›

Đồ án Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa của lá sen nelumbo nucifera

pdf 112 trang thiennha21 12/04/2022 4450
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa của lá sen nelumbo nucifera", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_thanh_phan_alkaloid_flavonoid_va_hoat_tinh.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa của lá sen nelumbo nucifera

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN/ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA LÁ SEN NELUMBO NUCIFERA Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHÊ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Ngọc Hồng Th.S: Nguyễn Thị Thu Hương Sinh viên thực hiện : Trần Thị Kim Ngân MSSV: 1151110218 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan: Đồ án này là cơng trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự đồng hướng dẫn khoa học của Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng và Thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Hương. Các số liệu, những kết luận được trình bày trong đồ án này hồn tồn trung thực và chưa từng được cơng bố dưới bất cứ hình thức nào. Em xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình Sinh viên Trần Thị Kim Ngân
  3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Ngọc Hồng và Th.S Nguyễn Thị Thu Hương, là giáo viên đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đồ án này. Tơi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cơ đã giảng dạy tại khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường đã truyền đạt những kiến thức quý cho tơi trong suốt khoảng thời gian học tập tại Trường Đại học Cơng nghệ TP.HCM. Tơi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập thể cán bộ, các anh, chị và các bạn trong Phịng thí nghiệm – Trường Đại học Cơng Nghệ TP.HCM. Cuối cùng tơi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luơn động viên, giúp đỡ tơi trong suốt thời gian qua. Sinh viên Trần Thị Kim Ngân
  4. Mục lục DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 3 DANH MỤC BẢNG 4 DANH MỤC HÌNH ẢNH 5 MỞ ĐẦU 7 1. Lý do chọn đề tài 7 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước 8 3. Mục đích nghiên cứu 9 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 9 5. Phương pháp nghiên cứu 9 6. Các kết quả đạt được của đề tài 10 7. Kết cấu của ĐATN 10 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1. Tổng quan về cây Sen 11 1.1.1. Vị trí, phân loại 11 1.1.2. Đặc điểm thực vật học, sinh thái 11 1.1.3. Thành phần hĩa học 12 1.1.4. Tính vị, tác dụng 14 1.1.5. Cơng dụng, chỉ định, phối hợp 14 1.2. Tổng quan về hợp chất Phenolics 16 1.2.1. Phân loại 16 1.2.2. Tính chất hĩa học 17 1.2.3. Vai trị của các hợp chất trong phenol trong thực vật 17 1.2.4. Flavonoid 18 1.3. Tổng quan về hợp chất alkaloid 20 1.4. Tổng quan về khả năng kháng oxy hĩa 24 1.4.1. Quá trình oxy hĩa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hĩa 24 1.4.2. Tính chống oxy hĩa của các hợp chất trong lá sen 25 1.5. Tổng quan về phương pháp khối phổ LC-MS 26 1.5.1. Phổ khối lượng 26 1.5.2. Cấu tạo một khối phổ kế 27 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35
  5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.1. Vật liệu nghiên cứu 35 2.2. Dụng cụ, hĩa chất thí nghiệm 35 2.3. Phương pháp thí nghiệm 36 2.3.1. Phương pháp vi học kiểm nghiệm dược liệu 37 2.3.2. Thử độ tinh khiết dược liệu 39 2.3.3. Quá trình chiết và thu nhận cao chiết 41 2.3.4. Phương pháp xác định lượng cao thu được 43 2.3.5. Phương pháp định tính các thành phần hĩa học trong lá sen 44 2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số 45 2.3.7. Phương pháp định lượng flavonoid tổng số 45 2.3.8. Phương pháp định lượng alkaloid tổng số 46 2.3.9. Phương pháp xác định năng lực khử 48 2.3.10. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hĩa trên mơ hình DPPH 49 2.3.11. Phương pháp phân tích phổ khối lượng MS 50 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1. Khảo sát vi phẫu và soi bột lá sen 53 3.2. Thử độ tinh khiết dược liệu 55 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng cao thu được 56 3.4. Định tính các thành phần hĩa học cĩ trong dịch chiết lá sen 58 3.5. Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết 61 3.6. Định lượng Flavonoid tổng số 64 3.7. Định lượng alkaloid tổng số 67 3.8. Xác định năng lực khử 68 3.9. Xác định hoạt tính kháng gốc tự do DPPH 69 3.10. Kết quả phân tích TPHH của dịch chiết lá sen bằng HPLC-ESI/MS 74 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 4.1. Kết luận 78 4.2. Kiến nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 2
  6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AG: Acid Gallic DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EtOAC: Ethyl Acetate Et-F: Ethyl acetate Fraction IC50: half maximal inhibitory concentration LC-MS: Liquid Chromatography–Mass Spectrometry TPHH: Thành Phần Hĩa Học TPC: Total Polyphenols Content (Hàm lượng polyphenol tổng số) TFC: Total Flavonoids Content (Hàm lượng flavonoid tổng số) db: gam dược liệu khơ . 3
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Độ ẩm dược liệu 55 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng chất khơ thu được 56 Bảng 3.3: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa học của lá sen 59 Bảng 3.4: Kết quả đường chuẩn Acid Gallic 60 Bảng 3.5: Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số 61 Bảng 3.6: Kết quả đường chuẩn Rutin 63 Bảng 3.7: Kết quả hàm lượng Flavonoid tổng số 64 Bảng 3.8: Kết quả hàm lượng alkaloid tồn phần 65 Bảng 3.9: Năng lực khử của dịch chiết ethanol tối ưu. 66 Bảng 3.10: Giá trị %I và kết quả IC50của vitamin C 68 Bảng 3.11: Giá trị %I và IC50 của mẫu lá sen trưởng thành chiết bằng ethanol 96% 70 Bảng 3.12: Giá trị %I và IC50 của lá sen non chiết bằng ethanol 70% 71 Bảng 3.13: Kết quả phân tích TPHH của dịch chiết cồn từ lá sen 73 4
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây sen 11 Hình 1.2: Cấu trúc Nuciferine 13 Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo một số chất cĩ trong lá sen 13 Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo của một số chất cĩ trong tâm sen. 14 Hình 1.5: Một số hợp chất phenol 17 Hình 1.6: Sơ đồ của một khối phổ kế. 27 Hình 2.1: Lá sen non 34 Hình 2.2: Lá sen trưởng thành 34 Hình 2.3: Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 35 Hình 2.4: Sơ đồ tiến trình nhuộm vi phẫu 37 Hình 2.5: Sơ đồ quy trình chiết và phân tích cao chiết lá sen 40 Hình 2.6: Sơ đồ xác định alkaloid tồn phần 46 Hình 2.7: Sơ đồ tiến trình năng lực khử 48 Hình 3.1: Vi phẫu cấu trúc lá sen 53 Hình 3.2: Bột lá sen 53 Hình 3.3: Vi phẫu bột lá sen 54 Hình 3.4: Sự biến đổi màu sắc dịch chiết ở các nồng độ cồn khác nhau 56 Hình 3.5: Sự biến đổi màu sắc khi hơ dịch chiết qua NH4OH 57 Hình 3.6: Sự tạo tủa với thuốc thử Mayer 57 Hình 3.7: Cột bọt trước và sau khi để yên 15 phút 58 Hình 3.8: Kết tủa đỏ gạch hình thành 58 Hình 3.9: Sự đổi màu của dịch chiết 59 Hình 3.10: Dung dịch dựng đường chuẩn Acid Gallic 60 Hình 3.11: Đường chuẩn Acid Gallic 61 Hình 3.12: Dung dịch Rutin chuẩn 63 5
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.13: Đường chuẩn Rutin 64 Hình 3.14: Mẫu lá sen phản ứng AlCl3 64 Hình 3.15: Đồ thị năng lực khử của dịch chiết 67 Hình 3.16: Sự đổi màu dung dịch do hiện tưởng khử Fe3+ 68 Hình 3.17: Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của vitamin C 69 Hình 3.18: Phản ứng màu của dung dịch DPPH + Vitamin C 69 Hình 3.19: Phản ứng của dịch mẫu + DPPH 70 Hình 3.20: Biểu đồ % I (% ức chế) của mẫu lá sen trưởng thành cồn 96% 70 Hình 3.21: Biểu đồ % I (% ức chế) của mẫu lá sen non trong ethanol 70% 71 Hình 3.22: Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của 2 đối tượng lá sen và vitamin C 71 Hình 3.23: Sắc ký đồ HPLC-ESI/MS của dịch chiết cồn 96% từ lá sen 73 6
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ ngày xưa người ta đã biết dùng đến các loại thảo dược để chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau, trong đĩ cĩ bệnh béo phì và tim mạch, Bên cạnh đĩ, khả năng chống béo phì trên người của nhĩm hợp chất catechin đã được nghiên cứu và chứng minh. Sen là loại cây quen thuộc với người dân Việt Nam, là loại cây mà hầu như tất cả các bộ phận đều được sử dụng để phục vụ cho việc trang trí, thực phẩm, dược phẩm chữa bệnh Dù vậy, việc nghiên cứu các hoạt chất sinh học cĩ trong sen vẫn cịn rất hạn chế ở nước ta. Việc nghiên cứu sản xuất ra các chất chiết từ thiên nhiên để bổ sung vào đồ uống, thực phẩm nĩi riêng và trong các ngành cơng nghiệp khác nĩi chung luơn được quan tâm mà chủ yếu là các hợp chất phenolic như flavonoid và các hợp chất alkaloid. Những hợp chất nay tồn tại nhiều trong các loại hoa lá, củ quả của nhiều loại thảo dược, Những thành phần này được sử dụng như một loại thực phẩm chức năng nhằm mục đích ngừa bệnh do cĩ tính chống oxy hĩa mạnh. Chúng được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau trong các ngành cơng nghiệp như thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm Việt Nam là một nước cĩ khí hậu nhiệt đới giĩ mùa, nĩng ẩm quanh năm, là một điều kiện tốt để sen tồn tại và phát triển. Việc nghiên cứu, phân tích các thành phần hĩa học cĩ trong sen sẽ là một bước đi cụ thể nhằm tìm ra các hợp chất thứ cấp cĩ dược tính tốt trong cây sen, trong đĩ cĩ alkaloid và flavonoid, tạo tiền đề cơ bản cho việc ứng dụng các hợp chất này vào trong các chế phẩm phịng và chữa bệnh cho người. Sen là một lồi thực vật gần gũi với đời sống của người dân Việt Nam. Tất cả các bộ phận của sen đều được sử dụng để phục vụ cho con người: lá dùng gĩi xơi, hoa sen dùng để trang trí, hạt sen thì dùng nấu chè, tâm sen lại cĩ dược tính an thần cho những ai mắc căn bệnh mất ngủ. Trong dân gian, lá sen được dùng nấu nước uống thay trà, nhưng hiện nay, chỉ cĩ một số ít các cơng trình nghiên cứu về lá sen cũng như những thành phần dược tính cĩ giá trị của nĩ. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen Nelumbo 7
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nucifera” được thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho việc tạo sản phẩm trà túi lọc từ lá sen hoặc tạo viên nang chức năng mang lại nhiều giá trị thực tiễn. 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước Những nghiên cứu trong nước - Tiến sĩ Hồng Thị Tuyết Nhung đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế Conessin, Kaempferon, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc”.Trong đĩ Nuciferin là chất được chiết xuất và tinh sạch từ cây Sen (Nelumbo nucifera). - Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch chiết cây sen thu hái ở Đà Nẵng. - Xây dựng qui trình định lượng đồng thời quercetin, kaempferol, catechin và quercetin-3-0-glucuronid trong lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dị PDA. - Độc tính mãn và tác dụng chống béo phì từ lá trà xanh và lá sen - Phương pháp khối lượng định lượng alkaloid tồn phần của lá sen và sự thay đổi hàm lượng alkaloid theo tuổi và thời vụ thu lá. - Nghiên cứu thành phần hĩa học của tâm sen và gương sen, - Tinh chế và xác định một vài tính chất đặc trưng của lectin từ nhị hoa sen (Nelumbo nucifera) và hoa cây thiên lý (Telosma condata) - Chiết xuất alkaloid từ lá sen làm thuốc senin chữa bệnh loạn nhịp tim. - Tác dụng chống loạn nhịp tim của lá sen. Những nghiên cứu nước ngồi Trên thế giới đã cĩ những nghiên cứu về cây Sen như: - Phân tích thành phần Alkaloid trong lá sen bằng phương pháp sử dụng tia UV và đo phổ khối lượng. - Xác định hàm lượng các hợp chất phenolic trong hoa sen (Nelumbo nucifera) bằng phương pháp điện di mao dẫn. - Xác định Nuciferin và các đồng phân của nĩ bằng phương pháp sắc ký lỏng cao năng ngược pha. 8
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3. Mục đích nghiên cứu - Xác định các thành phần hĩa học của cây sen thu hái tại khu vực quận 7, Thành phố Hồ Chí Minh. - Xác định được hàm lượng các chất cĩ dược tính trong lá sen, đồng thời xác định được khả năng chống oxy hĩa của lá sen sẽ là tiền đề cho việc tạo những chế phẩm cĩ hàm lượng phenolic, alkaloid cao, cĩ thể được bổ sung vào các thực phẩm chức năng cĩ nguồn gốc từ thiên nhiên, tăng cường sức khỏe, phịng chống bệnh tật. - Xác định một số thành phần flavonoid, alkaloid, mở ra hướng ứng dụng trong việc khai thác các chế phẩm chức năng giúp ngăn ngừa và điều trị bệnh 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên cứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo. - Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thơng qua các phương pháp xác định, khảo sát, phân tích. - Nhiệm vụ 3: Thu nhận dịch chiết lá sen bằng phương pháp ngâm dầm trong ethanol - Nhiệm vụ 4: Định tính sơ bộ các thành phần hĩa học cĩ trong lá sen - Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số và alkaloid tổng số từ dịch chiết lá sen - Nhiệm vụ 6: Đánh giá khả năng kháng oxy hĩa thơng qua giá trị IC50 hay nồng độ ức chế 50% gốc tự do của dịch chiết lá sen, đánh giá năng lực khử và thử nghiệm in vitro trên mơ hình DPPH. - Nhiệm vụ 7: Khảo sát các thành phần hĩa học trong lá sen bằng phương pháp HPLC-ESI/MS 5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: Các tài liệu về lá sen, sơ bộ thành phần hĩa học của lá sen, các phương pháp xác định hàm lượng các hợp chất thứ cấp, mơ hình đánh giá khả năng kháng oxy hĩa, phương pháp HPLC/MS 9
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Phương pháp làm thí nghiệm: Tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết các nhiệm vụ nghiên cứu. - Phương pháp xử lý số liệu bằng tốn học và phân tích phương sai ANOVA bằng phần mềm STATGRAPHICS Centurion XV.I: Các số liệu thu được sẽ được xử lý nhằm đưa ra kết luận cho đề tài. 6. Các kết quả đạt được của đề tài. - Thu nhận được dịch chiết lá sen bằng phương pháp ngâm dầm trong ethanol 96% cĩ hàm lượng phenolic và alkaloid cao (đối với lá sen trưởng thành) và trong ethanol 70% (đối với lá sen non). - Định tính sơ bộ các thành phần hĩa học trong dịch chiết cồn lá sen. - Định lượng được: polyphenol tổng số, flavonoid tổng số, alkaloid tồn phần của dịch chiết. - Xác định được các thành phần flavonoid, alkaloid trong dịch chiết lá sen - Tìm ra giá trị IC50, so sánh khả năng kháng oxy hĩa trên mơ hình DPPH với Vitamin C và so sánh năng lực khử của dịch chiết với Acid Gallic. 7. Kết cấu của đề tài. - Mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu, cơ sở khoa học của đề tài - Chương 2: Vật liệu, hĩa chất và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận - Chương 4: Kiến nghị 10
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây Sen 1.1.1. Vị trí, phân loại Giới (regnum): Plantae Bộ (ordo) Proteales Họ (familia) Nelumbonaceae Chi (genus) Nelumbo Lồi (species): N. nucifera Danh pháp: Nelumbo nucifera Hình 1.1: Cây sen 1.1.2. Đặc điểm thực vật học, sinh thái Về mặt thực vật học, Nelumbo nucifera (Gaertn,) đơi khi cịn được gọi theo các danh pháp cũ như Nelumbium speciosum (Willd.) hay Nymphaea nelumbo. Đây là một loại cây thủy sinh sống lâu năm. Trong thời kỳ cổ đại nĩ đã từng là loại cây mọc phổ biến dọc theo bờ sơng Nin ở Ai Cập cùng với một lồi hoa súng cĩ quan hệ họ hàng gần gũi cĩ tên gọi dài dịng là hoa sen xanh linh thiêng sơng Nin (Nymphaea caerulea) Dạng thân thảo mọc dưới nước, sống dai nhờ thân rễ (ngĩ sen). Ngĩ sen màu trắng, tiết diện gần trịn, cĩ khía dọc màu nâu, ngọn cĩ mang chồi hình chĩp nhọn. Thân rễ phình to thành củ, màu vàng nâu, hình dùi trống, gồm nhiều đoạn, thắt lại ở giữa, trong cĩ nhiều khuyết rộng. Lá hình lọng cĩ 2 thùy sâu đối xứng nhau, dài 30-55 cm, rộng 20-30 cm, mép lá hơi uốn lượn, mặt trên xanh đậm, nhẵn bĩng; mặt dưới xanh nhạt, nhám. Gân tỏa trịn, nổi rõ ở mặt dưới. Cuống lá màu xanh, hình trụ, dài 1-1,5m, rám, cĩ nhiều gai. Hoa đơn độc, to, màu hồng hay trắng. Cuống hoa màu xanh, dài 1,3-1,5 m, già chuyển sang màu nâu, cĩ nhiều gai nhọn. Cuống lá và cuống hoa cĩ nhiều khoang rỗng bên trong. Đế hoa rất lồi dạng hình nĩn ngược, mép lồi lõm, xốp, non màu vàng, 11
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP già màu xanh, dài 5-7 cm, đường kính 6-8 cm, chứa nhiều quả sen. Bao hoa gồm 12- 16 phiến xếp xoắn ốc khơng phân biệt rõ lá đài và cánh hoa, bên ngồi 3-5 phiến màu xanh hơi hồng, dài 3-6 cm; bên trong các phiến thuơn dài hình thuyền, dài 9-16 cm, rộng 4-9 cm, màu trắng hồng, đậm hơn ở bìa và ngọn cánh hoa, nhiều gân dọc nổi rõ ở mặt dưới; mĩng rất ngắn, màu trắng, hình chữ nhật hơi loe. Bộ nhị: nhiều, rời, đều, đính xoắn ốc, chỉ nhị màu trắng, hình sợi, dài 7-9 mm, nhẵn; chung đới màu trắng, hình sợi, dài 1,2-1,3 cm, đầu chung đới kéo dài thành hình chùy (gạo sen), màu trắng, dài 4-5 mm; bao phấn 2 ơ, màu vàng, thuơn dài, nứt dọc, hướng ngoại, đính đáy, hạt phấn hình bầu dục hay hình trứng, màu vàng, dài 57-75 µm, cĩ rãnh. Bộ nhụy nhiều lá nỗn rời đính thành nhiều vịng vùi sâu trong đế hoa, bầu màu vàng nhạt, hình bầu dục dài 6-11 mm, rộng 3-4 mm, 1 ơ cĩ 1 nỗn đính nĩc. Vịi nhụy rất ngắn, đầu nhụy hình trịn, lõm ở giữa. Quả bế màu xanh, nhẵn, hình bầu dục, dài 1,7-2,5 cm, đường kính 0,6-1,2 cm, Hạt màu trắng, dài 1,3-1,5 m, đường kính 5-6 mm, 2 lá mầm dày mập màu trắng bên trong cĩ tâm sen màu xanh. Tâm sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm và 2 lá đầu tiên; rễ mầm khơng rõ; thân mầm màu xanh, dài 3-4 mm, tiết diện bầu dục, nhẵn bĩng; 2 lá đầu tiên, 1 to, 1 nhỏ, cuống lá mầm màu xanh, hình mĩc câu, tiết diện đa giác, dài 1,8-2 cm, phiến lá mầm hai mép cuộn vào giữa tạo thành một đoạn dài 6-7 mm. Nelumbo lutea là lồi sen thứ hai cĩ màu trắng thấy phổ biến ở Bắc Mỹ. Thế giới cĩ 1 chi 2 lồi, phân bố ở nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, châu Úc, Bắc Mỹ. Ở Việt Nam cĩ 1 lồi. 1.1.3. Thành phần hĩa học Lá cĩ nhiều alkaloid đã được phân lập và xác định cấu trúc: nuciferin, anonain, roemerin, pronuciferin, N-nornuciferin, O-nornuciferin, N-methyl-coclaurin, 4- methyl-N-methylcoclaurin, nepherin, liriodenin, dehydroroemerin, armepavin, dehydronuciferin, dehydroanonain, N- methylsococlaurin, Nuciferin là thành phần chính, Ngồi alkaloid ra, lá sen cịn cĩ các flavonoid: quercetin, isoquercitrin, leucocyanidin, leucodelphinidin. 12
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP R= R1= R2= Nuciferin CH3 CH3 CH3 N-Nornuciferin CH3 CH3 CH3 O-Nornuciferin H CH3 CH3 Anonain -CH2- H Roemerin -CH2- CH3 Hình 1.2: Cấu trúc Nuciferin Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo một số chất cĩ trong lá sen Tâm sen cĩ các alkaloid sau đã được biết: liensinin, isoliensinin, methyl-corypalin, neferin, lotusin, 1(p-hydroxybenzyl) 6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetra-hydroisoquinolin, Gương sen cĩ quercetin, 4,9% chất đạm, 0,6% chất béo, 9% carbohydrat và một lượng nhỏ vitamin C 0,017%, 13
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo của một số chất cĩ trong tâm sen Hạt Sen chứa nhiều tinh bột (60%), đường raffinose, 1% chất đạm, 2% chất béo và cĩ một số chất khác như canxi 0,089%, phosphor 0,285%, sắt 0,0064%, với các chất lotusine, demethyl coclaurine, liensinine, isoliensinine. Tua nhị Sen cĩ tannin. Ngĩ Sen chứa 70% tinh bột, 8% asparagin, arginin, trigonellin, tyrosinglucose, vitamin C, A, B, PP, tinh bột và một ít tannin. 1.1.4. Tính vị, tác dụng Hạt Sen: Vị ngọt, tính bình; cĩ tác dụng bổ tỳ dưỡng tâm, sáp trường, cổ tinh. Tâm Sen: Vị rất đắng, cĩ tác dụng an thần nhẹ. Gương Sen: Cĩ tác dụng tiêu ứ, cầm máu. Tua nhị Sen: Vị chát, tính ấm; cĩ tác dụng sáp tinh, ích thận, thanh tâm, chỉ huyết. Lá Sen: Vị đắng, tính mát; cĩ tác dụng hạ huyết áp, an thần, thanh thử,lợi thấp, tán ứ, chỉ huyết. Ngĩ Sen: Cĩ tác dụng cầm máu, tráng dương, an thần. 1.1.5. Cơng dụng, chỉ định, phối hợp Hạt Sen: Chữa các bệnh đường ruột như tỳ hư, tiết tả, lỵ; di mộng tinh, đới hạ, hồi hộp mất ngủ, cơ thể suy nhược, kém ăn ít ngủ. Ngày dùng 12-20g cĩ thể đến 100g, 14
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP dạng thuốc sắc hay hồn tán. Là thực phẩm cao cấp để dùng cho người già yếu, trẻ con hoặc dùng chế biến các mĩn ăn quý, chất lượng cao như làm mứt, nấu chè; là phụ liệu cho các mĩn ăn dân tộc như bánh phồng tơm. Tâm Sen: Chữa sốt và khát nước, di mộng tinh, tim đập nhanh, huyết áp cao, hồi hộp hoảng hốt mất ngủ, Dùng 1,5-3g. Gương Sen: Chữa chảy máu tử cung, băng huyết, đau bụng dưới do máu ứ, tiêu ra máu, nơn ra máu. Dùng 10-15g, Trong các bài thuốc chữa băng huyết, rong huyết, thường cĩ kèm gương sen bên cạnh các vị thuốc khác. Tua nhị Sen: Chữa băng huyết, thổ huyết, di mộng tinh, trĩ bạch đới, đái dầm, tiểu nhiều, Dùng 3-10g. Lá Sen: trị say nĩng, viêm ruột, nơn ra máu dạ dày, chảy máu cam và các chứng chảy máu khác. Dùng 5-12g sấy trên than hoặc ngày dùng độ 1 lá, sắc nước uống. Cịn dùng chữa chứng béo phì; dùng 15g lá sen rửa sạch đun với nước sơi trong 50 phút hoặc hãm với nước sơi trong 10 phút, mỗi sáng uống 1 ấm. Ngĩ Sen: Dùng chữa bệnh sốt cĩ khát nước và dùng cầm máu (tiêu ra máu, tiểu ra máu, nơn ra máu, chảy máu cam, xuất huyết sau sinh) và trị bạch đới, tiêu chảy. Dùng ngĩ sen 5-12g phơi khơ sắc uống hàng ngày hoặc cĩ thể giã lá sen tươi lấy nước uống. Các bài thuốc dân gian từ lá sen Giảm béo phì: Dùng lá sen sấy khơ đun lấy nước uống thay trà lá vối hàng ngày hoặc cho một giúm nhỏ vào tách (ly) rồi hãm với nước sơi, sau khoảng 2 - 5 phút thì uống. Uống thường xuyên và liên tục sẽ giảm lượng mỡ dư thừa trong cơ thể đáng kể, giúp bạn cĩ thân hình khỏe và đẹp. Chữa háo khát: Lá sen non (loại lá cịn cuộn lại chưa mở càng tốt) rửa sạch, thái nhỏ, ép lấy nước uống làm nhiều lần trong ngày. Hoặc thái nhỏ, trộn với các loại rau ghém, ăn sống hằng ngày. Người bị tiêu chảy vừa chữa khỏi, cơ thể đang bị thiếu nước dùng rất tốt. Chữa máu hơi khơng ra hết sau khi sinh: Lá sen sao thơm 20-30g tán nhỏ, uống với nước hoặc đồng tiện (nước tiểu trẻ em) hoặc sắc với 200ml nước cịn 50ml, uống làm một lần trong ngày. 15
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chữa sốt xuất huyết: Lá sen 40g, ngĩ sen hoặc cỏ nhọ nồi 40g, rau má 30g, hạt mã đề 20g, sắc uống ngày một thang. Nếu xuất huyết nhiều, cĩ thể tăng liều của lá và ngĩ sen lên 50-60g. Chữa chảy máu não và các biến chứng kèm theo ở bệnh nhân tăng huyết áp: Lá sen 15,5g, cam thảo 15,5g, đỗ trọng 12,5g, sinh địa, mạch mơn, tang ký sinh, bạch thược mỗi vị 10g, sắc uống ngày một thang. Chữa băng huyết, chảy máu cam, tiêu chảy ra máu: Lá sen 40g để sống, rau má 12g sao vàng, thái nhỏ, sắc với 400ml nước cịn 100ml, uống làm hai lần trong ngày. Chữa ho ra máu, nơn ra máu: Lá sen, ngĩ sen, sinh địa mỗi vị 30g; trắc bá, ngải cứu mỗi vị 20g. Tất cả thái nhỏ, phơi khơ, sắc uống trong ngày. Chữa mất ngủ: Lá sen loại bánh tẻ 30g rửa sạch, thái nhỏ, phơi khơ, sắc hoặc hãm uống. Cĩ thể dùng viên nén gồm cao mềm lá sen 0,03g, bột mịn lá sen 0,09g, tá dược vừa đủ cho một viên, Ngày uống 3-6 viên trước khi đi ngủ 3 giờ. Hoặc sirơ lá sen gồm cao mềm lá sen 4g, cồn 45% 20ml, sirơ đơn vừa đủ cho 1,000ml, Người lớn uống 15ml, trẻ em tùy tuổi 5ml. 1.2. Tổng quan về hợp chất Phenolics Đây là nhĩm hợp chất lớn trong các nhĩm hợp chất thứ cấp ở thực vật, Các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 8,000 hợp chất phenol tự nhiên. Đặc biệt trong cấu trúc của nhĩm này trong phân tử cĩ vịng 6C (vịng benzen) gắn trực tiếp một hay nhiều nhĩm hydroxyl (OH). Vì vậy chúng là những alcol bậc 4 và được đặc trưng bởi tính acid yếu. 1.2.1. Phân loại - Dựa vào thành phần chính và cấu trúc phenol, người ta chia chúng thành 3 nhĩm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhĩm polyphenol, Phân loại này dựa trên bộ khung carbon của các hợp chất trong đĩ là C6 là nhĩm phenyl, C1 là nhĩm methyl, C2 là nhĩm acetyl, C3 là nhĩm thế cĩ 3 carbon, C4 là nhĩm thế cĩ 4 carbon C6 (phenol đơn giản, benzoquinone), C6-C1 (acid phenolic), C6-C2 (acetophenone, phenylacetic acid), C6-C3 (acid hydroxycinnamic, coumarin, phenylpropene, chromone), C6-C4 (naphthoquinone), C6-C1-C6 (xanthone), C6-C2-C6 (stilbene, anthraquinone), 16
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP C6-C3-C6 (flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thủy phân), (C6- C3)2(lignan, neolignan), (C6-C3-C6)2 (biflavonoid), (C6-C3)n (lignin), (C6)n (catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngưng tụ). - Nhĩm hợp chất polyphenol là nhĩm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol, cĩ cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc sự trung hợp của các đơn phân, Ngồi gốc phenol cịn cĩ các nhĩm phụ dị vịng mạch nhánh hoặc đa vịng Hình 1.5: Một số hợp chất phenol 1.2.2. Tính chất hĩa học Các hợp chất phenol cĩ cấu tạo và tính chất đa dạng nhưng do cĩ những đặc điểm giống nhau ở cấu trúc được cấu thành từ các vịng benzene nên chúng cĩ một số tính chất chung : Phản ứng của nhĩm hydroxyl. Phản ứng phá vịng benzen Phản ứng tạo phức với kim loại Phản ứng este hĩa 1.2.3. Vai trị của các hợp chất trong phenol trong thực vật Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ sinh so với động vật vì chúng khơng thể lẫn trốn đươc kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phịng thủ hĩa học này, Nhìn chung vai trị bảo vệ của các hợp chất phenol dựa trên đặc tính kháng khuẩn, kháng dinh dưỡng của chúng 17
  21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các phenol cịn cĩ vai trị then chốt trong hình thành các sắc tố của hoa như đỏ, xanh, tím Đặc tính chống oxyl hĩa (antioxidant) hay tạo phức với kim loại; tạo ra các tín hiệu thơng tin giữ phần ở trên cũng như dưới mặt đất, giữa các cây khác với sinh vật khác; phenol cịn là các tác nhân che chắn tia tử ngoại (UV) từ mặt trời. Khả năng che chắn tia UV giúp cho thực vật cĩ thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hồn tồn Các nghiên cứu cịn cho thấy trao đổi hợp chất phenol khơng chỉ là bảo vệ chống lại các yếu tố sinh học, vơ sinh mà cịn cĩ tham gia quá trình điều hịa ở cấp độ phân tử giúp cây sinh trưởng và phát triển bình thường Các flavonoid như flavonol và anthoxyane cĩ vai trị quan trọng trong việc điều chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang hợp. Một số hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả, hấp dẫn cơn trùng thụ phấn cho hoa. 1.2.4. Flavonoid Flavonoid là một trong các nhĩm polyphenol thường gặp ở thực vật, với hơn 4,500 hợp chất, phần lớn dễ tan trong nước màu vàng nên được gọi là “flavonoid” (flavus – tiếng Latin, cĩ nghĩa là màu vàng, một sắc tố xanh đỏ tím hoặc khơng màu cũng được sắp xếp vào nhĩm flavonoid nếu chúng cĩ chung đặc điểm cấu tạo hĩa học. Flavonoid là sản phẩm của con đường acid shikimic, chúng cĩ khung carbon chung là C6-C3-C6. Flavonoid gồm hai vịng benzen A, B và vịng pyran C, trong đĩ A kết hợp với C tạo thành khung chroman. 1.1.1.1. Tính chất của Flavonoids Tính chất vật lý - Tính chất vật lý là cơ sở để lựa chọn những phương pháp phân lập, phân tích và xác định các hợp chất flavonid. Các dẫn chất flavon cĩ màu vàng rất nhạt, flavol vàng nhạt đến vàng, chalcone và auro vàng đậm đến đỏ cam. Các chất thuộc nhĩm isoflavonne, flavanol, isoflavanone, flavanone, leucoantoxyanidin, catechin khơng màu. Các dẫn chất anthocyanidin cĩ màu thay đổi tùy theo pH mơi trường. 18
  22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Tính tan trong dung mơi: khả năng hào tan cuar flavonoid khơng giống nhau, tùy thuộc vào số nhĩm OH và các nhĩm thế khác của chúng. Flavonoid glycoside khơng tan trong ether, tan được trong nước nĩng, tốt nhất là cồn nĩng. Các dẫn xuất 7-hydroxyl thường dễ tan trong kiềm lỗng. - Một đặc điểm quan trọng của flavonoid là cĩ khả năng hấp thụ tia tử ngoại. Nguyên nhân này cĩ thể do hệ thống nối đơi liên hợp tạo ra bởi hai vịng benzen A, B và vịng pyran C. Flavonoid cĩ hai dãy hấp thụ cực đại, giải 1 ở bước sĩng > 290nm, giải 2 ở bước sĩng 220 – 280 nm Tính chất hĩa học - Flavonoid đa dạng về cấu trúc hĩa học, vì vậy khả năng phản ứng hĩa hoc của chúng rất lớn phụ thuộc vào nhiều yếu tố : vị trí các nhĩm OH, hệ thống nối đơi liên tiếp và các nhĩm thế. Dưới đây là các phản ứng hĩa học cơ bản của flavonoid Phản ứng của nhĩm OH: gồm phản ứng oxyl hĩa, phản ứng tạo thành liên kết hydrogen, phản ứng este hĩa, Phản ứng của vịng thơm : phản ứng diazo hĩa Phản ứng của nhĩm carboxyl: phản ứng shinoda, phản ứng tạo phức với kim loại, Đây là phản ứng khử, cĩ sự tham gia của kim loại như Fe, Zn, Mg và HCl, Sản phẩm cĩ màu da cam, hồng hoặc đỏ. Phản ứng này đặc trưng cho các flvonoid cĩ nhĩm C=O ở vị trí C4 và nối đơi giữa C2 và C3. Điển hình là flavonol, flavanone, flavanonol. Tính chất sinh học Tác dụng sinh học của các flavonoid rất đa dạng và phong phú, Các cơ chế hĩa học của chúng cĩ nhiều điểm cịn chưa sáng tỏ, tuy nhiên cơ chế đĩng vai trị quyết định là tác dụng chống oxyl hĩa. Nhờ đĩ flavonoid cĩ thể triệt tiêu gốc tự do cĩ hại trong cơ thể, giúp cơ thể động vật và con người phịng chống bệnh tật. - Flavonoid cĩ khả năng kiềm hãm các quá trình oxy hĩa dây chuyền sinh ra bởi gốc tự do hoạt động, Tuy nhiên hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc vào đặc điểm cấu tọa hĩa học của từng chất flavonoid cụ thể. Do bản chất cấu 19
  23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tạo polyphenol nên flavonoid ở trong tế bào thực vật hoặc ở trong cơ thể động vật chịu tác động của các biến đổi oxy hĩa khử, bị oxyl hĩa từng bước và tồn tại ở dạng hydroxyl, semiquinone, Semiquinone hoặc quinone là những gốc tự do bền vững, gọi là gốc phenoxyl, kí hiệu ArO*. Chúng cĩ thể nhận điện tử và hydrogen từ chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinone, Các chất này cĩ khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động sinh ra trong quá trình sinh lý và bệnh lý để triệt tiêu chúng. - Sự cĩ mặt của các nhĩm hydroxyl nhân thơm của các flavonoid cũng như các polyphenol làm cho chúng cĩ khả năng tương tác với protein. Tương tác này cĩ thể làm hoạt hĩa hay ức chế hoạt động của enzyme. Tác dụng của flavonoid lên các enzyme là một trong những cơ sở hĩa sinh để định hướng cho việc sử dụng các chất flavonoid để chữa bệnh. - Các cơng trình nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định flavonoid cĩ khả năng chống ung thư. Các flavonoid cĩ tác dụng kiềm hãm các enzyme oxy hĩa, kìm hãm quá trình đường phân, quá trình hơ hấp, kìm hãm quá trình giảm phân, hạn chế sự phá vỡ cân bằng các quá trình trao đổi chất bình thường trong tế bào. - Nhiều flavonoid cĩ hoạt tính của vitamin P cĩ tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch. Củng cố và làm giảm tính thấm thành mạch, bảo vệ thành mạch trong các bệnh làm tăng tính thấm thành mạch như đái đường, trĩ, giãn tĩnh mạch. 1.3. Tổng quan về hợp chất alkaloid Năm 1806 một dược sĩ là Friedrich Wilhelm Sertüner phân lập được một chất từ nhựa thuốc phiện cĩ tính kiềm và gây ngủ mạnh đã đặt tên là “Cinchonino”, sau đĩ chiết được chất kết tinh từ vỏ cây Canhkina và đặt tên là “Cinchonino”, sau đĩ P,J, Pelletier và J,B,Caventou lại chiết được hai chất cĩ tính kềm từ một lồi Strychnos đặt tên là strychnin và brucin. Đến năm 1819 một dược sĩ là Wilhelm Meissner đề nghị xếp các chất cĩ tính kiềm lấy từ thực vật ra thành một nhĩm riêng và ơng đề nghị gọi tên là alkaloid do đĩ người ta ghi nhận Meissener là người đầu tiên đưa ra khái niệm về alkaloid và cĩ định nghĩa: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, cĩ chứa nitơ, cĩ phản ứng kiềm và lấy từ thực vật ra. 20
  24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Ngồi tính kiềm, alkaloid cịn cĩ những đặc tính khác như cĩ hoạt tính sinh học mạnh, cĩ tác dụng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid Sau này Pơlơnơpski đã định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ cĩ chứa nitơ, đa số cĩ nhân dị vịng, cĩ phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đơi khi cĩ trong động vật, thường cĩ dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hĩa học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid. Tuy nhiên cũng cĩ một số chất được xếp vào nhĩm alkaloid nhưng nitơ khơng cĩ dị vịng mà ở mạch nhánh như: Ephedrin trong ma hồng (Ephedra sinica Staf,), capsaisin trong ớt (Capsicum annuum L,), hordenin trong mầm mạch nha (Hordenum sativum Jess,), colchicin trong hạt cây tỏi độc (Colchicum autumnale L,); một số alkaloid khơng cĩ phản ứng với kiềm như colchicin lấy từ hạt tỏi độc, ricinin lấy từ hạt thầu dầu (Ricinus communis L,), theobromin trong hạt cây cacao (Theobroma cacao L,) và cĩ alkaloid cĩ phản ứng acid yếu như arecaidin và guvacin trong hạt cau (Areca catechu L.) Tính chất vật lý Thể chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên cơng thức cấu tạo cĩ oxy nghĩa là trong cơng thức cĩ C, H, N, O, những alkaloid này thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường. Ví dụ: Morphine (C17H19NO3), codein (C18H21NO3), strychnin (C21H22N2O2), quinin (C20H24N2O2), reserpin (C33H40O9N2) Những alkaloid thành phần cấu tạo khơng cĩ oxy thường ở thể lỏng. Ví dụ như: Coniin (C8H17N), nicotin (C10H14N2), spartein (C15H26N2). Tuy nhiên cũng cĩ vài chất trong thành phần cấu tạo cĩ oxy vẫn ở thể lỏng như arecolin (C8H13NO2), pilocarpidin (C10H14N2O2) và cĩ vài chất khơng cĩ oxy vẫn ở thể rắn như sempecvirin (C19H16N2), conexin (C24H40N2), Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và cĩ điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng cĩ một số alkaloid khơng cĩ điểm chảy vì bị phân hủy ở nhiệt độ trước khi chảy, Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường vững bền, khơng bị phân hủy ở nhiệt độ sơi nên cất kéo được bằng hơi nước để lấy ra khỏi dược liệu, - Mùi vị: Đa số alkaloid khơng cĩ mùi, cĩ vị đắng và một số ít cĩ vị cay như capsaixin, piperin - Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều khơng màu trừ một số ít alkaloid cĩ màu vàng như berberin, palmatin, chelidonin, 21
  25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Độ tan: Nĩi chung các alkaloid base khơng tan trong nước, dễ tan trong các dung mơi hữu cơ như methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen,, trái lại các muối alkaloid thì dễ tan trong nước, hầu như khơng tan trong các dung mơi hữu cơ ít phân cực, Cĩ một số trường hợp ngoại lệ, alkaloid base lại tan được trong nước như coniin, nicotin, spactein, colchicin, cafein (tan 1/80 trong nước lạnh và 1/2 trong nước sơi). Một số alkaloid cĩ chức phenol như morphine, cephelin tan trong dung dịch kiềm. Muối alkaloid như berberin nitrat lại rất ít tan trong nước. Dựa vào độ tan khác nhau của alkaloid base và muối alkaloid người ta sử dụng dung mơi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid. - Năng suất quay cực: Phần lớn alkaloid cĩ khả năng quay cực (vì trong cấu trúc cĩ cacbon khơng đối xứng), thường tả tuyền, một số nhỏ hữu tuyền như cinchonin, quinidin, aconitin, pilocacpin một số khơng cĩ tác dụng với ánh sáng phân cực (vì khơng cĩ cacbon khơng đối xứng) như piperin, papaverin, naxein một số alkaloid là hỗn hợp đồng phân tả tuyền và hữu tuyền (raxemic) như atropin, atropamin, năng suất quay cực là hằng số giúp ta kiểm tra độ tinh khiết của alkaloid, Khi cĩ hai dạng D và L thì alkaloid dạng L cĩ tác dụng sinh lý mạnh hơn dạng D. Tính chất hĩa học - Hầu như alkaloid đều cĩ tính base yếu, song cũng cĩ chất cĩ tác dụng như base mạnh cĩ khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng cĩ chất tính base rất yếu như cafein, piperin vài trường hợp ngoại lệ cĩ những alkaloid khơng cĩ phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromin và cá biệt cũng cĩ chất cĩ phản ứng acid yếu như arecaidin, guvacin. Do cĩ tính base yếu nên cĩ thể giải phĩng alkaloid ra khỏi muối của nĩ bằng những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH khi định lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp. - Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng. - Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt ) tạo ra muối phức. - Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid, Những phản ứng chung này được chia làm 2 loại: Phản ứng tạo tủa: 22
  26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cĩ hai nhĩm thuốc thử tạo tủa với alkaloid Nhĩm thuốc thử thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nước, Tủa này sinh ra hầu hết là do sự kết hợp của một cation lớn là alkaloid với một anion lớn thường là anion phức hợp của thuốc thử. Cĩ nhiều thuốc thử tạo tủa với alkaloid: + Thuốc thử Mayer (K2HgI4 – kalitetraiodomercurat): Cho tủa trắng hay màu vàng nhạt. + Thuốc thử Bouchardat (iodo – iodid): Cho tủa nâu. + Thuốc thử Dragendorff (KBiI4 – Kali tetraiodobismutat III): Cho tủa vàng cam đến đỏ. + Muối Reinecke [NH4[Cr(SCN)4(NH3)2],H2O – amoni tetra sulfocyanua diamin cromat III] + Thuốc thử Scheibler [acid phosphovonframic – H3P (W3O10)4]. + Thuốc thử Godeffroy [acid silicovonframic – H3Si [(W3O10)4]. + Thuốc thử Sonnenschein [acid photphomolybdic – H3P (Mo3O10)4]. Phản ứng tạo tủa này rất nhạy, độ nhạy của mỗi loại thuốc thử đối với từng alkaloid cĩ khác nhau, Ví dụ: Thuốc thử Mayer cịn xuất hiện tủa với morphin khi pha lỗng 1/2,700 nhưng với quinin ở độ pha lỗng 1/125,000, Cafein cịn tạo tủa với thuốc thử Dragendorff ở độ pha lỗng 1/600, nhưng với thuốc thử Bouchardat ở độ pha lỗng 1/10,000. Trong phân tích alkaloid, một số thuốc thử tạo tủa trên cịn được dùng với ý nghĩa khác: Thuốc thử Dragendorff cịn được dùng phun hiện màu trong sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng. Muối Reinecke dùng trong định lượng alkaloid bằng phương pháp so màu. Acid photphomolybdic và acid photphovonframmic được dùng trong định lượng alkaloid bằng phương pháp cân và phương pháp so màu. Nhĩm thuốc thử thứ hai cho những kết tủa ở dạng tinh thể: + Dung dịch vàng clorid + Dung dịch platin clorid + Dung dịch nước bão hịa acid picric + Acid picrolonic + Acid styphnic 23
  27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Người ta thường đo điểm chảy của các hợp chất này để gĩp phần xác định các alkaloid. Phản ứng tạo màu: Cĩ một số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho màu đặc biệt khác nhau do đĩ người ta cũng dùng phản ứng tạo màu để xác định alkaloid. Phản ứng tạo tủa cho ta biết cĩ alkaloid hay khơng, cịn phản ứng tạo màu cho biết cĩ alkaloid gì trong đĩ. Thuốc thử tạo màu thường là những hợp chất hữu cơ hoặc vơ cơ hịa trong acid H2SO4 đậm đặc. Những thuốc thử tạo màu quan trọng là: Acid sulfuric đậm đặc (d=1,84), acid nitric đậm đặc (d=1,4), thuốc thử Frưhde (acid sulfomolybdic), thuốc thử Marquis (sulfofocmol), thuốc thử Mandelin (acid sulfovanadic), thuốc thử Erdmann (acid sulfonitric), thuốc thử Wasicky (p, dimetylaminobenzaldehyt hịa trong H2SO4), thuốc thử Merke (acid sulfoselenic). Trong dịch chiết cĩ nhiều alkaloid và cịn lẫn tạp chất khác thì phản ứng lên màu khơng thật rõ bằng những alkaloid đã được chiết và phân lập ở dạng tinh khiết.Do đĩ để kết luận được chắc chắn người ta thường dùng phản ứng màu kết hợp với phương pháp sắc ký lớp mỏng cĩ alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh. 1.4. Tổng quan về khả năng kháng oxy hĩa 1.4.1. Quá trình oxy hĩa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hĩa Gốc tự do là các nguyên tử khơng trọn vẹn, số điện tử vịng ngồi của nĩ là số lẻ nên khơng bền vững, nĩ phải kết hợp với một nguyên tử khác để cĩ số điện tử chẵn để bền vững, Sự bền vững này chỉ trong chốc lát, chính nĩ lại tạo ra một nguyên tử khơng trọn vẹn khác và tiếp tục kết hợp với một nguyên tử khác rồi trở thành nguyên tử khơng trọn vẹn và tiếp tục chu kỳ bất tận như thế. Phản ứng hĩa học của nĩ rất mãnh liệt và nĩ sẽ kéo theo một điện tử của phân tử khác về nĩ, cho ra những phân tử khác bị hư hại hay bị oxy hĩa, Một khi phân tử bị oxy hĩa rồi thì phân tử đĩ sẽ tự mất đi tất cả các chức năng vốn cĩ của nĩ, tiếp đĩ chính nĩ lại là tác nhân oxi hĩa các phân tử chung quanh nĩ, làm hư hại các tế bào của các phân tử xung quanh. Và quá trình này cứ tiếp tục như thế sẽ tạo thành các tế bào khơng bình thường dẫn tới các loại bệnh như: xơ vữa động mạch, ung thư Theo các tài liệu nghiên cứu đã cơng bố, các bệnh như: ung thư, tim mạch, lão hĩa cĩ liên quan rất gần với các quy luật về quá trình oxy hĩa trong các tế bào sống. 24
  28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các quá trình oxy hĩa diễn ra dưới tác dụng của các gốc tự do trong tế bào là cần thiết để tạo ra năng lượng hoặc trong các quá trình sinh tổng hợp của cơ thể. Gốc tự do là những hợp chất hoạt động mạnh, được tạo ra trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất hay được đưa vào từ bên ngồi do virút, vi khuẩn Các gốc tự do được tạo thành gồm 2+ các gốc cĩ hoạt tính cao như hydroxyl (OH), ion sắt (Fe O),Cu(OH)2 những gốc tự do cĩ hoạt tính trung bình và yếu như peroxyl (ROO), hydrogen peroxde H2O2, singlet oxy (O1), nitric oxide (NO), ankoxyl Thơng thường các gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng được kiểm sốt chặt chẽ thơng qua quá trình kháng oxy hĩa nội tại bằng các hợp chất như glutathione, vitamin E, vitamin C và enzym superoxide dismutase, Ngồi ra cơ thể cịn cĩ các tế bào như neutrophill, monocyte, B-cell cĩ khả năng chống lại các yếu tố oxy hĩa ngoại lai xâm nhập. Tuy nhiên, trong các tế bào cĩ thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được tạo ra quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngồi như các chất độc, do nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ, tia UV, nhiễm phĩng xạ, do thuốc lá, mơi trường ơ nhiễm Các gốc tự do dư thừa trong khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ để ngăn chặn, cĩ khả năng tương tác, phá hủy màng lipid khơng bão hịa của tế bào, làm giảm khả năng bảo vệ các tế bào dẫn đến sự xâm nhập các tác nhân gây bệnh từ bên ngồi oxy hố các nucleotid căn bản làm thay đổi cấu trúc AND, dẫn đến các quá trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư, làm hỏng cấu trúc protein hoặc hoạt hĩa enzym trong các quá trình trao đổi chất gây bệnh 1.4.2. Tính chống oxy hĩa của các hợp chất trong lá sen Trong cơ thể con người cĩ sẵn một vài enzyme dùng để bảo vệ và ngăn ngừa nhiều loại gốc tự do làm nguy hại tế bào như: superoxide dismutase phân hĩa nhiều trong các tế bào hồng cầu và gan, Tuy nhiên với số lượng gốc tự do quá nhiều nên cơ thể phải nhờ đến các chất chống oxy hĩa từ bên ngồi như vitamin E, vitamin C Tuy nhiên người ta đặc biệt chú tâm tới khả năng chống oxy hĩa của các hợp chất polyphenol cĩ trong các loại thực phẩm như: lá dâu tằm, trà xanh, lá chè Cơng thức hĩa học của các geranyl dihydrochalcone (2, 4, 5, 8, 9), geranyl flavonoids (1, 3, 6, 7) cĩ mặt các hydrogen phenolic thể hiện khả năng kháng oxy hĩa 25
  29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP mạnh, Quá trình kháng oxy hĩa của chúng được thể hiện bằng cách tác động trực tiếp lên các gốc tự do được sinh ra trong cơ thể, chúng sẽ tương tác với các gốc tự do đưa chúng về trạng thái các chất bền qua đĩ làm cho quá trình oxy hĩa bị loại bỏ thơng qua các dạng phản ứng sau: * * RO2 + AH ROOH + A (1) RO* + AH ROH + A (2) * * * RO2 + A ROOA (3) RO*+ A* ROA (4) * * * Các chất A tạo ra trong các phản ứng (1) (2) khác với các gốc RO2 , RO vì chúng khơng cĩ khả năng lấy các ion H+ từ các acid béo khơng no hay của các hợp chất trong cơ thể nên khơng tạo ra các gốc tự do mới để tiếp tục khởi động quá trình oxy hĩa. Các sản phẩm tạo ra trong phản ứng (3)(4) là những sản phẩm khá bền và kết quả là chuỗi phản ứng của các gốc tự do sẽ kết thúc sớm hơn. 1.5. Tổng quan về phương pháp khối phổ LC-MS 1.5.1. Phổ khối lượng Một trong những phổ cĩ ứng dụng nhiều nhất hiện nay trong phân tích và xác định các chất tự nhiên là phổ khối lượng (mass spectrometry, MS, thường được gọi là phổ khối), Phổ khối cung cấp những thơng tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử. Phổ khối khơng xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỉ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z), Ở các phân tử nhỏ, điện tích của ion thường là 1 nên giá trị m/z của phổ khối liên quan trực tiếp tới khối lượng của ion, Với các đại phân tử, điện tích của ion cĩ thể lớn hơn 1, Khi đĩ, để xác định khối lượng phân tử (M) cấn phải biết số điện tích của ion. Dưới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ion phân tử (hay cịn gọi là ion mẹ) M+, Ion mẹ này cĩ thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh nhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung hịa. Vì khối lượng của các electron rất nhỏ, cĩ thể bỏ qua, nên khối lượng của M+ chính là khối lượng của phân tử. 26
  30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong cùng một điều kiện ion hĩa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những quy định nhất định. Các chất cĩ cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng phân tử và các mảnh của phân tử, cùng với các phương pháp phổ khác người ta cĩ thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết, So sánh phổ khối của một chất với phổ khối của một chất đã biết cĩ thể giúp định danh chất đĩ dễ dàng và chính xác. Khối phổ kế cĩ thể hoạt động độc lập như một thiết bị đo phổ các chất tinh khiết hay ghép nối với các thiết bị sắc ký như sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí, điện di mao quản như một detector và đồng thời cung cấp các thơng tin cấu trúc. 1.5.2. Cấu tạo một khối phổ kế Cấu tạo của một khối phổ kế gồm cĩ các bộ phận chính sau: (a) Đầu vào, (b) buồng ion hĩa, (c) bộ phận phân tích khối, (d) detector và (e) máy tính ghi nhậ xử lý, lưu trữ kết quả và điều khiển hệ thống, Các bộ phận từ (b) - (d) được đặt trong một buồng chân khơng sâu, Tùy theo từng kỹ thuật phối khổ mà cấu tạo và nguyên lý hoạt động của từng bộ phận cĩ thể khác nhau. 27
  31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đầu vào Hình 1.6: Sơ đồ của một khối phổ kế Đầu vào là nơi mẫu được đưa vào máy phổ khối, Mẫu cĩ thể được đưa vào trực tiếp hay được ghép nối với đầu ra của một hệ thống sắc ký. Mẫu cĩ thể được đưa vào dưới dạng rắn, lỏng hay khí nhưng được ion hĩa trong buồng ion hĩa. Cổ điển nhất là mẫu được hĩa hơi, Với các kỹ thuật ion hĩa mới, mẫu cĩ thể được ion hĩa trực tiếp từ dạng lỏng hay dạng rắn. Ngày nay, việc ghép nối đã trở nên dễ dàng và khối phổ đang dần trở thành một detector phổ thơng cho các hệ thống sắc ký. Buồng ion hĩa Buồng ion hĩa là nơi mẫu thử được biến thành các ion để đi vào hệ thống phân tích, Hiện nay, cĩ nhiều kỹ thuật để biến các phân tử trung hịa thành ion. Tùy từng kỹ thuật, mức độ bị ion hĩa của các phân tử cĩ thể khác nhau, từ ion hĩa mạnh cho các chất dễ bay hơi và bền tới ion hĩa nhẹ nhàng cho các phân tử lớn, khĩ bay hơi. Cách cổ điển nhất để ion hĩa các chất là kỹ thuật bắn phá electron hay sau này cịn được gọi là ion hĩa bằng electron (electron impact hay electron ionization, EI). Người ta dùng một chùm electron để “bắn phá” phân tử mẫu ở trạng thái hơi, Điều kiện chuẩn để thực hiện EI là 70eV, Phổ EI thu được ở điều kiện này cĩ thể dùng để so sánh với phổ chuẩn để xác định các chất. EI là phương pháp ion hĩa mạnh, nhiều chất trong điều kiện này bị phân mảnh đến mức khơng cịn nhậ thấy ion M+ nữa. Để cĩ thể phát hiện được M+, nhiều kỹ thuật ion hĩa nhẹ nhàng hơn đã được áp dụng, Ion hĩa hĩa học (Chemical Ionization, CI) là một trong những kỹ thuật sớm nhất được sử dụng. Nguyên tắc của phương pháp là trong 28
  32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP buồng ion hĩa, người ta đưa vào một chất khí khác (được gọi là khí thử). Chất này sẽ bị ion hĩa và các ion này sẽ tác động lên mẫu để ion hĩa mẫu tạo ra M+ hay các ion cộng tương ứng. Các khí thử thường dùng trong CI là methan, isobutan hay ammonia. Quá trình ion hĩa mẫu thử M với khí thử là ammonia xảy ra như sau: + - NH3 + e- → NH4 + 2 e + NH4+ + M → NH3 + [M+H] Phân tử proton hĩa + NH4+ + M → [M+NH4] Ion cộng amoni Với CI, phổ MS thu được cĩ số lượng các ion ít hơn và cường độ các ion cao hơn nên dễ xác định được phân tử lượng của mẫu. EI và CI chỉ thích hợp với kỹ thuật đưa mẫu rắn (phân tích trực tiếp các mẫu tinh khiết) và khí (như GC-MS). Với dạng mẫu lỏng như trong HPLC–MS, CE- MS các kỹ thuật ion hĩa nhẹ nhàng ở áp suất thường như ion hĩa phun điện (electrospray ionization, ESI), ion hĩa hĩa học ở áp suất thường (atmospheric pressure chemical ionization, APCI), ion hĩa phun nhiệt (Thermospray Ionization, TS hay TSP) thường được sử dụng. Các chất dễ bị phân hủy nhiệt, khĩ hay khơng bay hơi cũng cĩ thể áp dụng tốt bởi các kỹ thuật ion hĩa này. Với ESI, dung dịch mẫu được phun thành những hạt nhỏ vào một buồng chân khơng dưới một điện trường mạnh. Các giọt dung dịch bị tích điện và bay hoiw dung mơi sẽ vỡ giọt thành các hạt nhỏ hơn và cuối cùng thành các ion. Các ion (dương hay âm) cần được phân tích sẽ được đẩy vào bộ phận phân tích khối, Các phân tử bị ‘vỡ’ nhẹ nhàng hơn tạo ra ít phân mảnh và cĩ cường độ lớn hơn. Với các polymer (với M tới vài chục ngàn đơn vị khối), điện tích của các ion (z) sẽ >1 (cĩ thể tới 20 hay hơn) do vậy vẫn cĩ thể được phân tích trong thiết bị phổ với m/z 1000-2000. APCI tạo ra các ion dương được proton hĩa hay ion âm do loại bỏ khỏi phân tử, Dung dịch mẫu được hĩa hơi bởi nhiệt độ dưới dạng phun mù và đi vào trong vùng plasma của các ion dung mơi tạo bởi hồ quang ở áp suất khí quyển. Sự cho nhận proton xảy ra giữa mẫu và dung mơi tạo nên các ion của mẫu thử. Trong TSP, dung dịch mẫu được bơm dưới áp suất tương đối cao qua 1 mao quản được nung nĩng bởi bằng nhiệt điện. Khi ra khỏi ống mao quản, dung mơi được 29
  33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP hĩa hơi hỗ trợ cho việc phun dung dịch thành các hạt mù rồi thành các ion đẩy vào bộ phận phân tích khối, TSP cĩ thể áp dụng cho những hệ thống cĩ tốc độ dịng cao (HPLC). Tuy nhiên, ngày nay kỹ thuật này phần lớn được thay thế bằng ESI. Ngồi những phương pháp ion hĩa trên được sử dụng nhiều trong phân tích các hợp chất phân tử nhỏ cịn cĩ nhiều kỹ thuật ion hĩa khác sử dụng cho các đại phân tử. Ví dụ, kỹ thuật bắn phá nhanh bằng nguyên tử (Fast Atom Bombardment, FAB), các kỹ thuật giải hấp trường (Field Desorption, FD), giải hấp laser (Laser Desorption, LD) và một trong những kỹ thuật đang được sử dụng nhiều là kỹ thuật giải hấp laser hỗ trợ bởi chất nền (matrix – assisted laser desorption ionization, MALDI). Với MALDI, mẫu được trộn với dung dịch chất nền và được làm khơ dung mơi trên phiến kim loại rồi đưa vào buồng ion hĩa của máy phổ khối chứ khơng kêt nối trực tiếp được với hệ thống sắc ký. Bộ phận phân tích khối Nhiệm vụ của bộ phận phân tích khối là phân tách hỗn hợp các ion sinh ra bởi bộ phận ion hĩa thành từng loại riêng biệt theo m/z để đưa các ion này tới detector để ghi nhận phổ, Cĩ nhiều cơ chế để tách riêng các ion như sử dụng từ trường, điện trường và vận tốc của các ion Các bộ phận phân tích khối đang được sử dụng trong phổ khối gồm cĩ các loại sau: cung từ (magnetic sector), tứ cực (quadrupole), bẫy ion (ion trap), thời gian bay (time of flight) và cộng hưởng bằng gia tốc ion – biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR). Kinh điển nhất trong các bộ phân tích khối là thiết bị sử dụng từ trường, Dưới một từ trường mạnh, quỹ đạo các ion sẽ thay đổi và khác nhau phụ thuộc vào điện tích và khối lượng ion. Thay đổi từ trường sẽ thay đổi quỹ đạo các ion, lần lượt đưa chúng đi vào detector, Đây cũng là 1 trong 2 loại phân tích ion mạnh và cĩ độ chính xác cao nhất được dùng trong các máy khối phổ phân giải cao (HR-MS). Bộ phân tích tứ cực gồm 4 thanh kim loại cĩ tiết diện trịn hay hyperbol đặt song song với nhau dài khoảng 100 - 200 mm. Một điện thế một chiều khơng đổi được điều biến bởi điện thế tần số radio được áp lên tứ cực tạo nên một điện trường trong tứ cực. Dưới tác động của điện trường, chỉ cĩ những ion nhất định bay dọc theo tứ cực đi tới detector. Các ion khác quỹ đạo bị lệch và va vào các thanh tứ cực hoặc bay ra ngồi. 30
  34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thay đổi dịng điện tần số radio trên tứ cực sẽ lần lượt cho phép các ion khác nhau bay vào detector và được ghi nhận thành phổ. Bẫy ion cĩ cấu tạo gồm một điện cực vịng với mặt trong cĩ dạng hyperbol và hai điện cực chỏm nằm ở hai đầu trống của điện cực vịng cũng cĩ dạng hyperbol. Bằng cách thay đổi điện thế các điện cực, người ta cĩ thể điều khiển được quỹ đạo của các ion trong bẫy. Tuy nhiên, khác với tứ cực, các ion khi đi vào bẫy ion sẽ bị giữ tại đĩ bởi điện trường nếu điện thế của điện cực vịng và 2 điện cực chỏm khơng khác nhau. Thay đổi điện thế và tần số của điện cực vịng sẽ lần lượt quét các ion ra khỏi bẫy đi tới detector để ghi nhận thành phổ. Thay đổi thế của hai điện cực chỏm sẽ giữ lại một hay một vài ion nhất định trong bẫy (trong chế độ chọn lọc ion) hay gia tốc các ion (trong chế độ MS nhiều lần). Tứ cực và bẫy ion cho phép phân tích các chất cĩ m/z tới 5000. Độ chính xác khối của tứ cực và bẫy ion khơng cao (0,1 đơn vị khối) nhưng nhỏ gọn, đơn giản, dễ sử dụng và rẻ tiền hơn nên được áp dụng nhiều trong các hệ LC-MS. Một cách khác để tách các ion ra khỏi hỗn hợp là dựa vào vận tốc của các ion. Ở cùng một mức năng lượng, vận tốc của ion phụ thuộc vào khối lượng của ion. Phân tử càng nhẹ vận tốc càng lớn. Đo lường thời gian để ion từ điểm xuất phát bay tới detector sẽ tính ra được khối lượng của ion. Do vậy, kỹ thuật này được gọi là xác định thời gian bay của ion (TOF), TOF cĩ độ phân giải tương đối cao (tới 20,000), với số khối chính xác hơn (tới 0,0001). Khoảng phân tích khối của TOF là khơng giới hạn, rất hữu dụng cho việc phân tích các đại phân tử. Một kỹ thuật mới để phân tích khối là cộng hưởng bằng gia tốc ion - biến đổi Fourier (FT-ICR). Các ion được giữ trong một buồng cộng hưởng dưới một từ trường mạnh ở bên và một điện trường theo hướng trục. Giống như trong cộng hưởng từ hạt nhân, tất cả các ion trong buồn được kích thích bởi một xung tần số radio băng rộng (10KHz - 1MHz), Các ion sẽ hấp thu năng lượng phù hợp để cộng hưởng. Các ion cùng loại khi hấp thu năng lượng (cộng hưởng) chuyển động đồng nhất tạo ra một tần số nhất định phụ thuộc vào m/z.Tất cả các tần số của các ion tạo ra sẽ được ghi nhận dưới dạng các dao động cảm ứng tự do tắt dần theo thời gian và sau đĩ được biến đổi Fourier để trở thành dạng phổ khối truyền thống, FT-ICR cĩ độ phân giải và độ chính 31
  35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP xác khối rất cao (tới 1 ppm), khoảng phân tích khối rộng (hiện nay là m/z tới 10,000). Độ nhạy của FT-ICR cũng rất cao, giới hạn phát hiện cĩ thể đạt tới mức attomole. Khi phối hợp với ESI, FT-ICR cĩ thể phân tích các protein tới 15,000 đơn vị khối. Ngồi các kỹ thuật phân tích khối đã nêu trên, cịn cĩ các loại khác đã hoặc đang được phát triển như bẫy quỹ đạo (orbital trap) hay dựa trên tính linh động của ion (ion mobility) và các kỹ thuật lai hay kết hợp giữa các loại trên. Detector Là nơi tiếp nhận các ion và biến thành các tín hiện điện để được ghi nhận thành các tín hiệu phổ khối, Cĩ nhiều loại detector khác nhau nhưng thường là loại ống nhân điện, ống nhân quang các tín hiện điện thu được từ detector sẽ được số hố và lưu trữ dưới dang các tập tin kỹ thuật số. Trong phân tích khổ phối, việc xác định chính xác một ion (M+ hay các phân mảnh) rất quan trọng cho việc xác định chất được phân tích. Một hợp chất xác định, trong những điều kiện xác định sẽ cho các ion xác định trên phổ khối. Tuy nhiên, một ion cĩ số khối xác định trên phổ khối lại cĩ thể xuất phát từ nhiều chất khác nhau. Trong phân tích một hỗn hợp bằng sắc ký - khối phổ, nếu điều kiện sắc ký khơng đảm bảo, các chất tách ra khơng hồn tồn dẫn tới phổ khối thu được sẽ cĩ các ion của các phân tử khác làm ảnh hưởng tới việc nhận định kết quả. Trong các trường hợp này, việc xác định MS thơng thường (một lần) khong cho được kết quả chính xác. Để khắc phục, người ta sử dụng các kỹ thuật khối phổ n lần với n thường là 2 hay đơi khi hơn. Kỹ thuật này được gọi là MS/MS hay MSn. Nguyên tắc của các kỹ thuật này là lực chọn một ion xác định (thường là M+ nhưng cũng cĩ thể là các ion con) trong các ion của lần ion hố thứ nhất và loại bỏ tất cả các ion khác trong bộ phận phân tích ion. Các ion này sau đĩ được cho tiếp xúc với 1 lượng nhỏ các khí (thường là argon). Với vận tốc cao, các ion này sẽ va đập vào các phân tử khí và phân thành các mảnh nhỏ hơn. Các ion sinh ra trong lần phân mảnh thứ 2 này sẽ được phân tích và ghi nhận phổ MS, Vì phổ khối ghi nhận được chỉ từ 1 loại ion duy nhất nên khơng cịn bị ảnh hưởng của các tạp chất trong mẫu nữa. Việc nhận định kết quả trên phổ MS/MS sẽ chính xác hơn, đặc biệt khih hàm lượng chất phân tích thấp và năm trong hỗn hợp phức tạp. 32
  36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các thiết bị để thực hiện MS/MS cĩ 2 loại chính là: loại phổ khối nối tiếp và bẫy ion. Loại cổ điển nhất của phổ khối nối tiếp gồm 3 tứ cực ghép nối tiếp với nhau. Tứ cực thứ nhất làm nhiệm vụ chọn lọc ion. Các ion được chọn sẽ bay vào tứ cực thứ 2 và va đập với khí argon để phân mảnh ion lần 2. Tất cả các ion tạo ra sẽ bay vào tứ cực thứ 3 và được quét lần lượt bởi điện trường để đi tới detector và ghi nhận thành phổ. Do cấu tạo bởi 3 tứ cực nên loại này thường được gọi là triplequad (triple quadrupoles). Với bẫy ion, cả 3 giai đoạn trên đều xảy tra trong bẫy theo trình tự thời gian. Vì các ion được giữ lại trong bẫy nên việc phân mảnh cĩ thể được thực hiện thêm nhiều lần nữa, Tuy nhiên, độ nhạy của kỹ thuật này ở các lần sau giảm đi nhanh chĩng do số ion giảm, Trên thực tế, người ta thường chỉ sử dụng MS2. Ngồi hai thiết kế cơ bản trên, cịn cĩ các loại lai khác như: Q-Trap (kết hợp giữa tứ cực và bẫy ion), Q-Tof (kết hợp giữa tứ cực và TOF), IT-Tof (kết hợp giữa bẫy ion và TOF) Các loại thiết bị này kết nối với GC, HPLC hiện cĩ mặt trên thị trường. Một phương tiện rất hữu hiệu trong phân tích các chất, đặc biệt là trong phân tích các chất cĩ nguồn gốc tự nhiên. Phổ khối cho nhiều thơng tin về các trúc để xác định cấu trúc một chất mới hay định danh một chất đã biết. Phổ khối cĩ độ nhạy cao, khoảng tuyến tính động học rộng rất thích hợp cho phân tích định lượng, đặc biệt là trong phân tích vết.Khi kết hợp với hệ thống sắc ký, phổ khối cĩ thể sử dụng như một detector phổ thơng, phát hiện hầu hết các chất nhưng với chế độ chọn lọc ion nĩ lại là detector chọn lọc cho những chất xác định rất cĩ ích trong việc định lượng các chất trong một hỗn hợp phức tạp. Các thiết bị phổ khối ngày càng nhạy và tin cậy hơn; giới hạn phân tích khối ngày càng mở rộng; việc sử dụng ngày càng dễ dang và giá thành ngày càng hạ, Điều này làm cho thiết bị khổ phối dần trở thành các phương tiện phân tích thường quy trong phân tích dược liệu. 33
  37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 34
  38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Lá sen được thu hái tại khu vực quận 7, thành phố Hồ Chí Minh. - Lá sen thu hái gồm 2 dạng: một loại lá cịn non, lá cịn cuộn lại, chiều dài khoảng từ 10-15cm và một loại lá đã trưởng thành (lá xịe rộng đường kính từ 20-30cm). H ì n h Hình 2.1: Lá sen non Hình 2.2: Lá sen trưởng thành 2.2. Dụng cụ, hĩa chất thí nghiệm Dụng cụ thí nghiệm - Máy sấy; Máy cơ quay chân khơng; Máy lọc chân khơng. - Máy lắc; Hệ thống chạy khối phổ MS; Máy quang phổ UV-Vis 2000 - Bể điều nhiệt; Bếp đun cách thủy. Hĩa chất - Thuốc thử Folin-Ciocateau của hãng Sigma; Dung dịch Na2CO3 bão hịa 20%; Acid Gallic. - Rutin, dung dịch AlCl3 2%, đệm photphast (pH=6,6) - Vitamin C ; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Methanol - Dung dịch FeCl3 0,1%; dung dịch K3Fe(CN)6 1% ; CCl3COOH 10% - Chloroform, NH4OH 25%, H3PO4 3%, NH4OH 10%. - Ethanol 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, PE, Cloroform, Ethyl acetate. 35
  39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3. Phương pháp thí nghiệm Sơ đồ tiến trình thí nghiệm Lá sen trưởng thành và lá non Vi phẫu lá cịn tươi Sấy khơ Định tính sơ bộ Thử độ tinh khiết Xay nhỏ TPHH & soi bột Ngâm dầm trong cồn với các nồng độ khác nhau Xác định hàm Thu cao lượng cao thu được Polyphenol tổng số Định lượng một số Flavonoid t ng ổ hợp chất thức cấp Alkaloid tổng số Thử hoạt tính kháng oxy hĩa Xác định TPHH bằng phương pháp LC-MS Hình 2.3: Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 36
  40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.1. Phương pháp vi học kiểm nghiệm dược liệu 2.3.1.1. Phương pháp vi phẫu Chọn mẫu Dùng mẫu lá tươi để thực hiện vi phẫu. Mẫu lá sen khơng quá già cũng cũng khơng quá non (DĐVN quyển III). Cắt vi phẫu Cắt mẫu bằng tay với dao lam. Dao lam mới, khi cắt đặt dao lam thẳng gĩc với mẫu vật.Cắt ở khoảng 1/3 phía dưới nhưng khơng sát đáy phiến lá sen. Bỏ bớt phần thịt lá 2 bên, cịn lại bề rộng 0,6 - 0,8cm. Độ dày lát cắt khoảng <1mm. Chọn các lát cắt thật mỏng để nhuộm. Nhuộm vi phẫu 37
  41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Ngâm vi phẫu trong Javel (t=15-20 phút) Rửa bằng nước cất (3-4 lần) Ngâm vi phẫu trong acid acetic 10% trong 2 phút Rửa bằng nước cất (3-4 lần) Ngâm vi phẫu trong thuốc nhuộm 2 màu (t=15 phút) Rửa mẫu bằng nước cất và ngâm ngay vào nước Hình 2.4: Sơ đồ tiến trình nhuộm vi phẫu 2.3.1.2. Phương pháp soi bột Chuẩn bị bột để soi Lấy lá sen cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ khoảng 60oC, tán nhỏ, nghiền nát hoặc dùng máy xay. Rây qua rây số 32 (rây mịn). Phần cịn lại trên rây được tán hoặc xay và rây tiếp (cĩ thể sấy lại cho dễ xay tán, nếu cần) cho đến khi tất cả dược liệu trở thành bột mịn Bột lá sau khi xay mịn thường cĩ màu xanh lục hoặc xanh nâu. Các cấu tử thường thấy là: biểu bì mang khí khổng, lơng che chở, lơng tiết, tinh thể calci oxalat, các mạch gỗ v.v Làm tiêu bản bột 38
  42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Cho 1 giọt nước cất vào giữa lame kính, lấy một ít bột cho vào giữa chất lỏng - Đậy lamette lại, Dùng ngĩn trỏ di nhẹ trên lá kính để các phần tử phân tán đều. - Loại bỏ phần bột và nước cất thừa bằng giấy thấm rồi quan sát bằng kính hiển vi - Nêu khơng nhìn thấy rõ vân tễ cĩ thể bổ sung thêm 1 giọt dung dịch KOH 5% để quan sát rõ hơn 2.3.2. Thử độ tinh khiết dược liệu 2.3.2.1. Xác định độ ẩm Độ ẩm của dược liệu được thực hiện bằng phương pháp Xác định mất khối lượng do làm khơ . Cụ thể là dùng phương pháp: sấy trong tủ sấy ở áp suất thường. theo DĐVN III Phụ lục 5.16 (Trang PL-98). Cách thực hiện Sấy cốc cân ở nhiệt độ 125-1300C trong 1h. Cho cốc vào bình hút ẩm 30 phút. Dùng cân phân tích cĩ độ chính xác 0,001g cân khối lượng của cốc. Cân chính xác 1g bột dược liệu cho vào cốc cân (đã biết trước khối lượng). Đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 125-1300C trong 1 giờ và cân khối lượng. Làm tương tự như vậy cho đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân khơng vượt quá 0,5 mg. Tính tốn kết quả Độ ẩm được tính bằng phần trăm theo cơng thức: % Trong đĩ: W: độ ẩm của dược liệu (%) mbd: Khối lượng ban đầu (g) msay: Khối lượng sấy (g) 2.3.2.2. Xác định tro tồn phần 39
  43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Xác định tro tồn phần theo DĐVN Phụ lục 7.5 và 7.6 (Trang PL-128 -129) Cách thực hiện Trong chén nung bằng sứ, đường kinh 35mm, sơ bộ đã đem nung đỏ, để nguội và cân bì. Cân chính xác 5g lá sen đã được cắt nhỏ cho vào chén nung. Lúc đầu đốt nhẹ rồi tăng dần nhiệt độ để dược liệu cháy hết. Cần theo dõi và điều chỉnh nhiệt độ để tránh than khơng bị thốt ra khỏi miệng chén. Đốt xong cho chén vào lị nung ở nhiệt độ 5000C cho đến khi thu được khối lượng khơng đổi. Để tránh các dược liệu hĩa gỗ tạo ra than khĩ đốt cháy, cĩ thể ngừng nung rồi làm ẩm bằng nước cất hoặc acid nitric đậm đặc rồi đem nung lại. Sau khi tro khơng cịn màu đen, để nguội trong bình hút ẩm và đem cân. Tính tốn kết quả Tro tồn phần tính trên dược liệu khơ kiệt theo cơng thức sau Trong đĩ: X: tỉ lệ tro tồn phần. tính ra phàn tram a: Khối lượng chén cĩ tro b: Khối lượng chén khơng c:Khối lượng dược liệu dung W: độ ẩm dược liệu, tính ra phần trăm 40
  44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.3. Quá trình chiết và thu nhận cao chiết 2.3.3.1. Sơ đồ quy trình Bột dược liệu khơ - Ngấm kiệt với cồn 60%, 70%, 80%, 90%, 96% - Cơ quay loại dung mơi Cao chiết cồn-nước - Nước - Dung mơi CHCl3 Dịch chiết CHCl3 Dịch chiết cồn-nước sau lắc CHCl3 Dung mơi EtOAC Cơ quay loại Dịch chiết cồn-nước dung mơi sau lắc EtOAC Et-F Phân tích bằng sắc ký LC-MS Xác định TPHH Hình 2.5: Sơ đồ quy trình chiết và phân tích cao chiết lá sen 41
  45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.3.2. Thuyết minh quy trình Nguyên liệu : lá sen tươi được lựa chọn, rửa sạch, sấy khơ ở nhiệt độ 600C và xay cho đến khi tạo thành bột cĩ kích thước từ d=1,5-2 mm. Chiết Mục đích: Chiết các hợp chất cĩ trong lá sen nhờ dung mơi ethanol với nhiều nồng độ khác nhau, nhằm khảo sát nồng độ dung mơi nào phù hợp vớitừng đối tượng lá sen, Quá trình chiết được diễn ra trong thời gian 24h, trên máy lắc 150 vịng /phút. Cách thực hiện : Ngâm bột lá sen vào 200ml dung dịch ethanol tại các nồng độ khác nhau, Để trên máy lắc 24h với tốc độ lắc 150 vịng/phút. Lọc Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thơ để loại cặn lá lẫn trong dịch chiết, thu dịch trong để chuẩn bị quá trình tinh chế. Thể tích dung dịch sau lọc V=175ml Cơ quay Nhằm thu hồi dung mơi ethanol để tái sử dụng, Dịch sau cơ quay được chuyển sang dung mơi khác để loại bỏ tạp chất khác khơng mong muốn cũng như thực hiện quá trình tiếp theo. Cơ quay bằng thiết bị cơ quay ở nhiệt độ 70 – 800C, sau đĩ tiến hành quá trình xử lý chloroform. Xử lý chloroform Mục đích: Sau khi xử lý lá sen bằng dung mơi chiết, thì trong dịch chiết, ngồi polyphenol và các alkaloid cần thiết, cịn cĩ mặt cafein, pigment và polysacarit, Để tách cafein và các tạp chất dịch trích sau khi loại dung mơi chiết được xử lý với chloroform để giải phĩng polyphenol, alkaloid tự do. Lắng Mục đích : Do chloroform khơng hịa tan trong dịch trích chứa polyphenol, Alkaloid mà chỉ hịa tan cafein và các tạp chất nên sau khi xử lý cần quá trình lắng để cho tách lớp. 42
  46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cách thực hiện: Chloroform cĩ khối lượng riêng cao nên sau khi tách lớp nằm phía dưới, tiến hành loại chloroform bằng bình chiết hoặc cẩn thận hút lớp dung dịch phía trên ra khỏi chloroform. Cơ quay loại dung mơi Nhằm loại bỏ triệt để chloroform ra khỏi dịch chiết và thu hồi chloroform, bằng cách cơ quay 70 – 800C, trong 30 phút. Dịch sau khi cơ đặc được chuyển sang cơng đoạn thu nhận sau, Xử lý ethyl acetate Mục đích: Dịch chiết sau khi xử lý bằng chloroform tuy đã loại bỏ một phần tạp chất nhưng vẫn cịn lại polysacarit và một số thành phần khơng hịa tan trong chloroform. Do đĩ dịch chiết tiếp tục được xử lý bằng dung mơi ethyl acetate nhằm làm tăng độ tinh sạch của chế phẩm. Dùng dung mơi là ethyl acetate để lơi kéo các chất cần cĩ trong dung dịch. Sau khi để yên, hỗn hợp phân tách thành 2 lớp, lớp bên trên là dịch ethyl acetate, bên dưới là nước. Tách lấy lớp trên là dung dịch ethyl acetate. Dung chiết Et-F được sử dụng để phân tích sắc ký LC-MS, xác định các thanh phần hĩa học của dịch chiết lá sen. 2.3.4. Phương pháp xác định lượng cao thu được Với mỗi loại dược liệu, sau quá trình chiết xuất ta thu được cao chiết. Cân khối lượng các cao thu được trên cân phân tích 4 số lẻ. Tính tốn % cao thu được cho phép ta biết được hiệu quả kinh tế của dược liệu. Với mỗi loại dược liệu, % cao được tính theo cơng thức sau: Trong đĩ: mcao : khối lượng cao thu được (g) mdl : khối lượng dược liệu đem chiết (g) wdl : độ ẩm của dược liệu đem chiết 43
  47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.5. Phương pháp định tính các thành phần hĩa học trong lá sen. Định tính Alkaloid Lấy khoảng 5ml dịch chiết cồn vào chén sứ, bốc hơi tới cắn, Hịa tan cắn trong 2-4ml dung dịch HCl 5%. Cho dung dịch phản ứng với thuốc thử Mayer. So sánh với ống đối chứng khơng cĩ thuốc thử. Nếu dung dịch đục hoặc cĩ tủa: cĩ alkaloid Định tính Flavonoid Nếu hơ một tờ giấy thấm cĩ nhỏ dịch chiết trên miệng lọ ammoniac thì cĩ màu vàng tăng lên tùy theo nồng độ flavonoid và tùy theo nhĩm flavonoid. Flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương, Chalcon và auron cĩ thể cho màu đỏ da cam. Định tính Tannin Pha lỗng 0,5ml dịch chiết với 1ml nước cất. Thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5% lắc đều. Nếu dung dịch cĩ màu xanh đen, xanh rêu hay nâu (tùy theo số lượng nhĩm OH): cĩ polyphenol trong đĩ bao gồm cả tannin. Định tính Saponin Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cơ trên bếp cách thủy tới cắn, Hịa tan cắn trong 5m cồn 25% trên bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm. Thêm 5ml nước cất và lắc mạnh theo chiều dọc, Nếu cĩ bọt bền: cĩ saponin Định tính các chất khử Lấy 5ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi dịch cồn đến cắn, Hịa cắn với 3ml nước cất trên bếp cách thủy, để nguội, lọc qua giấy lọc. Thêm 0,5ml dung dịch Fehling A và 0,5ml dung dịch Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu cĩ kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: cĩ các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử). 44
  48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số Nguyên tắc: dựa vào phản ứng oxy hĩa của các polyphenol với thuốc thử Folin- Ciocateau, tạo ra sản phẩm cĩ màu xanh lam. So màu ở bước sĩng λ=765 nm, Hàm lượng polyphenol được tính tốn theo đường chuẩn acid Gallic. Đường chuẩn acid Gallic: - Chuẩn bị các dung dịch acid Gallic cĩ các nồng độ khác nhau: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/ml, - Cho 60 mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch đã cĩ 4,74ml nước cất, sau đĩ cho 300 thuốc thử Folin-Ciocateau vào và trộn đều. Sau khoảng 30 giấy đến 8 phút cho vào 900 dung dịch Na2CO3 20%, lắc đều. Hỗn hợp phản ứng được giữ ở 400C trong vịng 30 phút. So màu ở bước sĩng λ=765 nm - Đối với mẫu nghiên cứu, pha lỗng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu cĩ phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên, hàm lượng polyphenol được tính tốn dựa theo đường chuẩn Acid Gallic trên. 2.3.7. Phương pháp định lượng flavonoid tổng số Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch khi phản ứng với AlCl3 tại bước sĩng λ=420 nm; tạo ra dung dịch cĩ màu vàng (theo phương pháp của Woisky and Salatino) Dựng đường chuẩn Rutin - Pha các dung dịch Rutin chuẩn bằng ethanol 960 theo dãy nồng độ sau: 0; 0,0125; 0,025; 0,05; 0,075; 0,1 (mg/ml) - Hút 2ml từ mỗi nồng độ vào 6 ống nghiệm sạch - Thêm 2ml dung dịch AlCl3 2% - Ủ ở nhiệt độ phịng trong vịng 1h, So màu ở bước sĩng λ=420 nm, - Đối với mẫu nghiên cứu, pha lỗng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu cĩ phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên, hàm lượng flavonoid được tính tốn dựa theo đường chuẩn Rutin. 45
  49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.8. Phương pháp định lượng alkaloid tổng số Alkaloid tổng số được định lượng bằng phương pháp cân (Tạp chí dược liệu số 2+3/2011). Nguyên tắc: Trước tiên dung dung mơi hữu cơ chiết alkaloid tồn phần trong mơi trường kiềm, Acid hĩa dịch chiết kiềm, loại nhựa và các tạp chất khác, Sau đĩ kiềm hĩa dịch acid và chiết alkaloid ở dạng bazo, làm khơ cắn, cân và tính kết quả Cách tiến hành 46
  50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyên liệu 2,50-3,00g bột lá sen Tẩm uớt dược liệu bằng 2ml ethanol 960 và 3ml ammoniac 25% Chiết với chloroform trong máy Soxhlet 4h Thu hồi chloroform đến cắn khơ. Hịa cắn với 15ml acid phosphoric 3% nĩng Rửa cắn và giấy lọc bằng 5ml acid rồi 5ml nước cất Kiềm hĩa dịch acid đến pH 10-11 bằng ammoniac 10% Lắc dung dịch đã kiềm hĩa với chloroform Làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 khan, chuyển vào bình cĩ khối lượng đã biết Thu hồi chloroform Sấy cắn alkaloid ở 1000C đến khối lượng khơng đổi Hình 2.6: Sơ đồ xác định alkaloid tồn phần 47
  51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tính tốn kết quả Hàm lượng % alkaloid tồn phần được tính theo cơng thức: X = . Trong đĩ: a: cắn alkaloid (g) b: Lượng dược liệu (g) c: Độ ẩm dược liệu (%) 2.3.9. Phương pháp xác định năng lực khử Năng lực khử của dịch chiết lá được xác định theo phương pháp của Wang và cộng sự 2008. Nguyên tắc: Dựa trên giá trị OD tại bước sĩng λ=700 nm của dung dịch khi cĩ sự biến đổi màu sắc từ vàng sang màu xanh lục do sự khử Fe3+ thành Fe2+ Cách thực hiện: theo sơ đồ 2.7. 48
  52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hút 2,5ml dịch chiết với các nồng độ khác nhau từ 0,001-0,005 mg/ml Thêm 2,5ml đệm photphate (pH=6,6). Bổ sung 2,5ml dung dịch K3Fe(CN)6 1%. Ủ ở 500C khoảng 20 phút Thêm vào 2,5ml CCl3COOH 10%. Ly tâm hỗn hợp 3000 vịng/10 phút. Hút 2,5ml lớp trên và cho vào 3,5ml nước cất. Thêm 0,5 ml FeCl3 0,1% Đo OD ở bước sĩng λ=700 nm Hình 2.7: Sơ đồ tiến trình thí nghiệm đánh giá năng lực khử 2.3.10.Đánh giá hoạt tính kháng oxy hĩa trên mơ hình DPPH Nguyên tắc: Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đơi hydro và đình chỉ quá trình oxy hĩa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn, Như vậy, khi cĩ mặt của chất chống oxy hĩa nĩ sẽ khử gốc tự do DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đĩ độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm đi. Z + AH = ZH + A, (1) Trong đĩ: Z: là gốc tự do DPPH, AH là chất chống ơxi hĩa 49
  53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Đánh giá Khả năng kháng oxy hĩa thơng qua IC50 là một giá trị nồng độ của mẫu mà tại đĩ nĩ cĩ thể ức chế 50% gốc tự do Dựng đường chuẩn Vitamin C - Pha dung dịch vitamin C theo các nồng độ sau: 0; 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 (mg/ml). - Dùng micropipet hút 50 mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn 2ml dung dịch DPPH. - Ủ trong tối 15’ ở nhiệt độ phịng. So màu ở bước sĩng λ=517 nm. - Đối với mẫu nghiên cứu, pha lỗng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu cĩ phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên. Kết quả được đánh giá thơng qua giá trị IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ chất chống oxy hĩa cần để ức chế (trung hịa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định - Mẫu Vitamin C được dùng để so sánh thơng số giá trị IC50 Tính tốn kết quả Phần trăm ức chế (%I) = % Trong đĩ: ADPPH là giá trị OD517nm của dung dịch DPPH ban đẩu pha trong methanol (ADPPH=0,705) ATN là giá trị OD517nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu) Giá trị IC50 được tính tốn dựa theo đường chuẩn: y=ax+b theo cơng thức 2.3.11.Phương pháp phân tích phổ khối lượng MS Nguyên tắc: khi dung dịch chạy qua hệ thống phân tích TOF-Time of Fly sẽ cho ra các peak phân mảnh của các chất cĩ trong dung dịch trên detector. Giải phổ khối lượng các chất này bằng phần mềm ChemDraw và đối chiếu với ngân hàng dữ liệu. 50
  54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cách tiến hành: - Dịch chiết nguyên liệu được lọc nhiều lần qua màng vi lọc trước khi bơm vào bộ phận tiêm mẫu, tiến hành cùng phương pháp với dịch chiết cồn. - Tiến hành thí nghiệm bằng kỹ thuật ion hĩa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion dương trên hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ HPLC Agilent 1200 Series coupled to MS detector, micrOTOF-QII Bruker. Thiết lập các thơng số cho hệ thống: điện thế tần số radio RF buồng va chạm 250,0 Vpp; tốc độ phun khí gas N2 làm sạch 9,0 l/phút với nhiệt độ dịng khí 20oC; áp lực bơm phun 1,2 bar; điện thế ion hĩa 4500V, điện tích nền -500V, khối phổ được quét ở chế độ quét liên tục với điểm bắt đầu 50 m/z đến điểm kết thúc 3000 m/z. Khơng kích hoạt hệ thống tham số thơng minh. - Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Chemstation cung cấp bởi Agilent Corporation, MA, USA. So sánh với dữ liệu trong phần mềm Bruker compass data analysis 4.0 với mức sai số ý nghĩa để kết luận. 0,005 51
  55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 52
  56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát vi phẫu và soi bột lá sen Vi phẫu lá sen Gân giữa Biểu bì trên tế bào hình chữ nhật khá đều, kéo dài thành núm lồi đầu tù dài 7,5-15 µm cĩ lỗ khí. Biểu bì dưới giống biểu bì trên nhưng tế bào dài hơn, vách hĩa mơ cứng, lớp cutin dày. Dưới biểu bì trên là mơ mềm giậu. Dưới mơ mềm giậu và trên biểu bì dưới là mơ dày gĩc gồm nhiều lớp tế bào đa giác gần trịn. Mơ mềm khuyết tế bào hình trịn hoặc đa giác gần trịn, kích thước lớn xếp tạo nhiều khuyết to, ven khuyết cĩ nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Nhiều bĩ libe gỗ kích thước khơng đều, 2 bĩ to giữa 2 khuyết lớn, một số bĩ nhỏ hơn nằm rải rác trong mơ mềm. Mỗi bĩ dẫn gồm gỗ ở trên, libe ở dưới; mạch gỗ to, hình bầu dục hoặc đa giác gần trịn; tế bào mơ mềm libe hình đa giác, kích thước nhỏ, sắp xếp lộn xộn; nhiều mạch rây hình đa giác. Bao quanh bĩ libe gỗ là 1-2 lớp tế bào hình đa giác, kích thước nhỏ, hĩa mơ cứng thành vịng. 53
  57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.1: Vi phẫu cấu trúc lá sen A: Cấu trúc gân lá. B: Mơ mềm khuyết với bĩ mạnh libe-gỗ; C: Biểu bì dưới D: Biểu bê trên, E: Mơ mềm giậu và các tinh thể calci oxalate; F: Mơ dày Soi bột Hình 3.2: Bột lá sen Bột lá sen: Bột màu xanh đến nâu, mịn, vị chát. Mảnh biểu bì trên tế bào hình đa giác, cĩ núm lồi. Mảnh biểu bì dưới tế bào vách uốn lượn. Sợi vách dày, khoang 54
  58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP rộng. Tinh thể calci oxalat cầu gai kích thước lớn, đường kính 25-30 µm. Mảnh mạch vạch H Hình 3.3: Vi phẫu bột lá sen A: Mảnh mạch vạch. B: Lơng che chở đa bào. C: Mơ cứng D: Núm lồi. E: Tinh thể canxi oxalate. F: Mảnh biểu bì dưới 3.2. Thử độ tinh khiết dược liệu Độ ẩm Nguyên liệu được sấy khơ đến khối lượng khơng đổi. Độ ẩm được xác định bằng cơng thức nêu trong mục 2.2 và biểu thị trong bảng 3.1 55
  59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.1: Độ ẩm dược liệu Đối tượng Lá sen trưởng thành Lá sen non Độ ẩm (%) 9,39 ± 0,18 11,66 ± 0.09 Độ ẩm là lượng nước chứa trong 100g dược liệu. Dược liệu tươi thường chứa một lượng nước rất lớn: lá chứa khoảng 60 - 80% nước, thân và cành chứa khoảng 40 - 50% nước. Khơng cĩ một dược liệu nào đạt độ khơ tuyệt đối (độ ẩm 0%), nhưng đối với mỗi dược liệu đều được quy định một độ ẩm an tồn. Để bảo quản tốt, dược liệu cần cĩ độ ẩm bằng hoặc dưới độ ẩm an tồn. Theo DĐVN III độ ẩm cho phép của lá cây dược liệu khoảng từ 8%-12%. Độ ẩm của lá sen thí nghiệm nằm trong giới hạn an tồn quy định. Cụ thể là 9,39% đối với lá sen trưởng thành và 11,66% đối với lá sen non. Tuy nhiên việc độ ẩm cao ở lá sen non sẽ gây ảnh hưởng đến việc bảo quản lá non nhiều hơn so với việc bảo quản lá sen trưởng thành. Tro tồn phần Hàm lượng tro tồn phần được xác định theo phương pháp 2.2. Kết quả hàm lượng tro tồn phần của lá sen là 5,45%. 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng cao thu được Điều kiện thí nghiệm: - Thời gian ngâm dung mơi: 24h - Tỉ lệ nguyên liệu: dung mơi=1:10 - Nhiệt độ sấy: sấy cùng một chế độ nhiệt - Chiết kiệt - Nồng độ ethanol: 60%, 70%, 80%, 90%, 96% Kết quả thu được thể hiện qua phụ lục và được mơ tả trong bảng 3.2 56
  60. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng chất khơ thu được Nồng độ Lượng cao lá sen trưởng thành Lượng cao lá sen non (%) (%) (%) Cồn 60% 7,12b ± 0,19 7,28b ± 0,07 Cồn 70% 7,62a ± 0,08 7,80a ± 0,01 Cồn 80% 6,67c ± 0,06 7,13c ± 0,1 Cồn 90% 5,93d ± 0,06 5,27d ± 0,06 Cồn 96% 5,20e ± 0,07 4,29e ± 0,02 Nhận xét: Khi thay đổi nồng độ ethanol từ 60% cho đến 70%, lượng chất khơ tăng dần. Do dung mơi ethanol cho phép chiết nhiều hợp chất cĩ độ phân cực khác nhau và kể cả những chất khơng phân cực, do vậy nồng độ ethanol càng tăng thì khả năng thẩm thấu và khuyếch tán hoạt chất càng cao. Chính vì vậy lượng cao thu được tăng dần khi nồng độ ethanol tăng. Tuy nhiên, ở nồng độ ethanol từ 80% lên 90% và 96% , lượng cao thu được giảm dần, đồng thời màu dịch chiết chuyển từ màu xanh vàng sang màu xanh lục. Ở nồng độ ethanol 96% thì hiệu suất chiết giảm đáng kể. Nguyên nhân là do khi nồng độ ethanol quá cao, ethanol sẽ háo nước làm các thành tế bào bị mất nước cục bộ dẫn tới hiện tượng các tế bào bị khơ và co lại ngăn cản quá trình chiết, đồng thời nhiều phức hợp khác cũng được chiết ra khỏi tế bào như chlorophyll làm cho dịch trích chuyển sang màu xanh lục. 57
  61. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.4: Sự biến đổi màu sắc dịch chiết ở các nồng độ cồn khác nhau Việc sử dụng dung mơi chiết với các nồng độ khác nhau đã cĩ ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết. Đối với mẫu lá trưởng thành ta thấy, hiệu suất thu cao cĩ phần lớn hơn so với mẫu lá non, vì lá trưởng thành tổng hợp nhiều hợp chất hơn so với lá non. Ethanol 70% cho hiệu suất thu cao hơn hẳn các nồng độ khác vì nĩ cĩ thể lơi kéo các chất từ phân cực trung bình đến rất phân cực. Hiệu suất thu cao cao nhất đạt 7,62% đối với lá sen trường thành, đạt 7,80% đối với lá sen non, kết quả này cao hơn so với hiệu suất thu cao chiết từ lá sen trong nghiên cứu của Ju-Hui Choe và cộng sự, được đăng trên tạp chí Food Sci.Biotechnol (2010) là 6,95%. 3.4. Định tính các thành phần hĩa học cĩ trong dịch chiết lá sen Định tính Flavonoid Hình 3.5: Sự biến đổi màu sắc khi hơ dịch chiết qua NH4OH - Khi hơ vết thấm của dịch chiết lá sen trên miệng lọ NH4OH 25%, vết thấm chuyển từ màu xanh sang màu vàng nhạt => cĩ sự hiện diện của Flavon và Flavonol. 58
  62. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Định tính Alkaloid Hình 3.6: Sự tạo tủa với thuốc thử Mayer - Khi cho dịch chiết pha lỗng với HCl 5% rồi phản ứng với thuốc thử Mayer, Quan sát ta thấy dung dịch bị đục và xuất hiện kết tủa vơ định hình màu trắng, Đối chứng với ống thuốc thử khơng cĩ dịch chiết, khơng cĩ tủa xuất hiện => cĩ mặt alkaloid trong dịch chiết. Định tính saponin - Saponin cĩ tính tạo bọt và bền trong khoảng thời gian nhất định, Việc dung dịch tạo cột bọt bền chứng tỏ trong dung dịch cĩ sự hiện diện của saponin, - Sau khi lắc mạnh và để yên ống nghiệm trong vịng 15 phút, Tuy chiều cao cột bọt giảm dần nhưng vẫn cịn bọt sau 15 phút => lá sen cĩ saponin nhưng hàm lượng rất ít nên sự duy trì bọt khơng được lâu. Hình 3.7: Cột bọt trước và sau khi để yên 15 phút 59
  63. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Định tính các hợp chất khử Hình 3.8: Kết tủa đỏ gạch hình thành Sau khi đun ống nghiệm trong khoảng thời gian 8 phút, dung dịch trong ống nghiệm đã chuyển từ màu xanh rêu sang màu vàng nâu cĩ xuất hiện kết tủa Cu2O (màu đỏ gạch) dưới đáy ống nghiệm. Sự cĩ mặt của các hợp chất khử mà chủ yếu là đường khử, trong mơi trường kiềm NaOH đã khử Cu (II) về Cu (I) oxid, cĩ màu đỏ gạch đặc trưng => cĩ mặt các hợp chất khử trong dịch chiết. Định tính tannin Hình 3.9: Sự đổi màu của dịch chiết Sau khi bổ sung vào ống nghiệm 2-3 giọt FeCl3, dung dịch đục dần và chuyển từ màu xanh lục qua màu nâu, Cĩ thể giải thích hiện tượng bằng sự tạo thành hợp chất Fe(OH)3 (màu nâu đỏ) trong ống nghiệm, làm cho dung dịch bị đục và xuất hiện màu đặc trưng => cĩ mặt các phenolics trong dung dịch. 60
  64. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa học của lá sen được trình bày trong bảng 3.3 Bảng 3.3: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa học của lá sen Kết quả Nhĩm hợp chất Thuốc thử và cách thực hiện Lá trưởng Lá non thành Flavonoid NH4OH đậm đặc ++ +++ Polyphenol FeCl3 +++ ++ Alkaloid Các thuốc thử chung của +++ ++ alkaloid Saponin Tạo bọt bền + + Acid hữu cơ Na2CO3 + + Tinh dầu Bốc hơi tới cắn ++ + Các thành phần Thuốc thử Fehling +++ ++ khử Ghi chú: (-): Khơng cĩ; (±): Nghi ngờ, (+): Cĩ ít, (++): Cĩ, (+++): Cĩ nhiều Kết quả cho thấy lá sen cĩ nhiều các nhĩm hoạt chất flavonoid, alkaloid , tannin; cĩ ít acid hữu cơ; cĩ carotenoid, tinh dầu Đây là những chất cĩ tiềm năng chống oxy hĩa mạnh. 3.5. Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết Xây dựng đường chuẩn Acid Gallic - Acid Gallic là chất chuẩn được sử dụng để tính tốn hàm lượng polyphenol tồng số. - Sau khi ủ ở nhiệt độ 400C, dung dịch cĩ màu xanh lam và được đo độ hấp thu ánh sáng tại bước sĩng λ=765 nm. 61
  65. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình: 3.10: Dung dịch dựng đường chuẩn Acid Gallic Bảng: 3.4 Kết quả đường chuẩn Acid Gallic Nồng độ 1 2 3 4 5 AG (µg/l) OD765nm 0,126 0,215 0,297 0,393 0,483 Hình 3.11: Đường chuẩn Acid Gallic 62
  66. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Từ đường chuẩn trên, ta tính được hàm lượng polyphenol tổng số tại các nồng độ cồn khác nhau, Hàm lượng polyphenol tổng số được tính cho tổng thể tích dịch chiết thu được sau quá trình chiết. Bảng 3.5: Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số Nồng độ Nồng độ Polyphenol tổng lá sen già Polyphenol tổng lá sen non cồn TN mẫu TN (mg GE/g dược liệu) (mg GE/g dược liệu) (0) (mg/ml) 60 273,08d ± 22,29 252,94c ± 3,99 70 300,73c ± 11,12 322,04a ± 3,77 80 0,5 304,42b ± 12,12 293,63b ± 11,14 90 264,45e ± 23,56 132,86d ± 5,89 96 335,47a ± 4,06 98,5e ± 2,94 Nhận xét - Lá sen trưởng thành cĩ hàm lượng polyphenol tổng số tăng dần theo nồng độ cồn từ 60%, 70%, 80%; tại nồng độ cồn 90%, cĩ sự giảm nhẹ tuy nhiên ở nồng độ 96%C thì lượng polyphenol tổng số đạt cao nhất. Nhìn chung, cồn 960 cho hiệu suất chiết polyphenol tốt nhất, và hàm lượng polyphenol tổng số tăng dần theo nồng độ dung mơi. - Lá sen non cĩ hàm lượng phenolics tăng dần từ 60% đến 70% và cao nhất ở nồng độ cồn 70%, giảm dần từ nồng độ cồn trở về sau. Cĩ thể giải thích vì lá sen non các polyphenol khá phân cực nên tại nồng độ cồn 60% và 70%, hàm lượng polyphenol tổng tăng dần. Tuy nhiên giảm dần về sau vì độ phân cực của dung mơi ngày càng giảm nên các polyphenol khơng được hịa tan tiếp tục. - Khi lá sen càng trưởng thành thì sẽ cĩ sự polymer hĩa hoặc biến đổi các nhĩm gắn trên vịng benzene, nhĩm OH- bị thay đổi bởi các gốc –CH3 hay nhĩm acyl làm giảm dần tính phân cực của các polyphenol. Điều đĩ giải thích tại sao tại lá sen già thì cồn 96% cho kết quả chiết polyphenol tốt nhất cịn ở lá sen non thì ethanol 70% cĩ phần tốt hơn - Polyphenol là một trong những thành phần quan trọng nhất và chiếm tỉ lệ lớn trong thực vật nĩi chung. Đây là chất chống oxi hĩa mạnh, Vì vậy, chỉ tiêu này khá quan trọng trong nghiên cứu hoạt tính chống oxi hĩa của thực vật. 63
  67. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số của lá sen đạt cao nhất khi thực hiện chiết ở lá sen trưởng thành, đạt 335,47mg GE/g chất khơ (db), Kết quả này so với hàm lượng polyphenol lá sen được cơng bố trên Tạp chí DD&TP/Journal of Food and Nutrition Sciences - Tập 8 - số 1 - Tháng 3 năm 2012/ Vol 8, No 1 - March 2012, trong cùng điều kiện thí nghiệm cĩ phần lớn hơn. Theo như nghiên cứu của tạp chí này thì hàm lượng polyphenol tổng số lá sen chỉ đạt 288,4mg GE/g. - Theo Marja et al. (1999), những lồi thực vật cĩ hàm lượng polyphenol tổng số lớn hơn 20mg GE/db thì cĩ hoạt tính chống oxy hĩa mạnh.Như vậy hàm lượng polyphenol tổng số của lá sen trưởng thành hay lá sen non đều cao hơn giá trị 20mg GE/db trên nên lá sen cơ bản cĩ hoạt tính chống oxy hĩa mạnh. - Việc sử dụng dung mơi thích hợp cũng ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng số thu được, Theo như kết quả thể hiện trên bảng 3.5, thì hàm lượng polyphenol tổng số thu được cao nhất khi chiết lá sen trưởng thành bằng ethanol 96%. Nên dịch chiết lá sen trong cồn 96% được sử dụng cho việc thừ nghiệm hoạt tính kháng oxy hĩa trên mơ hình DPPH, vì hàm lượng polyphenol cĩ mối liên quan chặt chẽ với hoạt tính chống oxy hĩa. 3.6. Định lượng Flavonoid tổng số Xây dựng đường chuẩn Rutin - Dung dịch Rutin chuẩn ban đầu được pha lỗng thành các nơng độ thích hợp, cho phản ứng với AlCl3, phản ứng cho hỗn hợp màu vàng từ nhạt đến đậm, so màu ở bước sĩng λ= 420nm. - Độ đậm nhạt của dịch màu tùy thuộc nồng độ Rutin. 64
  68. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.12: Dung dịch Rutin chuẩn Bảng 3.6: Bảng kết quả đường chuẩn Rutin Nồng độ 0,0625 0,125 0,25 0,375 0,5 Rutin (mg/ml) OD420nm 0,053 0,151 0,283 0,401 0,526 Hình 3.13: Đường chuẩn Rutin 65
  69. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Mẫu thí nghiệm được pha lỗng thành nồng độ 0,25mg/ml và cho phản ứng với dung dịch AlCl3, Từ phương trình đường chuẩn Rutin, ta tiến hành tính tốn hàm lượng Flavonoid tổng số (mg RE/g dược liệu khơ), Hình 3.14: Mẫu lá sen phản ứng AlCl3 Bảng: 3.7: Kết quả hàm lượng Flavonoid tổng số Flavonoid tổng Nồng độ mẫu Flavonoid tổng lá sen Nồng độ cồn TN lá sen non TN trưởng thành (%) (mg RE/g dược (mg/ml) (mg RE/g dược liệu) liệu) 60 140,53c ± 0,41 149,77d ± 3,27 70 145,10b ± 1,2 205,23a ± 3,72 80 159,39a ± 2,25 189,13b ± 1,74 0,25 90 128,81d ± 1,81 150,05c ± 1,62 96 102,83e ± 4,02 111,52e ± 0,25 - Các flavonoid là nhĩm hợp chất cĩ khả năng kháng oxy hố nổi bật nhất trong số các hợp chất phenolic thực vật. - Đối với 2 loại lá sen, cồn 70% cho hiệu quả chiết flavonoid tốt nhất. Lượng flavonoid tổng tăng dần từ nồng độ cồn 60% đến 70%, Cĩ thể giải thích điều này dựa trên tính phân cực của thành phần flavonoid trong lá sen. Các flavonoid cĩ độ phân cực mạnh nên khi ngâm trong dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần thì khả năng hịa tan của các flavonoid vào trong dung mơi sẽ tăng dần và đạt cực đại khi trích bằng cồn 70% (205,23 mg RE/g db). Càng về sau độ phân cực của dung mơi càng kém nên flavonoid tổng giảm dần. - So sánh với kết quả nghiên cứu Ju-Hui Choe , Aera Jang được đăng trên tạp chí Food Sci.Biotechnol (2010) đạt 69,5 mg KE/g db, thì lượng flavonoid tổng số cĩ phần tương đương, do Rutin là chất chuẩn hoạt tính kém hơn Kaempferol nên kết quả cĩ sự sai khác với nhau. 66
  70. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Polyphenol và Flavonoid cùng tồn tại trong cùng một đối tượng nghiên cứu. và tỉ số TFC/TPC quyết định hoạt tính kháng oxy hĩa của đối tượng nghiên cứu. Tỉ số này càng cao thì khả năng kháng oxy hĩa càng mạnh - Tùy theo mục đích chiết, sử dụng mà ta cĩ thể lựa chọn đối tượng thí nghiệm sao cho phù hợp. Cụ thể, nếu muốn chiết polyphenol cĩ độ phân cực kém, ta chọn lá sen to và chiết bằng ethanol 96%, Tuy nhiên, để thu nhận các flavonoid cĩ độ phân cực cao thì ta sử dụng lá sen non làm đối tượng nghiên cứu và chiết tốt nhất trong ethanol 70%. 3.7. Định lượng alkaloid tổng số Hàm lượng alkaloid tồn phần được xác định bằng phương pháp cân và tính tốn dựa trên cơng thức đã nêu trong mục 2.5. Kết quả được trình bày dưới bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết quả hàm lượng alkaloid tồn phần Đối tượng Lá sen trưởng thành Lá sen non Alkaloid tồn phần (%) 4,96 ± 0,006 3,08 ± 0,03 Kết quả trên cho ta thấy, lá sen trưởng thành cĩ hàm lượng % alkaloid tồn phần là 4,96% cao hơn so với hàm lượng % alkaloid tồn phần trong lá sen non là 3,08%. So sánh với kết quả nghiên cứu được đăng trên Tạp chí dược liệu ISSN 0868 – 3859 tập 6, theo tạp chí này hàm lượng % alkaloid tồn phần của lá sen trưởng thành thu hái ở huyện Đơng Anh, Hà Nội là 2,15% và hàm lượng % alkaloid tồn phần trong lá sen non đạt 2%., ta thấy cĩ sự khác biệt rõ rệt. Điều này cho thấy, hàm lượng % alkaloid tồn phần phụ thuộc vào địa điểm thu mẫu, thời vụ thu hái, tuổi lá, phương pháp tách chiết và cách bảo quản nguyên liệu trong quá trình thí nghiệm. Alkaloid là một trong những thành phần cĩ tác dụng dược lý rất tốt ở lá sen. Alkaloid tác động lên hệ thần kinh, cĩ thể giúp kéo dài giấc ngủ, làm giảm nhịp tim và hạ huyết áp, chống lão hĩa. Một nghiên cứu trên mơ hình in vivo cho thấy, Nuciferine trong dịch chiết lá sen cĩ khả năng ngăn ngừa việc thối hố và gây tổn thương gan trong chế độ ăn nhiều lipid (Guo F & et.al, 2013). Việc tinh chế thành phần alkaloid trong sen, tạo ra các loại thuốc làm giảm huyết áp (thuốc senin) đã chứng tỏ được 67
  71. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP dược tính sinh học của lá sen rất hữu ích cho việc hỗ trợ điều trị các căn bệnh thời đại: tim mạch, béo phì, cao huyết áp 3.8. Xác định năng lực khử Năng lực khử là một trong những phép phân tích nhằm đánh giá khả năng kháng oxy hĩa in vitro.Kết quả xác định năng lực khử của dịch chiết lá sen được thể hiện trong bảng 3.9 Bảng 3.9: Năng lực khử của dịch chiết ethanol tối ưu. Nồng độ Độ hấp thu (mg/ml) Acid Gallic Lá sen trưởng thành Lá sen non 0,001 0,183 ± 0,003 0,132 ± 0,00 0,047 ± 0,002 0,002 0,199 ± 0,003 0,14 ± 0,001 0,063 ± 0,003 0,003 0,213 ± 0,012 0,142 ± 0,001 0,068 ± 0,002 0,004 0,242 ± 0,004 0,158 ± 0,002 0,075 ± 0,003 0,005 0,294 ± 0,008 0,163 ± 0,002 0,089 ± 0,002 Hình 3.15: Đồ thị năng lực khử của dịch chiết Trong khảo sát năng lực khử dịch chiết, sự cĩ mặt của các chất chống oxy hĩa đã khử Fe3+ về Fe2+, làm dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu xanh lục, và được đo độ hấp thụ tại λ=700 nm, Độ hấp thụ càng tăng cho thấy năng lực khử càng mạnh. Hình 3.20: cho thấy đường cong cường độ hấp thụ ánh sáng của chất chuẩn và dịch 68
  72. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP chiết, tỉ lệ thuận với nồng độ dung dịch. Độ hấp thu ánh sáng của dung dịch tăng dần từ 1ppm-5ppm. Tại nồng độ 1ppm, giá trị hấp thu của AG, lá sen trưởng thành, lá sen non lần lượt là 0,183 ± 0,003, 0,132 và 0,047 ± 0,002. Theo như kết quả nghiên cứu của Ju-Hui Choe và cộng sự (2010) được đăng trên tạp chí Food Sci.Biotechnol, độ hấp thu tại nồng độ 1ppm của dịch chiết lá sen trong ethanol (L/E) là 0,0199, cịn giá trị BHT chuẩn đạt được là 0,0261. So sánh với kết quả thí nghiệm của Ju-Hui Choe, nhận thấy dịch chiết lá sen trong thí nghiệm của đề tài cĩ độ hấp thu cao hơn. Cụ thể, lá sen trưởng thành cĩ độ hấp thu gấp 6,6 lần và lá sen non gấp 2,36 lần. Năng lực khử càng cao, khả năng kháng oxy hĩa càng mạnh. Hình 3.16: Sự đổi màu dung dịch do hiện tưởng khử Fe3+ 3.9. Xác định hoạt tính kháng gốc tự do DPPH - Dựng đường chuẩn Vitamin C với dung dịch DPPH cĩ các nồng độ: 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5, Từ đĩ ta xác định được % ức chế gốc tự do (%I) theo cơng thức đã nêu, Kết quả được thể hiện ở bảng 3.10 69
  73. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.10: Giá trị %I và kết quả IC50của vitamin C Nồng độ vitamin C IC50 % ức chế (%I) / 6,1 / 56,83 ± 0.78 2,4 41,23 ± 0.46 4,553 1,2 34,89 ±0.57 0,61 28,84 ±0.86 Hình 3.17: Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của vitamin C Hình 3.18: Phản ứng màu của dung dịch DPPH + Vitamin C 70
  74. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Mẫu thí nghiệm được pha lỗng với các nồng độ : 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 (mg/ml) và cho phản ứng vs dung dịch DPPH. Hình 3.19 Phản ứng của dịch mẫu + DPPH Kết quả OD của mẫu lá sen trưởng thành được trích bằng cồn 96% và phần trăm ức chế gốc tự do được biểu thị trong bảng 3.12 Bảng 3.11: Giá trị %I và IC50 của mẫu lá sen trưởng thành chiết bằng ethanol 96% IC ( /ml) NĐ mẫu ( /ml) % ức chế (%I) 50 6,1 73,74 ± 1,92 2,4 45,72 ± 3,42 2,907 1,2 40,26 ± 0.9 0,61 30,4 ± 0.5 71
  75. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP %I 100 90 y = 4.7932x + 31.299 80 R² = 0.9856 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 / Hình 3.20: Biểu đồ %I của mẫu lá sen trường thành cồn 96% Kết quả OD của mẫu lá sen non được trích bằng cồn 70% và phần trăm ức chế gốc tự do được biểu thị trong bảng 3.12 Bảng 3.12: Giá trị %I và IC50 của lá sen non chiết bằng ethanol 70% IC ( /ml) NĐ mẫu ( /ml) % ức chế (%I) 50 6,1 27,42 ± 0.54 13,59 2,4 14,75 ± 0.43 1,2 12,1 ± 0.46 0,61 10,97 ± 0.85 % I 45 y = 2.3657x + 9.6495 40 R² = 0.9911 35 30 25 20 15 10 5 Nồng độ mẫu 0 ( 0 5 10 15 / ) Hình 3.21: Biểu đồ % I theo của mẫu lá sen non ethanol 70% 72
  76. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.27: Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của 2 đối tượng lá sen và vitamin C Nhận xét: Hoạt tính loại gốc tự do DPPH được sử dụng rộng rãi để sàng lọc hoạt tính chống oxy hĩa của các hợp chất tự nhiên từ thực vật và vi khuẩn.Hiệu quả loại gốc tự do của dich chiết cồn 96% của lá sen trưởng thành và dịch chiết cồn 70% lá sen non trong thử nghiệm loại gốc DPPH được trình bày ở bảng 3.11 và hình 3.12.Kết quả cho thấy hoạt tính loại gốc tự do ở nồng độ 0,5mg/ml của lá sen trưởng thành rất mạnh cĩ khả năng loại gốc tự do trên 88%. Do đĩ các dịch chiết lá này được xác định IC50 với vitamin C là chuẩn đối chứng. Để xác định chỉ số IC50, mỗi cao chiết được pha thành 6 nồng độ: 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,05 mg/ml và 0,025 mg/ml tương ứng với các nồng độ cuối của mẫu trong hỗn hợp phản ứng là 12,2 /ml; 6,1 /ml; 2,4 /ml; 1,2 /ml; 0,61 /ml, Sau đĩ hoạt tính ức chế DPPH ở mỗi nồng độ được xác định. Kết quả xác định IC50 của các dịch chiết so với vitamin C được trình bày ở hình 3.10. Theo đĩ, giá trị IC50 của dịch chiết cồn 96% lá sen trưởng thành là 2,907 µg/ml, dịch chiết cồn 70% của lá sen non IC50 = 13,59 /ml cĩ sự khác biệt đáng kể về hoạt tính chống oxy hĩa của Vitamin C (IC50= 4,932 /ml). Từ kết quả trên cho thấy, dịch chiết lá sen cĩ khả năng bắt giữ các gốc tự do tốt đặc biệt là dịch chiết lá sen cồn 96% cĩ khả năng kháng các gốc tự do DPPH cao hơn 73
  77. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP cả vitamin C trong cùng điều kiện thí nghiệm, thể hiện rõ nhất qua chỉ số IC50 của 2 loại dịch chiết. 3.10. Kết quả phân tích TPHH của dịch chiết lá sen bằng HPLC-ESI/MS Những thành phần alkaloid và flavonoid phong phú của dịch chiết cồn từ lá sen trưởng thành đã được xác định bằng HPLC-ESI/MS, Thiết bị phân tích TOF-Time of Fly cho phép độ đúng Mass ± 0,005 Da. Sắc ký đồ HPLC-MS của dịch chiết cồn lá sen được trình bày trong Bảng 3.13 và Hình 3.28. Bảng 3.13: Kết quả phân tích TPHH của dịch chiết cồn từ lá sen MS lý Rt Cơng thức MS thực tế Mũi thuyết Đơn vị Định danh (phút) phân tử (m/z) (m/z) (Dalton) 1 4,1 C15H10O7 325,0319 325,0357 Da Quercetine 3 5,7 C16H17NO3 272,1281 272,1298 Da Demethylcorlaurin 4 6,5 C15H14O6 291,0863 291,0869 Da Catechin 7 9,2 C19H23NO3 314,1751 314,1738 Da Armepavine 10 18,5 C18H19NO2 282,1489 282,1489 Da O-Nornuciferine 15 23,3 C19H21NO2 296,1645 296,1656 Da Nuciferine 16 23,8 C18H17NO2 280,1332 280,1338 Da Roemerine 18 24,9 C17H15NO2 266,1175 266,1187 Da Anonaine 19 25,6 C19H21NO3 325,0319 325,0357 Da Pronuciferine 74
  78. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.28: Sắc ký đồ HPLC-ESI/MS của dịch chiết cồn 96% từ lá sen Những hợp chất đã phát hiện nằm trong khoảng thời gian Rt từ 4,1 phút và 6,5 phút gồm quercetine, demethylcorlaurin và catechin. [28] [31]. Ngồi ra, những hợp chất vừa được xác định này cũng đã được tìm thấy trong gương sen và hạt sen trong các nghiên cứu trước đĩ [26]. Mũi thứ 7 ở thời điểm Rt 9,2 phút với chế độ ion dương [M-H]+ xác định được m/z 314,1738 so sánh với dữ liệu kết luận được thành phần này chính là Armepavine. [28]. Mũi thứ 10 ở thời điểm Rt 18,5 phút với chế độ ion dương [M-H]+ xác định được m/z 282,1491, so sánh với ngân hàng dữ liệu khối phổ MS kết luận được thành phần này chính là O-Nuceferine[29]. Mũi thứ 15 cho thấy chúng chiếm thành phần chính của mẫu dịch chiết, với chế độ ion dương [M-H]+ xác định được m/z 296,1656, so sánh với dữ liệu kết luận được thành phần này là Nuciferine [19] [29]. Mũi thứ 16 ở thời điểm Rt 23,8 phút với chế độ ion dương [M-H]+ xác định được m/z 280,1338, so sánh với dữ liệu kết luận được thành phần này chính là Roemerine [22]. 75
  79. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Mũi thứ 18 ở thời điểm Rt 24,9 phút với chế độ ion dương [M-H]+ xác định được m/z 266,1187, so sánh với dữ liệu kết luận được thành phần này chính là Anonaine [22] [14]. Mũi thứ 19 ở thời điểm Rt 25,6 phút với chế độ ion dương [M-H]+ xác định được m/z 312,1575, so sánh với dữ liệu kết luận được thành phần này chính là Pronuciferine. [27] Tuy đã xác định cĩ những mũi ở những thời điểm khác nhưng khơng cĩ dữ liệu khối phổ MS tương tự để xác định, Do đĩ những chất ở thời điểm Rt khác các mũi ở trên đều khơng được định danh. 76
  80. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 77
  81. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua thời gian thực hiện đề tài, kết quả nghiên cứu thu được như sau: - Vi phẫu cấu trúc của lá và bột dược liệu Sen (Nelubo nucifera) cĩ đặc điểm: Lá: biểu bì trên tế bào hình chữ nhật, cĩ núm lồi. Biểu bì dưới cĩ vách hĩa cutin dày, vách tế bào hình uốn lượn. Mơ mềm khuyết tế bào cĩ nhiều tinh thể calci oxalate. Bĩ libe xếp lộn xộn, kích thước nhỏ nằm rải rác trong mơ mềm Bột lá sen: Bột màu xanh, mịn, vị chát. Mảnh biểu bì trên tế bào hình đa giác, cĩ núm lồi . Mảnh biểu bì dưới tế bào vách uốn lượn. Sợi vách dày, khoang rộng. Tinh thể calci oxalat cầu gai kích thước lớn, đường kính 25-30 µm. Mảnh mạch vạch - Xác định được nồng độ dung mơi thích hợp cho việc tách chiết các hợp chất cĩ dược tính từ lá sen (polyphenol, flavonoid, alkaloid) là ethanol 96% đối với lá sen trưởng thành và ethanol 70% đối với lá sen non. - Xác định được hàm lượng cao thu được cao nhất của lá sen trưởng thành là 7,62%, của lá sen non là 7,8%, khi trích ly bằng ethanol 70% - Xác định được hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết ethanol 96% của lá sen trưởng thành là 335,47 mg GE/db và hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết ethanol 70% là 322,04 mg GE/db đối với lá sen non. - Đã xác định được hàm lượng Flavonoid tổng số trong dịch chiết lá sen trưởng thành và lá sen non. - Đánh giá được khả năng kháng oxy hĩa của dịch chiết lá sen trên 2 mơ hình cho thấy khả năng chống oxy hĩa của lá sen trưởng thành cĩ hoạt tính khá mạnh: Trên mơ hình DPPH thì dịch chiết cồn lá sen trường thành cĩ hoạt tính cao hơn chất chuẩn vitamin C( giá trị IC50 trên lá sen trưởng thành là 2,907, lá sen non là 13,59, IC50 của vitamin C là 4,553). Trên mơ hình đo năng lực khử, năng lực khử của lá sen trưởng thành thấp hơn khoảng 1,38 lần so với chất chuẩn acid gallic. 78
  82. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Xác định các thành phần hĩa học của dịch chiết lá trưởng thành, bằng phương pháp sắc ký LC-MS/ESI. Qua sắc ký đồ cho thấy, Nuciferine là thành phần chiếm số lượng nhiều nhất trong mẫu (mũi 15). Nuciferin cĩ tác dụng làm giảm nhịp tim [10]. Việc xác định hàm lượng cao Nuciferine trong lá sen, mở ra một hướng ứng dụng mới trong việc điều chế các sản phẩm giúp phịng và điều trị các chứng bệnh do nhịp tim tăng nhanh: ngất xỉu, ngưng tim, đột quỵ, suy tim. Bên cạnh đĩ Nuciferine cịn cĩ tác dụng giảm lipid và hạn chế sự tổn thương gan do cholesterol gây ra, nên cĩ thể dùng lá sen để hỗ trợ điều trị béo phì, mỡ máu 4.2. Kiến nghị Do giới hạn về mặt thời gian, điều kiện trang thiết bị cũng như điều kiện kinh tế nên thí nghiệm vẫn chưa hồn chỉnh. Đề hồn thiện đề tài, người thực hiện đề tài cĩ một số kiến nghị như sau: - Cần tìm ra phương pháp làm tăng hiệu suất trích ly: hỗ trợ vi sĩng, kết hợp trích ly gián đoạn và trích ly liên tục. - Nghiên cứu thêm về khả năng kháng khuẩn và các tác dụng khác của các chất cĩ trong polyphenol, flavonoid lá sen - Thiết lập được quy trình tạo 1 sản phẩm từ lá sen hoặc cao polyphenol hoặc 1 sản phẩm cĩ bổ sung cao polyphenol Ý nghĩa khoa học: - Xác định thành phần hĩa học , định lượng polypohenol tổng, hàm lượng alkaloid, flavonoid tổng số, đánh giá khả năng kháng oxy hĩa trên cùng một loại nguyên liệu mà chưa cĩ một nghiên cứu nào trước đây - So sánh hoạt tính kháng oxy hĩa và đo năng lực khử của lá sen non và lá sen trưởng thành Ý nghĩa thực tiễn Ứng dụng trong viêc tạo sản phẩm trà túi lọc lá sen, viên nang chức năng để điều trị các bệnh: tim mạch, béo phì, lão hĩa 79