Đồ án Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa (Oryza sativa)

70 trang thiennha21 13/04/2022 4500

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa (Oryza sativa)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_phan_lap_va_dinh_danh_mot_so_chung_nam_gay_benh_tren_l.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa (Oryza sativa)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN LÚA (Oryza sativa) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG ThS. LÊ QUỲNH LOAN Sinh viên thực hiện :NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG MSSV: 1311100334 Lớp: 13DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2017
Đồ án tốt nghiệp CAM ĐOAN Người thực hiện đề tài xin cam đoan: Đồ án này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoàng Dũng, ThS. Lê Quỳnh Loan. Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực, đề tài không trùng với bất kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào. Những thông tin tham khảo đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thanh Hương i
Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn thành tốt đồ án này. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: TS. Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đề tài. TS. Nguyễn Hoàng Dũng và ThS. Lê Quỳnh Loan phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian thực hiện đồ án. Thầy Ngô Đức Duy, phòng Vi sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy, cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường của trường đại học HUTECH đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm trong suốt 4 năm qua. Các bạn lớp 13DSH02 đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. Cuối cùng, con xin cám ơn Ba Mẹ, đã nuôi nấng, chăm sóc và tạo mọi điều kiện cho con ăn học thành người có ích cho xã hội, người đã luôn bên cạnh động viên, định hướng cho con những khi gặp khó khăn trong công việc. Xin trân trọng cảm ơn! Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thanh Hương ii
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 1 3. Mục đích nghiên cứu 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 5. Phương pháp nghiên cứu 3 6. Kết quả đạt được 3 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Sơ lược về cây lúa 4 1.2. Một số bệnh thường gặp trên lúa 5 1.2.1. Bệnh đạo ôn (bệnh cháy lá lúa) 5 1.2.2. Bệnh đốm nâu trên lúa 11 1.2.3. Bệnh tiêm lửa hại lúa 13 1.2.4. Bệnh khô vằn 15 1.3. Định danh bằng sinh học phân tử 20 1.3.1. Phương pháp ly trích DNA 20 1.3.2. PCR trong định danh vi sinh vật 22 1.4. Tái nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất 27 iii
Đồ án tốt nghiệp 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị 27 2.1.2. Nguồn mẫu 28 2.1.3. Hóa chất 28 2.2. Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1. Thu mẫu 29 2.2.2. Phân lập và làm thuần nấm 29 2.2.3. Phương pháp phòng ẩm 29 2.2.4. Phương pháp bảo quản chủng nấm 30 2.2.5. Định danh bằng sinh học phân tử (kỹ thuật PCR) 31 2.2.6. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35 3.1. Kết quả phân lập và làm thuần nấm bệnh 35 3.1.1. Kết quả thu nhận mẫu lá bị bệnh 35 3.1.2. Kết quả phân lập, làm thuần và quan sát hình thái 36 3.2. Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS 44 3.3. Kết quả so sánh vùng gen ITS 45 3.4. Kết quả tái nhiễm theo quy tắc Koch 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1. Kết luận 51 4.2. Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường 1 PHỤ LỤC B: So sánh trình tự tương đồng của các đoạn gene trên NCBI 2 PHỤ LỤC C: Kết quả trình tự vùng gen bảo tồn ITS .6 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base Pair CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleotide Acid EDTA Ethylene – Diamine – Tetraacetic – Acid ITS Internal transcribed spacer PCR Polymerase Chain Reation PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth TAE Tri – Acetic acid – Ethylenediamine – Tetraacetate TE Tris – Ethylenediamine – Tetraacetate v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại nấm M. oryzae 9 Bảng 1.2. Phân loại nấm C. lunata 11 Bảng 1.3. Phân loại nấm B. oryzae 14 Bảng 1.4. Phân loại nấm R. solani 17 Bảng 1.5. Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS 24 Bảng 3.1. Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu tại đồng ruộng 35 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Bản đồ mồi vùng gen ITS 24 Hình 3.1. Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được trên đồng ruộng 36 Hình 3.2. Chủng nấm CG1 37 Hình 3.3. Chủng nấm CG2 38 Hình 3.4. Chủng nấm CG3 39 Hình 3.5. Chủng nấm BL1 40 Hình 3.6. Chủng nấm BL2 40 Hình 3.7. Chủng nấm BL3 41 Hình 3.8. Chủng nấm VL1 42 Hình 3.9. Chủng nấm VL2 42 Hình 3.10. Chủng nấm HM1 43 Hình 3.11. Chủng nấm HM2 44 Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm ly trích và PCR. 45 Hình 3.13. Mẫu lúa đối chứng (phun nước cất) 49 Hình 3.14. Mẫu lúa thí nghiệm (phun dịch bào tử ở nồng độ 106 tế bào/ml) 49 Hình 3.15. Chủng nấm phân lập từ thí nghiệm tái nhiễm 50 vii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Lúa (Oryza sativa) là loại lương thực quan trọng được trồng nhiều trên thế giới đặc biệt là ở các nước châu Á, trong đó có Việt Nam. Nó có vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp, là nguồn cung cấp lương thực chính. Tuy nhiên do ảnh hưởng của quá trình thâm canh trong sản xuất nông nhiệp, tình hình dịch bệnh có nhiều biến đổi dẫn đến năng suất và chất lượng lúa đang bị suy giảm do sự tác động của nấm bệnh, đặc biệt là các bệnh như đạo ôn, bệnh đốm nâu, gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa. Triệu chứng ban đầu của các bệnh này trên lá khá giống nhau, vì vậy việc xác định các tác nhân gây bệnh này thường rất mất thời gian và khó khăn. Do đó, việc phát hiện kịp thời và chính xác các tác nhân gây bệnh trên lúa sẽ giúp ích cho việc đưa ra các biện pháp phòng ngừa và điều trị sớm, kịp thời và hiệu quả. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ sinh học, nhiều kỹ thuật mới ra đời trong đó có kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được xem là một phương pháp phổ biến và thông dụng trong việc xác định các tác nhân gây bệnh cây trồng vì đáng tin cậy, tiết kiệm thời gian và tính chính xác cao, tìm ra được tác nhân gây bệnh ngay ở giai đoạn đầu khi mới nhiễm bệnh. Trên cơ sở đó, tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa (Oryza sativa)” bằng kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi ITS1 – F và ITS4, nhằm phát hiện bệnh một cách chính xác và nhanh chóng, đưa ra cách phòng trừ hữu hiệu, giảm thiệt hại đến mức thấp nhất. 2. Tình hình nghiên cứu ❖ Các nghiên cứu trong nước – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp “Nghiên cứu bệnh đạo ôn trên một số dòng, giống lúa của viện cây lương thực và cây thực phẩm, vụ xuân 2010”. Phạm Tự Bắc (2010). Mục đích của đề tài này nhằm nắm được tác hại và đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh đạo ôn trên một số giống lúa tại Viện 1
Đồ án tốt nghiệp Cây lương thực – Cây thực phẩm trong vụ xuân 2010, xác định chủng sinh lý nấm đạo ôn và nghiên cứu một số đặc tính của chúng. – Báo cáo khoa học “Xác định nấm gây bệnh lem lép hạt lúa tại Đồng bằng sông Cửu Long”. Trần Thị Thu Thủy (2011). Tạp chí khoa học 2011 17a 155 – 163, Trường Đại học Cần Thơ. Đề tài này được thực hiện nhằm xác định nấm gây bệnh lem lép hạt tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, đã xác định được 11 chủng nấm. – Báo cáo khoa học “Ứng dụng phương pháp PCR trong việc xác định nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae”. Đoàn Thị Hòa et al. (2016). Tạp chí khoa học Đại học mở TP.HCM, số 4 (49) 104 – 110. Xác định nấm đạo ôn bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt nhằm giúp giảm chi phí, thời gian và công sức. ❖ Các nghiên cứu ngoài nước – Hajano et al. (2011). “Rice blast – mycoflora, symptomatology and pathogencity”. Nghiên cứu về đặc tính, triệu chứng của một số loại nấm gây bệnh trên lúa được phân lập từ hạt và lá lúa. – Kamaluddeen et al. (Dec 2013). “A new blight disease of rice caused by Curvularia lunata from Uttar Pradesh”. Nghiên cứu này mô tả về bệnh đốm nâu do Curvularia lunata gây ra. 3. Mục đích nghiên cứu Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa thu thập ở 2 tỉnh đồng bằng sông Cửu Long (Long An, Vĩnh Long) và huyện Hóc Môn, từ những kết quả của nghiên cứu này, có thể dựa vào những đặc điểm và những nghiên cứu về nấm bệnh rồi đưa ra các biện pháp khắc phục kịp thời, nhanh chóng, tránh tổn thất. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu – Phân lập và làm thuần nấm bệnh – Quan sát đặc điểm hình thái (khuẩn ty và bào tử) – Định danh bằng sinh học phân tử – Tái nhiễm nấm bệnh trên cây lúa. 2
Đồ án tốt nghiệp 5. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp phân lập và làm thuần nấm bệnh Phương pháp phòng ẩm (xem sợi khuẩn ty và bào tử) Phương pháp tách chiết và thu nhân bộ gen DNA (theo phương pháp CTAB) Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi ITS1 – F và ITS4 Phương pháp tái nhiễm của Robert Koch. 6. Kết quả đạt được Đề tài đã phân lập và làm thuần được 10 chủng nấm gây bệnh trên lúa. Thu nhận bộ gen DNA của 3 chủng nấm. Nhân bản thành công vùng gen ITS bằng phương pháp PCR. Thực hiện tái nhiễm theo phương pháp Koch, kết quả có 1 loài có khả năng tái nhiễm trên lúa. 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Nội dung của đồ án tốt nghiệp này gồm 4 chương: Chương 1 là tổng quan tài liệu: Giới thiệu sơ lược về cây lúa, một số bệnh thường gặp và chủng nấm gây bệnh trên lúa. Chương 2 là vật liệu và phương pháp: Mô tả các phương pháp nghiên cứu được sử dụng. Chương 3 là kết quả và biện luận: Đưa ra kết quả đạt được và nhận xét, biện luận các kết quả này. Chương 4 là kết luận và kiến nghị: Kết luận về các kết quả thí nghiệm đã đạt được và kiến nghị tiếp tục hoàn thiện thêm các kết quả chưa đạt được. 3
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về cây lúa Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae), họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima. Loài Oryza sativa là lúa trồng ở Châu Á và Oryza glaberrima là lúa trồng ở Châu Phi. Năm 1753, Lineaeus là người đầu tiên đã mô tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi Oryza. Dựa vào mày hạt và dạng hạt tác giả đã phân chi Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi Oryza gồm tất cả 19 loài [8] . Morinaga là người đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật phân tích genome để định danh các loài lúa dại. Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học này đã giúp phân tích các loài lúa được chính xác hơn [8]. Hội nghị di truyền lúa Quốc tế đã tổ chức họp tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế, Philippines năm 1967 khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có 20 loài lúa dại và hai loài lúa trồng [14]. Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New Ginea là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia thành bốn nhóm genome [22]. Ngày nay, các nhà phân loại học đều nhất trí là chi Oryza có 23 loài, trong đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrima thuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA. Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây và Trung Phi còn loài Oryza sativa được gieo trồng khắp thế giới và được chia thành hai loài phụ là Indica và Japonica. Trong quá trình tiến hoá của cây lúa, ngoài hai loài phụ Indica và Japonica còn có nhiều loại hình trung gian như Javanica v.v [7], [9]. Tang và ctv (2004), so sánh bộ gen lục lạp của giống lúa 93 – 11 (đại diện loài phụ Indica) và giống lúa Peiai'64S (giống lúa lai thuộc loài phụ Indica, nhưng nguồn gốc mẹ thuộc loài phụ Japonica) cho thấy sự phân chia bộ gen lục lạp của hai loài phụ Indica và Japonica xảy ra cách đây khoảng 86.000 – 200.000 năm trước [21]. 4
Đồ án tốt nghiệp Vitte và ctv (2004) cũng cho rằng hai loài phụ Indica và Japonica được phân hoá độc lập với nhau, cách đây khoảng 200.000 năm. Trong khi đó, tác giả Jianxin phân tích ADN nhân tế bào và cho rằng lúa Indica và Japonica được tách ra từ một tổ tiên chung, cách đây khoảng 440.000 năm [23], [18]. Jason và ctv (2006), nghiên cứu biến đổi trình tự ADN của ba vùng gen bằng phương pháp địa lý - thực vật để khảo sát quá trình thuần hoá lúa trồng. Kết quả cho thấy, cây lúa trồng đã được thuần hóa ít nhất là hai lần từ các quần thể khác nhau của loài Oryza rufipogon và sản phẩm của hai lần biến đổi này đã tạo ra hai loài phụ là Indica và Japonica [17]. Zhu và ctv (2007), trên cơ sở giải mã trình tự ADN của 10 gen ở nhân tế bào của lúa cho rằng, quá trình thuần hoá liên quan chặt chẽ với quá trình giảm đa dạng di truyền của các giống lúa dại. Đa dạng di truyền của lúa Japonica thấp hơn 2 lần so với đa dạng di truyền của lúa Indica [24]. 1.2. Một số bệnh thường gặp trên lúa 1.2.1. Bệnh đạo ôn (bệnh cháy lá lúa) Bệnh chính thức được phát hiện ở Ý vào năm 1560. Sau đó bệnh được quan sát thấy ở các nước châu Á như: Trung Quốc 1637, Nhật Bản 1760, Ấn Độ 1913, đây là bệnh phân bố rộng và có mặt trên 80 quốc gia trồng lúa trên thế giới. Ở nước ta, Vincens (người Pháp) đã phát hiện một số bệnh ở Nam bộ vào năm 1921. Năm 1951, Roger (người Pháp) đã xác định sự xuất hiện và gây hại của bệnh ở vùng Bắc bộ. Ở miền Bắc, các vùng Hải Phòng, Thái Nguyên, Ninh Bình, Bắc Giang, Hà Đông bị thiệt hại nặng. Ở đồng bằng sông Cửu Long, hàng năm thường có hai cao điểm của bệnh là tháng 11 – 12 dương lịch và tháng 5 – 6 dương lịch. Các huyện Châu Thành, Chợ Gạo, Cai Lậy, Chợ Mới (An Giang), Thạnh Trị (Cần Thơ) là những nơi thường có bệnh [10], [11]. 1.2.1.1. Triệu chứng của bệnh Bệnh đạo ôn là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất trên cây lúa, hay còn gọi là bệnh cháy lá lúa. Khi dịch cháy lá xảy ra trên diện rộng thì năng suất và sản lượng sẽ giảm rất rõ và thiệt hại nghiêm trọng về mặt kinh tế. Tác nhân gây bệnh có thể 5
Đồ án tốt nghiệp tấn công mọi giai đoạn của cây lúa; bắt đầu từ giai đoạn mạ hoặc sau khi gieo xạ cho đến trước trổ thì gọi là bệnh cháy lá. Bệnh có thể gây hại trên cổ lá gọi là thối cổ lá, hoặc gây hại trên cổ bông được gọi là thối cổ bông làm lép hạt, đôi khi bệnh có thể gây lem vỏ hạt lúa [10]. Trên mạ: vết bệnh lúc đầu hình bầu dục nhỏ sau tạo thành hình thoi nhỏ hoặc dạng tương tự hình thoi, màu nâu hoặc nâu vàng. Khi bệnh nặng, từng đám vết bệnh kế tiếp nhau làm cây mạ có thể héo khô hoặc chết. Trên lá: vết bệnh hình thoi màu nâu nhạt, rộng ở phần giữa và nhọn ở hai đầu, giữa vết bệnh có màu xám tro, xung quanh nâu đậm, vòng ngoài cũng có màu nâu nhạt. Kích thước vết bệnh biến thiên từ một chấm nhỏ như mũi kim đến chiều dài 1,5 cm, khi bệnh nặng các vết bệnh nối với nhau tạo thành những vệt lớn làm cho lá bị cháy. Trên cổ lá: vết bệnh hình khum theo chiều cong giữa cổ lá và phiến lá. Từ cổ lá bệnh lan ra bẹ lá và phiến lá làm lá lúa khô lụi và gãy gục. Trên đốt thân: lúc đầu là một đốm nhỏ màu nâu sau lớn rộng ra thành một vành tròn bao quanh đốt thân làm cho thân tóp lại, màu đen. Khi gặp trời mưa ẩm thân mềm nhũn dễ bị gãy khi mưa giông, gió. Trên cổ bông và gié lúa: vết bệnh ban đầu là đốm nhỏ, sau lan ra theo chiều dài làm cả đoạn cổ bông có màu nâu xám, khô. Nếu nhiễm bệnh sớm (ngay sau trổ) làm cho toàn bộ bông lúa bị lép trắng; nhiễm bệnh muộn (vào thời kỳ làm hạt – chín) gây ra hiện tượng bông lúa nhỏ, có nhiều hạt lép, dễ gãy, gié lúa dễ rụng dẫn đến làm giảm năng suất lúa. Trên hạt: vết bệnh gây trên hạt không đồng nhất về hình dạng như trên lá lúa mà có dạng đốm tròn hoặc không định hình, có màu nâu đen hoặc xám. Nấm ký sinh ở vỏ trấu và có thể ở bên trong hạt. Hạt giống bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh lây truyền từ vụ này sang vụ khác [10], [11]. 1.2.1.2. Quy luật phát sinh phát triển của bệnh Bệnh phát sinh thất thường, tùy thuộc vào yếu tố ngoại cảnh. Bệnh có thể phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ thấp (20oC), ẩm độ không khí cao và gió 6
Đồ án tốt nghiệp mạnh. Khi không đủ ánh sáng do mây mù, lúa sẽ tập trung nhiều Glutamic và nhiều amino acid khác nên sẽ tăng tính nhiễm của cây [10]. ❖ Ảnh hưởng của thời tiết khí hậu Nấm đạo ôn ưa nhiệt độ tương đối thấp, điều kiện nhiệt độ 20 – 28oC, ẩm độ không khí bão hòa và thời tiết âm u trong vụ lúa đông xuân là rất thích hợp cho bệnh phát sinh gây hại nặng nhất. Độ ẩm không khí và độ ẩm đất có tác dụng lớn tới tính mẫn cảm của cây đối với sự phát triển của nấm bệnh. Trong điều kiện khô hạn, ẩm độ đất thấp hoặc ở điều kiện ngập úng kéo dài cây lúa dễ bị nhiễm bệnh, ẩm độ không khí cao lại thuận lợi cho vết bệnh phát triển. Ở các vùng nhiệt đới có mưa thường xuyên kéo dài tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh gây hại nghiêm trọng [10]. ❖ Ảnh hưởng của đất đai, phân bón đến bệnh Những chân ruộng nhiều mùn, trũng ẩm, khó thoát nước; những vùng đất mới vỡ hoang, đất nhẹ, giữ nước kém, khô hạn và những chân ruộng có lớp sét nông rất phù hợp cho nấm bệnh đạo ôn phát triển và gây hại. Phân bón giữ vai trò đặc biệt quan trọng đối với sự phát sinh phát triển của bệnh đạo ôn ngay cả khi thời tiết không thuận lợi cho nấm phát triển nhưng do bón phân không hợp lý tạo điều kiện thúc đẩy bệnh phát sinh và gây hại mạnh. Mức độ ảnh hưởng của phân đạm tới bệnh biến động tùy theo loại đát, phương pháp bón và diễn biến khí hậu khi bón phân cho cây. Khi sử dụng dạng đạm tác dụng nhanh như amonium sunfat quá nhiều, qua muộn hoặc bón vào lúc nhiệt độ không khí thấp và cây còn non đều làm tăng tỷ lệ bệnh và mức độ gây hại của bệnh. Phân lân ảnh hưởng ít đến mức độ nhiễm bệnh của cây. Bón phân ở liều lượng nào đó đối với đất thiếu lân có thể làm giảm tỷ lệ bệnh nhưng nếu sử dụng lân không hợp lý thì bệnh vẫn có thể tăng. Nếu bón kali trên nền đạm cao sẽ làm bệnh tăng so với trên nền đạm thấp. Trong đất giàu kali nếu tăng mức độ bón phân kali trên nền đạm cao cũng có thể làm tăng mức độ bệnh của cây. 7
Đồ án tốt nghiệp Phân silic có tác dụng làm giảm độ nhiễm bệnh của cây. Mức độ nhiễm bệnh của cây tỷ lệ nghịch với hàm lượng silic trong cây, do đó bón nhiều silic sẽ làm giảm mức độ nhiễm bệnh của cây [10], [2]. ❖ Ảnh hưởng của giống lúa Ngoài các yếu tố khí hậu thời tiết, đất đai và phân bón, đặc tính của giống có nhr hưởng rất lớn tới mức độ phát triển của bệnh trên đồng ruộng. Những giống nhiễm bệnh nặng (giống mẫn cảm) không không những là những điểm bệnh phát sinh ban đầu mà còn là điều kiện cho bệnh dễ dàng lây lan hàng loạt hình thành nên dịch bệnh trên đồng ruộng. Đặc tính chống bệnh của cây lúa tăng khi tỷ lệ SiO2/N tăng. Giống lúa chống bệnh chứa nhiều polyphenol hơn ở giống nhiễm bệnh. Trong giống lúa chống bệnh sẽ sản sinh ra hàm lượng lớn hợp chất Phytoalexin có tác dụng ngăn cản sự phát triển của nấm trong cây. Tính chống bệnh của cây lúa do 23 gen kháng đạo ôn đã được phát hiện và đồng thời còn phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo của giống. Nhìn chung, các giống đẻ nhánh tập trung, cứng cây, chịu phân, tỷ số khối lượng thân trên khối lượng 20 cm gốc nhỏ, ống rơm dày là những giống thể hiện khả năng chống chịu bệnh tốt. Nhiều giống lúa đã khảo nghiệm và đánh giá là những giống có năng suất cao và chống chịu đạo ôn như IR1820, IR17494, C70, C71, RSB13, Xuân số 2, Xuân số 5, X20, X21, V14, V15, v.v và đã được gieo trồng rộng rãi ở miền Trung và vùng đồng bằng sông Hồng. Một số giống lúa nếp hoặc NN8, CR203 là giống mẫn cảm bệnh đạo ôn [10], [7]. 1.2.1.3. Nguyên nhân gây bệnh ❖ Nguồn gốc và phân loại Bệnh do nấm Magnaporthe oryzae gây ra, thuộc họ Moniliales, lớp nấm Bất toàn. Phân loại khoa học của nấm M. oryzae được mô tả ở bảng 1.1 [10]. 8
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Phân loại nấm M. oryzae [27] Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Ascomycota Lớp (Class) Sordariomycetes Bộ (Order) Magnaporthales Họ (Family) Magnaporthaceae Chi (Genus) Magnaporthe Loài (Species) M. oryzae ❖ Đặc điểm hình thái và sinh lý Cành bào tử phân sinh hình trụ, đa bào không phân nhánh, đầu cành thon và hơi gấp khúc. Nấm thường sinh ra các cụm cành từ 3 – 5 chiếc. Bào tử phân sinh hình quả lê hoặc hình nụ sen, thường có từ 2 – 3 vách ngăn ngang, bào tử không màu, kích thước trung bình của bào tử nấm 19 – 23 x 10 – 12 µm. Nhìn chung, kích thước của bào tử nấm biến động tùy thuộc vào các isolates, điều kiện ngoại cảnh khác nhau cũng như trên các giống lúa khác nhau. Nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 24 – 28oC và ẩm độ không khí là 93% trở lên. Phạm vi nhiệt độ nấm sinh sản bào tử là 10 – 30oC. Ở 28oC cường độ sinh bào tử nhanh và mạnh nhưng sức sinh sản giảm dần sau 9 ngày, trong khi đó ở 16oC, 20oC và 24oC sự sinh sản tăng và kéo dài tới 15 ngày sau đó mới giảm xuống. Điều kiện ánh sáng âm u có tác động thúc đẩy quá trình sinh sản bào tử của nấm. Bào tử này nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 24 – 28oC và có giọt nước. Quá trình xâm nhập của nấm vào cây phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, ẩm độ không khí và ánh sáng. Ở điều kiện bóng tối, nhiệt độ 24oC và ẩm độ bão hòa là thuận lợi nhất cho nấm xâm nhập vào cây. Trong quá trình gây bệnh nấm tiết ra một số độc tố như acid α – pycolinic (C6H5NO2) và pyricularin (C18H14N2O3) có tác dụng kìm hãm hô hấp và phân hủy 9
Đồ án tốt nghiệp các enzyme chứa kim loại của cây, kìm hãm sự sinh trưởng của cây lúa. Nấm đạo ôn có khả năng biến dị cao, tạo ra nhiều chủng, nhóm nòi sinh học. Các vùng trồng lúa trên thế giới đã có tới 256 loài xuất hiện. Ở nước ta xác định trên bộ giống chỉ thị nòi quốc tế đã thấy sự xuất hiện của nhiều nhóm nòi đạo ôn ký hiệu là IB, IC, ID, IE và IG phân bố từ Quảng Nam – Đà Nẵng đến các tỉnh đồng bằng Bắc bộ. Các nhóm nòi có sức gây bệnh cao ở các tỉnh miền Bắc là IB, IE, IG, IF và IC – 1, IA – 71 và IC – 23. Các nhóm IA, ID và IG có khả năng gây bệnh cao ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Nguồn bệnh của nấm đạo ôn tồn tại ở dạng sợi nấm và bào tử trong rơm rạ và hạt bị bệnh, ngoài ra nấm còn tồn tại trên một số cây cỏ dại khác. Ở điều kiện khô ráo trong phòng bào tử có thể sống được hơn một năm và sợi nấm sống được gần 3 năm, nhưng trong điều kiện ẩm ướt chúng không sống sót được sang vụ sau. Tuy nhiên, ở vùng nhiệt đới, bào tử nấm có thể tồn tại quanh năm đồng thời nấm có thể chuyển ký chủ từ cây lúa bị bệnh sang các cây ký chủ phụ sinh trưởng phát triển quanh năm [10]. 1.2.1.4. Biện pháp phòng trừ Theo dõi và phân tích các điều kiện liên quan đến sự phát sinh của bệnh như: vị trí tồn tại của nguồn bệnh, khí hậu thời tiết, sự sinh trưởng của cây, điều kiện đất đai, phân bón và giống lúa. Dọn sạch tàn dư rơm rạ và cây cỏ dại mang bệnh ở trên đồng ruộng. Bón phân N, P, K hợp lý, đúng giai đoạn, không bón đạm tập trung vào thời kỳ lúa dễ nhiễm bệnh. Khi có bệnh xuất hiện phải tạm ngừng bón thúc đạm và tiến hành phun thuốc phòng trừ. Tăng cường sử dụng giống lúa chống chịu bệnh có nhiều gen kháng trong cơ cấu giống ở những vùng bệnh thường hay xảy ra và ở mức độ gây hại nặng. Kiểm tra hạt giống nếu nhiễm bệnh thì cần xử lý hạt giống tiêu diệt nguồn bệnh bằng nước nóng 54oC trong 10 phút hoặc xử lý bằng thuốc trừ đạo ôn. Khi phát hiện bệnh trên đồng ruộng cần tiến hành phun thuốc sớm và trừ nhanh. Một số thuốc hóa học thường được sử dụng như: Fuji – one 40EC (1 l/ha); 10
Đồ án tốt nghiệp New Hinosan 30EC (1 l/ha); Kitazin EC (1 – 1,5 l/ha); Kasai 21,2WP (1 – 1,5 kg/ha); Benomyl (Benlate) 50WP 1 kg/ha; Triozol 20WP (Beam 20WP) 1 kg/ha [10]. 1.2.2. Bệnh đốm nâu trên lúa Bệnh làm tăng số hạt lép, giảm khối lượng hạt ảnh hưởng tới năng suất, bệnh nặng kéo dài tới cuối kỳ sinh trưởng có thể làm cây lúa cằn lại, trỗ kém. Hạt bị bệnh tỷ lệ lép lên tới 60 – 70% [10]. 1.2.2.1. Triệu chứng của bệnh Bệnh có thể xuất hiện từ thời kỳ mạ cho đến lúc lúa chín, phá hoại chủ yếu lá và hạt. Vết bệnh trên lá hình tròn, sọc ngắn hoặc không định hình màu nâu. Trên hạt lúa vết bệnh tròn nhỏ màu nâu. Vết bệnh trên lá và trên hạt dễ lẫn với bệnh tiêm lửa. Hạt bị bệnh thường biến màu [10]. 1.2.2.2. Nguyên nhân gây bệnh ❖ Nguồn gốc và phân loại Có khoảng 14 loài nấm Curvularia có liên quan đến bệnh nhưng phổ biến nhất là Curvularia lunata (Walker) Boedjin và Curvularia geniculata Tracy and Early, thuộc lớp Nấm Bất toàn. Giai đoạn hữu tính là Cochliobolus lunatus Nelson and Haasis và Cochliobolus genculata Nelson. Phân loại khoa học của nấm C. lunata được mô tả ở bảng 1.2 [10], [20]. Bảng 1.2. Phân loại nấm C. lunata [26] Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Ascomycota Lớp (Class) Euascomycetes Bộ (Order) Pleosporales Họ (Family) Pleosporaceae Chi (Genus) Curvularia Loài (Species) C. lunata ❖ Đặc điểm hình thái và sinh lý 11
Đồ án tốt nghiệp Trên lá và hạt bị nhiễm bệnh nấm mọc thành lớp mốc màu xám đến nâu xám. Cành bào tử phân sinh màu nâu đậm, đa bào, không phân nhánh mọc đơn hoặc thành cụm, đỉnh hơi tròn, kích thước 70 – 210 x 2 – 8 µm. Bào tử phân sinh mọc thành cụm ở đỉnh, cong, hình gù vai trâu, đa bào, có 2 – 5 vách ngăn ngang, đa số có 3 ngăn ngang, đỉnh tròn hơn thắt ở gốc. Nấm có thể kết hợp gây hại với nấm tiêm lửa và một số loài nấm khác. Nấm tồn tại chủ yếu trên bề mặt hạt giống hoặc dưới lớp vỏ trấu dưới dạng sợi nấm và bào tử phân sinh. Bệnh phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ 20 – 27oC, khi thời tiết biến động, cây lúa phát triển kém thiếu dinh dưỡng. Trong suốt thời kỳ sinh trưởng của cây bệnh thường xuất hiện vào hai cáo điểm từ mạ đến lúa hồi xanh và từ thời kỳ làm đòng đến lúa chín. Bệnh phát sinh mạnh ở những chân đất chua, mặn, đất bạc màu. Bón đạm thấp, đặc biệt là các giống lúa dài ngày nếu thiếu đạm vào thời kỳ làm đòng bệnh phát triển mạnh. Bón phân cân đối (phân chuồng, NPK) đầy đủ, bón tập trung vào giai đoạn đầu bệnh nặng hơn so với bón rải rác nhiều lần [10], [20]. 1.2.2.3. Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh Bệnh thường phát sinh và phá hoại vào vụ mùa và vụ chiêm xuân. Bệnh chỉ phá hại trên các trà lúa cấy muộn (trỗ trung tuần tháng 5 – 6 và hạ tuần tháng 10 – 11), các chân ruộng thiếu phân. Bệnh phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ 20 – 270C, khi thời tiết biến động, cây lúa phát triển kém thiếu dinh dưỡng. Trong suốt thời kỳ sinh trưởng của cây bệnh thường xuất hiện vào hai cáo điểm từ mạ đến lúa hồi xanh và từ thời kỳ làm đòng đến lúa chín. Bệnh phát sinh mạnh ở những chân đất chua, mặn, đất bạc màu. Bón đạm thấp, đặc biệt là các giống lúa dài ngày nếu thiếu đạm vào thời kỳ làm đòng bệnh phát triển mạnh. Bón phân cân đối (phân chuồng, NPK) đầy đủ, bón tập trung vào giai đoạn đầu bệnh nặng hơn so với bón rải rác nhiều lần. 12
Đồ án tốt nghiệp Nguồn bệnh tồn tại chủ yếu trên các hạt giống và rơm rạ của các cây nhiễm bệnh. Ngoài ra, ở Mỹ người ta còn phát hiện thấy nấm C. lunata gây bệnh cho quả cà chua và ớt. còn C. geniculata gây bệnh cho cải bắp, đạu Hà Lan [10]. 1.2.2.4. Biện pháp phòng trừ Dùng hạt giống sạch bệnh, sáng màu, mảy chắc. Chăm sóc mạ tốt, cấy đúng thời vụ. Bón đầy đủ các loại phân chuồng, N, P, K, bón phân cân đối, bón vào các giai đoạn lúa cần dinh dưỡng như đẻ nhánh, đón đòng. Trên các chân đất chua cần bôi thêm vôi để cải tạo đất. Điều tiết nước hợp lý, nước sâu khoảng 5 – 10 cm, không để lúa bị hạn hoặc ngập úng quá. Nếu bệnh phát triển có thể phun các loại thuốc sau: New Hinosan 30EC (1,2 l/ha); Kitazin 50EC (1 – 1,5 l/ha); Rovral 50WP (0,1 – 0,2 %); Zineb 80 WP (1kg/ha) [10], [11]. 1.2.3. Bệnh tiêm lửa hại lúa Bệnh được phát hiện năm 1901 ở Nhật Bản. Bệnh có phạm vi phân bố rộng, phổ biến ở các nước trồng lúa thuộc châu Á, châu Mỹ và châu Phi. Ở Philippines và miền Bắc Việt Nam trong những năm 60 bệnh gây hại nặng, mạ còi cọc, chết khô lá gây tình trạng thiếu mạ ở một số vùng trồng lúa [7]. 1.2.3.1. Triệu chứng của bệnh Bệnh có thể xuất hiện trên lá mầm, bẹ lá, lá và hạt. Khi hạt nhiễm bệnh nảy mầm, vết bệnh là các đốm nhỏ màu nâu trên lá mầm và các rễ non cũng có thể bị bệnh dưới dạng các vết đen nhạt. Vết bệnh ban đầu trên lá là các chấm nhỏ màu vàng, sau chuyển sang màu nâu nhạt và vết bệnh điển hình có hình bầu dục giống hạt vừng, có màu nâu non, xung quanh có vầng vàng. Đôi khi bệnh phát triển mạnh làm lá khô vàng và chết. Kích thước số lượng vết bệnh tùy thuộc vào thời tiết và giống. Trên các giống mẫn cảm vết bệnh lớn và nhiều, ngược lại trên các giống lúa chịu hoặc kháng vết bệnh nhỏ và ít. Vết bệnh trên bẹ lá đòng và trên vỏ hạt lúa có màu nâu không có hình dạng nhất định, khi bệnh nặng nấm có thể phát triển và bao phủ hoàn toàn bộ lớp vỏ hạt và xâm nhập vào nội nhũ [7]. 13
Đồ án tốt nghiệp 1.2.3.2. Nguyên nhân gây bệnh ❖ Nguồn gốc và phân loại Bệnh do nấm Bipolaris oryzae (Breda de Haan) Shoem. gây ra tên khác là Helminthosporium oryzae Breda de Haan thuộc nhóm Nấm Bất toàn, giai đoạn sinh sản hữu tính thuộc lớp Nấm Túi Ascomycetes có tên là Ophiobolus miyabeanus Ito and Kuribayashi. Phân loại khoa học của nấm B. oryzae được mô tả ở bảng 1.3 [7]. Bảng 1.3. Phân loại nấm B. oryzae [29] Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Ascomycota Lớp (Class) Dothideomycetes Bộ (Order) Pleosporales Họ (Family) Pleosporaceae Chi (Genus) Bipolaris Loài (Species) B. oryzae ❖ Đặc điểm hình thái và sinh lý Sợi nấm đa bào, phân nhánh, đường kính 4 – 8 µm màu nâu đến xám nhạt. Cành bào tử phân sinh mọc thành cụm, đa bào, phần gốc lớn hơn phần đỉnh cành và hơi gãy khúc. Bào tử phân sinh hình con nhộng thon dài thẳng hoặc hơi cong, hai đầu tròn có từ 3 – 11 ngăn ngang. Kích thước bào tử biến động từ 15 – 170 x 7 – 26 µm, phần gốc bào tử thon tròn. Trên môi trường nhân tạo bào tử nấm có màu xám đến hơn đen. Bào tử hữu tính ít gặp, bào tử hình sợi dài có từ 6 – 15 ngăn ngang, túi nằm trong quả thể và mỗi túi có 8 bào tử. Quả thể hình nậm màu vàng nhạt, có thể tìm thấy trong rơm rạ. Trên hạt giống mầm tồn tại trên vỏ hạt, ở mày hạt, giữa lớp mày và vỏ hạt đôi khi ở nội nhũ. Nấm sinh trưởng trong phạm vi nhiệt độ khá rộng. Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm sinh trưởng là 27 – 30oC, cho bào tử nảy mầm là 25 – 30oC trong điều kiện độ ẩm 60 – 100%. Bào tử hình thành từ 5 – 38oC, pH 4 – 10. Bào tử chết ở nhiệt độ 14
Đồ án tốt nghiệp 50 – 51oC, sợi nấm chết ở nhiệt độ 48 – 50oC trong 10 phút. Trong điều kiện thuận lợi nấm xâm nhập vào cây trong 4 giờ [7]. 1.2.3.3. Đặc điểm phát sinh, phát triển Nấm có thể tồn tại trên rơm rạ trong đất và sống sót trên hạt giống trong bảo quản dưới dạng bào tử hoặc sợi nấm tiềm sinh trong khoảng thời gian từ 2 – 3 năm. Nguồn bệnh đầu tiên thường từ hạt giống nhiễm bệnh, nấm gây bệnh trên chồi non và rễ làm giảm tỷ lệ nảy mầm khoảng 11 – 29% và giảm sức sống của cây con. Tỷ lệ bệnh truyền qua hạt giống trên các lô giống bị nhiễm bệnh có thể lên đến 59,4%. Trên đồng ruộng, bệnh lan truyền nhờ gió. Nấm có thể gây hại trên 23 loài cỏ dại một lá mầm. Bệnh gây hại chủ yếu trên các giống lúa dài ngày, thiếu dinh dưỡng và vào các thời kỳ khủng hoảng dinh dưỡng trong giai đoạn sinh trưởng của cây lúa (cuối mạ, lúa bị hạn, sau đẻ nhánh, đòn non). Mức độ thâm canh càng cao bệnh càng ít gây hại [10]. 1.2.3.4. Biện pháp phòng trừ Chủ yếu dùng biện pháp canh tác bao gồm các khâu: vệ sinh đồng ruộng, dọn sạch cỏ dại và tàn dư rơm rạ, cấy đúng thời vụ, bón phân đúng kỹ thuật, đảm bảo đủ nước cho lúa, luân canh và cải tạo đất. Đảm bảo cung cấp dầy đủ dinh dưỡng cho lúa là quan trọng nhất. Có thể dùng biện pháp xử lý giống bằng nước nóng 54oC trong 10 phút hoặc xử lý bằng thuốc diệt nấm. Trong trường hợp cần thiết có thể phun thuốc trừ nấm như: New Hinosan 30EC (1,2 l/ha); Kitazin 50EC (1 – 1,5 l/ha); Rovral 50WP (0,1 – 0,2%); Zineb 80 WP (1kg/ha) [10], [11]. 1.2.4. Bệnh khô vằn Bệnh khô vằn được phát hiện ở Nhật Bản (Miyake, 1910; Sawada, 1912) và một số nước khác (Reiking, 1918 và Palo, 1926). Là bệnh nghiêm trọng thứ hai sau bệnh đạo ôn và là loài bệnh gây hại chủ yếu trên lúa hè thu và lúa mùa [10], [11]. 15
Đồ án tốt nghiệp 1.2.4.1. Triệu chứng của bệnh Bệnh khô vằn gây hại chủ yếu ở một số bộ phận cây như bẹ lá, phiến lá và cổ bông. Các bẹ lá sát mặt nước hoặc bẹ lá già ở dưới gốc thường là nơi phát sinh bệnh đầu tiên. Vết bệnh ở bẹ lá lúc đầu là vết đốm hình bầu dục màu lục tối hoặc xám nhạt, sau lan rộng thành vết vằn da hổ, dạng đám mây. Khi bệnh nặng, cả bẹ và phần lá phía trên bị chết lụi. Vết bệnh ở lá tương tự như bẹ lá, thường vết lan rộng ra rất nhanh chiếm hết cả bề rộng phiến lá tạo ra từng mảng vân mây hoặc dạng vết vằn da hổ. Các lá già ở dưới hoặc lá sát mặt nước là nơi bệnh phát sinh trước sau đó lan lên các lá ở trên. Vết bệnh ở cổ bông thường là vết kéo dài bao quanh cổ bông, hai đầu vết bệnh có màu xám loang ra, phần giữa vết bệnh màu lục sẫm co tóp lại. Trên vết bệnh ở các vị trí gây hại đều xuất hiện hạch nấm màu nâu, hình tròn dẹt hoặc hình bầu dục nằm rải rác hoặc thành từng đám nhỏ trên vết bệnh. Hạch nấm rất dễ dàng rơi ra khỏi vết bệnh và nổi trên mặt nước ruộng [11]. 1.2.4.2. Nguyên nhân gây bệnh ❖ Nguồn gốc và phân loại Do nấm Rhizoctonia solani gây ra, thuộc bộ nấm trơ Mycelia sterilia, lớp nấm bất toàn Fungi imperfecti. Giai đoạn sinh sản hữu tính được gọi là Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk, thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, là nấm ký sinh không chuyên tính, có phổ ký chủ rộng. Phân loại khoa học của nấm R. solani được mô tả ở bảng 1.4 [11]. 16
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.4. Phân loại nấm R. solani [28] Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Basidiomycota Lớp (Class) Agaricomycetes Bộ (Order) Cantharellales Họ (Family) Ceratobasidiaceae Chi (Genus) Rhizoctonia Loài (Species) R. solani ❖ Đặc điểm hình thái và sinh lý Ở giai đoạn vô tính, nấm phát triển ở dạng sợi, tạo hạch. Sợi nấm khi còn non không màu, khi già chuyển sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu. Sợi nấm đa bào, có đường kính từ 8 – 13µm, phân nhánh tương đối thẳng góc, chỗ phân nhánh hơi thắt lại, và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). R. solani có 3 loại sợi nấm: sợi nấm bò (runner hyphae), sợi nấm phân nhánh (lobate hyphae) và các tế bào dạng chuỗi (moniloid cells) (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) [6], [11]. Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch. Đặc điểm của hạch rất hay thay đổi. Hạch nấm khi còn non có màu trắng nhưng khi về già có thể có màu nâu, nâu đen, nâu xám và trên vỏ có lông. Hạch nấm có hình dạng phức tạp, đôi khi hình cầu, đáy phẳng, bề mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Đường Hồng Dật, 1976). Đường kính hạch nấm từ 1 – 6 mm. Từng hạch nấm có thể liên kết lại với nhau tạo thành hạch nấm to. Hạch nấm khi còn non có thể chìm dưới nước nhưng khi già nổi lên do tế bào phía ngoài hạch trở nên rỗng (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) [2], [6]. Sợi nấm của R. solani có nhiều nhân (thông thường từ 4 đến 8 nhân) trong một tế bào. Điều này khác biệt với các nấm Rhizoctonia khác có đặc tính của sợi nấm tương tự Rhizoctonia solani, nhưng chỉ với 2 nhân trong tế bào và được gọi là binucleate Rhizoctonia. 17
Đồ án tốt nghiệp Sự sinh sản hữu tính của nấm tạo ra bào tử đảm. Thông thường có khoảng 4 bào tử đảm đơn bào được tạo thành khi môi trường trở nên ấm ướt và thuận lợi cho sự phát triển của nấm. Bào tử đảm phân tán theo gió và nảy mầm khi gặp môi trường ẩm ướt. Mỗi bào tử đảm có 1 nhân đơn và có hình trứng hoặc hình bầu dục. Thông thường không tìm thấy sự xuất hiện của bào tử đảm trên những mẫu cây bệnh. Nhiều phương pháp đã được phát triển nhằm tạo bào tử đảm trên mô kí chủ nhưng nó hình thành rất khó khăn. Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), nấm sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 28 – 32oC, ở nhiệt độ dưới 10oC và cao hơn 38oC nấm ngừng sinh trưởng. Hạch nấm hình thành nhiều ở nhiệt độ 30 – 32oC. Khi nhiệt độ quá thấp (12oC) và quá cao (40oC), nấm không hình thành hạch. Nấm có thể phát triển được trong phạm vi pH rộng từ 3,4 – 9,2; thích hợp nhất ở độ pH 6 – 7 [11]. Hạch nấm hình thành nhiều nhất ở ngoài ánh sáng và khi nhiệt độ môi trường giảm đột ngột. Các hạch nấm này nảy mầm ở nhiệt độ 16 – 30oC, nhiệt độ tối ưu 28 – 30oC. Ẩm độ tương đối 95 – 96% thích hợp cho hạch nấm nảy nầm. Hạch nấm có kích thước càng lớn, số lượng hạch càng nhiều thì độc tính càng cao. Hạch nấm có thể sống được 4 – 5 tháng trong đất khô, 7 tháng trong điều kiện ngập nước (Đường Hồng Dật, 1976) [2]. R. solani có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng (20 – 30oC) từ 6 – 12 tháng trong ống nghiệm chứa môi trường PDA (potato dextrose agar), PDYA (potato dextrose yeast extract agar) hoặc các vật liệu cây trồng tự nhiên. Nấm có thể tồn trữ trên môi trường hạt đậu khô đến 9 năm mà không làm mất tính độc. Tính độc của chúng bị mất trong vòng 2 – 3 tháng khi tồn trữ ở nhiệt độ từ 0 – 70oC. Nấm R. solani không đòi hỏi nhu cầu dinh dưỡng chuyên biệt, nó có thể phát triển tốt trên nhiều loại môi trường khác nhau. Hạch nấm thường hình thành sau 3 – 4 ngày nuôi cấy. Hạch nấm hình thành nhiều hay ít, có hình thành hay không phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, điều kiện ngoại cảnh cũng như phụ thuộc vào các nhóm nấm khác nhau. Hạch nấm thường mọc rải rác khắp đĩa, có loài mọc rời, cũng có loài mọc thành từng mảng liên kết với nhau. Tuy nhiên cũng có loài không hình 18
Đồ án tốt nghiệp thành hạch (Nguyễn Minh Nguyệt, 2003). Hạch nấm mọc trên môi trường nuôi cấy có kích thước lớn hơn so với hạch nấm mọc trên cây kí chủ tự nhiên. Nhìn chung, tốc độ phát triển của R. solani rất nhanh, tản nấm của chúng có thể phát triển trên toàn bộ đĩa petri 90 mm trong vòng 3 ngày [5]. 1.2.4.3. Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh Bệnh khô vằn phát sinh mạnh trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ cao. Nhiệt độ khoảng 24 – 32oC và ẩm độ bão hòa hoặc lượng mưa cao thì bệnh phát sinh phát triển mạnh, tốc độ lây lan nhanh. Bệnh thường phát sinh trước tiên ở các bẹ lá và lá già sát mặt nước hoặc ở dưới gốc. Tốc độ lây lan lên các lá phía trên phụ thuộc rất nhiều vào thời tiết mưa nhiều, lượng nước trên đồng ruộng quá cao, đặc biệt ở các vùng nước cấy quá dày. Sự phát triển của bệnh khô vằn ở thời kỳ đầu cây mạ đến đẻ nhánh có mức độ bệnh ít. Giai đoạn đòng trỗ đến chín sáp là thời kỳ nhiễm bệnh nặng. Ở miền Bắc nước ta, bệnh khô vằn gây hại trong vụ mùa lớn hơn ở vụ chiêm xuân. Sự phát sinh phát triển của bệnh có liên quan nhiều tới chế độ nước trên đồng ruộng và chế độ phân bón. Bón phân đạm nhiều, bón phân đạm tập trung thúc đòng bệnh sẽ phát sinh phát triển mạnh hơn. Bón nhiều lần cũng làm cho mức độ bị bệnh cao. Bón kali có tác dụng làm giảm mức độ nhiễm bệnh của cây. Nguồn bệnh chủ yếu là hạch nấm tồn tại ở trên đất ruộng, sợi nấm ở gốc rạ và lá bị bệnh còn sót lại sau khi thu hoạch. Hạch nấm có thể sống một thời gian dài sau thu hoạch lúa, thậm chí trong điều kiện ngập nước vẫn còn tới 30% số hạch giữ được sức sống, nảy mầm thành sợi và xâm nhiễm gây bệnh cho vụ sau. Quá trình xâm nhiễm lặp lại thường xảy ra qua tiếp xúc giữa hạch và bẹ lá lúa. Chỉ số của đợt gây bệnh lần đầu có liên quan mật thiết với số lượng tiếp xúc với cây, nhưng sự phát triển của bệnh sau khi tiếp xúc với ký chủ lại chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ, độ ẩm và tính mẫn cảm của cây ký chủ. Phản ứng của các giống lúa đều nằm trong phạm vi từ nhiễm nặng đến tương đối chống chịu. Chưa có giống lúa nào thể hiện đặc tính chống bệnh cao. Giống lúa Indica chống chịu bệnh tốt hơn giống lúa Japonica. 19
Đồ án tốt nghiệp Ở nước ta, hầu hết các giống lúa đại phương và giống nhập nội đều có mức độ nhiễm bệnh khô vằn từ trung bình đến nhiễm nặng. Một số ít các giống như KV10, JR9965, IF50, IR17494, OM80 có mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn so với các giống khác [11]. 1.2.4.4. Biện pháp phòng trừ Phòng trừ bệnh khô vằn chủ yếu là áp dụng các biện pháp tiêu diệt nguồn bệnh ở trong đất và quản lý kỹ thuật trồng trọt thâm canh thích hợp. Tiêu diệt nguồn bệnh ở trong đất tiến hành ngay sau khi thu hoạch, cày sâu để vùi lấp hạch nấm, phối hợp với các biện pháp gieo cấy đúng thời vụ, đảm bảo mật độ hợp lý, bón phân đúng tỷ lệ tránh bón tập trung đạm đón đòng, có thể phối hợp thêm kali với tro bếp để tăng cường tính chống bệnh của cây. Hệ thống tưới tiêu chủ động và không để mức nước quá cao trong trường hợp bệnh lây lan mạnh. Ngoài ra có thể dùng thuốc hóa học như Vida 3SC (Wida 5WP) = Validamycin A5% (1 l/ha); Bonanza 100 DD (0,4 l/ha); Tilt 250ND (0,3 – 0,5 l/ha); Anvil 5SC (50 – 100g a.i/ha); Roval 50WP (0,1 – 0,2 l/ha); Monceren 25WP (1 kg/ha) để phối hợp với các biện pháp canh tác kỹ thuật phòng trừ bệnh. Sử dụng thuốc hóa học phòng trừ bệnh chỉ đưa lại hiệu quả khi bệnh mới phát sinh ở những bẹ lá già và thuốc hóa học phải được phun tiếp xúc với tầng lá dưới của cây kết hợp với rút cạn nước trên đồng ruộng. Biện pháp sinh học như sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma để ức chế sự phát triển sợi nấm và hạch nấm khô vằn cũng có tác dụng phòng trừ bệnh, đảm bảo an toàn môi trường [10], [11]. 1.3. Định danh bằng sinh học phân tử 1.3.1. Phương pháp ly trích DNA Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải 20
Đồ án tốt nghiệp bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (deoxyribonuclease – DNase và ribonuclease – RNase). Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi theo từng môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc là những quần thể vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ gen hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết. Quá trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo. Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp [4]. Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên thường được sử dụng: Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): được xem là phương pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. Phương pháp ly trích sử dụng nồng độ muối cao (1,5 M NaCl) và ủ mẫu trong 2 – 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyltrimethylammonium bromide và proteinase K. Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phương pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích DNA cần phải có cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết. Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia 21
Đồ án tốt nghiệp nhiệt đến 65oC. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại kết quả khá cao. Phương pháp đóng băng và tan băng: Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đóng băng và tan băng ở - 65oC trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên [4]. 1.3.2. PCR trong định danh vi sinh vật 1.3.2.1. Kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được mô tả bởi Kary Mullis và các cộng sự (1983). Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen. PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược [3]. 22
Đồ án tốt nghiệp Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau: – Gây biến tính (denaturation) ở 90 – 95oC. Trong giai đoạn biến tính phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands). – Gắn primer (annealing) ở 40 – 65oC. Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các liên kết ion tạo thành một đoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu. – Kéo dài phân tử (extension) ở 70 – 72oC. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’ 3’ [3]. 1.3.2.2. Vùng trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer) Internal Transcribed Spacer (ITS) là vùng phiên mã bên trong, có rất nhiều sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của vi sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài [16]. Các mồi vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5,8S và 28S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Mồi ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8S của N. crassa, Szchiosaccharomyces prombe và S. cerevisiae, Viciafaba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28S của S. prombe, S. cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Mồi ITS5 có trình tự giống với rDNA 18S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách mồi ITS1 25bp. Trình tự đoạn mồi và bản đồ đoạn mồi vùng gen ITS được mô tả ở bảng 1.5 và hình 1.1. 23
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.5. Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS [33] ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G White và ctv, 1990 ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A Gardes và Bruns, 1993 ITS2 GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC White và ctv, 1990 ITS3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC White và ctv, 1990 ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC White và ctv, 1990 ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG Gardes và Bruns, 1993 ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G White và ctv, 1990 Hình 1.1. Bản đồ mồi vùng gen ITS [33] Đề tài này sử dụng cặp mồi ITS – F và ITS4 để phân tích di truyền và định danh các loài nấm đã phân lập. 1.3.2.3. Các ứng dụng của kỹ thuật PCR Kể từ khi ra đời, phương pháp PCR ảnh hưởng sâu sắc tới các nghiên cứu về sinh học phân tử. các ứng dụng tiêu biểu của PCR gồm: sản xuất mẫu dò dùng trong phương pháp lai phân tử, xác định trình tự nucleic acid, tạo đột biến điểm định hướng. ngoài ra, PCR còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như: Y học: chẩn đoán nhanh các bệnh có nguyên nhân là vi sinh vật mà không có khả năng mọc trên môi trường nuôi cấy hoặc chậm phát triển thông qua việc khuếch đại và phát hiện đoạn DNA đặc hiệu. Pháp y: dùng để thiết lập dấu vân tay DNA. 24
Đồ án tốt nghiệp Và gần đây nhất là sự đóng góp thiết thực trong việc giải mã bộ gen con người bằng kỹ thuật PCR. 1.4. Tái nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch Năm 1884, R. Koch đưa ra 4 nguyên tắc về tác nhân gây bệnh mà cho đến ngày nay vẫn còn được áp dụng là nguyên tắc chuẩn để chứng minh khả năng gây bệnh đặc trưng của một loài vi sinh vật nào đó. Các nguyên tắc đó là: – Tác nhân gây bệnh phải luôn được tìm thấy trên sinh vật bị nhiễm bệnh nhưng không có ở sinh vật khỏe. – Tác nhân gây bệnh phải được nuôi trong điều kiện thực nghiệm bên ngoài cơ thể sinh vật. – Tác nhân gây bệnh phải có khả năng gây bệnh khi gây nhiễm vào con vật mẫn cảm. – Tác nhân gây bệnh phải được xác định từ kết quả tái phân lập [32]. Để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, các loài cây mẫn cảm được trồng trong các điều kiện có kiểm soát và được cấy vi sinh vật nghi là gây bệnh. Việc lây bệnh nhân tạo có thể cung cấp thông tin để: Khẳng định một sinh vật được phân lập là tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch Xác định phổ ký chủ của tác nhân gây bệnh Đo độc tính các mẫu cấy khác nhau của tác nhân gây bệnh. Khi chọn lựa những cây khỏe mạnh để lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch, nên lưu ý dùng cùng một giống với cây bị bệnh mà từ đó tác nhân gây bệnh được phân lập. Như vậy các triệu chứng biểu hiện khi lây bệnh nhân tạo sẽ rất gần với các triệu chứng bệnh ban đầu ngoài tự nhiên – các giống cây trồng có thể có độ mẫn cảm khác nhau đáng kể đối với một tác nhân gây bệnh [1]. ❖ Các bước thực hiện quy tắc Koch – Mô tả các triệu chứng biểu hiện ở cây trồng bị bệnh. – Phân lập vi sinh vật có thể là tác nhân gây bệnh – các mẫu cấy giống nhau được phân lập từ các cây có triệu chứng giống nhau. 25
Đồ án tốt nghiệp – Dùng một mẫu cấy sạch đã được làm thuần để lây lên cây khỏe mạnh. – Quan sát các triệu chứng biểu hiện ở các cây đã được lây bệnh – triệu chứng phải giống như đã quan sát ban đầu trên cây trồng bị bệnh. – Phân lập lại tác nhân gây bệnh từ các bộ phận cây mới bị bệnh – mẫu cấy phải giống như mẫu cấy được làm thuần ban đầu. Các yếu tố cần được cân nhắc trong quá trình lây bệnh nhân tạo bao gồm: Nhiệt độ Quá ít hoặc quá nhiều nước Độ độc hoặc thiếu hụt chất dinh dưỡng Lượng nguồn bệnh trộn vào đất không thực tiễn (quá ít hoặc quá nhiều) Các điều kiện trồng nói chung. Luôn luôn bố trí công thức đối chứng (bao gồm các cây không được lây bệnh) trong các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo. Độ ẩm cao tạo điều kiện cho việc xâm nhiễm và lan truyền của nhiều bệnh. Phun sương hoặc để ẩm (bằng túi ny lông che phủ chậu trồng cây) có thể tạo một môi trường ẩm và làm tăng đáng tỷ lệ thành công của thí nghiệm lây bệnh nhân tạo. Không nên đặt các chậu trong tủ ẩm hoặc có ny lông che phủ trực tiếp dưới ánh nắng [1]. 26
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị ❖ Dụng cụ: – Đĩa petri – Đèn cồn – Ống nghiệm – Erlen – Que cấy – Dao – Ống đong – Lame, lamelle – Micropipet, pipetman – Đầu tip – Eppendorf. ❖ Thiết bị: – Cân phân tích (A&D HR – 200) – Nồi hấp khử trùng (TOMY ES – 315) – Máy vortex (GENIE) – Máy lắc – Bể ổn nhiệt (Cole Parmer BT – 15) – Máy ly tâm thường (Hettich Mikro 20), máy ly tâm lạnh (Hettich Mikro 220R) – Kính hiển vi quang học – Máy PCR (Sprint Thermo Cycler) – Máy điện di. 27
Đồ án tốt nghiệp 2.1.2. Nguồn mẫu Địa điểm thu mẫu: Các mẫu lúa bị nhiễm bệnh được thu tại đồng ruộng ở 2 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (Long An, Vĩnh Long) và huyện Hóc Môn, Tp.HCM. Thời gian thu mẫu: tháng 2 và 3 năm 2017. Bảo quản: Mẫu được giữ trong túi PE, được dán nhãn để phân biệt và để trong tủ mát khoảng 10oC. 2.1.3. Hóa chất 2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) bổ sung chloramphenicol 0,05%. Môi trường PDB (Potato Dextrose Broth). Thành phần môi trường được mô tả ở phụ lục A (trang 1). 2.1.3.2. Các hóa chất ly trích DNA Đệm CTAB (0,2M Tris – Cl pH 7,5; 2M NaCl; 0,05M EDTA; 2% CTAB) Polyphenol – Chloroform – Isoamyl alcohol P:C:I (25:24:1) Isopropanol Ethanol 70% 6X DNA Loading Dye TAE 1X (40mM Tris pH 7,6; 20mM acetic acid; 1mM EDTA) Agarose Ethidium bromide Thang DNA 1kb (HyperLadder 1kb). 2.1.3.3. Các hóa chất phản ứng PCR Nước khử ion. Master Mix (2x Mytaq HS Mix) o Mồi xuôi ITS1-F: TCCGTAGGTGAACCTGCGG (Tm = 49,7 C) o Mồi ngược ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC (Tm = 52,1 C) 28
Đồ án tốt nghiệp 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu mẫu Các mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh được thu nhận vào các tháng 2 và 3 năm 2017 tại các địa điểm: – Huyện Cần Giuộc và huyện Bến Lức tỉnh Long An. – Huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long. – Huyện Hóc Môn, Tp. HCM Mô tả đặc điểm bệnh trên lá: trên lá xuất hiện các vết bệnh nhỏ màu nâu, các vết bệnh lớn có màu nâu, tâm màu xám, nếu cây bị bệnh nặng các vết bệnh liên kết lại với nhau tạo thành mảng lớn và làm lá bị cháy khô. Mẫu được giữ trong túi PE, được dán nhãn để phân biệt và mang đến phòng thí nghiệm để phân lập nấm gây bệnh. 2.2.2. Phân lập và làm thuần nấm Nấm được phân lập và làm thuần tại phòng thí nghiệm phòng vi sinh, viện Sinh học nhiệt đới. Các thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Mẫu bệnh được cắt thành đoạn nhỏ, sau đó rửa bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần. Dùng bông thấm cồn 70o rửa nhẹ trên bề mặt mẫu trong 2 – 3s. Mẫu được cấy vào đĩa thạch môi trường PDA (bổ sung kháng sinh chloramphenicol). Các đĩa phân lập được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày để nấm phát triển, kích thích sự hình thành bào tử nấm. Theo dõi sự phát triển của hệ sợi nấm trên môi trường và tiến hành cấy chuyền để làm thuần. Kiểm tra tính thuần và giữ giống trong môi trường PDA thạch nghiêng ở 4oC. 2.2.3. Phương pháp phòng ẩm Chuẩn bị dụng cụ như lame, lamelle, đĩa petri có giấy lọc ở dưới, thanh thủy tinh chữ “U”, môi trường PDA và nước cất. Mang đi hấp khử trùng. Cách tiến hành: 29
Đồ án tốt nghiệp – Dùng pipetman hút môi trường và nhỏ vào lame sao cho môi trường trang mỏng khoảng 2/3 lame, để môi trường đông tự nhiên. – Dùng que cấy vòng ria tế bào nấm lên rồi đậy lamelle lại. – Nhỏ nước cất vô trùng cho thấm đều giấy, đậy nắp lại và ủ ở nhiệt độ phòng. – Quan sát dưới kính hiển vi. 2.2.4. Phương pháp bảo quản chủng nấm ❖ Phương pháp cấy truyền (bảo quản trong ống thạch nghiêng) Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng nấm được cấy trên môi trường thạch trong ống nghiệm và giữ trong 72 giờ ở nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển đạt đến độ cần thiết. Sau đó chủng nấm này được bảo quản ở 4 – 8oC, thông thường giống được bảo quản từ 3 – 6 tháng. Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng nấm luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Phương pháp này thường được sử dụng để bảo quản các chủng nấm đã phân lập được trong phòng thí nghiệm trong thời gian ngắn từ 3 – 6 tháng [25]. ❖ Phương pháp bảo quản lạnh sâu (-80oC) Vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu. Cách thực hiện như sau: – Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu. – Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO (chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh để không làm tế bào bị vỡ) đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng là 20% và mật độ tế bào là 106. – Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cân bằng áp suất. – Hoạt hóa mẫu: mẫu được hoạt hóa bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể. Tế bào có khả năng sống khoảng 95% [25]. 30
Đồ án tốt nghiệp 2.2.5. Định danh bằng sinh học phân tử (kỹ thuật PCR) Từ các mẫu phân lập, chọn những mẫu có đặc điểm hình thái tương tự các loài nấm gây bệnh trên lúa đã biết, đồng thời có khả năng gây tái nhiễm theo quy luật Koch để định danh bằng phương pháp sinh học phân tử và xác định danh pháp khoa học. 2.2.5.1. Ly trích DNA bằng phương pháp CTAB Nguyên tắc: thành tế bào bị phá vỡ bằng biện pháp cơ học và các chất tẩy mạnh. DNA được giải phóng và được kết tủa trong Ethanol và thu lại nhờ ly tâm. – Phá màng tế bào Bước 1: Cho tế bào nấm đã tăng sinh vào ống eppendorf (nghiền nhỏ), thêm 1ml nước cất vô trùng vào, mang đi ly tâm 10.000 rpm/15 phút. Bước 2: Sau khi ly tâm thu tủa bỏ dịch, cho 800µl đệm CTAB vào, vortex mạnh. Mang ủ ở bể điều nhiệt (60oC/1h). Bước 3: Ly tâm 13.000 rpm/15 phút, thu dịch (600µl) vào eppendorf mới, bỏ tủa. Loại bỏ protein Bước 4: Thêm vào thể tích P:C:I (25:24:1) tương đương với thể tích phần dịch lấy ra (600µl), trộn đều bằng cách lắc, ly tâm lạnh 14.000 rpm/10 phút/4oC. Có thể lặp lại 2 lần. Bước 5: Sau khi ly tâm thì hỗn hợp tách thành 3 lớp, cẩn thận hút lớp trên cùng cho vào eppendorf mới. Tủa DNA Bước 6: Tủa DNA bằng Isopropanol tỷ lệ 1:1 (hoặc Ethanol tỷ lệ 1:2,5), trộn đều. Ủ ở -80oC khoảng 30 phút (hoặc vài giờ). Bước 7: Ly tâm 14.000 rpm/15 phút/4oC, bỏ dịch thu tủa. Bước 8: Cho 1ml Ethanol 70% vào, ly tâm 14.000 rpm/15 phút/4oC. Sau khi ly tâm, bỏ dịch thu tủa và để khô tự nhiên. 31
Đồ án tốt nghiệp Bước 9: Sau khi Ethanol đã bay hơi hết, cho khoảng 50µl nước SHPT, bảo quản ở -4oC. Kiểm tra sự có mặt của DNA sau khi ly trích bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 % [13]. 2.2.5.2. Phản ứng PCR Tất cả các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho nấm. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung cho một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và điện di trên gel agarose [12]. 2.2.5.3. Dùng phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen ITS ❖ Thành phần phản ứng Master mix 9,5 µl ITS1F 1 µl ITS4 1 µl DNA 1 µl H2O 12,5 µl Tổng 25 µl ❖ Chu trình phản ứng PCR Bước 1: Biến tính DNA, 94oC trong 5 phút Bước 2: Gồm 35 chu kỳ 94oC trong 45 giây 58oC trong 50 giây 72oC trong 1 phút 32
Đồ án tốt nghiệp Bước 3: Kết thúc, 72oC trong 10 phút Bước 4: Bảo quản 4oC ❖ Kiểm tra kết quả PCR Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% Điều kiện điện di: 90 – 95V, trong 25 phút Chạy điện di trên gel agarose Nhuộm gel với dung dịch Ethidium Bromide trong 20 phút. Sau đó rửa lại bằng nước cất, quan sát dưới đèn UV và ghi nhận kết quả. Sản phẩm PCR vùng ITS với cặp mồi ITS1-F và ITS4 có kích thước 600 – 700 bp. 2.2.5.4. Giải trình tự gen và định danh Sản phẩm PCR vùng ITS được gửi đi giải trình tự gen tại Công ty CNSH Nam Khoa, địa chỉ: 793/58 Trần Xuân Soạn – Phường Tân Hưng, Quận 7 – Thành phố HCM – Việt Nam. Kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm DNAStar Lasergene 14.0 và Ngân hàng gen để định danh đến loài và xây dựng cây phát sinh loài. 2.2.6. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo Thử nghiệm về khả năng lây bệnh nhân tạo được tiến hành để xác nhận lại nguyên nhân gây bệnh. Bệnh có thể được tái tạo bằng cách cấy tác nhân gây bệnh lên bề mặt cây trồng theo cơ chế xâm nhiễm của tác nhân đó, hoặc bằng cách đưa mầm bệnh trực tiếp vào cây. ❖ Chuẩn bị dịch bào tử Dịch bào tử được thu nhận từ nấm đã nuôi cấy khoảng từ 14 ngày tuổi. Cho 10 ml nước cất đã hấp khử trùng vào đĩa PDA chứa mẫu nấm cần lây bệnh. Bào tử hòa cùng với nước được thu lại trong ống nghiệm vô trùng. Điểu chỉnh mật độ bào tử 1 x 106 /ml bằng buồng đếm hồng cầu. ❖ Lây bệnh lên lá 33
Đồ án tốt nghiệp Do nấm được phân lập từ mẫu lá luá bị bệnh cho nên tái nhiễm lên lá lúa. – Phun dịch bào tử lên lá cây được lây bệnh (hoặc nhỏ vài giọt dịch bào tử lên một số lá). – Phun nước vô trùng lên lá cây dùng làm đối chứng (hoặc nhỏ vài giọt nước vô trùng lên một số lá). – Đặt chậu trong tủ ẩm hoặc che bằng túi ny lông trong nhà lưới, tránh ánh nắng trực tiếp. – Kiểm tra và so sánh những cây được lây bệnh với những cây đối chứng. Quan sát và ghi nhận các triệu chứng và so sánh những triệu chứng này với các triệu chứng đã quan sát được trên đồng ruộng. Sau khi lây bệnh lên lá, ủ cây ở nhiệt độ 25oC – 28oC, độ ẩm 100% trong vòng 72 giờ dưới bóng tối để bào tử xâm nhập vào cây. Các cây phun nước cất vô trùng được dùng làm đối chứng [1]. ❖ Phân lập lại nấm sau khi tái nhiễm Việc phân lập lại được thực hiện từ cây đã được phun dịch bào tử nấm để lây bệnh. Các bước phân lập giống như đã mô tả ở mục 2.2.2. Nấm được phân lập trên môi trường PDA đến khi thuần. 34
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả phân lập và làm thuần nấm bệnh 3.1.1. Kết quả thu nhận mẫu lá bị bệnh Mẫu được thu thập từ đồng ruộng ở 2 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (Long An, Vĩnh Long) và huyện Hóc Môn, Tp.HCM, vào các tháng 2 và 3 năm 2017. Các mẫu được thu thập tập trung vào nhóm bệnh cháy lá. Tổng cộng thu thập được 4 mẫu (hình 3.1) và được ký hiệu như bảng 3.1. Bảng 3.1. Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu tại đồng ruộng STT Địa điểm Thời gian Ký hiệu Mô tả 1 Cần Giuộc, Long An 2/2017 CG Vết bệnh là các đốm nhỏ hình tròn, màu nâu vàng ở rìa, ở giữa có màu trắng xám. 2 Bến Lức, Long An 2/1017 BL Vết bệnh dài, hình thoi, rìa màu nâu đậm. 3 Vũng Liêm, Vĩnh 3/2017 VL Vết bệnh nhỏ, dài, ở rìa có Long màu nâu, tâm có màu trắng xám. 4 Hóc Môn, Tp.HCM 3/2017 HM Vết bệnh là các đốm tròn hoặc dài hình thoi, xuất hiện nhiều, rìa màu nâu, tâm có màu trắng xám. 35
Đồ án tốt nghiệp a b c d e Hình 3.1. Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được trên đồng ruộng a, Cần Giuộc; b, Bến Lức; c, Vũng Liêm; d và e, Hóc Môn Nấm gây ra bệnh ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây lúa. Trên lá lúa dễ bị bệnh, vết bệnh ban đầu xuất hiện như là các chấm màu xám hoặc nâu, nâu vàng dọc theo rìa lá. Sau đó, chúng biến thành các đốm hình elip dài và có hình thoi với đầu nhọn. Những đốm này trở nên hoại tử, ở giữa có màu nâu hoặc nâu đỏ. Những chỗ này lan ra và hình thành các vết thương lớn hơn. Trên thân, nấm tạo ra các vết thương dài, xám đến đen. Bệnh cũng xuất hiện trên các hạt giống lúa như dạng hình thoi màu nâu (hình 3.1). 3.1.2. Kết quả phân lập, làm thuần và quan sát hình thái Các mẫu lá lúa bị bệnh được thu nhận và phân lập trên môi trường PDA bổ sung thêm kháng sinh chloramphenicol. 36
Đồ án tốt nghiệp Từ các mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh, phân lập, làm thuần và chọn lọc được 10 chủng nấm ký hiệu lần lượt là CG1, CG2, CG3, BL1, BL2, BL3, VL1, VL2, HM1, HM2. 3.1.2.1. Hình thái chủng nấm thu được ở Cần Giuộc Từ mẫu lá lúa thu nhiễm bệnh thu được ở Cần Giuộc, phân lập được 3 chủng lần lượt là CG1, CG2 và CG3. Các chủng được mô tả hình thái và quan sát bào tử dưới kính hiển vi. a b c d Hình 3.2. Chủng nấm CG1 a, mặt trước; b, mặt sau; c, khuẩn ty; d, bào tử (vật kính 100X) Chủng nấm CG1 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung chloramphenicol (hình 3.2a và b) ở nhiệt độ 25 - 30oC trong 7 ngày mọc nhanh, có kích thước khuẩn lạc 90 mm, sợi nấm màu nâu đen dạng nhung mịn, bào tử màu nâu đen, mặt trước và mặt sau đều cùng màu nâu sậm. 37
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào hình ảnh sự hình thành sợi khuẩn ty và bào tử (hình 3.2c và d; vật kính 100X) quan sát được của chủng CG1 cho thấy sợi nấm có dạng phân nhánh, cuống bào tử đính hình thành cấu trúc bó sợi và bào tử hơi cong với một đỉnh nhọn, có hình lưỡi cày, có 2 – 3 vách ngăn, màu nâu, phân đốt. a b c Hình 3.3. Chủng nấm CG2 a, mặt trước; b, mặt sau; c, bào tử (vật kính 40X) Chủng nấm CG2 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm chloramphenicol (hình 3.3a và b) ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày mọc nhanh, có kích thước khuẩn lạc là 30 – 35 mm, sợi nấm màu xám nâu dạng nhung mịn, bào tử màu nâu đậm, mặt trước màu nâu xám xung quanh có tơ trắng và mặt sau có màu nâu đậm rìa màu trắng xám. Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.3c; vật kính 40X) quan sát được của chủng CG2 bào tử có hình tròn, dạng chuỗi, màu nâu nhạt. 38
Đồ án tốt nghiệp a b Hình 3.4. Chủng nấm CG3 a, mặt trước; b, bào tử (vật kính 100X) Chủng nấm CG3 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm chloramphenicol (hình 3.4a) ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày mọc nhanh, có kích thước khuẩn lạc là 90 mm, sợi nấm màu trắng, không có bào tử, mặt trước và mặt sau có cùng màu trắng vàng. Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.4b; vật kính 100X) của chủng CG3 cho thấy bào tử trong suốt, dài, hơi cong hình lưỡi liềm, có nhiều vách ngăn, phân đốt, nhọn ở hai đầu. 3.1.2.2. Hình thái chủng nấm thu được ở Bến Lức Từ mẫu lá lúa nhiễm bệnh thu được ở Bến Lức, phân lập được 3 chủng lần lượt là BL1, BL2 và BL3. Các chủng được mô tả hình thái và quan sát bào tử dưới kính hiển vi. a b 39
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Chủng nấm BL1 a, mặt trước; b, bào tử (vật kính 100X) Chủng nấm BL1 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung chloramphenicol (hình 3.5a) ở nhiệt độ 25 – 30oC trong 7 ngày mọc nhanh, có kích thước khuẩn lạc 80 – 85 mm, sợi nấm màu xanh xám dạng nhung mịn, rìa có màu trắng xám, bào tử cùng màu với tơ nấm. Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.5b; vật kính 100X) quan sát được của chủng BL1 bào tử hơi dài, hình bầu dục, có 2 – 3 vách ngăn, màu nâu, phân đốt, ở giữa vách ngăn có nhân. a b 3 Hình 3.6. Chủng nấm BL2 a, mặt trước; b, bào tử (vật kính 100X) Chủng nấm BL2 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm chloramphenicol (hình 3.6a) ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày mọc nhanh, khuẩn lạc có kích thước nhỏ, riêng lẻ, không có tơ nấm, bào tử màu xanh nhạt, mặt trước có màu xanh hơi vàng. Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.6b; vật kính 100X) của chủng BL2 cho thấy bào tử nhỏ, không có hình dạng xác định, không có vách ngăn đặc trưng. 40
Đồ án tốt nghiệp a b Hình 3.7. Chủng nấm BL3 a, mặt trước; b, bào tử (vật kính 100X) Chủng nấm BL3 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm chloramphenicol (hình 3.7a) ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày mọc nhanh, có kích thước khuẩn lạc là 90 mm, sợi nấm màu trắng hơi vàng, mặt trước có màu trắng vàng. Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.7b; vật kính 100X) của chủng BL3 cho thấy bào tử nhỏ, đính trên cuống bào tử, màu nâu đen, hơi dài, không có hình dạng xác định, hai đầu tròn. 3.1.2.3. Hình thái chủng nấm thu được ở Vũng Liêm Từ mẫu lá lúa nhiễm bệnh thu được ở Vũng Liêm, phân lập được 2 chủng lần lượt là VL1, và VL2. Các chủng được mô tả hình thái và quan sát bào tử dưới kính hiển vi. 41
Đồ án tốt nghiệp a b VL1 Hình 3.8. Chủng nấm VL1 a, mặt trước; b, bào tử (vật kính 100X) Chủng nấm VL1 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm chloramphenicol (hình 3.8a) ở nhiệt độ 22 – 26oC trong 3 ngày có kích thước khuẩn lạc là 30 – 35 mm, sợi nấm màu xanh đậm, ở rìa có màu trắng xám, xung quanh có màu nâu đỏ. Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.8b; vật kính 100X) của chủng VL1 cho thấy bào tử nhỏ, có dạng hình tròn, màu nâu đen. Dựa vào đặc điểm hình thái quan sát được từ khuẩn lạc và bào tử. a b Hình 3.9. Chủng nấm VL2 a, mặt trước; b, bào tử (vật kính 100X) 42
Đồ án tốt nghiệp Chủng nấm VL2 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm chloramphenicol (hình 3.9a) ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày mọc nhanh, khuẩn lạc có kích thước nhỏ và mọc riêng lẻ, bào tử màu xanh đậm, xung quanh có tơ nấm màu trắng, mặt trước có màu xanh đậm, xung quanh có viền màu trắng. Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.9b; vật kính 100X) của chủng VL2 cho thấy bào tử nhỏ, màu nâu nhạt, hơi dài, có nhiều vách ngăn, đính trên cuống bào tử. 3.1.2.4. Hình thái chủng nấm thu được ở Hóc Môn Từ mẫu lá lúa thu được ở Hóc Môn, phân lập được 2 chủng lần lượt là HM1, và HM2. Các chủng được mô tả hình thái và quan sát bào tử dưới kính hiển vi. a b HM1 Hình 3.10. Chủng nấm HM1 a, mặt trước; b, bào tử (vật kính 100X) Chủng nấm HM1 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm chloramphenicol (hình 3.10a) ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày mọc nhanh, khuẩn lạc có kích thước khoảng 25 – 30 cm, có màu trắng xám, xung quanh có viền trắng, bào tử có màu xanh đậm. Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.10b) của chủng HM1 cho thấy bào tử nhỏ, hình bầu dục, hai đầu hơi nhọn, màu nâu nhạt. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và bào tử. 43
Đồ án tốt nghiệp a b Hình 3.11. Chủng nấm HM2 a: mặt trước; b: bào tử (vật kính 100X) Chủng nấm HM2 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm chloramphenicol (hình 3.11a) ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày mọc nhanh, khuẩn lạc có kích thước trung bình, mọc không đều xung quanh đĩa, bào tử màu xanh đậm, không có tơ nấm xung quanh, mặt trước có màu xanh đậm. Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.11b; vật kính 100X) của chủng HM2 cho thấy bào tử nhỏ, màu nâu đậm, hơi tròn, đính trên cuống bào tử. Qua các kết quả sơ bộ về hình thái học khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử của các chủng nấm gây bệnh được phân lập từ lá lúa bị nhiễm bệnh, từ 10 chủng nấm chọn ngẫu nhiên 3 chủng nấm ở Cần Giuộc, Bến Lức và Vũng Liêm để tiếp tục định danh ở mức độ phân tử dựa vào vùng gen ITS với cặp mồi ITS1 – F và ITS4. 3.2. Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS Từ 10 chủng nầm phân lập được, bước đầu chọn 3 chủng nấm CG1, BL1, VL1 để tăng sinh trong môi trường PDB, thu sinh khối và sau đó tiến hành quá trình ly trích và thu nhận DNA bộ gen. Quá trình định danh bao gồm các bước tách chiết DNA, khuếch đại đoạn DNA bằng phản ứng PCR, điện di kiểm tra sản phẩm PCR, giải trình tự gen và so sánh đoạn trình tự với trình tự gen của các loài cơ sở dữ liệu ngân hàng gen NCBI. 44
Đồ án tốt nghiệp Sau khi ly trích và thu nhận DNA bộ gen, chúng tôi tiếp tục sử dụng sản phẩm đã ly trích dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen dựa vào vùng trình tự ITS. Đoạn gen được nhân bản dựa vào vùng trình tự ITS của các chủng nấm CG1, BL1, VL1 với cặp mồi ITS1 – F và ITS4 bằng kĩ thuật PCR. Sản phẩm đã PCR dựa vào vùng trình tự ITS được điện di trên gel agarose 1,5% để kiểm tra sự hiện diện của DNA (Hình 3.12). 1 2 3 4 1 2 3 4 700bp 600bp a b Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm ly trích và PCR a, Kết quả ly trích; b, Kết quả PCR 1: CG1; 2: BL1; 3: VL1; 4: Thang 1kb Từ hình 3.12 cho thấy kết quả điện di của sản phẩm PCR đều có các vạch nằm tương đương ở vị trí khoảng 600 – 700 bp. Sản phẩm sau khi PCR đã được khuếch đại thành công vùng gen ITS. Sau đó, sản phẩm này được gửi đến công ty CNSH Nam Khoa để giải trình tự. 3.3. Kết quả so sánh vùng gen ITS Sau khi gửi sản phẩm đã PCR để giải trình tự DNA tại công ty CNSH Nam Khoa thì kết quả được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng như phần mềm DNAStar Lasergene 14.0 và Ngân hàng gen 45
Đồ án tốt nghiệp Kết quả trình tự của các chủng nấm CG1, BL1 và VL1 sau khi gửi đi giải trình tự. >CG1 CTGCGGAGGGATCATTACACAATAAAATATGAAGGCTGTACGCGGCTGTGCTCTCGGGCCAGTT TTGCGGAGGCTGAATTATTTATTACCCTTGTCTTTTGCGCACTTGTTGTTTCCTGGGCGGGTTCGC CCGCCACCAGGACCACATCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAAT GTAAATCATTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA AATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCG CCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTG TTGGGCGTTTTTTGTCTTTGGTTGCCAAAGACTCGCCTTAAAAGGATTGGCAGCCGGCCTACTGG TTTCGCAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAAAGAGGACGGCAATCCATCAAGACT CCTTCTCACGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCG GAGGAA. >BL1 GGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACACAATAAAATATGAAGGCTGTACGCGGCTGTGCTCTCGG GCCAGTTTTGCGGAGGCTGAATTATTTATTACCCTTGTCTTTTGCGCACTTGTTGTTTCCTGGGCG GGTTCGCCCGCCACCAGGACCACATCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTAT AACAAATGTAAATCATTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAAC GCAGCGAAATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA CATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTG CTTGGTGTTGGGCGTTTTTTGTCTTTGGTTGCCAAAGACTCGCCTTAAAAGGATTGGCAGCCGGC CTACTGGTTTCGCAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAAAGAGGACGGCAATCCAT CAAGACTCCTTCTCACGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATC. >VL1 CTGCGGAAGGATCATTACTGAGTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGAATAC CTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCA TGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCT CTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA GTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCG AGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGG CCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGA CTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAG GTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT. Tiến hành so sánh vùng gen của các mẫu phân lập được với vùng gen bảo tồn ITS của các chủng nấm sợi trên ngân hàng gen NCBI, các đặc điểm hình thái học của các chủng tương đồng và có được kết quả như sau: 46
Đồ án tốt nghiệp Chủng nấm CG1 có mối quan hệ gần nhất với loài Curvularia lunata strain QRF374, Cochliobolus lunatus strain xsd08005 có độ tương đồng là 100%; Curvularia sp. isolate XI33 và Cochliobolus lunatus sp. wcy01 có mức tương đồng là 99%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng nấm CG1 là loài Curvularia lunata. Curvularia lunata có khuẩn lạc màu xám mọc lan ra trên môi trường CMX và màu đen trên đĩa đối chứng. Tốc độ tăng trưởng của C. lunata là 3,61 ± 0,3 cm/ngày. Bào tử có dạng hình thoi, hơi cong và có ba vách ngăn. Cả hai đầu tế bào có dạng trong suốt. Kích thước của bào tử dao động trong khoảng từ 17,75 – 23,29 µm x 6,25 – 8,75 µm. Curvularia lunata là nấm gây bệnh trên lúa và gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp Châu Á và Châu Phi [20]. Chủng nấm BL1 có mối quan hệ gần nhất với loài Curvularia lunata strain AN 2, Curvularia sp. isolate XI41, Curvularia hominis, Cochliobolus lunatus strain xsd08005 có độ tương đồng là 100%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng nấm BL1 thuộc chi Curvularia sp. Curvularia sp. phát triển rất nhanh, tơ nấm mịn, có khuẩn lạc màu trắng sau chuyển sang màu nâu xanh ở mặt trước và mặt sau. Tơ nấm phân nhánh, thường có màu nâu. Cuống bào tử đính có màu nâu, thẳng, đơn lẻ hoặc thành phân nhánh, cong gập. Bào tử có dạng hình thoi hoặc hình elip, cong, màu nâu, thường có 3 – 4 vách ngăn ngang [31]. Chủng nấm VL1 có mối quan hệ gần nhất với loài Aspergillus versicolor, Aspergillus sydowii strain OUCMBI110121, Aspergillus sp. BAB-2568, Aspergillus carneus strain xsd08017 có độ tương đồng là 100%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng nấm VL1 là loài Aspergillus versicolor. Khuẩn lạc chủng Aspergillus versicolor mọc khá chậm từ 3 – 5 ngày, phát triển tối ưu ở 35oC. Khuẩn lạc đa dạng màu sắc như: xanh nhạt, xanh xám, xanh hồng hoặc xanh đậm (tùy thuộc từng loại môi trường). Cuống bào tử đính trơn mịn (200 – 500 µm x 4 – 7 µm), phân nhánh. Bào tử hình cầu (tròn), kích thước 2 – 3,5 µm, vách tế bào có hình dáng gồ ghề. Hầu hết các chủng Aspergillus versicolor 47
Đồ án tốt nghiệp được phân lập từ những nơi ẩm ướt trong nhà, có khả năng sinh độc tố. Bệnh nốt sần do A. versicolor gây ra chủ yếu ở người 60 tuổi và có liên quan đến móng chân cái. Là tác nhân gây bệnh ở người, nó có thể được xem như là một mầm bệnh gây ra mụn nhọt ở móng chân. Các biện pháp xử lý thông thường không có hiệu quả. Chưa có báo cáo nào về nấm A. versicolor gây bệnh trên thực vật [15], [19], [30]. Dựa vào đặc điểm mô tả hình thái và phân tích di truyền dựa vào vùng gen ITS ta có thể kết luận định danh 3 chủng nấm được phân lập từ mẫu lá lúa bị bệnh cháy lá như sau: – Chủng nấm CG1 được xác định là loài Curvularia lunata với độ tương đồng 100%. – Chủng nấm BL1 được xác định thuộc chi Curvularia sp. với độ tương đồng là 100%. Cả hai chủng nấm này đều gây bệnh đốm nâu trên lúa, làm giảm năng suất lúa. – Chủng nấm VL1 được xác định là loài Aspergillus versicolor với độ tương đồng là 100%. A. versicolor có khả năng gây bệnh trên người, nhưng chưa có báo cáo nào về việc gây bệnh trên thực vật. 3.4. Kết quả tái nhiễm theo quy tắc Koch Trong 3 chủng nấm đã định danh thì có hai chủng có khả năng gây bệnh trên lúa là chủng CG1 và BL1, chủng CG1 là C. lunata được chọn ra và tiến hành thí nghiệm tái nhiễm trên cây lúa. Chủng VL1 là A. versicolor không được chọn vì hiện tại chưa có báo cáo nào khẳng định về khả năng gây bệnh trên thực vật của nó. Bào tử được pha loãng đến 102 và được xác định bằng phương pháp đếm trong buồng đếm hồng cầu. ❖ Kết quả thí nghiệm trên lúa Mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm được bọc trong túi ny lông trong 72 giờ (không có ánh sáng chiếu trực tiếp vào cây). 48
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.13. Mẫu lúa đối chứng (phun nước cất) a b Hình 3.14. Mẫu lúa thí nghiệm (phun dịch bào tử ở nồng độ 106 tế bào/ml) a và b, vết bệnh trên bề mặt lá lúa sau 72 giờ. Mẫu đối chứng được phun nước cất, không có hiện tượng (hình 3.13). Đối với mẫu thí nghiệm được phun dịch bào tử ở nồng độ 106 tế bào/ml, sau 72 giờ, ở điều kiện nhiệt độ và ánh sáng thích hợp, quan sát thấy trên lá lúa xuất hiện các đốm nhỏ màu nâu (hình 3.14a và b), vết bệnh tương tự như vết bệnh đã quan sát được trên đồng ruộng. Tiếp theo tiến hành phân lập lại từ lá lúa có vết bệnh từ mẫu thí nghiệm. 49
Đồ án tốt nghiệp a b Hình 3.15. Chủng nấm phân lập từ thí nghiệm tái nhiễm a, mặt trước đĩa petri; b, bào tử (vật kính 100X). Mẫu nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA bổ sung chloramphenicol trong vòng 5 ngày, ở nhiệt độ 25 – 30oC. Đường kính khuẩn lạc đạt khoảng 70 mm, tơ nấm có màu đen, bào tử cùng màu đen (hình 3.15a). Giống với hình thái đã quan sát được của chủng CG1. Bào tử hơi dài, hình bầu dục, có 2 – 3 vách ngăn, màu nâu, phân đốt, ở giữa vách ngăn có nhân (hình 3.15b; vật kính 100X). Mẫu nấm CG1 đã phân lập được từ lá lúa nhiễm bệnh ở Cần Giuộc được định danh là loài Curvularia lunata có khả năng gây bệnh trên lá lúa. Thí nghiệm tái nhiễm theo quy tắc Koch thành công. 50
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Từ 4 mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh đã phân lập, làm thuần được 10 chủng nấm có khả năng gây bệnh trên lá lúa. Định danh được 3 chủng nấm CG1, BL1 và VL1 dựa vào vùng bảo tồn ITS trong đó chủng CG1 có mức độ tương đồng với loài Curvularia lunata là 100%; chủng BL1 có mức độ tương đồng với chi Curvularia sp. là 100%; chủng VL1 có mức độ tương đồng với loài Aspergillus versicolor là 100%. Kết quả tái nhiễm theo quy tắc Koch của chủng nấm CG1 (Curvularia lunata) cho thấy chủng có khả năng xâm nhiễm và gây bệnh trên lá lúa. 4.2. Kiến nghị Định danh đến loài và tiến hành khảo sát khả năng tái nhiễm của các chủng nấm đã phân lập được còn lại. Thu mẫu ở nhiều vùng khác để có đánh giá tổng quan hơn về tình hình nấm bệnh trên lúa. Từ đó đề xuất các biện pháp phòng trừ nấm bệnh trên phạm vi lớn. 51
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]. Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan Thúy Hiền (2009). Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam. Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210 pp. ACIAR: Canberra. [2]. Đường Hồng Dật (1976). Sổ tay bệnh hại cây trồng tập 1, NXB Nông thôn, Việt Nam. [3]. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003). Sinh học phân tử, NXB Giáo dục. [4]. Nguyễn Hữu Trí (2010). Bài giảng sinh học phân tử, Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM, TP. HCM. [5]. Nguyễn Minh Nguyệt (2003). Khảo sát một số đặc tính của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ cây bông (Gossypium sp.) và cây bắp (Zae may L.), Luận văn tốt nghiệp, Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM, TP. HCM. [6]. Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005). Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau, Luận văn tốt nghiệp, Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM, TP. HCM. [7]. Nguyễn Văn Hoan (2006). Cẩm nang cây lúa, NXB Lao động, Hà Nội. [8]. Trần Văn Đạt (2005). Sản xuất lúa gạo thế giới: Hiện trạng và khuynh hướng phát triển trong thế kỷ 21, NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh. [9]. Trần Văn Minh (2004) (Chủ biên), Giáo trình cây lương thực, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. [10]. Vũ Triệu Mân (2007). Giáo trình bệnh cây chuyên khoa, NXB Hà Nội, Hà Nội. [11]. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1998). Giáo trình bệnh cây Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội. Tài liệu nước ngoài 52
Đồ án tốt nghiệp [12]. AHFS Drug Information 2006 (2006 ed.). American Society of Health System Pharmacists. [13]. Alexandra W. (2009). DNA Extraction - CTAB Method, Worden Lab. [14]. Chang T. T., Vaughan D. A. (1991). Manual of operations and procedures of the International genebank, IRRI. [15]. Engelhart S., Loock A., Skutlarek D., Sagunski H., Lommel A., Färber H. and Exner M. (Aug 2002). “Occurrence of toxigenic Aspergillus versicolor isolates and sterigmatocystin in carpet dust from damp indoor environments”. Appl Environ Microbiol.; 68(8): 3886 – 3890. [16]. Guarro J., Gené J., and Stchigel A. M., (1999). Developments in fungal taxonomy. Clin. Microbiol. Rev. Vol. 12, No. 3, p. 454 – 500. [17]. Jason P. L., Yu C. C., Kuo H. H., Tzen Y. C. and Barbara A. S. (2006), "Phylogeography of Asian wild rice, Oryza rufipogon, reveals multiple independent domestications of cultivated rice, Oryza sativa", Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 103 No. 25: 9578 – 9583. [18]. Jianxin M. and Bennetzen J. L. (2004), Rapid recent growth and divergence of rice nuclear genomes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 12404 – 12410. [19]. J.M. Torres-Rodriguez, N. Madrenys-Brunet, M. Siddat, O. Lopez- Jordra and T. Jimenez (1998). Aspergillus versicolor as cause of onychomycosis: report of 12 cases and susceptibility testing to antifungal drugs. J. Eur. Acad. Dermatol. Venerol. 11: 25 – 31. [20]. Nor A. K., Madihah M. Z. A., Shahrizim Z., Mohd T. Y. and Nur A. I. M. Z. (2015). Morphological and molecular characterization of Curvularia and related species associated with leaf spot disease of rice in Peninsular Malaysia, Rendiconti Lincei. Scienze Fisiche e Naturali. [21]. Tang J. B., Xia H. A., Cao M. L., Zhang X. Q. and Zeng W. Y. (2004), A comparison of rice chloroplast genomes, Plant Physiol.135: 412 – 420. 53
Đồ án tốt nghiệp [22]. Vaughan D. A. (1994), The wild relative of rice – A genetic resources handbook, IRRI. p. 3 – 5. [23]. Vitte C., Ishii T., Lamy F., Brar D. and Panaud O. (2004), Genomic paleontology provides evidence for two distinct origins of Asian rice (Oryza sativa L.), Mol. Gen. Genomics 272: 504 – 511. [24]. Zhu Q., Zheng X., Luo J., Gaut BS. and Ge S. (2007), Multilocus analysis of nucleotide variation of Oryza sativa and its wild relatives: severe bottleneck during domestication of rice, Mol. Biol. Evol., 24: 857 – 888. Tài liệu Internet [25]. ảng-kỹ-thuật-thực- phẩm-3/ [26]. [27]. [28]. [29]. [30]. versicolor.html [31]. [32]. ch [33]. mers.pdf 54
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường  Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) Dịch chiết khoai tây 200 g Dextrose 20 g Agar 20g Chloramphenicol 0,05 g Nước cất 1 L  Môi trường PDB (Potato Dextrose Broth) Dịch chiết khoai tây 200 g Dextrose 20 g Nước cất 1 L  CTAB buffer CTAB (10% in H2O) 5M NaCl 0.5M EDTA (pH 8.0) 1M Tris – HCl (pH 8.0) β - Mercaptoethanol H2O 1
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: So sánh trình tự tương đồng của các đoạn gene trên NCBI Chủng CG1, BL1 và VL1 2
Đồ án tốt nghiệp 3
Đồ án tốt nghiệp 4
Đồ án tốt nghiệp 5
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: Kết quả trình tự vùng gen bảo tồn ITS Chủng CG1 6
Đồ án tốt nghiệp Chủng BL1 7
Đồ án tốt nghiệp Chủng VL1 8