2: 0,3 mg/l NAA; CT3: 0,5 mg/l NAA; CT4: 1 mg/l NAA; CT5: 1,5 mg/l NAA.
38 4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng nhân nhanh cây lan hài Vân Nam Than hoạt tính là một hợp chất vô cơ thường được sử dụng trong giai đoạn rarễ trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Than hoạt tính có vai trò là tạo điềukiện“tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật. Ngoài ra, than hoạt tính còn có khả năng làm giảm hiện tượng thuỷ tinh thể ởmộtsố loài thực vật. Để số mẫu nuôi cấy có thể ra nhiều rễ với chất lượng rễ tốt, trongthí nghiệm này chúng tôi sử dụng nồng độ NAA 0,3 mg/l thích hợp nhất cho quá trình ra rễ kết hợp với than hoạt tính ở các hàm lượng khác nhau để thử nghiệm khảnăng ra rễ của cây lan hài Vân Nam. Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) Nồng độNồng độ Số mẫu Tỷ lệ Số rễ trung Công NAA THT nuôi cấy chồi ra bình trên Chất lượng rễ thức (mg/l) (g/l) (mẫu) rễ (rễ) chồi(rễ) CT 1 0,0 30 48 1,6 Ngắn, nhỏ CT 2 0,5 30 90 3 Dài mập 0,3 CT 3 1,0 30 79 2,63 Dài, mập CT 4 1,5 30 75 2,5 Ngắn,nhỏ CT 5 2,0 30 58 1,93 Ngắn,nhỏ LSD05 0,78 CV(%) 5,8 Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ4.5:
39 Số rễ trung bình trên chồi( chồi) 3.5 3 3 2.63 2.5 2.5 2 1.9 1.6 Số rễ trung bình trên chồi( chồi) 1.5 1 0.5 0 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) Từ bảng kết quả 4.7 và 4.5 cho thấy: Số rễ trung bình chồi trên rễ với giá trị LSD05 đạt 0,78; công thức khác trong thí nghiệm đều có sự sai khác nhau có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Các công thức có bổ sung than hoạt tính đều có tỷ lệ mẫu ra rễ cao hơn công thức đối chứng không bổsung than hoạt tính CT1. Ở CT2 với hàm lượng than hoạt tính 0,5g/l cho sốrễ trung nình chồi trên rễ cao nhất là90 chồi. Tăng dần hàm lượng than hoạt tính từ 1,0; 1,5; 2,0 tương ứng với CT3; CT4; CT5 có cho tỷ lệ mẫu rễ giảm dần. Ở chỉ tiêu chất lượng rễ: Các CT2, CT3 cho chất lượng rễ dài, mập.ỞCT1; CT4 và CT5 tương ứng với hàm lượng than hoạt tính 1,5 g/l; 2,0g/l cho rễ ngắn, và nhỏ. CT2 cho chất lượng ra tốt nhất là dài, mập. Kết quả trên được giả thích như sau: Ở CT1 chưa có than hoạt tính thì cho tỷlệ ra rễ ít nhất. Ở các công thức có bổ sung than hoạt tính, hàm lượng than hoạt tính tăng thì khả năng ra rễ cùa cây cũng tăng, số lượng rễ tăng. THT 0,5 g/l (CT2) ởhàm lượng này THT thúc đẩy cây ra rễ nhanh và mạnh nhất. Ở CT3, CT4, CT5 tạo điều kiện tối kích thích chồi ra rễ nhiều hơn CT1 (công thức Đ/c). Tuy nhiên khităng dần hàm lượng THT lên 1 g/l (CT3) ; 1,5 g/l (CT4) và 2,0 g/l (CT5) đồng thời THT ở hàm
40 lượng cao sẽ ngăn cản quá trình trao đổi chất của chồi nên cũng hạn chế sự hình thành rễ của chồi. Từ kết quả thí nghiệm cho thấy hàm lượng THT thích hợp nhất cho cây lanhài Vân Nam ra rễ là 0,5 g/l, khi đó tổng số rễ là 90 rễ và cho rễ dài, mập. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (ngắn , nhỏ) (dài, mập) (dài, mập) (ngắn, nhỏ) (ngắn , nhỏ) Hình 4.5. Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) CT1: 0,3 mg/l NAA +0g/lTHT; CT2: 0,3 mg/l NAA + 0,5g/lTHT; CT3: 0,3 mg/l NAA + 1g/lTHT; CT4: 0,3 mg/l NAA + 1,5g/lTHT; CT5: 0,3 mg/l NAA+ 2g/lTHT
41 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Trong khuôn khổ thí nghiệm chúng tôi đưa ra một số kết quả sau: - Hàm lượng BA tốt nhất cho sự phát sinh chồi lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) là: Môi trường MS + 0,5 mg/l BA ớiv tỷ lệ tái sinh chồi đạt%. 66,67 - Hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng tốt nhất cho giai đoạn nhân nhanh chồi lan hài VânNam là BA 0,5 mg/l + Kinetin 1,5 mg/l + TDZ 1,0 mg/l thu được hệ số nhân chồi đạt 2,23 lần. - Hàm lượng chất kích thích với than hoạt tính tốt nhất ở giai đoạn rarễlà NAA 0,3mg/l + nồng độ than hoạt tính 0,5g/l cho số rễ trung bình trên chồi tốt nhất là 3, tổng số chồi ra rễ 90 chồi. 5.2. Kiến nghị - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồilan hài Vân Nam. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng khác đến khảnăng nhân nhanh chồi Vân Nam. - Nghiên cứu điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, giá thể, độ ẩm) đến khả năng phát triển của lan hài Vân Nam.
42 TÀI LIỆU THAM KHẢ0 I. Tiếng Việt 1. Leonid Averyyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp (2004), Lan Hài Vệt Nam, Nxb Giao thông vận tải. 2. Trịnh Đình ĐạtCông nghệ sinh học tập– 4 Công nghệ di truyền( NXB giáo dục 2006) –,173 trang. 3. Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị ThuHà (2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan hài quý P. hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2010 - tập 8, số 2, tr. 194-201, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội. 4. Nguyễn Thu Hậu, Nguyễn Trí Minh, Đinh Văn Khiêm, Nguyễn ThịThanh Hằng, Cao Đình Hùng, Phan Xuân Nguyên, Nguyễn Đình Sĩ (2013), “Nghiên cứu nhân giống cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertond) in vitro”, Hội thảo Quốc tế Khoa học và Công nghệ phục vụ sản xuất Nông nghiệp Công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, Đà Lạt ngày 29 tháng 3 năm 2013, trang 239-245. 5. Lê Thị Huyên, Nguyễn Tiến Hiệp (2004), Hình thái và phân loại thực vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp Hà Nội. 6. Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu HàGiáo (2008), trình Công nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 7. Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ. 8. Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình các chất điều hoà sinh trưởng thục vật, Nxb Giáo dục Việt Nam. 9. Hoàng Thị Sản (2002), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục. 10. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2012), “Nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriatum Hook (Hoàng thảo long nhãn)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2012, tập 10(2), trang 263-271. 11. Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005),Giáo trình sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
43 12. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp. 13. Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở công nghệ sinh học – T3, Nxb Giáo dục. 14. Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, Nxb Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 8. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009), Công nghệ sinh học tập –2 Công nghệ sinh học tế bào, Nxb Giáo dục. 15. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2002), Công nghệ sinh học – T2, Nxb Giáo dục. II. Tài liệu tiếng anh 16. Bubeck S.K. (1973), A suty of Paphiopedilum meristem culture. Ph.D Thesis, Rutgers University Microfilm International, Ann Arbor, Mivhigan, The USA. 17. Chen T. Y., Chen J. T., Chang W. C. (2002), “Multiple shoot formation and plant regeneration from stem nodal explants of Paphiopedilum orchids”, In vitro Cell, Dev. Biol. Plant 38, p. 595-597. 18. Chen S. C., Liu. F. Y. (1982), “Notes on some species of Paphiopedilum from Yunnan”, Acta Bot, Yunnanica 4, p 163-167. 19. Huang L. C. (1988), “A procedure for asexual multiplication of Paphiopedilum in vtro, American Orchid Society Bulletin 57, p. 274-278. 20. Huang L. C., Lin C. J., Kou C. I., Huang B. L., Murashige T. (2001), “Paphiopedilum cloning in vitro”, Scientia Horticulturae 91, p. 111-121. 21. Kauth P. (2005), In vitro seed germination and seedling development of Calopogon tuberosus and Sacolia lanceolata var. lanceolata: Two Florida native terrestrial orchids, Master thesis, University of Florida. 22. Liao Y. J., Tsai Y. C., Sun Y. W., Lin R. S., Wu F. S. (2011), “In vitro shoot induction and plant regeneration from flower buds in Paphiopedilum orchids”, In vitro Cell, Dev. Biol. plant 47, p 702-709. 23. Lin Y. H., Chang C., Chang W. C. (2000), “Plant regeneration from callus culture of a Paphiopedilum hybrid”, Plant. Cell. Tiss. Org. Cult. Vol 62, pp. 21 – 25.
44 24. Liu ZJ, Liu KW, Chen LJ (2006), “Conservation ecology of endangered species Paphiopedilum armeniacum (Orchidaceae)”,Acta Ecol Sinica, Volume 26(9), pp. 2791–2800. 25. Nieman D. (1980), “Plantlet formation of Paphiopedilum flower stem”, American Orchid Society Bulletin 49, p. 372-373. 26. Nhut D. T, Thuy D. T. T., Luan V. Q., Don N. T., Khiem D. V., Tran Thanh Van K. (2005), “ Micropropagation of Paphiopedilum delenatii via stem node culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & Bio- System Engineering, p. 184-190. 27. Nhut D. T., Trang P. T. T., Vu N. H., Thuy D. T. T., Khiem D. V., Binh N. V., Tran Thanh Van K. (2005), “ A wounding method and liquid culture in Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental Plants 5(3), p.156-161. 28. Stewart J., Button J. (1975), “Tissue culture studies in Paphiopedilum”, American Orchid Society Bulletin 44, p. 591-599. III. www.vuonhoalan.net
PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Amount to Stock Final take Bottle Component Solution concentratic preparation (g/l) (mg/l) (ml) NH4NO3 82,5 1.650,0 I 20 KNO3 95 1.900,0 MgSO4.7H2O 37 370,0 MnSO4.4H2O 2,23 22,3 II 10 ZnSO4.7H2O 1,058 10,6 CuSO4.5H2O 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O 44 440,0 III KI 0,083 10 0,83 CoCl2.6H2O 0,0025 0,025 KH2PO4 17 170,0 IV H3BO4 0,62 10 6,2 Na2MoO4.2H2O 0,025 0,25 FeSO4.7H2O 2,784 27,85 V 10 Na2EDTA.2H2O 3,724 37,25 mg/100ml Nicotinic acid 100 0,5 0,5 Glycine 100 2,0 2,0 Vitamin Thiamine acid 100 0,1 0,1 Pyridocine HCl 100 0,5 0,5 Sucrose 30.0000,0 Agar 5.500,0 pH 5,6-5,8
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU Thí nghiệm1 : Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam. BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE TN3 21/ 6/20 22:15 :PAGE 1 Anh huong cua nong do BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam VARIATE V003 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 T 4 5.51829 1.37957 87.49 0.000 3 2 R 2 .585334E-02 .292667E-02 0.19 0.835 3 * RESIDUAL 8 .126147 .157684E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 5.65029 .403592 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN3 21/ 6/20 22:15 :PAGE 2 Anh huong cua nong do BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam MEANS FOR EFFECT T T NOS HSNC 1 3 0.200000 2 3 1.86667 3 3 0.666667 4 3 1.50000 5 3 0.703333 SE(N= 3) 0.724991E-01 5%LSD 8DF 0.236412 Anh huong cua nong do BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam MEANS FOR EFFECT R R NOS HSNC 1 5 0.996000 2 5 1.00600 3 5 0.960000 SE(N= 5) 0.561576E-01 5%LSD 8DF 0.183124 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN3 21/ 6/20 22:15 :PAGE 3 Anh huong cua nong do BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |T |R | (N= 15) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | HSNC 15 0.98733 0.63529 0.12557 8.5 0.0000 0.8347