Đồ án Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phản nitrate chịu mặn xử lý nitơ trong nước thải chế biến thủy sản

100 trang thiennha21 12/04/2022 5950

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phản nitrate chịu mặn xử lý nitơ trong nước thải chế biến thủy sản", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_phan_lap_va_tuyen_chon_vi_khuan_phan_nitrate_chiu_man.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phản nitrate chịu mặn xử lý nitơ trong nước thải chế biến thủy sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHẢN NITRATE CHỊU MẶN XỬ LÝ NITƠ TRONG NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN THỦY SẢN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Thành Quang Hiền MSSV: 1151110138 Lớp: 11DSH05 TP. Hồ Chí Minh, 2015
Đồ án tốt nghiệp ỜI CAM ĐOAN Đồ n tốt nghiệp n l ng tr nh nghi n ứu ủ ản th n t i i s h ng n kho h ủ TS Ngu n Ho i H ng – Kho C ng nghệ sinh h – Th phẩm – M i tr ờng, Tr ờng Đại H C ng Nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết quả ó đ ợ trong đồ n n ho n to n kh ng s o hép từ đồ n tốt nghiệp ủ ng ời kh i ất kỳ h nh thứ n o C số liệu trí h n trong đồ n tốt nghiệp n l ho n to n trung th T i xin hịu tr h nhiệm ho n to n về đồ n tốt nghiệp ủ m nh TP HCM, ng 5 th ng 8 n m 5 Sinh vi n th hiện THÀNH QUANG HIỀN
Đồ án tốt nghiệp ỜI CẢM N ời đầu ti n on xin gửi lời ảm n đến mẹ, mẹ đã sinh th nh, ạ ỗ, u th ng v he hở ho on, mẹ đã lu n ở n on v nh những điều tốt nhất ho on trong h tập ũng nh trong uộ sống Em xin đ ợ tr n tr ng ảm n qu thầ kho C ng nghệ Sinh h – Th phẩm – M i tr ờng, tr ờng Đại h C ng nghệ TP HCM đã nhiệt t nh giúp đỡ, tru ền đạt những kiến thứ nền tảng, những kinh nghiệm qu u ho em trong suốt qu tr nh h tập v l m đồ n tốt nghiệp Đặ iệt, em xin tỏ lòng iết n s u sắ t i TS Ngu n Ho i H ng, ng ời thầ đ ng kính, đã tận t nh giúp đỡ, h ng n ho em về nội ung ũng nh kỹ n ng, ph ng ph p, h thứ tiến h nh thí nghiệm để em ó thể ho n th nh đồ n tốt nghiệp ủ m nh Em xin h n th nh ảm n thầ Huỳnh V n Th nh v thầ Ngu n Trung Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi ho em trong suốt qu tr nh em th hiện đồ n tại phòng thí nghiệm Kho M i tr ờng v C ng nghệ sinh h , Tr ờng Đại h Kỹ thuật C ng nghệ TP Hồ Chí Minh Em xin h n th nh ảm n qu thầ trong hội đồng phản iện đã nh thời gi n đ v nhận xét đồ n tốt nghiệp ủ em in ảm n nh hị, ạn v em đã động vi n v giúp đỡ em trong khoảng thời gi n em h tập ũng nh l m đồ n tốt nghiệp tại tr ờng Em xin h n th nh ảm n Tp. Hồ Chí Minh, ng 5 th ng 8 n m 5 n v n t ện THÀNH QUANG HIỀN
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề: 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Ý ng ĩa đề tài 2 4.1. Ý nghĩa khoa học 2 4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2 5. P ƣơng p áp ng n ứu 2 CHƯ NG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Tổng quan nƣớc thải chế biến thủy sản (CBTS) 4 1.1.1. Nguồn phát sinh và đặc tính nước thải CBTS 5 1.2. C u trìn n tơ (N) 11 1.2.1. Giới thiệu về chu trình N tự nhiên 11 1.2.2. Quá trình phản nitrate ở tế bào vi khuẩn 13 1.3. Tổng quan về một số vi khuẩn phản nitrate 20 1.3.1. Pseudomonas stutzeri 20 1.3.2. Paracoccus denitrificans 22 1.3.3. Bacillus azotoformans 23 1.3.4. Thiobacillus denitrificans 23 1.4. Tổng quan p ƣơng p áp p ân lập vi sinh vật [2] 26 1.4.1. Khái niệm 26 1.4.2. Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết 26 1.4.3. Giữ và bảo quản giống 27 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1. Thờ g an và địa đ ểm th c hiện đề tài 29 2.2. Vật liệu – thiết bị - hóa chất 29 2.2.1. Vật liệu 29 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ 29 2.2.3. Hóa chất 29 2.3. Bố trí thí nghiệm : Các bước thí nghiệm được trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau 30 2.4. Ph ng ph p nghi n ứu th c nghiệm 31 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu 31 I
Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng VK có khả năng phản nitrate 31 2.4.3. Các thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng VK phân lập [8] 34 2.4.4. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm khảo sát khả năng khử nitrate và khử nitrate của các chủng VK phân lập được 38 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 46 3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng có khả năng phản nitrate: 46 - - 3.1.1. Tăng sinh VK phản nitrate từ nước thải CBTS trên môi trường Giltay NO3 và NO2 46 3.1.2. Phân lập và làm thuần vi khuẩn từ nước thải CBTS: 47 3.1.3. Tăng sinh VK phân lập được trên môi trường Giltay Nitrate và Giltay Nitrite: 49 3.1.4. Kết quả thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng VK phân lập: 53 3.2. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ đối với những chủng được tuyển chọn 55 3.2.1. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite của chủng 7.5 trong 48 giờ. 55 3.2.2. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ đối với chủng 7.1 57 3.3. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ đối với những chủng được tuyển chọn. 60 3.3.1. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ của chủng 7.5 60 3.3.2. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ của chủng 7.1 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 1. Kết luận 68 2. Kiến nghị 69 II
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIÊT TẮT CBTS Chế biến thủy sản G Giltay HK Hiếu khí HKGT Hiếu khí giá thể KK Kị khí KKGT Kị khí giá thể MT M i tr ờng N Nit + NH4 Amoni - NO2 Nitrite - NO3 Nitrate VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật III
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. S đồ quy trình công nghệ CBTS đ ng lạnh 5 Hình 1.2. S đồ quy trình công nghệ xử l n c thải CBTS điển hình 11 Hình 1.3. Chu trình N trong t nhiên 11 Hình 1.4. Chu trình N thu g n do VK th c hiện 13 Hình 1.5. Quá trình khử nitrate dị hóa và khử nitr te đồng hóa trong chu trình N của VK nhân th c 15 Hình 1.6. C hế quá trình khử nitrate dị hóa (hô hấp kỵ khí) 16 Hình 1.7. C hế quá trình khử nitrate dị hóa amôn hóa 17 Hình 1.8. Hình thái khuẩn lạc Pseudomonas stutzeri 21 Hình 1.9. Hình thái tế bào và khuẩn lạc Paracoccus denitrificans 22 Hình 1.10. Hình thái tế bào Thiobacillus denitrificans 24 Hình 2.1. S đồ tóm tắt bố trí c thí nghiệm 31 Hìn 2.2 Mô hình khảo sát khả n ng hu ển hóa N ở điều kiện khác nhau. 39 Hình 3.1. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.5 trong mô hình chuyển hóa nitrite 53 Hình.3.2. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.1 trong mô hình chuyển hóa nitrite 56 Hình 3.3. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.5 trong mô hình chuyển hóa nitrate 58 Hình 3.4. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.1 trong mô hình chuyển hóa nitrate 62 IV
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các thông số ô nhi m tiêu biểu củ n c thải CBTS Việt Nam 4 Bảng 1.2. Tải l ợng ô nhi m n c thải của một số nhà máy CBTS 4 Bảng 1.3. Nồng độ ô nhi m trung bình trong n c thải của một số loại hình CBTS . 6 Bảng 1.4. Tiêu chuẩn về hàm l ợng nitrate và nitrite trong n c uống ở mốt số tổ chức 10 Bảng 1.5. Nồng độ methanol sử dụng để khử nitrate hoặc nitrite hoàn toàn 18 Bảng 1.6 Tóm tắt đặc tính hình thái và sinh lý, sinh hóa của các vi khuẩn phản nitrate tiềm n ng 25 Bảng 2.1. Độ đụ m i tr ờng v l ợng khí sinh ra của các m u m i tr ờng sau khi t ng sinh VK ph n lập 32 Bảng 2.2. Ph ng ph p định tính nồng độ nitrite trong m u 33 Bảng 2.3. Ph ng ph p định tính nồng độ nitrate 33 Bảng 2.4. Ph ng ph p định tính nồng độ amoni: 33 - Bảng 2.5. Trình t tiến h nh định l ợng NO3 41 - Bảng 2.6. Trình t tiến h nh định l ợng NO2 42 + Bảng 2.7. Trình t tiến h nh định l ợng NH4 44 Bảng 3.1 Kết quả định tính N s u 5 ng t ng sinh n c thải CBTS trên môi tr ờng Giltay 46 Bảng 3.2 Kết quả phân lập VSV từ n c thải CBTS 48 Bảng 3.3 Kết quả định tính tr n m i tr ờng Giltay Nitrite sau 5 ngày 49 Bảng 3.4 Kết quả định tính tr n m i tr ờng Giltay Nitrate sau 5 ngày 49 Bảng 3.5. Kết quả thừ nghiêm sinh hóa của các chủng VK phân lập 51 Bảng 3.6. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử Nitrite của chủng 7.5 sau 48 giờ 52 Bảng 3.7. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrite của chủng 7.1 sau 48 giờ 55 V
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrate của chủng 7.5 sau 48 giờ 58 Bảng 3.9. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrate của chủng 7.5 sau 48 giờ 61 VI
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề: Ngành công nghiệp chế biến thủy sản là một trong những ngành kinh tế mũi nh n củ n t , đóng góp đ ng kể ho GDP n t Đ ũng l ng nh hế biến có số l ợng doanh nghiệp nhiều nhất trong công nghiệp chế biến, m ng đến việc làm cho nhiều ng ời dân Bên cạnh những lợi ích về kinh tế và xã hội, ngành CBTS ũng g r nhiều vấn đề về m i tr ờng nh nhi m không khí, ô nhiềm đất, ô nhi m chất thải rắn v nghi m tr ng h n ả là ô nhi m nguồn n Chính điều này làm ảnh h ởng rất l n đối v i cuộc sống củ on ng ời , ũng nh ảnh h ởng đến hệ sinh thái gần khu v n c thải đ ợc thải ra. N c thải của công nghiệp CBTS chứa các thành phần ô nhi m hữu ó nguồn gốc từ động vật, nh protein v lipi Ngo i r , n c thải này còn có hàm l ợng BOD, COD và Nitrate khá cao. V i ph ng ph p xử l hó l , ph ng pháp xử lý hóa h , ó thể xử lý hiệu quả đ ợ COD v BOD nh ng v n h xử lý triệt để đ ợ l ợng Nitr te ó trong n c thải. Hiện n , ph ng ph p sinh h c trong xử l n c thải sau chế biến đ ợc các doanh nghiệp CBTS quan tâm và áp dụng rất nhiều N c thải CBTS chứa l ợng chất hữu o, phân hủy sinh h c b i các vi sinh vật. Sử dụng ph ng pháp sinh h c trong xử l n c thải có thể khắc phụ đ ợc một vấn đề mà các ph ng ph p xử lý hóa lý, hóa h th ờng gặp phải là vấn đề tái ô nhi m sau xử lý. Nhiều chủng VSV có khả n ng th m gi v o hu tr nh nito trong n c, chuyển hóa các hợp chất N nh mon, nitrite, nitr te để phục vụ cho quá trình trao đổi chất, tổng hợp nên các thành phần cấu trúc của tế o ũng nh tổng hợp các chất cần ho qu tr nh sinh tr ởng và phát triển của chúng. D v o đó, nhiều chủng VSV có khả n ng hu ển hó N đ ợc sử dụng trong nhiều lĩnh v nh ng nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp th c phẩm, đặc biệt là công nghiệp chế biến thủy sản. Để ó đ ợc những ứng dụng trên, việc phân lập và tuyển ch n các chủng VSV mong muốn là một phần quan tr ng trong việc nghiên cứu ũng nh tạo ra chế phẩm sinh h c có giá trị ứng dụng vào xử l n c thải. 1
Đồ án tốt nghiệp Từ những sở trên, th c hiện đề tài “P ân lập và tuyển chọn vi khuẩn phản nitrate chịu mặn xử lý n tơ trong nƣớc thải chế biến thủy sản” v i mong muốn sẽ ch n đ ợc các chủng vi khuẩn có khả n ng xử lý hiệu quả nhất, để kết hợp tạo nên một chế phẩm sinh h c phù hợp v i n c thải chứa nguồn N cao, góp phần nâng cao hiệu quả xử lý và bảo vệ m i tr ờng trong ngành CBTS. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và tuyển ch n các chủng VK có khả n ng xử lý nitrate và nitrite trong điều kiện có nồng độ muối cao từ n c thải từ công ty CBTS. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và tuyển ch n các chủng VK có khả n ng xử lý nitrate và nitrite trong điều kiện có nồng độ muối cao từ n c thải chế biến thủy sản. - Định l ợng khả n ng xử lý nitrite của các chủng vi khuẩn tuyển ch n - Định l ợng khả n ng xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn tuyển ch n. 4. Ý ng ĩa đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Phân lập đ ợc chủng VSV có khả n ng xử lý N-Nitr te đạt hiệu quả cao, có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh v c. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Tạo thêm một số chế phẩm sinh h c ứng dụng trong xử l n c thải thủy sản, góp phần bảo vệ m i tr ờng n c. 5. P ƣơng p áp ng n ứu Ph ng ph p tổng hợp tài liệu: - Thu thập, nghiên cứu các tài liệu tham khảo, tài liệu internet có liên quan đến đề tài. - L a ch n, tổng hợp các tài liệu li n qu n đến mục tiêu đề r trong đề tài. Ph ng ph p th c nghiệm: - Phân lập các VK có khả n ng phản nitrate từ n c thải nhà máy CBTS. 2
Đồ án tốt nghiệp - Ph ng ph p định tính khả n ng khử nitrate, nitrite của các VK phân lập đ ợc. - Th c hiện một số th c nghiệm sinh hó nh : nhuộm gram, OF, MR-VP, In ol, C t l se, i động đối v i các chủng phân lập đ ợc, từ đó tu ển ch n chủng VK mong muốn, loại VSV không mong muốn. - Th c hiện bố trí thí nghiệm khảo sát khả n ng phản nitrate của chủng VK đã tu ển ch n Ph ng ph p thu thập và xử lý số liệu: - Ghi nhận số liệu từ các thí nghiệm khảo sát theo từng thời điểm. - Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel. - Xử lý thống kê bằng phần mêm Statgraphic Centurion XV. Các số liệu s u đó đ ợ ph n tí h ANOVA v đ ợc trắc nghiệm phân hạng LSD v i mứ nghĩ , 5 3
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan nƣớc thải chế biến thủy sản (CBTS) N c thải nh m CBTS đ ợ đặ tr ng ởi h m l ợng ô nhi m chất hữu v N cao. Nồng độ BOD ≥ 1000mg/l và tổng N ≥ 120mg/l. Tỉ lệ COD/BOD5 nằm trong khoảng 1,1 - 1,3, cho phép xử l n c thải theo ph ng ph p sinh h c đạt hiệu quả cao. Bảng 1.1 Các thông số ô nhi m tiêu biểu củ n c thải CBTS Việt Nam STT CHỈ TIÊU ĐƠN VỊ GIÁ TRỊ QCVN 11:2008, Cột B 1 pH - 6 – 8 5,5 – 9 2 COD mg/l 1500 – 2800 80 3 BOD mg/l 1000 – 1800 50 4 SS mg/l 388 – 452 100 5 Dầu mỡ ĐTV mg/l 150 – 250 20 6 Nit tổng mg/l 120 – 160 60 7 Photpho tổng mg/l 6 – 10 - Bảng 1.2. Tải l ợng ô nhi m n c thải của một số nhà máy CBTS Công suất Tải lƣợng ô nhiễm TT Tên ơ sở công nghiệp SS BOD COD N P (TSP/ngày) 5 1 Cty XNK thủy sản Việt 12 -15 484 3300 3960 198 21 Nam (SEAPRODEX) 2 Cty chế biến hàng xuất 25 – 30 396 2700 3240 162 19 khẩu Q3 (EPCO) 3 XNXK thủy hải sản 6 – 9 380 1100 1425 110 23 Seaspimex 4 XN đ ng lạnh Nhà Bè 3,5 - 5 53 360 423 22 5 5 XN CBTSXK Cần Th 3 – 6 200 682 900 30 8 6 Cty XNK thủy sản An Giang 8 - 12 1028 900 - 40 10 7 Cty CBTSXK Nha Trang 4 – 6 420 533 810 54 17 8 Cty Animex Đ Nẵng 1 – 2 351 460 630 - - 9 XN đ ng lạnh Huế 2 – 3 - 428 717 - - 10 Cty XNKTS Quảng Ninh 4 – 6 - - 1347 189 47 4
Đồ án tốt nghiệp 1.1.1. Nguồn phát sinh và đặc tính nước thải CBTS 1.1.1.1. Nguồn phát sinh Trong sản xuất thủy sản, n c thải ở các khâu chế biến chiếm 85% - 90% tổng l ợng n c thải, 10 % - 15% còn lại l n c thải sinh hoạt của công nhân trong nhà máy. Nguồn gây ô nhi m ở khâu chế biến ản : - S hế nguyên liệu: rửa, phân loại, mổ, rã đ ng - Các quá trình chế biến: ng m, t h x ng, ắt khúc, phile, làm sạch, luộ - Quá trình vệ sinh thiết bị, nh x ởng và vệ sinh của công nhân. C c sản xuất ản ó ph t sinh n c thải tại nh m CBTS đ ợc thể hiện trên hình 1.1. Hình 1.1 S đồ quy trình công nghệ CBTS đ ng lạnh (Lê Minh Nguyệt, 2003) 5
Đồ án tốt nghiệp Ngoài các nguồn gây ô nhi m trên thì các hoạt động đóng hộp nh kh u rót n c sốt, n c muối, dầu gia vị ũng góp phần gây ô nhi m đ ng kể Đối v i hoạt động sản xuất bột cá và dầu cá thì nguồn gây ô nhi m l n c máu từ khâu bốc dỡ, bảo quản cá, ép cá và thời điểm dòng thải đậm đặc nhất l kh u l t m n ng ng tụ các thiết bị đặc. Bảng 1.3. Nồng độ ô nhi m trung bình trong n c thải của một số loại hình CBTS Chỉ tiêu đ nh giá ô nhi m Loại hình chế biến pH SS BOD COD NTS PTS Đ ng lạnh 7,3 350 800 1100 90 20 Đồ hộp 7,1 100 478,8 775,6 24,84 11,82 Surimi (sản phẩm n liền) 7,8 586 3120 4890 125 11,32 N c mắm 7,5 75 20 40 - - M c khô, tôm khô các loại 7,5 250 100 150 20 6 Agar 6,7 136,6 217,8 413,8 9,7 27,5 (Nguồn: Báo cáo hiện trạng M i tr ờng, Cục thùy sản, 2007) 1.1.1.2. Đặc tính nước thải CBTS N c thải là một trong những vấn đề m i tr ờng l n nhất của ngành CBTS hiện nay, v i đặ tr ng ởi ô nhi m về màu, mùi, chất rắn l lửng, chất hữu o và VK gây bệnh, v.v Các chất thải ó đặc tính d n hỏng và d thất thoát theo đ ờng đi ủa dòng thải N c thải trong CBTS ó h m l ợng chất hữu o v trong đó ó ầu, protein, chất rắn l lửng và chứ l ợng photphat và nitrate cao. Dòng thải từ CBTS còn chứa những m u vụn thịt, x ng ngu n liệu chế biến, máu, chất béo, các chất hoà tan từ nội tạng ũng nh những chất tẩy rửa và các tác nhân làm sạ h kh Trong đó ó nhiều hợp chất khó phân hủy. Mứ độ ô nhi m củ n c thải tùy thuộc vào s có mặt của một số yếu tố, nh ng qu n tr ng nhất là ph ng ph p hế biến và loài thủy sản đ ợc chế biến sau : Nhìn chung, hầu hết n c thải củ nh m CBTS đều có chung đặc điểm 6
Đồ án tốt nghiệp - Có h m l ợng các chất hữu ạng d phân huỷ sinh h c cao. Giá trị BOD5 th ờng l n, o động trong khoảng 300 – 2000 mg/l, giá trị COD nằm trong khoảng 500 – 3000 mg/l. - H m l ợng l n các protein và chất inh ỡng, thể hiện ở 2 thông số tổng Nit (5 – 200 mg/l) và tổng Photpho (10 – 100 mg/l). - H m l ợng chất rắn l lửng cao từ 200 – 1000 mg/l. - pH th ờng nằm trong gi i hạn từ 6,5 – 7,5 do có quá trình phân huỷ đạm và thải amoniac. Ngoài ra, các thành phần chất hữu trong n c thải thủy sản khi phân huỷ tạo ra các sản phẩm trung gian là các axit béo không no nên tạo mùi rất khó chịu và đặ tr ng, gây ô nhi m về mặt cảm quan và ảnh h ởng tr c tiếp đến sức khoẻ công nhân làm việc. 1.1.1.3. Tác động của nước thải CBTS đến môi trường nước Nh đã tr nh , n c thải CBTS ó h m l ợng các chất ô nhi m cao, nếu kh ng đ ợc xử lý sẽ gây ô nhi m nghiêm tr ng nguồn n c mặt v n c ngầm xung quanh. Đối v i nguồn n c ngầm tầng n ng, n c thải CBTS có thể thấm xuống đất và gây ô nhi m mạ h n c ngầm. Các chất hữu v VSV g ệnh có trong nguồn n c ngầm nhi m gây cản trở cho việc xử l th nh n c sạch cung cấp cho sinh hoạt. Đối v i các nguồn n c mặn, các chất ô nhi m ó trong n c thải CBTS sẽ làm suy thoái chất l ợng n , t động xấu đến m i tr ờng và thủy sinh vật. Trong n c thải CBTS chứa các chất nh onh r t, protein, hất béo là các chất hữu bị phân hủy, nên khi xả vào nguồn n c t nhiên sẽ làm giảm nồng độ oxy hòa tan vốn có, do VSV sử dụng để phân hủy các chất hữu ó trong n c thải. Nồng độ ox hò t n i 50% bão hòa gây ảnh h ởng xấu t i s phát triển của các loài thủy sinh và làm giảm khả n ng t làm sạch của nguồn n c, d n đến giảm chất l ợng n c cấp cho sinh hoạt và công nghiệp. Ngoài ra, các chất l lững trong n c thải CBTS l m ho n đục hoặ ó m u ng n ản ánh sáng chiếu sâu vào 7
Đồ án tốt nghiệp lòng thủy v c, ảnh h ởng t i quá trình quang hợp của tảo, rong r u g t động tiêu c đến tài nguyên thủ sinh, đồng thời gây mất mỹ qu n ho òng n c và gây bồi lắng lòng sông, cản trở s l u th ng tr n l u v c. Về mặt vi sinh, n c thải CBTS chứa nhiều VK gây bệnh và trứng giun sán là những tác nhân gây nên dịch bệnh ở ng ời nh : ệnh lỵ, th ng h n, ại liệt, nhi m khuẩn đ ờng tiết niệu và tiêu chảy cấp tính Trên hết l t động của các hợp chất N v photpho nh g hiện t ợng phì ỡng trong hệ sinh th i n c, làm cạn kiệt ox trong n , g độc v i hệ sinh vật n , l m n c ngầm ô nhi m nitrate, ảnh h ởng t i sức khỏe cộng đồng. - Hiện t ợng ph ỡng trong n l o thừa chất inh ỡng d n t i s phát triển bùng nổ của các loài tảo và VSV, còn g i là hiện t ợng tảo nở hoa. Khi đó mật độ thuỷ sinh vật trong hồ rất đặ l m ho n ó độ màu và độ đục cao. Ngoài ra khi một l ợng l n tảo chết đi sẽ cần l ợng oxy l n t ng ứng để phân huỷ d n đến h m l ợng ox hò t n trong n c bị cạn kiệt, làm chết các sinh vật sống trong n c. - Theo tài liệu « H ng d n về chất l ợng n c uống » của Tổ chức Y tế thế gi i ũng nh Ti u huẩn 1329/2002 (Bộ Y tế) không xem amoni là chất gây hại cho sức khỏe on ng ời mà xếp amoni vào nhóm các chất g t động xấu về mặt cảm quan (mùi, vị) trong n c. Bên cạnh đó, moni òn l ếu tố cản trở trong công nghệ xử l n c cấp. Thứ nhất : nó làm giảm tác dụng của clo là tác nhân sát trùng chủ yếu áp dụng ở nh m n c Việt Nam, do phản ứng v i clo tạo thành monocloamin là chất sát trùng thứ cấp hiệu quả kém lo h n lần. Thứ hai : amoni cùng v i một số vi l ợng trong n c (hữu , phốt pho, sắt, m ng n ) l “thứ n” để VK phát triển, gây hiện t ợng “kh ng ổn định sinh h ” ủa chất l ợng n c sau xử l N c có thể bị đụ , đóng ặn trong hệ thống d n, chứ n N c bị xuống cấp về các yếu tố cảm quan. - Khi nồng độ moni trong n c cao sẽ rất d dàng tạo r nitrite Trong thể động vật, nitrite và nitrate có thể biến thành N-nitroso - là tiền chất có tiềm 8
Đồ án tốt nghiệp n ng g ung th Mặc dù bằng chứng dịch t h h đầ đủ về tác hại đối v i con ng ời. Ủ n h u Âu qu định mức tối đ ủ nitr te trong n c uống là 50 mg/l, Mỹ là 45 mg/l, Tổ chức sức khoẻ thế gi i: 100 mg/l, tiêu chuẩn 1329/2002 (Bộ Y tế) đã đề ra mức gi i hạn 3 v 5 mg/l đối v i nitrite v nitr te t ng ứng nhằm ng n ngừa bệnh mất sắc tố máu (meth emoglo in emi ) đối v i trẻ s sinh i 3 tháng tuổi v ung th tiềm t ng Độc tính củ nitrite đ ợc mô tả nh s u (Sharat và cộng s , 1994) Chứng máu Methaemo- globinaemia (hội chứng xanh xao trẻ em) : Trong thể, nitrite (hoặ nitr te i tác dộng của một số VK đuờng ruột chuyển thành nitrite) kết hợp v i hồng cầu (hemoglo in) trong m u s u đó hu ển thành methemoglobin, cuối cùng chuyển thành methemoglobinamin. Methemoglobinamin là chất ng n ản việc liên kết và vận chuyển oxy, gây bệnh thiếu oxy trong máu và sinh ra bệnh máu trắng: - - 4HbFe2+O2 + 4 NO2 + 2H2O → 4H Fe3+OH- + 4NO3 + O2 Bệnh nhân khi bị ngộ độc nitrite sẽ có những triệu chứng nh nhức đầu, hồi hộp, hoa mắt, nôn mử s u đó n đến hôn mê và có thể gây tử vong. Hiện t ợng n đặc biệt thấy rõ ở trẻ em. Trẻ em mắc chứng bệnh n th ờng xanh xao và d bị đe a đến cuộc sống đặc biệt là trẻ i 6 tháng tuổi. Ung t ƣ t ềm tàng : Ở một khía cạnh khác, trong dạ động vật nitrite kết hợp v i các acid amin trong th c phẩm làm thành một h chất nitrosamin. Nitrosamin có thể gây tổn th ng i tru ền tế bào nguyên nhân gây ra bệnh ung th , qu i th i Những thí nghiệm cho nitrite vào thứ n, n c uống của chuột, thỏ v i h m l ợng v ợt ng ỡng cho phép thì sau một thời gian thấy những khối u sinh ra trong gan, phổi, vòm h ng của vật thí nghiệm. Ở điều kiện pH <4 thì các hợp chất nitroso đ ợc tạo thành từ amin bậc hai và acid nitro (HNO2) có thể trở nên bền vững h n nhờ tách loại proton để trở thành nitrosamin: R2-NH + HNO2 → H2O + R2N-NO (pH<4). 9
Đồ án tốt nghiệp Các amin bậ trong m i tr ờng axit yếu ở pH = 3 - 6 v i s có mặt của ion nitrite chúng d dàng phân huỷ thành aldehyd và amin bậc hai. Sau dó amin bậc hai tiếp tục chuyển thành nitrosamin. Do độc tính cao của các hợp chất chứa N (amoni, nitrite, nitrate) nên việc loại bỏ húng trong n c thải ó h m l ợng N cao là việc quan tr ng, để loại bỏ đ ợc mối nguy hại khá l n ho m i tr ờng, đặc biệt là bảo vệ sức khỏe cộng đồng. S u đ l qu định về h m l ợng nitr te v nitrite trong n c uống của một số tổ chức Bảng 1.4. Tiêu chuẩn về hàm l ợng nitrate và nitrite trong n c uống ở mốt số tổ chức - Tổ chức Hàm l ợng NO3 (mg/l) - Hàm l ợng NO 2(mg/l) WHO 45 TCVN 5501-91 50 0,1 Canada 10 1 EEC 50 0,1 CHLB Đức 50 0,1 (Nguồn:genome) 1.1.1.4. Hệ thống xử l n c thải cho các nhà máy CBTS D v o đặ tr ng ủ n c thải CBTS, quy trình xử l n c thải thông dụng th ờng đ ợc áp dụng tại các nhà máy CBTS Việt Nam gồm ng đoạn sau: - Tiền xử lý hay xử l s ộ: Tách rác, lắng cát, cân bằng, tách dầu. - Xử l s ấp hay xử lý bậc 1: Xử lý kỵ khí trong bể UASB. - Xử lý thứ cấp hay xử lý bậc 2: Xử lý hiếu khí trong bể Aeroten. - Xử lý bậc 3: Keo tụ, lắng l c, khử trùng. Bùn lắng tụ s u khi đ ợc gom v o ng n hứa bùn sẽ đ ợ đ qu ể phân hủy bùn và cuối ùng đ ợc thải vào bãi rác hoặc dùng bón cây. Dây chuyền công nghệ xử l n c thải CBTS điển hình tại các nhà máy sản xuất thủy sản ở Việt N m đ ợc mô tả ở hình 2.2. 10
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. S đồ quy trình công nghệ xử l n c thải CBTS điển hình 1.2. C u trìn n tơ (N) 1.2.1. Giới thiệu về chu trình N tự nhiên Chu kỳ N là một qu tr nh m theo đó N đ ợc chuyển đổi qua lại giữa các dạng hợp chất hóa h c của nó. Chuyển đổi này có thể đ ợc th c hiện cả hai quá trình sinh h c và phi sinh h c. Quá trình quan tr ng trong chu trình N bao gồm: s cố định N, khoáng hóa, quá trình nitrate hóa và khử nitrate. Hình 1.3. Chu trình N trong t nhiên S chuyển hoá củ N trong m i tr ờng phụ thuộc vào nhiều yếu tố ảnh h ởng nh : pH, s phân tầng n c, nhiệt độ, độ mặn Việc cung cấp N vào các chu trình vật chất trong t nhiên phụ thuộc nhiều vào quá trình phân huỷ sinh h c 11
Đồ án tốt nghiệp các hợp chất chứa N trong môi tr ờng. S tr o đổi và phân huỷ sinh khối khác nhau đ ng kể giữ n i sống, kích cỡ và hoạt động sống của các quần xã VSV và nấm. Tỷ lệ trung bình của C:N trong sinh khối VSV xấp xỉ 10:1; Th c vật có tỷ lệ C:N là 40+8 : nghĩ l ó s thiếu hụt N; Động vật duy trì tỷ lệ C:N gần bằng tỷ lệ của VSV phân huỷ, gây phân hủ nh nh Trong đất, tỷ lệ C:N ổn định nhất là ~10. Theo Begon (1990), khi một chất ó h m l ợng N + 8% đ ợc bổ sung bởi các ion NH4 ó xu h ng đ ợc giải phóng. Nit trong m i tr ờng tồn tại ở nhiều dạng hóa h c khác nhau bao gồm N + - - hữu nh moni (NH4 ), nitrite (NO2 ), nitrate (NO3 ), nit xit (N2O), nitric ôxit (NO), hoặc nit v nh khí N (N2). Các quá trình trong chu trình N chuyển đổi N từ một dạng này sang dạng khác. Một số qu tr nh n đ ợc tiến hành bởi các VK, qu qu tr nh đó hoặ để chúng lấ n ng l ợng hoặ để tích tụ N thành một dạng cần thiết cho s phát triển của chúng. Việc chuyển hóa N hữu gồm 4 gi i đoạn: - Cố định đạm: cố định N phân tử ngoài không khí thành NH3 i tác dụng của hệ enzyme nitrogenase và hydrogenase kết hợp N2 v i H2. Sinh vật có khả n ng ố định đạm là VK và vi tảo, đặc biệt là VK sống cộng sinh trong nốt sần h đậu nh Azoto ter e e v Rhizo i e e + - Amoni hóa: thủy phân protein và oxy hóa các axit amin thành NH4 bằng enzyme protease do VK Actinomycetes và nấm tạo ra. - Nitrate hóa: gồm có nitrite hóa và nitrate hóa. Nitrite hóa: oxy hóa NH3, + - - NH4 thành NO2 bởi chủng VK Nitrosomonas; Nitrate hóa: NO2 đ ợc oxy hóa tiếp do chủng VK Nitrobacter thành NO3-. - Khử nitr te : trong điều kiện m i tr ờng ít hoặc không có oxy (ngập úng, cặn lắng ) sẽ di n ra quá trình khử nitr te Trong đó NO3- đ ợc các VK sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng (chất gây oxy hoá) và chuyển hóa thành các - chất trung gi n nh NO2 , NO, N2O và cuối cùng khử thành N2 trả lại cho khí quyển. Quá trình này xả r o VK nh Pseudomonas denitrificans, Bacillus spp , 12
Đồ án tốt nghiệp Do mụ ti u đề tài, sinh viên th c hiện đề tài chỉ tìm hiểu sâu về quá trình phản nitrate, các phần còn lại của chu trình N sẽ hạn chế trình bày. 1.2.2. Quá trình phản nitrate ở tế bào vi khuẩn Phản nitrate là một trong những quá trình chính củ hu tr nh N o VK đảm - nhiệm v đ ợc khái niệm là quá trình khử NO3 thành khí N2 theo 4 gi i đoạn - - bản sau: NO3 → NO2 → NO (k) → N2O (k) → N2(k), thông qua các phản ứng: khử nitrate hô hấp, khử nitrite hô hấp, khử NO hô hấp và khử N2O hô hấp Trong đó - NO2 , NO, N2O là các sản phẩm trung gian và mỗi gi i đoạn củ qu tr nh đ ợc xúc tác bởi 1 hệ enzyme khác nhau. Quá trình khử nitrate dạng này g i l “khử nitrate dị hó ” Hình 1.4. Chu trình N thu g n do VK th c hiện (Walter G. Zumft, 1997) Nh đã tr nh ở trên , số l ợng VK có thể th c hiện quá trình phản nitrate hoá khá phong phú. Có ít nhất 14 chủng VK đ ợc biết là có khả n ng phản nitrate hoá. Ví dụ: Bacillus spp., Pseudomonas spp., Methanomonas denitrificans, Paracoccus denitrificans, Spirillum, Thiobacillu denitrificans Phần l n VK phản nitrate hoá là VK dị ỡng tức là chúng cần nguồn C hữu (met nol, xit eti , met n, xit itri ) để tổng hợp tế bào, chỉ có một số ít VK phản nitrate hoá là VK t ỡng, sử dụng nguồn C v để tổng hợp tế bào. Ví dụ: loài Thiobaccillus denitrificans có khả n ng ox ho l u huỳnh nguyên tố lấ n ng l ợng và sử dụng nguồn C từ CO2 hoà tan hoặc HCO3- để tổng hợp tế bào. 13
Đồ án tốt nghiệp Hầu hết VK phản nitrate hoá là VK hô hấp kỵ khí tuỳ nghi (trừ Pseudomonas stutzeri, Paracoccus denitrificans là VK phản nitrate hiếu khí), có thể sử dụng O2 - hoặc NO3 làm chất nhận điện tử cuối cùng trong quá trình hô hấp. Có thể giải thích nh s u: Khi có mặt O2, VK sẽ sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng trong quá - trình hô hấp, g i là hô hấp hiếu khí, khi nguồn O2 cạn kiệt VK sử dụng NO3 hoặc - có thể là NO2 nh hất nhận điện tử cuối cùng cho quá trình hô hấp, g i là hô hấp kỵ khí C hế củ qu tr nh l t ng t nhau, s khác nhau duy nhất giữa hô hấp hiếu khí và hô hấp kỵ khí là enzyme xúc tác cho s vận chuyển điện tử. O2 phải - đ ợc loại trừ để tạo điều kiện cho quá trình khử nitrate di n ra. Nếu cả O2 và NO3 cùng có mặt thì VSV sẽ u ti n sử dụng O2 làm chất nhận điện tử, do hô hấp hiếu khí sinh ra nhiều n ng l ợng h n h hấp thiếu khí. C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O ( Go’ = - 2,870 kJ/1mol Glucose) - 5 C6H12O6 + 24 NO3 + 4H+ → 3 CO2+ 12N2 + 42H2O ( Go’= - 2,670 kJ/1mol Glucose) - + C6H12O6 + 3 NO3 + 6H+ → 6CO2 + 3 NH4 + 3H2O ( Go’ = -1,870kJ/1mol Glucose) Các VSV cần N để tổng hợp protein là thành phần cấu trúc của tế bào và + NH4 là nguồn N VSV có thể sử dụng tr c tiếp để tổng hợp Trong tr ờng hợp + - + không sẵn có nguồn NH4 , VSV có khả n ng khử NO3 thành NH4 để sử dụng. Khi đó một phần N đã đ ợc chuyển vào trong tế bào, quá trình khử N dạng n đ ợc g i l “khử nitr te đồng ho ” 1 C hế quá trình phản nitrate Tìm hiểu sâu về quá trình phản nitr te, th hế của quá trình di n ra theo hai mụ đí h hính: - Tổng hợp n ng l ợng cho quá trình hô hấp kỵ khí, g i là khử nitrate dị hóa. + - Chuyển hóa NO3- thành NH4 để tổng hợp nên cấu trúc tế bào, g i là khử nitr te đồng hóa. 14
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Quá trình khử nitrate dị hóa và khử nitr te đồng hóa trong chu trình N của VK nhân th c (Walter G. Zumft, 1997) Khử nitrate dị hóa Trong khử nitrate dị hóa, xả r đồng thời hai quá trình khử nitrate hóa - (denitrificans) và amôn hóa (ammonification). Cả h i đều chuyển hóa NO3 thành - NO2 v sinh n ng l ợng ở điểm khởi đầu thông qua quá trình hô hấp kỵ khí. - - Khử nitrate tiếp tục các quá trình khử liên tiếp NO2 → NO (k) → N O (k) và cuối cùng tạo ra N2, v i s xúc tác của các enzyme khử đ ợc mã hóa tổng hợp bởi các gen: Nap, Nar (hô hấp khử nitrate), Nir (hô hấp khử nitrite), Nor (hô hấp khử oxit nitric), Nos (hô hấp khử oxit nito) S u đ l s đồ quá trình khử nitrate dị hóa ở tế bào VK. 15
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6. C hế quá trình khử nitrate dị hóa (hô hấp kỵ khí) Trong m i tr ờng kỵ khí O2 vắng mặt, để tiếp tục duy trì s sống VSV buộc phải t m t nh n kh để thay thế O2 th c hiện quá trình hô hấp, và các tác nhân - 2+ đó hầu hết là các nguyên tử chứa O2 nh NO3 , SO4 , Trong m i tr ờng có - nhiều ion NO3 thì qu tr nh đ ợc di n r nh s u: - Ion NO3 đ ợc hấp thụ qua màng ngoài tế o v đ ợc chuyển hóa thành các dạng khác nhau tại khoảng không gian ngoại vi bào (periplasm). Ở đ , oxit ủa N lần l ợt đóng v i trò nh hất nhận điện tử cuối cùng thay cho O2, để tạo nên nấc th ng điện hóa qua màng sinh chất trong quá trình hô hấp kỵ khí của tế bàoVK . Sau mỗi phản ứng chuyển hóa, phân tử oxy dần đ ợc lấy ra khỏi oxit N để phục vụ cho quá trình hô hấp của tế bào và cuối cùng là tạo ra N2 thải ra bên ngoài. - Khử nitrate dị hó m n hó : qu tr nh n òn đ ợc g i là quá trình khử độc tế bào. 16
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7. C hế quá trình khử nitrate dị hóa amôn hóa Khi nồng độ nitrite trong tế o VK t ng o, ó thể g độc cho tế bào vì thế trong tế bào VK xả r hế khử độc nitrite cho tế bào bằng cách chuyển hóa + nitrite thành NH4 và NH3. Hai hợp chất này có thể phục vụ cho quá trình nitrate - + - hóa. Enzyme xúc tác chuyển hóa NO2 thành NH4 do gen NrfA mã hóa, NO2 thành NH3 do hệ gen phức tạp NrfHA mã hóa. Khử n trate đồng hóa + Khử nitr te đồng hó đ ợc di n ra v i mụ đí h tạo ra NH4 là nguồn N cho quá trình tổng hợp tế bào của VK. Enzyme xúc tác cho s chuyển hóa nitrite thành amoni và amoniac là do gen NirA và NasB mã hóa. Cả h i hế khử nitrate dị hóa và khử nitr te đồng hó , đầu đều khử nitrate về nitrite nh ng enz me xú tác là khác nhau. Ở khử nitr te đồng hóa enzyme xúc tác do gen Nas mã hóa, trong khi khử nitrate dị hó l o gen N r/N p mã hó Nh vậy, trong quá trình phản nitrate chỉ có quá trình khử nitrate dị hóa – hô hấp nitrate kỵ khí m i ó nghĩ xử lý N trong n c thải Đó l sở để tiến hành phân lập chủng VK mong muốn Nghĩ l hủng VK đó ó khả n ng khử nitrate và khử nitrite hoàn toàn, tạo thành các phân tử khí N2O, NO, tốt nhất là tạo ra khí N và không hoặc ít tạo ra amoni. Vì nếu l ợng amoni tạo ra nhiều sau quá trình xử lý thì 17
Đồ án tốt nghiệp việc ứng dụng VK đó v o xử l n c thải kh ng òn nghĩ , ng ợc lại còn làm cho n c ô nhi m nghiêm tr ng h n 1.2.2.2. Các yếu tố ảnh h ởng đến quá trình phản nitrate Các yếu tố ảnh h ởng mạnh mẽ đến quá trình phản nitrate đã đ ợc tìm hiểu và nghiên cứu là: nguồn cung cấp C, điều kiện m i tr ờng kỵ khí (s vắng mặt của oxy phân tử và s hiện diện của ion nitrate), s hiện diện của VK có khả n ng phản nitr te, điều kiện thích hợp cho s phát triển của VK.  Nguồn cung cấp carbon v n ng l ợng (C hất): Để quá trình khử nitrate xảy ra hoàn toàn thì nguồn cung cấp n ng l ợng và carbon (C) phải l n h n nồng độ ion nitrate hoặ nitrite, đ l ếu tố quan tr ng quyết định quá trình phản nitrate. Khi nồng độ ox trong m i tr ờng giảm thấp, các VK kỵ khí tùy nghi hay kỵ khí có s chuyển đổi về hệ thống enzyme từ việc sử dụng oxy làm chất nhận điện tử sang có thể sử dụng ion nitrate hoặc nitrite là chất nhận điện tử. Quá trình hô hấp kỵ khí di n ra phức tạp h n h hấp hiếu khí nên nguồn C v n ng l ợng cần phải nhiều h n Việc khử nitrate hoàn toàn hoặc loại bỏ tất cả các ion nitrite và các ion nitrate di n ra khi tỷ lệ giữa nguồn cung cấp C và n ng l ợng v i ion nitrate hoặc ion nitrite vào khoảng 3: , trong n c thải tỷ lệ này có thể là 3:1.05. Nguồn C v n ng l ợng VK phản nitrate sử dụng th ờng là các hợp chất hữu phân hủy sinh h nh : meth nol, xit xeti , glu ose, eth nol, Trong đó, xit eti v meth nol l h i hợp chất th ờng sử dụng nhiều nhất. - + NO3 + 0,85CH3COOH + H → , C5H7O2N + 0,45N2 + 1,2CO2 + 2,1H2O - + NO3 + 1,8CH3OH + H → , 65C5H7O2N + 0,47N2 + 0,76CO2 + 2,44H2O Meth nol l hất đ ợ u ti n sử dụng nhiều h n, o meth nol l hất d hò t n, nh nh hóng đi v o n trong tế o VK v ũng dàng bị chuyển hóa. Bảng 1.5. Nồng độ methanol sử dụng để khử nitrate hoặc nitrite hoàn toàn (A) (Michael H. Gerardi, 2002) Ion chứa N (A)/(1 mg/l ion chứa N) Tế bào m i N đ ợc dùng tổng hợp tế bào - NO2 1,5 mg/l 0,3 mg 0,04 mg - NO3 2,5 mg/l 0,5 mg 0,06 mg 18
Đồ án tốt nghiệp Đ ều kiện mô trƣờng kỵ khí: Phân tử oxy hòa tan ức chế quá trình phản nitrate do s cạnh tranh v i các ion nitrate và nitrite trong vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng cho quá trình phân hủy chất hữu Khi ox đi v o tế bào VK, thì việc sử dụng oxy làm chất nhận điện tử cho quá trình hô hấp sẽ u ti n h n việc sử ion nitrate hoặc nitrite, do việc sử dụng oxy hòa tan mang lại nhiều n ng l ợng và d tổng hợp tế o h n Nồng độ oxy hòa tan l n h n , - 0,5 O2 mg/l thì làm giảm đ ng kể tố độ của quá trình khử nit ho n toàn. Để quá trình phản nitrate xảy ra thì quá trình nitrate hóa phải xả r , đ l điều kiện tiên quyết cho quá trình khử nitr te Độ l n của nồng độ nitrate hoặc nitrite ít ảnh h ởng đến quá trình khử nitrate. Khi nồng độ nitrate > 0,5 mgN/l, thì s khử nitrate sẽ không phụ thuộc vào nồng độ nitrate. S hiện diện của vi khuẩn phản nitrate: Trong quá trình bùn hoạt tính, khoảng 80% VK là VK kỵ khí tùy nghi và có khả n ng khử nitrate. Vì trong quá trình này, dung tích hỗn hợp khá l n bao gồm c hất cần thiết và cả các chất l lững tan hoặc không tan có thể gây ảnh h ởng đến quá trình, nên cần một l ợng l n VK mụ đí h để đảm bảo quá trình khử nitrate di n ra thuận lợi. Có thể bổ sung VK khử nitrate vào quá trình xử lý từ các chế phẩm sinh h đặ tr ng Điều kiện thích hợp cho vi khuẩn phát triển: - pH: Khử nitrate có thể xảy ra trong phạm vi pH rộng 6,5 – 8,5, đ ũng l khoảng pH thích hợp cho quá trình hình thành bông cặn trong gi i đoạn bùn hoạt tính. Tố độ khử nitrate sẽ chậm lại khi pH 8,5. Mặt khác, khi giá trị pH<6 không chỉ ức chế quá trình khử nit , m òn ả quá trình nitrate hóa, và việc tạo ra khí N là không thể. Khoảng pH tối u ho qu trình khử nitrate là 7,0 – 7,5. - - Nhiệt độ: Khử nitrate xả r nh nh hóng h n ở nhiệt độ t ng v ng ợc lại sẽ chậm h n khi nhiệt độ giảm, nhiệt độ tối u ho qu tr nh l 4 oC. Khử 19
Đồ án tốt nghiệp nitrate bị ức chế trong n c thải ở nhiệt độ < 5oC. Khi nhiệt độ t ng th s hò t n ox trong n c giảm nhiều h n so v i n c có nhiệt độ giảm. Vì vậy, oxy hòa tan bị cạn kiệt nh nh h n trong điều kiện n c thải có nhiệt độ cao nên quá trình khử nitrate xảy ra d ng h n - Bên cạnh các yếu tố trên, thì s vắng mặt hoặc hiện diện ở nồng độ thấp của các hợp chất độc hại trong m i tr ờng khử nitrate là một yêu cầu cần nhắc đến nhằm đảm bảo cho quá trình xảy ra thuận lợi. So sánh s nhạy cảm đối v i chất độc hại giữa VK t ỡng và VK dị ỡng thì ở VK t ỡng ó độ nhạy cảm o h n, n n nếu quá trình nitrate hóa có thể xảy ra trong quá trình bùn hoạt tính, thì hiển nhiên sẽ có quá trình khử nitrate xảy ra. 1.3. Tổng quan về một số vi khuẩn phản nitrate VK phản nitrate phân bố rộng rãi trong t nhiên. Phần l n chúng thuộc loại dị ỡng hó n ng hữu , kỵ khí hoặc kỵ khí tùy nghi. Theo tổng quan về vi khuẩn phản nitrate (denitrifier) trong Prokaryote tập 2, Shapleigh, 2006 liệt kê một danh sách l n các vi khuẩn phẩn nitrate bao gồm vi khuẩn Gr m m v Gr m ng S u đ l một số loài VK có khả n ng phản nitr te đã đ ợc nghiên cứu và có tiềm n ng ứng dụng. 1.3.1. Pseudomonas stutzeri Đ l VK ó khả n ng khử nitrate thành N phân tử trong m i tr ờng hiếu khí, vì thế Pseudomonas stutzeri đ ợc ứng dụng khá rộng trong m i tr ờng n c chứa nhiều chất đạm tại các ao hồ nu i tr , s v đặc biệt trong xử l n c thải đặ tr ng 3 Đặ điểm Pseudomonas stutzeri là VK gram âm, hình que, di chuyển bằng một c c ti m m o Kí h th c tế bào: dài 1 - 3 µm, rộng 0,5µm. Khuẩn lạc có hình dạng kh ng ki n định khi đ ợc phân lập tr c tiếp, khuẩn lạc có dạng sần, khô, bám chặc v i nhau. Pseudomonas stutzeri là VK dị ỡng hó n ng hữu , kh ng ó sắc tố và có thể t ng tr ởng trong m i tr ờng amylase, maltose, tinh bột, cho kết quả ng 20
Đồ án tốt nghiệp tính v i phản ứng t l se, oxi se, in ol v qu tr nh ox hó nh ng kh ng ph t triển trong gel tin se, kh ng l n men đ ờng glucose, lactose, sucrose và cho kết quả âm tính v i thử nghiệm VP-MR . Là VK hiếu khí, phân bố rộng rãi trong t nhi n nh ng đ ợc tìm thấy chủ yếu trong đất v n c. Nhiều òng đ ợc phân lập từ các m u bệnh lý. Chúng có khả n ng hu ển hóa, làm giảm các chất độc cho môi tr ờng và các hợp chất có tr ng l ợng phân tử o nh pol eth lene gl ols. D a vào các nghiên cứu gen (trình t 16S rRNA) cho thấy Pseudomonas stutzeri t ng đồng v i lo i nh Pseudomonas mendocinia, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas pseudoalcaligenes và Pseudomonas balearica. Hình 1.8. Hình thái khuẩn lạc Pseudomonas stutzeri 2.3.1.2. Ứng dụng Pseudomonas stutzeri là loại VK khử nitrate, không phát quỳnh quang. Gần đ nhiều nhà nghiên cứu khoa h đ ng hú đến khả n ng hu ển hóa chuyên biệt của nó. Một vài dòng có thể chuyển hóa các hợp chất th m nh n phthalene và mathylnapthalenes. Hai hợp chất th m n hiện diện nhiều trong dầu thô, là chất có tiềm n ng g độc. P.stutzeri đ ợ đề cập nh một hệ thống khử nitrate vì nó có khả n ng l m giảm nitrate thành khí N2. Một số loài có khả n ng iến đổi t nhiên, l đối t ợng thích hợp cho các nghiên cứu về s biến đổi gen trong m i tr ờng. Ở Việt Nam, các chủng VK đị ph ng khử đạm mạnh, phù hợp v i điều kiện sinh th i đị ph ng ó thể ứng dụng vào xử l m i tr ờng n đã đ ợc các 21
Đồ án tốt nghiệp nhà khoa h c nghiên cứu, đặc biệt gần đ nhất l đề tài phân lập VK Pseudomomas stutzeri có khả n ng khử đạm mạnh trong n c thải ao cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu ong v đ ng ần đ v o ứng dụng xử l n c thải. 1.3.2. Paracoccus denitrificans 1.3.2.1. Đặc điểm Paracoccus denitrificans là VK gram âm, hình cầu, kh ng i động Tr c đ đ ợc biết đến v i tên Micrococcus denitrificans, lần đầu ti n đ ợc phân lập vào n m 9 ởi M Beijerin k, v o n m 969 đổi tên thành Paracoccus denitrificans bởi DH Davis. P. denitrificans là một sinh vật mô hình cho việc nghiên cứu quá trình khử N. Là VK có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí l n kỵ khí. Paracoccus denitrificans l VK ó qu tr nh tr o đổi chất linh hoạt đ ợc tìm thấ trong đất và bùn hoạt tính, có thể sử dùng cả hai nguồn n ng l ợng v v hữu , từ các hợp chất hữu nh meth nol v meth l mine, hợp chất v nh h ro v l u huỳnh (thiosulfate). Là VK có khả n ng đảm nhiệm vai trò khử hoàn toàn nitrate thành N phân tử vì chứa cả 3 enzyme quan tr ng trong quá trình khử nitrate. Là VSV phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, thể hiện một chuỗi hô hấp rất giống v i ty thể ó nh n điển hình. P. denitrificans đã v v n tiếp tục là chủ đề của nhiều nghiên cứu sinh hóa và sinh h c chuyển hó n ng l ợng, tính chất ản của chuỗi vận chuyển điện tử hiếu khí. Các bằng chứng từ 16S rRNA phân tích chỉ ra rằng tiền thân tiến hóa của ty thể là một h hàng gần của P. denitrificans. Hình 1.9. Hình thái tế bào và khuẩn lạc Paracoccus denitrificans 22
Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.2. Ứng dụng Paracoccus denitrificans tạo r h n 5 protein Trong đó ó nhiều protein và enzyme rất có ích trong các ứng dụng công nghệ sinh h c. Một số ứng dụng nh làm chất xúc tác các phản ứng sinh h c, làm màng l vi sinh để loại bỏ N khỏi n c thải. Paracoccus denitrificans có khả n ng khử nitrate thành khí N hiệu quả. Trong ứng dụng này, Paracoccus denitrificans kết hợp v i Nitrosomonas europaea làm giảm amoni thành nitrite. Hệ thống n giúp đ n giản hóa quá trình loại bỏ N trong n c thải. Các chủng Paracoccus denitrificans đ ợc phân lập từ bùn hoạt tính có thể phân hủy một loạt min meth l hó trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí, các chủng thuộc dạng t ỡng hó n ng v ó khả n ng l m giảm các hợp chất C bậc bốn nh imeth lm lon te trong điều kiện khử nitrate kỵ khí. Một số chủng có khả n ng khử N hiếu khí, khử hoàn toàn nitrate thành N phân tử trong điều kiện t ng tr ởng hiếu khí. 1.3.3. Bacillus azotoformans 1.3.3.1. Đặc điểm Bacillus azotoformans là một tr c khuẩn gr m ng, i động v đ ợc tìm thấ trong đất, có khả n ng khử ho n to n nitr te th nh khí N trong điều kiện kỵ khí. Tế bào B. azotoformans có hình bầu dục v i kí h th c 1,4 x 2 - 2,5 µm, sinh bào tử. Phát triển ở pH 6 – 7, nhiệt độ 42 – 460C, ở 40C VK ng ng ph t triển. Bacillus azotoformans có kết quả ng tính v i thử nghiệm oxidase, khử nitr te v itr te nh ng kh ng ó khả n ng l n men, ph n hủy tinh bột, gelatin, Tween 80 và cho kết quả âm tính v i thử nghiệm VP-MR, catalase, urea, indol. 2.3.3.2. Ứng dụng Tứ đặc tính trên, Bacillus azotoformans đ ợc ứng dụng trong xử l n c thải chứ N nh n c thải thủy sản, n c thải chế biến thịt v đ ng ó nhiều nghiên cứu về việc ứng dụng B. azotoformans trong lĩnh v c cuộc sống. 1.3.4. Thiobacillus denitrificans 1.3.4.1. Đặc điểm 23
Đồ án tốt nghiệp Thiobacillus denitrificans là VK gram âm, tế bào có hình que ngắn (0,5 x 1,0 – 3,0 µm). Là VK t ỡng hó n ng v , trong m i tr ờng kỵ khí tùy ý, có khả n ng ox hó hợp chất l u huỳnh v nh h rogen sulfi e, thiosulf te để khử các hợp chất N nh nitr te, nitrite đến khí N Điều kiện tối u ho qu tr nh khử N là pH 6,85 ở 32,8oC, trong khi đó điều kiện tốt nhất cho s t ng tr ởng là pH 6,90 ở 29,5oC. Thiobacillus denitrificans có thể khử N trong m i tr ờng có chứa các hợp chất Fe nh FeS2, FeS. Hình 1.10. Hình thái tế bào Thiobacillus denitrificans VK i động đ ợc bằng một c c tiêm mao, khuẩn lạ tr n m i tr ờng thạch thiosulfat/ nitrate yếm khí cho màu trắng đục. Thiobacillus denitrificans phát triển chậm, kh ng ó gi i đoạn ổn định rõ r ng Nh ng ph log đạt đ ợc ở gi i đoạn khử N tối đ , 45 mg/l. Mặc dù Thiobacillus denitrificans là một sinh vật kỵ khí tù nghi, nh ng nó có thể sống trong điều kiện hiếu khí. Thiobacillus denitrificans đ ợc tìm thấy trong đất, ùn, n c ng t, biển trầm tí h, n c thải và bể xử l n c thải trong điều kiện thiếu khí. Thiobacillus denitrificans đ ợc phân lập đầu tiên bởi Beijerin k v o n m 1904. 1.3.4.2. Ứng dụng T. denitrificans đ ợc ứng dụng trong việc loại bỏ nitr te thừa trong nguồn n c ngầm t nhiên. Là VK t ỡng đầu tiên và duy nhất có thể oxy hóa uranium (IV), oxit ur nium trong điều kiện kỵ khí tù nghi n n đ ợc dùng khắc phục các 24
Đồ án tốt nghiệp tầng chứ n c bị ô nhi m uranium. L VK đ ợc ứng dụng trong xử l n c thải có chứa cả các hợp chất l u huỳnh và N. Bảng 1.6. Tóm tắt đặc tính hình thái và sinh lý, sinh hóa của các vi khuẩn phản nitrate tiềm n ng Achromo- Bacillus Pseudomonas Paracoccus Thiobacilus Đặ đ ểm bacter azotofor- stutzeri denitrificans denitrificans xylosoxidans mans Hình thái Gram - - - - + Hình dạng Que Cầu Que Que ngắn Que 0,4x1,1 0,5x1,0-1,5 0,4x0,7–1,0 0,5 x 1,0 - 3,0 1,4 x 2- Kí h th c m m m m 2,5m Tiên mao + - + + + Sinh lý Kỵ khí tùy Kỵ khí tùy Yêu cầu oxy Hiếu khí Kỵ khí tùy nghi Kỵ khí tùy nghi nghi nghi Di động + - + + + Nhiệt độ M i tr ờng 25oC M i tr ờng 28 – 32oC 42 – 46oC Nội bào tử - - - - + Sinh hóa Catalase + k x đ + k x đ - O/F O+/F- k x đ O-/F- k x đ O+/F- Oxidase + k x đ + k x đ + MR - k x đ - k x đ - VP - k x đ - k x đ - Indol + k x đ = k x đ - Sử dụng citrate + k x đ + k x đ + 25
Đồ án tốt nghiệp Khử nitrate + + + + + (k x đ = kh ng x định). 1.4. Tổng quan p ƣơng p áp p ân lập vi sinh vật [2] Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, VSV th ờng tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá hoặc sử dụng vào th c ti n một lo i n o đó th ần phải đ húng về dạng thuần khiết. 1.4.1. Khái niệm Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV từ quần thể n đầu và đ về dạng thuần khiết Đ l một kh u ó nghĩ rất quan tr ng trong việc nghiên cứu và ứng dụng VSV. VSV ở dạng thuần khiết là giống VSV đ ợc tạo ra từ một tế o n đầu. D a theo nguyên tắc: tách rời các tế bào VSV; nuôi cấy các tế bào trên trong m i tr ờng inh ỡng đặ tr ng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau. 1.4.2. Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết Gồm ản sau: - Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể VSV n đầu: hóa lỏng m u phân lập, ph loãng đến nồng độ cần thiết, tiến hành cấy m u trên môi tr ờng đặ tr ng, để ó đ ợc chủng thuần có thể lập lại nhiều lần pha loãng đến khi khuẩn lạc xuất hiện tr n m i tr ờng thạ h đều đồng nhất. - Phân lập VSV thuần khiết: cấy chuyền nhiều lần đối v i từng loại khuẩn lạc riêng rẽ, có thể tiến hành cấy ria hoặc cấy trang. Chủng thuần khi khuẩn lạ tr n m i tr ờng là cùng một loại duy nhất, có hình thái giống v i khuẩn lạ n đầu. Mỗi khuẩn lạ đ n hỉ chứa một loại tế bào có hình thái giống nh u trong qu n s t i kính hiển vi. Khi th c hiện phải tuân thủ nghiêm túc các yêu cầu về thao tác vô trùng. 26
Đồ án tốt nghiệp - Kiểm tr độ tinh khiết của các khuẩn lạc: ch n các khuẩn lạc riêng rẽ tr n m i tr ờng thạ h, s u đó ph loãng ở các nồng độ cần thiết bằng n c muối sinh lý vô trùng, tiến hành cấ tr ng đối v i các nồng độ pha loãng. Ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp, quan sát nếu khuẩn lạc đồng nhất về màu sắc, hình dạng th đ ợc giữ lại, ng ợc lại khuẩn lạc không thuần nhất thì loại bỏ. S thuần khiết của khuẩn lạ đồng nghĩ v i s thuần khiết của giống. Việc l a ch n nguồn lấy m u ũng kh ần thiết, từ m i tr ờng lấy m u đặc tr ng t ó thể d dàng phân lập đ ợc chủng VSV mong muốn. Sau quá trình làm thuần chủng VSV phân lập, c kế tiếp có thể là xác định hình thái VSV bằng ph ng ph p nh nhuộm gram, nhuộm bào tử, nhuộm tiêm mao, nhuộm vỏ nhày, Và th c hiện các thử nghiệm sinh hó nh : kiểm tra khả n ng l n men, ox hó tr n m i tr ờng OF, thử nghiệm Indol, VP-MR, Catalase, Oxi se, Citr te, để từ đó tu ển ch n đ ợc chủng cần phân lập. 1.4.3. Giữ và bảo quản giống - Ph ng ph p ấy chuyền định kỳ: áp dụng cho tất cả các loại VSV. Ph ng ph p n đ n giản, d th c hiện nh ng thời gian bảo quản không lâu, tốn m i tr ờng, thời gian và phẩm chất n đầu của giống có thể bị th đổi sau mỗi lần cấy chuyền. - Ph ng ph p giữ giống tr n m i tr ờng thạch có l p dầu khoáng: v i yêu cầu các chất dầu kho ng nh p r fin lỏng, v z lin phải trung tính, độ nh t o, kh ng độc hại v i VSV và vô trùng (hấp 121oC, 2 giờ; sấy khô trong tủ sấy ở 170oC, 1-2 giờ). Dầu kho ng đ ợc cho lên bề mặt m i tr ờng đã ấy VSV, cách mép trên ống nghiệm 1 m Đối v i VSV kỵ khí cần loại bỏ O2 trong m i tr ờng tr c khi cấy chủng vào và tiến hành cho l p dầu khoáng vào thật nh nh Ph ng ph p n kh đ n giản nh ng ó hiệu quả cao nhờ khả n ng l m hậm quá trình biến ỡng và hô hấp, làm cho VSV phát triển chậm lại Ph ng ph p n kh ng l m m i tr ờng mất n c và khô. 27
Đồ án tốt nghiệp - Ph ng ph p giữ giống tr n đất, cát, hạt: Đất và cát l m i tr ờng dùng bảo quản các chủng có khả n ng tạo bào tử tiềm sinh, thời gian bảo quản từ một đến nhiều n m Đất, t s u khi s hế (loại bỏ axit hữu , rửa kỹ, sấ kh , v trùng) th đ ợc cho vào ống nghiệm có VSV đã ph t triển tr n m i tr ờng thạch, lắ đều, cho toàn bộ vào ống nghiệm khác và hàn kín miệng sẽ bảo quản đ ợc rất lâu; Hạt là môi tr ờng ùng để bảo quản các chủng có dạng sợi sinh bào tử hoặc không. Thời gian bảo quản có thể đến một n m Hạt s u khi đ ợc rửa sạch, nấu cho vừa nứt, để ráo, cho vào ống nghiệm và phủ một l p bông thấm n c nấu hạt, cấy giống vào, khi VSV m c dày đặc thì giữ ở nhiệt độ 15 – 20oC. - Ph ng ph p đ ng kh : l m mất n c tế bào ở trạng thái t do, làm ng ng hẳn quá trình phân chia của VSV, nhờ đó giống có khả n ng chịu đ ợc nhiều t động của ngoại cảnh Ph ng ph p n đ ợc áp dụng trong sản xuất, thời gian bảo quản l n đến vài chụ n m S l a ch n VSV ở gi i đoạn phát triển thích hợp ũng l ếu tố khá quan tr ng trong việc bảo quản giống. 28
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thờ g an và địa đ ểm th c hiện đề tài - Thời gian: Từ ngày 21/4/2015 – 21/7/2015 - Đị điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Công nghệ sinh h c – Th c Phẩm – M i tr ờng tr ờng Đại H c Công Nghệ TPHCM. 2.2. Vật liệu – thiết bị - hóa chất 2.2.1. Vật liệu - Nguồn phân lập vi khuẩn: M u n c thải đ ợc thu thập từ bể gom n c thải của công ty chế biến thủy sản Tân Phú Kiên Giang – số 4 đ ờng Minh H ng, ấp Hò H ng, xã Minh Hò , hu ện Châu Thành, tỉnh Kiên Giang. 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ - Nồi tiệt trùng Autoclave, cân điện tử, m l t m, m đo độ hấp thụ quang h c, máy lắc. - Cốc thủy tinh, erlen thủy tinh, pipet, micropipette, ống nghiệm, đĩ petri, eppen orf, xil nh 2.2.3. Hóa chất - M i tr ờng Giltay (Egorov NS,1986) - M i tr ờng NB (Nutrient Broth) t ng sinh vi khuẩn. - M i tr ờng OF (Harley, P. et al., 2002). - M i tr ờng MR-VP (Harley, P. et al., 2002). - M i tr ờng Indol (Harley, P. et al., 2002). - Thuốc thử: Griess A, Griess B, Diphenylamine, Nessler (Egorov NS,1986). - Các hóa chất định l ợng nitrate, nitrite, amon (Nguy n V n Ph c, 2005). - Bộ thuốc nhuộm Gram: Crystal Violet, Lugol, Fuchsin. 29
Đồ án tốt nghiệp 2.3. Bố trí thí nghiệm : Các bước thí nghiệm được trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau Nƣớc thải CBTS T ng sinh trong MT Gilt NO3- và Giltay NO2- - Qu n s t m i tr ờng đục, Định tính khả n ng khử Định tính khả n ng khử NO2 Định tính khả n ng khử + sinh khí NO3- (Diphenylamine) (Griess, Zn) NH4 (Nessler) 12 ống nghiệm tăng s n đều đục sinh khí, và khử hoàn toàn - NO3- và NO2 trong mô trƣờng. - Phân lập tr n m i tr ờng Giltay NO2 có bổ sung Phenol Red. L a ch n khuẩn lạc làm hồng môi tr ờng xung quanh. Làm thuần/ giữ giống trên môi - tr ờng Giltay NO3 6 chủng VSV thuần khiết - T ng sinh trong MT Gilt NO3 và - Giltay NO2 - - Qu n s t m i tr ờng đục, Định tính khả n ng khử NO3 Định tính khả n ng khử NO2 Định tính khả n ng khử + sinh khí NH4 (Nessler) định pH môi tr ờng 4 chủng VSV có khả năng k ử cả Nitrite và Nitrate Thử nghiệm O/F, nhuộm Gram và các thử nghiệm sinh hóa khác. - Khảo sát khả n ng khử NO2 trong 48h Định l ợng Nitrate, Nitrite, Quan sát thể tích khí sinh ra định pH m i tr ờng sau Amon tại các mốc khảo sát trong xylanh khi t ng sinh 30
Đồ án tốt nghiệp Khảo sát khả n ng khử - NO3 trong 48h Định l ợng Nitrate, Nitrite, Quan sát thể tích khí sinh định pH m i tr ờng Amon tại các mốc khảo sát ra trong xylanh s u khi t ng sinh Hình 2.1 S đồ tóm tắt bố trí c thí nghiệm 2.4. P ƣơng p áp ng n ứu th c nghiệm 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu M u n c thải đ ợc lấy từu bể thu gom của nhà máy CBTS. Khuấ đều tr c khi lấy. M u đ ng trong can nh 5 lit đã đ ợc rửa sạ h v đ về phòng thí nghiệm, s u đó tiến h nh ng c phân lập trong vòng 24 giờ. 2.4.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng VK có khả năng phản nitrate 2.4.2.1. Phương pháp tăng sinh và phát hiện VSV có khả năng khử nitrate  P ƣơng p áp tăng s n T ng sinh tr n m i tr ờng Giltay có chứa nguồn C là acid citric, nguồn N là NaNO3/NaNO2 và một số chất quan tr ng kh M i tr ờng Giltay là một trong những m i tr ờng t ng sinh đặ tr ng ho VK phản nitr te Do trong m i tr ờng Giltay có chứa một l ợng l n Acid Citric (5,46875g/l) nên phải điều chỉnh pH môi tr ờng về trung tính tr c khi sử dụng. - Để sàng l c các VK phản nitrate có khả n ng hịu mặn bổ sung vào môi tr ờng 1.5 – 3% NaCl. - M i tr ờng tr n s u khi đ ợc chỉnh pH về khoảng 7 – 7,5 v i KOH 10% đ ợc phân vào các ống nghiệm (5ml) có ống Durham, nút bông và nắp nh a hoặc nút bông có quấn Parafin, hấp tiệt trùng 121oC/15 phút. - M u lấy về đ ợc pha loãng bằng n c muối sinh lý (0.85%) ở các nồng độ 10-2 – 10-7. Từ mỗi nồng độ, lần l ợt lấy 1ml m u cấy vào ống nghiệm chứa m i tr ờng Gilt đã tiệt trùng Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Ống đối chứng là m i tr ờng không cấy m u. Ủ ở nhiệt độ phòng (28±2oC) trong 7 ngày. 31
Đồ án tốt nghiệp Dấu hiệu nhận biết s phát triển của VK khử Nitrate là có sinh khí trong ống Durh m, đụ m i tr ờng v pH m i tr ờng giảm. Bảng ký hiệu sau giúp d dàng nhận biết về s phát triển và s sinh khí của VK. Bảng 2.1. Độ đụ m i tr ờng v l ợng khí sinh ra của các m u m i tr ờng s u khi t ng sinh VK ph n lập Độ đục MT (sinh khối VK tạo ra) MT không đục MT đục ít MT đục vừa MT đục nhiều Ký hiệu - + + ++ + + Sinh khí Sinh khí rất ít Sinh khí ít Sinh khí vừa Sinh khí nhiều Ký hiệu - * + + ++ Tiến hànhKhôn kiểgm tra nồng nộ nitrate - nitrite trong m+ i tr ờng s u +t ng sinh sinh VK bằng thuốc thử Diphenylamine và nồng độ nitrite bằng thuốc thử Griess A, khí + Griess B và bột kẽm, nồng độ NH4 sinh ra bằng thuốc thử Nessler đối v i các ống nghiệm ó m i tr ờng đục, ống Durh m sinh khí nh s u: 32
Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.2. P ƣơng p áp định tính nồng độ nitrite trong mẫu M u Nhỏ Griess A + Cho ột Kết luận Griess B Zn (ít) Không màu Đỏ hồng - D ng tính – có s khử nitrate thành nitrite Không màu Không màu Không D ng tính, có s sinh khí màu trong ống Durham. Không màu Không màu Đỏ hồng Âm tính – không có s khử nitrate thành nitrite và không sinh -khí. M u ĐC (+) là môi tr ờng chứa ion NO 2. ĐC (-) là n ất Bảng 2.3. Ph ng ph p định tính nồng độ nitrate Mẫu Diphenylamine Kết luận Không Xanhg ọt) V n còn nitrate trong môi tr ờng. Độ đậm nhạt màu d a vào nồng độ còn lại ủ nitrate. Không Không màu Nitrate đã đ ợ chuyển hóa hết màu - M u đối chứng d ng ĐC (+) là môi tr ờng có chứa ion NO 3 (Giltay). ĐC (-) là n ất. Bảng 2.4. Ph ng ph p định tính nồng độ amoni: Mẫu Nessler(1g ọt) Kết luận Không Màu vàng + Có s tạo thành NH4 , độ đậm nhạt phụ thuộ vào màu nồng độ Không Không màu + Không ó s tạo thành NH4 màu M u ĐC (+) là dung dịch NH4Cl 0,5%, ĐC (-) là n ất 2.4.2.2. Phương pháp phân lập Từ các ống ng tính khử nitrate/nitrite ở thí nghiệm tr n (Đục, sinh - - khí,khử nitrate), th c hiện cấ ri s ng m i tr ờng thạch Giltay NO3 /NO2 (agar 2 – 2,5%), bổ sung thêm Phenol Red 1 mg/l. Ủ ở nhiệt độ phòng (28±2oC) trong 1 – 3 ngày. L a ch n các khuẩn lạc riêng lẻ, giảm pH m i tr ờng xung quanh khuẩn lạc (làm hồng m i tr ờng xung quanh). Các khuẩn lạc khác nhau đ ợc cấy ria nhiều lần 33
Đồ án tốt nghiệp - tr n m i tr ờng Giltay NO3 thạch nhiều lần ho đến khi thu đ ợc các chủng VK thuần khiết. Các chủng VK thuần khiết tr n đ ợc tiến hành cấ v o m i tr ờng GIltay - - NO3 và NO2 để tiến hành kiểm tra khả n ng khử nitr te/nitrite nh ở mục sau. 2.4.2.3. Phương pháp tăng sinh VK phân lập trên môi trường Giltay nitrate và nitrite - M i tr ờng t ng sinh l m i tr ờng Giltay nitrate và Giltay nitrite. Mỗi chủng VK lần l ợt đ ợc cấy vào các ống nghiệm chứ m i tr ờng trên (5 ml) đ ợc hấp tiệt trùng, có ống durham. Mỗi chủng VK đ ợc cấy vào cả môi - - tr ờng Giltay NO3 v m i tr ờng Giltay NO2 , đậy bằng nắp nh a và quấn parafin. Ủ ở nhiệt độ phòng, quan sát 5 – 7 ngày. - Tiến h nh định tính khả n ng khử Nitrite bằng thuốc thử Griess A, Griess B và bột kẽm theo bảng sau: - Kiểm tra s chuyển hóa Nitrite thành Nitrate bằng thuốc thử Diphenylanime. - Sản phẩm của s khử Nitrite là khí trong ống urh m Trong tr ờng hợp xảy + ra s khử nitr te đồng hóa thì NH4 có thể là sản phẩm của s khử nitrite. + Định tính s tạo thành NH4 sau khi nuôi cấ VK trong m i tr ờng Giltay nitrite bằng thuốc thử Nessler. Các chủng VK đạt yêu cầu trong định tính khả n ng khử nitrite và cho kết quả lên men âm tính (-) trong thử nghiệm khả n ng l n men, oxi hó đ ờng glucose (th c hiện ở mụ s u) đ ợc tiến hành giữ giống trong ống thạch nghiêng ở nhiệt độ 4oC. 2.4.3. Các thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng VK phân lập [8] 2.4.3.1. Thử nghiệm khả năng lên men (F) và oxy hóa (O) glucose Ý nghĩ ủa thử nghiệm này là kiểm tra khả n ng hu ển hóa glucose theo các cách khác nhau (lên men và oxy hóa). Thí nghiệm này góp phần quan tr ng trong việc loại bỏ VSV đ ờng ruột, vì hầu hết VSV đ ờng ruột đ u ó khả n ng l n men, nh ng đối v i hầu hết VK phản nitrate luôn cho kết quả (-) đối v i 34
Đồ án tốt nghiệp l n men đ ờng Glucose. Tiến h nh tr n m i tr ờng OF (Rucolph Hugh & Einar Leifson), chứa bromothymol blue là chất chỉ thị, pH 7,1. M i tr ờng OF s u khi đun t n g r đ ợ ph n đều vào các ống nghiệm (10ml), s u đó hấp khử trùng 121oC/15 phút. Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối (sinh khối đ ợ t ng sinh 4 – 48 giờ), đ m s u v o m i tr ờng OF đã đ ợc hấp khử trùng ở trên. Cho parafin lỏng (vô trùng) vào các ống nghiệm ùng để thử nghiệm khả n ng l n men glu ose (tạo điều kiện kỵ khí) Đ c kết quả sau 1,2 ngày. - Kết quả l n men ng tính (+) khi ả hai ống đều chuyển sang màu vàng, nghĩ l VK ó khả n ng l n men đ ờng glucose trong cả h i m i tr ờng hiếu khí (ống không có parafin lỏng) và kỵ khí (ống có chứa parafin lỏng). Các sản phẩm xit trong l n men l m gi m pH m i tr ờng từ pH 7,1 xuống pH 6,0 d n đến l m th đổi màu chỉ thị của bromothymol blue từ xanh lá sang vàng. - Kết quả ox hó ng tính (+) khi hỉ có ống không chứa parafin lỏng chuyển s ng m u v ng, nghĩ l VK hỉ chuyển hó glu ose theo on đ ờng ox hó trong m i tr ờng hiếu khí, không lên men trong điều kiện kị khí Sản phẩm oxy hóa glucose là acid yếu l m th đổi màu chỉ thị chậm. - Kết quả âm tính (-) (không chuyển hóa glucose): cả hai ống đều không chuyển sang màu vàng. Trong một số tr ờng hợp màu chỉ thị th đổi từ x nh l s ng x nh ng o pH m i tr ờng t ng (pH > 7,6) Đó l kết quả của việc VK sử dụng peptone (tạo m i tr ờng kiềm do s chuyển hóa các amino acid). 2.4.3.2. Thử nghiệm Catalase - Mục tiêu: Tìm hệ enzyme catalase ở vi sinh vật v i thuốc thử H2O2. - Nguyên tắc: H2O2 -> H2O + 1/2 O2 (b t khí) - Th c hiện: Dùng que cấy lấy sinh khối VK đặt lên lam kính sạch, nhỏ một gi t H2O2 lên sinh khối VK. - Kết quả: phản ứng (+) khi xuất hiện b t khí; (-) khi không xuất hiện b t khí. 2.4.3.3. Thử nghiệm MR 35
Đồ án tốt nghiệp - M i tr ờng tiến hành: Glucose Photphat (MR-VP broth). - Mục tiêu: x định VSV có khả n ng tạo ra và duy trì sản phẩm axit bên trong m i tr ờng từ quá trình lên men glucose v i thuốc thử methyl red. - Nguyên tắc: VSV lên men glucose tạo sản phẩm axit, làm giảm pH môi tr ờng, d n đến l m th đổi màu chất chỉ thị pH (methyl red). - Th c hiện: Cấy sinh khối VSV v o m i tr ờng MR – VP đã tiệt trùng 121oC/15 phút, ủ 37oC trong 24 – 48 giờ Khi đ c kết quả nhỏ 1 – 2 gi t methyl red vào. - Kết quả: phản ứng (+) khi m i tr ờng chuyển s ng m u đỏ , phản ứng (-) khi m i tr ờng không chuyển m u (m u m i tr ờng – màu vàng). 2.4.3.4. Thử nghiệm VP - M i tr ờng tiến hành: glucose photphat (MR – VP broth). - Mục tiêu: phát hiện VSV có khả n ng tạo sản phẩm trung tính acetylmethylcarbinol (acetion) trong quá trình lên men glucose v i thuốc thử α – Napthol, KOH 40%. - Nguyên tắ : etoin + α – Napthol -> phức chất m u đỏ. - Th c hiện: Cấy sinh khối VSV v o m i tr ờng MR – VP đã tiệt trùng 121oC/15 phút. Ủ 37oC trong 24 – 48 giờ. - Nhỏ 6 gi t α – N pthol, s u đó nhỏ 2 gi t KOH 40%, lắc nhẹ Đ c kết quả sau 20 phút, chậm nhất là 4 giờ. - Kết quả: phản ứng (+) khi m i tr ờng chuyển s ng m u đỏ; phản ứng (-) khí m i tr ờng không chuyển màu. 2.4.3.5. Thử nghiệm Indol: - M i tr ờng tiến hành: M i tr ờng tryptone (Tryptone broth) - Mục tiêu: nhằm phát hiện s tạo th nh In ol trong m i tr ờng nuôi cấy VSV nhờ vào hệ enzyme tryptophanase chuyển tryptophan thành Indol. - Nguyên tắ : In ol + Kov ’s -> phứ m u đỏ. - Th c hiện: Cấy sinh khối VSV v o m i tr ờng Tryptone, ủ 37oC /24 giờ. Nhỏ vài gi t thuốc thử Kov ’s ( – 4 gi t), không lắc ống nghiệm. 36
Đồ án tốt nghiệp - Kết quả: thử nghiệm (+) khi ó vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt m i tr ờng nuôi cấy VSV, (-) khi bề mặt m i tr ờng giữ nguyên màu vàng của thuốc thử. 2.4.3.6. Nhuộm Gram: - Nhỏ lên lam kính sạch 1 gi t n c muối sinh lý, lấy 1 khuẩn lạ đặ tr ng n đều trên lam kính và kéo một ít n c muối sinh l v o để tránh làm loãng m u nhuộm. - Cố định tiêu bản bằng h để khô t nhiên hoặ h o tr n ng n lử đèn cồn, kiểm tr độ nóng (nhẹ vừa phải trên mu bàn tay). - Chú ý: nóng quá, hoặ h l u, vi khuẩn sẽ biến dạng. - Phủ thuốc nhuộm tím Gentian lên tiêu bản 60 giây - Rử n để loại bỏ phẩm thừa. - Phủ dung dịch Lugol lên tiêu bản trong 60 giây nhằm cố định màu cho VK gr m ng (+) - Rửa nhanh bằng cồn 95o cho t i khi tiêu bản không còn màu tím Gentian. - Rử qu n để loại bỏ cồn thừa. - Phủ thuốc nhuộm Fuchsin lên tiêu bản trong 30 giây. - Dùng giấy thấm khô lame hoặ để khô t nhiên. - Qu n s t i kính hiển vi ở vật kính x100 có nhỏ dầu soi kính. Đọc kết quả: Vi khuẩn Gr m ng ắt màu tím (màu tím Gentian) còn vi khuẩn Gr m m ó m u đỏ hồng (đỏ Fuchsin). 2.4.3.7. Thử nghiệm khả năng di động: M i tr ờng Giltay v i ,6% g r Ph n m i tr ờng vào các ống nghiệm (10 – 15ml), hấp tiệt trùng 121oC/15 phút. Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối VSV cấy sâu v o m i tr ờng thạch bán rắn trên. Ủ ở nhiệt độ phòng Đ c kết quả sau 2 – 4 ngày. Kết quả: Thử nghiệm (+) khi VK m c lan rộng xung quanh vết cấy. Kết quả (-) VK chỉ m theo đ ờng cấy. 37
Đồ án tốt nghiệp 2.4.4. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm khảo sát khả năng khử nitrate và khử nitrate của các chủng VK phân lập được 2.4.4.1. Mô hình thí nghiệm khảo sát khả năng khử nitrite của các chủng VK phân lập: Một số VK đ ờng ruột và VK gây bệnh có khả n ng phản nitr te nh ng không thể tiếp tục khử nitrite thành các sản phẩm khí NO, N2O, N2 N n để tiết kiệm thời gian, hóa chất và dụng cụ, sinh viên th c hiện sẽ tiến hành khảo sát khả n ng khử nitrite tr đối v i các chủng VK phân lập đ ợc. Xem xét trong mô hình này v i thể tí h m i tr ờng thí nghiệm l n h n (9 ml) thì hiệu quả khử nitrite của các chủng VK n nh thế nào, di n ra nhanh hay chậm, thể tích khí tạo thành là bao nhiêu. Sau mô hình thì nghiệm này, loại bỏ các chủng VK có khả n ng xử lý kém hiệu quả, để khi tiến hành v i m i tr ờng khử nitrate sẽ d ng h n M h nh thử nghiệm tiến h nh nh s u: - Mô hình thí nghiệm đ ợc th hi n tr n m i tr ờng Giltay có nguồn N là - NO2 trong các bình thủy tinh nhỏ thể tích 100 ml/250 ml - Đối v i mô hình kị khí : sử dụng bình thủy tinh nhỏ thể tích 100ml, có nắp cao su đậy và gắn ống x l nh để đo l ợng khí tạo thành, quấn p r ffin để tránh thất thoát khí sinh ra. - Đối v i mô hình hiếu khí: sử dụng bình thủy tinh 250 ml, nút bông, không quấn paraffin và lắc 150 vòng/phút. V i mụ đí h ho VK ph n ố đều trong m i tr ờng thí nghiệm, sinh viên sử dụng ống hút nh a cắt nhỏ khoảng 1 – 2 cm làm giá thế ho VK m v o Do đ l mô hình nhỏ, th c hiện trong thời gian ngắn nên việc sử dụng ống hút làm giá thể không làm ảnh h ởng để quá trình khử nitrate, nitrite. Tiến h nh định tính, định l ợng nồng độ ban đầu của Nitrite, nitrate, amoni trong m i tr ờng Gilt tr c khi tiến hành cấy các chủng VK Ph ng ph p định tính nh tr n Ph ng ph p định l ợng sẽ trình bày ở mục sau. Thí nghiệm th c hiện tr n 4 điều kiện: Hiếu khí không giá thể (HK), hiếu khí có giá thể (HKGT), kị khí không giá thể (KK), kỵ khí có giá thể (KKGT). 38
Đồ án tốt nghiệp e d a b c Hìn 2.2 Mô hình khảo sát khả n ng hu ển hóa N ở điều kiện khác nhau. a) Đối chứng b) Kị khí giá thể c) Kị khí d) Hiếu khí giá thể e) Hiếu khí M i tr ờng đ ợc phân vào các bình thủy tinh v i thể tí h m i tr ờng là 90ml. Hấp tiệt trùng nh m i tr ờng trên,121oC/15 phút. Các chủng vi khuẩn khảo s t đ ợ t ng sinh trong m i tr ờng NB 24 giờ tr c khi cấy vào khảo sát. Mật độ vi khuẩn trong khảo s t đ ợc ổn định ở mức 106 fu/ml Để đảm bảo tính đồng nhất trong khảo s t, ho th m m i tr ờng NB t ng sinh VK vào các bình thủy tinh 100 ml để hấp tiệt trùng M i tr ờng NA này sẽ đ ợ ùng để pha loãng mật độ vi khuẩn ũng nh ổ sung v o m i tr ờng khảo sát ùng l m đối chứng. Dùng pipette hút 10ml huyền phù VK (107 cfu/ml) bổ sung vào các bình khảo s t đã đ ợc tiệt trùng bên trên. Mật độ VK ổn định ở 106 cfu/ml. Dùng parafin quấn kỹ phần tiếp xúc giữa miệng bình, nắp bình và ống xylanh nhầm mụ đí h hạn chế s thất thoát khí tạo thành. Ủ ở nhiệt độ phòng. Khảo sát tại các mốc thời gian 0h, 6h, 12h, 24h, 36h, 48h sau khi cấy VK. Mô hình hiếu khí khảo sát tại điều kiện 150 vòng/phút. 39
Đồ án tốt nghiệp - - + Định l ợng nồng độ NO3 ,NO2 , NH4 tại mỗi thời điểm khảo sát. Quan sát và ghi nhận thể tích khí sinh ra trong ống xylanh tại thời điểm. 2.4.4.2. Mô hình khảo sát khả năng khử nitrate của các chủng VK phân lập đã được tuyển chọn sau các quá trình trên M h nh đ ợc tiến hành t ng t nh đối v i mô hình khảo sát khả n ng khử - nitrite Nh ng nguồn N trong m i tr ờng Giltay là NO3 và thời gian khảo sát là 48 giờ. 2.4.4.3. Phương pháp định lượng nitrate. - - Nguyên tắ x định NO3 : ion NO3 tác dung v i axit phenoldisulfonic (PDA) thành nitrophenoldisulfonic axit khi muối nitrate ở dạng kh n), khi đ ợc kiềm hóa thì dung dịch chuyển th nh m u v ng v ó ờng đ màu phụ thuộc vào - - nồng độ NO3 có trong m u. Màu của phức và nồng độ NO3 tuân theo định luật - Beer trong khoảng 410 – 480 nm, nếu nồng độ NO3 trong khoảng 0,1 – 2 ppm thì n n đo ờng độ màu ở 410 nm và nồng độ càng l n th c song hấp thụ màu ng o, c song 480 nm có thể dùng v i m u có nồng dộ l n đến 12 ppm.  Các yếu tố ảnh h ởng: - Khi nồng độ NO2 > 0,2 mg/l sẽ ảnh h ởng đến kết quả phân tích, do có thể - oxy hóa thành NO3 . Loại bỏ bằng cách thêm 5 ml urea-acetic vào 50 ml m u hoặc 2 ml dung dịch axit sunfanic 2% vào 50 ml m u. Nếu độ m u > đ n vị, cần loại bỏ bằng cách cho 2 ml dung dịch Al(OH)3 vào 100 ml m u n đầu. Khuấy kỹ, lắng trong vài phút, tiến hành l c thu dịch - trong để đo nồng độ NO3 . S hiện diện của Clorua gây ra sai số âm, loại bỏ bằng cách thêm Ag2SO4 vừ đủ, để kết tủa ion clo trong m u, tiến hành l c thu dị h trong để x định nồng - độ NO3 . -  Tiến h nh x định nồng độ NO3 theo trình t sau: 40
Đồ án tốt nghiệp - Bảng 2.5. Trình t tiến h nh định l ợng NO3 Hóa ất ố t ứ t 0 1 2 3 Vmẫu (ml) 0 10 10 10 Urea-acetic (ml) 0 1 1 1 Cô ạn m u đến khô trên nồi cách thủy, để nguội (tránh làm cháy m u) Vdd PDA (ml) 1 1 1 1 - Để yên 10 phút, cho NO3 tác ụng v i PDA Vnƣớc cất (ml) 25 25 25 25 Trung hòa axit ằng NaOH 10% đến pH trung tính (dung ị h chuyển sang màu vàng đối v i m u thí nghiệm) Chuyển vào bình định mức 100 ml, tráng kỹ bằng n ất v định mức đến vạ h .Đo độ hấp thụ ủ m u ở sóng 4 nm. Lƣu ý: Ở trung hò xit , tiến hành trung hòa các bình chứa m u thí nghiệm tr c, nhằm x định đ ợc thể tí h N OH t ng ứng để pH m i tr ờng về trung tính, s u đó m i tiến hành trung hòa m u trắng (số thứ t 0), do m u trắng không có dấu hiệu điểm dừng rõ ràng (không chuyển sang màu vàng). M u trắng l n c cất. - Do việc tính toán nồng độ NO3 phụ thuộ v o đ ờng chuẩn nitr te n n tr c - khí tiến h nh định l ợng nitrate, cần x định nồng độ NO3 của m u thí nghiệm phải nằm trong đ ờng chuẩn, bằng cách pha loãng m u v i n c cất để đạt nồng độ - mong muốn. Ở mỗi mô hình khảo sát trên, nồng độ NO3 trong các m u sẽ rất khác nhau, nên thể tích pha loãng sẽ kh nh u nh s u: - Mô hình khảo sát khả n ng khử nitrite: - định nồng độ NO3 đầu v o (m i tr ờng h ấy vi khuẩn), T=0: do - trong hợp chất NaNO2 có l n ion NO3 , phát hiện bằng ph ng ph p định tính, nên cần x định nồng độ, thể tích m u dùng thí nghiệm là 10ml (pha loãng 10 lần). - định nồng độ NO3 còn lại trong dịch cấy (T=48 giờ): kh ng định l ợng - do không phát hiện NO3 trong định tính. 41
Đồ án tốt nghiệp - Mô hình khảo sát khả n ng khử nitrate: định nồng độ NO3- tại các thời điểm khảo sát (T=0,6,12,24,36,48 giờ): m u đ ợc pha loãng 10 lần (1ml m u + 9ml n c cất). 2.4.4.4. Phương pháp định lượng nitrite Đ ợc th c hiên theo ph ng ph p định l ợng nitrite của tác giả Nguy n V n Ph trong gi o tr nh “Thí nghiệm Hóa Kỹ thuật m i tr ờng” Nguyên tắc: ở pH 2 – 2,5 nitrite tác dụng v i axit sunfanic và naphthylanime tạo th nh zo enjol n phth mine sulfoni ó m u đỏ hồng – đỏ tía (phụ thuộc vào nồng độ nitrite có trong m u). Và bằng ph ng ph p so m u (ở c sóng 520 nm), x định đ ợ l ợng nitrite trong m u thí nghiệm. - Tiến h nh x định nồng độ NO2 theo trình t nh ảng sau: - Bảng 2.6. Trình t tiến h nh định l ợng NO2 ố t ứ t Hóa ất 0 1 2 3 Vmẫu (ml) 0 A a a Vnƣớc cất (ml) 25 (25 – a) (25 – a) (25 – a) Vdd EDTA (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 Vdd axit sulfanic 0,5 0,5 0,5 0,5 (ml) ắ đều,để yên 10 phút Vdd naphthylamine 0,5 0,5 0,5 0,5 V(mdl)d acetic (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 ắ đều, để yên 20 phút Đo độ hấp thụ các m u ở sóng 520nm Các yêu tố ảnh h ởng: Độ đụ trong m i tr ờng cần loại bỏ tr c khi làm thí nghiêm (l c, ly tâm); Các ion Sb, Fe3+, Pb2+, Ag+, tạo tủa ảnh h ởng đến kết quả đo qu ng loại bỏ bằng ph ng ph p l c: Chlorine, tricloride nếu có trong m u sẽ gây trở ngại ho ph ng ph p, loại bỏ bằng cách tạo tủa, l c. Thể tích m u khảo sát ở các mô hình là 0,1 ml (t ng đ ng ph loãng 5 lần) 42
Đồ án tốt nghiệp 2.4.4.5. Phương pháp định lượng amoni Đ ợc th c hiện theo ph ng ph p định l ợng amoni của tác giả Nguy n V n Ph trong gi o tr nh “Thí nghiệm Hóa kỹ thuật m i tr ờng”  Nguyên tắ : Amoni x định bằng ph ng ph p so m u v i thuốc thử Nessler. Amoni tác dụng v i Nessler theo phản ứng sau: Phức (NH2)Hg-O-HgI có m u v ng v ó độ hấp thụ c đại ở c sóng 430 nm.  Các yếu tố ảnh h ởng: Sunfur gây kết tủa v i Nessler nên cần loại bằng cacbonat chì. Một số hợp chất anime mạch thẳng , hợp chất cloramine hữu mạch vòng, acetone, aldehit, r ợu ó thể phản ứng v i Nessler cho phức màu vàng, gây sai số nên cần loại bỏ. Độ đụ v hlori e ũng g s i số nên cần đ ợc loại bỏ tr c khi tiến hành thí nghiệm  Tiến hành: Thể tích m u x định nồng độ amoni trong dịch cấy sau T=0,6,12,24,36,48 giờ: pha loãng 100 lần (1ml m u + 99ml n c cất). - Loại bỏ độ đục: Thêm 1ml ZnSO4 + 0,5ml NaOH 6N vào 100ml m u thí nghiệm để n ng pH đến 10,5. Đợi 3 ’ – 1 giờ để tạo tủa và l c lấy dịch trong bằng giấy l c. Thêm 1 gi t EDTA. - Loại trừ chloride: thêm 1ml Na2S2O3 N/70 vào 50ml m u đã loại bỏ độ đục. + Sau khi loại bỏ độ đục, chloride trong m u, tiến h nh định l ợng NH4 theo bảng sau: 43
Đồ án tốt nghiệp + Bảng 2.7. Trình t tiến h nh định l ợng NH4 Hóa chất Số thứ t 0 1 2 3 Vdd m u đã xử lý (ml) 0 50 50 50 Vn c cất (ml) 50 0 0 0 Vdd Nessler (ml) 2 2 2 2 Lắc đều để yên 5 phút.Đo độ hấp thụ b c sóng 430nm. 2.4.4.6. Phương pháp tính hiệu suất xử lý N trong mô hình khảo sát khả - - năng khử N- NO3 và khử N- NO2 - - + Các giá trị OD ó đ ợ trong ph ng ph p định l ợng NO3 , NO2 , NH4 đ ợc lần l ợt thay thế vào hệ số Y củ h ng tr nh đ ờng chuẩn t ng ứng, suy ra giá trị của hằng số t ng ứng S u đó gi trị đ ợc nhân v i hệ số pha loãng m u n đầu (nếu có), kết quả tính toán là hàm l ợng N của các hợp chất có trong m u cần x định (nitrate, nitrite, amoni). C ph ng tr nh đ ờng chuẩn đ ợc áp dụng o Tr ng C o D ng th c hiện trong o o đồ án tốt nghiệp “T m hiều khả n ng t ng sinh ph n lập v đ nh giá hoạt l c của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ n c thải chế biến thủy sản” Từ ph ng tr nh đ ờng chuẩn t ng ứng suy ra giá trị nh s u: - - Từ ph ng trình đ ờng chuẩn NO3 : Y= 0.236X + 0.046 (R2= 0.9937)  X = (Y- 0.046)/0.236 * hệ số pha loãng (N-NO3- mg/l). - - Ph ng tr nh đ ờng chuẩn NO2 : Y= 2.5286X + 0.0084 (R2= 0.999) -  X = (Y – 0.0084)/2.5286* hệ số pha loãng (N- NO2 mg/l) + - Ph ng tr nh đ ờng chuẩn NH4 : Y= 0.1697X – 0.0005 (R2= 0.9989) +  X= (Y + 0.0005)/0.1697* hệ số pha loãng (N- NH4 mg/l) - - Các giá trị X lần l ợt thay vào công thức H% = [1 – (N-NO3 fin + N- NO2 fin + - - + + N- NH4 fin)/(N-NO3 ini + N- NO2 ini + N- NH4 ini)]* để tính hiệu suất khử N-nitrite, khử N-nitrate của các chủng VK. (Lu Yu, Yanjun Liu, Gejiao Wang, 2008). 44
Đồ án tốt nghiệp - - + Trong đó, N-NO3 fin, N- NO2 fin, N- NH4 fin lần l ợt là các nồng độ N - trong nitr te, nitrite, moni đầu r (m i tr ờng sau khi nuôi cấy VK) và N-NO3 - + ini,N- NO2 ini,N- NH4 ini lần l ợt là nồng độ N trong nitr te, nitrite, moni đầu vào (T=0). 45
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng có khả năng phản nitrate: 3.1.1. Tăng sinh VK phản nitrate từ nước thải CBTS trên môi trường Giltay - - NO3 và NO2 VK phản nitrate là vi khuẩn inh ỡng hó n ng hữu ị ỡng T ng sinh trong m i tr ờng Giltay có chứa nguồn C là acid citric, nguồn N là asparagine - - và N-NO3 (hoặc N-NO2 ). Các vi khuẩn phản nitr te th ờng kỵ khí tùy nghi, có hai chuỗi hô hấp, chuỗi hô hấp hiếu khí có O2 là chất nhận điện tử cuối cùng và chuỗi - hô hấp kỵ kí có NO3 là chất nhận điện tử cuối ùng Trong điều kiện hiếu khí th ờng thì VK phản nitr te t ng sinh nh th ờng không khử nitr te Trong điều kiện thiếu khí chuỗi hô hấp kỵ khí m i hoạt động và phản ứng nitrate xảy ra do nhận điện tử để thành nitrite. Trong hầu hết các m u n c thải đều có s phát triển của VK trong cả hai m i tr ờng Giltay nitrate và Giltay nitrite ở điều kiện kỵ khí tùy nghi. Dấu hiệu nhận biết l đụ m i tr ờng và có sinh khí trong ống Durham. - Kết quả định tính nitrate d a vào s tạo màu giữa ion NO3 v i thuốc thử - Diphen l mine (m u x nh) C ờng độ màu phụ thuộc vào nồng độ của ion NO3 - còn lại trong m i tr ờng s u t ng sinh (m u ng đậm thì ion NO3 còn lại càng - - nhiều). Kết quả định tính s tạo thành NO2 d a vào màu giữa ion NO2 tạo thành v i thuốc thử Griess A, B và bột Zn. Nitrite tạo th nh đ ợc phát hiện bằng thuốc thử Griess A và B (màu hồng đậm hay nhạt tùy vào nồng độ). Khi nitrite tiếp tục đ ợc khử tiếp thành khí có thể không xuất hiện màu v i thuốc thử Griess. Khi ấy thêm vài hạt Zn, nếu sinh màu hồng thì chắc chắn là nitrate không bị khử bởi VK t ng sinh, nếu v n không màu thì chắc chắn là không còn nitrate trong dị h t ng sinh. Khi ấy không phát hiện thấy nitrate bằng Diphenylamine nữa. 46
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1 Kết quả định tính N s u 5 ng t ng sinh n c thải CBTS tr n m i tr ờng Giltay. - - + STT M u Đục Sinh NO3 NO2 NH4 pH khí - 1 G NO3 1.5% NaCl +++ ++ - - ++ 10 - 2 G NO3 3% NaCl ++ ++ - - +++ 10 - 3 G NO2 1.5% NaCl +++ ++ - - ++ 10 - 4 G NO2 3% NaCl ++ ++ - - ++ 10 - 5 ĐC G NO3 - - +++ - - 7 - 6 ĐC G NO2 - - - +++ - 7 Bảng 3.1 cho thấy kết quả t ng sinh n c thải CBTS trên cả bốn điều kiện kh nh u đều có s phát triển của vi sinh vật (l m đụ m i tr ờng) và sinh nhiều khí trong ống durham, khi quan sát bằng mắt th ờng ũng thấy s hình thành các bóng khí nổi lên trên. Tiến h nh định tính N trong dị h t ng sinh s u 5 ng ho - - thấy không còn s hiện diện của NO3 hay NO2 trong m i tr ờng và có s tí h lũ + NH4 . pH m i tr ờng tr c khi cấ đ ợc ổn định ở pH 7, s u 5 ng t ng sinh pH m i tr ờng ở cả bốn nghiệm thứ đều t ng o, pH = Điều này cho thấy trong n c thải CBTS thu gom đ ợc có mặt các vi khuẩn có khả n ng khử nitrate, nitrite và chuyển hóa thành NO, N2O. 3.1.2. Phân lập và làm thuần vi khuẩn từ nước thải CBTS: Tất cả các ống t ng sinh đục, sinh khí trong ống urh m đều đ ợc sử dụng làm nguồn phân lập bằng cách cấ ri tr n m i tr ờng Giltay Nitrate có bổ sung thêm chỉ thị Phenol Red 1 mg/l, mỗi ống lặp lại tr n đĩ Có ít nhất hai loại khuẩn lạc trên mỗi đĩ , tu nhi n hỉ l a ch n những khuẩn lạc có vòng màu hồng/tím xung quanh (do vi khuẩn làm kiềm hó m i tr ờng xung quanh). Khi xuất hiện các khuẩn lạc giống nhau giữ đĩ , hỉ ch n loại khuẩn lạc ở một đĩ ấy chuyển 47
Đồ án tốt nghiệp s ng m i tr ờng m i. Có 9 chủng VSV đ ợc phân lập từ các ống t ng sinh n c thải phản nitrate. 48
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2 Kết quả phân lập VSV từ n c thải CBTS STT Tên ống Tên chủng phân lập - 1 G NO3 1.5% NaCl 1 - 2 G NO3 1.5% NaCl 6 - 3 G NO3 1.5% NaCl 7.1;7.2 - 4 G NO3 3% NaCl 8 - 5 G NO3 3% NaCl - - 6 G NO3 3% NaCl - - 7 G NO2 1.5% NaCl 7.3;7.4 - 8 G NO2 1.5% NaCl 7.5 - 9 G NO2 1.5% NaCl - - 10 G NO2 3% NaCl - - 11 G NO2 3% NaCl H1 - 12 G NO2 3% NaCl - 3.1.3. Tăng sinh VK phân lập được trên môi trường Giltay Nitrate và Giltay Nitrite: Các chủng VK phân lập đ ợc từ n c thải CBTS h hắc có khả n ng phản nitrate nên cần tiếp tụ t ng sinh hủng VK thuần khiết và kiểm tra khả n ng phản nitrate của các chủng này. Quá trình phản nitrate là khi Vi khuẩn chuyển hóa nitrate thành nitrite và từ nitrite tiếp tục chuyển thành N2O/N2. Do đó, khả n ng khử nitrite của VK là một đặc tính quan tr ng có thể dùng loại trừ các chủng Vi khuẩn chỉ có khả n ng khử nitrate những không tiếp tục khử 49
Đồ án tốt nghiệp nitrite thành N2O/N2 mà khử nitrite thành amon (khử nitr te mon hó ) để khử độc. Do mụ ti u đề t i h ng đến là khử ho n to n N trong n c thải nên cần loại bỏ những VK chuyển hóa Nitrate thành Amon. Các chủng VK phân lập đ ợc sàng l c bằng cách cấ t ng sinh đồng thời vào h i m i tr ờng Giltay Nitrate và Giltay Nitrite có bổ sung thêm 1,5% N Cl để kiểm tra khả n ng khử nitrate, khử nitrite và khả n ng h nh th nh mon ủa VK. 50
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3 Kết quả định tính tr n m i tr ờng Giltay Nitrite sau 5 ngày - - + STT Mẫu Đục Sinh NO3 NO2 NH4 pH khí 1 7.5 + +++ - - + 10 2 7.1 + +++ - - ++ 10 3 6 + ++ - - + 9 4 8 + + - - + 9 5 7.2 + + + + ++ 8 6 7.3 + + + + ++ 8 7 7.4 + - ++ ++ ++ 8 8 H1 - - +++ +++ ++ 8 9 1 * - +++ +++ ++ 8 10 ĐC (M i tr ờng - - - +++ - 7 không cấy) (Ghi chú: Dấu (-): m tính; (*): ng tính ạng vết; (+): ng tính ít; (++): ng tính vừ ; (+++): ng tính nhiều) Trong 9 chủng VK phân lập từ NTCBTS sau khi làm thuần tr n m i tr ờng Gilt Nitr te đ ợc cấ v o m i tr ờng Gilt Nitrite để khảo sát khả n ng hu ển hóa nitrite,sau 5 ngày có 4 chủng (6;7 ;7 5;8) l m đụ m i tr ờng, sinh khí nhiều, khử đ ợc hoản to n l ợng nitrite trong m i tr ờng, sinh ra một l ợng nhỏ amon và l m m i tr ờng bị kiềm hóa. Các chủng (7.2;7.3;7.4) có s t ng tr ờng, sinh ít khí - + nh ng kết quả định tính cho thấy còn nhiều NO2 và có s tí h lũ NH4 . Hai chủng ( ;H ) khi t ng sinh trong m i tr ờng có nguồn N là nitrite gần nh kh ng t ng 51
Đồ án tốt nghiệp tr ởng, kh ng l m đụ m i tr ờng, không có khí trong ống urh m, l ợng nitrite đ ợc khử rất ít, sinh r mon t ng đối nhiều, làm kiềm nhẹ m i tr ờng. Bảng 3.4 Kết quả định tính tr n m i tr ờng Giltay Nitrate sau 5 ngày - - + STT Mẫu Đục Sinh NO3 NO2 NH4 pH khí 1 7.5 + +++ - - + 10 2 7.1 + +++ - - ++ 10 3 6 + ++ - - ++ 9 4 8 + + - - + 9 5 7.2 + * + + + 9 6 7.3 + * + + + 9 7 7.4 + - ++ + + 8 8 H1 + - ++ + + 9 9 1 * - ++ + + 9 10 ĐC (MT kh ng - - +++ - - 7 cấy) (Ghi chú: Dấu (-): m tính; (*): ng tính ạng vết; (+): ng tính ít; (++): ng tính vừ ; (+++): ng tính nhiều) Do mụ đí h ủ đề tài là phân lập VK phản nitrate nên th c hiện khảo sát t ng t nh ng th đổi nguồn N trong m i tr ờng khảo sát là Nitrate. Tất cả các chủng VK đều l m đụ m i tr ờng, tuy nhiên chủng (1;H1) không sinh khí trong ống durham. Các chủng 7. ;7 3;7 4 l m đụ m i tr ờng nh ng l ợng khí sinh ra - trong ống durham rất ít, s u 5 ng định tính v n còn NO3 trong m u, có s xuất - hiện của NO2 v tí h lũ một ít amon. Khi định tính bằng thuốc thử, nhận thấy 4 52
Đồ án tốt nghiệp - - chủng (6;7.1;7.5;8) khử hoàn toàn NO3 trong m i tr ờng, không tạo ra NO2 , và + - + sinh ra ít NH4 , còn chủng 1 và H1 chuyển hóa một ít NO3- thành NO2 và NH4 . Từ kết quả định tính cho thấy, 4 chủng (6;7.1;7.5;8) có khả n ng phản nitrate nên sẽ tiếp tục khảo s t định l ợng trong mô hình khủ nitrite/nitrate trong 48 giờ. 3.1.4. Kết quả thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng VK phân lập: Bảng 3.5. Kết quả thừ nghiêm sinh hóa của các chủng VK phân lập Chủng O (oxy F (lên Indol MR VP Catalase Oxidase Di Nhuộm hóa Men Dộng Gram glucos) glucose) 2 6 - + - + - + + - + 3 7.1 - - - - - + + + - 7 7.5 - - - - - + + + - 8 8 - - - - - + + - - Các vi khuẩn phân lập đ ợ đ số là gram Âm, trừ chủng 6, t l se đều (+). Chứng tỏ chúng là các VK có hô hấp hiếu khí. Từ đ tiến hành các thí nghiệm sinh hó để loại bỏ các vi khuẩn có khả n ng g ệnh trong các chủng phân lập. Vì các chủng phân lập từ n c phải CBTS, khả n ng nhi m VK gây bệnh là rất cao. Trong số các VK có khả n ng khử nitrate có thể có VK có tiềm n ng g ệnh nh VK đ ờng ruột, VK Vi rio spp C VK n th ờng khử nitrate thành nitrite, sau đó mono hó nitrite tạo th nh Trong điều kiện có oxy các VK này còn có thể hô hấp hiếu khí sinh CO2 m t thu đ ợc trong ống durham. Vì vậy loại trừ các vi khuẩn đ ởng ruột và vi khuẩn Virbio spp. là cần thiết để thu các VK phản nitrate th c s . Một số đặ điểm sinh hóa khác biệt ản giữa vi khuẩn phản nitrate và vi khuẩn gây bệnh đ ờng ruột và Vibrio spp. là khả n ng lên men của cúng. VK Phản nitrate có thể ox hó đ ờng Glucose (O+ hoặc O-) nh ng kh ng o giờ lên men đ ờng Glucose (F-), trong điều kiện kị khí chúng khử nitr te đều sinh n ng l ợng. 53
Đồ án tốt nghiệp Ng ợc lại vi khuẩn đ ờng ruột nh E.coli, Salmonella sp. và Vibrio spp. có phản ứng O+/F+. Thử nghiệm lên men O/F sử dụng chất chỉ thị màu là bromothymol lue,trong m i tr ờng axit pH <6,0 sẽ chuyển sang màu vàng, phát hiện đ ợc hầu hết tr ờng hợp l n men glu ose sinh i Nh vậ test sinh hó kh nh MR phát hiện lên mên axit hỗn hợp (pH thấp). Test MR nhằm hỗ trợ khẳng định lên men glucose sinh acid. Các chủng F+, MR+ đều bị loại bỏ. Ngoài ra, còn có hình thức lên men trung tính mà sản phẩm tạo ra là con đ ờng tạo ut ne iol đ ợc phát hiện qua VP test, F-,MR – nh ng VP + ó khả n ng v n l n men nh ng trung tính Tất cả các VK phân lập tr n m i tr ng gilt đều sử dụng citrate làm nguồn C, vì vậ để hoàn tất thử nghi m IMViC, In ol test ũng đ ợc tiến hành. Các chủng nghi ngờ là VK phản nitrate thật s trong số VK Gram – th ờng catalase + và phải có F-, MR- , VP-, Indol- , Citrate +. Tóm lại qua thử nghiệm sinh hóa loai bỏ đ ợc các chủng 6;8 do có kết quả F+ và MR+. Các chủng 7.1 và 7.5 do có kết quả F -, MR - n n đ ợc tiếp tục khảo sát. 54
Đồ án tốt nghiệp 3.2. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ đối với những chủng được tuyển chọn 3.2.1. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite của chủng 7.5 trong 48 giờ. Bảng 3.6. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử Nitrite của chủng 7.5 sau 48 giờ Kết quả định l ợng - + pH Vkhí N- NO2 N- NH4 STT ĐKTN (ml) T=0 T=48 T=0 T=48 giờ giờ 1 HKGT 9 K Đ 94,01 0 4,9 22,1a 2 HK 9 K Đ 73,8 0 3,3 20,2a 3 KKGT 8 5 95,3 0 2,9 86,1b 4 KK 8 3 89,9 0 3,2 94,1b Theo kết quả bảng 3.6,trong cả bốn điều kiện thí nghiệm, sau 48 giờ l ợng - NO2 trong m i tr ờng đều đ ợc khử hoàn toàn. L ợng amon đ ợc tạo thành ở điều kiện hiếu khí (20,2 – 22,1 mg/l) thấp h n so v i ở điều kiện kị khí (86,1 – 94,1 mg/l). Bên cạnh đó theo xử lý thống kê, việc bổ sung giá thể không làm ảnh h ởng dến l ợng mon đ ợc tạo thành. ợng khí sinh ra trong xylanh ở điều kiện kị khí có giá thể (~5 ml) o h n so v i l ợng sinh r trong điều kiện không có giá thể (~3 ml) ợng khí đo đ ợc 55
Đồ án tốt nghiệp m ng tính t ng đối do một phần l ợng khí bị thất thoát ra bên ngoài do phần tiếp xúc giữa ống xylanh và nắp cao su không kín, bên cạnh đó độ ma sát giữa ống tuýp và thành ống xylanh cao làm cho việ khí đẩy ống l n khó kh n - Trong quá trình khảo sát, không thấy s tạo thành ion NO3 ở tất cả các thời điểm khảo sát. 150 150 100 100 HKGT ,mg/l HKGT - HK HK 50 NO2 50 NH4+,mg/l - N KKGT KKGT 0 0 KK KK 0 6 12 24 36 48 0 6 12 24 36 48 thời gian,giờ Thời gian,giờ Tốc độ chuyển hóa của chủng 7.5 2 1.5 1 mg/l/g ờ mg/l/g 0.5 0 HKGT HK KKGT KK Hình 3.1. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.5 trong mô hình chuyển hóa Nitrite - + )Động h c chuyển hóa NO2 ) Động h c chuyển hóa NH4 c) Tố độ chuyển hóa nito trung bình - Hình 3.1a cho thấy s chuyển hóa NO2 tại các thời điểm khảo sát. Ở cả bốn - điều kiện thí nghiệm, l ợng NO2 ó trong m i tr ờng nuôi cấ đều đ ợc khử hoản toàn sau 24 giờ nuôi cấy. Xử lý thống kê v i độ tin cậy 0,05 cho thấy không có s khác biệt giữa bốn điều kiện thí nghiệm trong s chuyển hóa nitrite. Đối v i h m l ợng moni tí h lũ , xử lý thống kê cho thấy chỉ có s khác biệt giữ điều kiện oxy hòa tan khác nhau và việc bổ sung giá thể không ảnh h ởng + đến s hình thành amoni. Ở điều kiện hiếu khí, l ợng NH4 sinh ra nhiều nhất là sau 56
Đồ án tốt nghiệp 6 giờ nuôi cấy (31,4 mg/l) s u đó l ợng mon giảm ần đến điểm uối khảo s t l 20,2 mg/l Ở điều kiện hiếu khí ó ổ sung gi thể, tại thời điểm 4 giờ l ợng mon sinh r o nhất 4 ,9 mg/l s u đó giảm òn , mg/l tại thời điểm 48 giờ ợng mon tại điều kiện kị khí ó gi thể v kỵ khí kh ng ổ sung gi thể s u 48 giờ lần l ợt l 86,1 mg/l và 94,1 mg/l. Khi khảo s t định l ợng nitr te trong m i tr ờng tại thời điểm khảo s t, - kết quả ho thấ kh ng ó s hiện iện h h nh th nh NO3 trong suốt qu tr nh khảo s t Tố độ hu ển hó ủ hủng 7 tại điều kiện khảo s t kh nh u không đồng nhất, v i điều kiện hiếu khí ó gi thể, hiếu khí kh ng gi thể, kỵ khí gi thể v kỵ khí kh ng gi thể tại th i điểm 48 giờ lần l ợt l ,6 mg/l/giờ , 1,2 mg/l/giờ, ,3 mg/l/giờ v mg/l/giờ Kết quả định l ợng N trong m h nh khử Nitrite trong 48 giờ ủ hủng 7 5 ho thấ hủng 7 5 ó khả n ng khử nitrite o ở tất ả điều kiện khảo s t, l ợng nitrite trong m i tr ờng đ ợ khử ho n to n s u 4 giờ Tu nhi n l ợng amoni hình thành và tích lũ ũng l một điều kiện để l h n điều kiện xử l tốt nhất ho hủng VK Do kh ng ó s kh iệt giữ việ ó ổ sung gi thể h kh ng, n n kết quả định l ợng moni ho thấ hủng 7 5 tí h lũ moni ở điều kiện hiếu khí ≤ mg/l đạt ti u huẩn ủ đầu r n thải CBTS loại B 3.2.2. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ đối với chủng 7.1 Bảng 3.7. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrite của chủng 7.1 sau 48 giờ STT ĐKTN Kết quả định l ợng - + pH Vkhí N- NO2 N- NH4 (ml) T=0 T=48 T=0 T=48 giờ giờ 57
Đồ án tốt nghiệp 1 HKGT 9 K Đ 94,02 0a 0 137,2c 2 HK 9 K Đ 73,0 2,5a 0 179,3d 3 KKGT 8 3 95,3 114,2b 0 45,04b 4 KK 8 2 89,9 128,8b 0,7118 33,6a Theo kết quả định l ợng,điều kiện thí nghiệm và thời gian khảo s t đều ảnh h ởng đến quá trình chuyển hóa Nitrite trong mô hình khảo sát. - Ở điều kiện hiếu khí, sau 48 giờ khảo s t, l ợng NO2 ở cả h i điều kiện có bổ sung giá thể và không bổ sung gi đều đ ợc khử gần nh ho n to n, tu nhi n + l ợng NH4 đ ợc tạo thành nhiều (>100 mg/l), l ợng khí sinh r kh ng x định đ ợ o kh ng thu đ ợc ở điều kiện hiếu khí pH m i tr ờng đều t ng ~9 - Ở điều kiện kỵ khí, sau 48 giờ, nồng độ NO2 trong cả h i điều kiện đều t ng, bên cạnh đó ũng tạo thành một l ợng nhỏ Amon (<50 mg/l), l ợng khí sinh ra trong xylanh 2-3 ml, pH m i tr ờng t ng ~8 - Khi tiến h nh định tính ũng nh định l ợng N-NO3 , không phát hiện s hiện diện của nitrate trong các m u khảo sát tại tất cả các thời điểm khảo sát. 150 200 150 100 HKGT HKGT , , mg/l - 100 HK HK NO2 NH4+, NH4+, mg/l - 50 - N KKGT N 50 KKGT 0 KK 0 KK 0 6 12 24 36 48 0 6 12 24 36 48 Thời gian, giờ Thời gian,giờ 58
Đồ án tốt nghiệp Tố độ uyển óa N ủa ủng 7.1 2 1.5 1 0.5 mg/l/g ờ mg/l/g 0 HKGT HK KKGT KK Hình.3.2. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.1 trong mô hình chuyển hóa Nitrite - + ) Động h c chuyển hóa N- NO2 của chủng 7 ) Động h c chuyển hóa N- NH4 c) Tố độ chuyển hóa nito trung bình Các số liệu sau khi xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic cho thấy giữa các nghiệm thức khác nhau sẽ có s hình thành amon khác nhau, và s chuyển hóa - NO2 chỉ chịu ảnh h ờng của nồng độ oxi hòa tan trong thí nghiệm. - Hình 3.2a cho thấy s khử NO2 tại từng thời điểm trong thời gian 48 giờ - khảo sát. Có thể thấy ở điều kiện hiếu khí có giá thể, NO2 trong m i tr ờng đ ợc VK khử hoàn toàn sau 24 giờ nuôi cấy, ở điều kiện không giá thể sau 36 giờ ũng - khử đ ợ ho n to n l ợng NO2 . Tùy nhiên, ở điều kiện kỵ khí, sau 12 giờ t ng sinh, h m l ợng nitrite trong m i tr ờng t ng l n so v i n đầu ở cả hai nghiệm thức có bổ sung giá thể và không có giá thể lần l ợt là 140,9 mg/l và 137,3 mg/l và - tại những điểm khảo s t s u, l ợng NO2 này gần nh kh ng th đổi về mặt thống kê. + Hình 3.2b l s h nh th nh v tí h lũ NH4 trong m i tr ờng tại thời điểm khảo s t ủ hủng 7 khi khảo s t tr n m i tr ờng Gilt Nitrite Ở điều kiện + hiếu khí ó gi thể, l ợng NH4 t ng o nhất l s u giờ nu i ấ (142,04 mg/l), s u đấ l ợng moni n tu ó giảm (137,2 mg/l tại 48 giờ), ở điều kiện kh ng gi thể l ợng moni t ng nh nh nhất l s u 4 giờ nu i ấ (106,5 mg/l) v t ng đến thời điểm 48 giờ l ợng moni tí h lũ đ ợ l 79,3 mg/l. Ở điều kiện kị khí l ợng moni tí h lũ thấp h n s o v i ở điều kiện hiếu khí, lần l ợt ở điều kiện ó ổ sung + gi thể v kh ng ổ sung gi thể l 45,04 mg/l và 33,7 mg/l v l ợng NH4 tí h lũ s u giờ v ổn định đến uối thời gi n khảo s t 59
Đồ án tốt nghiệp Tố độ hu ển hó Nito trung nh ở điều kiện khảo s t đều đạt o nhất v o s u giờ nu i ấ ,lần l ợt ở điều kiện hiếu khí ó gi thể, kỵ khí ó gi thể v kỵ khí kh ng gi thể l 9,7 mg/l/giờ ; 6,4 mg/l/giờ; 8,5 mg/l/giờ s u đó tố độ hu ển hó giảm ần ho đến 48 giờ, tố độ hu ển hó lần l ợt l ,6 mg/l/giờ, , mg/l/giờ, ,7 mg/l/giờ Tố độ hu ển hó ở điều kiện hiếu khí kh ng gi thể t ng giảm kh ng đồng đều, tố độ hu ển hó tại thời điểm 48 giờ đạt ,5 mg/l/giờ S t ng l n về l ợng nitrite trong m i tr ờng trong điều kiện kị khí là vi + khuẩn 7 ó khả n ng nitr te hó , hu ển hó l ợng moni (NH4 ) tí h lũ trong - m i tr ờng th nh nitrite (NO2 ), l ợng mon sinh r v tí h lũ s u 48 giờ <5 mg/l - Tu nhi n khí khảo s t h m l ợng NO3 trong m u th kh ng ph t hiện s ó mặt ủ nitr te n n VK n hỉ ó khả n ng th hiện một gi i đoạn ủ qu tr nh Nitr te hó Ở điều kiện hiếu khí, vi khuẩn s u khi sử ụng hết l ợng Nitrite trong + m i tr ờng th ắt đầu hu ển N t o trong kh ng khí thành NH4 v vi khuẩn ần một l ợng moni để tổng hợp tế o ũng nh t ng tr ờng v ph t triển Chủng 7 tu ở điều kiện hiếu khí ó khả n ng khử nitrite tốt nh ng lại tí h lũ một l ợng l n moni ≥ mg/l, v ợt qu ti u huẩn đầu r ủ n thải - CBTS (20 mg/l) Ở điều kiện kị khí, hủng 7 lại ó khả n ng khử NO2 thấp h n rất nhiều so v i điều kiện hiếu khí Tu nhi n, mụ ti u đề t i l vi khuẩn ph n nitrate nên ần tiếp tụ khảo s t khả n ng khử nitr te ủ hủng VK n 3.3. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ đối với những chủng được tuyển chọn. Do mục tiêu củ đề tài là phân lập VK phản nitrate nên VK cần phải có cả quá trình khử Nitrate và khử nitrite thành khí. Mặc dù hai chủng VK khảo s t đều có khả n ng xử lý tốt nitrite trong điều kiện hiếu khí nh ng v n cần phải tiếp tục - khảo sát trên mô hình khử Nitrate. Còn mô hình khử N-NO2 l sở đề x định khả n ng khử nitrite thành khí của vi sinh vật. 3.3.1. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ của chủng 7.5 60
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrate của chủng 7.5 sau 48 giờ STT ĐKTN Kết quả định l ợng - + pH Vkhí N-NO3 N-NH4 (ml) T=0 T=48 T=0 T=48 giờ giờ 1 HKGT 9 K Đ 155,8 0 12,3 4,98a 2 HK 9 K Đ 160,3 0 19,8 2,3a 3 KKGT 8 5 167,5 0 16,8 72,7b 4 KK 8 3 177,8 0 18,6 28,97b - Ở cả 4 điều kiện thí nghiệm sau 48 giờ đều không còn NO3 .Ở điều kiện hiếu + khí có một l ợng nhỏ NH4 đ ợc tạo thành (<5 mg/l) và không chênh lệch nhiều dù ở điều kiện có giá thể hay không có giá thể. + Ở điều kiện kỵ khí, l ợng NH4 đ ợc toàn thành nhiều h n so v i điều kiện + hiếu khí Trong điều kiện có giá thể, l ợng NH4 tạo thành khoảng 7 ,7 mg/l, l ợng + khí sinh ra trong xylanh là 5 ml Trong điều kiện kỵ khí, l ợng NH4 tạo thành ít h n ( 8,9 mg/l), l ợng khí sinh ra trong xylanh khoảng 3 ml. Khi tiến h nh định tính v định l ợng Nit trong thời điểm khảo sát, - - không phát hiện s chuyển hóa NO3 thành NO2 trong tất cả điều kiện khảo sát khác nhau. 61
Đồ án tốt nghiệp 200 140 120 150 100 ,mg/l HKGT HKGT - 80 100 HK 60 HK NO3 NH4+, NH4+, mg/l - - 40 N 50 KKGT N KKGT 20 0 KK 0 KK 0 6 12 24 36 48 0 6 12 24 36 48 Thời gian, giờ thời gian,giờ Tốc độ chuyển hóa Hiệu quả xử lý của chủng 7.5 150 4 100 3 50 2 0 mg/l/giờ 1 6 12 24 36 48 0 HKGT HK KKGT KK HKGT HK KKGT KK Hình 3.3. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.5 trong mô hình chuyển hóa Nitrate - + ) Động h c chuyển hóa NO3 )Động h c chuyển hóa NH4 c) Tốc dộ chuyển hóa sau 48 giờ, d)Hiệu quả xử lý Động h c chuyển hóa N cho biết khả n ng hu ển hóa N-NO3 của chủng VK - tại khác mốc thời gian. Sau 36h khảo sát, không còn phát hiện N-NO3 trong cả 4 điều kiện khảo sát. Kết quả xử lý thống kê cho thấy có s sai biệt giữ điều kiện thí nghiệm kh nh u, trong đó điều kiện hiếu khí giá thể là có khả n ng khử - nitrate tốt nhất. Do khả n ng khử NO3 ở cả bốn điều kiện đều gấn nh ho n to n + nên cần xem xét để khả n ng tí h lũ NH4 ở điều kiện kh nh u ũng nh hiệu quả và tố độ xử lý của chủng VK để có thể đ nh gi đ ợc khả n ng ứng dụng của chủng VK này. + Kết quả cho thấ s tí h lũ NH4 ở điều kiện kỵ khí và hiếu khí có s + khác biệt, giá thể không ảnh h ởng đến s tích lũ NH4 trong khảo sát. Ở cả hai + điều kiện hiếu khí, l ợng NH4 tí h lũ s u 48 giờ thấp h n điều kiện củ n c thải 62
Đồ án tốt nghiệp đầu ra loai A của ngành CBTS là 10 mg/l, lần l ợt ở điều kiện có giá thể và không giá thể là 4,98 mg/l và 2,34 mg/l. Hình 3.3c thể hiện tố độ chuyển hó nit trung nh ủa chủng VK 7.5. Ở điều kiện khả sát, tố độ chuyển hó nito trung h nh đều đạt khoảng 5,2 mg/l/giờ. Tuy nhiên tố độ chuyển hỏa nito trung bình ở điều kiện Kỵ khí giá thể chỉ đặt 1,1 mg/l/giờ. Hình 3.3d cho thấy hiệu suất xử lý của chủng 7 5 trong điều kiện khác nh u đều cao (60 – 98%). Ở điệu kiện hiếu khí giá thể và hiếu khí không giá thể hiệu quả xử lý không có s sai biệt,lần l ợt đạt 97% và 98.7%. Ở điệu kiện kỵ khí s có mặt của giá thể có ảnh h ởng đến hiệu quả xử lý của chủng VK 7.5, hiệu quả xử lý ở điệu kiện có giá thể chỉ đ t 6 ,6% , trong khi đó ở điều kiện không giá thể hiệu quả xử lý lại đạt đ ợc 85,2%. Tu nhi n, trong điều điều kiện kỵ khí, l ợng amoni tạo thành lại >20 mg/l kh ng đạt tiêu chuẩn n c thải đầu ra củ nh m CBTS ợng amoni tạo thành ở điều hiếu khí thấp h n, mg/l, đạt tiêu chuẩn ho n c thải đầu ra (phụ lục B), pH từ 8.1 - 9.0. 63
Đồ án tốt nghiệp 3.3.2. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ của chủng 7.1 Bảng 3.9. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrate của chủng 7.5 sau 48 giờ STT ĐKTN Kết quả định l ợng - + pH Vkhí N-NO3 N- NH4 (ml) T=0 T=48 T=0 T=48 giờ giờ 1 HKGT 9 K Đ 174,4 0 0 15,8a 2 HK 9 K Đ 177,5 0 0 39,4b 3 KKGT 8 5 152,96 0 0 74,7c 4 KK 8 3 181,01 0 0,7 81,2c Bảng 3.9 cho thấy, ở cả 4 điều kiện thí nghiệm đều không còn Nitrate sau 48 giờ khảo s t, l ợng amon sinh ra ở các thí nghiệm có s khác biệt giữ điều kiện hiếu khí và kỵ khí.Việc bổ sung thêm giá thể không làm ảnh h ởng đến s hình thành amon khi xử lý. Thể tí h khí đo đ ợc ở điều kiện kỵ khí trong khoảng 3 – 5 + ml/ ml m i tr ờng. pH m i tr ờng sau 48 giờ t ng, pH 8 – 9. Tuy nhiên NH4 tí h lũ s u 48 giờ ở tất cả điều kiện thí nghiệm đều o h n so v i tiêu chuẩn về đầu ra củ n c thải CBTS. 64
Đồ án tốt nghiệp Trong qu tr nh định tính ũng nh định l ợng các chỉ tiêu nit trong m i - tr ờng tại các thời điểm khảo sát, không phát hiện s hình thành N-NO2 tại tất cả điều kiện thí nghiệm tại các mốc thời gian khảo sát. 65
Đồ án tốt nghiệp 200 120 100 150 80 HKGT HKGT , , mg/l +, +, mg/l 3 100 4 60 HK HK NO NH - - 40 N 50 KKGT N KKGT 20 KK KK 0 0 0 6 12 24 36 48 0 6 12 24 36 48 Thời gian, giờ Thời gian, giờ Tố độ uyển óa ủa ủng 7.1 H ệu suất xử lý ủa ủng 7.1 4 100 3 80 HKGT 2 60 HK 40 mg/l/g ờ mg/l/g 1 KKGT 20 KK 0 0 HKGT HK KKGT KK 6 12 24 36 48 - + Hình 3.4. ) Động h c chuyển hóa NO3 )Động h c chuyển hóa NH4 c)Tố độ chuyển hóa N sau 48 giờ, d)Hiệu quả xử lý của chủng 7.1 - Hình 3.4a cho thấy, ở cả 4 điều kiện khảo sát sau 24 giờ l ợng NO3 trong - m i tr ờng đ ợc khử hoản toàn từ h m l ợng NO3 n đầu là 177 mg/l. Không có s khác biệt về nghĩ thống kế giữ điều kiện khảo sát khác nhau. + Hình 3.4b biểu hiện s h nh th nh v tí h lũ NH4 của chủng VK 7.1 trong + 48 giờ khảo s t H m l ợng NH4 hình thành ở điều kiện khảo sát tại khác thời + điểm kh nh u kh ng đồng nhất, s tí h lũ NH4 chịu ảnh h ởng của nồng độ oxy hòa, việc bổ sung thêm giá thể v o m i tr ờng không ảnh h ởng đến l ợng amon sinh r trong điều kiện kỵ khí nh ng ó ảnh h ởng đến s hình thành amon ở điều kiện hiếu khí. Ở điều kiện hiếu khí có giá thể, l ợng amon sinh ra ít nhất so v i + những điều kiện khác 15,8 mg/l. Sau 48 giờ khảo s t, l ợng NH4 tí h lũ ở cả bốn điều kiện đều cao, ở điều kiện hiếu khí giá thể, hiếu khí, kỵ khí giá thể, kỵ khí + h m l ợng NH4 tí h lũ lần l ợt là 15,8 mg/l; 39,4 mg/l; 74,7 mg/l ; 81,2 mg/l. Ở 66
Đồ án tốt nghiệp điều kiện đều v ợt quy chuẩn về n c thải loại B của ngành CBTS, chỉ ở điệu kiện Hiếu Khí có giá thể l ợng mon tí h lũ l 5,8 mg/l l đạt tiêu chuẩn ( 50 %. Ở điều kiện hiếu khí có giá thể hiệu suất xử l đạt cao nhất (90,6 %). Tuy có hiệu suất xử lý o nh ng l ợng amon h nh th nh v tí h lũ s u 48 giờ o h n tiêu chuẩn n c thải đầu ra (20 mg/l), chỉ ở điều kiện hiếu khí có giá thể l ợng amon hình thành <20 mg/l (15,8 mg/l). Từ những kết quả trên, ở điều kiện hiếu khí có bổ sung giá thể, chủng VK - - 7.1 có khả n ng xử lý NO3 tối u v i khả n ng hu ển hóa hết l ợng NO3 trong + m i tr ờng sau 24 giờ ,hiệu quả xử l đạt 9 ,6% v tí h lũ 5,8 mg/l NH4 sau 48 giờ. 67
Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận - Từ nguồn n c thải CBTS thu thập đ ợ s u khi t ng sinh tr n m i tr ờng Giltay nitrate và Giltay nitrite có bổ sung thêm 1,5% NaCl , tất cả các ống nghiệm đều khử ho n to n nitr te,nitrite ó trong m i tr ờng và sinh khí trong ống durham. - Từ các ống t ng sinh, ph n lập đ ợc 9 chủng thuần khiết, trong đó hỉ có 4 chủng khử gần nh ho n to n nitrite trong m i tr ờng gilt nitrite, đồng thời khử ho n to n nitr te trong m i tr ờng Giltay nitrate, và sinh ra amoni ở các nồng độ khác nhau. - Thử nghiệm sinh hó , đặc biệt thử nghiệm O/F, MR, VP giúp loại bỏ vi khuẩn lên men glucose và giữ lại đ ợc 2 chủng để tiếp tục khảo sát. - - Khảo sát khả n ng khử nitrite (140 mg/l N-NO2 ) trong 48 giờ của 2 chủng giữ lại cho thấy khả n ng xử lý tốt nitrite và sinh ít amoni của chủng 7.5 trong điều kiện hiếu khí, và khả n ng xử lý tốt nitrite ở điều kiện hiếu khí của chủng 7.1. - - Khảo sát khả n ng khử nitrate (200 mg/L N-NO3 ) trong 48 giờ cho thấy chủng 7.5 ở điều kiện hiếu khí (không chịu ảnh h ởng của việc bổ sung giá thể) có khả n ng khử ho n to n nitr te, kh ng tí h lũ nitrite v xin rất ít + amon từ 2,3 ≤ mg/ N-NH4 , đạt hiệu suất xử lý từ 97 % đến 98,7 %, thể tích khí sinh ra 4 – 5 ml/ ml m i tr ờng s u 48 giờ, pH 8 – 9, đ p ứng ti u huẩn ủ n thải đầu r loại A Chủng 7 ở điều kiện ó ố sung gi thể - ó khả n ng khử ho n to n nitr te, kh ng tí h lũ NO2 và l ợng moni sinh + r thấp 5,8 mg/L N-NH4 ≤ mg/ , hiệu quả xử l đạt 9 ,6% đạt ti u huẩn ủ n thải đầu r loại B - định đ ợ điều kiện xử l tối u ủ hủng 7 5 l ở điều kiện hiếu khí, việ ổ sung gi thể v o m i tr ờng kh ng l m ảnh h ởng đến hiệu quả xử l ủ hủng VK n 68
Đồ án tốt nghiệp - Xác định đ ợ điều kiện xử l tối u ủ hủng 7 l ở điều kiện hiếu khí ó ổ sung gi thể - Chủng 7 5 ó khả n ng ứng ụng v o xử l nit trong n thải tốt h n so - v i hủng 7 o hủng 7 5 xử l đ ợ tất ả l ợng N-NO3 trong m i tr ờng - + thử nghiệm, kh ng h nh th nh h tí h lũ N-NO2 , l ợng N-NH4 tí h lũ s u 48 giờ xử l thấp i qu huẩn n thải đầu r loại A v ó hiệu suất xử l o h n 9 % 2. K ến ng ị - - Th hiện th m khảo s t khả n ng khử N-NO3 ở nồng độ o h n nhằm - x định đ ợ ng ỡng nồng độ N-NO3 m VK ó thể xử l tốt nhất - Khảo s t gi i đoạn t ng sinh nhằm x định đ ợ ph log ủ vi khuẩn - Th hiện thí nghiệm v i nguồn C kh nh u v tỷ lệ C/N nhằm x định nguồn C v tỷ lệ C/N thí h hợp nhất ho qu tr nh phản nitr te - Th hiện khảo s t khả n ng xử l ủ hủng VK ở điều kiện mặn kh nh u để t m đ ợ nồng độ muối tối u nhất ủ VK - - Cần nghi n ứu th m nghi n ứu về qu tr nh giảm nồng độ NO2 và + NH4 tạo th nh, để từ đó ó những iện ph p thí h hợp ho qu tr nh khửu nitrite i n r tốt nhất v l ợng moni tí h lũ thấp nhất - - Th hiện khảo s t khả n ng khử N- NO3 ủ hủng VK ở qu m l n h n v qu m th tế 69