›

Đồ án Thử nghiệm tận dụng bã vỏ chuối sản xuất bioethanol để tiếp tục thu nhận sản phẩm bằng phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF) với Saccharomyces cerevisiae và Pichia

pdf 75 trang thiennha21 13/04/2022 4210
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Thử nghiệm tận dụng bã vỏ chuối sản xuất bioethanol để tiếp tục thu nhận sản phẩm bằng phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF) với Saccharomyces cerevisiae và Pichia", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_thu_nghiem_tan_dung_ba_vo_chuoi_san_xuat_bioethanol_de.pdf

Nội dung text: Đồ án Thử nghiệm tận dụng bã vỏ chuối sản xuất bioethanol để tiếp tục thu nhận sản phẩm bằng phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF) với Saccharomyces cerevisiae và Pichia

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM TẬN DỤNG BÃ VỎ CHUỐI SẢN XUẤT BIOETHANOL ĐỂ TIẾP TỤC THU NHẬN SẢN PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI (SSF) VỚI Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. TRẦN THỊ TƯỞNG AN Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ ÁNH NGUYỆT MSSV: 1311101021 Lớp: 13DSH05 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN Là sinh viên năm cuối của trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nay đƣợc vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hoàn thành chƣơng trình học của mình. Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của Ths. Trần Thị Tƣởng An tiến hành tại Phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. Những số liệu, hình ảnh trong bài hoàn toàn trung thực chƣa từng đƣợc ai công bố. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Trần Thị Ánh Nguyệt
  3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho con gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cha mẹ, là ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, giáo dục và động viên, là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con, là ngƣời giúp con đứng vững sau những lần vấp ngã. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Trƣờng Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức quý giá ngay từ những ngày đầu tiên bƣớc chân vào giảng đƣờng đại học. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Trần Thị Tƣởng An đã trực tiếp hƣớng dẫn dìu dắt em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp vừa qua. Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời đã giới thiệu em với cô Trần Thị Tƣởng An để tiến hành làm đề tài. Em cũng xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Đình Quân đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. Cảm ơn các bạn Châu Nguyễn Quỳnh Nhƣ, Nguyễn Đăng Nguyên, Võ Mạnh Hùng, Văn Bảo Huy, Nguyễn Minh Thiện, Võ Thị Thảo Trang, Phạm Nhƣ Ngọc và anh Nguyễn Anh Duy đã cùng đồng hành, sát cánh và giúp đỡ mình trong suốt những ngày làm đồ án tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017 SVTH: Trần Thị Ánh Nguyệt
  4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu sơ lƣợc về Bioethanol 4 1.1.1. Khái niệm về Bioethanol 4 1.1.2. Sản xuất Bioethanol. 4 1.2. Nguyên liệu Lignocellulose 5 1.2.1. Cellulose 6 1.2.2. Hemicellulose 7 1.3. Qúa trình sản xuất Bioethanol từ lignocellulose 9 1.3.1. Quá trình tiền xử lý 10 1.3.2. Qúa trình thủy phân 12 1.3.3. Qúa trình lên men 15 1.4. Giới thiệu sơ lƣợc nguyên liệu vỏ chuối 22 1.4.1. Chuối 22 1.4.2. Thànhphần hóa học của chuối 22 1.4.3. Diện tích và sản lượng trồng chuối ở nước ta 23 1.5. Tình hình nguyên cứu bioethanol tại Việt Nam và trên thế giới 25 1.5.1. Tại Việt Nam 25 1.5.2. Trên thế giới 25 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Địa điểm, thời gian và đối tƣợng nghiên cứu 26 2.2. Nguyên vật liệu 26 i
  5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.1. Nguyên liệu vỏ chuối 26 2.2.2. Enzyme 26 2.2.3. Nấm men 26 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị 26 2.2.5. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng 28 2.3. Bố trí thí nghiệm 30 2.3.1. Sơ đồ quy trình 30 2.3.2. Bố trí thí nghiệm 31 2.4. Phƣơng pháp phân tích 33 2.4.1. Phương pháp hóa lý 33 2.4.2. Phƣơng pháp vi sinh. 40 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1. Kết quả khảo sát đặc điểm của chủng nấm men sử dụng trong đề tài 43 3.1.1. Saccharomyces cerevisiae 43 3.1.2. Pichia anomala 44 3.2. Phân tích thành phần vỏ chuối và bã nguyên liệu sau khi lên men lần 1 46 3.3. Quá trình thủy phân và lên men đồng thời 47 3.3.1. Khảo sátquá trình SSF lần 2 theo thời gian 47 3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme bổ sung 52 3.3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men bổ sung 55 3.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến quá trình lên men 58 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 4.1. Kết luận 61 4.2. Đề nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 1 ii
  6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT: Số thứ tự SHF: Separate Hydrolysis and Fermentation SSF: Simultaneous Saccharification Fermentation SSCF: Simultaneous Saccharification and Cofermentation Máy UV-VIS: Ultraviolet–visible spectroscopy HL: Hàm lƣợng SDA: Sabouraud Dextrose Agar SDB: Sabouraud Dextrose Broth iii
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sự tác động của các phƣơng pháp tiền xử lý khác nhau lên cấu trúc lignocellulose. 11 Bảng 1.2. Đặc điểm của các loại nấm men và vi khuẩn đƣợc xem xét để sản xuất ethanol từ nguyên liệu lignocellulose 19 Bảng 1.3. Diện tích gieo trồng chuối phân theo các vùng (Đơn vị: ha) 23 Bảng 1.4. Sản lƣợng trồng chuối phân theo các vùng (Đơn vị: tấn) 24 Bảng 1.5. Thành phần dinh dƣỡng của các loại chuối trong 100g chuối chín 24 Bảng 2.1.Hóa chất sử dụng 28 Bảng 3.1. Thành phần vỏ chuối khô trƣớc lên men và bã chuối sau lên men lần 1 . 46 Bảng 3.2.Tổng hợp kết quả nghiên cứu thu đƣợc theo thời gian 48 Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả nghiên cứu các tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau ở 48h 52 Bảng 3.4. Tổng hợp kết quả nghiên cứu các tỷ lệ nấm men bổ sung khác nhau ở 48h 55 Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả nghiên cứu các nồng độ pH khác nhau 58 iv
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Thành phần lignocellulose 5 Hình 1.2. Tỉ lệ các thành phần có trong lignocellulose 5 Hình 1.3. Cấu trúc của lignocellulose 6 Hình 1.4. Công thức hóa học của cellulose 7 Hình 1.5. Các đơn vị cơ bản của lignin 8 Hình 1.6. Quy trình chuyển hóa sinh khối lignocellulose thành bioethanol 9 Hình 1.7. Sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất và chuyển hóa phức hợp thành sản phẩm 13 Hình 1.8. Sơ đồ các bƣớc thủy phân cellulose bởi cellulase 15 Hình 1.9. Qúa trình đƣờng phân 16 Hình 1.10. Quá trình pyruvate chuyển hóa thành ethanol 17 Hình 1.11. S. cerevisiae và P. anomala 20 Hình 1.12. Quả chuối sứ 22 Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30 Hình 2.2. Mẫu sau khi đun bằng phƣơng pháp Miller 37 Hình 2.3. Mẫu sau khi đun bằng phƣơng pháp Kiursher – Hoff 38 Hình 2.4. Mẫu sau khi chuẩn độ acid 39 Hình 2.5. Nguyên liệu sau khi đƣợc trung hòa bằng NaOH 10N 40 Hình 2.6. S. cerevisiae và P.anomala đã đƣợc nhân giống trên môi trƣờng SDB 41 Hình 2.7. Cấy trang 42 Hình 3.1. Đặc điểm đại thể (a), vi thể (b) của S.cerevisiae 43 Hình 3.2. Đƣờng cong sinh trƣởng của S. cerevisiae (môitrƣờng SDB) 44 Hình 3.3. Đặc điểm đại thể (a) và vi thể (b) của P. anomala 45 Hình 3.4. Đƣờng cong sinh trƣởng của P. anomala (môi trƣờng SDB) 46 Hình 3.5. Vỏ chuối khô trƣớc lên men và bã chuối sau lên men lần 1 47 Hình 3.6. Sự biến đổi của HL đƣờng khửtheo thời gian 49 Hình 3.7. Sự biến đổi của HL cồn theo thời gian 49 v
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.8. Sự biến đổi của HLcellulose theo thời gian 50 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của thời gian đến sự phát triển tế bào 50 Hình 3.10. Sự biến đổi HL đƣờng khử phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung 53 Hình 3.11. Sự biến đổi HL cellulose phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung 53 Hình 3.12. Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung 54 Hình 3.13. Sự biến đổi HL đƣờng khử phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung 56 Hình 3.14. Sự biến đổi HL cellulose phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung 56 Hình 3.15. Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung 57 Hình 3.16. Sự biến đổi của HL đƣờng khử phụ thuộc vào các nồng độ pH khác nhau 58 Hình 3.17. Sự biến đổi của HL cellulose phụ thuộc vào các nồng độ pH khác nhau 59 Hình 3.18. Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào các nồng độ pH khác nhau 59 vi
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong bối cảnh hiện nay, thế giới đang đứng trƣớc nguy cơ khủng hoảng năng lƣợng trầm trọng do nguồn năng lƣợng hóa thạch có hạn trên trái đất đang dần đi đến cạn kiệt. Từ rất lâu dầu mỏ luôn giữ một vai trò quan trọng trong chiến lƣợc phát triển kinh tế của mỗi quốc gia, dầu mỏ và khí đốt hiện chiếm 68 – 80% nguồn năng lƣợng thế giới. Theo dự báo của các nhà khoa học trên thế giới nguồn năng lƣợng này sẽ bị cạn kiệt trong vòng 40 – 50 năm nữa[15]. Những nguồn năng lƣợng mới đã và đang dần đƣợc giới khoa học và con ngƣời quan tâm hơn, trong đó nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học có nguồn gốc từ sinh khối động, thực vật là một hƣớng đi có thể tạo ra nguồn nhiên liệu thay thế phần nào cho nguồn nhiên liệu hóa thạch đang cạn kiệt, đảm bảo đƣợc an ninh năng lƣợng cho từng quốc gia. Nhiên liệu sinh học là nhiên liệu có nguồn gốc từ sinh vật, thân thiện với môi trƣờng vì nguyên liệu để sản xuất nhiên liệu sinh học có hàm lƣợng lƣu huỳnh thấp, không chứa các chất độc hại và các hợp chất thơm, mặt khác khi thải nhiên liệu sinh học vào đất thì tốc độ phân hủy sinh học nhanh hơn gấp 4 lần so với nhiên liệu dầu mỏ[16]. Nhiên liệu sinh học ít gây hiệu ứng nhà kính, đặc biệt nhiên liệu này có khả năng tái sinh và gần nhƣ vô tận. Bioethanol đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp lên men và chƣng cất từ các loại ngũ cốc chứa tinh bột (bắp) và đƣờng (mía). Ngoài ra, ethanol có thể đƣợc sản xuất từ lignocellulose, từ những phụ phẩm có chứa hợp chất cellulose cao.Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế giới. Chính vì vậy, sản xuất ethanol từ biomass cụ thể là lignocellulose từ phế phẩm nông nghiệp là một giải pháp thích hợp trong bối cảnh giá nhiên liệu tăng cao, ô nhiễm môi trƣờng ngày càng trầm trọng và vấn đề an ninh lƣợng thực lại càng đƣợc chú ý và tiếp tục nghiên cứu hoàn thiên trên thế giới[2]. Hàng năm, sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam tạo ra một lƣợng lớn phế phẩm nông nghiệp, chủ yếu là lignocellulose từ các mùa vụ. Phế phụ phẩm nông nghiệp 1
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nhƣ rơm rạ, bã mía, vỏ cacao, vỏ chuối có tiềm năng năng lƣợng lớn, nhƣng việc sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp dƣới dạng nhiên liệu sinh học vẫn còn hạn chế và đây đƣợc coi là một hƣớng nghiên cứu mới và cần thiết tại Việt Nam. Vỏ chuối là nguồn phế phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose nên có thể sử dụng để lên men tạo bioethanol rất hiệu quả, tận dụng đƣợc nguồn vỏ phế phẩm. Hiện nay, lƣợng vỏ chuối phế thải sau khi bóc vỏ từ các nhà máy sản xuất các sản phẩm làm từ chuối, các khu chợ, quán xá và hộ gia đình đƣợc thải ra nhƣ rác. Đây là một trong những tác nhân gây hại cho môi trƣờng. Hoặc chỉ sử dụng một phần để làm thức ăn cho gia súc mang lại hiệu quả kinh tế không cao. Với tình hình phế phẩm vỏ chuối nhƣ vậy và qua nhiều công trình liên quan của tác giả đi trƣớc về bioethanol thì việc lên men vỏ chuối tạo thành rƣợu ethanol là rất có hiệu quả. Nhƣng mặt khác, sau quá trình lên men vỏ chuối chuyển hóa đƣờng thành ethanol nhƣ vậy, thì lƣợng đƣờng không chuyển hóa hết và còn sót lại rất cao. Để tiết kiệm đƣợc chi phí thì việc tái sử dụng lại nguồn bã nguyên liệu là rất cần thiết. Chính vì ý nghĩa thực tế trên, đề tài “Thử nghiệm tận dụng bã vỏ chuối sản xuất bioethanol để tiếp tục thu nhận sản phẩm bằng phƣơng pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF) với Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala” nhằm tìm ra khả năng tái sử dụng của bã cơ chất vỏ chuối để tiếp tục lên men bioethanol. 2. Mục đích nghiên cứu Mục đích của đề tài nhằm khảo sát khả năng thu nhận bioethanol bằng phƣơng pháp SSF sử dụng bã nguyên liệu vỏ chuối đã lên men trƣớc đó. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Tìm hiểu tổng quan tài liệu. - Khảo sát đặc điểm của S. cerevisiae và P. anomala. - Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ chuối và bã nguyên liệu lên men ethanol lần 1. - Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men bằng nấm men. 2
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 4. Kết quả đạt đƣợc của đề tài - Khảo sát đƣợc một số thành phần hóa học của vỏ chuối và bã nguyên liệu lên men lần 1: o Vỏ chuối khô: độ ẩm 7,5%, độ tro 9,4%, lignin 22,3%, hàm lƣợng đƣờng khử 142,6 mg/g, hàm lƣợng cellulose 367,8 mg/g. o Bã nguyên liệu lên men lần 1: độ ẩm 42,0%, lignin 0,15%, hàm lƣợng đƣờng khử 59,7 mg/g, hàm lƣợng cellulose 38,5 mg/g. - Các thông số lên men: o Thời gian lên men là 48h. o Xác định tỷ lệ giống nấm men bổ sung cho quá trình lên men là 5% (v/v) cho mỗi loại. o Xác định tỷ lệ enzyme bổ sung cho quá trình lên men là 0,5% (v/v). o Xác định nồng độ pH môi trƣờng ban đầu là 5,0. o Lƣợng ethanol thu đƣợc là 1,6%. - So với đề tài trƣớc (lên men lần 1) o Thời gian lên men: 72h o Tỷ lệ giống nấm men: 9% (v/v) o Tỷ lệ enzyme bổ sung: 0,7% (v/v) o pH môi trƣờng ban đầu là 5,5 o Lƣợng ethanol thu đƣợc là 2,75%  Khả năng tái sử dụng: vẫn sinh ra cồn từ bã cơ chất vỏ chuối.  Tiết kiệm về mặt chi phí, năng lƣợng, thời gian 3
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu sơ lƣợc về Bioethanol 1.1.1. Khái niệm về Bioethanol Ethanol theo phƣơng pháp sinh học (gọi tắt là Bioethanol) là ethanol thu đƣợc từ quá trình lên men vi sinh. Các loại nguyên liệu chứa đƣờng, tinh bột, hoặc cellulose đƣợc thủy phân thành đƣờng, sau đó đƣợc vi sinh vật sử dụng làm nguồn thức ăn để thực hiện lên men tạo ra ethanol và khí CO2. Bioethanol đƣợc sản xuất bằng nguồn nguyên liệu là sinh khối có từ sản phẩm và phế phẩm nông nghiệp, nguồn nguyên liệu có sẵn trong tự nhiên và có thể tái tạo. Với một nƣớc nông nghiệp lâu đời nhƣ Việt Nam thì đây là nguồn nguyên liệu rất đa dạng và phong phú. Vì vậy tổng hợp ethanol bằng con đƣờng sinh học là phƣơng pháp thích hợp để nâng cao hiệu quả kinh tế, tận dụng nguồn phế phẩm nông nghiệp và bảo vệ môi trƣờng. 1.1.2. Sản xuất Bioethanol. Bioethanol thế hệ thứ nhất Bioethanol thế hệ thứ nhất là bioethanol làm từ đƣờng, tinh bột bằng cách sử dụng công nghệ thông thƣờng. Các nguyên liệu cơ bản để sản xuất Bioethanol thế hệ đầu tiên thƣờng là hạt giống hoặc các loại ngũ cốc nhƣ lúa mì, tinh bột. Bioethanol thế hệ thứ hai Bioethanol thế hệ thứ hai đƣợc sản xuất bằng cách lên men thực vật không sử dụng cho các mục đích thực phẩm (không phải cây lƣơng thực) nhƣ cỏ jatropha, lục bình, hoặc phế phẩm nông nghiệp nhƣ rơm rạ, trấu, lá cây, bã mía. Bioethanol thế hệ thứ ba Bioethanol thế hệ thứ ba từ tảo (nƣớc ngọt và nƣớc biển), cây Jatropha curcas (cây cộc rào hay cây dầu mè), cỏ swichgrass, cây halophyte. 4
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2. Nguyên liệu Lignocellulose Lignocellulose là vật liệu phổ biến nhất trên trái đất. Trong tự nhiên, chúng ta có thể tìm thấy lignocellulose ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các chất thải rắn trong thành phố. Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào thực vật. Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin (hình 1.1). Hình 1.1. Thành phần lignocellulose Hình 1.2. Tỉ lệ các thành phần có trong lignocellulose 5
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Về cơ bản, trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và đƣợc bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lƣới nhƣ hemicellulose và kết dính nhƣ lignin[11]. Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và liên kết cộng hóa trị với nhau (hình 1.3). Các đƣờng nằm ở mạch nhánh nhƣ arabinose, galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thƣờng liên kết với lignin. Hình 1.3. Cấu trúc của lignocellulose Trong lignocellulose, các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản. Các sợi này đƣợc gắn lại với nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi với chiều rộng khoảng 25nm. Các vi sợi này đƣợc bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của enzyme cũng nhƣ các hóa chất trong quá trình thủy phân[9]. 1.2.1. Cellulose Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức (C6H10O5)n, là một polymer mạch thẳng của D-glucose, các D-glucose đƣợc liên kết với nhau bằng liên kết β 1-4 glucosid. Cellulose là loại polymer phổ biến nhất trên trái đất, độ trùng hợp đạt đƣợc 3.500 – 10.000 DP. Các nhóm OH ở hai đầu mạch có tính chất hoàn toàn khác nhau, cấu trúc hemiacetal tại C1 có tính khử, trong khi đó OH tại C4 có tính chất của rƣợu[1]. Các mạch cellulose đƣợc liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình. Trong 6
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP vùng kết tinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng nhƣ hóa chất. Ngƣợc lại trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt chẽ với nhau nên dễ bị tấn công[9]. Hình 1.4. Công thức hóa học của cellulose 1.2.2. Hemicellulose Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 – 200 DP. Hemicellulose chứa cả đƣờng 6 gồm glucose, mannose, galactose và đƣờng 5 gồm xylose, arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β-D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4)[9]. Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguồn nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung gồm: Mạch chính của hemicellulose đƣợc cấu tạo từ liên kết β-(1-4). Xylose là thành phần quan trọng nhất. Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3. Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thƣờng là disaccharide hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các nhóm polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân. 1.2.3. Lignin 7
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lignin là một phức hợp hóa học phổ biến đƣợc tìm thấy trong hệ mạch thực vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật. Lignin có cấu trúc không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình, chiếm 17% đến 33% thành phần của gỗ. Lignin không phải là carbohydrate nhƣng có liên kết chặt chẽ với nhóm này để tạo nên màng tế bào giúp thực vật cứng chắc và giòn, có chức năng vận chuyển nƣớc trong cơ thể thực vật (một phần là để làm bền thành tế bào và giữ cho cây không bị đổ, một phần là điều chỉnh dòng chảy của nƣớc), giúp cho cây phát triển và chống lại sự tấn công của côn trùng và mầm bệnh. Thực vật càng già, lƣợng lignin tích tụ càng lớn. Hơn nữa lignin đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon, tích lũy carbon khí quyển trong mô của thực vật thân gỗ lâu năm, là một trong các thành phần bị phân hủy lâu nhất của thực vật sau khi chết. Lignin là một loại polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose, rất khó để tách lignin ra hoàn toàn. Lignin là polymer, đƣợc cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình đƣợc đề nghị là: guaiacyl (G), chất gốc là rƣợu trans-coniferyl; syringly (S), chất gốc là rƣợu trans-sinapyl; p-hydroxylphenyl (H), chất gốc là rƣợu trans-p-courmary (hình 1.5). Hình 1.5. Các đơn vị cơ bản của lignin Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, độ tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ ngoài việc đƣợc phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và 8
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP cỏ, lignin có thể đƣợc phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicy-syringly lignin. Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl. Nghiên cứu chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trƣơng nở của sơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu đó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringly lignin[9]. Do sự liên kết chặt chẽ của lignin với mạng cellulose và hemicellulose nên yêu cầu cần một quá trình tiền xử lý ban đầu nhằm phá vỡ cấu trúc giữa lignin- cacbohydrate giải phóng cellulose, giúp cho quá trình thủy phân bằng enzyme hay acid diễn ra dễ dàng hơn. 1.3. Qúa trình sản xuất Bioethanol từ lignocellulose Có rất nhiều nguồn nguyên liệu để sản xuất bioethanol trong đó nguồn nguyên liệu lignocellulose là nguồn nguyên liệu phong phú để sản xuất bioethanol. Quy trình sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose đƣợc thể hiện qua hình 1.6. Hình 1.6. Quy trình chuyển hóa sinh khối lignocellulose thành bioethanol 9
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Qúa trình lên men ethanol từ các nguồn nguyên liệu lignocellulose cũng giống nhƣ từ tinh bột hay rỉ đƣờng. Bao gồm 4 bƣớc cơ bản: - Tiền xử lý nguyên liệu. - Thủy phân nguyên liệu. - Lên men. - Tinh chế sản phẩm (chƣng cất, tách nƣớc, bốc hơi, tách lỏng rắn) tùy thuộc vào nồng độ cồn mà ta dùng các phƣơng pháp tinh chế khác nhau. 1.3.1. Quá trình tiền xử lý Mục đích để làm tăng khả năng xâm nhập của enzyme vào cấu trúc nguyên liệu lignocellulose, làm giảm hàm lƣợng lignin, tăng diện tích bề mặt và mức độ cấu trúc vô định hình của nguyên liệu, tăng tốc độ thủy phân của enzyme vào cấu trúc cellulose và làm tăng hàm lƣợng đƣờng[14]. Yêu cầu của quá trình tiền xử lý: Các tiêu chuẩn để đánh giá quá trình tiền xử lý: - Giữ lại đƣợc các gốc đƣờng C5, C6 trong thành phần cellulose và hemicellulose. - Giảm thiểu đƣợc hàm lƣợng và sự biến chất của lignin trong nguyên liệu. - Sử dụng ít năng lƣợng. - Sử dụng các phƣơng pháp và tác nhân tiền xử lý giá thành thấp. Không có một phƣơng pháp tiền xử lý nào gọi là hoàn thiện, chúng đều tồn tại các nhƣợc điểm nhƣ: tạo ra các chất hóa học gây ức chế (acid, furan, phenol), tiêu tốn nhiều năng lƣợng hoặc kém hiệu quả trong phân riêng dung dịch đƣờng và bã rắn[13]. Điều kiện tiền xử lý xác định là yêu cầu cho từng loại nguyên liệu riêng.Vấn đề rất quan trọng đó là phải tối ƣu quá trình tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose bởi vì đây là một trong những giai đoạn tốn nhiều chi phí nhất trong quá trình chuyển hóa 10
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tạo thành ethanol. Ví dụ Mosier et al (2005) đã tính toán rằng quá trình tiền xử lý có chi phí ~30 UScent/gallon sản phẩm bioethanol[13]. Về cơ bản, phƣơng pháp tiền xử lý phải làm cho cellulose trở nên dễ bị enzyme thủy phân bằng cách phá vỡ cấu trúc kết tinh của nguyên liệu và để làm đƣợc điều này thì lớp lignin bao bọc cần phải đƣợc phá bỏ. Kỹ thuật tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose đƣợc chia thành 4 nhóm chính bao gồm vật lý, hóa học, hóa – lý và sinh học. Tiền xử lý vật lý làm tăng diện tích bề mặt bằng việc giảm kích thƣớc nguyên liệu. Tiền xử lý hóa học loại bỏ một phần hemicellulose và lignin, phá vỡ cấu trúc mạng lƣới lignin – hemicellulose. Tiền xử lý hóa – lý đòi hỏi điều kiện vận hành, kiểm soát cao bởi vì phản ứng xảy ra ở nhiệt độ và áp suất cao[12]. Tiền xử lý sinh học đƣợc sử dụng để loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocelluloses[7]. Bảng 1.1. Sự tác động của các phƣơng pháp tiền xử lý khác nhau lên cấu trúc lignocellulose. Nghiền Nổ hơi Acid Kiềm Oxy Nổ hơi nƣớc hóa CO2 Diện tích bề mặt H H H H H H Mức độ suy giảm cấu H - - - n.d - trúc vô định hình của cellulose Độ hòa tan hemicellulose - H H L - H Loại bỏ lignin - M M M M - Hợp chất ức chế sinh ra - H H L L - Sự thay đổi cấu trúc - H H H L - lignin H: tác động cao; M: tác động trung bình; L: tác động thấp; n.d: không xác định ( Nguồn: P. Alvira, 2010) 11
  21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.3.2. Qúa trình thủy phân Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicellulose sẽ bị thủy phân thành các đƣờng đơn (hexose và pentose). Ở đây, quan tâm nhiều đên sự thủy phân cellulose, do nó là thành phần chính trong sinh khối lignocellulos. Phƣơng trình phản ứng tổng quát (PT1): enzyme (C6H10O5)n + nH2O nC6H12O6 (PT1) Quá trình thủy phân cellulose đƣợc thực hiện bởi acid thủy phân hoặc enzyme thủy phân. 1.3.2.1. Cellulase a) Khái niệm Cellulase là một loại enzyme có thể đƣợc sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc sinh vật đơn bào, có khả năng thủy phân cellulose và cả hemicellulose. Ký hiệu là EC 3.2.1.4 b) Yêu cầu đối với cellulose Sự phát triển của quá trình chuyển hóa biomass – một nguồn nguyên liệu thô, ít giá trị, thành ethanol thông qua quá trình lên men đặt ra yêu cầu một số bƣớc đặt biệt là việc sản xuất enzyme cellulose cần phải đƣợc tối ƣu. Sản xuất cellulase quan trọng vì việc thủy phân cellulose có hiệu quả cần một lƣợng lớn enzyme cellulase (1kg cellulase cho 50 kg cellulose). Giá trị enzyme này khá cao từ 0,3 đến 0,81 dollar/gam[8]. Quá trình sản xuất cellulase gặp hai vấn đề chính: sự sinh trƣởng và phát triển chạm của nấm mốc và quá trình tách cellulase ra khỏi nấm mốc tốn rất nhiều thời gian. Để quá trình sản xuất ethanol có thể đƣợc xây dựng với quy mô lớn, vấn đề đƣợc đặt ra là hoạt tính của enzyme cellulase phải cao hơn enzyme đang đƣợc sản xuất từ nấm mốc. Hiện nay, yêu cầu cụ thể đặt ra với enzyme là cellulase phải có giá thành rẻ, hoạt tính đặt hiệu cao, độ ổn định cao, chịu đƣợc pH và nhiệt độ. 12
  22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.3.2.2. Cơ chế xúc tác enzyme Cơ chế xúc tác enzyme ( PT2) thƣờng trải qua 3 giai đoạn (hình 1.7): E + S ES P + E (PT2) Trong đó: E là enzyme ES là phức hợp enzyme – cơ chất P là sản phẩm - Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lƣợng hoạt hóa thấp. - Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng. - Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme đƣợc giải phóng dƣới dạng tự do. Các loại liên kết chủ yếu đƣợc tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là tƣơng tác tĩnh điện, liên kết hydro và liên kết Van der Waals. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hƣởng khác nhau khi có nƣớc. Hình 1.7. Sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất và chuyển hóa phức hợp thành sản phẩm 13
  23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.3.2.3. Phản ứng thủy phân cellulose Mặc dù phổ biến trên trái đất, cellulose lại rất bền vững và khó bị phá vỡ vì cellulose có độ kết tinh cao, không tan trong nƣớc, có khả năng chống lại các quá trình depolymer hóa. Quá trình thủy phân tạo thành glucose đƣợc thực hiện nhờ sự tác dụng hiệp đồng của 3 enzyme khác nhau (hình1.8): “β-D-glucosidase” hay còn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) có tác dụng tạo thành D-glucose từ celobiose là cellodextrin, cũng nhƣ các oligomer của glucose. “Endo-1,4,β-D-glucanases” (EG) hay 1,4-β-D-glucanohydrolases (EC 3.2.1.4), enzyme này sẽ tấn công ngẫu nhiên vào các cơ chất 1,4-β-glucan cả tan và không tan. “Exo-1,4-β-D-glucanases”(EG) hay 1,4-β-D-glucan glucohydrolase (EC 3.2.1.74), enzyme này có tác dụng giải phóng D – glucose từ 1,4-β-D-glucan và thủy phân chậm D-cellobiose; ngoài ra còn có enzyme 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)(CBH), enzyme này có giải phóng cellobiose từ 1,4-β-glucan. Nhóm enzyme endo và exo thƣờng đƣợc gọi là enzyme cellulose, còn β- glucosidase do có cấu trúc khác và cơ chế khác nên đƣợc tách thành nhóm riêng. 1.3.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ quá trình thủy phân Tốc độ quá trình thủy phân cellulose bằng cellulase chịu tác động của một số các yếu tố.Năm 2002, Lyn và cộng sự đƣa ra kết luận nhƣ sau:  Tỉ lệ kết tinh: đây là yếu tố chính ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân. Các mạch cellulose có tính kết tinh cao, các sợi cellulose liên kết rất chặt chẽ. Do đó sẽ cản trở quá trình tiếp xúc của enzyme với các mạch cellulose bên trong và làm giảm tốc độ quá trình thủy phân. 14
  24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Mức độ polymer hóa: mạch cellulose càng dài, tốc độ thủy phân càng chậm (Walker và cộng sự, 1990).  Kích thƣớc lỗ xốp: kích thƣớc của lỗ xốp phải đủ lớn cho các enzyme đi vào. Kích thƣớc lỗ xốp càng lớn quá trình thủy phân càng nhanh.  Bề mặt tiếp xúc: hầu hết các chuỗi cellulose bị giấu trong các vi sợi – yếu tố cản trở sự xâm nhập của enzyme và giới hạn tốc độ thủy phân. Bề mặt tiếp xúc càng lớn thì càng thuận lợi cho quá trình thủy phân. Hình 1.8. Sơ đồ các bƣớc thủy phân cellulose bởi cellulase 1.3.3. Qúa trình lên men Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử diễn ra trong cơ thể sinh vật dƣới tác động của hệ thống enzyme là quá trình oxy hóa sinh học. Trong quá trình đó, các nguyên tử cacbon của cơ chất bị oxy hóa đến CO2 còn các nguyên tử hydro tách ra khỏi cơ chất, đầu tiên đƣợc chuyển đến NAD+, sau đó từ NADH2 trong điều kiện yếm khí, hydro có thể chuyển đến các sản phẩm trung gian khác 15
  25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nhau hoặc để tái sinh NAD+. Chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ[3]. Sự tạo thành rƣợu glucose phải qua nhiều giai đoạn (hình 1.9 và hình 1.10): Hình 1.9. Qúa trình đƣờng phân 16
  26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.10. Quá trình pyruvate chuyển hóa thành ethanol Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men bao gồm: nhiệt độ, pH, nồng độ của dịch lên men, thời gian, nồng độ CO2 trong môi trƣờng, thành phần các chất dinh dƣỡng của môi trƣờng lên men, hàm lƣợng giống nấm men. 1.3.3.1. Một số loại nấm men thường được sử dụng trong lên men sản xuất bioethanol Có rất nhiều loại vi sinh vật khác nhau bao gồm nấm men, vi khuẩn và nấm sợi có thể lên men đƣờng từ quá trình thủy phân nguyên liệu lignocellulose thành ethanol. Trong đó, vi khuẩn E.coli, Zymomonas mobilis và nấm men S. cerevisiae, P. stipites là phù hợp nhất cho quá trình lên men đƣờng thành ethanol. Các loại nấm men và vi khuẩn này có những đặc điểm đặc trƣng khác nhau, nên có những tác động thuận lợi và bất lợi đến quá trình sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu lignocellulose và đƣợc trình bày trong bảng 1.2. Nấm men dùng để tiến hành lên men đƣờng tạo thành ethanol. Lignocellulose đƣợc cấu tạo từ đƣờng 5 và đƣờng 6. Nấm men thích hợp cho quá trình lên men cần có một số tính chất sau: - Hiệu suất lên men cao - Chịu đƣợc ethanol - Chịu đƣợc các sản phẩm phụ của quá trình thủy phân - Lên men ở pH thấp - Có thể tiêu thụ nhiều cơ chất khác nhau 17
  27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP a) Sacchromyces cerevisiae Phân loại khoa học (theo Feldman, Horst 2010) - Giới: Nấm - Ngành: Saccharomycetes - Bộ: Saccharomycetales - Họ: Saccharomycetaceae - Chi: Saccharomyces - Loài: S. cerevisiae Đặc điểm hình thái và sinh trƣởng S. cerevisiae có dạng hình ovan hay hình trứng, có kích thƣớc nhỏ, từ 5-6 đến 10-14µm, sinh sản bằng cách nảy chồi hay tạo bào tử (hình 1.11). Nguồn dinh dƣỡng của chúng là sử dụng đƣờng glucose, sacchrose, maltose nhƣ nguồn carbon, chúng sử dụng acid amin và muối amon nhƣ nguồn nitơ. S. cerevisiae phát triển tốt ở nhiệt độ 28 - 30ºC, độ pH tối ƣu của môi trƣờng là 4,5 – 5,5. b) Pichia anomala Phân loại khoa học - Giới: Nấm - Ngành: Ascomycota - Lớp: Saccharomycetes - Bộ: Saccharomycetales - Họ: Saccharomycetaceae - Chi: Pichia Đặc điểm hình thái và sinh sản Nấm men Pichia anomala có dạng hình elip dài, đầu tròn (hình 1.11). Chúng tồn tại ở dạng đơn lẻ, theo cặp hay nhóm nhỏ. Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi, kích thƣớc chồi từ 1,9 – 4,1 × 2,1 – 6,1µm. 18
  28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP P. anomala lên men đƣờng glucose, sucrose, galactose, maltose. Ngoài ra, P. anomala đồng hóa đƣợc cellobiose, xylose làm nguồn carbon. P. anomala có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 13 – 37ºC, pH từ 3,5–7. Bảng 1.2. Đặc điểm của các loại nấm men và vi khuẩn đƣợc xem xét để sản xuất ethanol từ nguyên liệu lignocellulose Đặc điểm E. coli Z. mobilis S. cerevisiae P. stipitis Lên men D-glucose + + + + Lên men D-galactose và D- + - + + mannose Lên men pentose (D-xylose và L- + - - + arabionose) Lên men kị khí + + + - Hình thành sản phẩm hỗn hợp + w w W Nồng độ ethanol cao (từ đƣờng - + + W glucose) Khả năng chịu đựng ethanol w w + W Khả năng chịu đựng chất ức chế w w + W dẫn xuất từ lignocelluloses Khả năng hoạt động pH có tính - - + W acid + Tích cực, - Tiêu cực, w Yếu 19
  29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (a) S. cerevisiae (b) P. anomala Hình 1.11. S. cerevisiae và P. anomala 1.3.3.2. Một số phương pháp lên men Phƣơng pháp truyền thống – thủy phân và lên men riêng rẽ (Separate hydrolysis and fermentation - SHF): Nguyên tắc: là một quá trình gồm hai pha tách biệt, thủy phân nguyên liệu và lên men glucose tạo thành ethanol. Ƣu điểm: Cả hai quá trình thủy phân và lên men đƣợc thực hiện trong điều kiện tối ƣu của mỗi quá trình, không phụ thuộc vào nhau. Nhƣợc điểm: - Tốc độ đƣờng hóa bị ảnh hƣởng mạnh bởi sự ức chế sản phẩm cuối đối với enzyme. - Sự tích tụ các chất ức chế cản trở hoạt động của enzyme thủy phân cellulose và glucose. Điều này làm cho quá trình biến đổi kém hiệu quả và gây tốn kém (phải bổ sung một lƣợng lớn enzyme). - Dễ nhiễm các vi sinh vật khác do thời gian ủ dài ở quá trình thủy phân. Phƣơng pháp thủy phân và lên men đồng thời (Simultancous saccharification and fermentation - SSF): 20
  30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đây là phƣơng pháp tiến hành quá trình thủy phân và lên men trong cùng một thiết bị phản ứng sinh học. Lƣợng đƣờng tạo ra khi thủy phân đƣợc chuyển hóa liên tục nhờ khả năng lên men của nấm men, làm giảm các chất ức chế quá trình thủy phân cellulose. Ƣu điểm: - Giảm lƣợng enzyme cho vào - Tăng tỷ lệ thủy phân và giảm ức chế ngƣợc khi sản phẩm tạo thành. - Cho hiệu suất ethanol cao - Điều kiện vô trùng thấp - Thời gian lên men ngắn. Nhƣợc điểm: - Nhiệt độ tối ƣu cho enzyme thủy phân và nấm men chuyển hóa đƣờng thành ethanol hoàn toàn khác nhau. - Cần lựa chọn điều kiện nhiệt độ và pH gắn với điều kiện tối ƣu của mỗi quá trình riêng. - Ethanol tạo thành sẽ quay lại ức chế enzyme làm cho lƣợng ethanol thu đƣợc không cao. Do đó, việc nghiên cứu giống vi sinh vật chịu nhiệt, chịu nồng độ ethanol cao là cần thiết. Phƣơng pháp thủy phân và lên men đồng thời kết hợp các giống vi sinh vật (Simultancous saccharification and cofermentation - SSCF) Nguyên tắc: là quá trình lên men kết hợp với các giống vi sinh vật diễn ra đồng thời với quá trình đƣờng hóa cơ chất. Ƣu điểm: 21
  31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sản phẩm hemicellulose sau khi tiền xử lý không cần tách khỏi thành phần sợi cellulose. Nhƣợc điểm: Nhiệt độ của quá trình thủy phân enzyme và lên men ethanol khác nhau đáng kể, làm cho việc tối ƣu hóa đồng thời hai hoạt động rất khó. 1.4. Giới thiệu sơ lƣợc nguyên liệu vỏ chuối 1.4.1. Chuối Họ chuối: Musa troglodytarum Phân loại khoa học - Giới: Plantae - Ngành: Magno l iophyta - Lớp: Liiiopsida - Phân lớp: Zingiberiadae - Bộ: Zingiberales - Họ: Musaceae - Chi: chuối sứ Hình 1.12. Quả chuối sứ Chuối có tên khoa học là Musa paradisiaca L., thuộc họ Musaceae, gồm rất nhiều giống chuối (ƣớc tính có khoảng 300 giống chuối hiện đƣợc trồng trên thế giới). Chuối là cây trồng nhiệt đới, yêu cầu ánh sáng mạnh và nhiệt độ cao để hoàn thành các giai đoạn sinh trƣởng và phát triển. 1.4.2. Thànhphần hóa học của chuối Theo Nguyễn Thị Ngọc Ẩn (1999) thành phần hóa học chính của chuối gồm: o Độ ẩm: 80,36% 22
  32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP o Glucid thô: 14,315% o Lipit thô: 0,25% o Protid thô: 4,23% o Xơ thô: 0,37% o Vitamin C: 122,80 mg/g o K: 340 mg/g o Ca: 6,49 mg/g 1.4.3. Diện tích và sản lượng trồng chuối ở nước ta Ở nƣớc ta chuối là một loại trái cây có sản lƣợng cao. Tuy nhiên, diện tích trồng chuối không tập trung (bảng 1.3). Là loại cây ngắn ngày, nhiều công dụng, ít tốn diện tích và công chăm sóc nên chuối đƣợc trồng nhiều ở trong các vƣờn cây ăn trái và hộ gia đình. Bảng 1.3. Diện tích gieo trồng chuối phân theo các vùng (Đơn vị: ha) Năm STT Tỉnh/ thành phố 2001 2002 2003 2004 2005 Cả nƣớc 101300 96300 99340 102091 103400 Đồng Bằng Sông 1 17900 18100 17546 17407 16400 Hồng 2 Đông Bắc Bộ 8900 6300 9021 8849 8700 3 Tây Bắc Bộ 2300 2200 2376 2668 2600 4 Bắc Trung Bộ 15400 15500 15867 16029 16400 Duyên Hải Nam Trung 5 10200 10500 10642 10713 11400 Bộ 6 Tây Nguyên 2900 3400 3496 3630 3700 7 Đông Nam Bộ 12100 12300 12689 12653 12800 Đồng Bằng Sông Cửu 8 31600 27700 27706 30142 31300 Long (Nguồn: Tổng cục thống kê, 2001 – 2005) 23
  33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 1.4. Sản lƣợng trồng chuối phân theo các vùng (Đơn vị: tấn) STT Tỉnh/Thành phố Năm 2001 2002 2003 2004 2005 Cả nƣớc 1080400 1097700 1281805 1353811 1354300 Miền Bắc 555500 531600 656987 687055 641500 1 Đồng Bằng Sông 359500 347700 426161 352181 403500 Hồng 2 Đông Bắc Bộ 95900 65200 100575 98517 96600 3 Tây Bắc Bộ 19300 25400 27285 30691 30600 4 Bắc Trung Bộ 80800 98300 102966 205666 110800 Miền Nam 524900 566100 624818 666746 172800 5 Duyên Hải Nam 66000 103500 99636 99504 111800 Trung Bộ 6 Tây Nguyên 33900 41400 44262 53027 58300 7 Đông Nam Bộ 114800 146400 150717 162596 175800 8 Đồng Bằng Sông 310200 274800 330203 351629 366900 Cửu Long (Nguồn: Tổng cục thống kê, 2001 – 2005) Bảng 1.5. Thành phần dinh dƣỡng của các loại chuối trong 100g chuối chín Thành phần dinh dƣỡng Chuối xanh Chuối Tây Chuối Tiêu Nƣớc (g) 80,2 83,2 74,4 Năng lƣợng (Kcal) 74 56 97 Protein (g) 1,2 0,9 1,5 Lipid (g) 0,5 0,3 0,2 Glucid (g) 16,4 12,4 22,2 Celluloza (g) 1,0 2,6 0,8 Tro (g) 0,8 0,8 0,9 24
  34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5. Tình hình nguyên cứu bioethanol tại Việt Nam và trên thế giới 1.5.1. Tại Việt Nam - Năm 2009, Nguyễn Thị Hằng Nga, với đề tài “Nghiên cứu khả năng sản xuất ethanol sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp” thu đƣợc hàm lƣợng ethanol từ 1,9 – 4,2% v/v trên đối tƣợng là thân cây ngô[4]. - Năm 2013, Võ Thị Thanh Kiều, đã nghiên cứu sản xuất bioethanol từ rong biển thu đƣợc 20,92 g/l cồn với hiệu suất quá trình đạt 90%[5]. 1.5.2. Trên thế giới - Năm 2011, Đại học Kansas, bằng phƣơng pháp lên men SSF trên đối tƣợng là vỏ chuối sấy khô đã thu đƣợc cồn có nồng độ 28,2 g/l. - Năm 2011, Ahmed S. A et al, bằng phƣơng pháp lên men SHF trên đối tƣợng phế phẩm chuối thu đƣợc ethanol từ 4,1 – 7,1%. - Năm 2013, Itelima et al, bằng phƣơng pháp lên men SSF trên đối tƣợng là vỏ chuối thu đƣợc 4% (w/v) ethanol. - Năm 2013, Rakesh Koppram et al, bằng phƣơng pháp lên men SSCF trên đối tƣợng là lõi ngô thu đƣợc 4% (w/v) ethanol. - Năm 2013, Ibrahim Nasser Ahmed et al, bằng phƣơng pháp lên men SSF trên đối tƣợng vỏ cây Melaleuca leucadendron (tràm lá dài) thu đƣợc nồng độ ethanol từ 43,7 – 63,2 g/l. - Năm 2014, Theo tạp chí The 10th Young Scientist Seminar, Yamaguchi University, Japan, đã nghiên cứu sản xuất ethanol từ vỏ ca cao thu đƣợc 5,15% (w/v) ethanol. - Năm 2014, Masahide Yasuda et al, bằng phƣơng pháp lên men SSCF trên đối tƣợng cỏ Napie đã thu đƣợc hiệu suất ethanol là 74%. - Năm 2015, S. Das et al, bằng phƣơng pháp lên men SSF trên đối tƣợng lục bình thu đƣợc nồng độ ethanol từ 6,76 – 10,4 g/l. 25
  35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm, thời gian và đối tƣợng nghiên cứu Đồ án đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 20/4/2017 đến 16/7/2017. Đối tƣợng nghiên cứu: thu nhận bioethanol bằng phƣơng pháp SSF sử dụng bã nguyên liệu vỏ chuối đã lên men trƣớc đó. 2.2. Nguyên vật liệu 2.2.1. Nguyên liệu vỏ chuối Vỏ chuối sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc thu gom trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh. 2.2.2. Enzyme Viscozyme Cassava C - Đƣợc cung cấp bởi Novozymes A/S (Đan Mạch) - Màu: Nâu - Thể vật lý: Lỏng - Là enzyme chuyên dùng để thủy phân các loại nguyên liệu lignocellulose. 2.2.3. Nấm men Quy trình lên men sử dụng đồng thời hai loại nấm men là: Saccharomyces cerevisiae (từ bộ sƣu tập giống ATCC, Hoa Kỳ) và Pichia anomala (từ bộ sƣu tập giống VTCC, Việt Nam). Mật độ tế bào nấm men đạt 109 cfu/ml. 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị Tất cả các thiết bị sử dụng đƣợc đặt tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. 26
  36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP a) Dụng cụ - Ống nghiệm - Đĩa Petri - Erlen 50ml, 100ml, 250ml - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml - Micropipet 200, 1000 - Burette - Đầu típ - Đũa thủy tinh - Bao hấp, giấy gói, thun - Đèn cồn, que cấy vòng, que cấy trang - Bông không thấm, bông thấm - Ống ly tâm - Chai thủy tinh - Bình định mức 100ml b) Thiết bị - Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2. - Tủ lạnh - Cân điện tử TE 612 của hãng Sartorius, Đức. - Cân phân tích PA 214 của hãng Ohaus, Mỹ. - Bếp khuấy từ gia nhiệt C-MAG HS 7 của hãng IKA, Đức. - Máy nƣớc cất - Máy hấp tiệt trùng tự động của hãng ALP, Nhật Bản. - Máy ly tâm lạnh Z32HK của hãng Hermle, Đức. - Máy đo quang phổ UV-VIS-NIR V770 của hãng Jasco, Nhật Bản. - Máy lắc ngang HY-4A, Trung Quốc. - Máy đo độ Ph Schott Lab850 của hãng SI Analytics, Đức. - Kính hiển vi điện tử MT4200H của hãng Meiji, Nhật Bản. - Brix kế, cồn kế HN101-1A, Trung Quốc. 27
  37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Tủ sấy HN101-1A, Trung Quốc. - Tủ ủ của hãng Memmert, Đức. - Lò nung nhiệt độ cao của hãng Nabertherm, Đức. - Hệ thống bơm hút chân không Gast, Mỹ. - Thiết bị đo độ bền oxy hóa ( UV-Vis Cary 60) 2.2.5. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng a) Hóa chất Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng STT Tên hóa chất Xuất xứ Mục đích sử dụng (nguồn gốc) 1 Acid acetic Trung Quốc Tiền xử lý 2 Nƣớc cất Sản xuất từ máy cất Pha mẫu nƣớc 2 lần Tạo môi trƣờng 3 DNS Sigma Aldrich Xác định đƣờng khử 4 Peptone Việt Nam Môi trƣờng SDB Môi trƣờng SDA 5 Dextrose Agar Việt Nam Môi trƣờng SDA 6 Glucose Trung Quốc Môi trƣờng SDA Môi trƣờng SDB 7 Xylose Sigma Aldrich Dựng đƣờng chuẩn 8 Anthrone Sigma Aldrich Xác định cellulose 9 NaOH Trung Quốc Trung hòa Chuẩn độ acid 10 Phenolphtalein Chỉ thị màu 28
  38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Môi trƣờng Thành phần môi trƣờng hoạt hóa và nhân giống nấm men Sabouraud Dextrose Broth (SDB) D – Glucose: 40 g Peptone: 15 g Nƣớc cất: 1000 ml Thành phần của môi trƣờng nuôi cấy nấm men Sabouraud Dextrose Agar (SDA) - D – Glucose: 40 g - Peptone: 15 g - Agar: 22 g - Nƣớc cất: 1000 ml 29
  39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3. Bố trí thí nghiệm 2.3.1. Sơ đồ quy trình Bã nguyên liệu Phân tích thành phần lên men lần 1 - Nhân giống - độ ẩm -Giữ giống - tro toàn phần -Khảo sát đƣờng cong tăng - hàm lƣợng lignin trƣởng tế bào - định lƣợng đƣờng khử -hàm lƣợng cellulose Tiền xử lý S. cerevisiae - acid acetic (2, 75%) P. anomala - Đối chứng ( không tiền xử lý) Nấm men Thủy phân và lên men đồng thời khảo sát các thông số Enzyme thời gian tỷ lệ enzyme tỷ lệ nấm men bổ sung Dịch lên men pH bioethanol Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Vỏ chuối sau khi đƣợc thu gom về tiến hành sấy khô, xay và ray nhỏ sau đó tiến hành lên men lần 1 thu đƣợc bã nguyên liệu để tiếp tục tận dụng bã lên men thu nhận bioethanol lần 2. 30
  40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.2. Bố trí thí nghiệm 2.3.2.1. Thí nghiệm khảo sát một số đặc điểm của nấm men - Quan sát đại thể và vi thể của nấm men. - Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng. - Giữ giống. - Đánh giá kết quả đƣờng cong sinh trƣởng dựa trên mật độ nấm men. - Tiến hành thí nghiệm với 2 loại nấm men là: S. cerevisiae và P. anomala và tính giá trị log (cfu/ml). Nghiệm thức là thời gian nhân giống từ 0h đến 48h trên môi trƣờng SDB, gồm: 0h; 2h; 4h; 6h; 8h; 10h; 12h; 14h; 16h; 18h; 20h; 22h; 24h; 26h; 28h; 30h; 32h; 34h; 36h; 38h; 40h; 42h; 44h; 48h. 2.3.2.2. Xác định thành phần nguyên liệu Phân tích thành phần nguyên liệu trƣớc và sau khi lên men lần 1. Tiến hành thí nghiệm với các nghiệm thức sau: - Xác định độ ẩm nguyên liệu ban đầu bằng phƣơng pháp sấy đến khối lƣợng không đổi - Xác định hàm lƣợng tro và lignin bằng phƣơng pháp Klason - Xác định hàm lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp Miller - Xác định hàm lƣợng cellulose bằng phƣơng pháp Kiursher – Hoff. 2.3.2.3. Thí nghiệm tiền xử lý bã lên men Mục đích của quá trình này là tiếp tục tiền xử lý vỏ chuối để thu nhận nguồn cellulose có trong bã vỏ chuối lên men lần 1. Nguồn cellulose này sẽ là nguyên liệu để ứng dụng trong quá trình lên men SSF lần 2. Khảo sát lên men có tiền xử lý bằng acid acetic 2,75%, tỷ lệ nguyên liệu / hỗn hợp là 1 : 20, thời gian 48h, tốc độ lắc 100 vòng/ phút và không tiền xử lý cái nào sinh ra ethanol hiệu quả hơn (đối chứng). 2.3.2.4. Thí nghiệm thủy phân và lên men đồng thời (SSF) 31
  41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Mục đích của quá trình này là khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình SSF lần 2. Bao gồm tỷ lệ enzyme bổ sung (v/v) (100.UI/ml), tỷ lệ giống nấm men bổ sung (v/v) (109 cfu/ml), pH môi trƣờng ban đầu và thời gian lên men. Khảo sát quá trình SSF lần 2 theo thời gian: Mẫu đƣợc lấy theo các mốc thời gian: 0h; 6h; 12h; 18h, 24h, 30h; 36h; 42h; 48h; 54h; 60h; 66h; 72h. Xác định hàm lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp Miller, hàm lƣợng cellulose bằng phƣơng pháp Kiursher - Hoff, đo độ cồn bằng cồn kế, hàm lƣợng đƣờng tổng bằng Brix kế, hàm lƣợng acid tổng bằng phƣơng pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N với chỉ thị là phenolphtalein, định lƣợng số tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc. Các thông số của mẫu bao gồm: - Tỉ lệ bã / dịch lên men 1:20 - Tỉ lệ enzyme bổ sung 0,5% (v/v) - Tỉ lệ nấm men bổ sung 5% (v/v) mỗi loại - pH 5,0 - Tốc độ lắc 120 vòng/ phút - Nhiệt độ phòng Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme bổ sung Tiến hành khảo sát theo tỷ lệ thể tích enzyme, thể tích dung dịch là 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7%, 0,9%. Xác định hàm lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp Miller, hàm lƣợng cellulose bằng phƣơng pháp Kiursher - Hoff, đo độ cồn bằng cồn kế, hàm lƣợng đƣờng tổng bằng Brix kế. Từ đó làm cơ sở để nhận xét ảnh hƣởng của enzyme đến quá trình. Các thông số của mẫu bao gồm: - Tỉ lệ bã / dịch lên men 1 : 20 - Tỉ lệ nấm men bổ sung 5% (v/v) mỗi loại - Thời gian lên men 48h - Tốc độ lắc 120 vòng/ phút - Nhiệt độ phòng 32
  42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - pH 5,0 Ảnh hƣởng của tỷ lệnấm men bổ sung Tiến hành khảo sát theo tỷ lệ nấm men/ thể tích dung dịch là 1%, 3%, 5%, 7%, 9%. Xác định hàm lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp Miller, hàm lƣợng cellulose bằng phƣơng pháp Kiursher - Hoff, đo độ cồn bằng cồn kế, hàm lƣợng đƣờng tổng bằng Brix kế. Từ đó làm cơ sở để nhận xét ảnh hƣởng của nấm men đến quá trình. Các thông số của mẫu bao gồm: - Tỉ lệ bã / dịch lên men 1:20 - Tỉ lệ enzyme bổ sung 0,5% (v/v) - Thời gian lên men 48h - Tốc độ lắc 120 vòng/ phút - Nhiệt độ phòng - pH 5,0 Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ban đầu Các giá trị pH khảo sát gồm 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0. Xác định hàm lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp Miller, hàm lƣợng cellulose bằng phƣơng pháp Kiursher - Hoff, đo độ cồn bằng cồn kế, hàm lƣợng đƣờng tổng bằng Brix kế. Từ đó làm cơ sở để nhận xét ảnh hƣởng của pH đến quá trình. Các thông số của mẫu bao gồm: - Tỉ lệ bã / dịch lên men 1:20 - Tỉ lệ enzyme bổ sung 0.5% (v/v) - Tỉ lệ nấm men bổ sung 5% (v/v) mỗi loại - Thời gian lên men 48h - Tốc độ lắc 120 vòng/ phút - Nhiệt độ phòng 2.4. Phƣơng pháp phân tích 2.4.1. Phương pháp hóa lý 2.4.1.1. Phương pháp phân tích hàm lượng ẩm 33
  43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Xác định độ ẩm ban đầu bằng phƣơng pháp sấy đến khối lƣợng không đổi. Trình tự thực hiện nhƣ sau: - Đặt cốc sấy trong tủ sấy ở 105ºC trong khoảng 6h cho đến khi khối lƣợng không đổi. Sau đó mang cốc bỏ vào bình hút ẩm và để nguội (sử dụng găng tay hoặc kẹp để di chuyển cốc). Cân chính xác khối lƣợng cốc đến 0.1mg. - Cho một lƣợng mẫu xác định vào trong cốc và cân. Sau đó dùng bút đánh dấu mẫu, lặp lại 3 lần đối với từng mẫu. - Đặt cốc đã chứa mẫu vào trong tủ sấy ở 105°C khoảng 6h. Sau khi sấy đến khối lƣợng không đổi, chuyển cốc từ tủ sấy sang bình hút ẩm và để nguội đến nhiệt độ phòng. Cân và ghi lại cốc chứa mẫu. 2.4.1.2. Xác định hàm lượng lignin, tro trong nguyên liệu biomass Phƣơng pháp xác định các thành phần lignin và tro trong mẫu nguyên liệu là biomass dựa trên qui trình của NREL - National Renewable Energy Laboratory, phòng thí nghiệm năng lƣợng quốc gia Hoa Kỳ[6]. Hàm lƣợng lignin trong nguyên liệu đƣợc xác định qua 2 bƣớc: - Bƣớc 1: sử dụng H2SO4 72% lắc nguyên liệu ở 30ºC trong 60 phút. - Bƣớc 2: sử dụng H2SO4 4% hấp nguyên liệu ở 121ºC trong 60 phút. Nguyên liệu đƣợc chia làm 2 phần: hòa tan bởi acid và không hòa tan bởi acid. Trình tự các bƣớc thực hiện thí nghiệm nhƣ sau: Chuẩn bị mẫu phân tích - Nung cốc crucible trong lò nung ở 575 ± 25ºC khoảng 6h, đến khối lƣợng không đổi, sau đó chuyển cốc trực tiếp từ lò nung sang bình hút ẩm và để nguội trong 1 khoảng thời gian xác định. Cân khối lƣợng cốc ban đầu (m0). - Cân 300,0 ± 10,0 mg mẫu phân tích cho vào trong ống nghiệm. Thêm vào 3,00 ± 0,01ml acid sunfuric 72% vào mỗi ống nghiệm chứa mẫu. 34
  44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Đặt các ống nghiệm chứa mẫu phân tích vào bể ổn nhiệt ở 30 ± 3ºC trong 1h. Sử dụng cá từ để khuấy cho hỗn hợp đồng đều. - Sau khi kết thúc sự thủy phân trong 60 phút, lấy các ống nghiệm ra khỏi bể ổn nhiệt. Pha loãng nồng độ acid trong ống nghiệm xuống 4% bằng cách cho thêm 84,00 ± 0,04ml nƣớc đề ion. - Đặt ống nghiệm vào trong nồi hấp và hấp ở 121ºC trong 1h. Phân tích mẫu xác định hàm lƣợng lignin không hòa tan trong acid - Mẫu sau khi hấp đƣợc lọc qua cốc crucible qua hệ thống lọc hút chân không. Phần rắn trong cốc đƣợc đem đi sấy ở 105°C cho đến khi khối lƣợng không đổi. - Tiếp tục đem mẫu sau sấy đi nung ở 575 ± 25ºC ít nhất trong 24 6h giờ cho đến khi mẫu thành tro trắng và đem cân khối lƣợng. Phân tích mẫu chứa lignin hòa tan acid Chạy mẫu trắng là dung dịch H2SO4. - Lấy dịch thủy phân sau khi lọc qua cốc đem pha loãng từ 5 – 10 lần với H2SO4 4%. Đo mẫu trên máy UV-Vis với bƣớc sóng 240nm và 320nm. Lựa chọn độ hấp thụ nằm trong khoảng từ 0,7 đến 1,0 tƣơng ứng với hệ số pha loãng. Xác định hàm lƣợng tro - Cho vào cốc khoảng 5g mẫu thử, đem cân cả cốc sứ lẫn mẫu. - Sau đó sấy khô ở 105°C đến khối lƣợng không đổi. - Đem cốc nung đến tro trắng ở 550 – 600°C trong 6 –7 giờ. Cân rồi tính kết quả.  Tính toán: % Ẩm = mđầu- msau sấy / mđầu × 100 % Tro = msau nung – mđầu / (mđầu – mẩm) × 100 % Lignin không hòa tan = msau lọc – msau nung / (mđầu – mẩm) × 100 35
  45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP % Lignin hòa tan = UVabs × Vsau lọc × hệ số pha loãng × 100 / (ε ×(mđầu – mẩm)) Với: + UVabs: trung bình mẫu đo tại OD 240nm. + Vlọc: thể tích sau lọc. + ε = 12 độ hấp thụ lignin tại OD = 240nm. 2.4.1.3. Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Miller - Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử với thuốc thử 3,5 – dinitrosalixylic acid (DNS), DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3 – amino – salicylic có màu đỏ cam khi đun nóng hỗn hợp phản ứng. Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử trong một phạm vi nhất định đƣợc đo bằng máy quang phổ so màu UV – VIS. Dựa theo đồ thị chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thụ mạnh nhất trong khoảng bƣớc sóng 540 nm. - Chuẩn bị dung dịch đo quang phổ o Cho 1 ml dung dịch mẫu (đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm, thêm 3 ml thuốc thử DNS. o Đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 5 phút. Làm lạnh nhanh ống nghiệm về nhiệt độ phòng rồi đo OD ở bƣớc sóng 540 nm (hình 2.2). Từ giá trị OD đo đƣợc, dựa vào đồ thị đƣờng chuẩn glucose suy ra hàm lƣợng đƣờng khử trong mẫu. 2.4.1.4. Định lượng cellulose theo phương pháp Kiursher – Hoff 36
  46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Nguyên tắc: Nguyên tắc này dựa trên phản ứng tạo màu giữa cellulose với thuốc thử Anthrone có màu vàng trong dung dịch acid H2SO4 đặc sẽ tạo màu xanh từ nhạt đến đậm nâu khi đun nóng hỗn hợp phản ứng. Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ cellulose trong một phạm vi nhất định đƣợc đo bằng máy quang phổ so màu UV – Vis. Dựa vào đồ thị đƣởng chuẩn giữa cellulose với thuốc thử, sẽ tính đƣợc hàm lƣợng cellulose của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp mạnh nhất ở bƣớc sóng 610 nm. - Cách tiến hành: o Cho 0,5 ml dịch mẫu (đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm và thêm 5 ml thuốc thử Anthrone. o Đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 5 phút. Làm lạnh nhanh rồi đo OD ở bƣớc sóng 610 nm (hình 2.3). Từ giá trị OD thu đƣợc, dựa vào đồ thị đƣờng chuẩn cellulose theo OD suy ra hàm lƣợng cellulose trong mẫu. Hình 2.2. Mẫu sau khi đun bằng phƣơng pháp Miller 37
  47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2.3. Mẫu sau khi đun bằng phƣơng pháp Kiursher – Hoff 2.4.1.5. Xác định hàm lượng acid tổng bằng NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphthalein. - Nguyên lý: Dùng kiềm tiêu chuẩn NaOH 0,1N hoặc KOH 0,1N để trung hòa các acid có trong mẫu với phenolphthalein làm chỉ thị màu. - Tiến hành: cho một lƣợng mẫu vào cốc thủy tinh dung tích 250ml và nhỏ vài giọt chỉ thị phenolphtalien 1% vào. Đem cốc đi chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng bền vững thì dừng. Đọc thể tích NaOH0,1N tiêu tốn (giả sử B ml). Tính kết quả: Mẫu lỏng: Xa = K .B .F . 100/V Trong đó: B: số ml NaOH 0,1N đã sử dụng chuẩn độ . F: là hệ số pha loãng tổng cộng . V: thể tích (mẫu lỏng) mẫu đem thí nghiệm. 38
  48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP K: biểu thị số g acid tƣơng đƣơng 1ml NaOH 0,1N. Đối với ethanol K = 0,0064g/ml. Hình 2.4. Mẫu sau khi chuẩn độ acid 2.4.1.6. Phương pháp xác định độ cồn bằng khúc kế Nguyên tắc hoạt động của khúc xạ kế: dựa theo định luật Snell trong khúc xạ ánh sáng. Chỉ số khúc xạ (n) của một chất so với không khí là tỷ lệ giữa sin của góc tới và sin của góc khúc xạ của chùm tia sáng truyền từ không khí vào chất đó. Tiến hành: - Hút vài giọt mẫu cần đo lên bề nặt khúc xạ kế. - Nhìn vào thang đo và xác định độ cồn, đƣờng. 2.4.1.7. Phương pháp xác định pH Xác định PH của dung dịch bằng máy đo bút pH. - Cho dung dịch vào cốc thủy tinh 100ml - Nhúng bút đo pH vào đọc kết quả hiền thị trên máy - Sau đó rửa bút bằng nƣớc cất rồi trung hoà bằng dung dịch KC1 tiếp tục cho vào cốc để đo thực hiện 2-3 lần lấy kết quả chính xác nhất. 39
  49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2.5. Nguyên liệu sau khi đƣợc trung hòa bằng NaOH 10N 2.4.2. Phƣơng pháp vi sinh. 2.4.2.1. Phương pháp giữ giống nấm men Chuẩn bị môi trƣờng SDA có chứa Agar, rót 10 ml dung dịch vào ống nghiệm và đậy nút bông lại. Sau đó đem đi hấp tiệt trùng, lấy ra để nghiêng cho agar đông lại. Tiến hành cấy giống nấm men từ ống nghiệm gốc sang ống môi trƣờng thạch nghiêng đã chuẩn bị sẵn từ trƣớc. Công việc này tiến hành trong tủ cấy vi sinh để tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hƣởng đến men giống và quá trình lên men sau này. Định kì cấy chuyền giống là 1 tháng 1 lần. 2.4.2.2. Phương pháp nhân giống Giống nấm men trƣớc khi đƣa vào lên men cần đƣợc nhân gống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống. S. cerevisiae và P. anomala đƣợc phân lập và hoạt hóa trên môi trƣờng SDA. - Sau khi môi trƣờng nấm men đã phát triển tốt trên môi trƣờng thạch nghiêng cấy ria vào đĩa petri chứa môi trƣờng SDA, ủ ở nhiệt độ phòng. 40
  50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Lấy 1 khuẩn lạc rời chai chứa 100 ml môi trƣờng SDB, nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng. Hình 2.6. S. cerevisiae và P.anomala đã đƣợc nhân giống trên môi trƣờng SDB Sau khi khảo sát đƣờng cong tăng trƣởng sẽ xác định đƣợc thời gian nhân giống tốt nhất cho nấm men. 2.4.2.3. Định lượng số tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Nguyên tắc: Xác định gián tiếp số lƣợng tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch, qua đó xác định đƣợc số tế bào sống. Tiến hành: o Pha loãng mẫu: pha loãng mẫu theo các dãy số thấp phân thích hợp nhƣ: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. o Trải mẫu: dùng micropipette hút 20µl dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ thích hợp cho vào môi trƣờng đĩa thạch. Sử dụng que cấy trang bằng thủy tinh đã đƣợc khử trùng để trải đều các tế bào trên bề mặt thạch, ủ ở nhiệt độ phòng. o Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đem tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau ủ. Chọn các khuẩn lạc đếm đƣợc từ 25-250 để tính toán. 41
  51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2.7. Cấy trang o Mật độ tổng của nấm men đƣợc tính theo công thức: Trong đó: A: mật độ tế bào (cfu/ml) : Số khuẩn lạc/đĩa : Độ pha loãng : thể tích dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa (ml) Làm tròn kết quả A có đƣợc, ghi lại 2 chữ số có nghĩa và biểu thị kết quả dƣới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ). 42
  52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát đặc điểm của chủng nấm men sử dụng trong đề tài 3.1.1. Saccharomyces cerevisiae Đặc điểm hình thái: S. cerevisiae sau khi đƣợc hoạt hóa, nhân giống và nuôi cấy trên môi trƣờng SDA thời gian 48h, thu đƣợc khuẩn lạc có hình tròn, lồi, trơn, màu trắng, đƣờng kính từ 1 – 2mm (hình 3.1). a) Khuẩn lạc S. cerevisiae (môi b) Tế bào S. cerevisiae quan sát trƣờng SDA) bằng kính hiển vi Hình 3.1. Đặc điểm đại thể (a), vi thể (b) của S.cerevisiae S. cerevisiae đƣợc hoạt hóa 24 giờ trong môi trƣờng mới để nấm men phát triển sinh khối. Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng của S. cerevisiae (hình 3.2) Qúa trình sinh trƣởng và phát triển của S. cerevisiae đƣợc thể hiện trong 4 pha Pha lag từ 0h (3,89×107 cfu/ml) đến 10h (5,89×107 cfu/ml) mật độ tế bào S. cerevisiae tăng chậm. Đây là khoảng thời gian vi sinh vật chƣa tiến hành sinh sản 43
  53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP mà chỉ xảy ra quá trình thích nghi với môi trƣờng nuôi cấy mới. Số tế bào tăng hoặc giảm không đáng kể nhƣng sự trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ. Pha log từ 10h đến 18h, mật độ tế bào nấm men tăng đáng kể, tại 18h đạt 8, 71×108 cfu/ml. Tại pha này tốc độ sinh sản của vi sinh vật đạt cực đại. Tế bào vừa sinh sản mạnh vừa tăng sinh khối, tế bào phát triển theo cấp số nhân. Ở giai đoạn này S. cerevisiae tiến hành tổng hợp enzyme với số lƣợng và chất lƣợng rất cao. Pha cân bằng từ 18h đến 38h quần thể tế bào ổn định, tỷ lệ sinh ra bằng với tỷ lệ chết đi, sản phẩm trao đổi chất tích tụ nhiều, chất dinh dƣỡng cạn kiệt, tại 38h là 1,15×109 cfu/ml. Pha suy vong từ 38h trở đi, mật độ tế bào nấm men có xu hƣớng giảm, tại 48h là 3,39×108 cfu/ml. Tế bào chết tăng dần, dinh dƣỡng cạn kiệt, các tế bào sống trở nên già đi. Số lƣợng tế bào sinh ra không cân bằng với số tế bào chết. 9.5 9.06 8.94 9 8.5 8.53 8 7.77 7.59 7.5 log (cfu/ml) log 7 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 thời gian khảo sát (giờ) Hình 3.2. Đƣờng cong sinh trƣởng của S. cerevisiae (môi trƣờng SDB) Theo kết quả thí nghiệm thì thời gian sử dụng S. cerevisiae cho quá trình lên men tốt nhất là cuối pha log 18h. 3.1.2. Pichia anomala 44
  54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP P. anomala sau khi đƣợc hoạt hóa, nhân giống và nuôi cấy trên môi trƣờng SDA thời gian 48h, thu đƣợc khuẩn lạc có hình tròn, lồi, trơn, màu trắng đục, có tâm trắng, đƣờng kính từ 1 – 2mm (hình 3.3). a) Khuẩn lạc P. anomala (môi b) Tế bào P. anomala quan sát bằng trƣờng SDA) kính hiển vi Hình 3.3. Đặc điểm đại thể (a) và vi thể (b) của P. anomala P. anomala đƣợc hoạt hóa 24 giờ trong môi trƣờng mới để nấm men phát triển sinh khối. Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng của P. anomala (hình 3.4) Tƣơng tự nhƣ S. cerevisiae, đƣờng cong tăng trƣởng của P. anomala cũng gồm 4 pha: pha lag, pha log, pha cân bằng và pha suy vong. Pha lag bắt đầu từ 0h (2,14×107 cfu/ml) đến 6h (7,24×107 cfu/ml). Pha log bắt đầu từ 8h đến 20h, tại 20h là 1,05×1011 cfu/ml. Pha cân bằng từ 20h đến 36h, mật độ tế bào tại 36h là 1,74×1011 cfu/ml. Pha suy vong từ 36h trở đi, mật độ tế bào nấm men giảm, tại 48h là 1,15×1010 cfu/ml. Theo kết quả thí nghiệm thì thời gian sử dụng P. anomala cho quá trình lên men tốt nhất là cuối pha log 20h. 45
  55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 12 11.24 11.5 11.02 11 10.5 10.06 10 9.5 9 8.5 7.86 log(cfu/ml) 8 7.57.33 7 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Thời gian khảo sát (giờ) Hình 3.4. Đƣờng cong sinh trƣởng của P. anomala (môi trƣờng SDB) 3.2. Phân tích thành phần vỏ chuối và bã nguyên liệu sau khi lên men lần 1 Bảng 3.1. Thành phần vỏ chuối khô trƣớc lên men và bã chuối sau lên men lần 1 Thành phần Hàm lƣợng Vỏ chuối khô Bã chuối sau lên men lần 1 Độ ẩm (%) 7,5 42,0 Độ tro (%) 9,4 _ Lignin (%) 22,3 0,15 Đƣờng khử (mg/g) 142,6 59,7 Cellulose (mg/g) 367,8 38,5 Qua khảo sát một số thành phần của vỏ chuối khô và bã chuối đã lên men lần 1 đƣợc trình bày trong bảng 3.1 cho thấy bã nguyên liệu lên men lần 1 sau khi vắt đến độ ẩm 42%, lignin chiếm 0,15%, đuờng khử chiếm 59,7 mg/ml, cellulose lúc này chiếm 38,5 mg/g thành phần chất khô, có thể thấy bã chuối sau lên men lần 1 có 46
  56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP hàm lƣợng lignin khá thấp khi này cấu trúc nguyên liệu trở nên lỏng lẻo nên dễ dàng tách đuờng, đuờng khử tƣơng đối cao và là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc tái sử dụng cho sản xuất bioethanol. a) Vỏ chuối khô sau khi ray nhỏ b) Bã chuối sau lên men lần 1 Hình 3.5. Vỏ chuối khô trƣớc lên men và bã chuối sau lên men lần 1 3.3. Quá trình thủy phân và lên men đồng thời 3.3.1. Khảo sát quá trình SSF lần 2 theo thời gian Thực hiện khảo sát quá trình SSF lần 2 theo thời gian. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình. Kết quả trình bày trong các đồ thị và bảng sau: 47
  57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.2.Tổng hợp kết quả nghiên cứu thu đƣợc theo thời gian Thời HL đƣờng HL HL đƣờng HL HL acid Mật độ tế gian tổng cồn khử cellulose bào (g/l) (%) (mg/ml) (mg/ml) (CFU/ml) (giờ) (ºBx) 0 2,8 0 5,01 35,81 0,93 1,51×109 6 2,9 1,0 5,86 34,80 0,93 7,38×109 12 3,0 1,3 6,11 33,27 0,92 1,28×1010 18 3,2 1,4 6,54 31,06 0,88 1,57×1010 24 3,5 1,4 6,65 28,11 0,90 8,75×1010 30 3,4 1,5 5,96 27,06 0,92 9,78×1010 36 3,1 1,4 7,53 24,67 0,91 1,02×1011 42 3,2 1,4 5,74 27,50 0,91 1,14×1011 48 3,5 1,6 3,80 25,31 0,93 1,21×1011 54 3,1 1,4 4,31 26,51 0,93 8,04×1010 60 3,0 1,4 1,49 28,77 0,90 7,19×1010 66 3,0 1,3 1,67 28,82 0,93 6,86×1010 72 3,0 1,3 2,01 30,09 0,92 4,14×010 48
  58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 7 6.65 6 5.74 5.11 5 5.01 4.31 Mẫu có tiền 4 xử lý 3.8 3.67 3 3.02 Đối chứng 2 2.01 1 1.49 HL đƣờng khử (mg/ml)đƣờngkhử HL 0 0 20 40 60 80 Thời gian (giờ) Hình 3.6. Sự biến đổi của HL đƣờng khử theo thời gian 1.8 1.6 1.6 1.5 1.4 1.2 1.4 1.3 1 Mẫu có 0.8 tiền xử lý 0.6 0.5 HL cồn (%) cồn HL 0.4 Đối chứng 0.4 0.3 0.2 0.3 0.3 0 0 0 20 40 60 80 Thời gian (giờ) Hình 3.7. Sự biến đổi của HL cồn theo thời gian 49
  59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 60 50 49.53 40 35.81 30.09 Mẫu có 30 27.5 24.67 25.31 tiền xử lý 26.66 20 Đối chứng 19.39 HL cellulose (mg/ml) cellulose HL 10 9.84 0 0 20 40 60 80 Thời gian (giờ) Hình 3.8. Sự biến đổi của HL cellulose theo thời gian 11.5 11.08 10.94 11 10.62 10.5 10.2 10 Log(cfu/ml) 9.5 9.18 9 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 Thời gian (giờ) Hình 3.9. Ảnh hƣởng của thời gian đến sự phát triển tế bào Hàm lƣợng đƣờng khử biến thiên không đồng đều, tăng dần từ 0h (5,01 mg/ml) đến 24h (6,65 mg/ml), sau đó có xu hƣớng giảm tại 48h (3,08 mg/ml) và tiếp tục tăng nhẹ tại 54h (4,31 mg/ml). Tại 60h hàm lƣợng đƣờng khử là 1,49 mg/ml và tăng nhẹ ở 72h (2,01 mg/ml) 50
  60. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tại 0h chƣa có ethanol sinh ra do enzyme và nấm men vừa đƣợc cho vào. Trải qua các mốc thời gian đến 30h, hàm lƣợng cồn liên tục đƣợc tạo ra, hàm lƣợng cồn tại 30h là 1,5%. Sau đó giảm ở mốc 36h và 42h là 1,4%, và tiếp tục tăng đến giá trị cực đại tại 48h (1,6%). Sau đó hàm lƣợng cồn có xu hƣớng giảm nhẹ đến 72h (1,3%). Tại 0h hàm lƣợng cellulose đạt 35,81 mg/ml và giảm dần đến 36h (24,67 mg/ml). Sau đó tăng nhẹ tại 42h (27,50 mg/ml)và giảm tại 48h (25,31 mg/ml), tiếp tục tăng dần đến 72h (30,09 mg/ml). Theo kết quả cho thấy mẫu đối chứng hàm lƣợng đƣờng khử và cồn tạo thành tƣơng đối thấp. Hàm lƣợng đƣờng khử cao nhất là 5,11 mg/ml tại 42h và thấp nhất là 3,02 tại 24h. Hàm lƣợng cồn dao động từ 0,3 đến 0,5%. Vì vậy việc lên men có tiền xử lý cũng là một trong những yếu tố quan trọng mà ta cần lƣu ý. Theo kết quả ở trên thì ta có thể lý giải nhƣ sau, khi kéo dài thời gian lên men thì hàm lƣợng ethanol sinh ra tăng và đạt cao nhất ở thời điểm 48h, do đây là thời điểm mà nấm men hoạt động tốt nhất. Khi tiếp tục kéo dài thời gian lên men đến 72h thì lƣợng ethanol có xu hƣớng giảm do bị ức chế bởi acid sinh ra trong quá trình lên men và một phần chuyển hóa thành các hợp chất ức chế khác nên hàm lƣợng cellulose có xu hƣớng tăng nhẹ. Mặc khác khi kéo dài thời gian lên men thì hàm lƣợng đƣờng khử có xu hƣớng giảm do enzyme thủy phân hết cellulose là ethanol giảm đi. Thời gian cũng là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm. Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ lên men, nồng độ đƣờng, chủng nấm men, Thời gian lên men đƣợc tính bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trƣờng lên men, nhƣng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trƣờng lên men cụ thể và tùy thuộc vào mục đích lên men mà ta dừng quá trình lên men. 51
  61. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong gian đoạn đầu của quá trình lên men phải cho dịch đƣờng tiếp xúc với oxy. Lúc này nấm men cần oxy để tích lũy một lƣợng sinh khối cần thiết cho quá trình lên men. Tiếp theo, để chuyển hóa đƣờng thành ethanol, nấm men phải đƣợc phát triển trong điều kiện yếm khí hoàn toàn. Vì trong môi trƣờng này, sự hô hấp của nấm men bị ức chế và bắt đầu phải tìm năng lƣợng cần thiết bằng con đƣờng lên men. Để đáp ứng năng lƣợng cần thiết thì nấm men cần phân hủy một lƣợng đƣờng lớn và đƣờng sẽ chuyển hóa thành ethanol và CO2. Đó là nguyên nhân muốn có ethanol nhiều thì không đƣợc thoáng khí môi trƣờng. Nếu có oxy thì trong giai đoạn này rƣợu sẽ tiếp tục chuyển hóa thành acid acetic làm sản phẩm bị chua. 3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme bổ sung Thực hiện khảo sát của lƣợng enzyme cho vào lên quá trình SSF lần 2. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình. Kết quả trình bày trong các đồ thị và bảng sau. Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả nghiên cứu các tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau ở 48h Tỷ lệ enzyme HL đƣờng HL đƣờng HL cellulose HL cồn (%) bổ sung (%) khử (mg/ml) tổng (ºBx) (mg/ml) 0,1 2,87 3,4 29,48 1,4 0,3 5,31 3,0 23,53 1,4 0,5 7,49 3,0 15,86 1,6 0,7 7,63 3,0 15,22 1,6 0,9 7,94 3,0 13,32 1,6 52
  62. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 9 7.94 ) 8 7.49 7.63 7 6 5.31 5 4 2.87 3 2 HL đƣờng khử (mg/mlđƣờngkhử HL 1 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 Tỷ lệ enzyme bổ sung (%) Hình 3.10. Sự biến đổi HL đƣờng khử phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung 35 29.48 ) 30 25 23.53 20 15.86 15.22 15 13.32 10 HL cellulose (mg/ml cellulose HL 5 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 Tỉ lệ enzyme bổ sung (%) Hình 3.11. Sự biến đổi HL cellulose phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung 53
  63. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.65 1.6 1.6 1.6 1.6 1.55 1.5 1.45 1.4 1.4 HL cồn (%) cồn HL 1.4 1.35 1.3 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 Tỷ lệ enzyme bổ sung (%) Hình 3.12. Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung Dựa vào kết quả thu đƣợc cho thấy hàm lƣợng đƣờng khử tỉ lệ thuận với % enzyme cho vào. Hàm lƣợng đƣờng khử thấp nhất ở 0,1% là 2,87 mg/ml và cao nhất ở 0,9% là 7,94 mg/ml. Khi lƣợng enzyme tăng từ 0,1% đến 0,9% thì hàm lƣợng cellulose giảm dần từ 29,48 mg/ml xuống còn 13,32 mg/ml. Thủy phân và lên men đồng thời bao gồm hai quá trình diễn ra song song, thủy phân cellulose thành glucose và lên men glucose thành ethanol. Phản ứng thủy phân là phản ứng dị thể rắn/ lỏng, trong khi đó phản ứng lên men là phản ứng đồng thể. Khi sử dụng nồng độ enzyme nhỏ (0,1% và 0,3%) thì nồng độ cồn sinh ra thấp (1,4%) vì khi dùng lƣợng enzyme nhỏ khả năng hấp thụ lên bề mặt sơ sợi kém dẫn đến khả năng xâm nhập vào cấu trúc cellulose trở nên khó khăn. Khi sử dụng nồng độ enzyme 0,5% thì nồng độ cồn sinh ra tăng cao (1,6%). Khi tăng đến các nồng độ enzyme 0,7% và 0,9% thì nồng độ cồn sinh ra vẫn không thay đổi (1,6%) vì khi ở nồng độ cao xảy ra quá trình cạnh tranh hấp thụ lên bề mặt sơ sợi dẫn đến nồng độ cồn thu đƣợc vẫn không đổi. 54
  64. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Enzyme ảnh hƣởng trực tiếp đến quá trình thủy phân. Khi tỷ lệ enzyme cho vào tăng sẽ có nhiều enzyme cùng lúc tấn công vào cơ chất nên lƣợng đƣờng sinh ra tăng. Khi enzyme tấn công vào celulose, những cellulose có cấu trúc xốp và vô định hình sẽ dễ bị thủy phân trƣớc. Khi những phần cellulose mất đi thì tốc độ phản ứng thủy phân cũng giảm dần, khả năng tấn công vào những cấu trúc còn lại của cellulose trở nên khó khăn hơn. Vì vậy ở giai đoạn này nếu lƣợng enzyme bổ sung vào tăng lên cũng không giúp cải thiện tốc độ phản ứng cũng nhƣ tạo thành nhiều glucose hơn. Việc này cho thấy ứng với mỗi lƣợng cơ chất nhất định có một lƣợng enzyme nhất định để hiệu suất đạt cƣc đại. Mặt khác, về chi phí để mua enzyme rất cao nên cần đƣợc cân nhắc. Vì vậy trong thí nghiệm này tỉ lệ enzyme bổ sung thích hợp nhất là 0,5%. 3.3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men bổ sung Giống nấm men phải đƣợc nuôi cấy để đạt đến mật độ tế bào là 109 cfu/ml (tƣơng ứng với thời điểm 18h đến 20h trên đƣờng cong tăng trƣởng). Thực hiện khảo sát tỉ lệ nấm men bổ sung vào quá trình SSF lần 2. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình. Kết quả trình bày trong các đồ thị và bảng sau. Bảng 3.4. Tổng hợp kết quả nghiên cứu các tỷ lệ nấm men bổ sung khác nhau ở 48h Tỷ lệ nấm HL đƣờng HL đƣờng HL cellulose HL cồn (%) men bổ sung khử (mg/ml) tổng (ºBx) (mg/ml) (%) 1 5,35 3,0 28,12 1,3 3 3,91 2,9 27,47 1,4 5 3,86 3,0 24,51 1,5 7 3,58 3,0 13,07 1,5 9 1,75 3,0 10,11 1,5 55
  65. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 6 5.35 5 3.91 3.86 4 3.58 3 2 1.75 1 HL đƣờng khử đƣờng(mg/ml) khử HL 0 1 3 5 7 9 Tỷ lệ nấm men bổ sung (%) Hình 3.13. Sự biến đổi HL đƣờng khử phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung 30 28.12 27.47 24.51 25 20 15 13.07 10.11 10 HL cellulose (mg/ml) cellulose HL 5 0 1 3 5 7 9 Tỷ lệ nấm men bổ sung (%) Hình 3.14. Sự biến đổi HL cellulose phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung 56
  66. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.55 1.5 1.5 1.5 1.5 ) 1.45 1.4 1.4 1.35 1.3 (% cồn HL 1.3 1.25 1.2 1 3 5 7 9 Tỷ lệ nấm men bổ sung (%) Hình 3.15. Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung Tỉ lệ nấm men bổ sung vào dịch lên men là bằng nhau, cụ thể nhƣ ở tỉ lệ 1% thì mỗi loại đều bổ sung 1%. Hàm lƣợng đƣờng khử giảm dần theo tỉ lệ nấm men bổ sung vào, tại tỷ lệ nấm men 1% thì hàm lƣợng đƣờng khử là 5,35 mg/ml và tại tỷ lệ 9% là 1,75 mg/ml. Hàm lƣợng cellulose đạt cao nhất ở tỷ lệ nấm men bổ sung 1% là 28,12 mg/ml và giảm dần đến tỷ lệ 9% là 10,11 mg/ml. Hàm lƣợng cồn tăng dần từ tỷ lệ 1% đến 5% (từ 1,3% đến 1,5%) và không thay đổi ở các tỷ lệ 7% và 9%. Đối với tỷ lệ nấm men bổ sung 1% và 3%, hàm lƣợng nấm men bổ sung vào quá ít nên không đủ để lên men hết lƣợng đƣờng tạo ra. Đối với tỷ lệ nấm men 5% trở đi, hàm lƣợng nấm men tƣơng đối cao nên hiệu quả lên men tăng cao so với tỷ lệ 1% và 3%. Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men, chuyển hóa đƣờng thành ethanol và khí carbonic. Trên thực tế, tỷ lệ nấm men bổ sung tăng thì hiệu suất lên men tăng dần. Khi hàm lƣợng nấm men vƣợt quá ngƣỡng giá trị cần thêm vào dịch lên men thì hiệu suất chuyển hóa ethanol sẽ không tăng nữa. Khi mật độ nấm men quá cao, nấm men có xu hƣớng cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng để sinh trƣởng và phát 57
  67. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP triển thay vì lên men ethanol. Vì vậy dựa trên kết quả của thí nghiệm này thì ta chọn tỉ lệ bổ sung nấm men 5% là thỏa mãn với yêu cầu của thí nghiệm. 3.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến quá trình lên men Thực hiện khảo sát giá trị pH môi trƣờng ban đầu chuẩn bị cho quá trình SSF lần 2. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình. Kết quả trình bày trong các đồ thị và bảng sau. Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả nghiên cứu các nồng độ pH khác nhau Nồng độ pH HL đƣờng HL đƣờng HL cellulose HL cồn (%) khử (mg/ml) tổng (ºBx) (mg/ml) 4,0 11,39 2,0 20,07 1,0 4,5 7,96 2,6 25,31 1,5 5,0 4,70 3,0 18,59 1,6 5,5 2,50 3,6 11,05 1,4 6,0 1,40 3,6 7,96 1,3 12 11.39 10 7.96 8 6 4.7 4 2.5 2 1.4 HL đƣờng khử (mg/ml) khử đƣờng HL 0 4 4.5 5 5.5 6 Nồng độ pH Hình 3.16. Sự biến đổi của HL đƣờng khử phụ thuộc vào các nồng độ pH khác nhau 58
  68. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 30 25.31 25 20.07 20 18.59 15 11.05 10 7.96 5 HL cellulose (mg/ml) cellulose HL 0 4 4.5 5 5.5 6 Nồng độ pH Hình 3.17. Sự biến đổi của HL cellulose phụ thuộc vào các nồng độ pH khác nhau 1.8 1.6 1.6 1.5 1.4 1.4 1.3 1.2 1 1 0.8 0.6 HL (%)cồn HL 0.4 0.2 0 4 4.5 5 5.5 6 Nồng độ pH Hình 3.18. Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào các nồng độ pH khác nhau Qua kết quả thí nghiệm cho thấy hàm lƣợng đƣờng khử cao nhất ở nồng độ pH 4,0 là 11,39 mg/ml và thấp nhất tại pH 6,0 là 1,40 mg/ml. Tại pH 4,0 thì hàm lƣợng cellulose là 20,07 mg/ml và tăng lên khi pH 4,5 ( 25,31 mg/ml), sau đó bắt đầu giảm dần tại pH 6,0 là 7,96 mg/ml. Hàm lƣợng cồn tại pH 4,0 là 1,0%, tăng dần đều đến pH 5,0 (1,6%) sau đó giảm dần đến pH 6,0 là 1,3%. 59
  69. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nồng độ ion H+ trong canh trƣờng ảnh hƣởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng là thay đổi điện tích của tế bào, làm tăng hoặc giảm mật độ thẩm thấu của các chất dinh dƣỡng cũng nhƣ chiều hƣớng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định, trạng thái này phụ thuộc vào pH của canh trƣờng. Trong điều kiện lên men ethanol, pH tối ƣu để tạo ethanol là 4,5 – 5,0. Nếu pH thấp khoảng 3,0 – 4,0 nấm men còn hoạt động đƣợc và vi khuẩn bị ức chế, pH hơi cao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm dễ bị nhiễm khuẩn và các sản phẩm phụ trong quá trình lên men sẽ tạo ra nhiều hơn, lên men có hiệu suất thấp. Theo kết quả thí nghiệm cho thấy ở tại pH 5,0 enzyme hoạt động có hiệu quả và sinh ra đƣợc nhiều ethanol. Khoảng pH hoạt động của enzyme rất có ý nghĩa với sản xuất công nghiệp vì trong quy mô công nghiệp, việc giữ pH ở một giá trị không đổi là rất khó khăn. Vì vậy việc đƣa ra một khoảng pH hoạt động sẽ giúp quá trình vận hành trở nên đơn giản hơn và đạt hiệu quả quá trình cao. 60
  70. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Thông qua đồ án có một số kết luận nhƣ sau: - Xác định đƣợc thành phần vỏ chuối gồm: độ ẩm 7,5%, độ tro 9,4%, lignin 22,3%, hàm lƣợng đƣờng khử 142,6 mg/g, hàm lƣợng cellulose 367,8 mg/g. - Xác định đƣợc thành phần nguyên liệu sau lên men lần 1 gồm: độ ẩm 42,0%, lignin 0,15%, hàm lƣợng đƣờng khử 59,7 mg/g, hàm lƣợng cellulose 38,5 mg/g. - Khảo sát đƣợc đƣờng cong sinh trƣởng của S. cerevisiae, thời điểm thích hợp để lên men là sau 18h nhân giống với mật độ tế bào đạt 8,71×108cfu/ml. - Khảo sát đƣợc đƣờng cong sinh trƣởng của P. anomala, thời điểm thích hợp để lên men là sau 20h nhân giống với mật độ tế bào đạt 1,05×1011cfu/ml. - Quá trình tiền xử lý với thông số gồm: tác nhân acid acetic 2,75% (v/v), tỉ lệ nguyên liệu / dung dịch là 1:20, thời gian là 48h. - Quá trình thủy phân và lên men đồng thời với các thông số tối ƣu gồm: o Thời gian lên men là 48h o Tỷ lệ enzyme bổ sung là 0,5% (v/v). o Tỷ lệ nấm men bổ sung là 5% (v/v) cho mỗi loại. o pH môi trƣờng ban đầu là 5,0. o Lƣợng ethanol thu đƣợc là 1,6%. 61
  71. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP So với đề tài trƣớc thì đã rút ngắn đƣợc thời gian lên men từ 72h xuống còn 48h, tỷ lệ enzyme bổ sung giảm từ 0,7% (v/v) xuống còn 0,5% (v/v), tỷ lệ nấm men bổ sung giảm từ 9% (v/v) còn 5% (v/v) cho mỗi loại. Kết quả cho thấy có thể tái sử dụng bã cơ chất là vỏ chuối để lên men thu nhận ethanol. Tuy nhiên kết quả còn chƣa đƣợc khả quan lắm vì lƣợng ethanol sinh ra còn khá thấp. 4.2. Đề nghị Kết hợp sử dụng nhiều chủng nấm men khác có khả năng sử dụng nguồn đƣờng 5 carbon và 6 carbon hiệu quả hơn. Khảo sát thêm ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình lên men. Bổ sung thêm các chất dinh dƣỡng để cải thiện hàm lƣợng ethanol tạo thành. Xây dựng quy trình sản xuất ở quy mô công nghiệp. 62
  72. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bích, N.T.N., Kỹ thuật cellulose và giấy. 2003, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 2. Hoàng Minh Nam (2009): Nghiên cứu công nghệ và thiết bị liên tục xử lý rơm rạ bằng hơi nước để lên men etanol. ĐH Bách Khoa- Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 3. Huỳnh Ngọc Vĩ, 2008. Nghiên cứu sản xuất ethanol từ bã khoai mì, Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa Kĩ thuật Hóa học, đại học Bách Khoa, Tp Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Thị Hằng Nga, Nghiên cứu khả năng sản xuất bioethanol sinh học từ phụ phế phẩm nông nghiệp, Luận văn thạc sĩ, ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM, Việt Nam, 2009. 5. Võ Thị Kiều Thanh ,2013. Nghiên cứu sản xuất bioethanol từ rong biển, nghiên cứu khoa học, Viện sinh học Nhiệt Đới, TP. Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 6. A. Sluiter, B.H., D. Hyman, C. Payne, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton, and J. Wolfe, Determination of Total Solids in Biomass and Total Dissolved Solids in Liquid Process Samples. Laboratory Analytical Procedure (LAP), 2008. 7. Chandel AK, Chan EC, Rudravaram R, Narasu ML, Rao LV, Ravinda (2007), “Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal”, Biotechnol Mol Biol Rev, pp. 14-32. 63
  73. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 8. Charles E.Wyman, Handbook on Bioethanol: Product and Utilization, Tatlor&Francis, 1996. P 119-285 9. E.Wyman, C., Handbook on Bioethanol: Product and Ulitization. . 1996. p. 119 – 285. 10. Kim, T.H., Kim, J.S., Sunwoo, C., Lee, Y.Y., Pretreatment of corn stover by aqueous ammonia. Bioresour. Technol, 2003: p. 39–47. 11. Palonen, H., Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose. VTT Publications 520, 2004. ISSN 1455-0849. 12. Taherzsadeh MJ, Karimi K (2007), “Enzymatic-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: a review”, Bioresources, pp. 707- 738. 13. Walker, G.M., Bioethanol: Science and technology of fuel alcohol. 2010 14. Zhu JY, P.X., Woody biomass pretreatment for cellulosic ethanol production: technology and energy consumption evaluation. Bioresour Technology, 2010. 101: p. 4992–5002. TÀI LIỆU TỪ TRANG WEB 15. Chuyên đề: chuối, &NewID=2202 16. Nguyễn Văn Chính, Nhiên liệu sinh học – nguồn năng lƣợng tái tạo trong tƣơng lai, 2015/1749/ 64
  74. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Cách dựng đƣờng chuẩn cellulose - Dung dịch cellulose chuẩn (20 mg/ml): cân chính xác 1 g cellulose hòa tan trong 50 ml nƣớc cất. - Hút lần lƣợt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch cellulose vào 6 bình định mức 100 ml, them nƣớc cất đến vạch định mức. Các dung dịch mới pha trên có nồng độ lần lƣợt 0,2; 0,3; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 mg/ml. - Cho 5 ml thuốc thử Anthrone vào mỗi ống nghiệm chứa 0,5 ml dung dịch trên. - Mẫu trắng: cho 5 ml thuốc thử Anthrone vào mỗi ống nghiệm chứa 1 ml nƣớc cất. - Đun cách thủy trong 5 phút. Làm lạnh nhanh rồi đo OD ở bƣớc song 610 nm. - Từ giá trị OD đo đƣợc, vẽ đồ thị đƣờng chuẩn. Cách pha Anthrone Cân 0,2g anthrone hòa tan trong 100 ml H2SO4 98%. Dung dịch sau khi đƣợc pha chứa trong chai thủy tinh nâu và để ở điều kiện lạnh 4 – 6°C trong 2 giờ trƣớc khi sử dụng. 2 1.8 y = 1.3455x + 0.0069 R² = 0.992 1.6 1.843 1.4 1.597 1.2 1.376 1 1.157 0.8 0.6 0.857 0.4 0.552 0.2 0 0.201 Hàm (mg/mL) cellulose Hàm lƣợng 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 OD 1
  75. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC B: Đồ thị tƣơng quan giữa mật độ quang OD-mật độ tế bào Saccharomyces cerevisiae 8.5 8.4 8.3 y = 1.6486x + 7.5527 8.2 R² = 0.9824 8.1 8 log(cfu/ml) 7.9 7.8 7.7 7.6 OD 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Pichia anomala 10 y = 4.234x + 7.272 9.5 R² = 0.9627 9 8.5 log(cfu/ml) 8 7.5 7 OD 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 2