Đồ án Thử nghiệm quy trình sản xuất sinh khối bào tử vi nấm phân huỷ cellulose và protein

73 trang thiennha21 12/04/2022 4890

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Thử nghiệm quy trình sản xuất sinh khối bào tử vi nấm phân huỷ cellulose và protein", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_thu_nghiem_quy_trinh_san_xuat_sinh_khoi_bao_tu_vi_nam.pdf

Nội dung text: Đồ án Thử nghiệm quy trình sản xuất sinh khối bào tử vi nấm phân huỷ cellulose và protein

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI BÀO TỬ VI NẤM PHÂN HUỶ CELLULOSE VÀ PROTEIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Ts. Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Kha Tôn Huy MSSV: 1191111022 Lớp: 11HSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2013
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây, cùng với xu hướng phát triển một nền nông nghiệp sạch và bền vững, các loại phân bón bảo vệ thực vật hữu cơ hoặc có nguồn gốc sinh học được đề cao, tập trung nghiên cứu và phát triển. Trong đó, phổ biến và hiệu quả nhất là việc sử dụng chế phẩm sinh học có chứa vi nấm Trichoderma sp., là loại vi nấm có tác dụng cao trong việc thúc đẩy quá trình phân huỷ chất hữu cơ, Ngày nay, theo sự phát triển của khoa học, công nghệ sinh học, việc sử dụng chế phẩm Trichoderma sp. ủ phân hữu cơ để bón cho cây trồng sẽ giúp tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất, phân giải nhanh các chất hữu cơ thành dạng dễ tiêu, phân huỷ cellulose thành các acid mùn, cung cấp dinh dưỡng cho cây, phòng một số bệnh hại cho cây trồng, chất lượng phân được cao hơn. Các chế phẩm sinh học chứa nấm Trichoderma sp. này còn là chế phẩm sạch, tạo ra các sản phẩm cây trồng an toàn cho người tiêu dùng, không làm mất đi quần thể thiên địch có ích trong tự nhiên, không gây ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Vì những lý do trên, nên em chọn đề tài: “Thử nghiệm quy trình sản xuất sinh khối bào tử vi nấm phân huỷ cellulose và protein”. 2. Mục đích nghiên cứu Sản xuất sinh khối bào tử vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4. 3. Mục tiêu nghiên cứu Thử nghiệm quy trình lên men thể rắn thu bào tử vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 phân huỷ cellulose và protein. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào. Xác định độ ẩm nguyên liệu. 1
Lên men thu sinh khối bào tử. Kiểm tra chất lượng thu được. 5. Phương pháp nghiên cứu 5.1. Phương pháp luận Trước khi bắt đầu thực hiện đồ án, tôi đã tham khảo các nghiên cứu từ trước đến nay về nấm Trichoderma sp. cũng như các ứng dụng và lợi ích mà nó mang lại, và tôi đã chọn môi trường lên men xốp sản xuất bào tử Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 để thực hiện đồ án. 5.2. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Excel để tính toán và vẽ đồ thị biểu diễn. 5.3. Các kết quả đạt được Xác định quy trình sản xuất bào tử Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4. Chế phẩm bào tử Trichoderma sp. đạt mật độ 3,63.107 ± 1,28.106 (bào tử/g) và Aspergillus sp. SD4 đạt mật độ 2,98.1011 ± 4,31.109 (bào tử/g) có khả năng nảy mầm tương đương giống gốc. 5.4. Kết cấu ĐATN Kết cấu ĐATN có 4 chương gồm: Chương 1: Tổng quan về tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả Chương 4: Kết luận và kiến nghị 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về ủ compost 1.1.1. Khái niệm khoa học về ủ compost Hình 1.1. Chu trình ủ compost. Ủ compost được hiểu là quá trình phân hủy sinh học hiếu khí các chất thải hữu cơ được biến đổi thành các chất mùn ổn định do hoạt động của các tổ chức có thể sống trong điều kiện tự nhiên hiện diện trong chất thải. Các tổ chức này bao gồm các loại vi sinh vật, như vi khuẩn, nấm, chất thải hữu cơ được phân huỷ ban đầu từ sinh 3
vật tiêu thụ bậc một như vi khuẩn, nấm. Quá trình diễn ra chủ yếu giống như phân hủy trong tự nhiên, nhưng được tăng cường và tăng tốc bởi tối ưu hóa các điều kiện môi trường cho hoạt động của vi sinh vật. Lịch sử quá trình ủ compost đã có từ rất lâu, ngay từ khi khai sinh của nông nghiệp hàng nghìn năm trước Công nguyên, ghi nhận tại Ai Cập từ 3000 năm trước Công nguyên như là một quá trình xử lý chất thải nông nghiệp đầu tiên trên thế giới. Người Trung Quốc đã ủ chất thải từ cách đây 4000 năm, người Nhật đã sử dụng compost làm phân bón trong nông nghiệp từ nhiều thế kỷ. Tuy nhiên đến năm 1943, quá trìnhủ compost mới được nghiên cứu một cách khoa học và báo cáo bởi Giáo sư người Anh, Sir Albert Howard thực hiện tại Ấn Độ. Đến nay đã có nhiều tài liệu viết về quá trìnhủ compost và nhiều mô hình công nghệ ủ compost quy mô lớn được phát triển trên thế giới. Compost là sản phẩm giàu chất hữu cơ và có hệ vi sinh vật dị dưỡng phong phú, ngoài ra còn chứa các nguyên tố vi lượng có lợi cho đất và cây trồng. Sản phẩm compost được sử dụng chủ yếu làm phân bón hữu cơ trong nông nghiệp hay các ụm c đích cải tạo đất và cung cấp dinh dưỡng cây trồng. Ngoài ra, compost còn được biết đến trong nhiều ứng dụng, như là các sản phẩm sinh học trong việc xử lý ô nhiễm môi trường, hay các sản phẩm dinh dưỡng, chữa bệnh cho vật nuôi và cây trồng. Phương pháp ứng dụng vi sinh vật rất quan trọng trong quá trình ủ compost. Thực tế, hệ vi sinh vật cần thiết cho quá trình ủ compost đã cóẵ s n trong vật liệu hữu cơ, tự thích nghi và phát triển theo từng giai đoạn của quá trìnhủ compost. Các thành phần bổ sung thông thường có thể là sản phẩm sau ủ compost hay các thành phần giúp điều chỉnh dinh dưỡng (C/N). Việc bổ sung các chế phẩm có bản chất là vi sinh vật ngoại lai hay enzyme là không cần thiết mà vẫn có thể ủ compost thành công. Kiểm soát tốt các điều kiện môi trường ảnh hưởng tới hoạt động của vi sinh vật chính là nhân tố quyết định sự thành công của quá trìnhủ compost. Kiểm soát tốt quá trình ủ compost cũng giúp giảm phát sinh mùi ô nhiễm và loại bỏ các ầm m vi sinh vật gây bệnh. Vì vậy các giải pháp kỹ thuật trong công nghệ ủ compost hiện đại đều hướng 4
tới mục tiêu kiểm soát tối ưu các điều kiện môi trường cùng với khả năng vận hành thuận tiện. Đặc điểm cần lưu ý đối với ủ compost từ chất thải rắn đô thị là phân loại để loại bỏ các kim loại nặng hay các hóa chất độc hại khác vì chúng cản trở quá trình chuyển hóa và có nguy cơ gây ô nhiễm cho sản phẩm compost. 1.1.2. Mục đích của quá trình compost Ổn định chất thải: các phản ứng sinh học xảy ra trong quá trình compost sẽ chuyển hoá các chất hữu cơ dễ thối rửa sang dạng ổn định chủ yếu là các chất vô cơ ít gây ô nhiễm môi trường khi thải ra đất hoặc nước. Làm mất hoạt tính vi sinh vật: nhiệt của chất thải sinh ra từ quá trình phân huỷ sinh học có thể đạt khoảng 50-60oC, đủ để làm mất hoạt tính của vi khuẩn gây bệnh, virus có hại nếu như nhiệt độ này được duy trì ít nhất 3 ngày. Do đó, các sản phẩm của quá trình compost có thể loại bỏ an toàn trên đất sử dụng làm chất bổ sung dinh dưỡng cho đất. Thu hồi dinh dưỡng và cải tạo đất: các chất dinh dưỡng (N, P, K) có trong chất thải ở dạng hữu cơ phức tạp, cây trồng khó hấp thụ. Sau quá trình compost các chất - này được chuyển hoá thành các chất vô cơ như NO3 và PO4 thích hợp cho cây trồng. Sử dụng sản phẩm của quá trình chế biến compost bổ sung dinh dưỡng vô cơ tồn tại chủ yếu ở dạng không tan. Thêm vào đó, lớp đất trồng cũng được cải tiến nên giúp rễ cây phát triển tốt hơn. Tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng: đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới chứng minh cho khả năng kháng bệnh của cây được trồng trong đất có bón compost. Cho đến nay, ở Việt Nam compost chưa được ứng dụng rộng rãi trong nộng nghiệp. Với hàm lượng dinh dưỡng cao dễ hấp thụ và chũng loại vi sinh vật đa dạng, phân hữu cơ không những làm tăng năng suất cây trồng mà còn có khả năng kháng bệnh cao. 5
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến ủ compost Hiệu quả của quá trình ủ compost phụ thuộc vào nhóm các tổ chức cư ngụ và làm ổn định trong chất thải hữu cơ. Do đó quá trình ủ sẽ không đạt kết quả mong muốn mà nguyên nhân chính là do sự mất cân bằng về thành phần hoá học và điều kiện lý học trong quá trình ủ. Chính vì vậy cần chú ý đến các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ủ compost như nhiệt độ, độ ẩm, pH, vi sinh vật, oxy, tỷ lệ C/N và các cấu trúc chất thải. 1.1.3.1. Các yếu tố vật lý Các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến quá trình ủ gồm: nhiệt độ, độ ẩm, kích thước nguyên liệu, độ rỗng, thổi khí. a. Nhiệt độ Nhiệt độ là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của vi sinh vật trong quá trình chế biến phân hữu cơ và cũng là một trong các thông số giám sát và điều khiển quá trình ủ CTR. Trong luống ủ, nhiệt độ cần duy trì là 55-65oC , vì ở nhiệt độ này, quá trình chế biến phân vẫn hiểu quả và mầm bệnh bị tiêu diệt. Khi nhiệt độ tăng lên ngưỡng này sẽ ức chế hoạt động của VSV. Ở nhiệt độ thấp hơn, phân hữu cơ không đạt tiêu chuẩn về mầm bệnh. Nhiệt độ trong luống ủ có thể điều chỉnh bằng nhiều cách khác nhau như hiệu chỉnh tốc độ thổi khí và độ ẩm, cô lập khối ủ với môi trường bên ngoài bằng cách che phủ hợp lý. b. Độ ẩm Độ ẩm là một yếu tố cần thiết cho hoạt động của VSV trong quá trình chế biến phân hữu cơ. Vì nước cần thiết cho quá trình hoà tan chất dinh dưỡng vào nguyên sinh chất của tế bào. Độ ẩm tối ưu cho quá trình ủ phân CTR nằm trong khoảng 50-60oC. Các VSV đóng vai trò quyết định trong quá trình phân huỷ CTR thường tập trung tại lớp nước mỏng trên bề mặt của phân tử CTR. Nếu độ ẩm quá nhỏ (<30%) sẽ hạn chế hoạt động 6
của VSV, còn khi độ ẩm quá lớn (>65%) thì quá trình phân huỷ sẽ chậm lại, sẽ chuyển sang chế độ phân huỷ kỵ khí vì quá trình thổi khí bị cản trở do hiện tưởng bít kín các khe rỗng không cho không khí đi qua, gây mùi hôi, rò rĩ chất dinh dưỡng và lan truyền VSV gây bệnh. Độ ẩm ảnh hưởng đến quá trình thay đổi nhiệt độ trong quá trình ủ vì nước có nhiệt dung riêng cao hơn tất cả các vật liệu khác. Trong trường hợp độ ẩm của khối ủ thấp, có thể điều chỉnh bằng cách thêm nước vào. Còn khi độ ẩm của khối ủ cao có thể điều chỉnh bằng cách trộn với vật liệu độn có độ ẩm thấp hơn như mạt cưa, rơm rạ Độ ẩm của phân bắc, bùn, phân động vật thường cao hơn giá trị tối ưu, do đó cần bổ sung thêm các chất phụ gia để giảm độ ẩm đến giá trị cần thiết. Đối với hệ thống làm compost vận hành liên tục, độ ẩm có thể được khống chế bằng cách tuần hoàn sản phẩm compost. c. Kích thước nguyên liệu Kích thước nguyên liệu ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ phân huỷ. Quá trình phân huỷ hiếu khí xảy ra trên bề mặt hạt, hạt có kích thước nhỏ sẽ có tổng diện tích bề mặt lớn nên sẽ tăng sự tiếp xúc với oxy, gia tăng vận tốc phân huỷ. Tuy nhiên, nếu kích thước hạt quá nhỏ và hạn chế sự lưu thông khí trong đống ủ, điều này sẽ làm giảm oxy cần thiết cho các VSV trong đống ủ và giảm mức độ hoạt động của VSV. Ngược lại, hạt có kích thước quá lớn sẽ có độ xốp cao và tạo ra các rãnh khí làm cho sự phân bố khí không đều, không có lợi cho quá trình chế biến phân hữu cơ. Đường kính hạt tối ưu cho quá trình chế biến khoảng 3-50mm. Kích thước hạt tối ưu có thể đạt được bằng nhiều cách như cắt, nghiền và sàng vật liệu thô ban đầu. 7
d. Độ rỗng Độ rỗng của khối vật liệu ủ là một yếu tố quan trọng trong quá trình chế biến phân hữu cơ. Độ rỗng tối ưu sẽ thay đổi tuỳ loại vật liệu chế biến phân. Thông thường, để quá trình chế biến diễn ra tốt khoảng 35-60%, tối ưu là 32-36%. Độ rỗng của CRT ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình cung cấp oxy cần thiết cho sự trao đổi chất, hô hấp của VSV hiếu khí và sự oxy hoá các phân tử hữu cơ hiện diện trong lớp vật liệu ủ. Độ rỗng thấp sẽ hạn chế sự vận chuyển oxy, nên hạn chế sự giải phóng nhiệt và làm tăng nhiệt độ trong khối ủ. Ngược lại, độ rỗng cao có thể dẫn đến nhiệt độ trong khối ủ thấp, mầm bệnh không bị tiêu diệt. Độ rỗng có thể được điều chỉnh bằng cách sử dụng vật liệu cấu trúc với tỷ lệ trộn hợp lý. e. Thổi khí Khối ủ được cung cấp không khí từ môi trường xung quanh để VSV sử dụng cho sự phân huỷ chất hữu cơ, cũng như làm bay hơi nước và giải phóng nhiệt. Nếu khí không được cung cấp đầy đủ thì trong khối ủ có thể có những vùng kỵ khí, gây mùi môi. Lượng khí cung cấp cho khối phân hữu cơ có thể được thực hiện bằng cách: đảo trộn, sử dụng ống khí, đổ chất thải từ tầng lưu chất trên cao xuống thấp, thổi khí. Quá trình đảo trộn cung cấp khí không đủ theo cân bằng tỷ lệ. Điều kiện hiếu khí chỉ thoả mãn đối với lớp trên cùng, các lớp bên trong hoạt động trong môi trường tuỳ tiện hoặc kỵ khí. Do đó, tốc độ phân huỷ giảm và thời gian cần thiết để quá trình ủ phân hoàn tất bị kéo dài. Cấp khí bằng phương pháp thổi khí đạt hiệu quả phân huỷ cao nhất. Tuy nhiên, lưu lượng khí phải khống chế thích hợp. Nếu cấp quá nhiều khí sẽ dẫn đến chi phí quá cao và gây mất nhiệt của khối phân, kéo theo sản phẩm không đảm bảo an toàn vì có thể chứa VSV gây bệnh. Khi pH của môi trường trong khối phân lớn hơn 7, 8
cùng với quá trình thổi khí sẽ làm thất thoát nito dưới dạng NH3. Trái lại, nếu thổi khí ít quá môi trường bên trong khối phân trở thành kỵ khí. Vận tốc thổi khí cho quá trình ủ compost thường trong khoảng 5-10m3 khí/ tấn nguyên liệu/ giờ. 1.1.3.2. Các yếu tố hoá sinh a. Tỷ lệ C/N Có rất nhiều nguyên tố ảnh hưởng đến quá trình phân huỷ do VSV, trong đó C và N là cần thiết nhất, tỷ lệ C/N là thông số dinh dưỡng quan trọng nhất, quan trọng kế tiếp là nguyên tố photpho, lưu huỳnh, canxi. Các nguyên tố vi lượng khác cũng đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất tế bào. Khoảng 20-40% của chất thải hữu cơ cần thiết cho quá trình đồng hoá thành tế bào mới, phần còn lại chuyển hoá thành CO2, C cung cấp năng lượng và sinh khối cơ bản để tạo ra khoảng 50% khối lượng tế bào VSV. N là thành phần chủ yếu của protein, axit nucleic, axit amin, enzyme, co-enzyme cần thiết cho sự phát triển và hoạt động của tế bào. Tỷ lệ C/N tối ưu cho quá trình ủ phân khoảng 30:1. Ở tỷ lệ thấp hơn, N sẽ thừa và sinh ra khí NH3 gây ra mùi khai. Ở mức tỷ lệ cao hơn hạn chế sự phất triển của VSV do thiếu N. Chúng phải trải qua nhiều chu kỳ chuyển hoá, oxy hoá phần dư C cho đến khi đạt tỷ lệ C/N thích hợp. Do đó, thời gian cần thiết cho quá trình làm phân bị kéo dài hơn và sản phầm thu được chứa ít mùn hơn. Theo nghiên cứu cho thấy nếu tỷ lệ C/N ban đầu là 20, thời gian cần thiết cho quá trình làm phân là 12 ngày, nếu tỷ lệ này dao động trong khoảng 20-50, thời gian cần thiết là 14 ngày và nếu tỷ lệ C/N là 78, thời gian cần thiết sẽ là 21 ngày. Mặc dù vậy, tỷ lệ này cũng có thể được hiệu chỉnh theo giá trị sinh học của vật liệu ủ, trong đó quan trọng nhất là cần quan tâm tới các vật liệu ủ có hàm lượng lignin cao. Khi bắt đầu quá trình ủ phân, tỷ lệ C/N là 30:1 và giảm dần còn 15:1 ở các sản phẩm cuối cùng do 2/3 C được giải phóng tạo ra CO2 khi các hợp chất này bị phân huỷ bởi VSV. 9
Trong thực tế, việc tính toán và hiệu chỉnh chính xác tỷ lệ C/N tối ưu gặp phải khó khăn vì những lý do sau: -Một phần các chất như cellulose và lignin khó bị phân huỷ sinh học, chỉ bị phân huỷ sau một khoảng thời gian dài. -Một số chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV không sẵn có. b. Oxy Oxy cũng là một trong những thành phần cần thiết cho quá trình ủ phân. Khi VSV oxy hoá C tạo năng lượng, oxy sẽ được sử dụng và khí CO2 được sinh ra, khi không có đủ oxy thì sẽ trở thành quá trình yếm khí và tạo mùi hôi như mùi trứng gà thối của khí H2S. Các VSV hiếu khí có thể sống được ở nồng độ oxy bằng 5%. Nồng độ oxy lớn hơn 10% được coi là tối ưu cho quá trình ủ phân hiếu khí. Tổng lượng khí cần cung cấp và do lưu lượng dòng khí là các thông số quan trọng đối với hệ thống ủ phân trong thùng kín. Nhu cầu oxy thay đổi theo tiến trình ủ gián đoạn, do đó cần xác định nhu cầu oxy tối đa để chọn máy thổi khí và thiết kế ống phân phối khí phù hợp. c. Dinh dưỡng Ngoài một số nguyên tố đa lượng, quá trình chuyển hoá các chất hữu cơ nhờ hoạt động VSV cũng cần một số nguyên tố vi lượng khác như P, K, Ca, Fe, Bo, Cu Thông thường, các chất dinh dưỡng này không có giới hạn bởi chúng có mặt nhiều trong các vật liệu làm nguyên liệu cho quá trình ủ phân. d. pH Giá trị dinh dưỡng trong khoảng 5,5-8,5 là tối ưu cho các VSV trong quá trình ủ phân. Các VSV, nấm, tiêu thụ các hợp chất hữu cơ và thải ra các axit hữu cơ. Trong giai đoạn đầu của quá trình ủ phân, các axit này bị tích tụ và kết quả làm giảm pH, kìm hãm sự phát triển của nấm và VSV, kìm hãm sự phân huỷ của lignin và cellulose. 10
Các axit hữu cơ sẽ tiếp tục bị phân huỷ trong quá trình ủ phân. Nếu hệ thống trở nên yếm khí, việc tích tụ các axit có thể làm pH giảm xuống đến 4,5 và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt động của VSV. 1.1.4. Chất lượng của compost Chất lượng của compost được đánh giá dựa trên bốn yếu tố sau đây: - Mức độ lẫn tạp chất (thuỷ tinh, plastic, đá, kim loại nặng, chất thải hoá học, thuốc trừ sâu ). - Nồng độ các chất dinh dưỡng (dinh dưỡng đa lượng N, P, K, dinh dưỡng trung lượng Ca, Mg, S, dinh dưỡng vi lượng Fe, Zn, Cu, Mn, Mo, Co, Bo). - Mật độ VSV gây bệnh ( thấp đến mức không ảnh hưởng đến cây trồng). - Độ ổn định (độ chín) và hàm lượng chất hữu cơ ( độ ổn định liên quan đến nhiệt độ, độ ẩm và nồng độ oxy trong quá trình chế biến phân hữu cơ, độ ỏn định thường tỷ lệ nghịch với hàm lượng chất hữu cơ, khi thời gian ủ phân kéo dài, độ ổn định của phân sẽ tăng, tức là hàm lượng hữu cơ trong phân giảm). 1.1.5. Tính cấp thiết của compost Cải tạo cơ cấu. Quân bình độ pH trong đất. Tạo ra sự màu mỡ trong đất. Duy trì độ ẩm cho đất. Tạo ra môi trường tốt cho VSV có lợi sống trong đất. 1.1.6. Những lợi ích và hạn chế của quá trình làm compost 1.1.6.1. Lợi ích của quá trình làm compost 11
Ổn định chất thải rắn: các phản ứng sinh học xảy ra trong quá trình làm phân hữu cơ sẽ chuyển hoá chất hữu cơ dễ thối rữa sang dạng ổn định, chủ yếu là các chất vô cơ ít gây ô nhiễm môi trường khí thải và nước. Làm mất hoạt tính VSV gây bệnh: Nhiệt độ của chất thải sinh ra từ quá trình phân huỷ sinh vật có thể đạt đến 60oC, đủ để làm mất hoạt tính của VSV gây bệnh, virus và trứng giun sán nếu nhiệt độ này duy trì ít nhất một ngày. Do đó, sản phẩm của quá trình làm phân hữu cơ có thể thải bỏ trên đất hoặc sử dụng làm chất bổ sung dinh dưỡng cho đất. Thu hồi dinh dưỡng và cải tạo đất: các chất dinh dưỡng (N. P, K) có trong chất thải ở dạng hữu cơ phức tạp, cây trồng khó hấp thụ. Sau quá trình làm phân hữu cơ, - 3- các chất này được chuyển hoá thành các chất vô cơ như NO3 , PO4 thích hợp cho cây trồng. Sử dụng sản phẩm của quá trình chế biến phân từ CTR hữu cơ bổ sung dinh dưỡng cho đất, có khả nặng làm giảm sự thất thoát dinh dưỡng do rò rĩ các chất dinh dưỡng vô cơ tồn tại chủ yếu dưới dạng không tan. Thêm vào đó, lớp đất trồng cũng được cải tiến nên giúp rễ cây phát triển tốt hơn. Làm khô bùn: phân người, phân động vật và bùn chứa khoảng 80-95% nước, do đó chi phí thu gom, vận chuyển và thải bỏ cao. Làm khô bùn trong quá trình ủ phân là phương pháp lợi dụng nhiệt của chất thải sinh ra từ quá trình phân huỷ sinh học làm bay hơi nước chứa trong bùn. Tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng: với hàm lượng dinh dưỡng cao, dễ hấp thụ và chủng loại VSV đa dạng, phân hữu cơ không những làm tăng năng suất cây trồng mà còn làm giảm thiểu bệnh trên cây trồng. Đối với các loại phân hoá học khác cây trồng chỉ hấp thụ được một phần chất dinh dưỡng nhưng đối với phân hữu cơ cây trồng có khả năng hấp thụ hầu hết các chất dinh dưỡng, đồng thời cây trồng phát triển tốt và có khả năng kháng bệnh cao. 12
1.1.6.2. Hạn chế của quá trình làm compost Hàm lượng chất dinh dưỡng trong phân hữu cơ không thoã mãn yêu cầu. Do đặc tính của chất hữu cơ có thể thay đổi rất nhiều theo thời gian, khí hậu và phương pháp thực hiện, nên tính chất của sản phẩm cũng khác nhau. Bản chất vật liệu làm phân thường làm cho sự phân bố nhiệt độ trong đống phân không đồng đều. Do đó khả năng làm mất hoạt tính của VSV gây bệnh trong phân cũng không hoàn toàn. Quá trình làm phân hữu cơ thường tạo mùi hôi, gây mất mỹ quan 1.2. Vai trò của giống khởi động trong ủ compost 1.2.1. Trichoderma spp 1.2.1.1. Giới thiệu a. Phân loại Hình 1.2. Nấm Trichoderma spp. 13
Trichoderma spp, là giống nấm khá phổ biến trong tự nhiên, tuy nhiên hệ thống phân loại của chúng chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều ý kiến khác nhau đưa ra khi phân loại giống nấm này. Ngành:Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Moniliaceae Chi: Trichoderma Chúng có 89 loài như: Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichoderma cerinum, Trichoderma aggressivum, Trichoderma candidum, Trichoderma effusum b. Hình thái, sự sinh trưởng và sự hình thành bào tử của nấm Trichoderma spp Đặc điểm hình thái: Trichoderma spp, là một loại nấm đất, phát triển tốt trên các loại đất giàu dinh dưỡng hoặc trên tàn dư thực vật. Đặc điểm hình thái của nấm này là cành bảo tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn. Bào tử thường có màu xanh, đơn bào hình trứng, tròn, elip hoặc hình oval tuỳ theo từng loại. Bào tử đính ở đỉnh của cành. Sự sinh trưởng của Trichoderma spp: là một loại nấm sinh trưởng trong đất nên Trichoderma spp, có khả năng sử dụng nguồn hỗn hợp carbon và nitrogen. Nguồn carbon và năng lượng Trichoderma spp, sử dụng được là đường đơn và đường đa, cùng với hỗn hợp purines, pyrimidines acid amin, tannin, aldehydes và acid hữu cơ. Đặc biệt là acid béo, methanol methylamine, formate và NH3 là nguồn đạm bắt buộc phải có trong môi trường nuôi cấy Trichoderma spp. Môi trường có nhiều dinh dưỡng muối, các nguồn sulfur và các hỗn hợp như vitamin cũng có ảnh hưởng khá lớn đến 14
khả năng sinh trưởng của Trichoderma spp. Nhưng muối sodium chloride sẽ làm giảm sinh trưởng và phát triển của một số loại nấm Trichoderma spp. Do đó trong môi trường nuôi cấy không được có mặt của muối này. Nồng độ CO2 trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm Trichoderma spp. Tuy nhiên, ảnh hưởng của CO2 đến sinh trưởng và sản xuất của Trichoderma spp phụ thuộc vào nồng độ pH của môi trường trong đất. Nồng độ CO2 10% không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma spp. Tốc độ mọc nhanh của Trichoderma spp ở nồng độ CO2 cao trong môi trường kiềm. Điều này có thể giải thích vì sao Trichoderma spp thường sống trong môi trường đất phèn, ẩm ướt, ít hiện diện trên đất kiềm. Vì thế CO2 có ảnh hưởng đến sinh trưởng của Trichoderma spp tại độ pH có giá trị cao. Sự hình thành bào tử trên môi trường: phần lớn các loại Trichoderma spp có độ cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều kiện môi trường trong tự nhiên và nhân tạo dưới điều kiện tối sáng lẫn lộn, hay bào tử có thể xuất hiện trong điều kiện sáng. Nhiều tác giả công bố, Trichoderma spp không hình thành bào tử ở bước sóng dưới 254 nm hoặc trên 1100nm và hình thành nhiều bào tử ở bước sóng 380-440nm. Các hỗn hợp như azaguanie, 5- fluororacil, actiomycin D, cycloheximide, phennethyl alcohol và ethidium bromide ngăn cản sự hình thành các bào tử hậu, làm tăng khả năng phòng trừ sinh học của các nấm Trichoderma spp. c. Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến nấm Trichoderma spp Nhiệt độ: Trichoderma spp có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ khá rộng từ 15 đến 35oC, trong đó, ở nhiệt độ từ 15 đến 20oC Trichoderma spp chậm hình thành bào tử. Nhiệt độ 25-30oC là khoảng nhiệt độ tối ưu đế Trichoderma spp sinh trưởng và phát triển nhanh, lượng bào tử nhiều và thời gian sinh sản bào tử sớm. Ở 35oC Trichoderma spp phát triển kém, khả năng sinh bào tử yếu. Ánh sáng: với cường độ chiếu sáng liên tục, nấm phát triển nhanh, nhưng mật độ bào tử ít. Tối liên tục sợi nấm phát triển chậm, mật độ thưa, sợi nấm hình thành xong sau đó bào tử hình thành theo từng đợt rất rõ. Sáng tối xen kẽ sợi nấm hình thành nhiều (chỉ 2 ngày), mật độ dày, sau đó xuất hiện nhiều bào tử. 15
1.2.1.2. Vai trò của giống khởi động Trong những năm gần đây, cùng với xu hướng phát triển một nền nông nghiệp sạch và bền vững, các loại phân bón - thuốc bảo vệ thực vật hữu cơ hoặc có nguồn gốc sinh học được đề cao, tập trung nghiên cứu và phát triển. Cùng với chức năng nghiên cứu, chuyển giao công nghệ và sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm sinh học BIMA có chứa vi nấm Trichoderma sp. là loại nấm đối kháng có tác dụng cao trong việc thúc đẩy quá trình phân huỷ chất hữu cơ và có nhiều tác dụng, được dùng cho các loại cây trồng. Chống được các loại nấm bệnh cây trồng gây bệnh thối rễ, chết yểu, xì mủ, do các nấm bệnh gây nên (Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii, ). Tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm sống trong đất phát triển. Sinh tổng hợp các enzyme cellulase, chitinase, protease, pectinase, amlylase nên có khả năng phân giải tốt các chất xơ, chitin, lignin, pectin trong phế thải hữu cơ thành các đơn chất dinh dưỡng, tạo điều kiện cho cây hấp thu được dễ dàng. Kết hợp với phân hữu cơ có tác dụng cải tạo đất xốp hơn, chất mùn nhiều hơn, đất trồng có độ phì cao hơn. Hạn chế việc sử dụng các phân bón hoá học và thuốc trừ sâu hoá học độc hại. Có thể sử dụng kết hợp với một số chế phẩm vi sinh khác như biolactyl, subtyl, để sản xuất chế phẩm Microfost phân hủy phân hầm cầu, và xử lý đáy ao hồ nuôi tôm cá, khử mùi hôiở bãi phân, chuồng trại, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường; phối trộn để sản xuất phân hữu cơ vi sinh, phân hữu cơ sinh học, tăng cường khả năng chống nấm bệnh gây hại hệ thống rễ cây trồng và cải tạo đất. 16
a. Cơ chế ký sinh Đặc trưng của nấm Trichoderma spp là sống hoại sinh, đồng thời cũng sống kí sinh trên nấm gây bệnh cây (Cook và Baker, 1983). Nấm Trichoderma spp có khả năng ký sinh trên nhiều loại nấm bệnh quan trọng trên nhiều loại cây trồng như Scerotium Rolfsii, Fusarium Spp, Pythium, Macrophomina, Botrytis cenerea, Rhizoctonia solani Sự ký sinh là 1 tiến trình phức tạp qua nhiều giai đoạn: Đầu tiên là phát hiện ký chủ và tăng trưởng nhanh về hướng ký chủ để tiếp xúc với ký chủ. Sau đó quấn quanh hoặc tăng trưởng dọc theo ký chủ và hình thành nên cấu trúc giống như đĩa bám để xâm nhập vào vách tế bào ký chủ. b. Cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng Trichoderma sử dụng cùng ộ m t nguồn tài nguyên (dinh dưỡng, không gian sống) với các sinh vật gây bệnh nhưng Trichoderma spp "xâm chiếm" môi trường trước khi tác nhân không mong muốn đến. Trichoderma spp rất tích cực trong cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian với những sinh vật khác, thông qua định luật Gaue (nguyên tắc ức chế cạnh tranh). Các nguyên tắc cho rằng khi hai loài cạnh tranh cho các nguồn tài nguyên quan trọng (hay trong cùng ộm t môi trường) thì ộm t trong số họ cuối cùng sẽ rời khỏi môi trường cạnh tranh và dịch chuyển đi nơi khác hoặc có thể chết hoặc chúng có thể thíchứ ng với điều kiện môi trường khác thích hợp hơn để chúng có thể tồn tại không cạnh trạnh với loài cạnh trạnh với chúng. Đây được gọi là định luật Gause. 17
c. Cơ chế tiết enzyme Cơ chế quan trọng giúpTrichoderma spp đối kháng hiệu quả với nấm gây bệnh cây là nhờ vào khả năng tiết ra nhiều chất tiết của nấm Trichoderma spp. Trong đó enzyme là nhân tố quan trọng giúp Trichoderma có khả năng đối kháng dễ dàng lên cơ chất cũng như khả năng tấn công trực tiếp lên nấm bệnh. Các loại enzyme do Trichoderma spp tiết ra là: Endochitinase. Glucanase. 1,3-beta-glucosidase. Chitobiosidase. Trypsin. Chymotrypsin. Cellulose. Protease. N-acetyl-beta-P glucusaminidase (NAGase). Lypase Trong số các enzyme được tiết ra từ nấm Trichoderma spp thì Endochitinase và Glucanase 1,3-beta-glucosidase đóng vai trò rất quan trọng trong hoạt động ký sinh của nấm Trichoderma spp. Do vách tế bào hầu hết các loài nấm đều được cấu tạo bởi chitin và glucan nên tác động đồng thời của 2 loại enzyme này sẽ làm tăng khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp (Margolles Clark và ctv., 1995). 18
d. Khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng của nấm Trichoderma spp Trichoderma spp định cư ở vùng rễ như những vi sinh vật cộng sinh khác, sự định cư mang lại lợi ích cho cả cây trồng lẫn Trichoderma spp. Huyền phù của Trichoderma spp vào trong đất làm tăng sự nảy mầm, tăng khả năng ra hoa, tăng trọng lượng và chiều cao của các loại hoa màu: ớt bắp, cà chua, (Bailey & Landsmen, 1998). Trichoderma spp còn có khả năng tiết ra các chất điều hòa sinh trưởng giúp kích thích rễ cây phát triển nhanh và mạnh hơn giúp rễ phát triển khỏe, tăng khả năng hút dinh dưỡng, đề kháng với các nhân tố gây stress, tăng khả năng phòng vệ của cây, giảm khả năng nhiễm bệnh (Newsham và ctv.,1995). e. Kích thích tính kháng lưu dẫn và định cư bảo vệ rễ Định cư bảo vệ rễ: Trichoderma spp có thể định cư trên bề mặt rễ, chúng hình thành khuẩn lạc trên rễ, một số dòng có khả năng kiểm soát ở vùng rễ cao. Chúng định cư và phát triển khi rễ tăng trưởng. Kích thích tính kháng lưu dẫn: ngoài khả năng tấn công trực tiếp mầm bệnh, Trichoderma spp còn có khả năng kích thích tính kháng lưu dẫn 1 số nấm bệnh. Một vài dòng được thành lập nhanh, định cư lâu dài trên bề mặt rễ và thâm nhập trong biểu bì và tế bào, chúng hình thành và giải phóng một số thành phần khác nhau làm kích thích tính kháng lưu dẫn và gây ra sự thay đổi quan trọng trong cơ chế chuyển hóa protein thực vật. 1.2.2. Aspergillus 1.2.2.1. Giới thiệu a. Phân loại 19
Hình 1.3. Vi nấm Aspergillus spp -Năm 1729 P. A. Micheli lần đầu tiên mô tả chi Aspergillus. -Năm 1900, Lindau lại xếp Aspergillus vào trật tự: Lớp: Fungi imperfect. Bộ: Hynphomycetes. Họ: Mucedinaceae. Họ phụ: Aspergillaceae. Chi: Aspergillus. -Năm 1950, Bessey đã xếp Aspergillus vào hai lớp khác nhau: Lớp 1: Ascomycetes. Lớp 2: Ascomycetes. Bộ: Aspergillaces. Bộ: Moniliales. Họ: Aspergillaceae. Họ: Moniliaceae. Chi: Eurotium. Chi: Aspergillus. 20
-Năm 1962, Alexopoulos trong cuốn “Introductory Mycology” đã xếp Aspergillus vào hai lớp: Ascomycetes (khi người ta tìm thấy hình thức sinh sản của nó) và Form class: Deuteromycetes (ơ trường hợp còn lại). Lớp: Ascomycetes. Lớp: Deuteromycetes. Dưới lớp: Euroascomycetidae. Bộ: Moniliales. Bộ: Eurotiales. Họ: Moniliacea. Họ: Eurotiaceae. Chi: Aspergillus. Chi: Eurotium, Sartorya, Emerycella (hình thức vô tính Asperillus) -Năm 1973, Ainworth đã xếp Aspergillus thuộc tổ chi Phialoconidiae lớp Hyphomycetes, ngành phụ nấm bất toàn Deuteromycotina -Năm 1977, Bùi Xuân Đồng căn cứ vào đặc điểm hình thái phát sinh BTT của Deuteromycota đã xếp chi Aspergillus vào tổ chi Phialocolidiae, lớp phụ Euhiphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ nấm bất toàn (Bùi Xuân Đồng, 2001). -Năm 2000, Robert K Noyd, lại xếp Aspergillus thuộc họ Monilaceae, bộ Moniliales, lớp Hyphomycetes, ngành Deuteromycota. Giống Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đó có các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae , có giá trị sử dụng trong sản xuất enzyme, rượu, acid hữu cơ 21
b. Hình thái Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu tiên vào năm 1729. Năm 1901 Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này. Hình thái Aspergillus có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không nằm trong bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu 5-6 x 20-30 µm, đôi khi 6-10 x 60-70 µm, màu đen. Thể bình gồm hai lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai, bào tử đính xoè ra, có hình cầu xù xì, có gai nhọn, có màu nâu đen đến đen than, đường kính 4-5 µm. c. Đặc điểm sinh học Aspergillus sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu 6-8oC và tối đa 45-47oC; tối ưu 28-35oC, trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23%. Độ ẩm môi trường thích hợp để lên men bán rắn là 60-65%; nó chỉ sinh trưởng và phát triển khi có mặt O2 ở pH tối ưu là 4-6,5; tuy nhiên, theo Patt (1981) cũng có những chủng sinh trưởng được ở pH 2. Sự thay đổi pH môi trường nuôi cấy từ 3 đến 6,5 làm thay đổi đáng kể hình thái của Aspergillus. d. Đặc điểm sinh hoá Khả năng lên men đường: Aspergillus có khả năng đồng hoá tốt các loại đường đơn và đôi như glucose, fructose, maltose, xylose, manose, saccharose. Khả năng tổng hợp enzyme: +α-amylase: có khả năng tổng hợp α-amylase ngoại bào để thuỷ phân nhanh tinh bột tạo dextrin và một ít maltose và glucose. +Protease: Theo Lương Đức Phâm, Aspergillus có khả năng tạo hai loại protease. Loại thứ nhất phân giải protein thành polypeptid, pepton, còn loại thứ hai tiếp tục chuyển hoá cản sản phẩm trên thành acid amin. pH và nhiệt độ tối thích cho hoạt động của chúng tương ứng là 3 – 4 và 50oC. 22
+Cellulase: là một phức hợp enzyme, chủ yếu là cellulase C1, cellulase Cx và β-glucosidase hay cellobiase. Cellulase có tác dụng thuỷ phân cellulase thành cellbiose rồi thành glucose. +Pectinase: Aspergillus có khả năng tạo pectinase ở nhiệt độ tối thích 25oC và pH 5,6. Tuy nhiên enzyme thể hiện hoạt tính trong khoảng pH 2,5-6,8. 1.2.2.2. Vai trò giống khởi động Từ lâu, người ta đã dùng một số loại như Aspergillus niger để sản xuất các chế phẩm sinh học như acid hữu cơ, các loại enzyme, các chế phẩm giàu protein , phục vụ phát triển công nghệ thực phẩm, dược phẩm chăn nuôi Trong đó enzyme là nhân tố quan trọng giúpAspergillus có khả năng đối kháng dễ dàng lên cơ chất cũng như khả năng tấn công trực tiếp lên nấm bệnh. Các loại enzyme do Aspergillus sp. tiết ra là: Amylase. Glucoamylase. Pectinase. Protease. Celullase Chitinase Do vách tế bào hầu hết các loài nấm đều được cấu tạo bởi chitin và glucan nên tác động đồng thời của 2 loại enzyme này sẽ làm tăng khả năng đối kháng của nấm Aspergillus spp (Margolles Clark và ctv., 1995). 23
1.3. Quy trình sản xuất bào tử nấm làm giống khởi động 1.3.1. Giới thiệu các quy trình và phân tích ưu nhược điểm Để sản xuất chế phẩm bào tử quy mô công nghiệp, người ta có thể áp dụng các hai phương pháp lên men thể rắn, lên men thể lỏng và lên men bề mặt. Ưu nhược điểm của lên men thể rắn. Ưu điểm: Sản xuất được ở quy mô nhỏ đến trung bình. Ít tốn chi phí lao động. Khối lượng nấm thu được cao. Tận dụng được nguồn nguyên liệu rẻ. Nhược điểm: Không sản xuất được trên quy mô công nghiệp lớn. Ưu nhược điểm của lên men thể lỏng. Ưu điểm: Kiểm soát được quá trình lên men. Tiết kiệm được nguồn nguyên liệu. Sử dụng các loại máy móc thiết bị như bơm, ống dẫn có khả năng sản xuất với quy mô công nghiệp lớn. Nhược điểm: Khối lượng nấm thu được ít. Tốn nguồn lao động. 24
Kết hợp lên men xốp và lên men thể lỏng: giai đoạn nhân giống quy mô nhỏ thực hiện nhờ lên men thể lỏng, lên men chính áp dụng lên men rắn. Lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm: phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm đã được thực hiện bởi Evlacchova (1968). Môi trường dinh dưỡng được nấu sôi ở 100oC, và khi nguội cho thêm chất kháng sinh Streptomycine (0,01%) để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men. Tuy nhiên với phương pháp này bào tử chỉ phát triển trên bề mặt chất lỏng, nên hiệu quả sử dụng thiết bị kém, khó tăng quy mô sản xuất. 1.3.2. Sản xuất bào tử bằng phương pháp lên men bề mặt hay lên men xốp Lên men xốp được gọi là lên men xốp là do đặc tính xốp của môi trường nuôi cấy để thông khí và độ ẩm vừa đủ để nấm phát triển. Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất vì đây là quá trình lên men đơn giản, dễ thành công hơn các quy trình khác. Dưới đây là sơ đồ công nghệ tổng quát quy trình sản xuất bào tử bằng lên men xốp. 25
Nguyên liệu (môi trường nuôi cấy) Chuẩn bị môi trường (nguồn C, khoáng, độ thoáng, độ ẩm) Thanh/ Tiệt trùng Cấy giống Lên men bề mặt Sấy Thu bào tử Tạo chế phẩm Đóng gói Hình 1.4. Quy trình sản xuất bào tử. 26
Thuyết minh quy trình: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy lên men thể rắn: Môi trường lên men xốp thường bao gồm nguồn năng lượng, đồng thời là nguồn C, nguồn N, khoáng. Quan trọng là phải có giá thể để tạo độ xốp ( độ thoáng khí) cho môi trường và độ ẩm thích hợp. Thành phần các loại môi trường dùng để lên men xốp: *Bột gạo + bã động phộng. *Cám gạo + bột ngô. *Cám gạo + bột ngô + bột đâu nành. *Cám gạo + bột ngô + bã đâu khô. *Lúa. *Hạt ngô khô. *Bánh dầu + cám gạo. *Bã neem + cám gạo. *Bã mía + cám gạo. Ngoài ra, các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Tú (1997) còn thử nghiệm trên 3 loại môi trường khác để nhân sinh khối Trichoderma spp đó là: *Môi trường cám, trấu. *Môi trường than, bùn. *Môi trường bột thạch cao tẩm mật rĩ 10%. Thành phần môi trường dinh dưỡng và các thông số của môi trường như độ thông thoáng, độ ẩm thường là những thông tin phụ thuộc vào hoàn cảnh sản xuất cụ thể. Môi trường dinh dưỡng tối ưu để đạt mật độ bào tử cao nhất vẫn luôn là ẩn số 27
với mỗi chủng Trichoderma spp, tương tự độ ẩm môi trường phụ thuộc vào từng chủng, kích thước hạt thành phần môi trường, độ ẩm không khí và thường do mỗi nhà sản xuất tự xác dịnh trong điều kiện của mình. Quá trình lên men: Lên men xốp có thể tiến hành với nhiều thiết bị: +Bao plastic. +Khay đơn. +Khay trong tủ ủ. +Buồng khay. +Thiết bị có khuấy trộn hoặc thối khí. Điều kiện lên men rất đơn giản, nhiệt độ thường, độ ẩm không khí 95-100%, thời gian 5-8 ngày thu bào tử. Độ ẩm canh trường cũng thấp (50-60%) nên các quá trình thu hồi sản phẩm đơn giản, ít tốn kém. Quá trình thu hồi sản phẩm: Sau khi bào tử hình thành và sử dụng hết cơ chất, toàn bộ sinh khối được chuyển qua sấy nhiệt độ thấp không quá 40oC bằng phương pháp sấy đối lưu áp suất thường hay sấy chân không. Tạo chế phẩm: Bào tử sau khi sấy có thể trực tiếp đưa vào tạo chế phẩm sau khi nghiền mịn, trường hợp này chất mang chủ yếu là môi trường còn dư. Để thu bào tử đồng nhất và bảo quản tốt hơn, người ta có thể sử dụng thiết bị hút chân không Mycoharvester. 28
Hình 1.5. Máy hút chân không tách bào tử ra khỏi cơ chất còn dư Mycoharvester. Bảo quản: Khi nuôi giống nấm khởi động trên môi trường xốp Solivey F.F (1984), cho biết đã đạt hiệu suất bào tử so với các phương pháp lên men khác để chống sâu bệnh. Tuy nhiên, khả năng sống của bào tử chế phẩm phụ thuộc không chỉ vào điều kiện bảo quản mà còn phụ thuộc vào sự sấy khô và cơ chất dinh dưỡng. Kết quả cho thấy giống đối kháng nếu bảo quản ở nhiệt độ từ 5-10oC có thể giữ được hoạt tính trong 6-8 tháng. Ngược lại bảo quản ở nhiệt độ thường thì chỉ giữ được khoảng 6-8 tuần. Vì vậy, giống nấm khởi động được sản xuất ra cần phải được bảo quản trong nhiệt độ lạnh, nơi khô ráo và có khả năng giữ được hoạt tính trong 6-8 tháng. 29
1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất giông khời động ủ compost ở Việt Nam Trong những năm gần đây, cùng với xu hướng phát triển một nền công nghiệp sạch và bền vững, các loại phân bón, thuốc bảo vệ thực vật hữu cơ hoặc có nguồn gốc sinh học được đề cao, tập trung nghiên cứu và phát triển. Cùng với chức năng nghiên cứu, chuyển giao công nghệ và sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm sinh học BIMA có chứa vi nấm Trichoderma sp. là loại nấm đối kháng có tác dụng cao trong việc thúc đẩy quá trình phân huỷ chất hữu cơ và có nhiều tác dụng, được dùng cho các loại cây trồng, có công dụng tiêu diệt và khống chế ngăn ngừa các loại nấm bệnh hại cây trồng gây bệnh xì ủ m , vàng lá thối rễ, chết yểu, héo rũ như: Rhizoctonia solani, Fusarium, Pythium, Phytophthora sp., Sclerotium rolfsii, tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển sống trong đất trồng kích thích sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ cây trồng, phân giải tốt các chất xơ, chitin, lignin, pectin trong phế thải hữu cơ thành các đơn chất dinh dưỡng, giúp cho cây hấp thu được dễ dàng, kết hợp với phân hữu cơ có tác dụng cải tạo đất xốp hơn, chất mùn nhiều hơn, tăng mật độ côn trùng có ích và giữ được độ phì của đất. 30
Hình 1.6. Chế phẩm sinh học BIMA. Ngoài ra, trên thị trường còn có các chế phẩm khác như Nolatri của công ty TNHH công nghệ Nông Lâm, chế phẩm Trichoderma sp. - ĐH Cần Thơ, chế phẩm Tam Nông của công ty TNHH Tâm Nông chứa đến 2 triệu bào tử Trichoderma sp. trong 1 gam chế phẩm 31
Hình 1.7. Chế phẩm sinh học NOLATRI. 32
Hình 1.8. Chế phẩm Trichoderma sp. - ĐH Cần Thơ. Hình 1.9. Chế phẩm Tam Nông Trichoderma sp 33
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Các chủng nấm dùng trong nghiên cứu Chủng nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 được phòng thí nghiệm cung cấp. 2.1.2. Thành phần môi trường nuôi cấy nấm trong phòng thí nghiệm và lên men xốp D-glucose. Agar. Khoai tây. Cám gạo. Trấu. Các khoáng thông dụng. 2.1.3. Bình tam giác để lên men thể rắn Bình tam giác thể tích 250 ml, nút bông. 2.2. Dụng cụ và thiết bị 2.2.1. Dụng cụ Các dụng cụ thuỷ tinh thông dụng dùng cho phân tích của phòng thí nghiệm. 2.2.2. Thiết bị Tủ sấy MEMMERT, Germany. Tủ cấy ESCO AIRS TREAM, Indonesia. Nồi hấp HL-340 SPEEDS AUTOCLAVE. 2.3. Phương pháp -Mục đích: sản xuất sinh khối bào tử vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp SD4. 34
-Mục tiêu: thử nghiệm quy trình lên men thể rắn thu bào tử vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 phân huỷ cellulose và protein. -Nội dung như sau: Khảo sát hình thái và hoạt tính enzyme ngoại bào tử của vi nấm Thử nghiệm quy trình lên men thể rắn thu bào tử vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 Kiểm tra chất lượng bào tử thu được bằng phương pháp lên men xốp Thí nghiệm kiểm tra khả năng nảy mầm Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm. 2.3.1. Nuôi cấy và quan sát hình thái của nấm 2.3.1.1. Quan sát hình thái đại thể Dùng que cấy móc vô trùng gạt nhẹ lên bào tử đính của nấm sợi chuyển sang đĩa petri chưa môi trường PGA, cắm đầu que xuống mặt thạch 1-3 điểm. Quan sát khuẩn lạc của nấm sợi (hình dạng, màu sắc) ở mặt trên và mặt dưới của khuẩn lạc. 2.3.1.2. Quan sát hình thái vi thể (phương pháp phòng ẩm) -Nguyên tắc: Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với các thành phần khác của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững. 35
Thường để quan sát hình thái cấu trúc sợi nấm và các cơ quan sinh sản của nấm ở trạng thái tự nhiên có thể làm phương pháp phòng ẩm. -Cách thực hiện: Dùng kẹp đặt giấy lọc vô trùng có đường kính 9cm vào đĩa petri đã hấp khử trùng. Đặt thanh thủy tinh hình chữ U vô trùng lên trên giấy lọc Đổ 4ml nước cất vô trùng lên giấy lọc để tạo độ ẩm Dùng kẹp đặt lame lên thanh chữ U Dùng dao ổm vô trùng cắt một miếng thạch hình vuông khoảng 5mm từ đĩa thạch. Cấy bào tử nấm mốc lên cả mặt trên và đáy của miếng thạch. Đặt miếng thạch lên lame sao cho có ộm t mặt cấy bào tử được đặt xuống mặt lame. Đậy lamel lên bề mặt khối thạch. Đậy nắp đĩa petri và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48h. Hình 2.2. Đĩa petri được thực hiện phương pháp phòng ẩm. 36
2.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào 2.3.2.1. Xác định hoạt tính cellulase ngoại bào a. Môi trường NaNO3 0,4 g K2HPO4 0,2 g MgSO4 0,1 g KCl 0,1 g CMC 1g (0,5%) Peptone 0,04 g Agar 2,5 g Nước 200ml b. Tiến hành Pha 200ml môi trường CMC cho vào chai thuỷ tinh 200ml, rồi đậy kính nắp đem hấp khử trùng với 6 đĩa petri sạch đã được gói kỹ. Sau khi hấp khử trùng lấy ra chờ nguội, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, ta lần lượt đổ môi trường vào 6 đĩa, sau đó chờ cho môi trường nguội và đặc lại. Sau đó, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, lấy 6 đĩa môi trường CMC tiến hành dùng que cấy nhọn đã khử trùng lấy 1 bào tử nấm phân lập được trong ống nghiệm môi trường PDA, cấy bào tử vi nấm lên điểm giữa của đĩa môi trường. Bảo quản ở nhiệt độ phòng, sau 2 ngày lấy ra quan sát. 37
2.3.2.2. Xác định hoạt tính chitinase ngoại bào a. Môi trường MSM (g/l) MgSO4.7H20 0,2 g K2HPO4 0,9 g KCl 0,2 g NH4NO3 1 g FeSO4.7H2O 0,002 g MnSO4 0,002 g ZnSO4 0,002 g Đệm phosphate 50mM pH 6.3. Nguồn C phát hiện: Colloidiol chitin 0,5% + Glucose 0,5%. b. Tiến hành Pha 200ml môi trường MSM cho vào chai thuỷ tinh 200ml, rồi đậy kính nắp đem hấp khử trùng với 6 đĩa petri sạch đã được gói kỹ. Sau khi hấp khử trùng lấy ra chờ nguội, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, ta lần lượt đổ môi trường vào 6 đĩa, sau đó chờ cho môi trường nguội và đặc lại. Sau đó, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, lấy 6 đĩa môi trường MSM tiến hành dùng que cấy nhọn đã khử trùng lấy 1 bào tử nấm phân lập được trong ống nghiệm môi trường PDA, cấy bào tử vi nấm lên điểm giữa của đĩa môi trường. 2.3.2.3. Xác định hoạt tính amylase ngoại bào a. Môi trường MSM (g/l) MgSO4.7H20 0,2 g K2HPO4 0,9 g 38
KCl 0,2 g NH4NO3 1 g FeSO4.7H2O 0,002 g MnSO4 0,002 g ZnSO4 0,002 g Đệm phosphate 50mM pH 6.3. Nguồn C phát hiện: Tinh bột 0,5% + Glucose 0,5%. b. Tiến hành Pha 200ml môi trường MSM cho vào chai thuỷ tinh 200ml, rồi đậy kính nắp đem hấp khử trùng với 6 đĩa petri sạch đã được gói kỹ. Sau khi hấp khử trùng lấy ra chờ nguội, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, ta lần lượt đổ môi trường vào 6 đĩa, sau đó chờ cho môi trường nguội và đặc lại. Sau đó, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, lấy 6 đĩa môi trường MSM tiến hành dùng que cấy nhọn đã khử trùng lấy 1 bào tử nấm phân lập được trong ống nghiệm môi trường PDA, cấy bào tử vi nấm lên điểm giữa của đĩa môi trường. 2.3.2.4. Xác định hoạt tính protease ngoại bào a. Môi trường MSM (g/l) MgSO4.7H20 0,2 g K2HPO4 0,9 g KCl 0,2 g NH4NO3 1 g FeSO4.7H2O 0,002 g MnSO4 0,002 g 39
ZnSO4 0,002 g Đệm phosphate 50mM pH 6.3. Nguồn C phát hiện: Casein 0,5% + Glucose 0,5%. b. Tiến hành Pha 200ml môi trường MSM cho vào chai thuỷ tinh 200ml, rồi đậy kính nắp đem hấp khử trùng với 6 đĩa petri sạch đã được gói kỹ. Sau khi hấp khử trùng lấy ra chờ nguội, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, ta lần lượt đổ môi trường vào 6 đĩa, sau đó chờ cho môi trường nguội và đặc lại. Sau đó, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, lấy 6 đĩa môi trường MSM tiến hành dùng que cấy nhọn đã khử trùng lấy 1 bào tử nấm phân lập được trong ống nghiệm môi trường PDA, cấy bào tử vi nấm lên điểm giữa của đĩa môi trường. 2.3.2.5. Xác định hoạt tính pectinase ngoại bào a. Môi trường NaNO3 0,4 g K2HPO4 0,2 g MgSO4 0,1 g KCl 0,1 g Pectin 1g (0,5%) Peptone 0,04 g Agar 2,4 g Nước 200ml 40
b. Tiến hành Pha 200ml môi trường Pectin cho vào chai thuỷ tinh 200ml, rồi đậy kính nắp đem hấp khử trùng với 6 đĩa petri sạch đã được gói kỹ. Sau khi hấp khử trùng lấy ra chờ nguội, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, ta lần lượt đổ môi trường vào 6 đĩa, sau đó chờ cho môi trường nguội và đặc lại. Sau đó, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, lấy 6 đĩa môi trường Pectin tiến hành dùng que cấy nhọn đã khử trùng lấy 1 bào tử nấm phân lập được trong ống nghiệm môi trường PDA, cấy bào tử vi nấm lên điểm giữa của đĩa môi trường. Bảo quản ở nhiệt độ phòng, sau 2 ngày lấy ra quan sát. 2.3.3. Xác định độ ẩm nguyên liệu 2.3.3.1. Nguyên tắc Dùng sức nóng làm bay hơi hết nước trong mẫu. Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu. 2.3.3.2. Dụng cụ và vật liệu Tủ điều chỉnh nhiệt độ (100oC – 105oC). Cân phân tích. Bình hút ẩm phía dưới để chất hút ẩm (CaCl2, Na2SO4 khan, H2SO4 đậm đặc hoặc Silicagen ). Cốc sứ. 41
2.3.3.3. Cách tiến hành Lấy cốc sứ và cốc đem cân, sau đó bỏ 10 g mẫu vào cốc cân. Cho tất cả vào tủ sấy ở 100-103oC, cho vào tủ sấy 6h. Sấy xong, làm nguội trong bình hút ẩm (20-25 phút) và đem cân ở cân phân tích. Cho lại vào tủ sấy 100-103oC trong 30 phút, lây ra làm nguội trong bình hút ẩm (20 - 25 phút) và đem cân như trên tới khi trọng lượng không đổi. Kết quả giữa hai lần cân liên tiếp không được cách nhau quá 0,5mg cho mỗi gam mẫu thử. 2.3.3.4. Tính kết quả Độ ẩm theo phần trăm tính theo công thức: (m1 m2).100 X m1 m Trong đó: m: trọng lượng cốc và nắp (g). m1: trọng lượng cốc có nắp và mẫu trước khi sấy (g). m2: trọng lượng cốc có nắp và mẫu sau khi sấy (g). Sai lệch giữa hai lần xác định song song không được lớn hơn 0,5%. Kết quả cuối cùng là trung bình của 2 lần lặp lại song song. 42
2.3.4. Quy trình lên men thu sinh khối bào tử Giống thạch nghiêng Nhân gi ống Lên men thu sinh khối b ào tử Đo mật độ quang Khả năng nảy mầm Hình 2.3. Quy trình lên men thu bào tử. 43
2.3.4.1. Môi trường nuôi cấy Trichoderma sp. a. Môi trường PDA (potatoe D-gulocose agar)  Khoai tây 200 g  D-glucose 20 g  Agar 20 g  Nước cất 1000 ml  Kháng sinh chloramphenycol Hấp khử trùng 121oC trong 15 phút. Cách tiến hành: Khoai tây gọt vỏ, cắt vỏ và nấu chín. Chiết lấy dịch khoai tây. Cho agar vào dich khoai tây từ từ và khuấy liên tục, sau đó cho D-glucose vào và tiếp tục khuấy, cho thêm 1 ít kháng sinh chloramphenycol. Đổ vào ống nghiệm, đậy nút bông và khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Để thạch nghiêng, chờ nguội, cấy giống. b. Nhân giống Giống gốc được giữ trong ống nghiệm sau đó tiến hành cấy truyền qua đĩa petri môi trường PDA. 2.3.4.1. Môi trường lên men xốp Cám gạo độ ẩm 72% 21 g Trấu 9 g MT Czapek 13,5 ml 44
MT Czapek: NaNO3 3 g K2HPO4 1 g MgSO4.7H2O 1 g FeSO4.7H2O 0,1 g Saccharose 30 g KCl 0,5 g Nước cất đủ 1000 ml Hấp khử trùng 121oC trong 15 phút. Hình 2.4. Chuẩn bị môi trường trong bình tam giác có nút bông để lên men thể rắn. 45
a. Cách tiến hành Tiến hành cân cám và trấu. Trộn đều cám và trấu với môi trường Czapek. Sau đó cho vào bình tam giác và nhét nút bông, đem khử trùng ở 121oC trong 15 phút. b. Cấy giống Giống bào tử trên đĩa petri sau 7 ngày ủ, được phân thành các cạnh bằng nhau bằng cách kẻ dưới đáy các ô vuông có cạnh là 1 cm. Trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, lấy 5 đĩa petri môi trường PDA tiến hành dùng dao cắt vào môi trường theo các đường kẻ dưới đáy đĩa, nhẹ nhàng dùng dao lấy từ 3-4 lát môi trường PDA đã có giống nấm Trichoderma sp. cấy vào bình tam giác đã có môi trường, sau đó nhanh chóng dùng que thuỷ tinh đã khủ trùng trộn nhẹ môi trường trong bình tam giác. Ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng, nơi thoáng mát, không có ánh sáng trực tiếp, sau 12 ngày lấy ra quan sát và đo mật độ quang. Hình 2.5. Bào tử Trichoderma sp. (trái) và Aspergillus sp.SD4 (phải) sau 12 ngày nuôi cấy. 46
2.3.4.2. Phương pháp đo OD (đo mật độ quang) a. Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định. Nấm Trichoderma sp. hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 600 nm. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 600 nm của các mẫu cho phép xác định nồng độ nấm Trichoderma sp. trong mẫu. b. Các bước đo OD Chuẩn bước sóng về 600nm. Lấy nước muối sinh lý bổ sung 0,1% Tween 80 vào cuvet (d = 1 cm, V = 4 ml), đo đối chứng. Đo mật độ quang của huyền phù bào tử. Hình 2.6. Huyền phù bào tử Trichoderma sp. được pha loãng để đo OD. 47
2.4. Nội dung nghiên cứu 2.4.1. Khảo sát hình thái và hoạt tính enzyme ngoại bào tử của vi nấm Làm tương tự như phương pháp nêu ở mục 3.3.1. 2.4.2. Thử nghiệm quy trình lên men thể rắn thu bào tử vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 Ta thực hiện lên men thể rắn dựa vào quy trình sau đây: Giống thạch nghiêng Nhân giống Lên men thu sinh khối bào tử Đo mật độ quang Khả năng nảy mầm Hình 2.7. Quy trình lên men thu bào tử. 48
2.4.3. Kiểm tra chất lượng bào tử thu được bằng phương pháp lên men xốp Sau khi đã lên men thể rắn thu sinh khối bào tử vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4, ta tiến hành đo mật độ quang để đo số bào tử vi nấm thu được. 2.4.4. Thí nghiệm kiểm tra khả năng nảy mầm Cấy bào tử nấm Trichoderma sp. từ ống nghiệm qua đĩa petri. Cấy bào tử nấm Trichoderma sp. trong bình tam giác qua đĩa petri. Sau đó đem so sánh bán kính khuẩn lạc nảy mầm. 49
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1. Khảo sát hình thái và hoạt tính enzyme ngoại bào của nấm Vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 được ứng dụng để làm phân ủ compost, có khả năng sinh tổng hợp các enzyme cellulase, chitinase, protease, pectinase, amlylase nên có khả năng phân giải tốt các chất xơ, chitin, lignin, pectin trong phụ phế phẩm nông nghiệp. Chính vì vậy các giống này thường được sử dụng để sản xuất giống khởi động ủ phân compost. Bước đầu tiên trong quy trình sản xuất giống khởi động là khảo sát hình thái xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 có ịb nhiễm hay thoái hóa giống hay không 3.1.1. Khảo sát hình thái của nấm 3.1.1.1. Hình thái Trichoderma sp Hình thái khuẩn lạc Trichoderma sp. được trình bày trên hình 3.1 2 ngày 4 ngày 6 ngày Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc Trichoderma sp. sau 2, 4, 6 ngày nuôi cấy. Qua hình trên, ta thấy được nấm Trichoderma sp. có tốc độ phát triển nhanh chỉ trong vòng 6 ngày nó đã lan ra khắp bề mặt của đĩa petri. Sợi tơ màu trắng xuất hiện trong những ngày đầu sau đó xuất hiện bào tử màu xanh. 50
A) B) Hình 3.2. Bào tử Trichoderma sp. quan sát dưới kính hiển vi A) Hệ số phóng đại X100; B) Hệ số phóng đại X1000. Quan sát dưới kính hiển vi sau khi nuôi cấy phòngẩ m ta thấy cuống bào tử phân nhánh nhiều, bào tử xuất hiện dày đặc, bào tử hình oval. 3.1.1.2. Hình thái Aspergillus sp. SD4 Hình thái khuẩn lạc Aspergillus sp. SD4 được trình bày ở trên hình 3.3. 2 ngày 4 ngày 6 ngày Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc Aspergillus sp. SD4 sau 2, 4, 6 ngày nuôi cấy. 51
Qua hình trên, ta thấy nấm Aspergillus sp. SD4 cũng tương tự như Trichoderma sp., chỉ trong vòng 6 ngày nó đã lan nhanh khắp bề mặt của đĩa petri. Thời gian đầu tơ nấm màu trắng, sau đó xuất hiện bào tử màu đen. A) B) Hình 3.4. Bào tử Aspergillus sp. SD4 quan sát dưới kính hiển vi A) Hệ số phóng đại X 100; B) Hệ số phóng ạđ i X1000. Qua quan sát dưới kính hiển vi, ta thấy Aspergillus sp. SD4 sinh bào tử đính, hình cầu màu đen. 52
3.1.2. Phát hiện enzyme ngoại bào Bằng phương pháp cấy điểm trên môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào, ta có thể phát hiện khả năng tiết enzyme ngoại bào của nấm sợi. Các enzyme quan tâm là cellulase, chitinase, amylase, pectinase, protease. Sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường cảm ứng enzyme, ta dùng lugol làm chất hiện màu. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng nấm mốc Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 được trình bày trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Vòng phân giải enzyme (nếu d=0 thì hoạt tính là không có ký hiệu 0, d≤30 thì hoạt tính là yếu, ký hiệu +; d=30-40 hoạt tính là trung bình, ký hiệu ++; d>40 hoạt tính là mạnh, ký hiệu +++) Vòng phân giải Đường kính Đánh giá hoạt vòng phân giải tính (mm) Trichoderma sp. Cellulase 40 ++ 53
Chitinase 55 +++ Amylase 0 0 Pectinase 70 +++ 54
Protease 55 +++ Aspergillus sp. SD4 Cellulase 18 + Chitinase 20 + Amylase 20 + 55
Pectinase 35 + Protease 25 + Qua bảng trên, ta thấy hoạt tính enzyme của vi nấm Trichoderma sp. mạnh hơn hẳn so với Aspergillus sp. SD4. Với hoạt tính cellulase của Trichoderma sp. rất mạnh còn của Aspergillus sp. SD4 thì lại yếu. Tương tự hoạt tính chitinase của Trichoderma sp. rất mạnh còn Aspergillus sp. SD4 thì lại yếu. Hoạt lực amylase thì chủng Trichoderma không có hoạt lực, còn Aspergillus sp. SD4 có hoạt lực yếu. Tương tự hoạt tính pectinase của Trichoderma sp. rất mạnh còn Aspergillus sp. SD4 thì lại yếu. Tương tự hoạt tính protease của Trichoderma sp. rất mạnh còn Aspergillus sp. SD4 thì lại yếu. 56
Như vậy, khảo sát hình thái vàhoạt tính enzyme ngoại bào của hai chủng Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 cho thấy các chủng này thuần khiết, không bị nhiễm hay thoái hóa. Do đó cả hai chủng được đưa vào sản xuất bào ửt giống khởi động. 3.2. Thử nghiệm quy trình lên men thể rắn thu bào tử vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 Quy trình lên men: Giống thạch nghiêng Nhân giống trên môi trường PDA, ở nhiệt độ phòng, thời gian 2 ngày Lên men thể rắn, độ ẩm 72%, trong nhiệt độ phòng, cho vào 3 lát thạch môi trường PDA đã có giống, thời gian 12 ngày. Thu bào tử Hình 3.5. Quy trình lên men thu bào tử Môi trường lên men xốp Cám gạo độ ẩm 72% 21 g Trấu 9 g MT Czapek 13,5 ml 57
Với độ ẩm là 72%. Đầu tiên ta kiểm tra độ ẩm nguyên liệu là cám. 3.2.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu 3.2.1.1. Kết quả đo được Bảng 3.2. Khối lượng cốc chưa có mẫu và nắp trước khi sấy. Cốc+nắp 1 Cốc+nắp 2 Cốc+nắp 3 Cốc Nắp Cốc Nắp Cốc nắp Khối 35,514 22,101 41,154 21,461 38,051 22,033 lượng (g) Bảng 3.3. Khối lượng cốc và nắp sau khi sấy lần 1. Cốc+nắp 1 Cốc+nắp 2 Cốc+nắp 3 Khối 60,420 65,231 62,865 lượng (g) Bảng 3.4. Khối lượng cốc và nắp sau khi sấy lần 2. Cốc+nắp 1 Cốc+nắp 2 Cốc+nắp 3 Khối 60,412 65,223 62,862 lượng (g) 58
Bảng 3.5. Khối lượng cốc và nắp sau khi sấy lần 3. Cốc+nắp 1 Cốc+nắp 2 Cốc+nắp 3 Khối 60,400 65,217 62,861 lượng (g) 3.2.1.2. Tính toán kết quả Dựa vào công thức ở phần 2.3.3 xác định độ ẩm nguyên liệu ta tính được kết quả độ ẩm ở bảng dưới: Bảng 3.6. Kết quả tính phầm trăm độ ẩm. trung bình của 3 lần sấy lần 1 sấy lần 2 sấy lần 3 sấy % độ ẩm cốc 1 71,95 72,03 72,15 72,04 % độ ẩm cốc 2 73,84 73,92 73,98 73,91 % độ ẩm cốc 3 72,19 72,22 72,23 72,21 % Độ ẩm trung bình của 3 72,72 cốc 59
3.2.2. Bào tử vi nấm thu được 3.2.2.1. Trichoderma sp. Hình 3.6. Bào tử Trichoderma sp Kết quả thu được bào tử Trichoderma sp. mọc đầy trong bình tam giác. 60
3.2.2.2. Aspergillus sp. SD4 Hình 3.7. Bào tử Aspergillus sp. SD4. Kết quả thu được bào tử Aspergillus sp. SD4 mọc đầy trong bình tam giác. 61
3.3. Kiểm tra chất lượng bào tử thu được bằng phương pháp lên men xốp Sau khi đã thu được bào tử vi nấm bằng phương pháp lên men xốp, ta tiến hành kiểm tra chất lượng bào tử thu được bằng phương pháp đo mật độ quang. 3.3.1. Đường chuẩn Dựa vào đường chuẩn ta tính ra mật độ bào tử có trong Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4. OD 600 0.7 0.6 y = 1E-06x + 0.0292 R² = 0.9804 0.5 0.4 OD 0.3 0.2 0.1 0 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 bào tử/g Hình 3.8. Đường chuẩn bào tử Trichoderma sp 62
3.3.2. Tính toán kết quả 3.3.2.1. Trichoderma sp. Trichoderma sp. pha loãng 2 lần (10-2) được kết quả như bảng dưới đây. Bảng 3.7. Kết quả và tính toán số liệu đo mật độ quang của Trichoderma sp Trung bình Số lần lặp lại 1 2 3 4 ml bao tử đo ở OD 0,415 0,394 0,391 600 (y) Bào tử/ml pha loãng 3,78.105 3,57.105 3,54.105 (x) Bào tử/ml mẫu ban đầu 3,78.107 3,57.107 3,54.107 3,63.107 (x*1E2 (102)) Độ lệch chuẩn 1,28.106 Kết quả = Trung bình ± Độ lệch chuẩn (bào tử/g) = 3,63.107 ± 1,28.106 (bào tử/g) 63
3.3.2.2. Aspergillus sp. SD4 Aspergillus sp. SD4 pha loãng 6 lần (10-6) được kết quả như bảng dưới đây. Bảng 3.8. Kết quả và tính toán số liệu đo mật độ quang của Aspergillus sp. SD4. Trung bình Số ml bào tử 3ml + 1 ml 3,5 ml + 0,5 ml 4ml + dịch pha loãng 0,257 0,3 0,33 OD 600 (y) 5 Bào tử/ml pha 2,23.105 2,65.105 2,94.10 loãng (x) Bào tử/ml mẫu ban đầu 2,97*1011 3,02*1011 2,94*1011 2,98*1011 (x* 106*(4/số ml bào tử)) Độ lệch chuẩn 4,31.109 Kết quả = Trung bình ± Độ lệch chuẩn (bào tử/g) = 2,98.1011 ± 4,31.109 (bào tử/g) 3.3.3. Giá thành Dựa vào giá của từng các loại nguyên liệu dùng để lên men để tính ra giá thành của sản phẩm. Giá thành của sản phẩm được trình bày ở bảng 3.9 64
Bảng 3.9. Giá thành của sản phẩm. Giá bán cho Số lượng STT Nguyên liệu Giá (VNĐ) 500g (VNĐ) dùng 1 Cám 5000 21g 210 2 Trấu 10000 9g 180 3 NaNO3 49500 3g 297 4 K2HPO4 49500 1g 99 5 MgSO4 43736 1g 87,5 6 FeSO4 30800 0,1g 6 7 Saccharose 52800 30g 3168 8 KCl 30800 0,5g 30,8 Tổng giá thành 4078,3 Bảng 3.10. So sánh giá thành sản phẩm. Giá tính cho STT Sản phẩm Mật độ bào tử Giá (VND) 106 bào tử/g (VND) 1 Bima 5×106 bào tử/gam 55000 11 2 Nolatri 107 bào tử /gam 55000 5,5 3,63.107 ± 1,28.106 3 Trichoderma sp. 4078,3 3,7 (bào tử/g) 2,98.1011 ± 4,31.109 4 Aspergillus sp. SD4 4078,3 0,0004 (bào tử/g) 65
Sản phẩm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 vừa lên men có giá tính ở 106 bào tử/g có giá thấp hơn giá của các sản phẩm như Bima và Nolatri có trên thị trường. 3.4. Kiểm tra khả năng nảy mầm 3.4.1. Trichoderma sp. Ta thực hiện thí nghiệm và theo dõi liên tục trong 4 ngày như bảng dưới. Bảng 3.11. Khả năng nảy mầm của Trichoderma sp Đối chứng Thí nghiệm Ngày Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau 1 2 3 4 66
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Thí nghiệm Đối chứng Hình 3.9. Đường kính khuẩn lạc nảy mầm của bào tử Trichoderma sp Dựa vào bảng 3.11 và đồ thị trên hình 3.9 ta thấy: Sau 1 ngày: khuẩn lạc trên đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm chênh lệch nhau 1cm (đối chứng là 2,5 cm, thí nghiệm là 3,5 cm). Sau 2 ngày: khuẩn lạc trên đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm chênh lệch nhau 2cm (đối chứng là 6,5 cm, thí nghiệm là 4,5 cm). Sau 3 ngày: khuẩn lạc trên đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm bằng nhau là 6 cm. Sau 4 ngày: khuẩn lạc trên đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm bằng nhau là 8 cm. Như vậy bằng phương pháp lên men xốp ta có thể thu được bào tử Trichoderma sp. có khả năng nảy mầm hầu như không đổi so với bào tử gốc. 67
3.4.2. Aspergillus sp. SD4 Ta thực hiện thí nghiệm và theo dõi liên tục trong 4 ngày như bảng dưới. Bảng 3.12. Khả năng nảy mầm của Aspergillus sp. SD4. Đối chứng Thí nghiệm Ngày Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau 1 2 3 4 68
8 7 6 5 4 3 2 1 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Thí nghiệm Đối chứng Hình 3.10. Đường kính khuẩn lạc nảy mầm của bào tử Aspergillus sp. SD4. Dựa vào bảng 3.12 và đồ thị trên hình 3.10 ta thấy: Sau 1 ngày: khuẩn lạc trên đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm gần như bằng nhau (đối chứng là 1,4cm, thí nghiệm là 1,3cm). Sau 2 ngày: khuẩn lạc trên đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm gần như bằng nhau (đối chứng là 3,5 cm, thí nghiệm là 3cm). Sau 3 ngày: khuẩn lạc trên đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm bằng nhau là 6 cm. Sau 4 ngày: khuẩn lạc trên đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm bằng nhau là 7,5 cm. Như vậy bằng phương pháp lên men xốp ta có thể thu được bào tử Aspergillus sp. SD4 có khả năng nảy mầm hầu như không đổi so với bào tử gốc. 69
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4có hình thái khuẩn lạc và hình nấm đặc trưng cho các nấm thuộc giống Trichoderma sp. và có hoạt tính phân huỷ cellulose và protein. Môi trường lên men thu bào tử Trichoderma sp. đạt mật độ 3,63.107 ± 1,28.106 (bào tử/g) và SD4 đạt mật độ 2,98.1011 ± 4,31.109 (bào tử/g), là môi trường dựa trên cơ chất cám (độ ẩm 72%), bổ sung giá thể trấu với tỷ lệ trấu:cám là 4:7, độ ẩm 40% và bổ sung khoáng là môi trường Czapek. Bào tử Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 thu được bằng phương pháp lên men có khả năng nảy mầm tương đương giống gốc (thạch nghiêng). 4.2. Kiến nghị Tối ưu hoá thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy (độ ẩm môi trường, độ ẩm không khí ) bằng quy hoạch thực nghiệm. Tăng quy mô thí nghiệm, sử dụng các thiết bị khác. 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu là sách Burgess LW., Knight TE., Tesoriero L., Phan HT., Diagnostic manual for plant Diseases in Vietnam. Australian Centre for International Agricultural Research Canberra 2008. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, (1997). Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. NXB Nông nghiệp TP.HCM. Lê Hùng (2011). Hoàn thiện môi trường lên men xốp sản xuát bào tử Trichoderma T40 đối kháng nấm bệnh cây Rhizoctonia solani. Đại học kỹ thuật công nghệ TPHCM. Tài liệu là bài báo trong tạp chí Asran-Amal A., Abd-Elsalam KA. , Omar MR., Aly AA. Antagonistic potential of Trichoderma spp. against Rhizoctonia solani and use of M13 microsatellite-primed PCR to evaluate the antagonist genetic variation. Journal of Plant Diseases and Protection, 2005, 112 (6), 550–561. Benistez T., Rincosn AM., Limón MC., Codosn AC. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains. INTERNATIONAL MICROBIOLOGY (2004) 7:249-260. Bailey B. A & Lumsden R. D., 1998. Direct effects of Trichoderma & Glioladium Volume 2: 185 – 201. Cook R.J., and Baker K. F. 1983. The Nature and Practice of Biological Coltrol of plant Pathogens. American Phythopathological Society, St. Paul, MN. 539 pp. Degenkolb T, , Graefenhan T., Berg A., Nirenberg HI., Gams W., Brueckner H. Peptaibiomics: Screening for Polypeptide Antibiotics (Peptaibiotics) from Plant- Protective Trichoderma Species. CHEMISTRY & BIODIVERSITY – Vol. 3 (2006). 71
Ghildiyal A. and A. Pandey A. Isolation of Cold Tolerant Antifungal Strains of Trichoderma spp. from Glacial Sites of Indian Himalayan Region. Research Journal of Microbiology, 2008, Vol 3, 559-564. Hadar Y, Harman G. E., Tavlor A. G. (1984) Evaluation of Trichoderma koningii and T. harzianum from New York soils for biological control of seed rot caused by Pythium spp. Phytopathology 74, 106-110. Newsham et al. Arbuscular mycorrhizae protect an annual grass from root pathogenic fungi in the field, J. Ecol. 1995, 83:991-1000 Pieterse CMJ., Leon-Reyes A., Van der Ent S. & Van Wees SCM. Networking by small-molecule hormones in plant immunity. Nature Chemical Biology, 2009, 5, 308 – 316. Rachid Lahlali & Mohamed Hijri. Screening, identicationand evaluation of potential biocontrol fungal endophytes against Rhizoctonia solani AG3 on potato plants. FEMS Microbiol Lett 311 (2010) 152–159. Tài liệu trích dẫn từ Internet: 72