›

Đồ án Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma licidum kết hợp enzyme và siêu âm

pdf 156 trang thiennha21 13/04/2022 4490
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma licidum kết hợp enzyme và siêu âm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_thiet_lap_quy_trinh_pha_vach_bao_tu_nam_linh_chi_ganod.pdf

Nội dung text: Đồ án Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma licidum kết hợp enzyme và siêu âm

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM KẾT HỢP VỚI ENZYME VÀ SIÊU ÂM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : ĐẶNG THỊ KIM TUYỀN MSSV: 1411100465 Lớp: 14DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2018
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này hoàn toàn trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các thông tin, tài liệu trích dẫn trong đồ án này đều được ghi rõ nguồn gốc. TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực hiện Đặng Thị Kim Tuyền
  3. LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đồ án, tôi đã nhận được rất nhiều sự hỗ trợ và giúp đỡ từ phía nhà trường cũng như gia đình. Chính vì lí do đó, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến họ vì đã giúp tôi đạt được thành quả như hôm nay. Lời đầu tiên tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện để tôi được học tập thật tốt tại trường trong thời gian qua và quý Thầy (Cô) của Viện Khoa học Ứng dụng lời cảm ơn sâu sắc, niềm tự hào vì đã được học tập tại đây. Bên cạnh đó, để hoàn thành được bài báo cáo này, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương đã tận tình chỉ dạy tôi, cho tôi thêm động lực mỗi khi gặp khó khăn, nhờ có cô tôi mới có thể hoàn thành tốt nhất đề tài của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn làm đồ án tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và các em Nguyễn Bảo Trân, Nguyễn Ngọc Gia Bảo và Hồ Lí Hải Vân (15DSH) đã giúp đỡ tôi và nhóm thực hiện đề tài nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Ngoài ra tôi cũng xin cảm ơn quý Thầy (Cô), các anh chị phụ trách phòng thí nghiệm khoa Dược, trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ tôi về thiết bị và dụng cụ để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, người thân và các bạn bè tôi, đã luôn quan tâm, động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành báo cáo. Trong quá trình hoàn thiện báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót nhất định mà tôi chưa thể khắc phục nên tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý Thầy (Cô) để đề tài này được hoàn chỉnh hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực hiện Đặng Thị Kim Tuyền
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH ix ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 4 1.1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi 4 1.1.1.1. Phân loại 5 1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi 8 1.1.2. Bào tử nấm Linh chi 9 1.2. Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 12 1.2.1. Các polysaccharide và peptidoglycan 15 1.2.2. Triterpenes 17 1.2.3. Saponin 22 1.2.4. Acid béo 23 1.2.5. Các thành phần khác 24 1.3. Công dụng của nấm Linh chi và bào tử Nấm Linh chi 24 1.3.1. Phòng chống ung thư 26 1.3.2. Khả năng kháng oxi hóa 27 1.3.3. Điều trị bệnh đái tháo đường 28 1.3.4. Điều trị các bệnh về tim mạch 28 1.3.5. Tăng cường hệ miễn dịch 29 1.4. Phương pháp phá vỡ và trích ly hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi 29 1.4.1. Enzyme chitinase 30 1.4.2. Giới thiệu về siêu âm phá tế bào 33 1.4.2.1. Khái niệm 33 1.4.2.2. Bản chất của sóng âm 34 1.4.2.3. Nguyên lý tác động của sóng siêu âm 34 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.4. Tác động của sóng siêu âm lên tế bào 36 1.4.2.5. Ứng dụng của sóng siêu âm 36 1.4.2.6. Thiết bị phát sóng siêu âm 37 1.4.3. Các phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi 38 1.4.4. Phương pháp trích ly hoạt chất thu dầu bào tử 41 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1. Vật liệu nghiên cứu 46 2.1.1. Vật liệu 46 2.1.2. Nơi thực hiện 46 2.1.3. Thời gian thực hiện 46 2.1.4. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất 46 2.1.4.1. Thiết bị 46 2.1.4.2. Dụng cụ 47 2.1.4.3. Hóa chất – Môi trường nuôi cấy 48 2.2. Phương pháp nghiên cứu 52 2.2.1. Thu enzyme chitinase bằng lên men thể rắn 54 2.2.1.1. Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 trên môi trường thạch PDA 55 2.2.1.2. Phương pháp hoạt hóa Trichoderma harzianum T2 55 2.2.1.3. Thu enzyme dịch trích ly bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn 55 2.2.1.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 tối ưu hóa để thu enzyme chitinase 55 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử nấm Linh chi 56 2.2.2.1. Phá vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp lạnh đông kết hợp sử dụng enzyme thương mại Cellulase (EC), dịch tăng sinh nấm Trichoderma harzianum T2 (DTL) và siêu âm 57 2.2.2.2. Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu 57 2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lý bào tử 60 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 61 2.2.4.1. Quy trình trích ly hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi 63 2.2.4.2. Định tính một số hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi 65 2.2.4.3. Định lượng một số hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi sau khi bị phá vỡ 67 2.2.4.4. Phương pháp kháng oxi hóa DPPH 69 2.2.4.5. Phương pháp thử độc tính tế bào artemia 71 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73 3.1. Thu enzyme chitinase trên môi trường lên men thể rắn 73 3.2. Ảnh hưởng của siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi 74 3.3. Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lí lạnh đông 78 3.4. Định tính thành phần hóa học sau khi phá vỡ bào tử nấm Linh chi 79 3.4.1. Định tính thành phần hóa học trong dịch phá vỡ bào tử 80 3.4.1.1. Định tính protein 81 3.4.1.2. Định tính saponin 82 3.4.1.3. Định tính polysaccharide 85 3.4.1.4. Định tính triterpenoid 85 3.4.2. Định tính thành phần hóa học còn lại trong vỏ bào tử phá vỡ bằng enzyme kết hợp siêu âm 87 3.4.2.1. Định tính protein 87 3.4.2.2. Định tính saponin 87 3.4.2.3. Định tính polysaccharide 88 3.4.2.4. Định tính triterpenoid 88 3.5. Định lượng các hoạt chất thu được từ dịch phá vỡ và bào tử bị phá vỡ 90 3.5.1. Định lượng polysaccharide trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu âm và mẫu siêu âm bằng phương pháp Phenol – Sulfuric 90 3.5.2. Định lượng lipid trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu âm và mẫu siêu âm bằng phương pháp Adam – Rose – Gottlieb 92 3.6. Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa 97 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp 3.7. Thử độc tính tế bào trên Artemia nauplii 101 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 104 4.1. Kết luận 104 4.2. Ki ến nghị 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO 106 Tài liệu tiếng Việt 106 Tài liệu tiếng Anh 106 PHỤ LỤC A 1 PHỤ LỤC B 13 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PDA: Potato Dextro Agar EC: Enzyme Cellulase C20032 DTL: Dịch trích ly A.nauplii: atermia nauplii DPPH: 1,1 - Diphenyl - 2 - picryl – hydrazyl Trolox: 6 – Hydroxy – 2, 5, 7, 8 - tetramethychroman - 2 – carboxylic CMC: Sodium carboxymethyl cellulose DNS: acid - 2 - hydroxyl - 3,5 – dinitrobenzoic DMSO: Dimethyl sulfoxit ĐC: Đối chứng KSA: Không siêu âm SA: Siêu âm SA 75%: Siêu âm độ khuếch đại 75% SA100%: Siêu âm độ khuếch đại 100% PHC: Pha hữu cơ PN: Pha nước DI: Diethyl ether HE: Hexane BT: Bào tử v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác nhau (Lê Xuân Thám, 1996) 10 Bảng 1.2. Thành phần dược tính của nấm Linh chi 12 Bảng 1.3. Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong thể quả và bào tử nấm Linh chi (Li JJ và cộng sự (2014)) 15 Bảng 1.4. So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi (2,5 mg/mL) 27 Bảng 1.5. Những nghiên cứu về phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi trên Thế giới 39 Bảng 1.6. Các phương pháp trích ly 41 Bảng 1.7. Các dung môi trong chiết xuất lipid của Ganoderma lucidum (CN1099455C) 44 Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm thử độc tính tế bào trên artemia nauplii 71 Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải chitin của enzyme chitinase thu được từ hai môi trường cơ chất (mm) 73 Bảng 3.2. Bảng so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi qua các ngày ủ enzyme 75 Bảng 3.3. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi qua các ngày 76 Bảng 3.4. Kết quả so sánh ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lí lạnh đông 78 Bảng 3.5. Kết quả định tính protein theo thử nghiệm biuret khi trích ly bằng hai dung môi 81 Bảng 3.6. Bảng ghi nhận kết quả chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian khi định tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly bằng diethyl ether 82 Bảng 3.7. Bảng ghi nhận kết quả chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian khi định tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly bằng hexane 84 Bảng 3.8. Kết quả định tính saponin khi trích ly bằng hai dung môi 85 Bảng 3.9. Kết quả định tính polysaccharide khi trích ly bằng hai dung môi 85 Bảng 3.10. Kết quả định tính triterpenoid khi trích ly bằng hai dung môi 86 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.11. Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính thành phần hóa học trong dịch phá vỡ bằng hai dung môi 86 Bảng 3.12. Kết quả định tính protein theo thử nghiệm biuret khi trích ly vỏ bào tử 87 Bảng 3.13. Kết quả định tính saponin theo thử nghiệm tạo bọt, Fontan - Kaudel khi trích ly vỏ bào tử 88 Bảng 3.14. Kết quả định tính polysaccharide theo thử nghiệm Molisch khi trích ly vỏ bào tử 87 Bảng 3.15. Kết quả định tính triterpenoid theo thử nghiệm Liebermann-Burchard khi trích ly vỏ bào tử 88 Bảng 3.16. Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính phần vỏ bào tử 88 Bảng 3.17. Bảng tổng kết các thử nghiệm tất cả các pha khi trích ly dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử 89 Bảng 3.18. Hàm lượng polysaccharide có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm 91 Bảng 3.19. Bảng phân tích hàm lượng polysaccharide trong hai pha khi trích ly lỏng lỏng dịch phá vỡ bào tử bằng diethyl ether và hexane từ 100 g bào tử không siêu âm và siêu âm 92 Bảng 3.20. Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm 92 Bảng 3.21. Giả sử hàm lượng polysaccharide tổng và lipid trong mẫu không siêu âm là 100% từ đó tính ra được% polysaccharide tổng và lipid của các mẫu còn lại nhằm so sánh ảnh hưởng của siêu âm lên hàm lượng polysaccharide và lipid trong bào tử nấm Linh Chi 93 Bảng 3.22. Tỉ lệ phần trăm quét gốc tự do DPPH của đối chứng dương Trolox 97 Bảng 3.23. Tỉ lệ phần trăm (%) quét gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào tử 97 Bảng 3.24. Bảng giá trị IC50 (µg/ml) của các mẫu dầu bào tử 98 Bảng 3.25. Tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất trong dung dịch nuôi cấy Artemia nauplii của PHC SA (mg/ml) 101 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.26. Tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất trong dung dịch nuôi cấy Artemia nauplii của BT SA (mg/ml) 102 viii
  12. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A), nấm mọc trong tự nhiên (B) và nấm trồng (C) 5 Hình 1.2. Bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần 11 Hình 1.3. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi Ganoderma lucidum 11 Hình 1.4. Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm Linh chi 12 Hình 1.5. Cấu trúc của Ganodermasides 14 Hình 1.6. Cấu trúc không gian của polysaccharide trong nấm Linh chi 17 Hình 1.7. Công thức của một số triterpene trong nấm Linh chi (Kubota và cộng sự, 1982; Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba và cộng sự, 1984; Agric Biol Chem 48: 2905-7; Sato và cộng sự, 1986; Agric Biol Chem 50: 2887- 90; Budavari và cộng sự, 1989). 19 Hình 1.8. Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và cộng sự, 2011) 20 Hình 1.9. Tên của 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và cộng sự, 2011) 21 Hình 1.10. Các dạng sản phẩm của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 26 Hình 1.11. Cấu trúc chitin 31 Hình 1.12. Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase 32 Hình 1.13. Quá trình phân hủy chitin thành chitosan và cellulose 33 Hình 1.14. Quá trình hình thành, phát triển và vỡ của bọt khí 36 Hình 1.15. Thiết bị phát sóng siêu âm dạng thanh 38 Hình 1.16. Máy phá mẫu, tế bào bằng sóng siêu âm Qsonica Q500 39 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 54 Hình 2.2 Sơ đồ thu enzyme chitinase bằng môi trường lên men thể rắn 54 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử nấm Linh chi 57 Hình 2.4. Buồng đếm hồng cầu Neubauer 58 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử 60 ix
  13. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 62 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình trích ly bào tử sau khi phá vỡ 64 Hình 2.8. Phương trình phản ứng định tính polysaccharide 66 Hình 3.1. Đường kính vòng phân giải enzyme chitinase thu được từ hai môi trường cơ chất (mm) 73 Hình 3.2. Khả năng phân giải chitin của enzyme thu được từ hai môi trường 74 Hình 3.3. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi qua các ngày 76 Hình 3.4. Bào tử nấm Linh chi soi dưới kính hiển vi (X400) 76 Hình 3.5. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi . 77 Hình 3.6. Biểu đồ so sánh tỉ lệ phá vỡ (%) bào tử nấm Linh chi qua các chế độ tiền xử lí 79 Hình 3.7. Hai pha dịch trích ly lỏng lỏng bằng diethyl ether 81 Hình 3.8. Biểu đồ polysaccharide tổng (%) có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm 92 Hình 3.9. Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm. 93 Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của siêu âm đến hàm lượng polysaccharide tổng số và lipid có trong bào tử nấm Linh chi sau khi phá vỡ. 94 Hình 3.11. Quy trình đề nghị phá vách bào tử nấm Linh chi kết hợp enzyme và siêu âm 96 Hình 3.12. Biểu đồ so sánh tỉ lệ phần trăm quét gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào tử 98 Hình 3.13 Đường chuẩn DPPH của mẫu pha hữu cơ không siêu âm và siêu âm 99 Hình 3.14 Đường chuẩn DPPH của mẫu bào tử không siêu âm và siêu âm 99 Hình 3.15. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 (g/ml) của các mẫu dầu bào tử 100 Hình 3.16. Phần trăm tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplii theo log nồng độ dầu bào tử PHC SA (mg/ml) 102 x
  14. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.17. Phần trăm tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplii theo log nồng độ dầu bào tử BT SA (mg/ml) 103 xi
  15. Đồ án tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết của đề tài Từ xưa đến nay, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được cho là một loại dược liệu và đã có không ít người sử dụng làm thuốc. Theo các tài liệu nghiên cứu, nấm Linh chi có nhiều công dụng trong việc hỗ trợ điều hòa huyết áp, tăng khả năng miễn dịch cho cơ thể, hỗ trợ giải độc và cải thiện bệnh viêm gan mãn tính, xơ gan, thần kinh suy nhược. Có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt chất và xác định tác dụng dược lý của nấm Linh chi như: Germanium, acid ganoderic, acid ganodermic, acid oleic, ganodosteron, ganoderans, adenosin, beta – D – glucan (đặc biệt trong nấm Linh chi có hàm lượng germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 - 8 lần). Các nhà khoa học Việt Nam tìm thấy trong nấm Linh chi có chứa 21 nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự vận hành và chuyển hóa của cơ thể như: đồng, sắt, kalium, magnesium, natrium, calcium. Trong đó, triterpenoid và polysaccharide được xem là thành phần chủ yếu có trong nấm được chú ý nhiều nhất. Chính vì lí do đó mà hiện nay việc trồng và sử dụng nấm Linh chi đang trở nên rất phổ biến và được nhiều người quan tâm. Bên cạnh đó, phần bào tử do nấm Linh chi phóng thích ra cũng có nhiều công dụng bổ ích nhưng lại ít được quan tâm nghiên cứu trích ly hoạt chất. Bào tử nấm Linh chi được cho là tinh chất của nấm Linh chi chứa nhiều chất dinh dưỡng và các đặc tính dược lý, là sản phẩm rất tốt cho sức khỏe. Tuy nhiên, cấu tạo bào tử nấm Linh chi gồm 2 lớp vỏ cứng, việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi để thu triệt để hoạt chất bên trong bào tử là điều đáng được quan tâm. Ngày nay đã có các phương pháp nghiên cứu phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng cơ học kết hợp enzyme Phương pháp phá vỡ sử dụng biện pháp cơ học vẫn chưa mang lại hiệu quả tối ưu. Theo nghiên cứu của Ma Jingjing và cộng sự từ trường Đại học Vũ Hán, Trung Quốc (2007), vách bào tử nấm Linh chi chứa 57,64% là chitin, việc sử dụng enzyme chitinase và cellulase trong việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi là bước không thể thiếu. Nhóm sinh viên HUTECH đã phân lập nấm Trichoderma từ nấm Linh chi phục vụ cho việc phá vách bào tử. Ngoài ra, việc kết hợp với enzyme 1
  16. Đồ án tốt nghiệp thương mại giúp phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi, kết quả đã đạt được từ nghiên cứu của sinh viên Nguyễn Thanh Liên Khương (khóa 13DSH) là 53.5%. Trong khi đó để tăng hiệu suất phá vỡ thì việc ứng dụng siêu âm giúp tăng tỉ lệ phá vỡ đến 74.3%. Vì muốn góp phần nâng cao tỉ lệ phá vỡ và chiết xuất hiệu quả các hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi, nên nhóm thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu các chế độ tiền xử và áp dụng siêu âm trước và sau khi ủ bào tử với dịch enzyme. Kết quả được trình bày trong đồ án tốt nghiệp “Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma licidum kết hợp enzyme và siêu âm”. Mục đích: Thu hồi hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi. Mục tiêu: Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma licidum kết hợp enzyme và siêu âm. Nội dung: - Chọn môi trường lên men thể rắn thu enzyme chitinase từ Trichoderma harzianum T2. - Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm và enzyme lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi. - Khảo sát ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý lên tỉ lệ phá vỡ bào tử. - Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của bào tử nấm Linh chi. Kết quả đạt được của đề tài: - Xác định môi trường lên men thể rắn thu enzyme chitinase để phá vỡ bào tử nấm Linh chi. - Thiết lập được chế độ tiền xử lý bào tử trước khi phá vỡ. - Thiết lập được quy trình phá vỡ bào tử kết hợp enzyme và siêu âm. - So sánh được thành phần polysaccharide tổng và lipid tổng của bào tử phá vỡ bằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm. - So sánh được hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết từ bào tử phá vỡ bằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm. 2
  17. Đồ án tốt nghiệp - Xác định được độc tính tế bào trên Artemia của cao chiết từ bào tử phá vỡ bằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm. Hạn chế của đề tài: - Chưa tối ưu hóa được thông số phản ứng enzyme như vận tốc khuấy đảo quy mô Phòng thí nghiệm. - Chưa tối ưu hóa được thông số siêu âm do hạn chế về thiết bị. - Hạn chế về việc khảo sát triterpenoid và các thành phần hoá học, hoạt tính sinh học khác của bào tử phá vỡ. Phương pháp nghiên cứu - Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm. - Đề tài được xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và Statisticals Analysis Systems (SAS). 3
  18. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 1.1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi Nấm Linh chi (tiếng Anh: Lingzhi mushroom) có tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm Lim (Ganodermataceae). Nấm Linh chi còn có những tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung được phân bố rộng rãi ở các nước Á Đông và thường mọc trên các thân cây khô hoặc đã chết. Ở một số nước Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan nấm Linh chi được sử dụng như một loại dược thảo thiên nhiên giúp cải thiện sức khỏe, tăng cường khả năng kháng tế bào ung thư Đây là một loại nấm lớn, màu tối, vỏ ngoài nhẵn bóng và nhìn giống như một khúc gỗ. Trong tiếng Latin thì lucidus có nghĩa là “sáng bóng” hay “rực rỡ” và điều này cũng tương thích với hình dáng bên ngoài của nấm Linh chi. Ở mỗi nơi nấm Linh chi được gọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc), Yeongji (Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan). Ngoài ra còn một số tên gọi khác như nấm vạn niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc). Theo 2 cuốn sách rất nổi tiếng mô tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao Jing – Thần Nông Bản Thảo Kinh” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán), tác phẩm chuyên tập hợp những kinh nghiệm về dược thực vật từ đời Hán trở về trước và “Ben Cao Gang Mil – Bản Thảo Cương Mục” của “Li Shi Zhen – Lí Thởi Trân” (1590 trước Công nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6 chủng nấm được biết đến tại thời điểm lúc bấy giờ. Trong đó có hơn 250 loại nấm Linh chi được đề cập. Tuy nhiên, trong các văn bản cổ chỉ đề cập nhiều đến khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi đỏ. 4
  19. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1: Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A), nấm mọc trong tự nhiên (B) và nấm trồng (C) 1.1.1.1. Phân loại Vị trí phân loại của nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2010) Giới: Nấm – Mycota hay Fungi Ngành: Nấm thật – Eumycota Ngành phụ: Basidiomycotina Lớp: Hymenomycetes Lớp phụ: Hymenomycetidae Bộ: Ganodermatales Họ: Ganodermataceae Chi: Ganoderma 5
  20. Đồ án tốt nghiệp Loài: Ganoderma lucidum Từ thời cổ xưa có rất nhiều nhà nghiên cứu (cả ở Trung Quốc và phương Tây) đã tìm hiểu về loại nấm này và họ cũng đã đưa ra rất nhiều hệ thống để phân loại nấm Linh chi. Những nhà nghiên cứu Trung Quốc cổ đại đã chia nấm Linh chi thành rất nhiều loại khác nhau dựa vào thể quả cũng như hình dáng bên ngoài của nấm. Ở phương Tây, theo trình định danh có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này. Kể từ lần đặt tên đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học Phần Lan xác định tên chính thức Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst đã mất đến 100 năm (1881). Kể từ đó nấm Linh chi đỏ đã trở thành một đại diện tiêu biểu cho chủng loại nấm này. Về sau, đặc điểm phân loại của nấm Linh chi đã được thay đổi bởi một số nhà khoa học khác như Donk, Murrill, Furtano và Steyaert, sau khi họ đã tìm ra những đặc tính khác của nấm Linh chi như các bào tử của nấm Linh chi có hình quả trứng, lớp ngoài của thành tế bào tương đối mỏng và trong suốt, ngược lại lớp trong của thành tế bào lại dày, màu vàng nâu và có nhiều nốt nhỏ. Cũng từ đó, nấm Linh chi không còn được phân loại dựa vào màu sắc hay hình dạng bên ngoài nữa. Trong bộ “Bản thảo cương mục” (in năm 1995) của Lý Thời Trân, đại danh y Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), với màu sắc và tên gọi khác nhau: Thanh chi, Xích chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi, Tử chi. - Xích Chi - Nấm Linh chi đỏ: còn được gọi là Đơn chi, Hồng chi có vị đắng, thường được tìm thấy ở trên núi Huo. Ganoderma lucidum là đại diện chính cho loài nấm này. Những đặc điểm của nấm Linh chi đỏ chính là nắp nấm có hình dạng giống như quả thận hoặc hình bán nguyệt, màu nâu đỏ. Thân nấm có dạng giống như một thân cây, cùng màu hoặc đậm hơn so với nắp nấm. Nấm Linh chi đỏ giúp ích tâm khí, chủ vị, tăng trí tuệ. Sử dụng Linh chi đỏ để tăng cường trí nhớ, bổ trung, phòng tránh các bệnh tim mạch và chữa trị tức ngực. - Tử chi - Nấm Linh chi tím: còn được biết đến với tên gọi là Linh chi gỗ, màu tím có vị ngọt. Đặc điểm của loại nấm này là nắp nấm có màu nâu hoặc nâu tím. Thể quả có màu nâu, bào tử của chúng lớn hơn nấm Linh chi đỏ. Ganoderma sinense là đại 6
  21. Đồ án tốt nghiệp diện của loài nấm này. Tử chi có tác dụng bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươi đẹp. - Hoàng chi - Linh chi vàng: còn gọi là Kim chi, loại nấm này có màu vàng tím, có vị ngọt. Một cây nấm lớn có thể nặng khoảng 5 kg hoặc hơn, còn cây nấm non thì nặng khoảng 1,5 đến 2 kg. Laetiporus sulphureus là đại diện của loài nấm này. Khi tươi thì nấm này sẽ chứa rất nhiều nước, có tác dụng ích tì khí, trung hòa, an thần. - Bạch chi - Linh chi trắng: còn gọi là nấm Linh chi ngọc bích, có màu trắng. Theo như Bao Puzi mô tả thì đây là loại nấm không có chất béo, Fomitopsis officinalis là đại diện cho loài nấm này. Loại nấm này có thể quả màu trắng, hình dáng giống như một cái móng ngựa. Một cây nấm lớn có thể nặng đến nhiều kilogram. Loại nấm này thường mọc trên cây thông và một số loại cây lá kim khác. Bạch chi có vị cay, tính bình, không độc, ích phế khí, chữa ho nghịch hơi. - Hắc chi - Linh chi đen: còn gọi là nấm Linh chi xuân hay Huyền chi có màu đen và vị mặn. Loại nấm này thường mọc ở trong những thung lũng, nắp nấm bên ngoài có màu đen bên trong có màu đỏ, thường mọc trên các thân cây, có vị mặn và đắng. Amauroderma rugosum và Polyporus melanopus là 2 đại diện chính của loài nấm này. Cả cuống và nắp của 2 loại nấm này đều có màu đen. Hắc chi có tác dụng ích thận khí, khiến cho đầu óc sản khoái và tinh tường. - Thanh chi – Linh chi xanh: còn gọi là nấm Linh chi rồng. Theo Bao Puzi miêu tả thì nấm Linh chi xanh có hình dáng giống như những sợi lông của chim bói cá. Coriolus versicolar là đại diện tiêu biểu cho loài nấm này. Đặc điểm của loài này là mũ nấm cứng và bề mặt được bao phủ bởi những sợi lông ngắn. Thanh chi giúp cho sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng và thoải mái. Trong mỗi loài nấm Linh chi lại được chia ra rất nhiều loại khác nhau. Ví dụ như nấm Linh chi đỏ thì có Ganoderma lucidum và Ganoderma tsugae được biết đến nhiều nhất. Đối với Linh chi tím thì có Ganoderma neojaponicum và Ganoderma sinense. Tuy nhiên, trong lĩnh vực trồng trọt, y dược và nha khoa, người ta chỉ tập trung nghiên cứu 2 loại đó là Linh chi đỏ và Linh chi tím. 7
  22. Đồ án tốt nghiệp Gần đây khi đã tìm ra được phương pháp gây giống, những nhà khoa học Nhật Bản chứng minh được rằng những cây nấm có màu sắc khác nhau không phải vì khác loại mà chỉ vì môi trường và điều kiện sống khác nhau. Nếu thay đổi điều kiện người ta có thể có được sáu loại từ cùng một giống. Ngoài cách phân loại Linh chi theo màu sắc, người ta còn có thể phân loại Linh chi theo các đặc điểm như:  Vị trí nấm mọc trên cơ chất chủ. Nhóm mọc cao: tai nấm mọc từ gốc lên đến ngọn cây. Nhóm mọc gần đất : nấm mọc từ gốc cây chủ. Nhóm mọc từ đất : tai nấm mọc từ rễ cây hoặc xác mùn.  Nhiệt độ ra nấm. Nhóm nhiệt độ thấp: tai nấm mọc ở nhiệt độ 200C – 230C. Nhóm nhiệt độ trung bình: tai nấm mọc ở 240C – 260C. Nhóm nhiệt độ cao: tai nấm mọc ở 270C – 300C. Do đó, có thể thấy rằng Linh chi không những đa dạng về chủng loại mà còn đa dạng về sinh thái, đây là loại nấm mang tính toàn cầu (Patouillard, N. 189). Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại, từ khi xác lập một chi riêng là Ganoderma Karst (1981), đến nay tính ra có tới 2000 loài và phổ biến nhất là Ganoderma lucidum có tới 45 loại. Ở Việt Nam, loài chuẩn Linh chi Ganoderma lucidum mới được trồng thành công trong phòng thí nghiệm năm 1978. Năm 1994 loài nấm lim – một chủng Linh chi đỏ đặc sắc của các rừng cây Lim miền Bắc Việt Nam đã được Phạm Văn Thụ đưa vào nuôi trồng chủ động. 1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi Về hình thái ngoài, chúng cũng có ít nhiều sai khác: - Cuống nấm: dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3cm, cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi uốn khúc. Lớp vỏ cuống màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen, bóng, không có lông phủ trên mặt tán nấm. 8
  23. Đồ án tốt nghiệp - Mũ nấm: khi non hình trứng, lớn dần hình quạt. Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu – vàng cam – đỏ cam – đỏ nâu – nâu tím – nâu đen, được bao phủ bởi sợi không vách ngăn ngang xếp sít nhau kiểu hàng rào và có đầu sợi dày thêm ra, đường kính đoạn sợi phình to ra 8 – 10 μm. Chính những tế bào vỏ này tạo nên lớp vỏ bền vững và bóng như vecni cho nấm. Lớp vỏ láng phủ suốt theo cuống. Kích thước tán biến động từ 2 – 30 cm, dày 0,8 – 2,5 cm, cuống dài từ 2,5 - 3,5 cm, tròn mập hoặc mảnh (đường kính từ 0,5 – 2,2 cm). phần đính cuống hoặc gồ lên hoặc lõm như lõm rốn. Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8 cm màu vàng kem – nâu nhạt – trắng. Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc cứng và nhẹ. Hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận cùng lớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mặt trên mũ và bao quanh cuống bởi sự hình thành các chất lacate tan mạnh trong cồn. Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước đó mà nấm chịu được mưa, nắng. Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào . - Thụ tầng: Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ 0,2 – 1,7 cm, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng – vàng ánh xanh, khoảng 3 – 5 ống/mm. Đảm đơn bào mang 4 đảm bào tử hình trứng – trứng cụt – hình chùy, không màu, dài 16 - 22μm. Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầm (germpore) phồng căng hay lõm thụt vào mà thành. 1.1.2. Bào tử nấm Linh chi Cũng như các loài nấm khác, nấm Linh chi khi trưởng thành sẽ sản sinh ra bào tử, tức là hạt giống hữu ích cho đời sau. Bào tử thường được mô tả có dạng trứng cụt. Đôi khi có tác giả mô tả là dạng hình trứng có đầu chóp tròn - nhọn. Thực ra đó là do chụp phủ lớp nảy mầm hoặc phồng căng, hoặc lõm thụt vào mà tạo thành. Mỗi bào tử được bao phủ với hai lớp vách rất khó phá vỡ gọi là sporoderm (FDA 1.8.1999), màu vàng mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu, kích thước bào tử rất nhỏ dao động khoảng từ 6,5 x 8,0 µm đến 9,6 x 12,6 µm. Vách bào tử gồm hai lớp liên kết giữa exosporium và endosporium, có độ dày 0,8 x 1,0 µm và 11 x 14 µm, có cấu trúc phức tạp. Bào tử nấm Linh chi có hai lớp vách rất cứng, khó nảy 9
  24. Đồ án tốt nghiệp mầm (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016). Một số nghiên cứu về kích thước bào tử nấm Linh chi được trình bày trong bảng dưới đây (bảng 1.1). Bảng 1.1. Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác nhau (Lê Xuân Thám, 1996) Nguồn Kích thước bào thử (μm) Vùng thu mẫu 1889, Patouuillard 10 – 12 x 6 – 8 Đông Dương 1939, Imazeki 9,5 – 11 x 5,5 – 7 Nhật Bản 1964, Teng 8,5 - 11,5 x 5 – 6,5 Trung Quốc 1972, Steyaert 8,5 – 10,8 – 13 x 5,5 – 8,5 Indonesia, Úc châu 1973, Pegler và cộng sự 9 – 13 x 6 – 8 Anh Quốc 1976, Ryvarden 7 – 12 x 6 – 8 Bắc Âu, Phi châu 1980, Ryvarden và cộng 7 – 12 x 6 – 8 Đông Phi châu sự 1981, Kiet 7,5 – 10 x 5 – 6,5 Bắc Việt Nam 1982, Bazzalo và cộng sự 9 – 13 x 5 – 7 Argentine 1986,Melo 8,2 – 11,5 – 13,5 x 6,5 – 7,5 – 8,1 Bồ Đào Nha 1986, Gibertson và cộng 9 – 12 x 5,5 – 8 Bắc Mỹ sự 1986, Adaskaveg và cộng 10 – 11,8 x 6,8 – 7,8 Bắc Mỹ sự 1987, Peterson 7 – 8 x 6 – 7,8 Bắc Âu 1989, Zhao 9 – 11 x 6 – 7 Trung Quốc 1990, Hseu 8,5 – 11,5 x 5 – 7 Đài Loan 1994, Thu 9 – 12 x 5 – 7 Hà Bắc, Việt Nam 1994, Tham và cộng sự 8 – 10,5 x 5 x 7 Lạng Sơn, Việt Nam 1996, Tham 7,5 – 11,5 x 5,5 – 7 Đà Lạt, Việt Nam Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào tử bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ rất mịn. 10
  25. Đồ án tốt nghiệp Tuy vậy số lượng bào tử Linh chi rất ít. Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi sẽ chỉ thu được 1 kg bào tử. Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về cấu tạo tinh vi của bào tử thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật, Trung Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt. a) b) Hình 1.2. Bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần a) Bào tử nấm Linh chi chưa bị phá vỡ b) Bào tử nấm Linh chi bị phá vỡ vách Hình 1.3. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi Ganoderma lucidum 11
  26. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm Linh chi 1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào tử). 2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử xẻ múi ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma) Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường cản quang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học. Cấu trúc của lớp vỏ trong cho đến nay còn chưa được biết rõ. Cần lưu ý rằng: khái niệm – “gai chống nhọn” từ màng trong đâm sát màng ngoài của hầu hết các mô tả trước đây không chính xác. Thực chất các gai hay chính các cột chống hầu như không nhọn, mà phình đầu thành các u lồi - và chính các u lồi này đội lớp màng phủ trong suốt ngoài cùng (episporium, exosporium hay chính là tầng phủ tectum), tạo thành các kiến trúc gò hạt - mụn cóc - u nhú trên bề mặt vỏ bào tử. Điều này Heim (1962), Hansen (1958), Perreau (1973), Mims và cộng sự (1989) đã từng phân tích và thảo luận nhiều. 1.2. Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi Trong đề tài nghiên cứu năm 2005 của Nguyễn Minh Khang, thành phần dược tính của nấm Linh chi được phân như sau: Bảng 1.2. Thành phần dược tính của nấm Linh chi 12
  27. Đồ án tốt nghiệp Chất Hàm lượng Nước 12 - 13% Cellulose 54 - 56% Lignin 13 - 14% Hợp chất nitơ 1,6 – 2,1% Chất béo (kể cả dạng xà phòng hóa) 1,9 - 2% Hợp chất phenol 0,08 – 0,1% Hợp chất Sterol toàn phần 0,11 – 0,16% Saponin toàn phần 0,3 – 1,23% Theo Wachtel Galor và cộng sự (2011) trong nấm Linh chi tươi, nước là thành phần chủ yếu chiếm 90% khối lượng. Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10- 40%, chất béo chiếm từ 2 - 85%, carbonhydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm lượng tro chiếm 8 - 10% cùng một số loại vitamin và khoáng chất khác như kali, can- xi, phốt pho, ma-giê, selen, sắt, kẽm, trong đó đồng chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Borchers và cộng sự, 1999). Trong một nghiên cứu về những thành phần của nấm, Mau và cộng sự (2001) đã xác định được tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm Linh chi gồm: tro (1,8%), carbonhydrate (26 - 28%), chất béo thô (3 - 5%), chất xơ (59%) và protein (7 - 8%). Hàm lượng của protein trong nấm Linh chi khoảng 7 - 8%, thấp hơn so với nhiều loại nấm khác (Chang và cộng sự, 1996; Mau và cộng sự, 2001). Đặc biệt thành phần protein của nấm Linh chi có rất nhiều các amino acid thiết yếu nhất là lysine và leucine. Hàm lượng chất béo tổng thấp nhưng chứa nhiều acid béo không bão hòa nhiều nối đôi, đây là các hợp chất rất có lợi cho sức khỏe của con người (Chang và cộng sự, 1996; Borchers và cộng sự, 1999; Sanodiya và cộng sự, 2009). Ngoài ra trong nấm còn chứa các glycoprotein và các polysaccharide. Bên cạnh đó, nấm Linh chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính sinh học như các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất của chúng. Hoạt tính sinh học của nấm Linh chi có được chủ yếu là do các polysaccharide, peptidoglycan và các triterpene mang lại (Boh và cộng sự, 2007; Zhou và cộng sự, 2007). 13
  28. Đồ án tốt nghiệp Địa điểm sinh trưởng của nấm Linh chi cũng được xem là yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi. Trong một nghiên cứu về hoạt tính sinh học của 11 mẫu sản phẩm nấm Linh chi được trồng ở Nhật Bản, người ta nhận thấy sự chênh lệch về hàm lượng triterpenoid giữa các mẫu dao động trong khoảng từ 0 – 7,8% và hàm lượng các polysaccharide dao động trong khoảng từ 1,1 - 5,8% (Lu và cộng sự, 2012). Sự khác nhau về hàm lượng của các hoạt tính sinh học trong các sản phẩm thương mại cũng chịu ảnh hưởng bởi quá trình chế biến hoặc chiết xuất, qua đó cho thấy chiết xuất bằng nước sẽ cho hàm lượng triterpenoid ít hơn khi chiết xuất bằng ethanol (Lu và cộng sự, 2012). Bên cạnh đó, điều kiện sinh trưởng cũng ảnh hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi (Lu và cộng sự, 2012). Trước kia, việc thu thập bào tử Ganoderma lucidum rất khó nên điều này làm cho việc nghiên cứu chức năng cũng như các hoạt chất sinh học có trong bào tử cũng trở nên khó khăn, do đó cũng chỉ tập trung nghiên cứu vào thể quả của nấm Linh chi. Hiện nay, việc trồng nấm Linh chi đã trở nên phổ biến hơn, việc thu thập dễ dàng cũng tạo nhiều điều kiện để nghiên cứu về bào tử Ganoderma lucidum. Ganodermasides A, B, C và D là dẫn xuất ergosterol phân lập từ chiết xuất methanol của bào tử Ganoderma lucidum (Jue Wang và cộng sự, 2017). Cấu trúc của Ganodermasides A, B, C và D được thể hiện trong hình 1.5. 14
  29. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Cấu trúc của Ganodermasides A, B, C và D. 1 đại diện cho A, 2 đại diện cho B, 3 đại diện cho C, 4 đại diện cho D; 1: R 1 = H, R 2 = OH, R 3= H; 2: R 1 = H, R 2 = H, R 3 = OH; 3: R 1 = OH, R 2 , R 3 = O; 4: R 1 = OH, R 2 = H, R 3 = H. Bào tử Linh chi có chứa các thành phần giống nấm Linh chi: Polysaccharide, triterpenoid, acid béo, acid amin, vitamin, các nguyên tố vi lượng, với hàm lượng đậm đặc hơn Linh chi từ 7 - 20 lần (Cheng CR và cộng sự, 2010). Bào tử nảy mầm có hoạt tính sinh học cao hơn bào tử không nảy mầm, có thể thấy việc thu các hợp chất sinh học phụ thuộc vào việc vách bào tử có bị vỡ hay không (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016). Bảng 1.3. Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong thể quả và bào tử nấm Linh chi (Li JJ và cộng sự, 2014) Hàm lượng Polysaccharides Triterpenoids Protein Thể quả nấm 0,25% - 1,42% 0,44% - 1,42% 1,82% - 3,67% Bào tử còn nguyên 0,41% - 0,91% 0,09% - 0,12% 0,78% - 0,90% Bào tử phá vỡ 1,03% - 2,25% 1,89% - 3,15% 0,96 % - 1,04% 1.2.1. Các polysaccharide và các peptidoglycan Hàm lượng carbonhydrate và hàm lượng chất xơ có trong nấm Linh chi được xác định lần lượt từ 26 - 28% và 59% (Mau và cộng sự, 2001). Hàm lượng carbohydrate trong bào tử Ganoderma lucidum bị phá vỡ là 1,57% ± 0,06% cao hơn so với bào tử còn nguyên là (0,41% ± 0,01%) (Yue và cộng sự, 2008). Nấm Linh chi có chứa rất nhiều polysaccharide có khối lượng phân tử lớn, các hợp chất này mang hoạt tính sinh học và được tìm thấy ở tất cả các bộ phận của nấm Linh chi. Nhiều nhóm polysaccharide có thể được chiết xuất từ thân nấm, bào tử và khuẩn ty. Các polysaccharide của nấm Linh chi có tác dụng sinh học như chống viêm, hạ đường huyết, chống loét, chống lại sự hình thành khối u và tăng cường khả năng 15
  30. Đồ án tốt nghiệp miễn dịch (Miyazaki và cộng sự, 1981; Hikino và cộng sự, 1985; Tomoda và cộng sự, 1986; Bao và cộng sự, 2002; Wachtel Galor và cộng sự, 2004). Người ta thường chiết xuất các polysaccharide trong nấm Linh chi bằng nước nóng sau đó tiến hành kết tủa chúng bằng dung dịch ethanol hoặc methanol. Đôi khi cũng có thể chiết xuất bằng nước và dung dịch kiềm. Theo kết quả phân tích, thành phần chủ yếu trong polysaccharide của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum - polysaccharides: GL - PSs) là đường glucose (Bao và cộng sự, 2002; Wang và cộng sự, 2002). Ngoài ra, GL - PSs cũng có cấu trúc polymer mạch thẳng, bao gồm: xylose, mannose, galactose và fucose với nhiều vị trí liên kết p hoặc a khác nhau như 1 - 3, 1 - 4 và 1 - 6 với các dạng đồng phân - D hay L (Lee và cộng sự, 1999; Bao và cộng sự, 2002). Khả năng chống lại sự hình thành khối u của GL - PSs phụ thuộc vào cấu hình mạch nhánh cũng như tính tan của polysaccharide này (Bao và cộng sự, 2002; Zhang và cộng sự, 2001). Ngoài ra, nấm Linh chi cũng có chứa một mạng lưới chitin, đây là thành phần mà cơ thể người không tiêu hóa được và đóng vai trò tạo nên độ cứng cho nấm Linh chi (Upton và cộng sự, 2000). Có rất nhiều peptidoglycan có hoạt tính sinh học trong nấm Linh chi đã được phân lập, bao gồm proteoglycan (GLPG) có tác dụng kháng virus (Li và cộng sự, 2005), tăng cường miễn dịch (Ji và cộng sự, 2007) và F3 là một glycoprotein trong cấu trúc có chứa fucose (Chien và cộng sự, 2004). 16
  31. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6. Cấu trúc không gian của polysaccharide trong nấm Linh chi 1.2.2. Triterpenes Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có độ dài mạch carbon là một bội số của 5, ví dụ như menthol (monoterpene) và β - carotene (tetraterpene). Phần lớn các terpenoid thuộc nhóm alkene, một số có chứa những nhóm chức năng, đa phần các terpenoid có cấu trúc mạch vòng. Những hợp chất này được tìm thấy trên rất nhiều loài thực vật. Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lượng chất béo. Terpenoid được tìm thấy trong các loại thực vật thuộc nhóm bạch quả, ví dụ như hương thảo (Rosemarinus officinalis) và nhân sâm (Panax ginseng) có 17
  32. Đồ án tốt nghiệp tác dụng tăng cường sức khỏe (Mahato và cộng sự, 1997; Mashour và cộng sự, 1998; Haralampidis và cộng sự, 2002). Triterpene là một phân lớp của terpenoid và có độ dài mạch carbon là 30. Khối lượng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc hóa học phức tạp và có khả năng bị oxy hóa cao (Mahato và cộng sự, 1997; Zhou và cộng sự, 2007). Nhiều loài cây có khả năng tổng hợp triterpene trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Một số có chứa nhiều triterpene trong nhựa, qua đó giúp các cây này chống lại các loại bệnh. Mặc dù có hàng trăm loại triterpene đã được phân lập từ rất nhiều loại thực vật khác nhau và phân nhóm này cũng đã cho thấy có rất nhiều tiềm năng nhưng hiện nay có rất ít những ứng dụng của triterpene được sử dụng trong thực tế. Trong nấm Linh chi, cấu trúc hóa học của triterpene có dạng lanostane, đây là chất tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình thành nên các squalene mạch vòng (Haralampidis và cộng sự, 2002). Trong quá trình chiết xuất triterpene, người ta thường sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetone, chloroform, ether hoặc là hỗn hợp của chúng. Dịch chiết sau đó sẽ được phân tách bằng nhiều phương pháp khác nhau, có thể dùng HPLC thông thường hoặc HPLC pha nghịch đảo (Chen và cộng sự, 1999; Su và cộng sự, 2001). Những triterpene đầu tiên được Kubota phân tách từ nấm Linh chi là ganoderic acid A và B (Kubota và cộng sự, 1982). Kể từ khi đó, hơn 100 loại triterpene cùng với cấu hình của chúng đã được tìm ra. Trong số đó, có hơn 50 loại là đặc trưng chỉ được tìm thấy trong nấm Linh chi. Đa số các triterpene là các ganoderic và lucidenic acid, nhưng cũng có một số loại khác như là ganoderal, ganoderiol và ganodermic acid (Nishitoba và cộng sự, 1984; Sato và cộng sự 1986; Budavari và cộng sự, 1989; Gonzalez và cộng sự 1999; Ma và cộng sự 2002; Akihisa và cộng sự 2007; Zhou và cộng sự 2007; Jiang và cộng sự 2008; Chen và cộng sự 2010). 18
  33. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7. Công thức của một số triterpene trong nấm Linh chi (Kubota và cộng sự, 1982; Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba và cộng sự, 1984; Agric Biol Chem 48: 2905-7; Sato và cộng sự, 1986; Agric Biol Chem 50: 2887- 90; Budavari và cộng sự, 1989). Nấm Linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng góp phần tạo nên vị đắng của nấm Linh chi. Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể. Tuy nhiên, hàm lượng triterpene trong nấm Linh chi lại không ổn định. Chúng phụ thuộc rất nhiều vào giống, loài, nơi trồng, điều kiện canh tác cũng như phương pháp chế biến, điều này đã được thể hiện trong một nghiên cứu của Chen và Su được tiến hành vào năm 1999 và 2001 (Chen và cộng sự, 1999; Su và cộng sự, 2001). Cho đến nay, hơn 150 triterpenoids đã được tìm thấy từ thể quả của nấm Linh chi đại diện cho năm lớp cấu trúc chính. So với thể quả của nấm Linh chi, các nghiên cứu về bào tử của nấm Linh chi mới bắt đầu từ năm 1988 (Hou CY và cộng sự, 1988) và có 29 loại triterpenoids đã được tìm thấy trong bào tử này. Với những tiến bộ gần đây trong quang phổ và trắc phổ kỹ thuật hiện đại, một loạt các triterpenoids được phân lập từ các bào tử của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược sĩ. Tất cả các triterpenoids trong các bào tử của nấm Linh chi có quá trình tổng hợp tương tự nhau, cụ thể là con đường acid movalonic (MVA) (Bingji Ma và cộng sự, 2011). Các Triterpenoids này được bắt đầu từ trans - squalene và sau đó đã được thay 19
  34. Đồ án tốt nghiệp đổi bởi quá trình oxy hóa, giảm, khử acid, tạo vòng, sắp xếp lại, tạo ra nhiều loại cấu hình triterpenoids trong bào tử của nấm Linh chi. Triterpenoids được cô lập từ bào tử Linh chi cho thấy khả năng kháng HIV-1 protease, chống khối u, và các hoạt động chống bổ sung. Triterpenoids này là thành phần hoạt chất chính của bào tử Linh chi và biểu thị cho các hoạt tính sinh học khác nhau được sử dụng trong dược liệu. Hình 1.8. Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và cộng sự, 2011) 20
  35. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.9. Tên của 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và cộng sự, 2011) Triterpenoids được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi: năm triterpenoids thu được từ phần tan trong ether của bào tử của nấm Linh chi và trên cơ sở tính chất hóa học và dữ liệu quang phổ, acid ganopsoreric A (1), acid ganoderic B (2), acid ganoderic C1 (3), 21
  36. Đồ án tốt nghiệp acid ganoderic E (4) và ganodermanontriol (5) được xác định tương ứng (Bingji Ma và cộng sự, 2011). Thí nghiệm dược lý cho thấy acid ganopsoreric A có có hoạt tính GTP thấp đối với gan chuột bị tổn thương bởi CC14 và GaNI (Chen RY và cộng sự, 1993). Hai triterpenoids pentacyclic mới, có tên ganosporelactone A (6) và B (7) được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi, có thể được bắt nguồn từ khung lanostane thông qua việc hình thành liên kết C18 và C23 (Chen RY và cộng sự, 1991). Hai triterpenes lanostane kiểu mới, lucidumol A (8) và p - acid ganoderic (9), cùng với một lucidumol B (10) và bảy triterpenoids đã biết, ganodermanondiol (11), ganoderiol F (12), acid ganoderic A (13), acid ganolucidic A (14), và 2, 3, 5. Trong số các hợp chất cô lập, các hợp chất 5, 10, 11 và 14 cho thấy khả năng kháng virus gây suy giảm miễn dịch (kháng HIV) - 1 protease hoạt động đáng kể với giá trị IC50 với giá trị 20 - 90 μM (Min BS và cộng sự, 1998). 6 loại lanostane - triterpenes mới có tính oxy hoá cao, được gọi là ganoderic acid γ (15), acid ganoderic δ (16), acid ganoderic ε (17), acid ganoderic ξ (18), acid ganoderic η (19), acid ganoderic θ (20), cùng với ganolucidic acid D (21) và acid ganoderic C2 (22) thu được từ các bào tử nấm. Các khả năng gây độc của các hợp chất 15 - 21 đã được thực hiện in vitro chống dòng tế bào ung thư Meth - A và LLC (Min BS và cộng sự, 1998). Một terpenoid C27 có hoạt tính oxy hóa cao mới, lucidenic axit SP1 (23), thu được từ một phần CHCl3 - tan của bào tử nấm Linh chi cùng với 11 triterpenoids, acid ganoderic C6 (24), acid ganoderic G (25), và 2, 3, 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14 (Bingji Ma và cộng sự, 2011). 1.2.3. Saponin Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo - xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycosid lớn, được tìm thấy rộng rãi trong thực vật. Người ta cũng phân lập được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao. Saponin có một số tính chất đặc biệt: - Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch. - Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng. 22
  37. Đồ án tốt nghiệp - Độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên. - Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao gây nôn mửa, đi lỏng. - Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b -hydroxysteroid khác. Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin. Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol. Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt. Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người ta dùng 3 dung môi này để tủa saponin. Saponin có thể bị tủa bởi chì acetate, bari hydroxyde, ammoni sulfat. Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất. Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin. Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm. Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia ra: saponin triterpenoid và saponin steroid. 1.2.4. Acid béo Người ta thu được lipid của bào tử bị phá vỡ bằng sắc kí lỏng CO2 siêu tới hạn tìm thấy có 15 loại acid béo, các hợp chất chính là acid palmitic (6,12%), acid stearic (4,97%), acid oleic (67,11%) và acid linoleic (9,63%) (Gao P và cộng sự, 2012). Chen và cộng sự (2013) đã xác định và định lượng 9 acid béo, phần lớn trong số đó là acid oleic (C18:1; 57,5%), acid linoleic (C18:2; 13,4%), acid palmitic (C16:0; 19,6% ), acid hexadecenoic (C16:1; 2,2%), và acid linolenic (C18:3; 0,5%) và Liu và cộng sự (2007) xác định được 18 acid béo. Hoạt tính của acid béo thu được từ bào tử gồm acid nonadecanoic và acid cis-9-nonadecenoic có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào khối u và gây độc cho tế bào hồng cầu (HL-60) (Gao P và cộng sự, 2012). 23
  38. Đồ án tốt nghiệp 1.2.5. Các thành phần khác Tiến hành phân tích thân nấm Linh chi, người ta còn tìm thấy thành phần chất khoáng như phospho, silicon, sulfur, kali, calcium và magnesium chiếm một tỉ lệ khá cao. Bên cạnh đó còn có sắt, nhôm, kẽm, đồng, mangan và strontium với hàm lượng thấp hơn. Ngoài ra còn có một số kim loại nặng như chì, cadmium và thủy ngân (Chen và cộng sự, 1998). Trong một nghiên cứu của Chiu được tiến hành vào năm 2000, khi phân tích nấm Linh chi hoang thuộc loài Ganoderma spp, ông đã xác định được trong hàm lượng chất khoáng của loại nấm này có chứa 10,2% là kali, calcium và magnesium. Cũng trong một nghiên cứu khác thì Falandysz đã không tìm thấy cadmium và thủy ngân trong những mẫu nấm Linh chi, nhưng hàm lượng selenium được xác định là 72 pg/g. Trong thành phần của nấm Linh chi (Ganoderma spp) có một chất cũng nhận được rất nhiều sự quan tâm, đó là germanium. Đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5 trong các chất khoáng (489 pg/g) có trong nấm Linh chi. Chất này tồn tại rất ít ở các loại thực vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhân sâm, lô hội và tỏi (Mino và cộng sự, 1980). Mặc dù germanium không phải là thành phần thiết yếu, nhưng chỉ cần một liều lượng thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch, kháng khối u, chống oxy hóa và chống đột biến (Kolesnikova và cộng sự, 1997). Những hợp chất khác cũng được tìm thấy trong nấm Linh chi đó là các loại enzyme như metalloprotease (đây là loại enzyme có tác dụng trì hoãn quá trình đông máu). Ngoài ra, ergosterol (provitamin D2), các nucleoside và các nucleotide (như adenosine và guanosine) (Wasser và cộng sự, 2005; Paterson và cộng sự, 2006; Kim và cộng sự, 2004). cũng đã được tìm thấy trong nấm Linh chi, đây là những hợp chất có tác dụng ức chế thuận nghịch a-glucosidase và SKG-3. Trong lớp vách sporoderm còn phát hiện được các chất vô cơ như magie, nhôm, silicon, phosphate, lưu huỳnh, clo, kali, canxi, sắt và niken, một số chất có hàm lượng cao như silicon (19,01%) và canxi (24,31%) (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016). 1.3. Công dụng của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi Một số dạng sản phẩm từ nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi đang có hiện nay: 24
  39. Đồ án tốt nghiệp - Trà túi lọc nấm Linh chi: bồi bổ sức khỏe, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, điều hòa tim mạch, hạ cholesterol, phòng và chống viêm gan, an thần, tăng trí nhớ, tăng tuổi thọ. - Bột Nấm Linh chi: bồi bổ sức khỏe và hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnh ung thư, xơ gan, điều hòa huyết áp, tiểu đường, tăng cường hệ miễn dịch, chống lão hóa - Viên nang dầu bào tử: Chống oxy hóa, trung hòa các gốc tự do, giảm Cholesterol trong máu, chống xơ vữa động mạch, ổn định huyết áp, giải độc gan. Chữa mất ngủ, giúp da dẻ mịn màng, giảm sạm nám tàn nhang. Hỗ trợ tăng hồng cầu cho bệnh nhân ung thư. Giúp đào thải độc tố trong gan cho bệnh nhân ung thư, bệnh mãn tính, người hay tiếp xúc rượu bia, stress. - Bột bào tử nấm Linh chi: Tăng cường hệ thống miễn dịch, cô lập và diệt các tế bào ung thư, chống viêm nhiễm, bảo vệ gan, tăng cường chức năng chức năng gan, thải độc chống dị ứng, điều hoà huyết áp, nhịp tim, tăng lượng oxy trong máu, giảm cholesterol, dùng tốt cho bệnh nhân tiểu đường. Hình 1.10. Các dạng sản phẩm của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 25
  40. Đồ án tốt nghiệp Riêng đối với bào tử nấm Linh chi có thể được sử dụng dưới dạng còn nguyên hoặc bị phá vỡ, nhưng có nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng bào tử bị phá vỡ có hoạt tính sinh học cao hơn so với bào tử còn nguyên. Bào tử còn nguyên đã được tìm thấy trong phân người và động vật, như vậy bào tử Ganoderma lucidum không thể được tiêu hóa trong cơ thể, nhưng cũng có báo cáo cho rằng bào tử với lớp vách còn nguyên vẹn có thể hoạt động khi uống vào trong cơ thể (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016). 1.3.1. Phòng chống ung thư Nấm Linh chi được sử dụng phổ biến trong quá trình hỗ trợ điều trị ung thư nhằm giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho các bệnh nhân bên cạnh áp dụng những liệu pháp chữa trị thông thường. Mặc dù hiện nay quá trình điều trị bệnh ung thư đã có những tiến bộ nhất định thông qua việc chẩn đoán bệnh sớm cũng như những phương pháp hoá trị hiện đại, tuy nhiên việc chữa dứt điểm các căn bệnh này vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn thử thách (theo WHO 2008). Trong quá trình tìm kiếm những phương pháp điều trị và những tác nhân hoá trị mới, người ta đã tìm ra trong hàng trăm loài thực vật, trong đó có cả nấm Linh chi, những hoạt chất sinh học có khả năng ngăn chặn quá trình hình thành khối u (Wasser và cộng sự, 1999; Borchers và cộng sự, 2008). Trong nấm Linh chi có một lượng lớn những hợp chất hoá học có thể được chiết xuất từ thân nấm, sợi nấm và bào tử. Trong đó, các polysaccharide và triterpene là 2 nhóm hợp chất chính trong nấm Linh chi có tác dụng ngăn ngừa ung thư và ngăn chặn quá trình hình thành khối u, điều này đã được chứng minh trong những nghiên cứu của Yuen và cộng sự (2005) cũng như của Zaidman và cộng sự (2005). Một trong những tác dụng mới được tìm thấy của dịch chiết nấm Linh chi là có khả năng hỗ trợ điều trị cho các căn bệnh mãn tính, ví dụ như bệnh ung thư và bệnh liên quan đến gan (Bao và cộng sự, 2005). Những thí nghiệm trên động vật đã cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc ức chế sự hình thành và di căn của các tế bào ung thư. Tuy nhiên, việc tiến hành những thí nghiệm này trên cơ thể người vẫn còn hạn chế. Daniel Sliva và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư vú trên chuột với các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi như: bào tử còn 26
  41. Đồ án tốt nghiệp nguyên, bào tử bị phá vỡ, bột thể quả, dịch chiết của thể quả và bào tử với các nguồn cung cấp khác nhau và đã thu được kết quả như bảng 1.4. Bảng 1.4. So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi (2,5 mg/mL) Tên Nguồn gốc Thành phần Khả năng ức chế tế bào ung thư Zihanga Trung Quốc Bào tử còn nguyên 89,3% Zhongkeb Trung Quốc Bào tử phá vỡ 71,9% Jilinc Trung Quốc Bào tử còn nguyên 9,5% Two Urnd Trung Quốc Bột thể quả 54,3% Double Cranee Đài Loan Bột thể quả 86,5% ReishiMaxf Mỹ Dịch chiết thể quả 99% và bào tử Gần đây có nghiên cứu cho thấy rằng các acid béo C-19 là nonadecanoic acid và cis-9-nonadecenoic acid thu được từ bào tử Ganoderma lucidum bị phá vỡ có tác dụng chống tế bào ung thư (Gao P và cộng sự, 2012). Từ những nhận định và kết quả thí nghiệm nêu trên cho ta thấy việc tìm ra một quy trình phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi hiệu quả để trích xuất các thành phần hoạt tính sinh học từ bào tử Ganoderma là việc rất quan trọng. Đã có rất nhiều báo cáo khoa học về các phương pháp phá vỡ bào tử Ganoderma lucidum. 1.3.2. Khả năng kháng oxi hóa Những hợp chất chống oxi hoá trong thực vật có tác dụng ngăn ngừa ung thư cũng như những căn bệnh nan y khác (Collins và cộng sự, 2005; Benzie và cộng sự, 2009). Những hợp chất này có tác dụng bảo vệ các thành phần có trong màng tế bào chống lại những tổn thương do quá trình oxy hoá gây nên, qua đó giúp làm giảm những nguy cơ gây ra đột biến và ung thư cũng như góp phần bảo vệ các tế bào miễn dịch. Những hợp chất có trong nấm Linh chi chủ yếu là các polysaccharide và các triterpene cũng có tác dụng chống lại quá trình oxy hoá tế bào (Lee và cộng sự, 2001; Lin và cộng sự, 2002; Shi và cộng sự, 2002; Wachtel Galor và cộng sự, 2005; Yuen và cộng sự, 2008; Saharelli và cộng sự, 2009; Wu và cộng sự, 2009). 27
  42. Đồ án tốt nghiệp Các thành phần hoạt tính sinh học trong Ganoderma lucidum bao gồm polysaccharides, triterpenes, peptide và polysaccharide peptide có tác dụng gián tiếp hoặc trực tiếp trong việc chống lão hóa (Jue W và cộng sự, 2017). 1.3.3. Điều trị bệnh đái tháo đường Những thành phần của nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hạ đường huyết đối với động vật. Các ganoderan A và B là hai polysaccharide được chiết tách từ thân nấm Linh chi, sau khi được tiêm cho chuột bị tiểu đường với liều lượng 100 mg/kg, cho thấy hàm lượng glucose trong máu giảm và tác dụng hạ đường huyết vẫn tiếp tục kéo dài suốt 24 giờ (Hikiko và cộng sự, 1985). Cũng trong một thí nghiệm trên chuột, ganoderan B có tác dụng làm tăng lượng insulin, qua đó làm giảm hàm lượng glucose trong máu và điều chỉnh quá trình tổng hợp glucose dưới tác dụng của các enzyme có sẵn trong gan (Hikiko và cộng sự, 1989). Trong một nghiên cứu khác cũng được tiến hành trên chuột, người ta đã chứng minh được rằng một polysaccharide khác có trong nấm Linh chi được gọi là ganoderan C cũng có tác dụng hạ đường huyết (Hikiko và cộng sự, 1989; Tomoda và cộng sự, 1986). 1.3.4. Điều trị các bệnh về tim mạch Chống nhiễm mỡ, xơ mạch và các biến chứng (bệnh xơ vữa động mạch vành). Có tác dụng đặc biệt trong việc loại trừ chất cholesterol trong máu và các thành mạch, trợ tim, lọc sạch máu, làm giảm cholesterol, giảm xơ cứng thành động mạch, thúc đẩy quá trình lưu thông máu, tăng cường tuần hoàn máu. Làm giảm mệt mỏi, hỗ trợ thần kinh, chống đau đầu và tứ chi, điều hòa kinh nguyệt. Nấm Linh chi đã được cho là có đặc tính hạ huyết áp và tăng huyết áp (homeostasis). Một peptidoglycan có tác dụng hạ huyết áp nhẹ trên chuột SHR (bẩm sinh tăng huyết áp) đã được phân lập từ dịch chiết nước nóng của Linh chi. Theo một báo cáo, huyết áp của khoảng một nửa số bệnh nhân tăng huyết áp được giảm khi được tiêm chiết xuất từ Linh chi. Điều đó đã được báo cáo rằng bệnh nhân cao huyết áp liên quan đến angiotensin-I-converting enzyme bị ức chế bởi acid ganoderic (B, D, F, H), ganoderal A trong nấm Linh chi. 28
  43. Đồ án tốt nghiệp 1.3.5. Tăng cường hệ miễn dịch Những tác nhân giúp làm tăng khả năng hoạt động của hệ miễn dịch cũng có tác dụng tăng cường sức khoẻ, qua đó giúp ngăn ngừa bệnh tật. Nhiều thành phần trong nấm Linh chi đã được chứng minh có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào lympho, các bạch cầu đơn nhân, các tế bào NK (natural killer cells) (Bao và cộng sự, 2001); Cao và cộng sự, 2002); Zhu và cộng sự, 2007; Ma và cộng sự, 2008). Trong một nghiên cứu của Chang và cộng sự (2009) được tiến hành trên chuột BALB/c cho thấy dịch chiết nấm Linh chi chứa nhiều polysaccharide có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào spleno và hoạt tính của các đại thực bào và các tế bào NK. Trong một nghiên cứu khác của Wang và cộng sự (1997), polysaccharide có trong nấm Linh chi có tác dụng làm tăng khả năng hoạt động của các tế bào lympho T và các đại thực bào, bằng cách làm tăng hàm lượng IL- ip, TNF-a và IL-6. Cũng trong một nghiên cứu khác, quá trình ủ của các đại thực bào và các tế bào lympho T bằng các polysaccharide đã cho thấy hàm lượng TNF- a và INF- Y tăng lên (Zhang và cộng sự, 1999). 1.4. Phương pháp phá vỡ và trích ly hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi Trong các nghiên cứu gần đây, bào tử của nấm Linh chi chứa một số hoạt chất sinh học phong phú hơn nhiều so với trong thể quả của chúng (Chaiyavat Chaiyasut và cộng sự, 2010), thành phần hoạt tính bào gồm polysaccharides, triterpenoids, amino acids, proteins, alkaloids và các nguyên tố vi lượng, Tuy nhiên, với bào tử của nấm Linh chi được cấu tạo phức tạp với 2 lớp vách rất cứng và bền vững, hai lớp vách này có thành phần gồm silica (19,01%), canxi (19,01%) và chitin (52,08 - 57,64%) (Ma Jingjing và cộng sự, 2007), do đó việc trích ly các chất có hoạt tính sinh học từ bào tử Ganoderma rất khó khăn. Trong đồ án này, nhóm thực hiện đề tài đã thực hiện phá vỡ bằng phương pháp tiền xử lý lạnh đông bào tử nấm Linh chi kết hợp sử dụng enzyme dịch nuôi cấy từ nấm Trichoderma harzianum T2 là nấm mốc kí sinh trên nấm Linh chi cùng với chế phẩm enzyme Cellulase C20032 của Novozyme cuối cùng là sử dụng sóng siêu âm để phá 29
  44. Đồ án tốt nghiệp vách bào tử nấm Linh chi, để thu được các chất tiếp tục thực hiện trích ly bằng diethyl ether và ethanol. 1.4.1. Enzyme chitinase Chitin là polysaccharide có nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia trong hầu hết cấu trúc polymer ở nấm và côn trùng, có công thức hóa học [C8H13NO5]n Hình 1.11. Cấu trúc chitin Chitin có cấu tạo và chức năng gần giống với cellulose, trong tự nhiên chitin là chất hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng, chitin thay thế một phần hay toàn bộ cellulose trong thành tế bào của một số loài thực vật. Chitin là chất rắn vô định hình, không tan trong nước và hầu hết các acid, cồn, dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc) hoặc bằng enzyme vi sinh vật. Chitinase là enzyme thủy giải chitin, chitinase xúc tác cắt liên kết C1 và C4 của 2 đơn vị β – 1,4 – N – acetyl glucosamine (GlcNac). Hệ enzyme chitinase được phân làm 3 lớp (Sahai và Manocha, 1993): - Chitobiosidase: enzyme này giải phóng đơn vị diacetyl chitobiose - Endochitinase: phân cắt liên kết bên trong cấu trúc chitin ở vị trí bất kì, phóng thích các loại đường đa như chitotetraose, chitotriose, diacetyl chitobiose. Endochitinase có vai trò quan trọng trong quá trình ký sinh nấm. - β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase phân cắt chitotetraose, chitotriose, diacetylchitobiose thành GlcNac monomer. 30
  45. Đồ án tốt nghiệp Glucosamin là sản phẩm phân giải cuối cùng, glucosamine là một đường khử có nhóm amin tự do nên vừa có đặc tính của hexo monosaccharide vừa mang đặc tính của nhóm amino. Hình 1.12. Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase Người ta đã tinh chế được rất nhiều chitinase, trong đó phổ biến nhất là endochitinase có kích thước 42 kDa, sau đó là N – acetyl – β – D – glucosaminidase có kích thước 70 – 73 kDa. Ngoài ra còn có endochitinase 37 kDa và 33 kDa (Cruz và cộng sự, 1992), chitobiosidase 40 kDa, enzyme này có thể hoạt động một mình hoặc kết hợp với enzyme endochitinase 42 kDa (Harman và cộng sự, 1993), exochitinase 28 kDa (Deane và cộng sự, 1998) và β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase 102 kDa có vai trò duy nhất trong việc gây biểu hiện các enzyme thủy phân chitin khác nhưng chưa tinh chế được (Harman và cộng sự, 1995). Chitinase ở Trichoderma spp. được xem là enzyme có hoạt tính thủy phân mạnh, hoạt động thủy phân của chitinase cũng kết hợp với các enzyme khác như β – glucanase, sự phối hợp giữa hai enzyme này làm tăng hiệu quả hoạt động thủy phân. Mặt khác, theo báo cáo của Lorito (1994) cho biết, có sự phối hợp tác động lên màng tế bào giữa enzyme thủy phân chitin với các hợp chất tự nhiên cũng như chất tổng hợp. Cơ chế phân hủy chitin trong vách bào tử nấm Linh chi 31
  46. Đồ án tốt nghiệp Theo nghiên cứu của Ma Jingjing và cộng sự từ trường Đại học Vũ Hán, Trung Quốc (2007) về phương pháp nghiên cứu phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng máy nghiền ly tâm tốc độ cao đã báo cáo rằng thành phần vách bào tử nấm Linh chi có 19,01% Si; 19,01% Ca; 52,08% - 57,64% là chitin. Cấu trúc phức tạp của vách bào tử nấm Linh chi nhờ sự liên kết của cellulose với các thành phần trên tạo ra vách bền vững giúp cho bào tử nấm Linh chi chống chịu được tác nhân axit và kiềm. Việc phân hủy chitin đóng vai trò rất quan trọng trong việc phá vách bào tử nấm Linh chi. Chitin có công thức hóa học (C8H13NO5)n trong đó C chiếm 47,29%, H chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37%. Về cấu trúc, chitin là một polysaccharide bao gồm các gốc N-acetyl-D- glucosamine [GlcNAc, còn gọi là (1 → 4) – 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D – glucose] gắn với nhau bằng liên kết β – 1,4 – O – glycoside. Quá trình phân hủy chitin được gọi là chitinoclastic. Nếu quá trình phân hủy này bao gồm cả sự thủy phân liên kết (1 → 4) – β – glycoside giống như trong quá trình xúc tác chitinase phân hủy chitin thì quá trình này được gọi là chitinolytic. Ngoài ra, chitin có thể được deacetyl hóa thành chitosan hoặc thậm chí các dạng cellulose nếu nó tiếp tục được deamin hóa (ZoBell và Rittenberg, 1938; Campbell và Williams, 1951). Chính vì vậy phải có sự kết hợp giữa enzyme chitinase và cellulose trong quá trình phá vách bào tử nấm Linh chi. 32
  47. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.13. Quá trình phân hủy chitin thành chitosan và cellulose. GH: họ glycosid hydrolase; GlcNAc: N – acetylglucosamine; GlcN: glucosamine; Glc: glucose. 1.4.2. Giới thiệu về siêu âm phá tế bào 1.4.2.1. Khái niệm Siêu âm (ultrasound) là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phần tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (16- 20kHz). Ngoài ra, sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc (longitudinal wave) hay sóng nén (compression wave), nghĩa là trong trường siêu âm các phần tử dao động theo phương cùng với phương truyền của sóng. Con người có thể nghe được sóng âm có tần số từ 16 Hz đến 18 kHz. Sóng siêu âm là tên gọi của những sóng có tần số cao hơn 18 kHz. Giới hạn trên của tần số sóng siêu âm thường là 5 MHz đối với chất khí và 500 MHz đối với chất lỏng hay chất rắn. Trong phạm vi ứng dụng, sóng siêu âm được chia ra thành sóng siêu âm tần số thấp, năng lượng cao (20kHz-100kHz) và sóng siêu âm tần số cao, biên độ nhỏ (2MHz-10MHz) (Kuldiloke J., 2002). 33
  48. Đồ án tốt nghiệp Các thông số của quá trình siêu âm: - Tần số (Frequency, Hz): là số dao động phần tử thực hiện được trong 1 giây, (Hz). - Biên độ (Amplitude): biểu thị mức độ thay đổi áp suất (so với áp suất cân bằng của môi trường) trong quá trình dao động. - Cường độ (Intensity, W/m2): là năng lượng mà sóng siêu âm truyền trong một đơn vị thời gian qua một đơn vị diện tích đặt vuông góc với phương truyền âm. Công thức tính I = P/S; trong đó P là công suất của nguồn âm (W), S là diện tích miền truyền âm (m2). 1.4.2.2. Bản chất của sóng âm Các môi trường chất đàn hồi (khí, lỏng hay rắn) có thể coi như những môi trường liên tục gồm những phần tử liên kết chặt chẽ với nhau. Lúc bình thường, mỗi phần tử có một vị trí cân bằng bền. Nếu tác động một lực lên phần tử A nào đó trong môi trường này, nó sẽ rời khỏi vị trí cân bằng bền. Do tương tác tạo nên bởi các mối liên kết với các phần tử bên cạnh, một mặt phần tử A bị kéo về vị trí cân bằng, một mặt nó cũng chịu tác dụng bởi các lực tác động nên phần tử A sẽ di chuyển qua – lại vị trí cân bằng, có nghĩa là phần tử A thực hiện chuyển động dưới dạng dao động. Hiện tượng này tiếp tục xảy ra đối với các phần tử khác của môi trường. Dạng dao động cơ, có tính chất lặp đi lặp lại, lan truyền trong môi trường đàn hồi được gọi là sóng đàn hồi hay sóng cơ. Nói một cách khác, sóng là một hiện tượng vật lý trong đó năng lượng được dẫn truyền dưới dạng dao động của các phần tử vật chất của môi trường truyền sóng. Về bản chất, sóng âm là sóng cơ học, do đó nó tuân theo mọi quy luật đối với sóng cơ, có thể tạo ra sóng âm bằng cách tác động một lực cơ. 1.4.2.3. Nguyên lý tác động của sóng siêu âm Hiện tượng xâm thực khí Khi sóng siêu âm được truyền vào môi trường chất lỏng, các chu trình kéo và nén liên tiếp được tạo thành. Trong điều kiện bình thường, các phân tử chất lỏng ở rất gần nhau nhờ liên kết hóa học. Khi có sóng siêu âm, trong chu trình nén các phân tử ở gần nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa. Áp lực âm trong chu trình kéo đủ 34
  49. Đồ án tốt nghiệp mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử và tạo thành những bọt khí nhỏ. Bọt khí trở thành hạt nhân của hiện tượng xâm thực khí, bao gồm bọt khí ổn định và bọt khí tạm thời (Kuldiloke J., 2002). Bọt khí ổn định là nguồn gốc của những bong bóng khí nhỏ, kích thước của chúng dao động nhẹ trong các chu trình kéo và nén. Sau hàng ngàn chu trình, chúng tăng thêm về kích thước. Trong suốt quá trình dao động, bọt khí ổn định có thể chuyển thành bọt khí tạm thời. Sóng siêu âm làm rung động những bọt khí này, tạo nên hiện tượng “sốc sóng“ và hình thành dòng nhiệt bên trong chất lỏng. Bọt khí ổn định có thể lôi kéo những bọt khí khác vào trong trường sóng, kết hợp lại với nhau và tạo thành dòng nhiệt nhỏ (Kuldiloke J., 2002). Các bọt khí tạm thời có kích cỡ thay đổi rất nhanh chóng, chỉ qua vài chu trình chúng bị vỡ ra. Trong suốt chu trình kéo/nén, bọt khí kéo giãn và kết hợp lại cho đến khi đạt được cân bằng hơi nước ở bên trong và bên ngoài bọt khí. Diện tích bề mặt bọt khí trong chu trình kéo lớn hơn trong chu trình nén, vì vậy sự khuyếch tán khí trong chu trình kéo lớn hơn và kích cỡ bọt khí cũng tăng lên trong mỗi chu trình. Các bọt khí lớn dần đến một kích cỡ nhất định mà tại đó năng lượng của sóng siêu âm không đủ để duy trì pha khí khiến các bọt khí nổ tung dữ dội. Khi đó các phân tử va chạm với nhau mãnh liệt tạo nên hiện tượng “sốc sóng“ trong lòng chất lỏng, kết quả là hình thành những điểm có nhiệt độ và áp suất rất cao (50000C và 5x104kPa) với vận tốc rất nhanh 106℃/s (Kuldiloke J., 2002). 35
  50. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.14. Quá trình hình thành, phát triển và vỡ của bọt khí Hiện tượng xâm thực khí mở đầu cho rất nhiều phản ứng do có sự hình thành các ion tự do trong dung dịch; thúc đẩy các phản ứng hóa học nhờ có sự trộn lẫn các chất phản ứng với nhau; tăng cường phản ứng polymer hoá và depolymer hóa bằng cách phân tán tạm thời các phần tử hay bẻ gãy hoàn toàn các liên kết hóa học trong chuỗi polymer; tăng hiệu suất đồng hoá; hỗ trợ trích ly các chất tan như enzyme từ tế bào động vật, thực vật, nấm men hay vi khuẩn; tách virus ra khỏi tế bào bị nhiễm; loại bỏ các phần tử nhạy cảm bao gồm cả vi sinh vật (Kuldiloke J., 2002). Hiện tượng vi xoáy Sóng siêu âm cường độ cao truyền vào trong lòng chất lỏng sẽ gây nên sự kích thích mãnh liệt. Tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha lỏng/rắn hay khí/rắn, sóng siêu âm gây nên sự hỗn loạn cực độ do tạo thành những vi xoáy. Hiện tượng này làm giảm ranh giới giữa các pha, tăng cường sự truyền khối đối lưu và thúc đẩy xảy ra sự khuyếch tán ở một vài trường hợp mà khuấy trộn thông thường không đạt được (Kuldiloke J., 2002). 1.4.2.4. Tác động của sóng siêu âm lên tế bào Sóng siêu âm có tần số từ 20KHz đến 1MHz sẽ tạo ra xen kẽ các sóng có áp suất cao và áp suất thấp trong chất lỏng mà nó truyền qua. Trong suốt chu kỳ áp suất thấp, sóng siêu âm tạo ra các bong bóng chân không nhỏ trong chất lỏng và sau đó bị phá vỡ hoàn toàn trong chu kỳ áp suất cao. Hiện tượng này được gọi là cavitation. Sự nổ của các bong bóng trong cavitation gây ra lực cắt thủy động lực rất mạnh và lực này sẽ tác động lên màng tế bào và nếu đủ mạnh sẽ gây vỡ tế bào. Dãy sóng âm có tần số từ 20KHz đến 1MHz tạo ra hiện tường cavitation nhưng sóng âm có tần số ở vùng gần 20KHz tạo cavitation hiệu quả hơn. Theo Jian Bing và cộng sự (2006), hiện tượng sủi bọt do sóng siêu âm gây ra tạo nên lực cắt xén cao làm tăng tốc độ truyền khối của chất chiết. Ngoài ra sự vỡ bọt cũng tạo nên sự khuấy trộn mạnh giúp cho sự khuếch tán chất chiết từ bên trong tế bào thoát ra bên ngoài dễ dàng hơn. 1.4.2.5. Ứng dụng của sóng siêu âm Siêu âm là một lĩnh vực đang được nghiên cứu và có tiềm năng phát triển trong ngành công nghệ thực phẩm. Sóng siêu âm có tần số từ 20kHz đến trên 25MHz thường 36
  51. Đồ án tốt nghiệp được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Có 2 lĩnh vực được ứng dụng chính trong công nghiệp thực phẩm: Siêu âm tần số cao và năng lượng thấp: còn được gọi là siêu âm chuẩn đoán, trong khoảng tần số 20 – 60 MHz. Phần này được sử dụng như một kỹ thuật phân tích, không làm phá hủy cấu trúc của mẫu, điều này được ứng dụng để xác định tính chất thực phẩm, đo tốc độ dòng chảy, kiểm tra bao gói thực phẩm (Floros J. D., 1994). Tần số thấp và siêu âm năng lượng cao (2 MHz – 10 MHz): được ứng dụng rộng rãi như một quá trình hỗ trợ trong hàng loạt các lĩnh vực như: kết tinh, sấy, bài khí, trích ly, lọc, đồng hoá, làm mềm thịt, quá trình oxi hoá, quá trình tiệt trùng (Floros J. D.,1994). 1.4.2.6. Thiết bị phát sóng siêu âm Hình 1.15. Thiết bị phát sóng siêu âm dạng thanh Thiết bị phát sóng siêu âm phải gồm có 3 phần tối cần thiết sau: - Bộ phận chuyển phần lớn điện năng thành dòng điện xoay chiều tần số cao để vận hành bộ phận biến đổi. - Bộ phận biến đổi chuyển dòng điện xoay chiều tần số cao thành những dao động. Phần lớn thiết bị phát sóng siêu âm ngày nay sử dụng kỹ thuật áp điện. Hình dạng và kích thước của bộ phận này phụ thuộc vào tần số làm việc, bộ phận 20 kHz có chiều dài gấp đôi bộ phận 40 kHz. Năng lượng qua bộ biến đổi sẽ chuyển ngược lại thành bình phương tần số dao động, vì vậy thiết bị năng lượng cao tần số thấp được chú 37
  52. Đồ án tốt nghiệp trọng. Bộ phận biến đổi nối với hệ thống truyền sóng thông qua một thiết bị phụ (Povey M.I.W. và Mason T.J, 1998). - Hệ thống truyền sóng sẽ truyền những dao động vào trong lòng chất lỏng. Trong thiết bị phát sóng siêu âm dạng bể, bộ phận biến đổi được gắn ở đáy bể và truyền trực tiếp dao động vào chất lỏng trong bồn. Tuy nhiên, đối với thiết bị năng lượng cao (thiết bị dạng thanh/que) dao động được khuyếch đại và truyền vào môi trường lỏng nhờ thiết bị trung gian gắn với bộ phận biến đổi. Theo thời gian, đầu của bộ phận trung gian này có thể bị mòn và bị giảm chiều dài cần thiết vì vậy người ta phải lắp đầu có thể tháo gỡ được( Povey M.I.W. và Mason T.J, 1998). Hình 1.16. Máy phá mẫu, tế bào bằng sóng siêu âm Qsonica Q500 1.4.3. Các phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi Hiên nay trong và ngoài nước đã có khá nhiều phương pháp phá vỡ vách bào tử Ganoderma lucidum bằng vật lý, hóa học, phương tiện cơ học và enzyme sinh học. Sử dụng enzyme sinh học có thể lấy được tối đa các hoạt chất có trong bào tử, giúp cơ thể người dễ hấp thu hơn, nhưng sau thời gian dài của quá trình lên men thì phải có sự kết thúc quá trình này bằng cách tách chất rắn và sấy khô để thu được bào tử bị phá vỡ, quá trình này phức tạp dễ gây nhiễm tạp chất gây phá hủy hoạt chất sinh học trong bào tử. Xử lý bằng phương pháp vật lý phức tạp, sản phẩm dễ bị nhiễm tạp chất, chi phí đầu tư thiết bị cao. Xử lý bằng phương pháp hóa học không đạt yêu cầu, dễ dàng phá hủy hoạt 38
  53. Đồ án tốt nghiệp tính sinh học trong bào tử Ganoderma lucidum, khó loại bỏ các dư lượng chất có hại. Các phương tiện cơ học bao gồm cắt, mài, phun nghiền, nghiền không khí, microstream, Thiết bị nghiền siêu mịn bao gồm máy nghiền bi, máy nghiền không khí tốc độ cao, xilanh, máy phun. Mặc dù phương tiện cơ học là một cách đơn giản và dễ dàng để đạt được tỷ lệ phá vỡ cao và thực tế cho sản xuất công nghiệp quy mô lớn, dầu bào tử nấm Linh chi có khả năng giảm hoạt tính do quá trình oxy hóa trong các phương pháp tác động cơ học. Hơn nữa, chi phí hoạt động cao vì các thiết bị cơ khí đắt tiền. Sự phá vỡ của vách bào tử tạo điều kiện khai thác sinh khối bằng cách các hoạt chất tiếp xúc nhiều hơn với dung môi chiết. Điều này đã được chứng minh bằng việc tăng năng suất của dịch chiết polysaccharide lên 40,08% và quan sát thấy tác dụng sinh học cao hơn sau khi bào tử bị phá vỡ (Ma và cộng sự, 2007). Hàm lượng carbohydrate trong bào tử bị vỡ (1,57% ± 0,06%) cao hơn trong chiết xuất bào tử còn nguyên (0,41% ± 0,01%) (Yue và cộng sự, 2008). Hàm lượng của polysaccharides từ 0,94% bào tử còn nguyên thấp hơn so với bào tử bị vỡ là 2,98% (Fu và cộng sự, 2009). Do đó tìm một phương pháp đơn giản, hiệu quả để tăng tỷ lệ phá vỡ bào tử Ganoderma lucidum, chi phí thấp và không làm giảm hoạt tính sinh học của các chất có trong bào tử Ganoderma lucidum rất quan trọng. Một số nghiên cứu quan trọng được trình bày ở bảng dưới đây ( Bảng 1.5). Bảng 1.5. Những nghiên cứu về phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi trên Thế Giới Patent/ Nghiên cứu Tác giả Phương pháp phá vỡ bào tử Tỉ lệ phá vỡ JP52041208 Xin Liu, Xiao Ni Cơ học (nghiền vụn) 99,6% Huang và cộng sự JP52041208 Xin Liu, Xiao Ni Xử lý enzyme 99,9% Huang và cộng sự CN1134306A Xing Xiaohe, Zhu Ngâm nước, sấy khô và sử 85% Shujun và cộng sự lý nhiệt vi sóng (1995) 39
  54. Đồ án tốt nghiệp CN101596220A Zhao Hui (2009) Xử lý bằng enzyme từ dịch Không nuôi cấy vi khuẩn nêu rõ African Journal of Chaiyavat Len men với Lactobacillus Không Biotechnology Chaiyasut, plantarum nêu rõ Chakkrapong Kruatama và Sasithom Sirilun (2010) CN1165032A Du Yuguang, Bai Tiền xử lý lạnh đông, xử lý >80% Xuefang (1996) bằng enzyme và sóng siêu âm US20110244556A1 Wang Cunxue và Ngâm nước, xử lý enzyme 95% cộng sự (2002) 1,5%, sấy khô, nghiền US20110244556A1 Xia Zhilan và cộng Sóng siêu âm trong 5 phút 40% sự (2005) US20110244556A1 Xia Zhilan và cộng Sóng siêu âm, xử lý enzyme 98% sự (2005) CN00130883 Liu X. và cộng sự Ngâm nước/ biotin, xử lý 99,9% (2000) enzyme, nghiền CN1114446C Liu X. và cộng sự CO2 siêu tới hạn ở áp suất 5 99,7 – (2000) MPa-60 MPa, nhiệt độ từ 99,9% 320C - 850C Chen Pharm Bull Bao X.F. và cộng Siêm âm 60 - 80% sự (2002) J Food Sci Zhao D. và cộng sự (2014) CN1099455C Liu X. và cộng sự Xử lý bằng enzyme 99,3 – (2000) Chitinase, enzyme được bổ 99,8% sung 0,002 đến 2% khối 40
  55. Đồ án tốt nghiệp lượng bào tử Ganoderma lucidum để thủy phân cellulase 10 phút – 3 giờ, ly tâm hoặc siêu lọc. CN105125595A Jinghua Luo và Lưới lọc, ngâm nước, sóng 99,3 – cộng sự (2015) siêu âm 99,8% Can Tho University Nguyen Minh Lên men với Lactobacillus 52,38% Journal of Science Thuy và Nguyen plantarum Thi My Tuyen (2015) 1.4.4. Phương pháp trích ly hoạt chất thu dầu bào tử Dầu bào tử Ganoderma lucidum chiết xuất phương tiện cơ học có hoạt tính sinh học thấp, có chất lượng kém do một phần hoạt tính sinh học bị mất trong quá trình cơ học. Một loạt các dung môi được sử dụng để trích xuất hoạt chất sinh học từ bào tử bị phá vỡ như: methanol và chloroform thường được sử dụng để trích xuất triterpenes, nước để trích xuất polysaccharides, dichloromethane cho chất béo, và ethanol cho chất béo và polysaccharides. Nghiên cứu về phương pháp chiết xuất lipid của Ganoderma lucidum thường sử dụng các dung môi hữu cơ như hexane, benzen, ethylene dichloride, dichloroethylene, nước sôi, ethanol, với các thiết bị lọc thông thường để chiết xuất. Lipid trong bào tử Ganoderma lucidum thu được sau quá trình chiết xuất, dung môi hữu cơ có thể tái sử dụng. Một số phương pháp trích ly được trình bày ở bảng dưới đây (bảng 1.6). Bảng 1.6: Các phương pháp trích ly Hoạt chất sinh Phương pháp Tài liệu học Literatan loại Sắc kí cột của chiết xuất methanol của Min và cộng sự, triterpene bào tử bị phá vỡ. Chem Pharm Bull (1998) 41
  56. Đồ án tốt nghiệp Chiết xuất lipid Ngâm trong dung môi hữu cơ: hexane, Liu X. và cộng benzen, ethylene dichloride, sự, CN1099455C dichloroethylene, nước sôi, ethanol, ở (2000) nhiệt độ 25 - 1000C (nhiệt độ lọc thông thường là 550C), thời gian 5 - 150 phút (thường là 60 - 90 phút). Ganodermasides A Các bào tử khô đã được chiết xuất bằng Weng Y. và cộng và B methanol, được phân tách bằng cách lọc sự, Bioorg Med và cô đặc. Chem (2010) Chiết xuất thô Các bào tử ngâm trong ethanol tuyệt đối Liu X. và cộng bằng ethanol trong 10 giờ ở 300C trên máy lắc và cô sự, Cancer Lett quay chân không. (2002) Các bào tử được hòa tan trong ethanol, Fukuzawa M. và lắc trong 24 giờ, sau đó ly tâm. Năng cộng sự, Bio suất của chiết xuất bào tử là 10% của Pharm Bull trọng lượng ban đầu. (2008) Bột bào tử ngâm bằng ethanol tuyệt đối Chan W.K. và trong 3 ngày, sau khi ly tâm được tái cộng sự, J Altern chiết thêm 3 ngày nữa. Complement Med (2005) Acid béo C19 Khai thác trong ethanol ở nhiệt độ phòng Gao P. và cộng trong 40 giờ. Chiết xuất được lọc, cô sự, Fitoterapia quay và chia thành 5 phần theo sự khác (2012) biệt trong độ hòa tan trong etanol và CHCl3. Polysaccharide Định lượng bằng ethanol 95%, cặn được Bao X.F. và cộng ủ trong nước sôi. Chiết xuất được khử sự, Chem Pharm với acid tricloaxetic. Bull (2002) Sau khi xử lý bằng etanol để loại bỏ chất Ma C. và cộng 42
  57. Đồ án tốt nghiệp béo, các bào tử khô được chiết xuất bằng sự, nước sôi, và dịch chiết nước được cô đặc Phytomedicine và được thẩm tách. (2008) Các bào tử được hòa tan trong nước và Dong Q. và cộng khuấy ở 40C trong 12 giờ. sự, Carbohydr Sau khi được ly tâm trong 30 phút, phần Res (2012), Guo nổi phía trên được cô đặc và kết tủa với L. và cộng sự, nước không chứa ethanol. Immunopharmcol (2009) Chiết xuất thô Các bào tử Ganoderma lucidum được Hsu P.Y. và cộng bằng nước chiết xuất với nước ở nhiệt độ phòng và sự, Chang Gung sau đó ở 700C Med J (2012) Nước sôi với nồng độ 50 mg/mL. Chiết Sliva D. và cộng xuất được bảo quản ở 40C và trước mỗi sự, Biochem lần thử nghiệm chiết xuất được đun nóng Biophys Res đến 700C trong 10 phút Commun (2002) Chiết xuất Lipid Trích xuất với CH2Cl2 trong 2 giờ. Lọc Liu X. và cộng thô bằng CH2Cl 2 và phần còn lại được chiết xuất hai sự, Anal Bioanal (dichloromethane) lần. Dung môi được loại bỏ bằng thiết bị Chem (2007) cô quay ở 300C. Ergosterol, sterols, Các chất béo trong bào tử được chiết xuất Chen T.Q. và lipids bằng cách sử dụng CO2 siêu tới hạn. cộng sự, Chem Ethanol được thêm vào để tăng hiệu năng Nat Compd chiết xuất. (2012) Weng Y. và cộng sự, Bioorg Med Chem (2010) Yuan J.P. và 43
  58. Đồ án tốt nghiệp cộng sự, J Agric Food Chem. (2006) Polysaccharide Sau khi nghiền trong 5 - 30 phút, thêm Zhu X. và cộng vào một lượng nước thích hợp (10 - 30 sự, Int J Food ml/g) ở nhiệt độ 50 - 900C trong một thời Technol (2012) gian 30 - 150 phút. Sau đó hỗn hợp được ly tâm (4200 vòng/ 10 phút) và phần nổi phía trên được cô đặc. Triterpenes bằng Chiết xuất 3 lần bằng CHCl3, ủ trong bể Gao J.J. và cộng 0 CHCl3 nước 100 C, 3 giờ. Sau khi lọc, cô quay sự, Chem Pharm (chloroform) chân không. Bull (2004) Chiết xuất lipid Chiết xuất chất lỏng CO2 siêu tới hạn Liu X. và cộng (SCF – CO2) ở nhiệt độ khoảng 320C – sự, 450C. US6440420B1 (2001) Bảng 1.7. Các dung môi trong chiết xuất lipid của bào tử Ganoderma lucidum (CN1099455C) Khối lượng thu được STT Dung môi Phương pháp (kg)/ 100 kg bào tử Ganoderma Chiết suất lỏng-lỏng, nhiệt độ 1 Hexan 35,8 kg lọc 550C, thời gian lọc 60 phút Đặt trong bể ủ ở 520C, thời 2 Hexan 36 kg gian 80 phút Đặt trong bể ủ ở 600C, thời 3 Hexan 27 kg gian 70 phút 44
  59. Đồ án tốt nghiệp Nhiệt độ lọc 700C, thời gian lọc 4 Hexan 9,2 kg 50 phút Chiết xuất thẩm thấu trong máy 5 Light gasoline chiết, nhiệt độ ở 500C, thời gian 37 kg 90 phút nhiệt độ lọc 750C, thời gian lọc 6 Dichloroethane 7,5 kg 20 phút Nhiệt độ lọc 350C, thời gian lọc 7 Ethanol 7,4 kg 50 phút 45
  60. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu - Bào tử nấm Linh chi được thu thập từ trại nấm Bảy Yết, huyện Hóc Môn, Thành phố Hồ Chí Minh được cung cấp bởi ông Phan Văn Yết. Rây bào tử để loại bỏ một số tạp chất. Bảo quản trong điều kiện khô ráo. - Giống nấm Trichoderma harzianum T2 được phân lập từ nấm Linh chi trong đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh Hiếu (10DSH), nhận từ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở A, 475A Điện Biên Phủ, phường 25, quận Bình Thạnh, Thành phố Hồ Chí Minh. - Enzyme thương mại Cellulase C20032 được cung cấp bởi công ty TNHH Khoa học và Công nghệ Sài Gòn. - Trứng bào xác Artemia nauplii được cung cấp tại trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. - Viên nang Linh chi OPC, sản xuất tại công ty Cổ phần Dược Phẩm OPC, 1017 Hồng Bàng, phường 12, quận 6, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Nơi thực hiện Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở E, Lô E1, Khu công nghệ cao, Xa lộ Hà Nội, Phường Hiệp Phú, Quận 9, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.3. Thời gian thực hiện Từ 06/11/2017 đến 20/07/2018 2.1.4. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất 2.1.4.1. Thiết bị - Nồi hấp tiệt trùng Hyrayama - Tủ cấy vi sinh cấp 1 - Bể điều nhiệt Memmert - Bếp từ Heidolph 46
  61. Đồ án tốt nghiệp - Cân điện tử Vibra - Cân phân tích - Kính hiển vi quang học - Máy đo quang phổ khả kiến SP - 300 - Máy lắc ngang - Máy vortex Heidolph - Máy ly tâm Universial 320 - Máy siêu âm Qsonica Q500 - Máy nước cất - Tủ sấy Memmert - Đức - Tủ ủ Memmert - Tủ lạnh Toshiba 2.1.4.2. Dụng cụ - Erlen 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml, 2000 ml - Cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml - Bao nylon hấp, giấy báo, dây thun - Bông thấm nước, bông không thấm nước - Đĩa petri - Đũa thủy tinh - Kẹp - Dao cấy - Phễu thủy tinh - Micropipette 100 µl, 1000 µl – đầu tuýp tương ứng - Ống đong 50 ml, 100 ml, 500 ml - Eppendorf 1,5 ml, 2 ml - Ống ly tâm 50 ml - Ống nghiệm - Pipette thủy tinh 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 25 ml - Thanh khuấy từ 47
  62. Đồ án tốt nghiệp - Buồng đếm hồng cầu Neubauer 2.1.4.3. Hóa chất - Môi trường nuôi cấy a. Hóa chất - Tween 80 - C4H4KNaO6 - HCl đậm đặc - H2SO4 đậm đặc - HCl 1% - HCl 0,1 N - NH4OH đậm đặc - NaOH 0,1 N - CH3COOH - Na2CO3 tinh thể - Anhydrid acetic D-glucose - α-naphthol - NaOH 10% - CuSO4 3% - Ethanol 960 - Diethyl ether - Petroleum ether - Hexane - Phenol - Phenolphtalein - 1,1 - Diphenyl - 2 - picryl - hydrazyl (DPPH) - 6 – Hydroxy – 2, 5, 7, 8 - tetramethychroman - 2 - carboxylic (Trolox) - Acid ascorbic - Đệm natri acetate 0,05 M - Thuốc thử Lugol + Iodine 1 g 48
  63. Đồ án tốt nghiệp + KI 2 g + Nước cất 300 ml Hòa tan rồi giữ trong lọ tối màu - Dung dịch Sodium carboxymethyl cellulose (CMC) 1% w/v CMC: cân chính xác 10 g CMC, hòa tan trong đệm natri acetate 0,05 M. - Dung dịch acid - 2 - hydroxyl - 3,5 - dinitrobenzoic (DNS): cân 20 g DNS cho vào cốc 2000 ml, thêm khoảng 800 ml nước cất. Đặt cốc vào chậu nước 800C khuấy đều; hòa tan 32 g NaOH với 300 ml nước cất, thêm dung dịch NaOH này từ từ vào 0 dung dịch DNS, khuấy nhiệt ở 80 C. Tiếp tục thêm 600 g C4H4KNaO6 vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy. Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung dịch vào bình định mức 2000 ml, thêm nước cất đến vạch lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai tối màu. - Dung dịch lactose: hòa tan 0,12 g lactose monohydrate với 80 ml nước cất, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch lắc đều. - Dung dịch DNS – lactose: trộn đều 150 ml DNS với 50 ml dung dịch lactose. - Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2 M: hòa tan 27,8 g NaH2PO4 và định mức đến 1000 ml bằng nước cất. - Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2 M: hòa tan 53,05 g NaHPO4.7H2O và định mức đến 1000 ml bằng nước cất. - Dung dịch acid acetic 0,2 M: hòa tan 11,55 ml CH3COOH đậm đặc và định mức đến 1000 ml bằng nước cất. - Dung dịch natri acetate 0,2 M: hòa tan 16,4 g CH3COONa và định mức đến 1000 ml bằng nước cất. - Dung dịch đệm pH 7: hút 39,0 ml dung dịch mononatri orthophosphate 0,2 M trộn với 61,0 ml dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2 M rồi định mức đến 200 ml bằng nước cất. - Dung dịch đệm pH 5: hút 14,8 ml dung dịch acid acetic 0,2 M trộn với 35,2 ml dung dịch natri acetate 0,2 M rồi định mức đến 100 ml bằng nước cất. 49
  64. Đồ án tốt nghiệp - Huyền phù chitin từ bột chitin thương mại: cân 10 g bột chitin hòa tan với 1000 ml nước cất để được huyền phù chitin 1%. - Pha stock DPPH 1M: cân 0,3943 g DPPH hòa tan trong 1 ml methanol, để trong tối 2 giờ (bọc giấy bạc). - Pha stock Trolox 1 mg/ml: cân 1 mg Trolox hòa tan vào 1 ml Methanol, để trong tối. b. Môi trường nuôi cấy - Môi trường PDA (g/L) D-glucose 5 g Agar 5 g Dịch chiết khoai tây 250 ml Cloramphenicol 0,025 g pH 6 - 7 Chuẩn bị dịch chiết khoai tây: cân 200 g khoai tây được cắt hạt lựu, cho vào cốc 2000 ml, đong nước cất tới 1000 ml rồi đun sôi hỗn hợp trên bếp từ. Đun sôi khoảng 10 phút rồi đem lọc lấy dịch trong. - Môi trường hoạt hóa Trichoderma harzianum Nấm Linh chi nghiền 20 g Nước cất 30 ml Độ ẩm 60% - Môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma harzianum Nấm Linh chi nghiền 40 g Malt 10 g Dung dịch khoáng 20 ml Cao nấm men 1 g Chitin 0,5 g Nước bổ sung 80 ml Độ ẩm 70%, pH 5 - Pha dung dịch khoáng 50
  65. Đồ án tốt nghiệp NH4NO3 0,5 g KH2PO4 0,2 g NaCl 0,1 g MgSO4.7H2O 0,1 g Hòa tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml - Môi trường chitin – agar 1% Chitin thương mại 2,5 g Agar 5 g Bổ sung nước cất đến 250 ml Hấp tiệt trùng ở 1210C/15 phút, để nguội đến khoảng 500C tiến hành đổ đĩa, mỗi đĩa khoảng 20 ml môi trường. 51
  66. Đồ án tốt nghiệp 2.2. Phương pháp nghiên cứu a. Mục tiêu: Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma lucidum kết hợp enzyme và siêu âm. b. Nội dung: - Chọn môi trường lên men thể rắn thu enzyme chitinase từ Trichoderma harzianum T2. - Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm và enzyme lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi. - Khảo sát ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý lên tỉ lệ phá vỡ bào tử. - Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của bào tử nấm Linh chi. c. Phương pháp luận: Nghiên cứu này nhằm hoàn thiện những nghiên cứu trước đó của Phòng thí nghiệm liên quan đến phá vỡ bào tử nấm Linh chi, trả lời những vấn đề còn chưa rõ sau: - Liệu có thể sử dụng bã nấm Linh chi nuôi cấy thể rắn thu enzyme phá vỡ bào tử không? - Có thể thực hiện siêu âm trước phản ứng enzyme để phá vỡ bào tử không? - Siêu âm ảnh hưởng thế nào lên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của bào tử phá vỡ? - Để giải quyết những vấn đề trên, đề tài tiến hành 4 nội dung (xem sơ đồ bố trí thí nghiệm (Hình 2.1)). 52
  67. Đồ án tốt nghiệp Môi trường thể quả Thu enzyme Đo đường kính chitinase bằng vòng phân giải lên men thể rắn chitin Môi trường bã nấm Xử lí enzyme Không siêu âm Ảnh hưởng của siêu Xác định âm và enzyme trong Siêu âm trước tỉ lệ phá phá vỡ bào tử nấm khi ủ enzyme vỡ Linh chi Ủ enzyme trước khi siêu âm -40C -200C Tiền xử lí Xác định Bố trí -700C tỉ lệ phá thí vỡ nghiệm -1960C Định lượng lipid, polysaccharide tổng số Khảo sát ảnh hưởng siêu âm lên thành Khảo sát khả năng phần hóa học và kháng oxy hóa hoạt tính sinh học Thử độc tính trên Artemia nauplii Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 53
  68. Đồ án tốt nghiệp 2.2.1. Thu enzyme chitinase bằng lên men thể rắn Giống gốc Tricoderma harzianum T2 Môi trường thể quả Hoạt hóa (7 ngày, Môi trường bã nấm 320C) Lên men thể rắn, 72 giở, 28 – 300C Nước cất + Tween 80 1% Trích ly (dung môi : cơ chất = 10 : 1) Lắc 150 vòng/ phút * 24 giờ Lọc, ly tâm (4000 vòng/ phút* 15 phút) Thu dịch trích ly Đo đường kính vòng phân giải chitin Hình 2.2. Sơ đồ thu enzyme chitinase bằng môi trường lên men thể rắn 54
  69. Đồ án tốt nghiệp 2.2.1.1. Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 trên môi trường thạch PDA Chuẩn bị môi trường PDA như mục 2.1.4.3 cho vào bình môi trường 250 ml rồi đem hấp khử trùng ở 1210C/ 1 atm/ 15 phút. Hấp xong, để môi trường hạ xuống khoảng 500C rồi tiến hành đổ đĩa. Đợi thạch đông lại, tiến hành cấy điểm Trichoderma harzianum T2 từ ống giống được phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh Hiếu năm 2014 trường Đại học Công nghệ TP. HCM, rồi lật úp đĩa (tránh tụ nước trên bề mặt thạch) đem ủ ở 28 - 320C. Sau 7 ngày nuôi nấm trên môi trường PDA chuyển sang môi trường hoạt hóa Trichoderma harzianum T2. 2.2.1.2. Phương pháp hoạt hóa Trichoderma harzianum T2 Chuẩn bị môi trường hoạt hóa Trichoderma harzianum T2 như mục 2.1.4.3 phối vào erlen 1000 ml rồi đem hấp khử trùng ở 1210C/ 1 atm/ 15 phút. Hấp xong để môi trường hạ xuống nhiệt độ phòng, cắt 1/8 đĩa thạch PDA chứa Trichoderma harzianum T2 đã được nuôi cấy 7 ngày cho vào erlen chứa môi trường hoạt hóa, ủ ở 28 - 320C. Sau 7 ngày nuôi nấm trên môi trường hoạt hóa, tiến hành cấy chuyển sang môi trường tăng sinh khối thu dịch enzyme nuôi cấy. 2.2.1.3. Thu enzyme dịch trích ly bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn Chuẩn bị môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma harzianum T2 như mục 2.1.4.3, phối vào erlen 2000 ml, hấp tiệt trùng ở 1210C/ 1 atm/ 15 phút. Để nguội về nhiệt độ phòng rồi cấy bào tử nấm Trichoderma harzianum T2 đã nuôi cấy 7 ngày trên môi trường hoạt hóa. Giữ bình ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Thực hiện trích ly bằng nước cất lạnh vô trùng có bổ sung Tween 80 1% theo tỉ lệ nước cất/cơ chất là 10 : 1. Đem lắc trên máy lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ rồi lọc bỏ bã. Sau đó đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch tăng sinh loại bỏ cặn còn sót lại. 2.2.1.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy nấm Tricoderma harzianum T2 tối ưu để thu enzyme chitinase Chuẩn bị môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma harzianum T2 như mục 2.1.4.3 nhưng thay thành phần cơ chất là hai loại: thể quả nấm Linh chi nghiền và bã 55
  70. Đồ án tốt nghiệp nấm Linh chi nghiền. Tiến hành tăng sinh và trích ly thu dịch enzyme như mục 2.2.1.3. Tiến hành đục lỗ thạch trên đĩa petri có chứa môi trường huyền phù chitin – agar 1% đã được chuẩn bị như mục 2.1.4.3. Mỗi đĩa môi trường chitin – agar đục bốn lỗ thạch đường kính 5 mm, sau đó dùng micropipette hút 100 µl dịch enzyme trích ly từ hai môi trường tăng sinh rắn vào 3 lỗ thạch đã đục ở mỗi đĩa và một lỗ không nhỏ dịch enzyme làm đối chứng. Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng phân giải của dịch enzyme sau 24 giờ, 48 giờ bằng thuốc thử lugol để xác định vòng phân giải chitin. 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử nấm Linh chi 200 ml 20 gam bào tử nấm Linh chi nước cất Lạnh đông -40C/ 12 giờ Rã đông ở nhiệt độ phòng Ly tâm 4000 vòng/phút * 15 phút Nước Thu bào tử Ủ bào tử trong Siêu âm Ủ bào tử trong hỗn hợp enzyme hỗn hợp enzyme Ủ bào tử trong hỗn hợp Siêu âm enzyme Xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử nấm Linh chi 56
  71. Đồ án tốt nghiệp 2.2.2.1. Phá vách bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp lạnh đông kết hợp sử dụng enzyme thương mại Cellulase (EC) và dịch tăng sinh nấm Trichoderma harzianum T2 (DTL) và siêu âm Quy trình phá vách bào tử bằng lạnh đông bào tử kết hợp chế phẩm enzyme Cellulase và dịch tăng sinh nấm Trichoderma harzianum T2 và siêu âm Phương pháp tiến hành: Cân 20 g bào tử nấm Linh chi vào cốc, thêm 200 ml nước cất vào cốc, để vào trong tủ đá làm lạnh đông bào tử ở - 40C trong 12 giờ. Sau thời gian lạnh đông, bào tử rã đông ở nhiệt độ phòng, khi đá đã tan hết, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút để tách nước, thu bào tử. Chuẩn bị hỗn hợp enzyme: chế phẩm enzyme gốc được pha loãng thu được dung dịch enzyme C20032 10%, dịch trích ly enzyme thu được từ phương pháp tăng sinh rắn nấm Trichoderma harzianum T2. Thu bào tử cho vào cốc 1000 ml bổ sung thêm hỗn hợp 300 ml enzyme C20032 10%, 300 ml dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 và 400 ml đệm acetate pH 5. Đặt cốc trên bếp khuấy từ ở 500C và khuấy liên tục trong 2, 4, 6, 8, 10 ngày để tăng hiệu suất phá vỡ bào tử. Ngoài ra còn kết hợp phương pháp siêu âm để tăng tỉ lệ phá vỡ bào tử. Với công suất máy là 500 W, thực hiện với hai độ khuếch đại 75% và 100% và siêu âm trong 1,5 phút. Hút 15 ml dịch ngâm bào tử pha với 15 ml đệm acetate pH 5 và chạy siêu âm. Tiến hành đếm bào tử còn nguyên vẹn bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer để xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại x100 sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày. 2.2.2.2. Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu (Trần Thanh Phong, 2004; Nguyễn Đức Lượng, 2005) 57
  72. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4. Buồng đếm hồng cầu Neubauer Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm các vi sinh vật có kích thước rất nhỏ (nấm men, bào tử nấm mốc ). Nguyên tắc: Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu đó là một phiến kính hình chữ nhật, chia thành ba khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng nhỏ có kẻ một lưới đếm, gồm nhiều ô vuông nhỏ, mỗi ô có diện tích là 1/25 mm2, lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16 ô), mỗi ô có diện tích là 1/400 mm2 và chiều sâu là 0,1 mm. Như vậy thể tích của mỗi ô nhỏ là 1/400 x 0,1 = 1/4000 mm3. Thực hiện : - Bào tử nấm Linh chi sau khoảng thời gian ủ thích hợp, được lấy ra thực hiện đếm bào tử nguyên vẹn bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer. - Thực hiện pha loãng bằng cách dùng micropipette hút 0,5 ml từ cốc chứa hỗn hợp bào tử và enzyme và 0,5 ml đệm pH 5 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất lạnh vô trùng chứa 1% Tween 80 thu được độ pha loãng 10-1. Tiếp tục dùng 58
  73. Đồ án tốt nghiệp micropipette hút 1 ml hỗn hợp ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất lạnh vô trùng chứa 1% Tween 80 thu được độ pha loãng 10-2. - Dùng micropipette hút 1 ml hỗn hợp sau siêu âm từ mỗi cốc cho vào từng ống nghiệm chứa 9 ml trong nước cất lạnh vô trùng chứa 1% Tween 80 thu được độ pha loãng 10-1. Lặp lại như trên để thu được hỗn hợp có độ pha loãng 10-2. - Tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer: Lắc đều mẫu pha loãng. Đậy lá kính lên lưới đếm. Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho một giọt vào mép lá kính, do lực mao dẫn, dịch mẫu tràn vào mặt trên lưới đếm. Chú ý không để tạo bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh. Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3 – 5 phút, sau đó tiến hành đếm bào tử. Chú ý: nồng độ dịch huyền phù mẫu pha loãng phải đảm bảo sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không được quá 10 bào tử. Cách đếm và tính: - Đếm số bào tử trong 4 ô W (ô W là 4 ô nằm ở 4 góc buồng đếm Neubauer), gọi B là số bào tử trung bình trong một ô lớn W. Trong mỗi ô trung bình, đếm tất cả những bào tử nằm gọn trong ô và những bào tử nằm ở cạnh trên và cạnh trái. Những bào tử nằm ngay trên vạch ngoài thì đếm 2 tính 1, còn bào tử nằm giữa 2 vạch hoặc trên 1 vạch thì 1 tính 1. - Số bào tử trong 4 ô W là B1, B2, B3 và B4. ( 1 + 2 + 3 + 4) - B trung bình = 4 - Tỉ lệ bào tử phá vỡ được tính theo công thức: 푛 Tỉ lệ bào tử phá vỡ (%) = (1 - ) x 100 표 - Trong đó: + B0: số bào tử còn nguyên vẹn trung bình của 4 ô W trong buồng đếm Neubauer ngày 0 (ngày đầu tiên, khi vừa cho hỗn hợp enzyme vào bảo tử nấm Linh chi sau xử lý lạnh đông). 59
  74. Đồ án tốt nghiệp + Bn: số bào tử còn nguyên vẹn trung bình của 4 ô W trong buồng đếm Neubauer ngày n ( 2 ≤ n ≤ 10). 2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử 200 ml 20 g bào tử nước cất nấm Linh chi Lạnh đông đá khô Lạnh đông nito lỏng Lạnh đông Lạnh đông -40C/ 12 giờ -200C/ 12 giờ -700C/ 12 giờ -1960C/ 12 giờ Rã đông ở nhiệt độ phòng Ly tâm 4000 vòng/phút * 15 phút Nước Thu bào tử Ủ bào tử trong hỗn hợp enzyme 500C, có khuấy đảo, pH 5, 10 ngày Siêu âm 500W, 100%, 5 phút Xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử Phương pháp tiến hành: Ở các chế độ lạnh đông - 40C, - 200C, - 700C (đá khô), - 1960C (nitơ lỏng), tiến hành cân 20 g bào tử nấm Linh chi vào cốc, thêm 200 ml nước cất vào cốc, để lạnh đông bào tử trong 12 giờ. Sau thời gian lạnh đông, bào tử rã đông ở nhiệt độ phòng, khi đá đã tan hết, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút để tách nước, thu bào tử. 60
  75. Đồ án tốt nghiệp Chế phẩm enzyme gốc được pha loãng thu được dung dịch enzyme C20032 10%, dịch trích ly enzyme thu được từ phương pháp tăng sinh rắn nấm Trichoderma harzianum T2. Thu bào tử cho vào cốc 1000 ml bổ sung thêm hỗn hợp 300 ml enzyme C20032 10%, 300 ml dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 và 400 ml đệm acetate pH 5. Đặt cốc trên bếp khuấy từ ở 500C và khuấy liên tục trong 10 ngày để tăng hiệu suất phá vỡ bào tử. Sau 10 ngày ủ enzyme tiến hành siêu âm hỗn hợp bào tử ở mỗi chế độ lạnh đông với công suất máy là 500 W, độ khuếch đại 100% và siêu âm trong 5 phút. Hút 15 ml dịch ngâm bào tử pha với 15 ml đệm acetate pH 5 và chạy siêu âm. Phương pháp xác định tỉ lệ phá vỡ tiến hành theo mục 2.2.1.5. 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 200 ml 20 g bào tử nước c ất nấm Linh chi Lạnh đông -40C / 12 giờ Rã đông ở nhiệt độ phòng Ly tâm 4000 vòng/phút * 15 phút Nước Thu bào tử Ủ bào tử trong hỗn hợp enzyme ở 500C có khuấy đảo, pH 5, 10 ngày Không siêu âm Siêu âm 500W, 100%, 5 phút 61