›

Đồ án Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot

pdf 98 trang thiennha21 13/04/2022 4750
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_san_xuat_che_pham_probiotic_chiu_nhiet_su_d.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC CHỊU NHIỆT SỬ DỤNG TRONG THỨC ĂN CHO CHĂN NUÔI HEO, GÀ QUY MÔ PILOT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Phạm Huỳnh Ninh Sinh viên thực hiện : Trần Lệ Quyên MSSV: 1311100608 Lớp: 13DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực Sinh viên thực hiện Trần Lệ Quyên
  3. LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp tốt nghiệp ở Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn thành tốt đồ án này. Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến: Em xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả những người thân trong gia đình đã nuôi em khuôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi điều kiện cho em được học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp . Ngôi trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó suốt bốn năm qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh nghiệm trong cuộc sống. Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, các Thầy Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã trang bị cho em những kiến thức cơ bản, làm nền móng để em thực hiện đề tài và làm tốt công việc sau này. TS. Phạm Huỳnh Ninh, Phó bộ môn Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đề tài tại đây, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ cho em trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp Chị Lê Hoàng Bảo Vi, anh Vũ Minh, anh Lê Quang Trí phòng Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án Cô Nguyễn Hoài Hương, phòng vi sinh, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài
  4. MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v DANH MỤC HÌNH ẢNH vii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Đại cương về probiotic 3 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic 3 1.1.2 Định nghĩa probiotic 4 1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp 4 1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic 7 1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic 8 1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi 11 1.1.7 Probiotic từ bào tử 12 1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng Probiotic trên thế giới và Việt Nam 13 1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus 18 1.2.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus 18 1.2.2 Bào tử Bacillus 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 25 2.2 Vật liệu 25 2.2.1 Chủng vi sinh vật: . 25 2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ . . 25 2.3 Môi trường nghiên cứu 26 2.4 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát) 30 2.5 Phương pháp nhuộm Gram 31 i
  5. 2.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton .32 2.7 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 32 2.7.1 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang .33 2.7.2 Lập đường cong tăng trưởng 34 2.7.3 Khảo sát sự tạo thành bào tử 35 2.8 Khảo sát các đặc điểm probiotic .35 2.8.1 Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày 35 2.8.2 Khảo sát khả năng chịu muối mật 36 2.8.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào . 37 2.8.4 Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak .40 2.8.5 Khảo sát môi trường tạo bào tử .40 2.8.6 Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất .41 2.8.7 Sản xuất bào tử dạng pilot .42 2.8.8 Phân tích thống kê dữ liệu .44 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .45 3.1 Khảo sát các đặc điểm probiotic 45 3.1.1 Khả năng chịu axit dạ dày 45 3.1.2 Khả năng chịu muối mật 46 3.1.3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào ( amylase, protease, cellulase) . 48 3.1.4 Khả năng đối kháng kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak . 51 3.2 Đặc tính sinh học và phân loại chủng đã tuyển chọn 53 3.2.1 Đặc tính hình thái của chủng Sub và Yoi 53 3.2.2 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi 54 3.3 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Sub .54 3.3.1 Thiết lập đường chuẩn 54 ii
  6. 3.3.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng .56 3.4 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Yoi .56 3.4.1 Thiết lập đường chuẩn 56 3.4.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng .58 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành bào tử của các chủng Sub và Yoi 58 3.6 Kết quả khảo sát các điều kiện tạo bào tử tốt nhất 59 3.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot 61 3.7.1 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô pilot . 61 3.7.2 Tiến hành tạo bào tử 62 3.8 Tạo chế phẩm 64 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 65 4.1 Kết luận . .65 4.2 Kiến nghị . 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC . 74 Phụ lục I: Bảng biểu . .74 Phụ lục II: Hình ảnh . .85 iii
  7. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT KL Khuẩn lạc MT Môi trường N Mật độ tế bào TB Tế bào TN Thí nghiệm VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật iv
  8. DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường 17 Bảng 1.2. Các đặc điểm khác nhau của tế bào sinh dưỡng và bào tử 23 Bảng 3.1. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn vi khuẩn trong môi trường pH thấp 45 Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường muối mật 2% 47 Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus 49 Bảng 3.4. Hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus với vi khuẩn kiểm định 51 Bảng 3.5. Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi 54 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Sub 55 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Yoi 57 Bảng 3.8. Tỷ lệ hình thành bào tử ở các khoảng thời gian khác nhau với quy mô pilot 63 Bảng 5.1. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường pH thấp 74 Bảng 5.2. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường muối mật 2% 75 Bảng 5.3. Số liệu đường chuẩn của chủng Sub 76 Bảng 5.4. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng Sub 77 Bảng 5.5. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Sub 78 Bảng 5.6. Số liệu đường chuẩn chủng Yoi 79 Bảng 5.7. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng Yoi 80 Bảng 5.8. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Yoi 81 v
  9. Bảng 5.9. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào và bào tử của các chủng Sub 82 Bảng 5.10. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào và bào tử của các chủng Yoi 82 Bảng 5.11. Tỷ lệ hình thành bào tử qua 7 môi trường của 2 chủng Sub và Yoi. .83 Bảng 5.12. Mật độ bào tử của các phương pháp tạo bào tử tốt ở các khoảng thời gian khảo sát khác nhau 83 Bảng 5.13. Tỷ lệ hình thành bào tử theo thời gian của các phương pháp khác nhau 84 Bảng 5.14. Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô pilot 85 Bảng 5.15. Kết quả khảo sát mật độ bào tử theo thời gian với quy mô piot 86 vi
  10. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật 9 Hình 1.2. Các cấu trúc chính của bào tử B. Subtilis 23 Hình 1.3. Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacilllus .24 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30 Hình 3.1. Vòng phân giải gelatin (protease), tinh bột (amylase), cellulose (cellulase) của các chủng Bacillus 50 Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định của các chủng Bacillu .52 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Sub 53 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Yoi .53 Hình 3.5. Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Sub . 55 Hình 3.6. Đường cong tăng trưởng chủng Sub theo thời gian 56 Hình 3.7. Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Yoi . .57 Hình 3.8. Đường cong tăng trưởng chủng Yoi theo thời gian 58 Hình 3.9. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng Sub và Yoi 59 Hình 3.10. Tỷ lệ hình thành bào tử bằng các phương pháp khác nhau theo thời gian của chủng Bacillus subtilis .60 Hình 3.11. Mật độ tế bào với quy mô pilot của chủng Bacillus subtilis 61 Hình 5.1. Máy ly tâm Avanti JXN Series .87 Hình 5.2. Chế phẩm thử nghiệm bào tử Bacillus subtilis 87 Hình 5.3. Hệ thống lên men 5 L .88 vii
  11. LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Khí hậu Việt Nam nóng ẩm theo mùa, thời tiết thay đổi thường xuyên, nhiệt độ không ổn định là môi trường lí tưởng để vi khuẩn gây bệnh bùng phát ở các chuồng trại chăn nuôi. Ngành chăn nuôi gặp rất nhiều vấn đề về bệnh tật xuất phát từ đường ruột và hệ tiêu hóa. Theo thống kê hằng năm, tỷ lệ gia súc và gia cầm chết do mắc bệnh đường ruột lớn nhất so với nguyên nhân gây bênh khác. Không chỉ vậy, trong chăn nuôi còn tồn tại các vấn đề khác như lạm dụng kháng sinh và chất tăng trọng gây tác hại đối với người sử dụng, lãng phí thức ăn do vật nuôi không hấp thụ hết thức ăn, dinh dưỡng. Vì vậy, để giải quyết được những vấn đề trên đồng thời có thể nâng cao năng suất hiệu quả kinh tế cho bà con nông dân, Probiotic là một giải pháp hiệu quả nhất hiện nay. Các tác dụng cơ bản của probiotic là tăng cường khả năng miễn dịch, chống lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh vị trí bám dính và dinh dưỡng của vi khuẩn có hại trong hệ tiêu hóa. Một lượng lớn các sản phẩm probiotic được sản xuất hay nhập khẩu, phân phối và sử dụng trong chăn nuôi. Các chế phẩm này chủ yếu chứa các vi khuẩn sống thuộc các giống Bacillus, Lactobacillus, Enteroccocus, nấm men. Số lượng và chủng loại chế phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam hiện nay rất đa dạng. Tuy nhiên, không phải chế phẩm nào cũng đạt chuẩn và phù hợp với môi trường, khí hậu, điều kiện chăn nuôi Việt Nam. Một chế phẩm probiotic đạt hiệu quả ở một quốc gia nông nghiệp tiên tiến nhưng có thể hoàn toàn không hiệu quả ở một quốc gia nông nghiệp đang phát triển như Việt Nam. Nguyên nhân lớn nhất xuất phát từ hệ sinh thái vi sinh từng nơi. Hiện nay, trong công nghiệp chế biến thức ăn dạng viên thì nguyên liệu thức ăn sẽ được xử lý ở nhiệt độ từ 70 - 80oC, có khi lên đến 90oC nhằm kiểm soát nguy cơ về nhiễm khuẩn, ví dụ như Salmonella (Jones và cộng sự, 2004; Doyle và cộng sự, 2006) 1
  12. cũng như để hồ hóa tinh bột. Quá trình xử lý nhiệt làm giảm đáng kể số lượng vi sinh vật probiotic trong chế phẩm (chứa các tế bào sinh dưỡng). Vì vậy để đảm bảo cung cấp đủ lượng vi sinh vật probiotic trong thức ăn viên thì cần phải chọn ra một chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic và có khả năng chịu được nhiệt độ cao. Bào tử vi khuẩn probiotic thuộc chi Bacillus được xem là một giải pháp thích hợp cho vấn đề sử dụng trong thức ăn ép viên cho chăn nuôi gia súc và gia cầm. Bào tử Bacillus khá bền nhiệt, tính kháng axit cao hơn so với tế bào sinh dưỡng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy bào tử Bacillus nảy mầm và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật nuôi khoảng 70 - 90%. Ở Việt Nam, hiện có rất ít các nghiên cứu về việc sử dụng bào tử của các chủng Bacillus bổ sung vào thức ăn cho động vật, hoặc là chưa được quan tâm thực hiện hoặc đã thực hiện nhưng không công bố, nếu có cũng rất hạn chế về số lượng các nghiên cứu. Từ hiện trạng nghiên cứu và sản xuất probiotic như trên cho thấy, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử Bacillus ở quy mô pilot là một yêu cầu cấp thiết nhằm tiến tới sản xuất ở quy mô công nghiệp, đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của ngành chăn nuôi an toàn và góp phần hạn chế nhập khẩu, chủ động nguồn sản phẩm và làm giảm giá thành sản phẩm. Đây là cơ sở cho việc thực hiện khóa luận “ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot”. Mục đích đề tài Sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn Bacillus với quy mô pilot Nhiệm vụ của đề tài Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có đặc tính probiotic tốt Khảo sát điều kiện tạo bào tử trong điều kiện lên men lỏng Sản xuất bào tử Bacillus dạng pilot (5 lít ) Tạo chế phẩm Probiotic 2
  13. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về probiotic 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh [53]. Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908) [53]. Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [37]. Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [38]. Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được [37]. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80 [38]. 3
  14. Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi. 1.1.2 Định nghĩa probiotic Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” [26]. Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ” [26]; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”. 1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp Chế phẩm probiotic là một tập hợp các chủng VSV có ích. Đó là các TB sống của các chủng VSV, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp chất sinh học có tác dụng đến đời sống cây trồng, vật nuôi, cải thiện MT, đồng thời cũng có tác dụng dương tính đối với sức khỏe con người khi đưa chế phẩm này vào đường ruột [12]. Chế phẩm probiotic thường gồm các nhóm VSV sau: Các nhóm VSV cơ bản: Nhóm VK lactic [17]: Đây là nhóm VK thân thuộc với con người từ ngàn xưa. Trong tự nhiên, chúng phân bố rất rộng rãi, thường gặp nhiều trong các sản phẩm muối chua như dưa chua, cà 4
  15. muối, mắm chua, sữa chua Ngoài khả năng sinh axit lactic do lên men đồng hình và dị hình, VK lactic còn có thể sinh hàng loạt chất có hoạt tính kháng sinh được gọi chung là bacterioxin gồm nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxindin, lactolin, brevin, Các chất này được dùng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, trong chăn nuôi với vai trò là chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong việc phòng và trị các bệnh đường tiêu hóa cho người và vật nuôi. Các chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng VK lactic sau: L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L. sporogenes, Bifidobacterium, Bifidus bacteria, S. faecalis [24]. Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng 1 chủng VSV như chế phẩm Antibio của Hàn Quốc (100% là L. acidophilus) hay Biosubtyl của Đà Lạt (100% là bào tử B. subtilis) hoặc kết hợp nhiều chủng VSV như chế phẩm Emina thuộc Viện Sinh học Nông nghiệp Hà Nội (ngoài VK lactic còn có VK Bacillus, VK quang dưỡng khử H2S và nấm men ) [17]. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng: các VK lactic có một vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Nhờ khả năng sản sinh ra axit lactic, axit pyruvic, tổng hợp vitamin nhóm B, sản sinh enzyme nên có tác dụng ức chế VSV đường ruột, cải thiện tăng trưởng và sức đề kháng của vật chủ Nhóm VK Bacillus Các VK Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào tử, sống hiếu khí tùy tiện nhưng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Chúng phân bố phổ biến trong tự nhiên. Một số loài của giống này còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người và động vật. Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ như protein, tinh bột, cellulose nhờ khả năng sinh enzyme ngoại bào khá mạnh như: amylase, cellulase, protease [17]. 5
  16. Ngoài các enzyme trên, các VK này còn có khả năng sinh bacterioxin-chất có hoạt tính kháng sinh có khả năng ức chế một số VSV gây bệnh đường ruột đặc biệt là E. coli, đồng thời giúp kích thích tiêu hóa và tăng trọng ở vật nuôi. Trong chế phẩm probiotic, người ta thường sử dụng các chủng thuộc giống Bacillus sau: B. subtilis, B. mesentericus, B. megathericum, B. licheniformis, B. clausii, [8, 17]. Các chủng này rất có ích, không gây bệnh cho người và vật nuôi. Nấm men Saccharomyces: Nhóm này được con người biết đến từ rất lâu và được sử dụng trong nghề làm bánh mì, nấu rượu, làm bia, ủ rượu vang Trong thành phần của TB nấm men rất giàu protein, vitamin nhóm B và khoáng chất nên thường được bổ sung vào chế phẩm probiotic để làm giàu sinh khối TB [17]. Chúng còn hấp thu và bài thải độc tố ra ngoài, tham gia chuyển hóa glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản [14, 20]. Ngoài ra, TB nấm men có trong chế phẩm còn tạo mùi thơm, giúp cải thiện mùi cho MT và nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật nuôi. Để sản xuất probiotic, người ta thường dùng các chủng sau: S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. vini hoặc S. pombe [13], đặc biệt là S. boulardii. S. boulardii có tác động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp, ngừa tiêu chảy do kháng sinh và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori [10]. Nấm mốc: Điển hình là Asp. oryzae, Asp. niger. Trong chế phẩm probiotic, chúng có vai trò sản sinh các enzym amylase, protease, cellulase, nhằm tăng cường khả năng tiêu hóa thức ăn của con người và vật nuôi, đồng thời cũng có thể được bổ sung vào chế phẩm để hỗ trợ quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ do thức ăn thừa hay phân do vật nuôi bài tiết ra [17]. Ngoài ra, còn một số nhóm VSV khác cũng được bổ sung vào chế phẩm probiotic giúp cải thiện MT nước nuôi trồng thủy sản, tăng khả năng làm sạch ao hồ, 6
  17. giảm hoặc mất mùi hôi thối do H2S như: VK nitrat (Nitrobacter và Nitrosomonas), VK quang dưỡng khử H2S, VK tía có lưu huỳnh và VK tía không chứa lưu huỳnh (Rhodobacter sp., Rhodospirillum, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas palustris ) [17] 1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật probiotic với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa vật chủ. Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau: - Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày: Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chịu được áp lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được sử dụng làm probiotic phải chịu được pH thấp ít nhất 90 phút, tiếp đến chúng phải gắn vào biểu mô ruột và phát triển được trong ruột trước khi phát huy vai trò đối với vật chủ. Vì vậy, đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu, là một trong những tiêu chí quan trọng khi sàng lọc, tuyển chọn các chủng probiotic [10]. - Khả năng chịu muối mật: Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Do vậy, khi thức ăn cùng với VSV probiotic từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột, tại đây, chúng sẽ chịu tác động của muối mật. Khả năng sống sót của các chủng VSV sau tác dụng của muối mật là một trong những đặc tính quan trọng của VSV được sử dụng làm probiotic [10, 21, 23]. Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của động vật dao động 1 – 3 % [50]. Để tồn tại 7
  18. và phát triển, các chủng probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2% - Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Một số chủng probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh enzym tiêu hoá như: amylase, cenlulase và protease, lipase và phytase có vai trò làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ - Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trong phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Salmonella và Staphylococcus aureus. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như: + Sản sinh ra các chất Bacteriocin. + Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic. + Tạo ra H2O2. + Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau. + Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt. + Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh. - Khả năng sinh enzyme ngoại bào: 1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic Đã có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic, song vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau. Sau đây là tóm tắt những kiểu tác động của probiotic được nhiều nhà khoa học chấp nhận [9, 24, 26]. Cơ chế tác động của probiotic được tóm tắt như sau [9, 27] 8
  19. Cải thiện sức khỏe và năng suất Cải thiện sự cân bằng Giảm thiểu sự sản sinh hệ VK dạ dày – ruột nhóm amin độc hại Tăng độ hữu dụng của chất dinh dưỡng Cải thiện sự hấp thu Phân giải các chất dinh dưỡng như protein, Cạnh tranh với Vi sinh vật có lợi Tổng hợp VK gây bệnh vitamin đường ruột Sản xuất axit hữu cơ Sản xuất kháng Ức chế sự phát sinh triển của VK gây Làm giảm pH bệnh Kích thích miễn dịch Trung hòa các độc tố đường ruột Hình 1.1 Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật - Probiotic giúp duy trì hệ VSV có lợi trong đường ruột bằng hoạt động đối kháng với VSV gây bệnh [28]. Đối kháng là hiện tượng một loài VSV bằng cách này hay cách khác ức chế hoặc tiêu diệt sự ST và phát triển của một loài VSV khác. Một số nhà khoa học cho 9
  20. rằng, cơ chế tác động đối kháng xảy ra khi nguồn thức ăn cạn kiệt do sự phát triển nhanh chóng của một vài loại VSV và tạo điều kiện bất lợi cho sự phát triển của VSV khác Hoạt động đối kháng với VSV gây bệnh bao gồm: Cạnh tranh về vị trí bám dính trên nhung mao ruột để tranh giành chất dinh dưỡng và khối lượng các chất được sinh ra. Khi VSV gây bệnh bị cạnh tranh, thiếu chất dinh dưỡng nên không thể sinh trưởng và phát triển được. Từ đó có thể ức chế hoặc tiêu diệt VSV gây bệnh, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột. Phương pháp sử dụng probiotic để loại trừ các VK có hại bằng quá trình cạnh tranh tốt hơn nhiều so với phương pháp sử dụng kháng sinh [24] Ngoài khả năng gia tăng về số lượng để cạnh tranh vị trí bám với VSV gây bệnh, VSV probiotic còn có thể tác động nhờ khả năng sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn như: kháng sinh, bacterioxin, axit hữu cơ, H2O2, ethanol, Những chất này được sinh ra trong quá trình sống của VSV, có khả năng tiêu diệt có chọn lọc các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột [17, 20]. - Gia tăng lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa: probiotic kích thích tính thèm ăn, làm tăng tích lũy mỡ, nitrogen, Ca, P, Cu, Mn, tiết các enzyme tiêu hóa như amylase, cellulase, lipase, protease giúp phân giải các chất dinh dưỡng phức tạp thành chất đơn giản dễ hấp thụ. - Tổng hợp vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, B12, làm giảm hoạt tính urease trong ruột non, ngăn chặn tổng hợp những amin độc, giảm nồng độ NH3 trong phân gia súc, gia cầm, do đó có ảnh hưởng tốt đối với MT [17]. - Kích thích hệ thống miễn dịch: yếu tố được xác định có vai trò kích thích hệ thống miễn dịch là thành phần của vách TB vi khuẩn (peptidoglycan). Sự phân hủy peptidoglycan tạo ra chất muramyl peptid có tác dụng kích thích hoạt động của đại thực bào (Tannock, 1997). Saarela và cộng sự (2000) cho rằng khả năng bám vào niêm mạc ruột của probiotic tạo nên sự tương tác giúp probiotic tiếp xúc với hệ thống 10
  21. lympho bào đường ruột và hệ thống miễn dịch, nhờ đó thúc đẩy hiệu quả miễn dịch và tạo nên sự ổn định của hàng rào bảo vệ ruột [24]. Tóm lại, probiotic được xem là sản phẩm hữu hiệu cho việc phòng ngừa và điều trị bệnh tiêu chảy ở vật nuôi nhờ cơ chế cạnh tranh và đối kháng với VSV gây bệnh, sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ Tuy nhiên, lợi ích của nó chỉ thể hiện rõ khi vật nuôi có sức khỏe kém, stress hoặc có sự xáo trộn hệ VSV đường ruột [4]. 1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi [17] Probiotic có tác dụng tốt đối với vật nuôi như gia súc, gia cầm, thủy cầm, thủy sản. Cụ thể như sau: - Probiotic giúp phát triển hệ VSV đường ruột bình thường, tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng từ các loại thức ăn. Đối với gia súc dạ cỏ, probiotic còn giúp hệ VSV dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn. - Ức chế và có thể tiêu diệt được các VSV có hại. Làm tăng sức đề kháng và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi đối với vật nuôi, phòng chống các dịch bệnh thường gặp, nhất là bệnh phân trắng ở heo con do E. coli. Nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và cộng sự (2002) về tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm EM1 (do Nhật Bản sản xuất) cho thấy: chế phẩm này có tác dụng ức chế E. coli, Salmonella, Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium perfringens, Sarcina lutea. Sau khi dùng chế phẩm EM1 trộn với thức ăn cho heo (khoảng 109 cfu /kg thức ăn), kết quả kiểm tra số lượng E. coli trong 1g phân heo đã giảm 7% ở heo từ 1 - 21 ngày tuổi, giảm 5,3% ở heo từ 22 - 60 ngày tuổi [24]. - Làm cho gia súc, gia cầm cái mắn đẻ hơn, tăng chất lượng thịt và tăng năng suất chăn nuôi [17]. Lã Văn Kính (1998) đã tổng hợp các công trình nghiên cứu của các tác giả nước ngoài khi sử dụng các chế phẩm probiotic trên gà đẻ và gà thịt với kết quả như sau: Đối với gà đẻ, sản lượng trứng tăng 5% ở mức bổ sung 100mg probiotic/kg thức ăn (Mohal 11
  22. và ctv, 1995). Khi bổ sung hỗn hợp L. acidophilus và L. casei (khoảng 106 cfu /kg thức ăn) đã cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ số chuyển hóa thức ăn và chất lượng lòng trắng (Tortuero và Fernandez, 1995). Đối với gà thịt, tăng trọng cao và tiêu tốn thức ăn thấp hơn đối chứng. Đặc biệt là hiệu quả sử dụng thức ăn đã cải thiện 2% khi bổ sung hỗn hợp L. acidophilus và S. faecium (2 x 109 cfu /kg thức ăn) cho gà thịt. [9] - Góp phần cải thiện chất lượng nước, chống ô nhiễm MT nước, tăng cường khả năng phân hủy các chất hữu cơ, giảm nồng độ N và P, kích thích sinh trưởng của tảo, giảm nguy cơ mắc bệnh và tăng năng suất tôm, cá, [3, 27, 28]. Chẳng hạn như sử dụng chế phẩm chứa B. subtilis, B. licheniformis, B. polymixa, B. circulans, B. laterosporus đã làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn và thúc đẩy tăng trưởng của ấu trùng cá tầm Acipenser nudiventris [59]. - Đặc biệt, dùng chế phẩm probiotic hòa vào thức ăn hay nước uống cho vật nuôi sẽ làm giảm hoặc làm mất mùi hôi thối gây ô nhiễm chuồng trại chăn nuôi. Có thể dùng dạng dịch pha loãng phun trực tiếp lên cơ thể vật nuôi như chó, lợn sẽ mất mùi thối, phun trực tiếp vào bầu vú con cái khi cho con bú sẽ tránh bị nhiễm khuẩn có hại [17]. Tóm lại, probiotic đã trở thành sản phẩm hữu hiệu, là bạn đồng hành của người chăn nuôi, giúp người chăn nuôi tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi [1, 8] . 1.1.7 Probiotic từ bào tử Probiotic từ bào tử đang ngày càng được dùng rộng rãi dưới dạng thực phẩm bổ sung cho người và động vật dưới dạng các chất thúc đẩy sinh trưởng và cạnh tranh với vi khuẩn có hại; trong thủy sản để thúc đẩy sự tăng trưởng của tôm, cá; và dùng để phòng ngừa bệnh tật. Hiện nay không chỉ ở nước ngoài mà ở tại Việt Nam, nhiều sản phẩm probiotic Bacillus đã được cấp phép làm thực phẩm chức năng. Các loài được nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis.[41] 12
  23. Các ưu điểm của probiotic từ bào tử: - Sản phẩm probiotic dạng bào tử có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng ở điều kiện khô mà không bị ảnh hưởng đến độ sống. - Bào tử có thể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH axit của dịch vị dạ dày [30,54], trong khi phần lớn các Lactobacillus ở dạng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt [58]. Một liều lượng nhất định của bào tử có thể được bảo quản vô thời hạn không cần để trong tủ lạnh và toàn bộ bào tử trong liều dùng đó sẽ được đi vào ruột để phát triển thành vi khuẩn sống và phát huy tác dụng. - Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bào tử vi khuẩn, các loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B. clausii, B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis với nhiều dạng bào chế và số lượng bào tử khác nhau. 1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic từ các chủng Bacilllus trong chăn nuôi gia súc và gia cầm trên thế giới và Việt Nam Với đặc điểm sinh lý, sinh hóa ưu việt, Bacillus là một nguồn gen phong phú, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong công nghiệp thực phẩm, trong lĩnh vực CNSH, trong lĩnh vực y học Đặc biệt là trong chăn nuôi, con người đã sử dụng Bacillus một cách hiệu quả trong việc tạo ra nhiều chế phẩm probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnh đường tiêu hóa ở gia súc, gia cầm 1.1.8.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế giới Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura từ B. subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Asp. Flavus, Asp. Paraciticus. Nghiên cứu này được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi. Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc dạng lỏng chứa B. subtilis chủng IP 5832, đến năm 1955 có thêm dạng bột và viên nang mềm. Năm 1962, Guy Albot còn 13
  24. phát hiện B. subtilis có tác dụng tốt trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn tính. Còn khi trộn thêm với VK lactic, B. subtilis chữa chứng loạn khuẩn rất hiệu quả ở người và vật nuôi. Tại Nhật Bản, với chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M. (Effective Microorganisms) trong đó có Bacillus, do GS.TS. TeRuo Higa, Trường Đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản nghiên cứu năm 1980. Chế phẩm này được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng như bảo vệ môi trường và đã mang lại hiệu quả khả quan. Cho đến nay, đây là chế phẩm được hơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á, Thái bình Dương trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam. Năm 1999, Kyriakis và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của probiotic LSP 122 đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy trên heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí nghiệm này được tiến hành trên 4 lô: Lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng B. toyoi với liều 106 cfu/kg thức ăn, lô 3 và 4 sử dụng B. licheniformis với liều 106 và 107 cfu/kg thức ăn. Kết quả cho thấy các lô thí nghiệm (2, 3 và 4) đều có tỷ lệ tiêu chảy và tình trạng tiêu chảy ít nghiêm trọng hơn so với lô đối chứng. Ngoài ra, sự tăng trọng và tiêu tốn thức ăn cũng cải thiện hơn so với lô đối chứng. Trong đó, lô sử dụng 107 cfu B. licheniformis/kg thức ăn cho kết quả tốt nhất. Năm 2001, Lema và cộng sự đã dùng probiotic trộn với thức ăn cho cừu ăn liên tục trong 7 ngày với liều 6 x 106 cfu/kg thức ăn để khảo sát sự bài thải của E.coli O157:H7. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự bài thải E. coli trong phân thấp hơn so với đối chứng không sử dụng probiotic trộn với thức ăn. 1.1.8.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt Nam Năm 1962, yaourt và canh trùng subtilis được Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hưng dùng để phòng và trị bệnh phân trắng ở heo con, bước đầu cho kết quả khả quan [5]. 14
  25. Năm 1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyễn Văn Hùng đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm B. subtilis dạng viên, nuôi cấy trên MT đậu tương, cua đồng, hấp thu bằng tinh bột tan. Chế phẩm này dùng cho heo uống với liều 0,5 - 1g/kg thể trọng. Kết quả sau khi sử dụng chế phẩm, heo tăng trọng nhanh. Năm 1979-1984, Phan Thanh Phượng và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Biolactyl để phòng và trị bệnh đường ruột ở heo. Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm Coli- subtyl (E.coli và B. subtilis) đã làm giảm tỷ lệ tái phát tiêu chảy ở heo so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt. Năm 1996, Lê Thị Tài sử dụng Biseptol và Biosubtyl kết hợp với Cloramphenicol trong điều trị loạn khuẩn đường ruột ở heo con và chó con. Kết quả ghi nhận được như sau: trên heo con sau cai sữa, tỷ lệ khỏi bệnh khi dùng Biseptol là 80%, Cloramphenicol là 70%, Biosubtyl là 68%, Biseptol + Biosubtyl là 98% và Biosubtyl + Cloramphenicol là 95 %; còn trên chó con, sử dụng Biseptol cho tỷ lệ khỏi bệnh là 80%, Biseptol + Biosubtyl là 95% và Cloramphenicol là 80%. Năm 1998, Lã Văn Kính đã thử nghiệm probiotic trên gà đẻ cho kết quả sản lượng tăng 5% so với đối chứng không sử dụng probiotic. Năm 1999, Lưu Thị Uyên sử dụng chế phẩm EM (Effective Microorganisms) của Nhật Bản trong phòng ngừa và điều trị hội chứng tiêu chảy ở heo, cho thấy số lượng E.coli trong 1g phân giảm từ 31,1 đến 80,95 triệu vi khuẩn. Năm 2001, Lê Thị Phượng ghi nhận hiệu quả phòng ngừa tiêu chảy ở heo con của các chế phẩm sinh học Paciflor (thành phần 100% bào tử Bacillus CIP*, 109 cfu/g) và Pacicoli (thành phần 100% bào tử Bacillus CIP*, 109 cfu/g + các kháng sinh: Colistin 4mg + Lincomycin 3mg). Chế phẩm Paciflor bổ sung trong thức ăn heo nái mang thai giai đoạn cuối và liên tục 28 ngày sau khi sinh đã làm giảm số lượng E. coli trong phân heo nái và heo con, giảm tỷ lệ tiêu chảy của heo con theo mẹ; heo con ăn 15
  26. thức ăn có bổ sung Paciflor hoặc Pacicoli thì số lượng E. coli trong phân giảm, giảm tỷ lệ tiêu chảy và cải thiện tăng trọng heo. Cũng trong năm 2001 này, Phan Ngọc Kính sử dụng chế phẩm EM trong chăn nuôi heo thịt cho thấy chênh lệch tăng trọng so với đối chứng tăng từ 20 - 34%, tỷ lệ thịt xẻ tăng 1,3%, tỷ lệ nạc tăng 4,5%. Năm 2002, Nguyễn Thị Minh Chiến bổ sung probiotic cho heo con theo mẹ với liều 0,8, 1,0 và 1,2 tỷ cfu /kg thức ăn cho kết quả khả quan trong việc làm giảm tỷ lệ tiêu chảy, tỷ lệ chết và nâng cao tăng trọng heo con lúc cai sữa. Cũng trong năm 2002 này, Tạ Thị Vịnh và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm VITOM 1.1 và VITOM 3 (do Nga sản xuất, chứa B. subtilis chủng VKPMV- 7092-) để phòng, trị bệnh đường tiêu hóa trên heo và gà. Qua đó nhận thấy khi dùng VITOM 3 tăng trọng trên heo tăng 6%, tỷ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỷ lệ khỏi bệnh đạt 100% và không có tái phát, còn khi dùng VITOM 1.1 tăng trọng trên gà tăng 11,8%, tỷ lệ khỏi bệnh đạt 99%. Năm 2003, Nguyễn Như Pho và Trần Thị Thu Thủy đã nghiên cứu sử dụng probiotic (Oganic Green) trong việc phòng ngừa tiêu chảy do E. coli trên heo con sau cai sữa đã cho kết quả làm giảm số lượng E. coli thải qua phân, giảm tỷ lệ tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn. Năm 2009, Trần Quốc Việt và cộng sự thuộc Viện Chăn nuôi Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất probiotic và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi. Kết quả đã tìm ra 2 quy trình sản xuất và 2 chế phẩm probiotic làm tăng sinh trưởng vật nuôi 10%, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn 10%, hạn chế 15% tỷ lệ bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi. Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường: 16
  27. Bảng 1.1: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường Vi sinh vật sử dụng và mật độ (cfu/g) Sản phẩm Nước sản xuất Vi khuẩn Lactic Bacillus Nấm men BioGuard Việt Nam 107 E.lac Hàn Quốc 2 x 107 4 x 107 BioSix Việt Nam 105 105 Lactacids Việt Nam 107 Adepro Việt Nam 107 Lactizym Việt Nam 6 x 105 Ferment Trung Quốc 109 Lacto-Sacc Mỹ 2,5 x 108 4,6 x 106 Tóm lại, các công trình nghiên cứu được tóm lược ở trên đã sử dụng các chế phẩm probiotic trên gia súc, gia cầm. Mỗi công trình nghiên cứu về những khía cạnh khác nhau nhưng điều kết luận là probiotic có ảnh hưởng tốt cho vật nuôi như ức chế VSV gây bệnh, phòng ngừa và điều trị tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và hệ số tiêu tốn thức ăn, 1.1.8.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng probiotic dạng bào tử Bacillus Hồ Thị Việt Thu (2012) đã nghiên cứu hiệu quả phòng bệnh của bào tử Bacillus subtilis biểu hiện Interferon alpha gà (B. subtilis - ChIFN ), một sản phẩm của bộ môn Vi sinh Ký sinh – Khoa Dược, Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, trong phòng bệnh Newcastle cho gà được thực hiện trên gà giống Tam Hoàng 3 tuần tuổi. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả thử nghiệm cho gà uống với liều 0,5 x 1010 bào tử B. subtilis - ChIFN , sau đó công cường độc virus Newcastle độc lực cao với liều 104 ELD50 cho mỗi gà thí nghiệm, đồng thời so sánh hiệu quả của ChIFN chuẩn với liều 104 IU. Kết quả thí nghiệm cho thấy bào tử B.subtilis - ChIFN có khả năng phòng 17
  28. bệnh Newcastle với tỷ lệ bảo hộ là 79,17% cao hơn so với tỷ lệ bảo hộ bởi ChIFN chuẩn (45,83%) và so với lô đối chứng Bacillus subtilis (12,50%). Phạm Kim Đăng và cộng sự (2016) nghiên cứu đánh giá tác dụng của chế phẩm probiotics NeoAvi GroMax chứa Bacillus dạng bào tử (trộn thức ăn với tỷ lệ 0,3%) đến khả năng sản xuất gà thịt, giống Ri Ninh Hoà và gà được bổ sung kháng sinh BMD (Bacitracin Methylene-Disalicylate) 10% (0,4g/kg thức ăn). Kết quả cho thấy rằng số lượng vikhuẩn E. coli và Salmonella sp.trong hồi tràng và trong phân giảm xuống; số lượng Lactobacillus sp. trong hồi tràng tăng lên, đồng thời chiều cao và chiều dày lông nhung biểu mô tá tràng và không tràng tăng lên. Điều này chứng minh tác dụng của probiotics dạng bào tử chịu nhiệt đến năng suất gà thịt thông qua tác dụng cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột và sức khỏe biểu mô ruột. Hầu hết các sản phẩm probiotic dạng bào tử Bacillus hiện đang bán tại Việt Nam đều được nhập khẩu từ nước ngoài hay sản xuất tại Việt Nam nhưng nguyên liệu thô được nhập từ nước ngoài (ví dụ như NeoPig Topgold và PigMax chứa bào tử Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans và Bacillus indicus với các nồng độ khác nhau dùng cho heo hay Neoavi Supamax dùng cho gà của Biospring, Anh Quốc). Một sản phẩm nữa chứa bào tử Bacillus đang được phân phối tại Việt Nam là BioPlus®YC của công ty Evonik, sử dụng cho tất cả các loại vật nuôi. 1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus 1.2.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus - Đặc điểm phân loại: Theo Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Bacillus thuộc: [46] Giới: Bacteria Nghành:Firmicutes Lớp: Bacilli 18
  29. Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus, Geobacillus Vi khuẩn Bacillus được Ehrenberg mô tả lần đầu tiên năm 1835 là “Virbrio subtilis”. Năm 1872, Cohn đặt tên lại là B. subtilis (Gordon, 1981). Đó là thành viên của một chi lớn và đa dạng được Cohn nghiên cứu đầu tiên, là một phần của họ Bacillaceae. Họ Bacillaceae được chia làm 5 chi gồm: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfortomaculum, đặc trưng của họ này là hình thành nội bào tử [33, 39] - Đặc điểm hình thái: Tế bào hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thước 0,3 - 2,2 x 1,2 -7 µm. Các tế bào thường xếp thành cặp hay chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông. Là VK Gram dương, hầu hết có catalase dương tính. Chúng thường di động nhờ roi. Họ Bacillaceae được Fischer trình bày có hệ thống năm 1895 thì nội bào tử được dùng trong khóa phân loại vi khuẩn. Đặc điểm của chi Bacillus là tất cả có nội bào tử, hiếu khí, có thể bắt buộc hay tùy ý, hình que và tạo catalase. Một tế bào chỉ có thể hình thành duy nhất một nội bào tử, nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, axit, sự hình thành nội bào tử không bị ngăn cản bởi sự tiếp xúc không khí. Các loài thuộc chi Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ nguyên hình que khi mang bào tử, trong một số trường hợp chỉ hơi phình to lên một chút [17]. Tùy theo loài, bào tử có thể nằm giữa, gần cuối, hoặc ở cuối [13, 34]. Tuy nhiên, cũng có một số loài thuộc chi Bacillus không tạo bào tử như B. thermoamylovorans, B. halodenitrificans [46] - Đặc điểm phân bố: Nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau. Chúng rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ 19
  30. nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, không khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, lớp mùn chủ yếu là đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N [28, 33]. - Dinh dưỡng và tăng trưởng: Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hóa dị dưỡng, thu năng lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ như đường, amino axit, axit hữu cơ, Một số VK tự dưỡng không bắt buộc (B. schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường chỉ có CO2. Một số loài Bacillus (B. subtilis) có khả năng sử dụng các chất vô cơ, trong khi một số loài khác như B. sphaericus, B. cereus cần các hợp chất hữu cơ (vitamin, axit amin) cho sự sinh trưởng. Đặc biệt Bacillus gây bệnh cho côn trùng như B. thuringiensis, B. popllae, B. lentimorbus, B. cereus, B. anthracis (trong đó B. cereus, B. anthracis gây bệnh trên người) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển được trong môi trường VK thông thường như NA, NB [28, 29, 33]. Phần lớn các loài thuộc chi Bacillus là VK hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 30 – 45oC, một số VK chịu nhiệt với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu lên tới 65oC, hoặc ưa lạnh (5oC – 25oC). Các loài VK thuộc chi Bacillus sinh trưởng trong khoảng pH rộng từ 2 – 11. Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện sinh trưởng tối ưu, Bacillus có thời gian thế hệ là 25 phút. Nhờ có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ và muối rộng nên Bacillus có thể tồn tại ở điều kiện bất lợi trong thời gian dài [23, 28] - Một số loài Bacillus phổ biến trong tự nhiên: B. subtilis có khuẩn lạc khô, không màu hoặc có màu xám nhạt, trắng, hơi nhăn hay tạo ra các lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch. Khuẩn lạc có mép nhăn bám vào MT thạch. Trực khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, tế bào đứng riêng rẽ hoặc chuỗi. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 36 - 50oC, tối đa là 60oC. Bào tử chịu được nhiệt độ khá cao, có hình bầu dục, phân bố lệch tâm. Nhờ khả năng sinh một số enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease, ) và sinh tổng hợp được nhiều loại KS như subtilin, 20
  31. subtilosin A, sublancin, mà B. subtilis được ứng dụng rất rộng rãi trong chăn nuôi, y học, thực phẩm, [17] B. amyloliquefaciens có hình thái khuẩn lạc và tế bào tương tự B. subtilis. Nhưng khác nhau về đặc tính sinh hóa, có khả năng lên men đường lactose nhanh và lên men glucose chậm. Chúng phân bố phổ biến trong đất, nước. Do có khả năng sinh tổng hợp mạnh các enzyme như amylase, protease [73], lipase [48], phytase, xenlulase và xylanase [36] nên được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyme, công nghiệp thuộc da [31, 39]. Ngoài ra, B. amyloliquefaciens còn được ứng dụng trong các lĩnh vực khác như nông nghiệp, y học bởi khả năng sinh các chất chuyển hóa như vitamin, nucleoside purine (inosine, guanosine) [42, 43], chất kháng khuẩn (bacteriocin), chất kháng nấm (bacimin), hoocmon tăng trưởng thực vật IAA [39, 42, 43, 56]. Đặc biệt, nhiều nghiên cứu cho thấy các chế phẩm probiotic từ Bacillus amyloliquefaciens đã góp phần cải thiện chất lượng môi trường nước, tăng cường các phản ứng miễn dịch, kiểm soát sự phát triển quá mức của VSV gây bệnh cho tôm, cá, [46]. B. licheniformis là vi khuẩn hoại sinh, bào tử hình ovan, phát tán chủ yếu trong đất, kể cả đất nghèo dinh dưỡng như đất hoang hay sa mạc. Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục, bề mặt nhăn nheo. Tế bào chuyển động nhờ tiêm mao và loài này kỵ khí không bắt buộc. B. pumilus phát tán rộng khắp nơi, thường có mặt trong đất nhiều hơn B. subtilis. Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ không ranh giới. Tế bào của nó gần giống tế bào B. subtilis. B. megaterium có khuẩn lạc hình tròn đều, không có thùy, không có nếp, mép tròn hoặc hơi lượn sóng, màu trắng kem, trông giống như giọt bạch lạp (nến trắng), thường có vòng hoặc các vòng đồng tâm trên mặt. Tế bào dài, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. Bào tử hình elip, nằm lệch tâm. B. megaterium được sử dụng trong sản xuất penicillin nhờ khả năng tổng hợp penicillin amidase. Bên cạnh đó, chúng còn có 21
  32. thể sản sinh các enzyme phân hủy sinh học, sản sinh vitamin B12, oxetanocin, cytochromes P450 và một số axit amin khác B. polymyxa có khuẩn lạc không màu, phẳng, lồi, trơn, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Bào tử hình bầu dục kéo dài. Loại vi khuẩ này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Ngoài ra, chúng còn có khả năng cố định đạm. Đây là một vi khuẩn rất phổ biến trong đất. B. cereus có khuẩn lạc phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục. Tế bào đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi. Bào tử có hình bầu dục, nằm lệch tâm, tế bào chất có chứa các hạt và không bào nhỏ. Chúng thường phát tán khắp nơi, sinh sôi, nảy nở trên thực phẩm và có thể sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm. 1.2.2 Bào tử Bacillus 1.2.2.1 Cấu tạo bào tử vi khuẩn Bacillus Quan sát bào tử khi không nhuộm, thấy có lớp màu đen ở mép rất sáng và chiết quang, cấu trúc bào tử bao gồm - Vỏ bào tử (spore coat): bao quanh lớp màng ngoài, gồm những protein di động, phức tạp, gồm ba lớp khác nhau. Có chức năng bảo vệ lớp peptidoglycan của bào tử khỏi bị các tác nhân bên ngoài tấn công như enzyme, UV, chất oxy hóa, - Cortex: lớp peptidoglycan dày đặc biệt, bao quanh màng trong. Cortex là thành phần quan trọng giúp bào tử không bị khử nước, do đó tạo sự bền vững và dạng sống tiềm sinh. Lớp cortex tích điện âm, trong quá trình nảy mầm, lớp này sẽ nhanh chóng bị thủy giải do enzyme có sẵn trong bào tử - Lõi tế bào (core): đây là thành phần quan trọng nhất của bào tử, bao gồm đầy đủ các thành phần gần giống như tế bào sinh dưỡng như protein bào tương, ribosom, thể nhân chứa DNA. Tuy nhiên, thành phần bào tưởng của bào tử chứa khoảng 30 – 50% nước, trong khi tế bào sinh dưỡng là 70 – 88% nước. 22
  33. Hình 1.2 Các cấu trúc chính của bào tử Bacillus [57] Bảng 1.2 Các đặc điểm khác nhau của tế bào sinh dưỡng và bào tử [2] Đặc tính Tế bào sinh dưỡng Bào tử Cấu trúc Tế bào Gram dương, điển Vỏ bào tử dày, khó thấm hình nước Thành phần hóa học Canxi Thấp Cao Protein Thấp hơn Cao hơn Hoạt tính enzyme Cao Thấp Đặc tính chịu nhiệt Yếu Cao Đặc tính chịu bức xạ Kém Mạnh Đặc tính chịu các chất hóa Yếu Cao học và axit Khả năng bắt màu chất Dễ nhuộm Phải sử dụng phương nhuộm pháp đặc biệt 23
  34. 1.2.2.2 Quá trình hình thành và nảy mầm của bào tử vi khuẩn Bacillus Khi gặp điều kiện bất lợi, vi khuẩn Bacillus có khả năng hình thành nội bào tử. Quá trình bào tử hóa bắt đầu từ cuối thời kỳ sinh trưởng, khi gặp điều kiện thức ăn cạn kiệt hoặc có tích lũy sản phẩm trao đổi chất có hại. Bào tử vi khuẩn Bacillus có khả năng chịu nhiệt, chịu chất độc và enzyme phân giải. Trong thời kỳ mới bắt đầu hình thành nội bào tử, vi khuẩn Bacillus tiết ra chất kháng khuẩn tiêu diệt các vi khuẩn xung quanh. Ở các loài thuộc chi Bacillus được nghiên cứu, quá trình hình thành bào tử tương tự nhau. Toàn bộ quá trình diễn ra trong khoảng từ 8 – 10 giờ, bắt đầu bằng việc phân chia DNA, tách một nhiễm sắc thể bao quanh bởi màng sinh chất tạo thể nguyên sinh là dạng bào tử sơ khởi, và kết thúc bằng việc hình thành vỏ bào tử, rút hết nước tạo thành bào tử trưởng thành và phóng thích ra khỏi tế bào mẹ Sự nảy mầm bào tử là quá trình chuyển bào tử từ trạng thái ngủ sang trạng thái sinh dưỡng của vi khuẩn. Quá trình này gồm 3 giao đoạn: hoạt hóa, nảy mầm và sinh trưởng. Có thể hoạt hóa bào tử bằng cách nâng nhiệt độ trong thời gian ngắn, hạ thấp pH, xử lý hóa chất. Ví dụ bào tử B. subtilis có thể được hoạt hóa bằng cách đun 65oC trong 5 phút. Hình 1.3 Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacilllus [44] 24
  35. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện tại phòng công nghệ sinh học, Bộ môn dinh dưỡng và thức ăn chăn nuôi thuộc Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ Thời gian thực hiện : 4/2017 – 7/2017 2.2 Vật liệu 2.2.1 Chủng vi sinh vật: 11 chủng Bacillus do phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn dinh dưỡng và thức ăn chăn nuôi thuộc Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ cung cấp 3 chủng vi sinh vật gây bệnh: Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Streptococcus aureus (ATCC 65338) 2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 2.2.2.1 Hóa chất - Peptone, cao nấm men, cao thịt, NaOH, NaCl, glucose, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2, FeSO4.7H2O, MnCl2.4H2O, ZnCl2, CuCl2, CoCl2.6H2O, Na2MoO4, KCl, Agar - Thuốc nhuộm: tím kết tinh, lugol, safranin, lục malachite 2.2.2.2 Dụng cụ Que cấy vòng, ống nghiệm, đĩa petri, pipetman 100μl, 1000μl, 5000μl, đầu típ, becher 100ml, 500ml, erlen 250ml, 1L, đèn cồn, đèn cồn, bật lửa, ống đong, chai nắp xanh, bông thấm nước, bông không thấm, lame, lamel 25
  36. 2.2.2.3 Thiết bị Các loại máy móc: tủ ấm, nồi hấp vô trùng, tủ cấy vô trùng, máy lắc, tủ sấy, máy đo OD, kính hiển vi quang học, cân phân tích điện tử, tủ lạnh, máy đo pH, tủ giữ giống, bồn lên men 5l Biostat, máy ly tâm Avanti JXN Series 2.3 Môi trường nghiên cứu - Môi trường 1: (Môi trường LB) (MT1) (g/l) Cao nấm men 5g Peptone 10g NaCl 10g Agar 18g Nước cất 1000ml - Môi trường 2: ( MT2) (g/l) Glucose: 10 g (NH4)2SO4: 2 g K2HPO4: 13,6 g MgSO4.7H2O: 0,2 g Dung dịch muối khoáng :10 ml Nước cất 1000ml Dung dịch muối khoáng: CaCl2: 0,42 g FeSO4.7H2O: 2,29 g MnCl2.4H2O: 0,1 g ZnCl2: 0,17 g CuCl2: 0,03 g CoCl2.6H2O: 0,06 g Na2MoO4: 0,06g 26
  37. Nước cất 1000ml - Môi trường 3: ( MT3) (g/l) Peptone 5g/l Cao thịt 3g/l KCl 1g/l MgSO4 0,25g/l Nước cất 1000ml - Môi trường 4: (MT4) (g/l) Peptone 10g/l Cao thịt 6g/l KCl 2g/l MgSO4 0,5g/l Nước cất 1000ml - Môi trường 5 (MT5) (g/l): Glucose 2g/l MgSO4.7H2O 0,5g/l MnCl2.4H2O 0,5g/l KH2PO4 6g/l Cao thịt hoặc cao nấm men 5g/l Peptone 3g/l Nước cất 1000ml - Môi trường 6 (MT6) (g/l): Glucose 3g MgSO4.7H2O 0,6g Cao nấm men 10g K2HPO4 6g Peptone 5g 27
  38. NaCl 0,01g FeSO4.7H2O 0,1M 1,14ml ZnSO4.7H2O 0,1M 0,3ml CaCl2 0,1M 9,9ml MnCl2 0,1M 30ml Nước cất 1000ml - Môi trường 7 (MT7) (g/l) Peptone 10g Cao thịt 3g NaCl 3g B.complex ( vitamin B1) 0,5ml Nước cất 1000ml - MT8: ( MT định tính khả năng sinh amylase) (g/l) Peptone 10g Cao thịt 3g NaCl 3g Tinh bột tan 1% Agar 18g Nước cất 1000ml - MT9( MT định tính khả năng sinh protease) (g/l) Peptone 10g Cao thịt 3g NaCl 3g Gelatin 1% Agar 18g Nước cất 1000ml - MT10 (MT định tính khả năng sinh cellulase ) (g/l) 28
  39. Peptone 10g Cao thịt 3g NaCl 3g CMC 1% Agar 18g Nước cất 1000ml Các chất của môi trường nói trên được hòa theo thứ tự vào nước, các thành phần khoáng được hòa tan với nước cất trước rồi mới cho vào hỗn hợp môi trường theo thứ tự của công thức môi trường, điều chỉnh pH cho phù hợp với từng môi trường và hấp khử trùng 121oC trong 15 phút 29
  40. 2.4 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát) 11 Chủng Bacillus Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày Khảo sát khả năng chịu muối mật Sàng lọc chủng Bacillus có đặc tính Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào probiotic tốt Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định Dựng đường cong tăng trưởng Chủng Bacillus Khảo sát các môi trường tạo bào tử được chọn Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất Sản xuất bào tử quy mô pilot Tạo chế phẩm Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30
  41. 2.5 Phương pháp nhuộm Gram Nguyên tắc - Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với tím kết tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào - Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hoà tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím – iot và làm cho vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc này Đỏ vàng với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin - Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào màu tím Cách tiến hành - Làm tiêu bản: Dùng que cấy lấy sinh khối làm vết bôi trên lame Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn - Nhuộm tiêu bản: Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal Violet trong 30 giây Rửa nước Nhuộm lugol trong 1 phút Rửa nước Tẩy cồn 960 trong 20 – 30 giây, để ngiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu. Rửa nước Nhuộm bổ sung Fuchsin hoặc Safranin từ 10 – 30 giây Rửa nước Thấm khô Quan sát [16] 31
  42. 2.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton Nguyên tắc Dựa trên cấu trúc đặc biệt của bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lí để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. - Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và TB bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. - Tẩy màu tế bào chất TB đi và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất TB bắt màu phân biệt. Cách tiến hành - Dùng dây cấy vòng vô trùng lấy sinh khối vi khuẩn cần xác định làm vết bôi trên lame - Đặt 1 cốc nước trên bếp từ và đun sôi. Sau đó đặt lên trên miệng cốc một miếng giấy lọc - Cho dung dịch Malachite Green 5% vào vết bôi và đặt lame có sinh khối của vi khuẩn lên miếng giấy lọc trên cốc và để trong thời gian 5 phút - Sau đó, rửa vết bôi bằng nước trong khoảng thời gian 30 giây - Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fuchsin trong khoảng 60 – 90 giây - Rửa lại bằng nước cất rồi thấm khô - Quan sát dưới kính viển vi Đọc kết quả - Bào tử màu xanh - Tế bào sinh dưỡng màu đỏ [11, 16] 2.7 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Nguyên tắc Đếm số KL mọc trên MT từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi KL được hình thành từ một TB duy nhất 32
  43. Cách tiến hành - Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Dùng pipetman hút 1ml dịch nuôi cấy đưa sang ống nghiệm có 9ml NaCl 0,85%, ta được độ pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng để được các độ pha loãng 10-2,10-3, 10-4, 10-5, 10-6. - Chuẩn bị MT thạch đĩa: MT1 được vô trùng cẩn thận. - Cấy và dàn đều dịch pha loãng. Dùng pipetman lấy 0,1ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 cho vào mỗi đĩa Petri, mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa. Dùng que trang trang mẫu thật đều trên mặt thạch để tách riêng rẽ từng TB. Ghi vào nắp hộp Petri các thông tin: nồng độ pha loãng, ngày cấy, chủng cấy mẫu. - Lật ngược các đĩa Petri vừa cấy, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 37oC. - Sau 24 giờ, đếm số KL trong mỗi đĩa. Ghi nhận các độ pha loãng có số KL từ 25 đến 250 KL/đĩa [16, 22, 25, 28] Cách tính kết quả: Số lượng tế bào VK trong 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức: X (CFU/ml) = n1V 1 + + 푛푖V 푖 Trong đó: X: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn (trong khoảng 25 – 250 khuẩn lạc) n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường f: độ pha loãng tương ứng 2.7.1 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang Nguyên tắc: Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lửng. VSV trong MT nuôi cấy có thể hấp thu 33
  44. hoặc phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm. Do đó, số lượng ánh sáng được hấp thu hoặc phân tán có mối tương quan thuận với số lượng VSV trong dịch nuôi cấy. Độ đục này chính là giá trị OD (Optical Density) đo được ở bước sóng 600nm (OD600nm) trên máy quang phổ (dựa trên sự tương quan tuyến tính giữa OD600nm và mật độ TB (cfu /ml) [12, 25] Cách tiến hành 2.7.1.1 Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ TB (đường chuẩn) - Pha loãng huyền phù chứa chủng Bacillus cần xác định thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD600nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Xác định giá trị thực tế OD600nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo thực tế - Dùng phương pháp đếm KL, xác định mật độ TB (cfu/ml) của các huyền phù này. - Tính giá trị log N (cfu /ml) cho mỗi giá trị mật độ tương ứng với mỗi giá trị độ đục. Vẽ đường chuẩn biểu diễn của log N (cfu/ml) (trục tung) theo OD600nm (trục hoành). Xác định khoảng tuyến tính giữa log N (cfu /ml) và OD600nm - Dùng phần mền Microsoft office Excel 2010 để phân tích sự tuyến tính giữa log N (cfu /ml) - giá trị OD600nm và dựng đường chuẩn bằng công cụ Insert Charts 2.7.1.2 Xác định mật độ TB theo độ đục và OD600nm - Sau khi nuôi cấy VK trong MT lỏng với các điều kiện phù hợp, lấy dịch sau nuôi cấy đo OD600nm (dịch nuôi cấy VK cần được pha loãng trước khi đo OD600nm). - Từ giá trị OD600nm đo được, dựa vào đường chuẩn suy ra số lượng TB (cfu /ml) của mẫu và nhân với độ pha loãng. 2.7.2 Lập đường cong tăng trưởng Chủng vi khuẩn Bacillus thử nghiệm được tăng sinh trong 50ml môi trường LB ở 37oC, 24 giờ 34
  45. Cấy 1 lượng dịch vi khuẩn Bacillus thử nghiệm đã huyền phù vào erlen chứa 450ml môi trường LB sao cho OD xấp xỉ khoảng 0,1 - 0,5; đem nuôi cấy lắc 150 vòng/phút ở 37oC Xác định đường cong tăng trưởng: đo OD dịch nuôi cấy lắc sau mỗi 2 giờ nuôi cấy, ghi nhận sự phát triển của vi khuẩn 2.7.3 Khảo sát sự tạo thành bào tử Kiểm tra mật độ bào tử bằng phương pháp xử lý nhiệt ở 80oC trong vòng 15 phút trong bể điều nhiệt. Pha loãng và cấy trang ở các độ pha loãng thích hợp 2.8 Khảo sát các đặc điểm probiotic 2.8.1 Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày Nguyên tắc: Dạ dày của gia súc có pH thấp (1 – 3) là nơi có ảnh hưởng mạnh đến khả năng sống sót của các chủng VSV được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi. Dựa vào khả năng chịu pH thấp (1 - 3) của dạ dày và tồn tại sau thời gian tiêu hóa ở dạ dày (1 - 3 giờ) làm cơ sở để tuyển chọn các chủng probiotic [15, 23] Cách tiến hành: - Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC - Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT1 có pH=2 được điều chỉnh bằng HCl 1N. Thí nghiệm lặp lại 3 lần - Chuyển dịch huyền vào ống nghiệm đã chuẩn bị - Ủ mẫu ở 37oC. Tại các thời điểm 0, 60, 180 phút tiến hành pha loãng mẫu bằng cách cấy trang theo mục 3.4.3 - Ủ mẫu sau khi trang ở 37oC, 24 giờ. Đếm số KL mọc trên đĩa và tính tỷ lệ sống sót của TB sau các khoảng thời gian khác nhau Kiểm tra kết quả 35
  46. - Tính tỷ lệ TB sống sót (%) 푖 × 100 표 Trong đó: Ni: mật độ TB sau thời điểm i (i là 60 và 180 phút) No: mật độ TB ở thời điểm 0 phút - Căn cứ vào tỷ lệ TB sống sót ở pH 2 và thời gian khác nhau để chọn chủng Bacillus 2.8.2 Khảo sát khả năng chịu muối mật Nguyên tắc: Các chủng VSV probiotic khi qua ruột non sẽ chịu tác động của muối mật trong đường ruột. Dựa trên khả năng sống sót của các chủng Bacillus sau tác động của muối mật trong đường ruột làm cơ sở để tuyển chọn các chủng probiotic. [15, 23] Cách tiến hành: - Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC - Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT1 có bổ sung 2% muối mật. Thí nghiệm lặp lại 3 lần - Chuyển dịch huyền vào ống nghiệm đã chuẩn bị - Ủ mẫu ở 37oC. Tại các thời điểm 0, 60, 180 phút tiến hành pha loãng mẫu bằng cách cấy trang theo mục 3.4.3 - Ủ mẫu sau khi trang ở 37oC, 24 giờ. Đếm số KL mọc trên đĩa và tính tỷ lệ sống sót của TB sau các khoảng thời gian khác nhau Kiểm tra kết quả - Tính tỷ lệ TB sống sót (%) 푖 × 100 표 36
  47. Trong đó: Ni: mật độ TB sau thời điểm i (i là 60 và 180 phút) No: mật độ TB ở thời điểm 0 phút - Căn cứ vào tỷ lệ TB sống sót ở muối mất 2% và thời gian khác nhau để chọn chủng Bacillus 2.8.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào 2.8.3.1 Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân Nguyên tắc: Xác định chủng Bacillus có khả năng sinh enzyme protease thủy phân gelatin. Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của enzyme [11, 16, 24] Cách tiến hành: - Nuôi VK trong MT9 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3, lắc 150 vòng/phút, 37oC - Sau 24 giờ, lấy dịch nuôi cấy ly tâm 5000v/p, 15phút, thu dịch nổi, sau đó lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn tế bào còn sót lại. - Đổ môi trường thạch đĩa có chứa 1% gelatin vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội đông lại dùng khuyên đục lỗ (đường kính d=0,7cm), đục 3 lỗ trên môi trường thạch tạo thành các giếng - Dùng pipetMan hút 20μl dịch cho vào mỗi lỗ thạch, để yên và ủ ở 37oC. Sau 24 giờ, dùng thuốc nhuộm lugol đo vòng kháng khuẩn. Nếu VK sinh protease sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ thạch. Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt tính enzym cao: 37
  48. - Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzym càng nhiều 2.8.3.2 Xác định hoạt tính amylase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [19] Nguyên tắc: Xác định chủng Bacillus có khả năng sinh hệ enzyme amylase thủy phân tinh bột thành glucose. Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của enzyme Cách tiến hành: - Nuôi VK trong MT8 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3, lắc 150 vòng/phút, 37oC - Sau 24 giờ, lấy dịch nuôi cấy ly tâm 5000v/p, 15phút, thu dịch nổi, sau đó lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn tế bào còn sót lại. - Đổ môi trường thạch đĩa có chứa 1% tinh bột tan vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội đông lại dùng khuyên đục lỗ (đường kính d=0,7cm), đục 3 lỗ trên môi trường thạch tạo thành các giếng - Dùng pipetMan hút 20μl dịch cho vào mỗi lỗ thạch, để yên và ủ ở 37oC. Sau 24 giờ, dùng thuốc nhuộm lugol đo vòng kháng khuẩn. Nếu VK sinh amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ thạch Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt tính enzym cao: - Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzym càng nhiều 38
  49. 2.8.3.3 Xác định hoạt tính cellulase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [11] Nguyên tắc: Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của enzyme Cách tiến hành: - Nuôi VK trong MT10 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3, lắc 150 vòng/phút, 37oC - Sau 24 giờ, lấy dịch nuôi cấy ly tâm 5000v/p, 15phút, thu dịch nổi, sau đó lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn tế bào còn sót lại. - Đổ môi trường thạch đĩa có chứa 1% CMC vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội đông lại dùng khuyên đục lỗ (đường kính d=0,7cm), đục 3 lỗ trên môi trường thạch tạo thành các giếng - Dùng pipetMan hút 20μl dịch cho vào mỗi lỗ thạch, để yên và ủ ở 37oC. Sau 24 giờ, dùng thuốc nhuộm lugol đo vòng kháng khuẩn. Nếu VK sinh cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ thạch Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt tính enzym cao: - Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzym càng nhiều 39
  50. 2.8.4 Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy VK vào MT thạch, những nơi nào có chất ức chế khuếch tán thì nơi đó VSV kiểm định không sinh trưởng được và tạo thành đường vô khuẩn Cách tiến hành - Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu và các chủng vi sinh vật gây bệnh được tăng sinh trong MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC. - Sau 24 giờ tăng sinh các chủng Bacillus nghiên cứu, dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối và cấy chủng VK dọc theo một đường ngang trên đĩa thạch LA, ủ 37oC - Sau 24 giờ ủ, tiến hành cấy vi khuẩn gây bệnh đã được tăng sinh trước đó theo các vạch thẳng góc với vạch vi khuẩn đã mọc. Ủ 37oC, 24 giờ. - Đo khoảng cách giữa mép của vạch vi khuẩn với chỗ vi sinh vật gây bệnh bắt đầu sinh trưởng 2.8.5 Khảo sát môi trường tạo bào tử - Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC - Chuẩn bị môi trường tạo bào tử: MT1 đến MT8. MT1 (môi trường LB) đây là môi trường cơ bản cho tất cả các chủng Bacillus để sinh trưởng và phát triển tốt. [60] MT2 được sử dụng để khảo sát tạo mật độ bào tử Bacillus subtilis R14 với mật độ đạt được 108 cfu/ml. [32] MT3 cho mật độ tế bào Bacillus subtilis 7,5 × 109 cfu/ml, mật độ bào tử: 3,6 × 109 cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử 48%. Trong khi đó MT4 cho mật độ TB 40
  51. Bacillus subtilis: 6,2 × 109 cfu/ml, mật độ bào tử: 4,8 × 109 cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử 77% [51] MT5 mật độ TB Bacillus subtilis EA-CB0575 đạt được 2,01 × 109 cfu/ml, mật độ bào tử 1,87 × 109 cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử 93,2% [45] Chủng Bacillis EA-CB0575 khảo sát trên MT6 cho mật độ bào tử là 1,4 × 109 cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử là 94% [35] Vitamin cần thiết cho sự hình thành bào tử. Vì vậy MT7 sử dụng môi trường NA kết hợp với B. complas để tạo môi trường kích thích tạo bào tử [49] - Sau 24 giờ tăng sinh các chủng Bacillus nghiên cứu được cấy chuyển vào 8 môi trường khác nhau. Ủ 37oC, 150 rpm - Lấy mẫu kiểm tra: kiểm tra mật độ tế bào sau 24 giờ bằng cách đo OD và mật độ bào tử sau 72 giờ nuôi cấy 2.8.6 Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất - Chọn chủng có hoạt tính probiotic tốt nhất khảo sát điều kiện tạo bào tử tốt nhất - Các điều kiện khảo sát: cô đặc, nuôi cấy môi trường nghèo dinh dưỡng, nâng pH, tăng nhiệt độ nuôi cấy Cách tiến hành - Chuẩn bị giống: Chủng Bacillus tốt nhất được tăng sinh trong MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC - Chuẩn bị môi trường: LB, nước muối sinh lý, môi trường tối ưu tạo bào tử - Sau 24 giờ tăng sinh cấy chuyển chủng vào bình erlen có chứa 450ml môi trường LB - Sau 24 giờ nuôi cấy thì bắt đầu xử lý các điều kiện tạo bào tử nhiều nhất: 41
  52. Cô đặc: Bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo bào tử được ly tâm ở 5000 vòng/phút, 5 phút. Sau đó sinh khối ly tâm có chứa một lượng nhỏ môi trường LB được nuôi cấy lắc ở 150rpm Nuôi cấy môi trường nghèo dinh dưỡng: Bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo bào tử được ly tâm ở 5000 vòng/phút, 5 phút. Sau đó sinh khối ly tâm được nuôi cấy tiếp trong môi trường nước muối sinh lý, lắc ở 150rpm pH: Bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo bào tử được nâng pH = 9, 10, 11 bằng NaOH 10N, lắc ở 150rpm Nhiệt độ: Chuyển bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo bào tử vào điều kiện nuôi cấy là 45oC, lắc ở 150rpm. - Lấy mẫu kiểm tra mật độ tế bào và mật độ bào tử sau các khoảng thời gian khác nhau: Kiểm tra kết quả: - Hiệu suất hình thành bào tử (%) ậ푡 độ à표 푡ử 푖ờ 푖 푛 × 100 ậ푡 độ 푡ế à표 푖표 Trong đó: in: là mật độ bào tử tại các thời điểm khảo sát (cfu/ml) io: mật độ tế bào nhiều nhất (cfu/ml) 2.8.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot Từ các kết quả đã khảo sát ở trên đề xuất quy trình lên men trong môi trường lỏng để thu bào tử của chủng Bacillus với mẻ 3,5 L (trong bồn lên men 5 L thuộc Biostat, Sartorius, Đức ) 2.8.7.1 Khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất Vì thời gian có hạn nên không thể khảo sát hết các yếu tố cần thiết, nên: 42
  53. - Thừa kế thông số về tốc độ khuấy, oxy hòa tan (pO2) từ các nghiên cứu khác (Fabrízio Siquer Boniolo và cộng sự, 2012; Trần Hữu Tâm, 2014; S. M. S. Monteiro và cộng sự, 2014). - pH: thừa kế thông số về pH như khảo sát ở các thí nghiệm trên - Xác định thời gian có mật độ tế bào cao nhất: 4 giờ lấy mẫu pha loãng và cấy trang trên môi trường LB rắn 2.8.7.2 Tiến hành tạo bào tử - Sau khi có thời gian tối ưu cho mật độ tế bào nhiều nhất, bắt đầu chỉnh pH từ pH 7 lên 9 để tạo điều kiện bất lợi giúp cho quá trình hình thành bào tử - Theo nghiên cứu của Fabrízio Siquer Boniolo và cộng sự (2012) thì tiếp tục khuấy và sục khí để hình thành bào tử. Mặt khác theo Sarrafzadeh và Navarro (2006) thấy rằng sự gián đoạn cung cấp oxy ảnh hưởng đến việc hình thành bào tử 2.8.7.3 Sản xuất chế phẩm Sử dụng kết quả của mục 2.8.7.1 và 2.8.7.2 Cách tiến hành Chuẩn bị giống: Tăng sinh chủng Bacillus trong bình erlen chứa 350 ml môi trường LB ở 37oC, 150rpm Sau 24 giờ tăng sinh, cấy chuyển sang bồn lên men có chứa 3150ml môi trường tạo bào tử tối ưu. - Thời gian lấy mẫu: 4 giờ lấy mẫu 1 lần. Sau 24 giờ bắt đầu xử lý pH từ pH 7 lên pH 9 bằng NaOH và tiếp tục 4 giờ lấy mẫu 1 lần. - Kiểm tra bào tử: xử lý nhiệt ở 80oC, 15 phút bằng bể điều nhiệt. Sau đó tiến hành cấy trang và pha loãng ở độ pha loãng phù hợp - Thu bào tử: ly tâm ở 5000 vòng/phút, 10 phút - Sấy: Bào tử sau ly tâm được trộn với bột mì đã được hấp tiệt trùng ở 121oC, 15 phút, 1 atm và đem sấy ở nhiệt độ 40oC đến khi khô 43
  54. - Tạo chế phẩm: sau khi bào tử khô được nghiền mịn, bổ sung các chất mang và đóng gói. 2.8.8 Phân tích thống kê dữ liệu Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel, trong bộ Microsoft Office phiên bản 2010 44
  55. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát các đặc điểm probiotic Căn cứ vào các tiêu chuẩn chọn chủng VSV làm probiotic, tiến hành sàng lọc và tuyển chọn chủng Bacillus đáp ứng yêu cầu tạo chế phẩm probiotic 3.1.1 Khả năng chịu axit dạ dày Khả năng sống sót của các chủng Bacillus sau tác dụng của pH thấp ở dạ dày là một trong những đặc tính quan trọng của chủng VSV được chọn làm probiotic. Do vậy, tiến hành khảo sát khả năng chịu pH thấp của chúng ở pH 2 tại các thời điểm 0, 60, 180 phút (tương ứng với thời gian thức ăn lưu lại tại dạ dày). Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, từ đó tính tỷ lệ tế bào sống sót (%) của các chủng VK khảo sát với các khoảng thời gian khác nhau (mục 1.4.7.1). Bảng 3.1 Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường pH thấp Tỷ lệ tế bào sống sót ở pH 2 qua các Kí hiệu STT khoảng thời gian (%) chủng 0 phút 60 phút 180 phút 1 BI1 100 158,97 27,32 2 BI2 100 30,35 10,58 3 BI3 100 25,61 12,56 4 BI4 100 16,50 10,43 5 MN1 100 25,83 9,87 6 MN2 100 51,75 11,32 7 Sub 100 84,73 43,45 8 Yoi 100 115,80 48,44 9 Liche 100 0 0 10 Natto 100 0 0 45
  56. 11 BA 100 0 0 Số liệu ở bảng trên cho thấy rằng dưới tác động của pH thấp (pH 2), hầu hết các chủng khảo sát đều có xu hướng giảm tỷ lệ sống sót khi kéo dài thời gian xử lý (0 phút đến 180 phút). Trong 11 chủng thử nghiệm chỉ có 8 chủng (BI1, BI2, BI3, BI4, MN1, MN2, Sub, Yoi) có khả năng tồn tại ở điều kiện pH thấp cụ thể như sau: Sau 60 phút khảo sát thì cả 3 chủng Liche, Natto, BA đều không sống sót được trong môi trường pH 2 (0%). Trong khi đó sau 180 phút khảo sát của 8 chủng còn lại, tỷ lệ tế bào sống sót cao nhất thu được từ chủng Yoi (48,4%), kế đến là Sub (43,4%), BI1, BI3, MN2, BI2, BI4, và thấp nhất là MN1 (9,1%). Trong đó chủng BI1 sau 60 phút có sự phát triển trong môi trường pH 2, điều này cho thấy chủng BI1 thích nghi tốt trong điều kiện này, tuy nhiên sau 180 phút thì tỷ lệ sống sót của chủng giảm mạnh. Mặt khác, so sánh với các nghiên cứu của nhóm tác giả Hồ Trung Thông và Hồ Lê Huỳnh Châu (2009) về khả năng chịu pH thấp của các chủng probiotic: sau 180 phút khảo sát ở pH 2, tỷ lệ TB sống sót của 4 chủng LA5, LA6, LA7 và LA11 lần lượt là 53,56%, 28,42%, 23,23% và 27,81% [21]. Đồng thời, nghiên cứu của Trần Thị Bích Quyên (2012) cho thấy tỷ lệ sống sót trong điều kiện pH 2 của 4 chủng Q1, Q16, Q22 và Q29 lần lượt là 42,52%, 42,38%, 45,93% và 38,94% [18]. Từ đây có thể thấy khả năng chịu pH thấp của 8 chủng là tương đối thấp so với các nghiên cứu đã đề cập ở trên. Tóm lại, qua 180 phút khảo sát thì chủng Sub và Yoi có tỷ lệ sống sót cao nhất (48,4%, 43,4%) tương đồng với khá nhiều tác giả 3.1.2 Khả năng chịu muối mật Trong hệ tiêu hóa, sau khi trải qua điều kiện khắc nghiệt với pH thấp ở dạ dày, các VSV probiotic lại phải tiếp xúc với muối mật trong đường ruột. Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. 46
  57. Havenaar và cộng sự (1992) đã chỉ ra rằng, probiotic chỉ phát huy tác dụng có lợi lên vật chủ khi chúng định cư và tồn tại trong ruột non để từ đó hình thành KL, tăng khả năng kết dính trong đường ruột. Như vậy, dựa trên khả năng sống sót của các chủng Bacillus sau tác dụng của muối mật trong đường ruột làm tiêu chí quan trọng để sàng lọc các chủng VSV probiotic. Ở ruột non, nơi dịch mật toàn phần tiết ra có thể có nồng độ cao nhất khoảng 2%. Vì vậy tiến hành khảo sát khả năng chịu muối mật của các chủng Bacillus ở nồng độ muối mật 2% tại các thời điểm 0, 60, 180 phút (tương ứng với hời gian thức ăn lưu lại tại ruột non của người và động vật (Charteris và cộng sự, 1998) Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường muối mật 2% STT Chủng Tỷ lệ tế bào sống sót ở muối mật 2% qua các khoảng thời gian (%) 0 phút 60 phút 180 phút 1 BI1 100 89,12 16,25 2 BI2 100 83,86 39,52 3 BI3 100 33,21 7,56 4 BI4 100 21,25 11,17 5 MN1 100 128,79 45,26 6 MN2 100 19,58 7,20 7 Sub 100 269,79 64,44 8 Yoi 100 169,32 27,74 9 Liche 100 35,52 17,94 10 Natto 100 49,08 20,05 11 BA 100 41,34 31,94 Bảng số liệu cho thấy, cả 11 chủng đều có khả năng chịu muối mật 2%. Tuy nhiên tỷ lệ sống sót giảm dần theo thời gian như sau: Sau 180 phút, tỷ lệ sống sót cao 47
  58. nhất thu được từ chủng Sub (64,44%), kế đến là MN1 (45,26%), BI2, BA, Yoi, Natto, Liche, BI1, BI4, BI3, và thấp nhất là MN2 (7,20%). Mặt khác, so sánh với nghiên cứu của Trần Thị Bích Quyên về khả năng chịu muối mật của các chủng probiotic thấy được 4 chủng Q1, Q16, Q29, Q22 đều có tỷ lệ sống sót cao từ 75,51% - 105,85%, trong đó chủng Q22 đạt tỷ lệ sống sót cao nhất 105,85% [18]. Ba chủng còn lại có tỷ lệ sống sót ở thời điểm 4 giờ giảm so với thời điểm 1 giờ khảo sát Tóm lại, sau 180 phút khảo sát thì chủng Sub cho tỷ lệ tế bào sống sót tốt nhất với 64,44% 3.1.3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) Như chúng ta đã biết, thành phần chủ yếu trong thức ăn chăn nuôi là protein (bột cá, bột xương, bột đậu nành), xơ thô và tinh bột Tuy nhiên, sự phân tiết các enzyme tiêu hóa ở dạ dày và ruột non của động vật còn thấp nên khả năng tiêu hóa thức ăn còn hạn chế và dễ dẫn đến tiêu chảy. Vì vậy, khả năng sinh các enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) của các chủng probiotic có vai trò hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, chuyển hóa các chất khó tiêu thành chất dễ tiêu, giúp heo con tăng trọng Vì vậy, 11 chủng Bacillus đang khảo sát được tiến hành xát định khả năng sinh enzyme ngoại bào theo phương pháp ở mục 1.4.7.3 48
  59. Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus STT Kí hiệu Đường kính vòng phân giải, D-d (mm) chủng Protease Amylase Cellulase 1 BI1 15,00 ± 0,00 14,66 ± 0,47 15,67 ± 0,47 2 BI2 13,33 ± 0,47 14,66 ± 0,47 15,67 ± 0,47 3 BI3 13,00 ± 0,82 13,33 ± 0,47 13,00 ± 0,00 4 BI4 16,67 ± 0,47 13,67 ± 0,47 16,33 ± 0,47 5 MN1 14,33 ± 0,47 11,33 ± 2,36 - 6 MN2 9,33 ± 0,94 15,67 ± 1,25 - 7 Sub 15,67 ± 0,47 8,33 ± 0,94 15,00 ± 0,00 8 Yoi 15,00 ± 0,82 13,00 ± 0,00 14,67 ± 0,47 9 Liche 18,33 ± 0,94 13,33 ± 0,47 15,00 ± 0,00 10 Natto 6,67 ± 0,47 8,33 ± 0,47 - 11 BA 15,67 ± 0,47 14,67 ± 0,47 14,67 ± 0,47 Liche BI4 Sub Liche – Protease BI4 – Protease Sub – Protease 49
  60. BA BI1 MN2 BI1 – Amylase MN2 – Amylase BA – Amylase BI4 BI1 BI2 BI4 – Cellulase BI1 – Cellulase BI2 – Cellulase Hình 3.1 Vòng phân giải gelatin (protease), tinh bột (amylase), cellulose (cellulase) của các chủng Bacillus Kết quả khảo sát phía trên cho thấy rằng hầu hết các chủng Bacillus khảo sát đều có khả năng sinh cả 3 loại enzyme ngoại bào. Có thể đây là một đặc tính nổi bật của các loài Bacillus để chúng thích nghi và tồn tại với điều kiện môi trường sống phức tạp. Trong đó, chủng Liche, BI4, BA và Sub có hoạt tính protease tương đối mạnh (15 – 19 mm) so với các chủng còn lại, chủng MN2, BI1, BI2, BA hoạt tính amylase tương đối mạnh (14 – 15 mm) so với các chủng còn lại, còn hoạt tính cellulase cũng biểu hiện tương đối mạnh ở các chủng BI4, BI1, BI2, Sub, Liche (14 – 17 mm) Tóm lại, hoạt tính protease của chủng Liche là tốt nhất với 18,33 ± 0,94 mm. Hoạt tính amylase của chủng MN2 là tốt nhất với 15,67 ± 1,25mm. Hoạt tính cellulase của chủng BI4 là tốt nhất với 16,33 ± 0,47 mm 50
  61. 3.1.4 Khả năng đối kháng kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak Để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, ngoài việc cạnh tranh vị trí bám dính thì khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh là một đặc tính rất quan trọng của các chủng VSV được chọn làm probiotic. Các chủng Bacillus được tiến hành khảo sát khả năng đối kháng với 3 chủng VK kiểm định gồm E. coli, Salmonella typhimurium, Streptococcus aureus. Tiến hành theo phương pháp 1.4.7.4, thu được kết quả như sau: Bảng 3.4 Hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus với vi khuẩn kiểm định Khoảng cách đối kháng của các chủng Bacillus (mm) STT Kí hiệu chủng Salmonella Streptococcus E. coli typhimurium aureus 1 BI1 - - 4 2 BI2 - - 6 3 BI3 - - 3 4 BI4 - - 5 5 MN1 - - 2 6 MN2 - - - 7 Sub - - 4 8 Yoi - - 7 9 Liche - - 5 10 Natto - - 4 11 BA - - 2 51
  62. BI1 BI2 Sub Yoi Liche BI4 Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định của các chủng Bacillus Kết quả được trình bày ở trên bảng cho thấy, 10/11 chủng có khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định Streptococcus aureus, trong đó chủng Yoi, BI2, Liche, BI4 cho hoạt tính đối kháng tương đối mạnh (7 mm, 6 mm, 5 mm, 5 mm). Tất cả 11 chủng Bacillus khảo sát không có khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định E. coli và Salmonella typhimurium. Tóm lại, chủng Yoi cho khả năng đối kháng mạnh với Streptococcus aureus với khoảng cách đối kháng là 7 mm Như vậy, qua 4 bước sàng lọc và tuyển chọn các đặc tính probiotic của các chủng Bacillus trong điều kiện in vitro, nhận thấy được 2 chủng Sub và Yoi có tiểm năng sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi. Bước kế tiếp, 2 chủng vi khuẩn này sẽ được khảo sát khả năng tạo sinh khối và sinh bào tử. Từ đó chọn ra chủng vi khuẩn tốt nhất cho sản xuất probiotic dạng bào tử Bacillus. 52
  63. 3.2 Đặc tính sinh học và phân loại chủng đã tuyển chọn 3.2.1 Đặc tính hình thái của chủng Sub và Yoi Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào (x40) Hình thái bào tử (x40) Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Sub Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào (x40) Hình thái bào tử (x40) Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Yoi 53
  64. 3.2.2 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi Bảng 3.5 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi Stt Đặc tính probiotic Sub Yoi 1 Tỷ lệ sống sót ở pH 2 sau 180 phút 43,35% 48,44% Khả năng chịu muối mật 2% sau 180 2 64,44% 27,74% phút Vòng phân giải protease (Khả năng phân 3 15,67 ± 0,47 15,00 ± 0,81 giải casein, mm) Vòng phân giải amylase (Khả năng phân 4 14,67 ± 0,47 13,00 ± 0,00 giải tinh bột, mm) Vòng phân giải cellulase (Khả năng 5 15,00 ± 0,0 14,67 ± 0,47 phân giải cellulose, mm) Khoảng cách đối kháng với VK kiểm 6 định Streptococcus aureus (Khả năng 4 7 đối kháng với VK kiểm đinh, mm) 3.3 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Sub 3.3.1 Thiết lập đường chuẩn Việc thiết lập đường cong tăng trưởng một cách gián tiếp theo giá trị OD bắt buộc phải thông qua một bước là thiết lập đường chuẩn tương quan giữa OD và mật độ tế bào. Sau các thao tác pha loãng, đo OD và đếm thì có được các dữ liệu như sau: 54
  65. Bảng 3.6 Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Sub OD N (cfu/ml) Log N 0,16 9,70 × 107 7,99 0,215 1,02 × 108 8,01 0,27 1,18 × 108 8,07 0,354 1,38 × 108 8,14 0,4 1,51 × 108 8,18 0,474 1,73 × 108 8,24 0,541 2,10 × 108 8,32 Dựa vào phân tích sự tuyến tính của giá trị OD theo Log N dựa vào công cụ Data Analysis Regressio, ta có được phương trình hồi quy: y = 0,8792x + 7,8312. Với giá trị R Square = 0,991 cho thấy 99,1% các trường hợp xảy ra được giải thích bằng phương trình y = 0,8792x + 7,8312, chỉ có 0,9% trường hợp không thể giải thích với phương trình này. Mặt khác, giá trị P-value của Intercept và OD đều nhỏ hơn 0,05 chứng tỏ phương trình y = 0,8792x + 7,8312 có ý nghĩa thống kê. Như vậy, phương trình hồi quy này là phù hợp Hình 3.5 Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Sub 55
  66. 3.3.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng Dựa vào biểu đồ cho thấy chủng Sub có pha lag rất nhỏ, chỉ trong 1 giờ đầu nuôi cấy, sau giờ thứ 1 bắt đầu pha log và kéo dài tới giờ thứ 12, kế tiếp là pha ổn định kéo dài tới thời điểm 24 giờ. Hình 3.6 Đường cong tăng trưởng chủng Sub theo thời gian 3.4 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Yoi 3.4.1 Thiết lập đường chuẩn Việc thiết lập đường cong tăng trưởng một cách gián tiếp theo giá trị OD bắt buộc phải thông qua một bước là thiết lập đường chuẩn tương quan giữa OD và mật độ tế bào. Sau các thao tác pha loãng, đo OD và đếm thì có được các dữ liệu như sau: 56
  67. Bảng 3.7 Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Yoi OD N (cfu/ml) Log N 0.103 1,51 × 107 7,18 0.151 2,25 × 107 7,35 0.316 4,90 × 107 7,69 0.394 6,75 × 107 7,83 0.527 1,15 × 108 8,18 Phân tích sự tuyến tính của giá trị OD theo Log N dựa vào công cụ Data Analysis Regressio, ta có được phương trình hồi quy: y = 2,0333x + 7,0164. Với giá trị R Square = 0,991 cho thấy 99,1% các trường hợp xảy ra được giải thích bằng phương trình y = 2,0333x + 7,0164, chỉ có 0,9% trường hợp không thể giải thích với phương trình này. Mặt khác, giá trị P-value của Intercept và OD đều nhỏ hơn 0,05 chứng tỏ phương trình y = 2,0333x + 7,0164 có ý nghĩa thống kê. Như vậy, phương trình hồi quy này là phù hợp Hình 3.7 Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Yoi 57
  68. 3.4.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng Dựa vào biểu đồ cho thấy chủng Yoi có pha lag rất nhỏ, chỉ trong 2 giờ đầu nuôi cấy, sau giờ thứ 4 bắt đầu pha log và kéo dài tới giờ thứ 12, kế tiếp là pha ổn định kéo dài tơi thời điểm 24 giờ. Hình 3.8 Đường cong tăng trưởng chủng Yoi theo thời gian 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành bào tử của các chủng Sub và Yoi Quá trình tạo sinh khối tế bào và bào tử phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện và thành phần môi trường nuôi cấy. Do đó, việc nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp cho mục đích này là điều rất cần thiết. Để khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên khả năng sinh trưởng của chủng nghiên cứu, chúng tôi nuôi chủng này trên các môi trường khác nhau (MT1 đến MT7 như đã trình bày trong phần 2.3). Sau 24 giờ nuôi cấy xác định mật độ tế bào (OD600nm và đếm khuẩn lạc). 58
  69. Hình 3.9 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng Sub và Yoi Qua kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy của cả 2 chủng thì nhận thấy rằng cùng thời gian khảo sát thì chủng Sub và Yoi hình thành bào tử cao nhất tương ứng ở môi trường MT6 (79,87%) và MT2 (70,13%). Do mục đích của nghiên cứu là tạo ra mật độ bào tử nhiều nhất nên quyết định chọn chủng Sub để nghiên cứu tiếp. Chủng Sub dựa vào tài liệu của Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ được xác định là chủng Bacillus Subtilis, do đó sẽ thuận lợi hơn trong việc khảo sát và nghiên cứu Theo báo cáo của Trần Quốc Việt và cộng sự (2008), nhóm Bacillus có khả năng sinh trưởng mạnh ở hầu hết các loại MT, kể cả các MT không đặc trưng cho chủng. Đó là các đặc tính rất quí của các chủng Bacillus khi chúng thật sự là những VK hữu ích được sử dụng như nguồn probiotic dùng trong chăn nuôi. 3.6 Kết quả khảo sát các điều kiện tạo bào tử tốt nhất Bào tử được tạo thành trong điều kiện môi trường thiếu dinh dưỡng, các độc tố do quá trình trao đổi chất sinh ra quá nhiều, dẫn đến tình trạng không phát triển được. Vì 59
  70. vậy tiến hành khảo sát các điều kiện khác nhau để thúc đẩy quá trình hình thanh bào tử trong thời gian ngắn như: cô đặc, lên men môi trường nghèo dinh dưỡng, xử lý pH, xử lý nhiệt độ lên men. Hình 3.10 Tỷ lệ hình thành bào tử bằng các phương pháp khác nhau theo thời gian của chủng Bacillus subtilis Sau 75 giờ khảo sát các điều kiện tạo bào tử nhiều nhất trong thời gian ngắn nhất, nhận thấy rằng khi xử lý pH 9 thì sau 29 giờ đã đạt được tỷ lệ hình thành bào tử B. subtilis là 74,26%, tuy nhiên theo thời gian mật độ bào tử có sự giảm nhẹ. Để đáp ứng được nhu cầu đối với việc sản xuất bào tử với quy mô pilot, rút ngắn thời gian sản xuất và mật độ bào tử đạt được nhiều. Vì vậy quyết định chọn xử lý pH 9 để tiếp tục quá trình lên men bằng bồn lên men 5 lít 60
  71. 3.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot 3.7.1 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô pilot - Tốc độ khuấy và oxy hòa tan: Trong 3 giờ đầu, lượng oxy hòa tan (pO2) được kiểm soát ở 20%, sau đó lượng oxy hòa tan được kiểm soát ở 10% do mật độ tế bào bắt đầu phát triển mạnh dẫn đến tình trạng lượng oxy hòa tan cần nhiều để đáp ứng lại nhu cầu tiêu thụ của tế bào. Tuy nhiên do hiện trạng nghiên cứu sử dụng không khí tự nhiên, không phải khí oxy nguyên chất nên khó nâng lượng oxy hòa tan lên cao. Lượng khí oxy hòa tan tăng lên được dựa vào hai yếu tố là lượng không khí bơm vào và tốc độ khuấy. Nếu tốc độ khuấy quá mạnh sẽ làm chết tế bào và tạo lớp bọt phía trên mặt ngăn cản quá trình trao đổi không khí, nên tốc độ khuấy được kiểm soát dao động ở 200 – 350 rpm. Lượng khí được bơm vào dao động ở 2000 – 4000 ccm, pO2 dao động 10 – 20% - pH bằng 7 được điều chỉnh bằng NaOH 3N và HCl 1N. - Kiểm tra mật độ: cách 4 giờ lên men lấy mẫu một lần để kiểm tra bằng cách pha loãng và cấy trang ở độ pha loãng thích hợp Hình 3.11 Mật độ tế bào với quy mô pilot của chủng Bacillus subtilis 61
  72. Theo bảng số liệu ở trên cho thấy rằng sau 8 giờ thì mật độ tế bào đạt được nhiều nhất với 8,20 × 108 cfu/ml. Vậy nên, 8 giờ được chọn là thời gian để xử lý pH tạo điều kiện hình thành bào tử 3.7.2 Tiến hành tạo bào tử Sau khi có được thời gian hình thành tế bào nhiều nhất, tiến hành lên men tạo bào tử với bồn lên men. Từ thí nghiệm mục 3.7.1 thu được kết quả như sau: - Môi trường tăng sinh: LB - Môi trường lên men tạo bào tử: MT6 - pO2: dao động trong khoảng 10 – 30% - Khuấy: 200 – 350 rpm - Thời gian: 36 giờ - pH: chỉnh pH 7. Sau 8 giờ lên men pH được chỉnh lên pH 9 bằng NaOH 3N và HCl 1N - Mật độ cấy giống: 10% - Nhiệt độ: 37oC - Chất phá bọt: Defoamer XP 747 thuộc công ty Kovin với tỷ lệ 0,5% - Kiểm tra mật độ tế bào: Sau khi lên men cứ 4 giờ lấy mẫu để kiểm tra. Sau 8 giờ lên men bắt đầu xử lý pH từ pH 7 lên pH 9 bằng NaOH 3N và HCl 1N để cân bằng pH trong bồn lên men và cứ 4 giờ lấy mẫu kiểm tra mật độ tế bào và mật độ bào tử 62
  73. Bảng 3.8 Tỷ lệ hình thành bào tử ở các khoảng thời gian khác nhau với quy mô pilot Thời gian (giờ) Tỷ lệ hình thành bào tử (%) 0 0 4 0 8 0 12 4,5 24 32,71 28 45,79 32 64,95 36 80,84 Sau khi xử lý pH thì tỷ lệ hình thành bào tử tăng cao theo thời gian. Tuy mật độ bào tử không cao có thể do tốc độ khuấy và lượng oxy hòa tan ảnh hưởng đến tỷ lệ hình thành bào tử. Sau khi xử lý pH thì bồn lên men vẫn tiếp tục được bơm không khí để duy trì lượng oxy hòa tan do lượng oxy hòa tan có ảnh hưởng đến việc hình thành bào tử. Theo Fabrízio Siqueira Boniola và cộng sự (2012), Sarrafzadeh và Navarro (2006) đã làm thí nghiệm và thấy được rằng nếu gián đoạn cung cấp oxy hòa tan sau khi kết thúc giai đoạn tăng trưởng của tế bào thì sẽ ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử. Do lượng oxy hòa tan ở giai đoạn ổn định không đủ để cung cấp năng lượng duy trì sự hình thành bào tử với mật độ tế bào dày đặc. [34, 52] Tóm lại sau 36 giờ lên men, mật độ bào tử đạt được 80,84% đã đáp ứng được yêu cầu đặt ra là sản xuất sản phẩm với mật độ 108 - 109 cfu/ml có chứa 80% bào tử và 20% tế bào sinh dưỡng. 63
  74. 3.8 Tạo chế phẩm Sau khi có được mật độ bào tử nhiều nhất, tiến hành ly tâm thu bào tử ở 5000 vòng/phút, 15 phút bằng máy ly tâm. Loại bỏ dịch nổi và thu bào tử, bào tử được trộn với chất mang là bột mì đã được hấp tiệt trùng ở 121oC, 1 atm. Sau đó đem sấy ở 40oC đến khi khô, nghiền mịn. Sau đó bổ sung các chất mang khác nhau với tỷ lệ thích hợp. Đóng gói Chế phẩm probiotic chịu nhiệt: Thành phần: Bacillus subtilis Mật độ: 8,65 × 107 cfu/ml Chất mang: bột mì Đóng gói: bằng túi bạc 1 kg 64
  75. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ 11 chủng Bacillus thuộc Phân Viện Chăn nuôi Nam Bộ đã chọn ra được chủng Bacillus subtilis SU có các đặc tính probiotic, có khả năng hình thành bào tử tốt trên môi trường MT6 với tỷ ệ hình thành bào tử đạt 79,87% Điều kiện tạo bào tử tốt nhất đối với chủng Bacillus subtilis là xử lý pH bằng 9 sau 29 giờ xử lý (với tỷ lệ hình thành bào tử là 74,26%) Mật độ tế bào khi sản xuất với quy mô pilot đạt được nhiều nhất sau 8 giờ (8,20 × 108 cfu/ml) và tỷ lệ hình thành bào tử đạt được nhiều nhất sau 36 giờ với 80,84% Đã sản xuất 35 kg bào tử Bacillus subtilis SU với mật độ 8,65 × 107 cfu/ml với 3,5 lít lên men 4.2 Kiến nghị - Tối ưu hóa các điều kiện như oxy hòa tan, chất phá bọt, tốc độ khuấy để nâng cao mật độ tế bào - Khảo sát tỷ lệ sống sót của bào tử sau khi đóng gói thành sản phẩm - Khảo sát môi trường lên men tạo bào tử Bacillus subtilis SU sử dụng các nguồn carbon, nitơ phụ phế phẩm công nghiệp để cải thiện giá thành sản phẩm 65
  76. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Kiều Hữu Ảnh, 1999. Giáo trình VSV Công nghiệp, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr.100-108. [2] Tô Minh Châu, 2000. Giáo rình thực tập vi sinh vật học [3] Phạm Thị Trân Châu, 2007). Công nghệ sinh học (tập 3), NXB Giáo dục [4] Trần Thị Dân, 2002. Thay đổi sinh lý heo con, Tài liệu giảng dạy, Trường ĐH Nông lâm Tp. HCM [5] Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ, 1995. Bệnh đường tiêu hóa ở lợn, NXB Nông nghiệp, Hà Nội [6] Phạm Kim Đặng, Nguyên Đình Trình, Nguyễn Hoàng Thịnh và cộng sự, 2016. Ảnh hưởng của Probiotics Bacillus dạng bào tử chịu nhiệt đến năng suất, vi khuẩn và hình thái vi thể biểu mô đường ruột gà thịt lông màu. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật chăn nuôi, số 213 [7] Nguyễn Thị Hoàng Hải, 2009. Nghiên cứu thu nhận enzyme α- amylase từ trực khuẩn cỏ khô, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. HCM [8] Hội Nhi khoa Tp. HCM, 2007. Bacillus clausii và vai trò probiotics trong điều trị tiêu chảy. Báo cáo hội thảo chuyên đề probiotic, tr.1-12 [9] Lã Văn Kính, 1998. Những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong công nghệ sản xuất thức ăn gia súc và vai trò của probiotic đối với sức khỏe động vật. Báo cáo khoa học, Trung tâm Thông tin KH và CN, Sở KHCN và Môi trường Tp. HCM [10] Trần Thị Ái Liên, 2011. Nghiên cứu đặc điểm và vai trò của Lactobacillus acidophilus trong chế phẩm probiotic, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. HCM, tr. 7-9, 39-40 66
  77. [11] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2006. Thí nghiệm vi sinh vật học (tập 2), NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM [12] Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương, 2008. Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM [13] Đỗ Thị Thu Nga, 2011. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng Bacillus, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. HCM, tr. 27-36. [14] Trần Trường Nhân, 2009. Phân lập VK Bacillus subtilis từ phân heo đối kháng với E. coli và ứng dụng trong sản xuất probiotic, Luận văn tốt nghiệp ngành Kỹ sư Chăn nuôi-Thú Y, Trường ĐH Nông lâm Tp. HCM [15] Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008. Phân lập và sàng lọc một số chủng Bacillus có hoạt tính probiotic trong nuôi trồng thủy sản, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Khoa học tự nhiên Tp. HCM, tr. 8-11, 17-19. 29 [16] Phạm Minh Nhựt, 2015. Giáo trình các phương pháp phân tích vi sinh [17] Lương Đức Phẩm, 2007. Các chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 112-152 [18] Trần Thị Bích Quyên, 2012. Nghiên cứu và tuyển chọn một số chủng Bacillus làm probiotic trong chăn nuôi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. HCM [19] Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Minh Thái,Nguyễn Thị Linh Giang và cộng sự, 2014. Nghiên cứu đặc tính probiotic của Bacillus subtilis BS02, Y học thực hành (907) – số 3/2014, trang 20-24 [20] Nguyễn Thị Thu Thảo, 2007. Sản xuất và thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm probiotic phòng tiêu chảy và trên sự sinh trưởng của heo con sau cai sữa 103 (21 đến 67
  78. 58 ngày tuối), Luận văn tốt nghiệp ngành Bác sĩ Thú y, Trường ĐH Nông lâm Tp. HCM. [21] Hồ Trung Thông, Hồ Lê Huỳnh Châu, 2009, Nghiên cứu khả năng sống trong môi trường đường tiêu hóa của động vật của một số chủng vi sinh vật nhằm từng bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotics, Tạp chí khoa học, 09 (55), Trường Đại học Nông lâm, Đại học Huế, tr. 82-84 [22] Trần Thanh Thủy, 1999. Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr. 45-56, 97-102,163-171 [23] Văn Thị Thủy, 2011. Phân lập các chủng Bacillus spp. có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Khoa học tự nhiên Tp. HCM, tr. 36, 52-54 [24] Trần Thị Thu Thủy, 2003. Khảo sát tác dụng thay thế KS của probiotic trong phòng ngừa tiêu chảy do E. coli trên heo con, Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Trường ĐH Nông lâm Tp. HCM, tr. 21-24, 28-43 [24] Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009. Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Trường ĐH Sư phạm Tp. HCM [25] Trần Linh Thước, 2013. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB Giáo dục Việt Nam [26] Trần Thị Mỹ Trang, 2006. Nghiên cứu sử dụng VK lactic để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. HCM, tr. 58-60. 68
  79. [27] Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành, 2009. Công nghệ vi sinh và môi trường, NXB Giáo dục [28] Đào Thị Thanh Xuân, 2008. Nghiên cứu sử dụng nhóm VK Bacillus tạo chế phẩm sinh học xử lí môi trường nước nuôi thủy sản, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Hà Nội, tr. 15-27, 32-35, 47-53 Tài liệu tiếng anh [29] Aronson A. I and Fitz J. 1976. Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat, Bacterial. Rev. 40, pp. 360-402 [30] Barbosa T. M., Serra C. R., La Ragione R. M., Woodward M. J. and Henriques A. O. (2005). Screening for Bacillus isolated in the broiler gastrointestinal tract, Applied and Environmental Microbiology, 71, pp. 968 – 978 [31] Baumann P, Clark A. M, Baumann L, Broadwell H. A. 1991. Bacillus sphaericus as a mosquito pathogen. Properties of the organisms and its toxins. Microbiol, Rev.55, pp. 425-436 [32] Boniolo FS, Rodrigues RC, Prata AM., et al., 2012. Oxygen supply in Bacillus thuringiensis fermentations: bringing new insights on their impact on sporulation and δ-endotoxin production. Appl Microbiol Biotechnol. 94(3), 625-36 [33] Bula J.A, Costilow R, Sapple E.S., 1978. Biology of Bacillus popillae, Adv. Appl, Microbiol, 23, pp. 1-18 [34] Carvalho A. L. U. D., Oliveira F. H. P. C. D., Mariano R. D. L. R., et al., 2010. Growth, Sporulation and Production of Bioactive Compounds by Bacillus subtilis R14. Brazilian archives of biology and technology. 53, 643-652 69
  80. [35] Escobar, Valeska Villegas, et al. Process for increasing biomass and spores production of plant growth promoting bacteria of the Bacillus genus. U.S. Patent Application No. 14/471,345. [36] Eui-Sun Son and Jong-Il Kim, 2002. Purification and Characterization of Caseinolytic Extracellular protease from Bacillus amyloliquefaciens S94, The Journal of Microbiology, 40 (1), pp. 26-32 [37] Fuller. R., 1989. Probiotics in man and animals. J Appl Bacteriol, 66, pp. 65–78 [38] Fuller. R., 1992. History and development of probiotics, In: R. Fuller (Ed.) Probiotics: The Scientific Basis. pp 1−8. Chapman & Hall, London [39] Gibson T và Gordon Ruth E., 1975. Bacillus in Bergey`s Manual of Detemenative Bacteriology, R.E. Buchanan & N.E. Gibbons. Editors, willion & Wilkins, pp576-583 [40] Halimi B., Dortu C., Argwelles A., et al., 2010. Antilisterial Activity on Poultry Meat of Amylosin, Bacteriocin from Bacillus amyloliquefaciens GA1, Probiotic and Antimicro. Prot,. DOI10.1007/s. 12602-00-9040-9 [41] Hong H. A., Le Hong Duc, Simon M. C., 2005. The use of bacterial spore formers as probiotics, FEMS Microbiology Reviews, 29, pp. 813 – 835 [42] Huilin Yang, Yuling liao, Bin Wang, Ying Lin, and Lipan, 2011. Complete genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens XH7, which exhibits production of purine nucleosides, Journal of bacteriology, pp. 5393-5594 [43] Idris SE, Iglesias DJ, Talon M, Borriss R, 2007. Tryptophan- dependen production of Indoles-3-Acetic (IAA) affects level of plant grawth promotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42, Molecular-Microbe Interactions, 20 ( 6), pp. 619- 626. 70
  81. [44] J. Errington, 2003. Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis, Nat Rev Microbiol, 1(2), pp. 117-26 [45] Luisa F. Posada-Uribe, Magally Romero-Tabarez, Valeska Villegas-Escobar, 2015. Effect of medium components and culture conditions in Bacillus subtilis EA- CB0575 spore production. Bioprocess Biosyst Eng,. 38(10), 1879-88 [46] Niall A. Logan and Paul De Vos, 2009. Bacillus in Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Paul De Vos, George M. Garrity, Dorothy Jones, Noel R. Krieg, Wolfgang Ludwig, Fred A. Rainey, Karl-Heinz Schleifer, William B. Whitman, Editor, Springer: London, pp. 21-128 [47] Nista E. C., Candelli M., Cremonini F., Cazzato I. A. and et al., 2004. Bacillus clausii therapy to reduce side-effects of anti-Helicobacter pylori treatment: randomized, double-blind, placebo controlled trial, Alimentary Pharmacology and Therapeutics, 20(10), pp. 1181 – 1188 [48] Priest (F.G), Goodfellow (M.), Shute (LA) and Berkeley (R.C.W), 1987. Bacillus amyloliquefaciens sp. nov. nom. rev, Int, j. Syst. Bacteriol, 37, pp. 69-71 [49] S. M. S. Monteiro, J. J. Clemente, M. J. T. Carrondo., et al., 2014. Enhanced Spore Production of Bacillus subtilis Grown in a Chemically Defined Medium. Advances in Microbiology. 4, 444-454 [50] Sameh. H. M. (2003), “Influence of Different Capsule Materials on the Physiologycal Properties of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus”, Dessertation at the University of Bonn. pp. 49-50 [51] Sandra M. Monteiro, João J. Clemente, Adriano O. Henriques., et al., 2005. A Procedure for High-Yield Spore Production by Bacillus subtilis. Biotechnol . 21, 1026- 1031 71