Đồ án Phân lập các chủng Trichoderma spp. từ đất vườn cacao và đánh giá khả năng đối kháng của chúng với nấm phytophthora palmivora gây thối quả cacao

87 trang thiennha21 12/04/2022 7630

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập các chủng Trichoderma spp. từ đất vườn cacao và đánh giá khả năng đối kháng của chúng với nấm phytophthora palmivora gây thối quả cacao", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_phan_lap_cac_chung_trichoderma_spp_tu_dat_vuon_cacao_v.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập các chủng Trichoderma spp. từ đất vườn cacao và đánh giá khả năng đối kháng của chúng với nấm phytophthora palmivora gây thối quả cacao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP CÁC CHỦNG TRICHODERMA SPP. TỪ ĐẤT VƯỜN CACAO VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHÚNG VỚI NẤM PHYTOPHTHORA PALMIVORA GÂY THỐI QUẢ CACAO Ngành: CNSH – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : LÊ NHẬT ĐĂNG MSSV: 1151110082 Lớp: 11DSH03 - TP. Hồ Chí Minh, 2015 -
LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả trong Đồ án là trung thực. Mọi thông tin trích dẫn trong Đồ án đều được ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện Lê Nhật Đăng
LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn bên cạnh, cổ vũ, động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để tôi có thể học tập và hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hai – Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học – Đại Học Công nghệ Tp HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi từ việc định hướng đề tài đến theo sát tiến trình thí nghiệm. Tôi đã học được nhiều điều hay ở cô về kiến thức chuyên môn cũng như lòng nhiệt huyết, tinh thần trách nhiệm trong công việc, và cả tình yêu thương đối với mọi người. Cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện về trong thiết bị thí nghiệm thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành tốt đẹp Đồ án này. Xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và Môi trường đã giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức quan trọng tạo nền tảng kiến thức vững chắc để hoàn thành tốt Đồ án và sau này có thể ứng dụng vào công việc thực tiễn. Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn thành tốt khóa học 2010 – 2014. Và cuối cùng tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng làm khóa, các anh chị khóa 10, các em khóa 12 đã giúp tôi hoàn thành đồ án cũng như trao đổi kinh nghiệm làm việc trong quá trình làm đồ án. Tp. HCM, Ngày 10 tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện Lê Nhật Đăng
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC  MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu về cây cacao. 3 1.1.1. Phân loại. 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái 4 1.1.3. Đặc điểm sinh thái. 5 1.1.4 Thành phần hóa học trái cacao. 6 1.1.5. Tình hình trồng và sản xuất cacao tại Việt Nam. 6 1.1.6. Dịch hại trên cây cacao 9 1.1.6.1. Côn trùng gây hại chính 9 1.1.6.2. Bệnh hại chính trên cacao. 10 1.2. Giới thiệu về nấm Phytophthora. 12 1.2.1. Vòng đời của nấm phytophthora 14 1.2.2. Đặc điểm hình thái của giống Phytophthora. 14 1.2.3. Đặc tính chung của nhóm nấm Phytophthora spp. 15 1.2.4. Khả năng gây bệnh của Phytophthora trên thực vật 16 1.2.5. Bệnh thối quả gây hại trên cây cacao. 22 1.2.5.1. Thời gian xuất hiện và nguồn lây bệnh 22 1.2.5.2. Triệu chứng bệnh. 23 - i -
Đồ án tốt nghiệp 1.2.5.3. Thiệt hại do bệnh gây ra. 23 1.2.5.4. Các nghiên cứu về bệnh thối trái trên cacao. 24 1.2.5.5. Một số phương pháp phòng ngừa bệnh thối trái trên cacao. 24 1.3. Giới thiệu về nấm Trichoderma. 26 1.3.1. Phân loại: 26 1.3.2. Lịch sử nghiên cứu về Trichoderma. 26 1.3.3. Cấu tạo tế bào Tricoderma spp. 27 1.3.4. Đặc điểm sinh học và sự phân bố của nấm Trichoderma spp. 27 1.3.5. Đặc điểm hình thái của nấm Tricoderma spp. 29 1.3.6. Cơ chế đối kháng và vai trò nấm Trichoderma trong đất. 29 1.3.6.1. Cơ chế 29 1.3.6.2. Nấm Trichoderma spp. trong phòng trừ sinh học bệnh hại cây trồng. 31 1.3.6.3. Khả năng phân hủy chất hữu cơ của nấm Trichoderma spp. 32 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 33 2.2. Vật liệu 33 2.1.1. Nguồn mẫu phân lập 33 2.1.1.1. Nguồn mẫu phân lập nấm bệnh 33 2.1.1.2. Nguồn phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp. 33 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 33 2.2.4. Hóa chất 34 2.2.5. Các loại môi trường 35 2.4. Phương pháp nghiên cứu. 37 2.4.1. Phương pháp phân lập nấm gây bệnh thối trái trên cacao. 37 - ii -
Đồ án tốt nghiệp 2.4.1.1. Phân lập từ mẫu trái cacao nhiễm bệnh thối trái. 37 2.4.3. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm. 38 2.4.3.1. Quan sát đại thể nấm sợi 38 2.4.3.2. Quan sát vi thể nấm. 38 2.4.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch. 39 2.4.2. Phương pháp phân lập nấm đối kháng Trichoderma spp 41 2.4.2.1. Các bước thu mẫu 41 2.4.2.2. Các bước phân lập. 41 2.4.2.3. Cấy truyền và làm thuần mẫu nấm Trichoderma. 42 2.4.3. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm. 42 2.4.3.1. Quan sát đại thể nấm sợi. 42 2.4.3.2. Quan sát vi thể nấm. 43 2.4.5. Định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của các chủng nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng cacao. 43 2.4.6. Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng nấm Trichoderma spp. 44 2.4.6. Khảo sát tính đối kháng của chủng nấm Trichoderma spp. với chủng nấm bệnh Phytophthora palmivora trong điều kiện in vitro. 44 2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu. 46 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1. Phân lập nấm Phytophthora palmivora trên trái cacao. 47 3.1.1. Kết quả phân lập nấm Phytophthora palmivora. 47 3.1.2. Đặc điểm hình thái của chủng nấm bệnh. 47 3.1.3. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch ở điều kiện in vitro 49 3.2. Kết quả phân lập một số chủng nấm Trichoderma từ đất trồng cacao. 51 - iii -
Đồ án tốt nghiệp 3.2.1. Kết quả phân lập Trichoderma từ đất trồng cacao. 51 3.2.2. Kết quả quan sát hình thái sợi nấm. 51 3.2.2.1. Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc1. 51 3.2.2.2. Đặc điểm hỉnh thái chủng nấm Tcc2. 52 3.2.2.3. Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc3. 53 3.2.2.4. Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc4. 55 3.2.2.5. Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc5. 56 3.2.2.6. Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc6. 57 3.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (chitinase và cellulose) của các chủng Trichoderma phân lập từ đất vườn cacao. 58 3.3.1. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase ngoại bào. 58 3.3.2. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào. 59 3.4. Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng Trichoderma phân lập được. . 60 3.5. Khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma phân lập được với nấm Phytophthora palmivora. 61 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 4.1. Kết luận 70 4.2. Kiến nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 71 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 72 TÀI LIỆU INTERNET 74 - iv -
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT  1. CMC: Carboxymethyl cellulose 2. ĐC: Đối chứng 3. MSM: Minimal Synthetic Medium 4. PDA: Potato D-Glucose Agar 5. TN: Thí nghiệm 6. VSV: Vi sinh vật 7. NSC: Ngày sau cấy 8. CMA: Cornmeal agar - v -
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1 : Các thành phần của hạt cacao tươi, tính theo % trọng lượng tươi 6 Bảng 1. 2: Các tỉnh trồng ca cao ở Việt Nam 8 Bảng 1. 3: Một số dịch hại chính trên cacao. 11 Bảng 1. 4: Bệnh Phytophthora trên một số cây trồng 20 Bảng 1. 5 : Nguồn lây nhiễm gây bệnh thối trái do nấm Phytophthora spp. trên cacao. 22 Bảng 2. 1 : Nguồn tráí cacao nhiễn bệnh thối trái 33 Bảng 2. 2: Nguồn đất phân lập Trichoderma. 33 Bảng 3. 1: Tần xuất xuất hiện chủng nấm Phy.1 47 Bảng 3. 2: Tỷ lệ trái cacao bị nhiễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo 50 Bảng 3. 3 : Kết quả tái phân lập lại tác nhân gây bệnh sau khi tái nhiễm trên trái cacao sạch bệnh theo quy tắc Koch. 50 Bảng 3. 4. Đường kính tản nấm (mm) sau 3 ngày nuôi cấy tại các nồng độ muối khác nhau 60 Bảng 3. 5: Đường kính tản nấm Phytophthora palmivora sau các ngày theo dõi khả năng đối kháng với nấm Trichoderma. 62 Bảng 3. 6: Tỷ lệ % đối kháng giữa nấm Phytophthora palmivora và nấm Trichoderma. 62 - vi -
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Trang Hình 1. 1: Cây cacao 4 Hình 1. 2: Trichoderma harzianum 26 Hình 2. 1: Quy trinh phân lập nấm bệnh từ mẫu thực vật nhiễm bệnh 38 Hình 2. 2: Phương pháp pha loãng dung dịch đất. 42 Hình 2. 3: Phương pháp cấy đối kháng trược tiếp 46 Hình 3. 1: Hình thái đại thể chủng nấm Phy.1 trên môi trường CMA sau 7 ngày nuôi cấy. 47 Hình 3. 2: Hình ảnh vi thể Phy.1 dưới kính hiển vi quang học 100X 48 Hình 3. 3: Kết quả thí nghiệm tái nhiễm chủng nấm Phy.1 trên trái cacao sạch bệnh theo quy tắc Koch 49 Hình 3. 4: Hình thái đại thể chủng nấm Tcc1 52 Hình 3. 5: Hình thái vi thể của chủng Tcc1. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. 52 Hình 3. 6 : Hình thái đại thể chủng nấm Tcc2 53 Hình 3. 7. Hình thái vi thể của chủng Tcc2. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. 53 Hình 3. 8: Đại thể chủng nấm Tcc3 54 Hình 3. 9: Hình thái vi thể cua chủng Tcc3. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. 54 Hình 3. 10: Hình thái đại thể chủng nấm Tcc4 55 Hình 3. 11: Hình thái vi thể của chủng Tcc4. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. 55 Hình 3. 12: Hình thái đại thể chủng nấm Tcc5 56 Hình 3. 13: Hình thái vi thể của chủng Tcc5. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. 56 Hình 3. 14: Hình thái đại thể chủng nấm Tcc6 57 - vii -
Đồ án tốt nghiệp Hình 3. 15: Hình thái vi thể Tcc6. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. 57 Hình 3. 16: Đường kính vòng phân giải cơ chất chitin huyền phù của 6 chủng nấm Trichoderma phân lập được. 58 Hình 3. 17: Vòng phân giải cơ chất chitin huyền phù của các chủng nấm phân lập được (sau 2 ngày nuôi cấy) 58 Hình 3. 18: Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải cơ chất CMC của các chủng Trichoderma phân lập được. 59 Hình 3. 19: Vòng phân giải cơ chất CMC của các chủng Trichoderma phân lập được sau 2 ngày nuôi cấy 59 Hình 3. 20: Biểu đồ thể hiện đường kính tản nấm Trichoderma phân lập được sau 3 ngày nuôi cấy tại các nồng độ mưới khác nhau. (ĐV: mm) 61 Hình 3. 21: Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sao 3 ngày đối kháng trực tiếp trong đĩa petri 63 Hình 3. 22: Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sao 5 ngày đối kháng trực tiếp trong đĩa petri. 64 Hình 3. 23 : Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sao 7 ngày đối kháng trực tiếp trong đĩa petri 65 Hình 3. 24: Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sao 9 ngày đối kháng trực tiếp trong đĩa petri 66 Hình 3. 25: Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sao 11 ngày đối kháng trực tiếp trong đĩa petri 67 Hình 3. 26: Hiện tương giao thoa sợi nấm Trichoderma và nấm Phytophthora palmivora. (100X) 68 - viii -
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Trên thế giới, cây ca cao (Theobroma cacao) và những sản phẩm từ nó đã có lịch sử lâu đời. Những sản phẩm từ cây ca cao luôn mang lại hiệu quả kinh tế cao. Sản phẩm chính của cây ca cao là hạt ca cao được sử dụng làm nguyên liệu trong công nghiệp chế biến và thực phẩm và là sản phẩm hoàn chỉnh hay bán hoàn chỉnh trong các ngành công nghiệp khác. Hiện nay, tại Việt Nam trong chiến lược phát triển cây công nghiệp của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, cây ca cao đang rất được chú trọng. Ca cao được khuyến khích trồng ở nhiều địa phương với mục tiêu 60 000 ha vào năm 2020 (Theo Ban điều phối cacao Việt Nam – VCC), sản lượng ca cao trong tương lai sẽ rất lớn. Tuy nhiên vài năm gần đây diện tích trồng cây cacao đang giảm mạnh theo Sở NN- PTNT tỉnh Bến Tre, tính đến tháng 2 năm 2013 diện tích ca cao của tỉnh chỉ còn hơn 5.200 ha (giảm tương đương 50%). Nguyên nhân chính là vì cây cacao bị nhiều bệnh hại tấn công làm giảm năng suất. Trong đó bệnh cháy lá, thối quả do nấm Phytophthora palmivora gây hại nghiêm trọng và là một trong những nguyên nhân chính làm mất năng suất, chất lượng và sự phát triển của sản xuất cacao tại Việt Nam. Vì vậy việc tìm ra quản lý nấm Phytophthora palmivora nhằm giảm thiệt hại cho trồng trọt và sản xuất cacao ở các vùng là nhu cầu rất cấp thiết hiện nay. Xuất phát từ lý do trên, sinh viên thực hiện đề tài “Phân lập các chủng Trichoderma spp. từ đất vườn cacao và đánh giá khả năng đối kháng của chúng với nấm Phytophthora palmivora gây thối quả cacao” 2. Mục đích nghiên cứu đề tài: Tìm được chủng nấm Trichoderma spp có hiệu quả khống chế nấm Phytopthora palmivora gây bệnh trên thối trái trên cây cacao. Đồng thời bổ sung chủng nấm mới vào bộ sưu tập Trichoderma cho phòng thí nghiệm Hutech. Muc tiêu cụ thể - Phân lập được chủng nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối trái trên cacao. - Phân lập một số chủng nấm Trichoderma từ đất trồng cacao và xác định được một số đặc điểm sinh học của chúng. - 1 -
Đồ án tốt nghiệp - Xác định được khả năng đối kháng nấm Phytopthora palmivora của các chủng nấm Trichoderma phân lập được trong điều kiện in vitro. 3. Nội dung nghiên cứu: - Phân lập nấm Phytopthora palmivora gây bệnh thối trái ca cao - Phân lập các chủng nấm Trichoderma trên đất trồng cacao. - Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và khả năng đối kháng nấm Phytopthora sp. của các chủng nấm Trichoderma spp trong đĩa petri. - Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm Trichoderma thu nhận được trong điều kiện in vitro. - 2 -
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây cacao. 1.1.1. Phân loại. Cây ca cao (Theobroma cacao L.) có nguồn gốc từ những khu rừng nhiệt đới Amazon, nhưng những giống hoang dại cũng được tìm thấy từ Mexico đến Peru. Người Mayas ở Yucatan và người Aztec ở Mexico đã trồng cây ca cao từ rất lâu trước khi chúng được đưa tới châu Âu. Những người Nam Mỹ cổ đại rất thích uống ca cao trộn với gia vị và bột ngô. Họ tin rằng ca cao là món ăn của thượng đế và chỉ có hoàng tộc mới được sử dụng. Từ “cacao” xuất phát từ tiếng Maya còn người Aztec gọi chúng là cacauatol nghĩa là nước ca cao. Đầu thế kỉ 16, người Tây Ban Nha xâm lược Mexico và sau đó đổi tên cacauatol thành chocolatol. Sau đó từ chocolatol được đổi thành chocolate vào khoảng cuối thế kỉ 16 và tên gọi đó được giữ đến bây giờ. Do đó từ “chocolate” có nghĩa nguyên thủy là “nước cacao” (Chiyoda, Sakado-shi, Saitama, 2003). Vào năm 1754, nhà sinh vật học người Thụy Điển Carl von Linné dùng tên “Theobroma” – món ăn của thượng đế - để chỉ loài cacao (Iwao Hachiya, 2003). Ngày nay, tất cả các cây cacao trồng đều xếp vào loài Theobroma. Do người Tây Ban Nha thích nước giải khát có vị ngọt, cho nên không bao lâu sau chocolate đã được tiêu thụ phổ biến tại Tây Ban Nha và từ đây cây cacao được mang vào trồng ở các thuộc địa của đế quốc Tây Ban Nha thời ấy. Cuối thế kỉ 16, cây cacao trồng hầu khắp ở các vùng nhiệt đới Trung và Nam Mỹ và trên nhiều hòn đảo ở vùng Caribbe như Trinidad, Grenada, St. Lucia , mà chủ yếu là ở Trinidad. Người Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, và Hà Lan về sau cũng đưa cây cacao vào các hòn đảo West Indies (Cuba, Dominica, Jamaica), Đông Nam Á (Philippines, Indonesia) và Ceylon (Sri Lanka) (Phạm Trí Thông, 1999). - 3 -
Đồ án tốt nghiệp Thực vật học Cây cacao (Theobroma cacao) thuộc:  Giới: Plantae  Bộ: Malvales  Họ: Malvaceae  Phân họ: Byttnerioideae  Chi: Theobroma  Loải: T.cocoa Hình 1. 1: Cây cacao (Theobroma cacao) Chi Theobroma gồm 22 loài, trong đó chỉ có loài Theobroma cacao là có giá trị kinh tế. Theobroma cacao được chia ra làm 2 loài phụ : + Criollo: có nguồn gốc từ Trung Nam Mỹ. Đặc điểm rất thơm, ít đắng nhưng năng suất thấp, khả năng kháng bệnh kém, trồng 4-5 năm mới có trái. Hiện nay giống này không được trồng phổ biến + Forastero: là các giống cacao thường gặp ở Brazil và Tây Phi, Trung Nam Mỹ, Malaysia, Indonesia Đặc điểm: năng suất cao và kháng sâu bệnh nhưng chất lượng trung bình. Hiện chiếm 80 % nguyên liệu sản xuất chính trên thế giới. Ngoài ra còn có nhóm Trinitario là nhóm lai giữa hai nhóm Criollo và Forastero. Đặc điểm: năng suất cao và kháng bệnh tốt. Chiếm 15 % sản lượng chế biến của thế giới. (Intermediate technology development group, 1999). 1.1.2. Đặc điểm hình thái Cacao là loài cây thân gỗ nhỏ có thể cao đến 10 - 20 m nếu mọc tự nhiên trong rừng. Trong sản xuất do trồng mật độ cao và khống chế sự phát triển thông qua tỉa cành nên cây thường có chiều cao trung bình khoảng 5 - 7 m, đường kính thân từ 10 -18 cm. Cacao sinh trưởng tốt dưới bóng che, do đó có thể trồng xen với các loại cây kinh tế khác. Thời kỳ kinh doanh hiệu quả có thể kéo dài từ 25 - 40 năm. Lá dài 25 cm, màu đậm, hình gân lông chim. Thân cây do thụ tinh, mỗi năm cho đến hàng nghìn hoa ở thân chính và cành to nhưng chỉ có 1 - 3 % thành trái. Sau khi thụ phấn trái - 4 -
Đồ án tốt nghiệp tăng trưởng chậm trong khoảng 40 ngày đầu và đạt tốc độ tối đa sau 75 ngày. Sau khi thụ phấn 85 ngày sự tăng trưởng của trái chậm lại, trong khi hạt bên trong trái bắt đầu tăng trưởng nhanh, đây cũng là thời kỳ hạt tích luỹ chất béo. Lớp cơm nhầy hình thành khoảng 140 ngày sau khi thụ phấn Trái cacao có thể đạt chiều dài 10 - 30 cm, đường kính 7 - 9 cm, cân nặng từ 200 - 1000 g. Tuỳ theo từng loài, hình dạng của trái thay đổi từ hình cầu, hình dài và nhọn, hình trứng hoặc hình ống. Màu sắc của trái khá đa dạng, có loại trái màu xanh, màu vàng có loại màu đỏ. Khi hạt tăng trưởng tối đa, trái vào giai đoạn chín. Trái chín không nở bung ra và ít khi rụng khỏi cây. Từ khi thụ phấn đến trái chín kéo dài từ 5 - 6 tháng tuỳ theo giống. Mỗi trái chứa từ 30 - 40 hạt. Mỗi hạt có lớp cơm nhầy bao quanh có vị chua, ngọt, thơm và xếp thành 5 dãy. Thời gian thu hoạch thay đổi theo từng vùng canh tác, đối với các nước nằm ở phía Bắc xích đạo, thời gian thu hoạch vụ chính thường từ tháng 9 đến tháng 12 và vụ hai từ tháng 4 đến tháng 6. (Phạm Trí Thông, 1999) 1.1.3. Đặc điểm sinh thái. Cây cacao thường được trồng trong khoảng từ xích đạo đến vĩ độ 20. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là từ 30 - 30 oC, nhiệt độ thấp nhất cho phép là 18oC. Lượng mưa hàng năm thích hợp nhất trong khoảng 1150 đến 3000 mm. Đất trồng nên xốp và ẩm. Ẩm độ thích hợp nhất từ 70 - 80 %. Cây cacao là loại cây ưa bóng mát. Cây cacao lúc đầu cần 25 - 50 % ánh sáng, nhu cầu về bóng mát giảm đi khi cây cacao đã phát triển để tự đảm bảo được tán che cho mình. Che sáng làm giảm nhu cầu phân bón đến một mức độ nhất định. Sau đó muốn tăng độ chiếu sáng để đạt năng suất cao thì phải đảm bảo đủ ẩm cho đất và tăng lượng phân bón. Cách nhân giống hiệu quả nhất là từ. Việc tạo cây con làm giống bằng cách ghép hạt tại hố trồng không thuận lợi bằng gieo hạt tại vườn ươm, sau 4 - 6 tháng đưa cây con ra đất trồng. Ngoài ra, người ta còn nhân giống ca cao bằng phương pháp vô tính như: giâm, ghép và chiết cành. hạt (Intermediate technology development group, 1999) - 5 -
Đồ án tốt nghiệp 1.1.4 Thành phần hóa học trái cacao. Bảng 1. 1 : Các thành phần của hạt cacao tươi, tính theo % trọng lượng tươi Thành phần Chất nhầy Vỏ hạt Phôi nhũ Nước 84.5 9.4 35 Chất béo (bơ - 3.8 31.3 cacao) Carbonhydrat + Cellulose - 13.8 3.2 + Tinh bột - 46.0 4.5 + Pentosans 2.7 - 4.9 + Sucrose 0.7 - - + Glucose 10 - 1.1 + Fructose Nitrogen + Protein 0.6 18 8.4 + Theobromine - - 2.4 + Enzyme - - 0.8 + Polyphenols - 0.8 5.2 Acid hữu cơ 0.7 - 0.6 Citric và Acetic,Oxalic Muối khoáng 0.8 8.2 2.6 Tổng số 100 100 100 Nguồn: F. Hardy (1960) 1.1.5. Tình hình trồng và sản xuất cacao tại Việt Nam. Hiện nay, việc phát triển cây ca cao tại nước ta dựa theo vùng quy hoạch sản xuất. Mặc dù điều kiện của các địa phương đều thích hợp cho cây phát triển. Song hạt ca cao chỉ mới là mặt hàng để xuất khẩu. Trong nước hiện chưa có cơ sở tiêu thụ sản phẩm. Một lượng nhỏ sản lượng ca cao được các cơ sở thủ công tại địa phương - 6 -
Đồ án tốt nghiệp thu mua và sản xuất theo phương pháp thủ công. Với dự án Success Alliance được triển khai ở nước ta từ năm 2002, người nông dân trồng ca cao được hỗ trợ mọi mặt. Đây là một chương trình do Bộ Nông nghiệp Mỹ hỗ trợ và tổ chức phi Chính phủ Mỹ ACDI- VOCA triển khai để hỗ trợ đào tạo về kĩ thuật giúp nông dân trồng ca cao đạt chất lượng xuất khẩu, đồng thời liên kết các tổ chức thu mua, chế biến sản phẩm cho người nông dân. Hiện tại, Bộ nông nghiệp Mỹ (USDA) đang hỗ trợ 4 triệu USD để mở các đợt tập huấn cho nông dân trồng và nâng cao diện tích canh tác cây ca cao; Cơ quan phát triển quốc tế Mỹ (USAID) tài trợ 800000 USD để giúp Việt Nam trở thành một nước cung cấp hạt ca cao đã lên men có chất lượng cao và chương trình PSOM của Chính phủ Hà Lan giúp Việt Nam phát triển thành nhà sản xuất ca cao đạt tiêu chuẩn chất lượng với mức hỗ trợ là 650000 USD. Bên cạnh việc nhập giống từ nước ngoài vào, trong nước cũng đang tiến hành khai thác nguồn giống sẵn có ở trong nước. Thực ra, cây ca cao đã có mặt ở Việt Nam từ rất lâu nhưng do không tiêu thụ được sản phẩm nên chúng không được xem là cây trồng chính mang lại nguồn thu nhập. Nhưng cây lại có hình dáng đẹp nên vẫn được người dân giữ lại trồng làm cảnh. Nhờ đó mà ngày nay các chuyên gia nghiên cứu trong nước đã dựa trên những cây giống còn giữ lại lựa chọn và nhân rộng những giống có năng suất cao đáp ứng nhu cầu cây giống cho nông dân. Với sự giúp đỡ của các tổ chức quốc tế, diện tích trồng cây ca cao ngày càng được mở rộng. Cụ thể, sẽ nâng diện tích trồng ca cao từ 3000 ha hiện nay lên 10000 ha vào năm 2010, tập trung tại các tỉnh Bến Tre, Bình Phước và Đắk Lắk. Có nhiều mô hình trồng ca cao đang được áp dụng ở Việt Nam. Phổ biến nhất là mô hình trồng xen lẫn các loại cây khác như dừa, cà phê, tiêu, nhãn, cam , điều, chuối, sầu riêng Ưu điểm của mô hình này là tận dụng được bóng mát của những cây có sẵn trong giai đoạn đầu phát triển của cây ca cao. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, qua 3 năm trồng thử nghiệm tại Việt Nam, cây ca cao đã phát triển tốt, hiệu quả kinh tế cao hơn các loại cây trồng khác như cà phê, điều - 7 -
Đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên, đầu ra của ca cao vẫn còn là nỗi băn khoăn của người nông dân. Hiện nay, đa số những trái ca cao thu hoạch được đưa vào để nhân giống. Một lượng nhỏ ca cao được các cơ sở sản xuất thủ công tại địa phương thu mua và chế biến theo phương pháp thủ công. Sản phẩm thường là bột ca cao hòa tan uống liền hay để trộn vào các sản phẩm như kẹo dừa, bánh. Một lượng rất ít còn lại được xuất khẩu. Bảng 1. 2: Các tỉnh trồng ca cao ở Việt Nam STT Tỉnh Năm 2003 (ha) Năm 2004 (ha) 1 Bà Rịa - Vũng Tàu 28 100 2 Bến Tre 260 500 3 Bình Định 10 4 Bình Dương 5 5 Bình Phước 74 6 Cần Thơ 2 7 Đắc Lắc 506 990 8 Đồng Nai 25 15 9 Gia Lai 5 10 Hồ Chí Minh 3 11 Lâm Đồng 10 10 12 Long An 2 13 Phú Yên 5 14 Quảng Ngãi 50 15 Tây Ninh 5 16 Tiềng Giang 7 50 17 Đắc Nông 120 18 Vĩnh Long 5 19 Các tỉnh khác 120 Tổng Cộng 1002 1905 Ban điều phối cacao Việt Nam (VCC) - 2005 - 8 -
Đồ án tốt nghiệp 1.1.6. Dịch hại trên cây cacao Theo Phạm Hồng Đức Phước (2013) Tương tự như bất kì loại cây trồng nào khác, cacao cũng có thể bị rất nhiều bệnh. Trong hầu hết các trường hợp, bệnh làm giảm sản lượng và chất lượng trái cacao, nghiêm trọng hơn là gây thất thu cho người trồng. Bệnh có thể xảy ra ở bất kì giai đoạn nào của quá trình trồng trọt và có 2 dạng chủ yếu là côn trùng và nấm bệnh. 1.1.6.1. Côn trùng gây hại chính  Bọ xít muỗi (Helopeltis) Triệu chứng và tác hại: bọ xít muỗi chích hút nhựa trái, chồi non, vết chích thâm đen, làm cháy khô chồi non, tạo thành vết thâm đen, trái đang lớn phát triển dị dạng, ít hạt và dễ bị nấm bệnh xâm nhập.  Bọ cánh cứng hại lá (Adoretus compressus. và Apogonia spp.) Triệu chứng và tác hại: gây hại chủ yếu vào chạng vạng tối đến đêm, ban ngày chúng trú ngụ nơi tối hay dưới đất. Bọ ăn lá non làm lá thủng lổ chổ, mất khả năng quang hợp, ảnh hưởng sinh trưởng đối với cây con trong vườn ươm, cây mới trồng 1 – 2 năm đầu. Trên ca cao trưởng thành tác hại của bọ cánh cứng không đáng kể.  Rầy mềm (Toxoptera citricida) Triệu chứng gây hại: rầy mềm sống tập trung và chích hút nhựa cây trên chồi non, lá non, chùm hoa, trái non làm cây chậm phát triển, chùm hoa khô rụng, héo trái. Do rầy mềm tiết ra dịch đường nên thu hút nhiều kiến, nếu là kiến sống trong đất bò lên thì dễ lan truyền mầm bệnh Phythophthora có trong đất làm khô bông, khô trái non và làm phát sinh nấm bò hóng ảnh hưởng sinh trưởng cây.  Rệp sáp (Cataenococcus hispidus = Planococcus hispidus). Triệu chứng và tác hại: rệp sáp sống bám ở ngọn thân cành non, chùm hoa, trái để hút nhựa cây làm thân cành còi cọc, dị dạng, trái chậm lớn. Mùa khô rệp sáp còn phát triển mạnh vùng cổ rễ làm cây chậm lớn, còi cọc.  Sâu đục vỏ trái (Cryptophlebia encarpa) Triệu chứng và tác hại: sâu đục luồn quanh vỏ trái tạo thành các đường rảnh, làm rụng trái non, trái chậm lớn giảm năng suất. - 9 -
Đồ án tốt nghiệp 1.1.6.2. Bệnh hại chính trên cacao.  Bệnh thối trái, loét thân, cháy lá (Phythophthora palmivora) Triệu chứng và tác hại: Đây là bệnh hại chính trên ca cao. Bệnh xuất hiện trong suốt thời gian sinh trưởng của cây, từ vườn ươm cho đến khi thu họach, bệnh tấn công khắp bộ phận trên cây (trên thân, lá, hoa, trái non, trái già), bệnh có mặt hầu hết các vùng trồng ca cao và đặc biệt phát triển mạnh trong điều kiện mùa mưa, ẩm độ cao. Ngoài ca cao Phytophthora còn có nhiều ký chủ khác như: sầu riêng, cao su, bơ, đu đủ, cây có múi, Bệnh phát tán mạnh từ 2 nguồn chính là từ đất và từ trái bệnh: Từ đất: Nước mưa làm bắn đất có mang mầm bệnh lên cây, lá, trái. Kiến, mối di chuyển từ đất lên cây mang theo mầm bệnh. Từ trái bệnh: bào tử phát tán do gió, mưa, các loại côn trùng (bọ cánh cứng Scolytid và Nitidulid).  Bệnh nấm hồng (Corticium salmonicolor) Triệu chứng và tác hại Bệnh thường chỉ xuất hiện vào mùa mưa, ở những vườn ca cao quá ẩm và rợp do tán lá dày và mật độ cây trồng cao. Nấm tấn công ở những cành đã hóa nâu. Nấm bệnh lúc đầu có màu mốc trắng nhưng dần chuyển sang màu trắng hồng, hoặc vàng. Tên bệnh được đặt theo màu của nấm trong giai đoạn này. Đây cũng là giai đoạn nấm phóng thích bào tử và phát tán mầm bệnh. Nấm mọc sâu vào phần gỗ cành. Lá phần trên của cành nhiễm bệnh sẽ vàng và khô nhưng vẫn lưu trên cành một cành một thời gian. Cành khô nâu sẽ chết, lớp vỏ thân cành bị tách ra từng mảng. Nếu điều kiện nắng khô trở lại, bệnh phát triển chậm lại và cây có thể phục hồi nhưng dễ tái phát nếu mưa trở lại mà không có biện pháp cải thiện như vệ sinh đồng ruộng hoặc xử lý thuốc.  Bệnh hại rễ (Rigidoporus lignosus, Ganoderma pseudoferum, Phellinus noxius, Rosellinia bunodes) Triệu chứng và tác hại: Rễ ca cao có thể bị trắng, bị hoá nâu, hoá đen hoặc nứt cổ rễ gây ra bởi nhiều loại nấm khác nhau.  Bệnh khô thân (Algal rust) - 10 -
Đồ án tốt nghiệp Triệu chứng và tác hại: Thân, cành bị nắng chiếu trực tiếp làm tổn thương các mô dưới biểu bì. Sự tổn thương càng trầm trọng khi đang nắng gắt cây gặp nước (do mưa hoặc tưới). Mô tổn thương bị tạp nhiễm các loại nấm như Collectotrichum, Fusarium, và tảo. Tảo không làm hại cây nhưng các loại nấm hại phát triển và làm khô chết cành. Lớp tế bào dưới biểu bì thân/cành có màu sậm như hiện tượng cháy nắng, sau thời gian bào tử màu vàng cam xuất hiện từ vùng nhiễm bệnh. Lá nhỏ, kém phát triển có màu nhạt. Cây ít hoặc không có lá non. Bệnh thường xảy ra cả mùa khô lẫn mùa mưa, đặc biệt là đối với những cây ca cao thiếu bóng che hoặc bị tỉa quá nặng để ánh sáng chiếu trực tiếp vào thân cành trong thời gian dài. Bệnh phát triển mạnh trong khoảng giao mùa nắng mưa. Ca cao ở miền Đông và Tây Nguyên rất hay bị bệnh này. Bảng 1. 3: Một số dịch hại chính trên cacao. STT DỊCH HẠI TIẾNG ANH TÊN KHOA HỌC GHI CHÚ Witches´ Nấm Moniliophthora Chồi non, hoa 1 Bệnh chổi rồng Broom perniciosa và trái Swollen Shoot 2 Phình chồi đọt Virus Chồi non Virus Thối eo giữa Nấm Moniliophthora 3 Frosty Pod Rot Trái non trái roreri Pellicularia 4 Nấm Hồng Pink disease Cành, thân salmonicolor 5 Thối trái Monilia pod rot Monilia sp. Trái Thối vòng trên Colletotrichum 6 Cherelle rot trái gloeosporioides Charcoal pod Botryodiplodia 7 Thối khô đen Trái rot theobromae Vascular-streak Oncobasidium Lá, đỉnh chồi, 8 Chết cây con dieback (VSD) theobroma cành và thân. - 11 -
Đồ án tốt nghiệp Bệnh P. palmivora, P. Tất cả các giai 9 Phytophthora Phytophthora megakarya and P. đoạn: rễ, thân, capsici. lá, hoa và trái. Thân, cành và 10 Bọ xít muỗi Mirids Helopeltis spp. trái Cocoa Pod Conopomorpha Trái non lẫn 11 Sâu đục trái Borer cramerella trái già Sâu đục vỏ Ring Bark Phassus hosei and P. Cây con và cây 12 thân Borers sericeus già Selenothrips 13 Bọ trĩ Thrips rubrocinctus Xén tóc đục 14 Cocoa Beetle Steirastoma breve Thân, cành thân, cành M. barneyi, O.yunnanensis, O. 15 Mối Termite hainanensis, O. Gốc, thân formosanus and M. pakistanicus Proof rat or 16 Chuột Rattuus rattus Trái Black rat 17 Sóc Squirel Sciurus carolinensis Trái Selenothrips 13 Bọ trĩ Thrips rubrocinctus Nguồn: Hồ Văn Chiến và Lê Quốc Cường (2011) 1.2. Giới thiệu về nấm Phytophthora. Tên của giống nấm Phytophthora có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp (Phyto: có nghĩa là thực vật; phthora: có nghĩa là vật phá hoại). Là một giống nấm gây nên thiệt hại kinh tế lớn với nền nông nghiệp trồng trọt ở nhiều quốc gia. Cụ thể vào năm 1845 – - 12 -
Đồ án tốt nghiệp 1846, loài P.infestans đã gây nên nạn mất mùa khoai tây ở Ireland dẫn đến nạn đói và sự ra đi của 2 triệu cư dân (Bourke, 1964). Bệnh do nấm Phytophthora spp. gây ra được nghiên cứu kỹ ở những vùng ôn đới. Tuy nhiên, ở những vùng nhiệt đới ẩm Phytophthora phát triển mạnh và gây ra nhiều bệnh nghiêm trọng khiến nền kinh tế nông nghiệp gánh chịu tổn thất nặng nề như: thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá, thôi trái. Một mình P. palmivora gây ra vô số bệnh nghiêm trọng trên nhiều loại cây trồng khác nhau bao gồm: thối quả ca cao; thối rễ và bệnh bạc lá của cây có múi; sọc đen trong cao su; thối rễ, thân cây thối mục và thối trái cây trong sầu riêng Năm 1995, Hawksworth và công sự đã xác định Phytophthora thuộc phân loại: Giới: Chromalveolata Ngành: Heterokontophyta Lớp: Oomycetes Bộ: Peronosporales Họ: Pythiaceae Chi: Phytophthora Hình 1.2: Phân loại của lớp nấm trứng Oomycetes (Hawksworth et al. 1995) - 13 -
Đồ án tốt nghiệp 1.2.1. Vòng đời của nấm phytophthora Hình 1.3: Vòng đời nấm Phytophthora infestans. (Drenth et al, 1994) Khi nuôi cấy Phytophthora ở điều kiện thích hợp, khuẩn lạc nấm phát triển rất nhanh, dưới điều kiện ẩm ướt chúng tạo thành các những bào tử vô tính được gọi là các túi bào tử (Sporangia), hoặc túi bào tử động (Zoosporangia). Túi bào tử này nảy mầm trong môi trường nước hoặc nhiệt độ môi trường giảm, chúng phóng thích ra những bào tử động (Zoospores) với hệ lông roi không đều nhau. Những bào tử động được phóng thích sẽ bơi lội hàng giờ liền và cuối cùng ngừng bơi lội để cuộn tròn hay kết kén. Sau một thời gian chúng hình thành vách tế bào. Cấu trúc hữu tính bao gồm túi bào tử đực (Antheridium – bộ phận sinh sản đực) và túi noãn (Oogonnium – bộ phận sinh sản cái). Quá trình giàm phân tạo nên túi bào tử đực và túi noãn. Đây chỉ là gian đoạn đơn bội trong vòng đời Phytopthora. Giai đoạn lượng bội đóng vai tro quyết định trong suốt chu trình sống của chúng. Các vòi thụ tinh từ túi giao tử đực sẽ thoát vị đưa nhân của giao tử đực vào noãn, hợp tử sau khi thủ tinh sẽ nảy mầm ở điều kiện thích hợp. 1.2.2. Đặc điểm hình thái của giống Phytophthora. - Túi bào tử + Hình thái túi bào tử (hình dạng, kích thước, chiều dài, chiều rộng, ), hệ gai của túi, tính rụng sớm của túi. - 14 -
Đồ án tốt nghiệp + Chiều dài của cuống trên túi bào tử. + Sự tăng sinh của túi bào tử. + Nhánh của cuống túi bào tử mà trên đó túi bào tử sinh ra. Một số loài Phytophthora tạo túi bào tử ngay trên môi trường agar trong khi số khác cần được nuôi cấy trong môi trường nước, dung dịch muối khoáng hay dịch chiết từ đất pha loãng trước khi chúng tạo ra bào tử. Điều quan trọng hơn là việc tạo túi bào tử của Phytopthora phụ thuộc vào điều kiện ánh sáng. - Chlamydospore và sự trương phồng sợi nấm Chlamydospore là một bào tử vách dày có chức năng như một bào tử nghỉ. Chúng có thể chỉ có một đốt (năm giữa sợi nấm) hoặc tận cùng (nằm cuối sợi nấm). Hình thái của Chlamydospore không khác biệt nhiều giữa các loài. Tuy nhiên sự hiện diện (trên P.palmivora) hay sự vắng mặt (trên P.havae) có thể xác định ở mức độ loài. 1.2.3. Đặc tính chung của nhóm nấm Phytophthora spp. Không giống như những chủng nấm gây bệnh trên thực vật khác có cấu tạo thành tế bào chủ yếu là chitine, lớp Oomycete mà điển hình là chi Phytophthora có cấu tạo thành tế bào chủ yếu là cellulose. (Joshi và Mansfield, 2007) Nấm Phytophthora spp. phát triển được trong dãy nhiệt độ từ 4 – 26oC, nhưng phát triển tốt nhất 16 – 20oC, ẩm độ thích hợp 91 – 100%. Bào tử nấm có kích thước trung bình khoảng 36 x 22 µm – 29 x 19 µm (Erwin và Ribeiro, 1996), đường kính sợi nấm từ 3.5 – 4.0 µm, khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo có thể đạt kích thước từ 7.0 – 16 µm. Trên mô bệnh nấm hình thành các bào tử phân hình oval hoặc elip, bào tử ngắn, đỉnh bào tử có núm nhỏ kích thước khoảng 29 – 36 µm x 19 – 22 µm (Stevenson, 1993) Nấm ký sinh chuyên tính nhưng vẫn có khả năng phát triển trên các môi trường nhân tạo như : Soybean Argar, carrot agar, PDA, V8, CMA, lima bean agar, pea agar ( Erwin và Ribeiro, 1996; Hartman, 1995). Cũng theo nhóm tác giả trên, nấm phát triển tốt nhất trên môi trường Pea – agar (Hartman, 1995; Vinh, 2003) và Rye – agar (Hartman, 1995). Trên môi trường nhân tạo nấm có khả năng sinh bào tử trứng, thành phần môi trường ảnh hưởng lớn đến sự hình thành bào tử trứng của nấm và khả năng sinh sản hữu tính. (Fry, 2000) - 15 -
Đồ án tốt nghiệp Nấm Phytophthora spp. được phát sinh từ đất thường gây hại nặng ở những vùng tưới tiêu chủ động, lượng mưa nhiều hay mực thuỷ triều cao. Nấm bệnh Phytophthora spp. tấn công ở vườn ươm làm chết cây con, những vườn mới trồng thì bị thối gốc, xì mủ và thối rễ. Những vườn trồng lâu năm thì bị thối gốc, xì mủ, thối rễ hoàn toàn và thối nâu trên trái. Đặc biệt nhất là điều kiện trái khi tồn trữ ở kho hay đóng gói thì bị thối nâu (Timmer, 1990). 1.2.4. Khả năng gây bệnh của Phytophthora trên thực vật Drenth và Sendall (2001) cho biết hầu hết toàn bộ loài trong Chi Phytophthora đều là những tác nhân gây bệnh nguy hại đáng sợ trên thực vật và cây trồng. Vì vậy, câu hỏi chúng ta đặc ra là cái gì đã làm cho những sinh vật này trở thành những mầm bệnh có ảnh hưởng đến như vậy. Những nhân tố sau đây liên quan đến sự ảnh hưởng đó: ● Khả năng sản xuất ra nhiều loại bào tử khác nhau như túi bào tử (sporangia) và bào tử động (zoospores) cho sự tồn tại ngắn hạn và lan đi; cùng với bào tử vách dày (chlamydospores) và noãn bào tử (oospores) cho sự tồn tại lâu dài hơn. ● Sự hình thành bào tử nhanh chóng trên tế bào vật chủ, chẳng hạn như lá, điển hình trong vòng 3 tới 5 ngày sau khi bi lây nhiễm. Điều này đưa đến việc tích tụ nhanh chóng chất nhiễm truyền cấu thành từ nhiều chu kì, dẫn đến những dịch bệnh dưới các điều kiện môi trường thuận lợi. ● Khả năng liên kết với đầu ngọn rễ cây của bào tử động (zoospores) của Phytophthora thông qua kênh kích thích hoá học (hoá hướng động dương - positive chemotaxis: chuyển động của tế bào hay sinh vật hướng về phía kênh kích thích hoá học) kết hợp với tính linh động của bảo tử động (zoospores) khi có thể bơi đến các đầu rễ đang lớn nhanh, bao bọc và lan nhiễm những tế bào rễ non, nhạy cảm và dễ bị ảnh hưởng. ● Khả năng tồn tại bên trong hoặc ngoài tế bào vật chủ như những noãn bào tử (oospores) hoặc bào tử vách dày (chlamydospores) trong khoản thời gian dài. Các noãn bào tử (oospores) còn được biết có thể tồn tại qua con đường hệ tiêu hoá của động vật (ví dụ như các loài ốc). - 16 -
Đồ án tốt nghiệp ● Sự sản sinh ra túi bào tử (sporangia), giúp phát tán trên không và đi qua những khoản cách khá xa theo luồng gió, và lây nhiễm cho những mảnh ruộng vườn lân cận. Những bào tử túi này có thể gây nhiễm trực tiếp đến tế bào vật chủ. Và cũng những bào tử túi này (sporangiospores) có khả năng phân chia ra từ 4 đến 32 bào tử động (zoospores) dưới những điều kiện mát và ẩm thấp, và gây ra sự đa nhiễm từ chỉ một túi bào tử. Mặc dù vậy, bào tử động (zoospores) chỉ có thể di động trên khoản cách nhỏ vì tính nhạy cảm với điều kiện khô, va sự mất nước. ● Những mầm bệnh từ Phytophthora với cơ chế và những con đường sinh hoá khác với những loài nấm thực sự. Vì thế nhiều loại thuốc diệt nấm không mang lại tác dụng chống lại mầm bệnh từ những loài Phytophthora. ● Mầm bệnh từ Phytophthora phát triển nhanh dưới những điều kiện và môi trường sống ẩm ướt, khiến chúng trở nên khó kiểm soát, bởi những chất bảo vệ và diệt nấm khó áp dụng và kém hiệu quả trong những điều kiện trên. a) Thối rễ (Root rot) Nhìn chung, cây được ươm từ hạt giống thường dễ bị ảnh hưởng và dễ mắc phải bệnh thối, hư rễ và úng nước gây ra bởi Phytophthora. Các biểu hiện sớm là sự tàn, héo và ngả vàng ở hạt giống. Các triệu chứng tổng quát của thối rễ là cây có biểu hiện thiếu nước, úa vàng lá (chlorotic) và thường còi cọc trong giai đoạn sinh trưởng. Tế bào rễ bị nhiễm bệnh thường mềm, bị no nước và chuyển sang màu nâu đậm nếu so với màu trắng sữa ở rễ khoẻ mạnh. Thoái rễ nặng hơn sẽ dẫn đến việc thiếu hụt đi các rễ phụ, rễ bên và đầu rễ khoẻ mạnh. b) Thối cổ rễ (Collar rot) Thối cổ rễ thường biểu lộ ngay bên dưới lớp đất. Sự lan nhiễm đi từ rễ đi lên, gây thối tế bào phần vỏ bên dưới và làm đổi màu phần thân dưới. Những triệu chứng bên trên mặt đất biểu hiện như: tàn, héo rủ xuống và giảm sút tán lá; khô ngược cành, đen lá (dieback of branches). Tế bào vỏ bọc của cây thường có dấu hiệu phòng và bị nứt ra, dễ dàng bị tách rời khỏi những tế bào nằm bên dưới. c) Mục loét thân cây (Tree canker) Nhiều loài Phytophthora có thể hình thành những vết loét, mục trên thân của các cây ký chủ. Những vết loét này mang nhiều cái tên khác nhau: mục loét sọc (stripe - 17 -
Đồ án tốt nghiệp canker) trên cây quế, mục loét loan lỗ (patch canker) trên cây sầu riêng, hoặc mục thân gỗ. Dấu hiệu đầu tiên thường là sự xuất hiện các vết thương tổn ướt trên bề mặt vỏ cây, thường gần với các phần nhánh. Sự đổi màu vỏ và sự ứa ra chất dịch nhựa màu nâu đỏ, thường đi kèm với hoại tử. Khi lớp vỏ bọc bị bóc ra, những tế bào vỏ và gỗ trở nên khô cùn và đổi màu từ trắng kem sang nâu đỏ. Những vết thương mục trên gỗ thường có hình dạng bất thường nhưng định hình rất rõ. Khi vết thương lan rộng sẽ gây hạn chế gay gắt sự lưu thông nước và chất dinh dưỡng đến các nhánh cây, đem đến hình ảnh tàn rủ cho cây. Nếu những vết thương đó nằm trên nhánh, sự khô ngược cành (dieback) sẽ lan rộng trên ngọn và toàn bộ cây có thể trở nên trụi lá. d) Thương tổn phần thân, lá (Stem lesions) Một số loài Phytophthora tấn công lên lá lẫn thân. Lấy ví dụ, loài P. infestans trên cây khoai tây và cà chua, loài P. sojae trên cây đậu nành, loài P. nicotianae trên cây thuốc lá. Thân và cọng non thường dễ bị tác động nhất. Trong những giai đoạn phát triển bệnh, những vết hư tổn khô màu đen hoặc nâu đậm, bộc lộ ra ở tế bào vỏ trên phần thân gần mặt đất. Những vết hư tổn như thế lan rộng lên trên và có thể phủ đến phân nửa chiều cao phần thân trong trường hợp bệnh cuống đen (black shank) ở cây thuốc lá. Vết hư lan rộng thường phủ trên thân và làm tăng tình trạng tàn rủ và chết lên bên trên cành và lá. e) Bud rot (gây hư chồi) Hư chồi là một vấn đề quan trọng đối với những giống cây họ cau dừa. Nó được gây ra chủ yếu bởi loài P. palmivora. Biểu hiện của hư chồi trên cây họ cau thể hiện ra qua một giai đoạn dài hàng tháng thường theo sau những trận bão lớn tạo điều kiện cho truyền nhiễm và lây lan Phytophthora. Triệu chứng ban đầu xuất hiện là sự đổi màu của các cuống gân lá chính/giáo lá và trên một vài lá mới. Những lá mới này có thể biểu hiện hư tổn từ sự nhiễm bệnh xuất hiện trên giáo lá. Khi sự nhiễm bệnh trên chồi tiến triển, những lá mới đang phát triển cho thấy sự gia tăng về mức độ hư tổn. Cuối cùng các giáo lá dễ dàng bị rụng ra bởi sự thoái hoá ở phần đáy và sự sinh sản của nấm sợi trắng cũng dễ dàng nhận thấy ở những đáy lá. Cả thuỳ lá sẽ chuyển sang vàng, sau đó sang nâu và rụng đi, cuối cùng để lại phần thân bị chết trụi. Trong phần nền của chồi, tác nhân xâm lược lần hai tiến vào và chất dịch bắt đâu tiết ra gây mùi - 18 -
Đồ án tốt nghiệp hôi thối. Những tế bào bên dưới chồi cho thấy sự đổi màu từ đỏ nâu sang nâu. Rất khó để có thể phân lập Phytophthora khỏi những cây họ Cau khi chồi đã bị hư hại nặng vì sự phân rã của chồi. Những cây khi vừa mới bắt đầu biểu hiện triệu chứng, với mép chồi đang phát triển bệnh, nên được dùng để phân lập Phytophthora khi chúng vần còn tương đối an toàn và không bị ảnh hưởng trước tác nhân xâm lược lần hai. f) Gây mốc lá (Leaf blight) Một số loài Phytophthora gây ra mốc lá. Chúng bao gồm: loài P. infestans trên khoai tây và cà chua; loài P. palmivora trên một số lớn các cây trồng nhiệt đới như cao su, sầu riêng và mắc ca (macadamia); và loài P. colocasiae tấn công khoai sọ, khoai môn. Những vết mốc sương trên là được thấy đầu tiên như những vết đốm nhỏ vàng nhưng sau 3 – 5 ngày, chúng lan rộng ra thành những vết hư tổn lớn hơn. Ban đầu, mô nhiễm bệnh bị úng nước nhưng về sau trở nên hoại tử (nâu hoặc đen) trong vài ngày. Thông thường những vết hư hại bao quanh mô bởi vầng sáng xanh lá nhạt. Lớp mốc trắng nhạt mọc ra ở rìa những vùng hư hại, chủ yếu phần bên dưới lá. Cũng những mốc trắng này giúp phân biệt bệnh hư mốc lá bởi Phytophthora với nhiều bệnh trên lá khác. Thường một số lượng lớn bào tử túi (sporangiospores) được sản xuất ra từ 1-4 nang/cuống túi bào tử (sporangiophores) đưa ra từ khí khổng bên dưới mặt lá và sản xuất ra lượng lớn túi bào tử có thể bay đi theo đường không khí dưới điều kiện không khí tương đối khô hoặc phân chia ra thành rất nhiều bào tử động (zoospores) dưới điều kiện ẩm ướt. Những bào tử động này có thể bao vào và hình thành những vết thương tổn mới trên cùng một lá hoặc cây và có thể lan ra những cây lân cận qua tiếp xúc giữa lá với lá. g) Gây hư, thối rữa trên trái (Fruit rot). Hư thối trên trái gây ra bởi Phytophthora biểu hiện như những vết ứ nước với màu nâu nhạt tập trung lúc 3-5 ngày sau khi nhiệm bệnh, tuỳ vào loại cây chủ. Vết hư lan rộng nhanh chống và có thể gây thối toàn bộ trái. Dưới điều kiện độ ẩm cao, những sợi nấm trắng/xám mycelium có thể thấy phía sau mép của phần hư hại. Thông thường quả sẽ không rụng mà héo khô ngay trên cây. Sự nhiễm bệnh có thể hình thành từ bên - 19 -
Đồ án tốt nghiệp trong đối với trường hợp của loài P. palmivora trên trái đu đủ nơi mà sợi nấm mốc sản sinh trên hạt có thể thấy được sau khi bổ đôi trái bị nhiễm bệnh. h) Gây thối rữa trên thân rễ củ (Tuber and corm rot) Khoai tây và khoai môn/sọ được coi như là những loài có thân rễ phình lớn lên và dễ bị tác động bởi Phytophthora. Củ khoai tây có thể bị nhiễm bệnh bởi bào tử động của loài P. infestans khi được mưa rửa trôi xuống từ lá. Bệnh ở củ được mô tả bằng những đốm loan lổ đổi màu từ nâu sang tím trên vỏ khoai tây. Chỉ cắt mỏng ngay bên dưới lớp vỏ lộ ra phần hư màu nâu đỏ đập và khô như bần. Bị nhiễm nặng có thể dẫn đến mất toàn bột phần củ. Nhiễm nhẹ cũng có thể xảy ra và khó phát hiện. Mặc dù vậy, nếu những cây/củ khoai tây đó được dùng để gieo giống, chúng có thể gây nhiễm đến phần thân đang sinh trưởng và bắt đầu lan truyền bệnh dịch cho mùa vụ tiếp theo. Đây cũng có lẻ là cách mà những đợt dịch bệnh mốc sương (potato blight) và tàn rụi muộn (late blight) bắt đầu. Khoai tây cũng có thể bị nhiễm bệnh bởi loài P. erythroseptica gây ra căn bệnh thường gọi là sự thối hồng (pink rot). Củ bị nhiễm bệnh có dạng màu nâu mờ đục và ứa ra nước dưới áp lực khi ấn vào. Trên mặt cắt của củ trở nên màu hồng nhạt sau khi tiếp xúc với không khí. Sau 30 phút, toàn bộ bề mặt cắt chuyển sang hồng sáng. Nếu củ của cây khoai môn/sọ bị nhiễm bệnh, chúng vẫn giữ nguyên và bề mặt như da, đặc điểm điển hình của hư/ thối khô của Phytophthora. Dưới điều kiện thuận lợi, rễ củ của khoai môn có thể hư thối hoàn toàn chỉ sau khoản một tuần. Bảng 1. 4: Bệnh Phytophthora trên một số cây trồng STT CÂY TRỒNG TÁC NHÂN GHI CHÚ 1 Cà chua và P.infestans Bệnh tàn lụi lá là bệnh chính khoai tây trên nhóm cây trồng này. Bệnh xuất hiện vào khoảng tháng 12 đến tháng 3. Gây thất mùa từ 30 -70%, trường hợp xấu có thể mất trắng. 2 Khoai sọ P. colocasiae Bệnh tàn lụi lá trên khoai sọ do P. colocasiae gây ra được phát - 20 -
Đồ án tốt nghiệp hiện đầu tiên bởi Roger (1951), nhiệu độ ấm và độ ẩm cao là yêu cầu để nấm bệnh phát triển. Bệnh xuất hiện vào khoảng tháng 4 – 5 và cao điểm vào tháng 7 – 8. 3 Cacao P.palmivora Bệnh thối quả cacao gây thiệt hại lớn đến nhiều vùng trồng cacao tại Việt Nam. Bệnh tấn công mạnh vào những tháng mùa mưa. Tỷ lệ quả nhiểm bệnh trong vườn từ 15,6 – 48,5%. 4 Hồ Tiêu P. capsici Bệnh chết nhanh hồ tiêu P. parasitica var. thường rất khó phát hiện sớm, piperana chỉ khi cây biểu hiện các triệu chứng điển hình thì nông dân mới phát hiện. Khi đó việc áp dụng các biện pháp phòng trừ hầu như không còn tác dụng. 5 Dứa P. cinnamomi Bệnh thối nõn dứa là bệnh P. nicotianae. chính gây mất năng suất dứa. Bệnh suất hiện ở vùng trồng dứa miền Trung tuy nhien không xuất hiện ở những vùng đất có pH thấp (3,5 – 4,2). 6 Cây ăn quả có P. citrophthor. Bệnh thối gốc, chảy nhựa, chảy múi P. parasitica gôm. Chúng tấn công trên rễ, thân, cành, lá và trái làm giảm năng suất và chất lượng. Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ thấp (15-250C), ẩm độ - 21 -
Đồ án tốt nghiệp cao, đất trồng ẩm ướt thường xuyên, thoát nước kém trong mùa mưa, vườn trồng dầy, ít được tỉa cành tạo tán, bón phân không cân đối. 7 Sầu riêng P.palmivora Bệnh thối gốc chảy mủ gây hại trên sầu riêng từ giai đoạn vườn ươm đến cây trưởng thành và cây đang cho trái, trên rễ, thân, lá và trái. Bệnh phát triển mạnh trong khoảng nhiệt độ từ 16 đến 32oC, ẩm độ không khí từ 80 đến 95%, nhất là trong mùa mưa 1.2.5. Bệnh thối quả gây hại trên cây cacao. Những năm gần đây, cây cacao mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho các nông hộ. Tuy nhiên, vào thời điểm này, bệnh thối trái trên cây cacao đã gây ảnh hưởng nặng đến năng suất cây trồng. 1.2.5.1. Thời gian xuất hiện và nguồn lây bệnh Bệnh thường xuất hiện vào mùa mưa, âm độ cao trên 75%, bào tử nấm phát tán nhờ vào gió, nước mưa, côn trùng làm trung gian, có sẵn trong đất trồng bị mưa gió hất tung lên thân, cành , lá hay do trồng xen với những cây cùng nguồn bệnh như dừa, sầu riêng. Bảng 1. 5 : Nguồn lây nhiễm gây bệnh thối trái do nấm Phytophthora spp. trên cacao. Nguồn lây Các giống cacao khảo sát Trung bình nhiễm Amazonian Amelonado Trinitario (%) Các trái tiếp 39.6 33.3 33.5 35.5 xúc với nhau Đất và rác 2.8 5.7 15 3.3 - 22 -
Đồ án tốt nghiệp Nguồn bệnh 8.4 7.2 6.2 7.3 trong vườn Chuột 7.9 12.0 14.9 11.6 Kiến 0.3 0.1 0.2 0.2 Thu hoạch 2.6 1.8 1.5 2.0 Côn trùng 1.8 3.2 1.7 2.2 Nguồn khác 36.6 36.7 40.5 37.9 Theo: Lê Cao Lượng , 2004 1.2.5.2. Triệu chứng bệnh. Trên trái: Bệnh thường xuất hiện ở trái lớn, vết bệnh xuất hiện ở chóp, đuôi hoặc giữa trái, thường nơi có sẹo hoặc vết thương. Lúc đầu vết bệnh là những đốm nhỏ đục liên kết nhau, sau đó chuyện sang màu socola, cuối cùng trái bị thối đen. Trên lá: bệnh làm lá bị cháy thành từng mảng, thường từ các đầu lá hoặc mép lá sau đó lan dần ra phiến lá đến gân chính vào cuống lá, lan ra gân phụ, sau đó làm lá khô cháy và rụng. Trên thân: bệnh gây những vết sũng nước gần gốc, phát triển nhanh vòng quanh thân, làm các lá bị vàng, rụng, bên trong thân mạch dẫn bị hóa nâu, bị nặng có thể làm chết cây 1.2.5.3. Thiệt hại do bệnh gây ra. Theo Bowers và cộng sự (2001), bệnh thối quả trên cacao gây thiệt hại hàng năm cho nước châu Á, châu Phi và Brazil ước tính khoảng 423 triệu USD, gây lỗ 30 – 90% vốn đầu tư ban đầu. Diện tích cacao thiệt hại do thối quả đôi khi lên đến 90% ở các khu vực ẩm ướt (Gregory và Maddison, 1981). Chỉ tính riêng tại tỉnh Bến Tre – nơi có diện tích trồng cacao lớn thứ nhì cả nước,. Theo báo Đồng Khởi số ra 10/11/2010, huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre có diện tích trồng xen canh cây cacao nhiều nhất. Toàn huyện có 2.630 ha trồng xen cacao; trong đó, diện tích cây cacao cho trái là 1.500ha. Hàng năm, huyện cung ứng ra thị trường khoảng 13.500 tấn Đến nay, toàn huyện có hơn 30% diện tích trồng cacao bị nhiễm bệnh thối trái. - 23 -
Đồ án tốt nghiệp Theo đánh giá của Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bến Tre năm 2013, Bệnh gây hại ca cao chủ yếu là bệnh thối trái xuất hiện ở tất cả các vùng trồng ca cao trong tỉnh với mức độ gây hại từ 6,4% (huyện Bình Đại) đến 17,1% (huyện Châu Thành). 1.2.5.4. Các nghiên cứu về bệnh thối trái trên cacao. Phytopthora spp. tấn công cây cacao vào nhựng bộ phận như hoa, vỏ cây, thân, trái, rễ. Thối đen qua cacao do bốn loài Phytophthora: P. palmivora, P. capsici, P.citrophthora và P. megakarya. Tác nhân gây bệnh thối trái cacao của các loài Phytophthora thay đổi theo vùng. Ở Đông Nam Á, P. palmivora là tác nhân gây bệnh chủ yếu, trong khi P. megakarya chỉ được tìm thấy ở Tây Phi (Brasier et al. 1981). Ở Châu Phi, P.megakarya có xu hướng là tác nhân gây bệnh, trong khi ở châu Mỹ, P. capsici và P.citrophthora là nguyên nhân chính gây bệnh thối quả. (Erwin và Ribeiro 1996). Phytophthora palmivora cũng gây bệnh thối mục gốc và héo lá ca cao. Thổng hợp các bệnh do Phytophthora spp. gây ra cho cacao, gây thiệt hại 20 - 30% số cây trồng ca cao trên toàn thế giới. (Erwin và Ribeiro 1996). Trước thực trạng bệnh gây hại nặng trên cây cacao, ngày 17 tháng 6 năm 2014, Cục Bảo vệ Thực vật kết hợp với Cục Trồng trọt đạ tổ chức hội thảo quản lý bệnh do nấm Phytophthora sp. và Bọ xít muỗi gây hại cacao tại hội trường Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Bến Tre. Tại hội thảo, đại diện của Viện khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiêp Tây Nguyên (WASI), Thạc sĩ Đào Thị Lan Hoa và cộng tác viên đã trình bài nghiên cứu “Phòng trừ bệnh thối quả do nấm Phytophthora palmivora gây hại trên cacao tại Buôn Ma Thuộc và Dak Lak.” 1.2.5.5. Một số phương pháp phòng ngừa bệnh thối trái trên cacao. Bệnh thối quả trên cacao được xem như đối tượng nguy hiểm nhất đối với nông dân trồng cacao ở Việt Nam. Hiện nay hầu hết các giống cacao đang được trồng ở Việt Nam đều có nguy cơ nhiễm bệnh thối quả do nấm Phytophthora palmivora gây hại. Đặc biệt vào khoảng thời gian mùa mưa tỷ lệ bệnh thối quả rất cao, đôi khi chiếm 100% diện tích canh tác nếu như không áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp. Đào Thị Lan Hoa và ctv (2012) khuyến cáo: - 24 -
Đồ án tốt nghiệp 1. Không hoặc ít sử dụng giống mẫn cảm với bệnh như giống TD14 và TD5. Nếu có sử dụng, không nên trồng quá 20% giống TD5 và TD14 trong vườn. 2. Cách ly nguồn bệnh: Đây là biện pháp rất quan trọng trong phòng trừ tổng hợp. Cần thực hiện thường xuyên và triệt để như sau: - Vệ sinh đồng ruộng: Làm cỏ, quản lý bóng che, loại bỏ cây tầm gửi. Thường xuyên cắt bỏ ngay trái bệnh trên cây. Chỉ cần thấy vết bệnh dù rất nhỏ trên trái cũng cần cắt bỏ ngay. Đưa trái bệnh đem chôn hoặc xa vườn ca cao. - Tủ gốc: Giữ lại lá ca cao trên vườn sau khi tỉa (kể cả mùa mưa) để tránh đất văng lên thân khi mưa/tưới. - Phá bỏ đường đi của kiến, mối trên thân cây. 3.Vườn cây nên bón nhiều phân hữu cơ, tốt nhất là phân gà và phân cút. Cung cấp nấm đối kháng Trichoderma vào trong đất xung quanh gốc cây để nấm hoạt động và tiêu diệt các mầm bệnh. 4.Tỉa cành, điều chỉnh mật độ cây che bóng, giảm độ ẩm dưới tán lá trong vùng thân cành mang trái giúp vườn cây đủ ánh sáng và thông thoáng. 5. Gốc cây cũng nên được quét vôi mỗi năm từ 1 đến 2 lần, vào cuối mùa nắng hay đầu và cuối mùa mưa, chiều cao của vết quét ít nhất là 50cm kể từ gốc cây, xung quanh gốc nên rải vôi. Vôi có tác dụng làm hạn chế sự nẩy mầm của bào tử nấm. 6. Sử dụng thuốc hóa học: Hiện nay thuốc hóa học phòng trừ sâu bệnh hại trên ca cao đăng ký trong danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam rất ít, vì vậy bà con nông dân có thể tham khảo sử dụng một số thuốc đã được đăng ký sử dụng trên cây trồng tương tự để phòng trừ bệnh như: Eddy 72WP, Aliette 80 WP, 800 WG, Ridomil Gold, Mataxyl và một số thuốc gốc đồng khác, Phòng bệnh: Mỗi năm phun thuốc 3 lần vào đầu mùa, giữa mùa và cuối mùa mưa hoặc khi bệnh có nguy cơ phát triển mạnh thì phun cách 3 tuần trong giai đoạn trái phát triển. Trị bệnh: Khi xuất hiện các dấu hiệu đầu tiên của bệnh nên dùng luân phiên các loại thuốc như đã khuyến cáo, phun thuốc 5-7 ngày một lần. Khi bị nhiễm bệnh trên thân hoặc cành có thể chữa trị bằng cách bóc vỏ của thân cây hoặc cành phần bị bệnh cho tới phần thân khỏe mạnh (thấy mô trắng). Phần thân hoặc - 25 -
Đồ án tốt nghiệp cành bị bóc ra sau đó được bôi thuốc có gốc đồng (Copper Hydroxide ) pha với độ đậm đặc 5 – 10 %. Cũng có thể xử lý bằng cách tiêm thuốc có hoạt chất Phosphorous acid (Agri - Fos 400; Herofos 400 SL) trực tiếp vào thân cây ca cao. 1.3. Giới thiệu về nấm Trichoderma. 1.3.1. Phân loại: Giới (Kingdom): Nấm (Fungi) Ngành (Phylum): Nấm túi (Ascomycota) Lớp (Class): Sordariomycetes Phân lớp (Subclass): Hypocreomycetidae Bộ (Order): Hypocreales Họ (Family): Hypocreaceae Chi (Genus): Trichoderma Hình 1. 2: Trichoderma harzianum Loài (Species) : Trichoderma spp. (Gary J.Samuels, 2004) 1.3.2. Lịch sử nghiên cứu về Trichoderma. Gần 200 năm về trước Tricoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được biết là Trichodermaviride. . Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa học khác. Tình hình thay đổi trong Thế Chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiện tượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương. Chương trình điều tra của quan đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma "viride" mã số QM 6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này. Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người đã khám phá ra loài này là Elwyn T. Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này và các thể đột biến trên chủng đó. Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh - 26 -
Đồ án tốt nghiệp lần đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma, Việc nuôi cấy dể dàng và không tốn kém các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng nghiên cứu cơ bản về Trichoderma hơn là ứng dụng về phân giải cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp. Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Trong tự nhiên, đất chứa nhiều vi sinh vật sống chung với nhau. Chúng cạnh tranh nhau về không gian sinh sống và chất dinh dưỡng. Một số vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng, số khác là những sinh vật phân hủy các chất hữu cơ nhưng không gây hại cho cây trồng, số còn lại giúp ích cho cây trồng bằng cách đối kháng với vi sinh vật gây bệnh hoặc tăng cường khả năng kháng bệnh của cây, Trichoderma thuộc vào nhóm này, chúng sống trên các xác bã thực vật và các chất hữu cơ trong đất nhưng không gây hại cho thực vật, một số loài Trichoderma có khả năng ký sinh trên các loài nấm gây bệnh cho cây trồng một số loài Trichoderma có khả năng ký sinh trên các loài nấm gây bệnh cho cây trồng. Các nấm bệnh có thể bị Trichoderma ức chế: Pythium, Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotinia và Verticillium. 1.3.3. Cấu tạo tế bào Tricoderma spp. (Lâm Thanh Hiền, 1999) Nấm mốc nói chung (trong có có Trichoderma) có thành tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin (là polymer của m – acetylclucosamine) và chitosan (chitin bị deacetyl hóa) và các thành phân khác gồm β – glucan, α – glucan, mannoprotein, chất màu, lipid (8 – 33%) màng tế bào dày khoảng 7 µm thành phần chủ yếu là lipit (40%) và protein (38%). Nhân phân hóa, thường hình tròn, đôi khi kéo dài, đường kính khoảng 2 – 3 µm. Ty thể hình eclip, luôn di dộng để tham gia vào quá trình hô hấp tế bào. 1.3.4. Đặc điểm sinh học và sự phân bố của nấm Trichoderma spp. Đa số các dòng Tricoderma phát triển tốt trong đất có pH từ 4,5 – 6,5. Nhiệt độ tối ưu để phát triển từ 25 – 30oC. Một số loài phát triển tốt ở 35oC. Một số ít phát triển được ở 40oC. (Gary J.Samuels, 2004). Theo Prasun K. M. và Kanthadai R. (1997) hình thái khuẩn lạc và bào tử Trichoderma khác nhau ở những nhiệt độ khác nhau. Ở - 27 -
Đồ án tốt nghiệp 35oC chúng tạo những khuẩn lạc dị thường với sự hình thành bảo tử nhỏ và ở mép bất thường, ở 37oC không tạo bào tử sau 7 ngày nuôi cấy. Kubicek và Harman (1998) đã miêu tả 33 loài nấm Trichoderma spp. khác nhau, ông cho rằng : tùy tưng loại nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau. Một số loài Trichoderma spp. được ứng dụng trong phòng trừ sinh học: - Trichoderma atroviride: Khuẩn lạc phát triển nhanh, bào tử có màu xanh, vách dày, trơn lán, kích thước (2,6 – 3,8 µm) x (2,2 – 3,4 µm), khi nấm già thường mất màu hay màu vàng nhạt hoặc xám, bào tử già phát ra mùi hương dừa. (Kubicek và Harman - 1998). - Trichoderma hazianum: Khuẩn lạc phát triển nhanh, màu xanh vàng hay xanh tối, có bào tử màu xanh, hình cầu với kích thước (2,7 – 3,5) x (2,1 – 2,6) µm. - Trichoderma hamatum: bào tử màu xanh, trơn, dạng elip, kích thước (4 – 5µm) x (2,5 – 3µm) (Cook và Baker, 1983) - Trichoderma viride : bào tử màu xanh lục, vách xù xì, dạng hình cầu, kích thước (4 – 5µm) x (2,5 – 3µm) (Cook và Baker, 1983). Nhiệt độ tối ưu cho hầu hết các loài nấm Trichoderma spp. là 25oC – 30oC. Theo Widden và Scattolin (1998), nấm Trichoderma harzianum và Trichoderma koningii phát triển nhanh ở nhiệt độ 25oC và lấn ác các loài nấm khác. Bào tử của hầu hết nấm Trichoderma có hình bầu dục với kích thước khoảng (3 – 5µm) x (2 – 4µm), rất hiếm khi bào tử của nấm này có hình cầu. Vách bào tử trơn láng, tuy nhiên ở một vài loài Trichoderma (như T. viride) bào tử có vách xù xì (Mecray, 2002). Tất cả các loài Trichoderma đều có khả năng sinh bào tử chống chịu (Chlamydospore). Bào tử chống chịu có hình cầu méo và ở dạng đơn bào, mặc dù cũng có một số loài có khả năng hình thành nên các bào tử chống chịu đa bào (Papavizas, 1985). Nấm Trichoderma có khu vực phân bố rộng, chúng hiện diện khắp nơi trong đất, trên vỏ cây mục nát. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triện mạnh ở vùng xung quanh rễ cây, một số có khả năng phát triển ngay trên rễ cây. Khi quan sát hạch nấm - 28 -
Đồ án tốt nghiệp hay chồi mầm của nhiều loại nấm khác cũng có thể tìm thấy loài Trichoderma (Klein và Eveleigh, 1998). 1.3.5. Đặc điểm hình thái của nấm Tricoderma spp. (Gary J.Samuels, 2004) Đặc điểm hình thái của loài nấm này là sợi nấm không màu, có vách ngăn, cành bào tử không màu, có khả năng phân nhánh nhiều và cho bào tử với số lượng lớn. Bào tử thường có màu xanh, đính ở đỉnh của cành. Bào tử thường có hình trứng, oval, eclip hoặc tròn tùy từng loài. Khuẩn lạc Trichoderma spp. tăng trưởng rất nhanh trên môi trường PDA, sợi nấm ban đầu có màu trắng, khi sinh bào thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng, hoặc trắng. Ở một số loài có khả năng tiết ra 1 số chất làm môi trường PDA hóa vàng. Ở một số loài Trichoderma cuốn bào tử chưa được xác định. Cuốn bào tử là một nhóm sợi nấm bện vào nhau. Một số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T.koningii), có kích thước 1 – 7 µm. Bào tử đính của Tricoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chum nhỏ nhờ chất nhày. Đặc điểm mổi bật của Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng (T.virens), vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình eclip hay hình oval, đa số bào tử trơn láng với kích thước không quá 5 µm Nhờ Trichoderma có khả năng sinh bào tử chống chịu (Chlamydospore). T.harzianum có thể tồn tại 100 – 130 ngày khi không được cung cấp chất dinh dưỡng. Chlamydospore là những cấu trúc dạng ngủ làm tặng khả năng sống sót của Trichoderma trong môi trường cạn kiện nguồn dinh dưỡng nên chlamydospore có thể dùng nhằm mục dích sản xuất chế phẩm phòng trừ sinh học. 1.3.6. Cơ chế đối kháng và vai trò nấm Trichoderma trong đất. 1.3.6.1. Cơ chế Theo Harman (1996), nấm Trichoderma spp. có nhiều cơ chế đối kháng, cơ chế ký sinh lên nấm bệnh, cơ chế tiết kháng sinh (antibiosis), cơ chế cạnh tranh dinh dƣỡng và không gian sống. - 29 -
Đồ án tốt nghiệp Theo Kredics (2003), quá trình đối kháng của nấm Trichoderma spp. với nấm bệnh chủ yếu bằng 2 cơ chế: Thứ nhất: Nấm Trichoderma spp. bao quanh và cuộn lấy nấm bệnh. Thứ hai: Nấm Trichoderma spp. tiết ra các loại enzyme thủy phân. Theo Elad (2000), có nhiều cơ chế được ứng dụng trong phòng trừ sinh học của Trichoderma spp. đối với nấm gây bệnh, nhưng chỉ có 3 cơ chế quan trọng là ký sinh, tiết ra kháng sinh và cạnh tranh. Ký sinh: Trichoderma có thể nhận ra vật chủ nhờ vào tính hướng hoa chất, nó ký sinh phân nhánh hướng về những nấm đã được định trước (do những nấm náy tiết ra các hóa chất). Đồng thời Trichoderma ký sinh bằng cách cuộn quanh sợi nấm vật chủ bằng cách hình thành các dạng móc hay dạng bám, tiết enzyme chitinase, β – glucanase, protease những enzyme này có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợ nấm vật chủ. Khi ký sinh vào cây một số loài Trichoderma tiết ra enzyme cellulose, cho phép chúng tấn công những nấm như Phytophthora spp. hay Pythium spp. Đây là khả năng tấn công trực tiếp của Trichoderma. (Gary J.Samuels, 2004) Tiết kháng sinh: T.Virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kiềm hãm sự phát triển của các loài R.solani và Pythium spp. Isonitriles được sản xuất bởi các loài T.harzianum, T.hamatum, T.viride, T.koningii và T.polysporum giúp hạn chế sự phát triển của nấm bệnh. Ở một số loài T.antroviride và T.viride tiết 6-pentyl alpha- pyrone có hương dừa, hoạt động của loại phytotoxin này có thể ngăn cản sự nảy mầm của những noãn bào tử nấm gây bệnh Phytophthora spp. Peptaibols do nấm T.harzianum và T.polysporum sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh và giúp cây trồng kháng lại mầm bệnh. (Gary J.Samuels, 2004) Một số loại enzyme do Trichoderma tiết ra bao gồm glucan 1,3- betaglucosidase, endochitinase, chitobiosidase, N-acetyl-beta-D-glucosaminidase (NAGase), trypsin, chymotrypsin, cellulase, protease, lipase, khi kết hợp hai enzyme glucan 1,3-beta-glucosidase và endochitinase sẽ ngăn cản đƣợc quá trình tăng trưởng - 30 -
Đồ án tốt nghiệp của nhiều loại Ascomycetes trong nuôi cấy, thêm vào đó sẽ có hiệu quả cao trong việc ngăn cản sự nảy mầm của bào tử hơn là từng loại enzyme đơn lẻ (Margolless – Clark, 1995). Cạnh tranh: Trichoderma canh tranh, làm suy kiệt nấm bệnh cây trồng bằng cách hút hết dưỡng chất 1 cách thụ động và dai dẳng bằng các bào tử chống chịu (Chlamydospore). Ngoài ra Trichoderma còn cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhậm vào mô già hoặc chết, sữ dụng chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào mô khỏe. Không những thế, Trichoderma spp. còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, tạo thành khuẩn lạc của những túi bào tử nấm Pythium spp. sau đó xâm nhập vào cây (gây bệnh cho cây). Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của những túi bào tử Pythium spp. bằng cách sự dụng dịch tiết đó. Trichoderma spp. còn đối kháng với nấm bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xam nhiểm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự lây nhiễm của nấm bệnh. (Gary J.Samuels, 2004) 1.3.6.2. Nấm Trichoderma spp. trong phòng trừ sinh học bệnh hại cây trồng. Nấm Trichoderma spp. phát triển cực nhanh trong đất, nên chúng tăng nhanh về số lượng so với các loài nấm khác (Saksena, 1960). Nấm Trichoderma spp. phân bố trên nhiều loại đất khác nhau và chúng ký sinh trên nhiều loại nấm gây hại cây trồng như: Armillaria mellea, Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia solani, Chondrostereum purpureum, Sclerotium rolfsii và Heterobasidion annosum (Cook và Baker, 1983). Trong hoạt động sống ký sinh của nấm Trichoderma spp. thì enzyme thủy phân chitinase và β-glucanase đóng vai trò rất quan trọng (Cruz và ctv, 1995). Nấm Trichoderma hazianum có khả năng sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào như chitinase, β-1-3-glucanase đây là 2 loại enzyme quan trọng trong quá trình ký sinh lên nấm gây hại (Muhammad và Amusa, 2003). Những enzyme do nấm Trichoderma spp. tiết ra bao gồm: endochitinase, chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucusaminidase (NADase), trypsin, chymotrypsin, - 31 -
Đồ án tốt nghiệp glucan 1,3- β-glucosidase, cellulase, protease, lypase (Marco, 2002; Kredics và ctv, 2003). Khả năng tiết enzyme của Trichoderma spp. còn chịu ảnh hưởng của độ yếm khí, lượng oxy hòa tan, tốc độ lắc (Marco và ctv, 2002). Một vấn đề quan trọng trong sự hình thành cơ chế đối kháng được trình bày ở nhiều báo cáo là: tùy thuộc vào dòng vi sinh vật đối kháng, nguồn gốc của chúng và điều kiện môi trường, vì thế khi chọn một tác nhân sinh học nên quan tâm đến hướng áp dụng, nguồn gốc của mầm bệnh (Kubicek và Harman, 1998). 1.3.6.3. Khả năng phân hủy chất hữu cơ của nấm Trichoderma spp. Nấm Trichoderma có 3 loại enzyme giúp phân hủy xác bã thực vậy là endoglucanase (carboxylmethyl cellulose – CMCase), exoglucanase và β – glucoside (Srinivas và Panda, 1998). Theo Lynch và Harper (1985) thì Trichoderma có khả năng phân hủy xác bã thực vật sau mùa vụ và chuyển chúng thánh đường, đồng thời chúng còn có khả năng ký sinh và diệt một số mầm bệnh gây hại cho cây trồng. Nấm Trichoderma spp. đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy xác bã thực vật có trong đất (Kredics và ctv, 2003). Theo Klein và Eveleigh (1998), nấm Trichoderma spp. hiện diện khắp nơi, sống hoại sinh và có khả năng phân hủy nhanh các chất hữu cơ trong tự nhiên. Khả năng phân hủy cellulose của nấm Trichoderma spp. bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như: ẩm độ, độ thoáng khí, pH, hàm lượng nitrogen (Alexander, 1961). - 32 -
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: tháng 10/2014 đến tháng 8/2015 Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và Môi trường thuộc trường Đại học Công nghệ Tp.HCM 2.2. Vật liệu 2.1.1. Nguồn mẫu phân lập 2.1.1.1. Nguồn mẫu phân lập nấm bệnh - Trái cacao bị bệnh thối trái được thu thập tại các vườn trồng cacao ở huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre. Bảng 2. 1 : Nguồn tráí cacao nhiễn bệnh thối trái Đợt Ngày thu Nơi thu Số lượng trái 1 15/10/2014 Bến Tre 10 2 15/11/2014 Bến Tre 10 3 20/12/2014 Bến Tre 10 2.1.1.2. Nguồn phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp. - Đất vườn cacao thu thập tại các vườn cacao ở huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre. Bảng 2. 2: Nguồn đất phân lập Trichoderma. Đợt Ngày thu Nơi thu Số gram đất 1 5/3/2014 Bến Tre 500g 2 15/3/2014 Bến Tre 500g 3 25/3/2014 Bến Tre 500g 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Dụng cụ – Ống nghiệm – Đĩa petri – Que cấy – Đũa thủy tinh – Khoan thạch hình trụ - 33 -
Đồ án tốt nghiệp – Cốc thủy tinh – Ống đong – Đèn cồn 2.2.3.2. Thiết bị Tủ cấy Máy hấp Autoclave Tủ lạnh Máy đó pH Kính hiển vi Cân phân tích Máy cất nước Bếp từ 2.2.4. Hóa chất D-Glucose CMC Chitin huyền phù NaNO3 K2HPO4 MgSO4 MgSO4.7H2O NH4NO3 MnSO4 ZnSO4 KCl FeSO4 Agar Nước cất Cồn 700, 960 - 34 -
Đồ án tốt nghiệp 2.2.5. Các loại môi trường  Môi trường phân lập, nuôi cấy và xác định khả năng đối kháng của nấm Trichoderma: Môi trường Potato D-Glucose agar (PDA) - Thành phần môi trường: + D – Glucose 20g + Agar 20g + Dịch chiết khoai tây 1000ml * 200g khoai tây gọt vỏ, rữa sạch cắt nhỏ cho vào bếp đun với 1 lít nước từ 15 – 20 phút, sau đó lọc lấy dịch trong.  Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm Phytophthora palmivora: Môi trường Cornmeal agar (CMA) - Thành phần môi trường: + Bột bắp (cornmeal) 20g + D – Glucose 20g + Pepton 20g + Agar 15g * Phối 20g cornmeal vào cốc thủy tinh sau đó thêm 500ml nước cất, đun và khuấy đều hỗn hợp ở 60oC trong 1 giờ. Sau đó thêm glucose, pepton và agar vào và đem hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong vòng 15 phút.  Môi trường khảo sát hoạt tính sinh enzyme ngoại bào: Môi trường Minimal Synthetic Medium (MSM) - Thành phần môi trường: + Cơ chất 10g + MgSO4.7H2O 0,2g + K2HPO4 0,9g + KCl 0,2g + NH4NO3 1g + FeSO4.7H2O 0,002g + MnSO4 0,002g + ZnSO4 0,002g - 35 -
Đồ án tốt nghiệp + Agar 20g * Cơ chất để khảo sát hoạt tính enzyme chitinase và cellulase lần lượt là huyền phù chitin 1% và CMC. - 36 -
Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phương pháp nghiên cứu. 2.3.1. Phương pháp phân lập nấm gây bệnh thối trái trên cacao. 2.3.1.1. Phân lập từ mẫu trái cacao nhiễm bệnh thối trái. Tiến hành theo phương pháp của Canten và Jinks (1986)  Các bước thu mẫu Chuẩn bị mẫu bệnh: các mẫu bệnh thu tại vườn cacao, chọn những mẫu bệnh điển hình, mới, còn tươi, không dính thuốc bảo vệ thực vật và tốt nhất nên chọn những trái cacao thuộc các giống mẫn cảm với bệnh. Quả cacao thu về được phân lập ngay.  Các bước phân lập, cấy truyền và làm thuần mẫu nấm bệnh. a) Khử trùng mẫu: Rửa mẫu bệnh bằng nước để loại bỏ bụi bẩn. Sau đó mới khử trùng mẫu bệnh. Quá trình khử trùng bề mặt phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm của mô bệnh. Một trong những phương pháp phổ biến nhất là có thể khử trùng bằng cồn 70% trong vòng 1 phút. c) Chuẩn bị mẫu cấy: Dùng dao vô trùng cắt một mẫu vỏ trái nhỏ (1-2 x 1-2mm) nơi tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe. Dùng kẹp đã khử trùng gấp giữ và ấn nhẹ những mẫu cấy lên mặt thạch gần mép đĩa môi trường phân lập CMA. Đặt ngược đĩa cấy để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường ở nhiệt độ phòng. d) Ủ mẫu cấy và theo dõi: Đặt mẫu sau khi cấy ở điều kiện nhiệt độ phòng và chiếu sáng 12h luân phiên. Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi quan sát thấy xung quanh mẫu cấy xuất hiện sợi nấm, tiến hành dùng que cấy khêu nhẹ sợi nấm và cấy lên môi trường CMA. Sau k \hi chuyển nấm lên môi trường 3 – 4 ngày kiểm tra xem sợi nấm có phát triển tốt hay không, nấm đã thuần chưa. Nếu mẫu đã thuân có thể tiến hành cấy chuyển sau 7 – 9 ngày nuôi cấy. Các thao tác đều được tiến hành trong tủ cấy vi sinh dưới ngọn lửa đèn cồn. - 37 -
Đồ án tốt nghiệp Hình 2. 1: Quy trinh phân lập nấm bệnh từ mẫu thực vật nhiễm bệnh e) Tính tỷ lệ xuất hiện của nấm ở các mẫu cấy: Tỷ lệ (%) = A/B x 100 Trong đó: A là số mẫu cacao xuất hiện nấm. B là tổng số mẫu phân lập. 2.3.2. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm. 2.3.2.1. Quan sát đại thể nấm sợi Tiến hành theo phương pháp của Agrios (2005) Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm đối kháng cũng như nấm bệnh bằng việc mô tả đặc điểm tản nấm của chúng khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng. Các chủng nấm phân lập được sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa môi trường CMA và được ủ 1 tuần. Quan sát mô tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển; Dạng sợi nấm, màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; Màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra; thời gian hình thành động bào tử trong thời gian nuôi ủ; khả năng tạo túi bào tử trên khi nuôi cấy trên môi trường agar. 2.3.2.2. Quan sát vi thể nấm. a) Quan sát sợi nấm Phytophthora. Tiến hành theo phương pháp của Agrios (2005) Quan sát hình thái vi thể các chủng nấm phân lập được bằng phương pháp tiêu bản phòng ẩm. Chuẩn bị một đĩa môi trường CMA và một đĩa petri vô trùng nuôi cấy chứa: - 38 -
Đồ án tốt nghiệp mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai thanh đũa tre. Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1 cm2) từ đĩa môi trường CMA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy. Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm thí nghiệm cấy vào 4 mặt bên của khối thạch.Sau đó đậy lamelle lên trên khối thạch. Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy ra (thường là 4 – 5 ngày). Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch có sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần và mô tả đặc điểm: Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn; Hình dạng cuống bào tử; Đặc điểm hình dạng. màu sắc, kích thước bào tử b) Tạo động bào tử Phytophthora Tiến hành theo phương pháp của Drenth và Sedall (2001) Một số loài Phytophthora tạo túi bào tử (Sporangia) dễ dàng trên môi trường agar trong khi số khác chỉ tạo được túi bào tử trong môi trường lỏng như nước cất, dung dịch muối khoáng hay dịch chiết suất thích hợp. (Schmitthenner và Bhat, 1994) Chủng nấm nghi ngờ Phytophthora được nuôi cấy trên môi trường CMA trong 2 – 4 ngày. Cắt 1 khoanh thạch có chứa khuẩn lạc nấm bệnh đường kính 0.5 cm cho vào đĩa petri có sẵn nước cất và 1 mảnh giấy lọc đã được hấp vô trùng từ trước. Nuôi cấy trong điều kiện có ánh sáng liên tục và đặt trong nhiệt độ phòng. Túi bào tử sẽ nãy mầm và phóng thích ra các bào tử động (Zoospores) trong khoảng thời gian từ 1 – 2 ngày. Quan sát dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại từ 40X nhằm sát định du động bào tử. 2.3.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch. Nguyên tắc: Để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, các trái cacao chọn làm thí nghiệm phải sạch bệnh, được lấy từ những vườn chưa có dấu hiệu nhiễm bệnh - 39 -
Đồ án tốt nghiệp thối trái và cùng một giống cacao với trái dùng để phân lập nấm bệnh. Bệnh có thể được tái tạo bằng cách cấy tác nhân gây bệnh theo cơ chế xâm nhiễm của tác nhân đó. Chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh được thí nghiệm. Luôn luôn bố trí công thức đối chứng (bao gồm các cây không được lây bệnh). (Agrios, 2005) Tiến hành: Tiến hành theo phương pháp của Lê Cao Lượng (2004)  Lây bệnh nhân tạo từ trái cacao Sử dụng mẫu nấm thuần mới phân lập được làm tác nhân gây bệnh, Lây bệnh bằng cách cho động bào tử xâm nhiễm vào trái cacao khỏe, không nhiễm bệnh. Chuẩn bị dịch có chứa động bào tử gây bệnh: Đĩa petri chứa nấm nghi ngờ nấm bệnh được nuôi cấy trong vòng 7 ngày trên môi trường CMA. Hút một ít nước cất vô trùng cho vào đĩa trên sao cho nước chỉ đủ trãi đều khắp bề mặt thạch mà không tràn ra khỏi đĩa, dùng que cấy trang vô trùng cạo nhẹ và đều khắp bề mặt thạch nhằm lấy các túi bào tử và tơ nấm. Đậy đĩa petri lại và dùng paraffin quấn kín, ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 – 2 ngày. Dùng giấy thấm, cắt thành những hình tròn bán kính 0.5cm, hấp vô trùng. Sau khi các mẫu giấy nguội, dùng kẹp vô trùng kẹp từng mảnh giấy cho vào dịch chứa động bào tử đã chuẩn bị phía trên và để trong khoảng 1 giờ. Dùng dao mỗ vô trùng tạo vết thương nhỏ khoảng 0.2 cm trên trái cacao sạch bệnh nhằm tạo điều kiện dễ dàng cho nấm bệnh xâm nhập vào trái. Dùng kẹp vô trùng kẹp từng mãnh giấy đã thấm dịch chứa du dộng bào tử chuẩn bị phía trên đặt lên vị trí vết thương vừa tạo. Cho mẫu trái cacao vừa lây nhiễm bệnh nhân tạo này vào túi nhựa đã hấp vô trùng buộc kín bên trong có giấy thấm nước vô trùng nhằm duy trì độ ẩm trong bao. Mẫu thí nghiệm gồm 5 trái cacao sạch bệnh được lây nhiễm nhân tạo từ cùng 1 chủng nấm nghi ngờ nấm bệnh phân lập được. Mẫu đối chứng gồm 5 trái cacao sạch bệnh nhưng không được lây nhiễm nấm bệnh, những khoanh giấy thấm hình tròn chỉ được thấm nước cất vô trùng. Đặt các trái cacao thí nghiệm và đối chứng trong cùng điều kiện nhiệt độ phòng - 40 -
Đồ án tốt nghiệp với điều kiện sáng và tối xen kẽ để hoàn thành quá trình lây bệnh. Thời gian theo dõi: 5, 10, 15 ngày sau khi lây nhiễm. Kiểm tra và so sánh những tai nấm được lây bệnh với những tai nấm đối chứng. Quan sát và ghi nhận các triệu chứng và so sánh các triệu chứng biểu hiện khi lây bệnh nhân tạo với các triệu chứng bệnh ban đầu.  Tỷ lệ xuất hiện bệnh (%) sau khi lây bệnh nhân tạo tính theo công thức: Tần lệ xuất hiện = A/B x 100 Trong đó: A là số mẫu bị nhiễm bệnh. B là tổng số mẫu lây nhiễm.  Kiểm chứng tác nhân gây bệnh Các trái cacao thí nghiệm sau khi lây bệnh có biểu hiện bệnh giống tương tự như quan sát lúc ban đầu trước khi phân lập được phân lập lại nhằm khẳng định tác nhân gây bệnh. Phân lập lại từ các trái mới bị bệnh. Tiến hành quan sát kiểm tra và đối chiếu hình thái đại thể và vi thể của chúng. Mẫu nấm phân lập lại có đặc điểm hình thái phải giống như mẫu nấm được làm thuần ban đầu. 2.3.4. Phương pháp phân lập nấm đối kháng Trichoderma spp 2.3.4.1. Các bước thu mẫu - Chọn đất có nhiều mùn hoặc xác bã thực vật hoặc đất gần gốc, rễ của cây bị bệnh (không có xử lý thuốc trừ nấm). - Mỗi vùng lấy 5 mẫu, mỗi mẫu 100g đem về và trộn đều. 2.3.4.2. Các bước phân lập. - Cân 10 g đất vào 90 ml cất đã khử trùng, lắc đều mẫu trong khoảng 20 phút - Chuẩn bị 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước cất và được đánh số từ 1 đến 4. - Dùng micropipette hút 1ml dung dịch đất trong bình tam giác, cho vào ống nghiệm thứ 1, lắc đều. - Hút 1ml từ dung dịch ở ống nghiệm thứ 1 cho vào ống nghiệm thứ 2, lắc đều. - Hút 1ml dung dịch ở ống nghiệm thứ 2 cho vào ống nghiệm thứ 3, lắc đều. - Từ ống nghiệm thứ 3 hút 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm thứ 4, lắc đều. - 41 -
Đồ án tốt nghiệp Hình 2. 2: Phương pháp pha loãng dung dịch đất. - Sau khi lắc kỹ, dùng micropipet hút 100 µl (1/10 ml) dung dịch của các nồng độ pha loãng trên rồi nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường đã chuẩn bị. Dùng que cấy vô trùng trang đều dung dịch trên bề mặt thạch, đậy kín nắp hộp và đánh dấu nồng độ lên nắp. Đặt úp nắp hộp xuống dưới để tránh đọng nước. Mỗi nồng độ làm 3 đĩa lặp lại. 2.3.4.3. Cấy truyền và làm thuần mẫu nấm Trichoderma. - Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi các tản nấm phát triển từ những đĩa cấy, dùng que cấy đã khử trùng cấy truyền bằng cách cấy đỉnh đầu sợi nấm sang đĩa môi trường PDA để tách rời các chủng nấm. - Tiến hành làm thuần các mẫu nấm qua nhiều lần cấy truyền. 2.3.5. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm. 2.3.5.1. Quan sát đại thể nấm sợi. Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm đối kháng cũng như nấm bệnh bằng việc mô tả đặc điểm tản nấm của chúng khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng. Các chủng nấm phân lập được sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa môi trường PDA và được ủ 1 tuần. Quan sát mô tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển; Dạng sợi nấm, màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; Màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra. - 42 -
Đồ án tốt nghiệp 2.3.5.2. Quan sát vi thể nấm. a) Quan sát sợi nấm Trichoderma. Quan sát hình thái vi thể các chủng nấm phân lập được bằng phương pháp tiêu bản phòng ẩm. Chuẩn bị một đĩa môi trường PDA và một đĩa petri vô trùng nuôi cấy chứa: mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai thanh đũa tre. Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1 cm2) từ đĩa môi trường PDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy. Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm thí nghiệm cấy vào 4 mặt bên của khối thạch.Sau đó đậy lamelle lên trên khối thạch. Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy ra (thường là 4 – 5 ngày). Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch có sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần và mô tả đặc điểm: Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn; Hình dạng cuống bào tử; Đặc điểm hình dạng. màu sắc, kích thước bào tử 2.3.6. Định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của các chủng nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng cacao. Tiến hành theo phương pháp của Tô Duy Khương (2007) Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự phân giải cơ chất chitin và CMC bởi enzyme chitinase và cellulase. Cơ chất bị phân giải tạo ra các đường khử. Các đường này không cho phản ứng màu với lugol. Vì vậy có thể khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase và cellulase của các chủng nấm khi nuôi cấy chúng trên môi trường có nguồn cơ chất cacbon duy nhất lần lượt là huyền phù chitin và CMC. Khả năng sinh enzyme chitinase và cellulase của các chủng nấm được đánh giá tỷ lệ thuận với đường kính vòng phân giải chitin và cellulose sau khi nhuộm màu với thuốc thử lugol Tiến hành: Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm: Cấy điểm các chủng nấm thí nghiệm lên môi trường PDA và ủ tại nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày. - 43 -
Đồ án tốt nghiệp Dùng khoan thạch hình trụ đục một miếng thạch (từ đĩa môi trường PDA đã nuôi cấy nấm thí nghiệm) đặt lên tâm đĩa môi trường cảm ứng MSM có chứa 1% cơ chất (CMC, huyền phù chitin) và ủ trong thời gian 2 ngày. Sau 2 ngày, nhuộm màu môi trường bằng cách đổ dung dịch lugol vào đĩa thí nghiệm để yên 5 phút rồi rữa sạch bằng nước cất và tiến hành đo đường kính vòng phân giải. Các thí nghiệm được lặp lại 4 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri. 2.3.7. Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng nấm Trichoderma spp. Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Phạm Thanh Hà và cộng sự (2003) Nguyên tắc: Môi trường PDA dùng nuôi cấy các chủng Trichoderma phân lập được bổ sung muối NaCl theo dãy nồng độ tăng dần 0.5%, 1%, 2%, 4%, 8%. Khả năng chịu mặn của các chủng Trichoderma phân lập được đánh giá thông qua tỉ lệ thuận với dường kính tản nấm được đo sau 3 ngày nuôi cấy. Tiến hành: Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm: Cấy điểm các chủng nấm thí nghiệm lên môi trường PDA và ủ tại nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày. Dùng khoan thạch hình trụ đục một miếng thạch (từ đĩa môi trường PDA đã nuôi cấy nấm thí nghiệm) đặt lên tâm đĩa môi trường PDA có bổ sung NaCl theo nồng độ đã xác định trước và ủ trong khoảng thời gian 2 ngày và 3 ngày. Tiến hành đo và ghi nhận đường kính tản nấm phát triển trên đĩa petri sau 2 ngày và 3 ngày nuôi cấy. Mỗi chủng nấm được lặp lại 4 lần ở mỗi nồng độ muối, mỗi lần lặp lại trên 1 đĩa. 2.3.9. Khảo sát tính đối kháng của chủng nấm Trichoderma spp. với chủng nấm bệnh Phytophthora palmivora trong điều kiện in vitro. Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Dennis và Webster (1971) Nguyên tắc: Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Trichoderma với nấm gây bệnh thối trái khi nuôi cấy đồng thời trên môi trường thạch đĩa PDA. Tiến hành:  Chuẩn bị nguồn nấm - 44 -
Đồ án tốt nghiệp Đĩa nấm Trichoderma gốc: Cấy điểm các chủng Trichoderma cần khảo sát vào giữa đĩa thạch PDA ủ ở nhiệt độ phòng (7 ngày) làm nguồn đối kháng nấm bệnh. Đĩa nấm bệnh gốc: Cấy điểm các chủng nấm bệnh cần khảo sát vào giữa đĩa thạch PDA ủ ở nhiệt độ phòng (7 ngày) làm nguồn thử khả năng bị ức chế bởi nấm Trichoderma.  Thí nghiệm đối kháng trực tiếp Đĩa đối kháng: Dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch có chứa nấm bệnh từ đĩa nuôi cấy nấm bệnh gốc, đặt khoanh thạch cách mép đĩa môi trường PDA là 1cm. Sau 2 ngày cấy nấm bệnh, tiến hành tương tự khoan lấy 1 khoanh thạch có chứa nấm Trichoderma trên đĩa Trichoderma gốc, đặt vào đĩa có chứa nấm bệnh, cách mép đĩa petri 1cm nhưng ở phía đối xứng với nấm bệnh qua tâm đĩa thạch. Đĩa đối chứng: khoanh thạch nấm bệnh, đường kính 5mm đặt tương tự trên đĩa môi trường PDA cách mép đĩa petri 1cm và không cấy nấm Trichoderma sp. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 3 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát ghi nhận kết quả sau 3, 5, 7, 9 và 11 ngày nuôi cấy. Chỉ tiêu theo dõi Hiệu quả % ức chế. Sự phát triển của nấm Trichoderma đối kháng lại nấm bệnh.  Tính toán số liệu Phần trăm ức chế nấm bệnh được tính theo công thức: % Ức chế = (R1 – R2)/ R1 . 100 (%) Chú thích: R1: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối chứng khi không có cấy Trichoderma (mm). R2: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối kháng khi có cấy Trichoderma (mm). - 45 -
Đồ án tốt nghiệp R R1 T Đĩa đối chứng Đĩa đối kháng Hình 2. 3: Phương pháp cấy đ ối kháng trược tiếp R1: tản nấm bệnh trên đĩa đối chứng; R2: tản nấm bệnh trên đĩa đối kháng cấy chung với nấm Trichoderma; T: tản nấm Trichoderma trên đĩa đối kháng. 2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu. Số liệu của các thí nghiệm được lấy giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD và xử lý số liệu bằng phần mềm Excel 2013 và Statgraphics . - 46 -
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập nấm Phytophthora palmivora trên trái cacao. 3.1.1. Kết quả phân lập nấm Phytophthora palmivora. Từ các mẫu trái cacao nhiễm bệnh thối trái sinh viên chỉ phân lập được 1 chủng nấm trên môi trường CMA với tần suất xuất hiện là 75% (Bảng 3.1) và ký hiệu chủng nấm này là Phy.1. Bảng 3. 1: Tần xuất xuất hiện chủng nấm Phy.1 Tần suất xuất hiện qua 3 đợt phân lập (%) Chủng nấm Trung bình 1 2 3 Phy.1 67 75 83 75% 3.1.2. Đặc điểm hình thái của chủng nấm bệnh.  Đại thể: Trên môi trường CMA, sợi nấm mảnh, màu trắng, dạng bông, đan xen nhau dày đặc hướng dạng tia từ tâm ra ngoài mép đĩa. Sau 7 ngày nuôi cấy, đường kính tản nấm đạt 80 mm và không làm đổi màu môi trường CMA. Mặt trước Mặt sau Hình 3. 1: Hình thái đại thể chủng nấm Phy.1 trên môi trường CMA sau 7 ngày nuôi cấy. - 47 -
Đồ án tốt nghiệp  Vi thể: Sợi nấm không có vách ngăn. Cành bào tử ít phân nhánh, trên môi trường agar hình thành túi bào tử hình trứng, trong môi trường nước cất vô trùng các động bào tử nảy mầm từ các túi bào tử hình thành các hình dạng riêng biệt, và di chuyển nhanh theo nhiều hướng. A B C Động bào tử Hình 3. 2: Hình ảnh vi thể Phy.1 dưới kính hiển vi quang học 100X (A): Tơ nấm và túi bào tử (Sporangia). (B): Túi bào tử chuẩn bị nảy mầm. Hình 3 (C): Động bào tử Đặc điểm hình thái đại thể và vi thể của chủng nấm thu nhận được trùng khớp với nấm Phytophthota palmivora được mô tả bời Drenth và Sendall (2001). Vì vậy có thể khẳng định chủng nấm sinh viên phân lập từ trái cacao bị bệnh là nấm Phytophthora palmivora. - 48 -
Đồ án tốt nghiệp 3.1.3. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch ở điều kiện in vitro Để khẳng định chủng nấm Phytophthota palmivora phân lập được chính là tác nhân gây bệnh thối quả cacao. Sinh viên tiến hành tái nhiễm và phân lập lại theo quy trình Koch, kết quả được trình bày như sau: Đối chứng Thí nghiệm Bệnh ban đầu Hình 3. 3: Kết quả thí nghiệm tái nhiễm chủng nấm Phy.1 trên trái cacao sạch bệnh theo quy tắc Koch - 49 -
Đồ án tốt nghiệp 3.1.3.1. Tỷ lệ xuất hiện bệnh Bảng 3. 2: Tỷ lệ trái cacao bị nhiễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo Trái cacao Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Nhiễm nấm Phy.1 100% Không nhiễm (Đối chứng) 0 Kết quả nhiễm lại cho thấy toàn bộ quả cacao nhiễm nấm đều thể hiện bệnh. Số liệu cũng cho thấy mức tấn công của nấm Phytophthora palmivora trên quả cacao rất lớn. 3.1.3.2. Biểu hiện sau khi lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch Trái cacao sau khi lây nhiễm 5 ngày đã bắt đầu biểu hiện bệnh và cho đến 10 – 15 ngày đã xuất hiện tơ nấm. Triệu chứng này rất giống với triệu chứng quả cacao dùng để phân lập ban đầu. 3.1.3.3. Kết quả tái phân lập sau khi lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch. Sau 15 ngày theo dõi các trái cacao bị nhiễm bệnh nhân tạo, tiến hành tái phân lập tác nhân gây thối trái. Kết quả tái phân lập được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3. 3 : Kết quả tái phân lập lại tác nhân gây bệnh sau khi tái nhiễm trên trái cacao sạch bệnh theo quy tắc Koch. Nấm lây Đặc điểm hình thái sau 7 ngày nuôi cấy bệnh Nấm phân lập lại sau lây bệnh Nấm phân lập ban đầu Trên môi trường CMA, sợi tơ nấm Trên môi trường CMA, sợi tơ nấm mảnh, màu trắng, dạng bông. Có mảnh, màu trắng, dạng bông. Có khả Phy.1 khả năng tạo bào tử trứng trên môi năng tạo bào tử trứng trên môi trường thạch và động bào tử trong trường thạch và động bào tử trong nước cất. nước cất - 50 -
Đồ án tốt nghiệp Động bào tử Động bào tử Kết quả trình bày ở bảng 3.3 cho thấy đặc điểm đặc trưng về hình thái tản nấm, sợi nấm, khả năng sinh bào tử trứng trên môi trường agar và động bào tử trong nước cất của chủng nấm phân lập lại được sau lây bệnh nhân tạo hoàn toàn tương đồng với đặc điểm hình thái của chủng nấm Phy.1 phân lập ban đầu. Mặt khác, tác giả Đào Thị Lan Hoa (2012) củng cho biết, bệnh thối trái cacao ở Việt Nam là do nấm Phytopthora palmivora gây ra. Do đó, có thể khẳng định chủng nấm sinh viên phân lập được là chủng Phytophthora palmivora gây bệnh thối quả cacao tại Bến Tre, Việt Nam. 3.2. Kết quả phân lập một số chủng nấm Trichoderma từ đất trồng cacao. 3.2.1. Kết quả phân lập Trichoderma từ đất trồng cacao. Từ mẫu đất lấy từ vườn trồng cacao thuộc xã An Hóa, huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre sinh viên đã phân lập được 6 chủng nấm Trichoderma được ký hiệu lần lượt là Tcc1, Tcc2, Tcc3. Tcc4. Tcc5, Tcc6. 3.2.2. Kết quả quan sát hình thái sợi nấm. 3.2.2.1. Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc1.  Đặc điểm đại thể: Sơi nấm mảnh, dạng bông, lúc đầu tơ màu trắng, sau 3 ngày nuôi cấy bắt đầu xuất hiện bào tử màu xanh. Sợi nấm phát triển thành những vòng tròn đồng tâm. Khi nuôi cấy đến ngày thứ 5 tơ nấm không còn dạng bông mà nằm sát mặt đĩa, đến ngày nuôi cấy thứ 7 môi trường PDA nuôi cấy Tcc1 trở nên mềm nhũng và có dấu hiệu tan ra. Tản nấm đạt 80mm sau 3 ngày nuôi cấy trên PDA. - 51 -
Đồ án tốt nghiệp Mặt trước 5 ngày 7 ngày Mặt sau 5 ngày 7 ngày Hình 3. 4: Hình thái đại thể chủng nấm Tcc1  Vi thể: Sợi nấm không màu, có vách ngăn, cành bào tử ít phân nhánh. Bào tử đính co màu xanh lục, hình trứng. Hình 3. 5: Hình thái vi thể của chủng Tcc1. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. 3.2.2.2. Đặc điểm hỉnh thái chủng nấm Tcc2.  Đại thể: Sợi nấm mảnh, mọc sát bề mặt thạch. Tản nấm phát triển thành những vòng tròn đồng tâm. Sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA tản nấm xuất hiện bào tử màu xanh đậm, sau 3 ngày nuôi cấy đường kính tảng nấm đạt 80 mm. - 52 -
Đồ án tốt nghiệp Mặt trước 5 ngày 7 ngày Mặt sau 5 ngày 7 ngày Hình 3. 6 : Hình thái đại thể chủng nấm Tcc2  Vi thể: Sợi nấm không màu, có vách ngăn, cành bào tử phân nhánh nhiều. Bào tử đính có màu xanh lục, hình cầu méo, oval. Hình 3. 7. Hình thái vi thể của chủng Tcc2. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. 3.2.2.3. Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc3.  Đại thể: Sợi nấm mảnh, dạng bông. Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA tản nấm xuất hiện bào tử màu xanh đậm. sau 7 ngày nuôi cấy, sợi nấm chuyển từ dạng bông sang nằm sát bề mặt thạch, đường kính tảng nấm đạt 80 mm sau 3 ngày nuôi cấy - 53 -
Đồ án tốt nghiệp Mặt trước 5 ngày 7 ngày Mặt sau 5 ngày 7 ngày Hình 3. 8: Đại thể chủng nấm Tcc3  Vi thể: Sợi nấm không màu, có vách ngăn, cành bào tử phân nhánh nhiều. Bào tử đính có màu xanh lục, hình cầu méo, oval. Hình 3. 9: Hình thái vi thể cua chủng Tcc3. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. - 54 -
Đồ án tốt nghiệp 3.2.2.4. Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc4.  Đại thể: Sợi nấm mảnh, có màu hơi ngã vàng phát triển sát trên bề mặt thạch. Sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA tản nấm xuất hiện bào tử màu xanh vàng, đường kính tảng nấm đạt 80 mm. Sau 7 ngày nuôi cấy nấm làm đổi màu môi trường PDA sang ngã vàng. Mặt trước 5 ngày 7 ngày Mặt sau 5 ngày 7 ngày Hình 3. 10: Hình thái đại thể chủng nấm Tcc4  Vi thể: Sợi nấm không màu, có vách ngăn, cành bào tử phân nhánh nhiều. Bào tử đính có màu xanh lục, hình cầu méo, oval. Hình 3. 11: Hình thái vi thể của chủng Tcc4. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. - 55 -
Đồ án tốt nghiệp 3.2.2.5. Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc5.  Đại thể: Sợi nấm dày, dạng bông. Sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA tản nấm xuất hiện bào tử màu xanh đậm, đường kính tảng nấm đạt 80 mm. sau 5 ngày nuôi cấy, sợi nấm chuyển thành dạng bông xốp trên bề mặt thạch. Sau 7 ngày nuôi cấy, sợi nấm không còn dạng bông mà chuyển sang nằm sát bề mặt thạch. Mặt trước 5 ngày 7 ngày Mặt sau 5 ngày 7 ngày Hình 3. 12: Hình thái đại thể chủng nấm Tcc5  Vi thể: Sợi nấm không màu, có vách ngăn, cành bào tử phân nhánh nhiều. Bào tử đính có màu xanh lục, hình trứng và cầu méo. Hình 3. 13: Hình thái vi thể của chủng Tcc5. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. - 56 -
Đồ án tốt nghiệp 3.2.2.6. Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc6.  Đại thể: Sợi nấm dày, dạng bông. Sau 3 ngày nuôi cấy, sợi nấm chuyển thành dạng bông xốp trên bề mặt thạch, đường kính tảng nấm đạt 80 mm. Sau 7 ngày nuôi cấy, bào tử nấm xuất hiện đầy dĩa thạc PDA, môi trường đổi màu sang vàng nhạt . Mặt trước 5 ngày 7 ngày Mặt sau 5 ngày 7 ngày Hình 3. 14: Hình thái đ ại thể chủng nấm Tcc6  Vi thể: Sợi nấm không màu, có vách ngăn, cành bào tử phân nhánh nhiều. Bào tử đính có màu xanh lục, hình trứng và cầu méo. Hình 3. 15: Hình thái vi thể Tcc6. Từ trái qua: Sợi nấm; cành bào tử; bào tử. - 57 -
Đồ án tốt nghiệp 3.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (chitinase và cellulose) của các chủng Trichoderma phân lập từ đất vườn cacao. 3.3.1. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase ngoại bào. 50 44.5d 45 40 33.75c 32.5bc 32.75bc 35 30.5b 30 25.25a 25 TB ĐV: mm ĐV: 20 15 10 5 0 Tcc1 Tcc2 Tcc3 Tcc4 Tcc5 Tcc6 Hình 3. 16: Đường kính vòng phân giải cơ chất chitin huyền phù của 6 chủng nấm Trichoderma phân lập được. Hình 3. 17: Vòng phân giải cơ chất chitin huyền phù của các chủng nấm phân lập được (sau 2 ngày nuôi cấy) - 58 -
Đồ án tốt nghiệp Các chủng nấm Trichoderma phân lập được đều có khả năng sinh enzyme chitinase ngoại bào sau 2 ngày nuôi cấy. Trong đó chủng nấm Tcc4 thể hiện khả năng sinh enzyme cao nhất (44.5 mm) và khả năng thấp nhất thuộc về chủng nấm Tcc1 (25.25 mm) 3.3.2. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào. 40 34d 34d 35 32.5 cd 30b 30.25bc 30 25 19.5a 20 TB ĐV: mm ĐV: 15 10 5 0 Tcc1 Tcc2 Tcc3 Tcc4 Tcc5 Tcc6 Hình 3. 18: Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải cơ chất CMC của các chủng Trichoderma phân lập được. Hình 3. 19: Vòng phân giải cơ chất CMC của các chủng Trichoderma phân lập được sau 2 ngày nuôi cấy - 59 -
Đồ án tốt nghiệp Dựa bào biểu đồ 3.2 và hình 3.18 sinh viên nhận thấy cả 6 chủng đều có khả năng sinh enyme cellulase sau 2 ngày nuôi cấy. Trong đó chủng nấm Tcc4 và Tcc6 cho hiệu quả cao nhất (34 mm). Thấp nhất là chủng nấm Tcc5 (19.5 mm). Theo Cruz và ctv. (1995) trong quá trình sinh trưởng và phát triển, Trichoderma có khả năng tiết ra các enzyme chitinase và cellulase làm mềm vách tế bào sợi nấm bệnh. Đây là cơ sở làm tiền đề giúp sinh viên thực hiện tiếp thí nghiệm nghiên cứu khả năng đối kháng với nấm bệnh Phytophthpra palmivora của 6 chủng Trichoderma phân lập được từ đất vườn trồng cacao. 3.4. Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng Trichoderma phân lập được. Vùng sinh thái sinh viên phân lập được 6 chủng Trichoderma là thuộc tỉnh Bến Tre. Đây là địa phương có diện tích trồng cacao lớn nhất nhì cả nước. Tuy nhiên, theo báo cáo của Trung tâm khí tượng thủy văn Bến Tre, hàng năm vào khoảng từ tháng 3 đến tháng 6 nước mặn bao trùm lên toàn tình Bến Tre, làm nhiễm mặn nhiều diện tích đất nông nghiệp, trong đó có các khu vực canh tác cacao. Độ mặn của nước vào những tháng này đo được dao động từ 0.1% đến 0.4%, đỉnh điểm có thể đạt 0.66%. Vì vậy thí nghiệm này nhằm đánh giá lại khả nặng chịu măn của các chủng Trichoderma làm cơ sở ứng dụng chúng cho vùng sinh thái này. Bảng 3. 4. Đường kính tản nấm (mm) sau 3 ngày nuôi cấy tại các nồng độ muối khác nhau Đường kính tản nấm Trichoderma ở các nồng độ muối Chủng 0% 0.5% 1% 2% 4% 8% 77,67 ± 76,0 76,0 75,0 77,33 13,0 Tcc1 0,58b ± 1,73b ± 1,0b ± 2,0b ± 2,08b ± 2,0a 77,0 74,33 75,67 76,0 76,0 16,67 Tcc2 ± 1,0c ± 0,58b ± 1,16b ± 1,0b ± 1,0b ± 1,53a 78,67 74,33 75,67 72,0 70.33 ± 19,33 Tcc3 ± 1,53d ± 0,58b ± 0,58bc ± 2,0bc 1,53bc ± 0,58a 79,33 78,33 80,0 80,0 81,67 28,0 Tcc4 ± 0,58b ± 1,11b ± 0,0bc ± 2,0bc ± 1,53c ± 2,0a 80,0 ± 79,67 79,0 80,0 75,0 14,0 Tcc5 0,0c ± 0,58c ± 1,0c ± 0,0b ± 0,0b ± 1,0a 77,0 ± 75,0 77,67 75,67 69,33 16,0 Tcc6 2,0cd ± 2,0c ± 0,58d ± 1,53cd ± 1,15b ± 1,0a - 60 -
Đồ án tốt nghiệp * Các giá trị có các chữ cái giống nhau ở cùng 1 dòng thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phâm hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05. 90 80 70 Tcc1 60 Tcc2 50 Tcc3 40 Tcc4 30 Tcc5 20 Tcc6 10 0 0% 0.5% 1% 2% 4% 8% Hình 3. 20: Biểu đồ thể hiện đường kính tản nấm Trichoderma phân lập được sau 3 ngày nuôi cấy tại các nồng độ mưới khác nhau. (ĐV: mm) Số liệu ở bảng 3.4 và biểu đồ 3.3 cho thấy, sau 3 ngày nuôi cấy hầu hết các chủng phân lập được đều sinh trưởng và phát triển tốt trong môi trường có nồng độ muối từ 0,5% đến 4% , Điều này cho thấy 6 chủng Trichoderma này đều có phổ chịu muối cao và có khả năng sinh trưởng tốt ở điều kiện đất không ngập mặn và ngập mặn. Tuy nhiên, phạm vi chịu đựng muối của các chủng chỉ dao động trong khoảng 0,5% - 4% . Ở nồng độ muối 8%, hầu hết các chủng đều bị ức chế mạnh. Số liệu trên cũng cho thấy, các chủng Trichoderma này có thể tồn tại ở những vùng có nguy cơ xâm mặn do biến đổi khí hậu. 3.5. Khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma phân lập được với nấm Phytophthora palmivora. Thí nghiệm đối kháng trực tiếp 6 chủng Trichoderma phân lập từ đất vườn cacao với loài Phytophthora palmivora phân lập được trên trái cacao nhiễm bệnh trong điều kiện in vitro. Kết quả được trình bày như sau: - 61 -
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 5: Đường kính tản nấm Phytophthora palmivora sau các ngày theo dõi khả năng đối kháng với nấm Trichoderma. Đường kính tản nấm P.palmivora (mm) ở các ngày nuôi cấy Chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày 15,25 15,75 15,25 7,25 4,75 ± Tcc1 ± 0,96c ± 1,71b ± 1,26bc ± 1,5b 0,96c 12,25 21,25 26,75 29,0 34,5 ± Tcc2 ± 0,5a ± 2,22c ± 3,40d ± 3,16c 1,29d 15,5 15,75 15,75 6,75 5,5 Tcc3 ± 1,0c ± 1,5b ± 1,5c ± 1,71c ± 1,0c 13,5 0,25 0,0a 0,0a 0,0a Tcc4 ± 1,0ab ± 0,5a 14,75 16,75 12,25 2,5 0,75 ± Tcc5 ± 0,96bc ± 1,26b ± 1,71b ± 2,08a 0,96a 13,0 15,75 13,0 6,5 2,5 ± 0,58b Tcc6 ± 1,71a ± 2,99b ± 3,65bc ± 1,0b 21,75 43,0 48,25 65,75 79,75 ± P,palmivora ± 0,82d ± 2,16d ± 2,63e ± 2,99d 1,7e Bảng 3. 6: Tỷ lệ % đối kháng giữa nấm Phytophthora palmivora và nấm Trichoderma. Tỷ lệ % đối kháng P.palmivora ở các ngày nuôi cấy Chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày 29,63 63,39 68,29 89,02 94,06 Tcc1 bc b ± 6,17ab ± 3,10b ± 3,63 ± 1,87 ± 1,07b 43,33 50,32 44,54 55,76 56,70 Tcc2 a a ± 6,29d ± 7,58a ± 6,6 ± 5,95 ± 2,42a 28,34 63,24 67,28 89,64 93,09 Tcc3 b b ± 8,03a ± 4,69b ± 3,62 ± 3,01 ± 1,38b 37,72 99,44 100,0 100,0 100,0 Tcc4 d c ± 5,87abc ± 1,11c ± 0,0 ± 0,0 ± 0,0d 31,82 60,93 74,61 96,18 99,08 Tcc5 c c ± 7,45ab ± 4,26b ± 3,26 ± 1,54 ± 1,17d 39,85 63,09 73,24 90,10 96,87 Tcc6 bc b ± 7,47bc ± 8,65b ± 6,36 ± 1,54 ± 0,67c - 62 -
Đồ án tốt nghiệp Hình 3. 21: Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sau 3 ngày đối kháng trực tiếp trong đĩa petri - 63 -
Đồ án tốt nghiệp Hình 3. 22: Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sau 5 ngày đối kháng trực tiếp trong đĩa petri. - 64 -
Đồ án tốt nghiệp Hình 3. 23 : Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sau 7 ngày đối kháng trực tiếp trong đĩa petri - 65 -
Đồ án tốt nghiệp Hình 3. 24: Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sau 9 ngày đ ối kháng trực tiếp trong đĩa petri - 66 -
Đồ án tốt nghiệp Hình 3. 25: Biểu hiện của nấm Trichoderma và nấm P.palmivora sau 11 ngày đối kháng trực tiếp trong đĩa petri - 67 -
Đồ án tốt nghiệp Trichoderma Phytophthora palmivora Hình 3. 26: Hiện tương giao thoa sợi nấm Trichoderma và nấm Phytophthora palmivora. (hình chụp dưới kính hiển vi với độ phóng đại x100). Kết quả đối kháng nấm Phytophthora palmivora của các chủng Trichoderma được trình bày ở bảng 3.5 và 3.6 cho thấy, tất cả các chủng đều kháng được với nấm Phytophthora palmivora. Trong đó, chủng chủng Tcc4 cho hiệu quả đối kháng trong điều kiện in vitro. Điều này hòan toàn phù hợp với các kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm này. Chủng nấm Tcc4 có khả năng sinh enzyme ngoại bào chitinase và cellulase cao nhất. Vì nấm Phytophthora palmivora có cấu tạo vách tế bào là cellulase nên chủng nấm đối kháng phải có hoạt tính enzyme cellulase và chủng Tcc4 đã đáp ứng được điều này. Bốn chủng Tcc1, Tcc3, Tcc5 và Tcc6 cũng rất có triển vọng trong việc phòng ngừa nấm Phytophthora palmivora với tỷ lệ đối kháng lần lượt là 94,06%, 93,09%, 99,08% và 96,87% ở thời điểm 11 NSC. - 68 -