›

Đồ án Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB

pdf 117 trang thiennha21 13/04/2022 3030
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_hoan_thien_quy_trinh_san_xuat_che_pham_diet_sau_tu_dic.pdf

Nội dung text: Đồ án Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN Serratia marcescens HB Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực hiện : HỒ TRUNG LỘC MSSV: 1411100591 Lớp: 14DSH03 TP. Hồ Chí Minh, năm 2018
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN Serratia marcescens HB Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực hiện : HỒ TRUNG LỘC MSSV: 1411100591 Lớp: 14DSH03 TP. Hồ Chí Minh, năm 2018
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoài Hƣơng (Giảng viên Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM). Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp của mình. TP.HCM, ngày 27 tháng 7 năm 2018 Sinh viên thực hiện HỒ TRUNG LỘC
  4. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã nuôi nấng dạy dỗ con trong 22 năm qua, ngƣời đã cùng con trải qua biết bao nhiêu khó khăn trong cuộc sống và luôn quan tâm con, chăm sóc con, luôn bên cạnh con lúc khó khăn nhất. Con xin cảm ơn gia đình ông bà nội ngoại. Đặc biệt là bà nội, bà ngoại, ba, cô bảy và cậu mợ mƣời trong suốt những năm qua đã tạo điều kiện thuận lợi tốt nhất để con đƣợc bƣớc vào giảng đƣờng đại học với tâm thế thoải mái. Em xin cảm ơn quý thấy cô trong Viện Khoa học Ứng Dụng HUTECH và những thầy cô giảng viên của trƣờng đã tận tâm dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời thầy đầy nhiệt huyết, luôn định hƣớng và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn em xuyên suốt quá trình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai, ngƣời đã cho em lời khuyên trong quá trình nuôi sâu khoang thí nghiệm và cung cấp trứng sâu cho em. Em xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Minh Nhựt, chị Huỳnh Ngọc Nhi đã cho em vật liệu thử nghiệm để em tiến hành các thí nghiệm khảo sát. Em xin chân thành biết ơn anh Trƣơng Hoài Nguyên, anh Nguyễn Phƣớc Sinh, anh Phạm Hoàng Nhân, chị Cao Thị Thanh Thúy đã truyền đạt cho em những kinh nghiệm, lời khuyên bổ ích trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Và em xin cảm ơn tất cả các bạn đồng nghiệp Lê Đình Nhân, Nguyễn Mộng Trâm, Đặng Thị Kim Tuyền, Đào Đặng Phƣơng Dung, Đinh Ngọc Phƣơng Trinh, Võ Lan Hƣơng, Võ Thành Lâm cùng hai em Võ Đình Chiến và Nguyễn Đăng Thùy Dƣơng đã đồng hành giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2018 HỒ TRUNG LỘC
  5. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC CÁC BẢNG i MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu: 1 3. Nhiệm vụ nghiên cứu: 1 4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2 5. Kết quả cần đạt đƣợc 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 3 1.1.1. Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học 3 1.1.2. Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trƣờng hiện nay. 3 1.1.3. Những ƣu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học 4 1.2. Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 5 1.2.1. Lịch sử phát hiện 5 1.2.2. Phân loại 6 1.2.3. Đặc điểm của Serratia marcescens 6 1.2.3 .Đặc điểm sinh lí 7
  6. Đồ án tốt nghiệp 1.2.4. Đặc điểm sinh hóa 7 1.2.5. Đặc điểm phân bố 9 1.3. Giới thiệu về Prodigiosin 10 1.3.1 Khái niệm vê Prodigiosin 10 1.3.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin 10 1.3.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin 13 1.3.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens 13 1.4. Enzyme 17 1.5.Yếu tố độc lực của Serratia marcescens 17 1.6. Khả năng diệt sâu của vi khuẩn Serratia marcescens 18 1.7. Một số nghiên cứu trên thế giới 20 1.7.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens 20 1.7.2. Tình hình nghiên cứu Prodigiosin 21 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu 22 2.1.1. Thời gian 22 2.1.2. Địa điểm 22 2.2. Vật liệu, hóa chất, thiết bị 22 2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens 22 2.2.2. Nguồn nấm 22 2.2.3. Nguồn sâu khoang Spodoptera litura 22 2.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất 22 2.2.5. Dụng cụ, thiết bị 23 ii
  7. Đồ án tốt nghiệp 2.3. Mục tiêu nghiên cứu 24 2.4. Nội dung nghiên cứu 24 2.5. Phƣơng pháp thí nghiệm 24 2.5.1. Phƣơng pháp luận 24 2.5.2. Bố trí thí nghiệm 27 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu bố trí thí nghiệm 29 2.6.1. Phƣơng pháp chọn lọc chủng seratia marcescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào Protease mạnh nhất. 30 2.6.1.1. Phƣơng pháp định tính enzyme 30 2.6.1.2. Phƣơng pháp trích ly thu Prodigiosin 31 2.6.2. Khảo sát phƣơng pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu quả 33 2.6.2.1. Phƣơng pháp xử lý tế bào bằng acid. 33 2.6.2.2. Phƣơng pháp xử lý nhiệt 33 2.6.2.3. Phƣơng pháp xử lý tế bào bằng Formalin 34 2.6.3. Phƣơng pháp định tính enzyme của dịch nuôi cấy sau khi xử lý tế bào 34 2.6.4. Phƣơng pháp khảo sát sự ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiêu lực diệt sâu của chế phẩm ở các công thức phụ gia 37 2.6.4.1 Tỷ lệ các chất phụ gia trong chế phẩm 37 2.6.4.2. Khảo sát hiệu lực diệt sâu khoang bằng phƣơng pháp quét lá 38 2.6.6. Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng nấm 40 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 iii
  8. Đồ án tốt nghiệp 3.1.Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và prodigiosin cao nhất. 43 3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào. 43 3.1.2. Trích ly thu prodigiosin 45 3.1.3. So sánh hình thái của chủng SH1 và HB. 47 3.2. Kết quả khảo sát phƣơng pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu quả nhất. 50 3.2.1. Phƣơng pháp xử lý acid 51 3.2.2. Phƣơng pháp xử lý nhiệt 52 3.2.3. Phƣơng pháp xử lý tiêu diệt tế bào bằng dung dịch Formalin. 54 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào của dịch nuôi cấy Serratia marcescens HB sau khi xử lý tế bào. 57 3.3.1. Thử nghiệm hoạt tính protease 57 3.3.2. Thử nghiệm hoạt tính Chitinase 57 3.5. Khả năng ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở các nồng độ phụ gia 59 3.6. Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm có lợi 62 3.8. Quy trình sản xuất chế phẩm chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB. 64 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 4.1. Kết luận 66 4.2. Kiến nghị 66 Tài liệu tiếng Việt 67 iv
  9. Đồ án tốt nghiệp Tài liệu nƣớc ngoài 68 PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG 72 PHỤ LỤC B. HÌNH ẢNH 75 PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ 82 PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ 84 v
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EPN : Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (viết tắt tên tiếng Anh: Entomopathogenic nematodes). H-CP16 : Heterorhabditis indica CP16 A.nauplii : Artemia nauplii S.marcescens: Serratia marcescens. SH1 : Serratia marcescens SH1 SH4 : Serratia marcescens SH4 SH5 : Serratia marcescens SH5 SB :Serratia marcescens SB HB :Serratia marcescens HB PG :Môi trƣờng Peptone glycerol PGA :Môi trƣờng Peptone glycerol agar CMC :Carboxymethyl cellulose vi
  11. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011 Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens Hình 1.3 Các chất đại diện Prodigiosin (Fursttner, 2003) Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp Prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp Undercylprodigiosin (cụm màu đỏ từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp Prodigiosin Hình 1.6 Cơ chế gây bệnh của enzyme serralysin metallprotease của S. marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishi et al; 2014) Hình 2.1 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật phù hợp Hình 2.2 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học khả năng diệt sâu và độc tính của chế phẩm Hình 2.3 Quy trình thử nghiệm khảo sát chọn ra phƣơng pháp tiêu diệt tế bào tối ƣu. Hình 2.4 Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men các chủng vi khuẩn Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch gelatin agar Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch Tween 80 agar Hình 2.7 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch chitin agar Hình 2.8 Bố trí nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA Hình 3.1 Khả năng tiết enzyme Protease của 5 chủng Serratia marcescens SH1, SH4, SH5, SB, HB tƣơng ứng với các ký hiệu A, B, C, D, E. Hình 3.2 Khả năng tiết enzyme chitinase của chủng SB và HB. vii
  12. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện giá trị OD hiệu chỉnh của 5 chủng SH1, SH4, SH5, SB, HB. Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc và hình thái nhuộm Gram của hai chủng SH1 và HB Hình 3.5 Kết quả quét phổ hấp thu dịch lên men hai chủng Serratia marcescens SH1 và HB Hình 3.6 Kết quả quét phổ sau trích ly bằng hệ dung môi Ethanol:HCl (95:5,v:v) của chủng SH1 Hình 3.7 Kết quả quét phổ sau trích ly bằng hệ dung môi Ethanol:HCl (95:5,v:v) của chủng HB. Hình 3.8 Khuẩn lạc Serratia marcescens xuất hiện trên thạch PGA ở đĩa đối chứng (A) và đĩa khảo sát (B) sau 48 giờ ủ. Hình 3.9 Kết quả sau khi ria lại trên thạch PGA sau 24 giờ ủ ở hai nghiệm thức 1000C (A) và 650C (B). Hình 3.10 Kết quả sau khi cấy ria dịch canh trƣờng Serratia marcescens HB đã xử lý Formalin ở các nồng độ. Hình 3.11 Hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura của chế phẩm với các nồng độ phụ gia theo thời gian theo công thức Abbott (1925). Hình 3.12 Sâu khoang chết sau khi thử nghiệm chế phẩm. Hình 3.13 Sơ đồ sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB đã xử lý tế bào. viii
  13. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens. Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973). Bảng 1.3 Tóm tắt những nghiên cứu liên quan đến chế phẩm diệt sâu từ Serratia marcescens đã thực hiện. Bảng 2.1 Bảng bố trí các nghiệm thức các nồng độ phụ gia. Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescen SH1, SH4, SH5, SB và HB. Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm), OD535nm sau khi trích ly sắc tố của các chủng SH1, SH4, SH5, SB, HB. Bảng 3.3 Bảng so sánh lƣợng prodigiosin còn lại sau quá trình xử lý tế bào ở các giá trị nồng độ Formalin . Bảng 3.4 Các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng lên men sau xử lí Formalin 0,5%. Bảng 3.5 Hiệu lực diệt sâu khoang tuổi 3 của chế phẩm. Bảng 3.6 Tỷ lệ ức chế nấm Trichoderma sp. Bảng 3.7 Tỷ lệ ức chế nấm Paecilomyces lilacinus. ix
  14. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Theo thống kê của tổ chức Lƣơng – Nông thế giới cho thấy: các loài cây trồng hiện nay phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Đây quả là một lực lƣợng hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất lớn cho mùa màng. Để giải quyết vấn đề trên, con ngƣời đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây hại.Từ đó đã ra đời nền công nghiệp thuốc trừ sâu hóa học, diệt các mầm bệnh cho cây trồng. Tuy nhiên, ngƣời nông dân đã dùng thuốc hóa học với liều lƣợng quá mức cho phép, vô tình tạo cho côn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho tình hình sâu hại trở nên nghiêm trọng và diễn biến phức tạp hơn. Những năm gần đây, việc trích ly đƣợc hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay chỉ có một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chƣa có nghiên cứu nào về ứng dụng tạo phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin hoặc đã nghiên cứu nhƣng vẫn chƣa hoàn thiện đƣợc sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học. Dựa trên cơ sở đó mà ngƣời thực hiện đề tài đã chọn hƣớng cho Đồ án tốt nghiệp là: “Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB. 2. Mục đích nghiên cứu: Hoàn thiện quy trình tạo chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcesces chứa hợp chất prodigiosin. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu: Khảo sát chọn chủng vi khuẩn Serratia marcescens thích hợp có khả năng sinh tổng hợp Prodigiosin với nồng độ cao và hoạt lực enzyme protease, chitinase mạnh 1
  15. Đồ án tốt nghiệp Khảo sát phƣơng pháp xử lý tiêu diệt tế bào vi khuẩn sau lên men thích hợp và để đảm bảo mục tiêu an toàn sinh học. Khảo sát sự ảnh hƣởng của việc phơi nắng đối với hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở các công thức phụ gia. Đƣa ra quy trình hoàn thiện để tạo chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Sử dụng công thức Abbott (1925) để tính toán hiệu lực diệt sâu. Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để phân tích ANOVA từ số liệu kết quả thu đƣợc. 5. Kết quả cần đạt đƣợc Chọn đƣợc chủng vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và nồng độ prodigiosin cao. Chọn phƣơng pháp xử lý thích hợp đối với dịch nuôi cấy sau lên men để tiêu diệt tế bào vừa đảm bảo mục tiêu an toàn sinh học vừa giữ đƣợc hoạt tính, nồng độ của hợp chất thứ cấp prodigiosin. Khảo sát đƣợc hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: hoạt lực enzyme, khả năng kháng nấm. Khảo sát khả năng ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở các nồng độ phụ gia. Chọn ra đƣợc tỷ lệ phụ gia thích hợp cho việc tạo chế phẩm. Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm sinh học trừ sâu từ dịch lên men vi khuẩn Serratia marcescens HB. 2
  16. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học là chất có khả năng kiểm soát dịch hại bằng cơ chế không độc. Thuốc trừ sâu sinh học có thể là các sinh vật sống (thiên địch) hoặc chế phẩm của chúng (hóa chất thực vật, chế phẩm vi sinh) hoặc hóa chất truyền tin đƣợc sử dụng để quản lý dịch hại cho thực vật. Thuốc trừ sâu sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng, mặc dù hầu hết các loại thuốc này thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với các công cụ khác (thuốc trừ sâu hóa học) nhƣ một phần của hoạt động quản lý dịch hại bằng phƣơng pháp sinh học. 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay 1. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox 16.000 IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các loại sâu thuộc họ Lepidoptera. 2. Chế phẩm NPV: là chế phẩm trừ sâu hoạt lực mạnh và có tính chuyên hóa cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc chuyên dung để diệt trừ sâu xanh, sâu xanh đốm trắng, sâu khoang, sâu tơ trên các loại cây rau màu, cây công nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV có nồng độ đặc hơn so với các loại thuốc khác, sử dụng tƣơng đối dễ dàng: chỉ cần hòa thuốc vào bình và phun bình thƣờng với liều lƣợng 1,0 – 1,2 kg/ha. 3. Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium anisopliae (nấm xanh) đƣợc dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa va cây ăn quả đạt 70-90%, dạng nấm trắng (Beauveria sp.) đạt 50-85%. Chế phẩm Beauveria chuyên dung để trị sâu róm thong và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%.Tiến sĩ Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại 3
  17. Đồ án tốt nghiệp thuốc này có thể sử dụng để tiêu diệt sâu róm hại thong đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”. 4. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15-20 x106 IJs trừ sâu xám hại thuốc lá, đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã đƣợc đƣa vào ứng dụng để trƣ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ hung hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hóa). 5. Chế phẩm hóa sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trƣ các loại sâu hại rau màu đạt 45-50%. 6. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây ăn quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004). 1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học Ƣu điểm: - Ít độc với ngƣời và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ đƣợc sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu), ít gây tình trạng bùng phát dịch côn trùng. - Thời gian phân hủy trong tự nhiên nhanh chóng, ít để lại dƣ lƣợng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao nhƣ các loại rau, chè - Ngoài ra, các nguyên liệu để làm thuốc trừ sâu sinh học thƣờng có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc nhƣ ớt, tỏi, hành, gừng Chi phí sản xuất khi tự làm thuốc trừ sâu sinh học thấp hơn so với thuốc trừ sâu hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho ngƣời dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao. Hạn chế: - Các thuốc vi sinh thƣờng thể hiện hiệu quả diệt sâu tƣơng đối chậm hơn so với thuốc hóa học. - Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thƣơng yêu cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn. 4
  18. Đồ án tốt nghiệp 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 1.2.1 Lịch sử phát hiện Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó, vào năm 332 trƣớc công nguyên, những ngƣời lính trong quân đội Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có “máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng. Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố nhƣ vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bóng tối và sự ẩm ƣớt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc sử dụng trong Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcescens. Tuy nhiên, điều này lại khiến nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011). Bizio, một dƣợc sĩ ở Padua (Italya) là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để ở nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo nhà vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serrati, tên loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta. Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn thấy những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn. 5
  19. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Phân loại Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serriatia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Serratia Loài: Serratia marcescens 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 400C và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) 6
  20. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc Serratia marcesens 1.2.3 Đặc điểm sinh lí Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng Nutrient agar đƣợc mô tả là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012). Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học. 1.2.4 Đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng hiếu khí và kỵ khí. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lƣợng và nhờ có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, catalase, peroxides, bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). 7
  21. Đồ án tốt nghiệp Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease, protease và hemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein. Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens STT Đặc điêm sinh hóa Kết quả 1 Di động + 2 Indole - 3 Methyl Red - 4 Voges Proskauer + 5 Citrate + 6 Dnase + 7 Catalase + 8 Oxidase - 9 Urease - 10 Gelatinase + 11 Chitinase + 12 Triple sugar iron Môi trƣờng chuyển sang acid, không sinh khí và không sinh H2S 13 Hydrogen sulphide - 14 Lysine decarboxylase + 8
  22. Đồ án tốt nghiệp 15 Ornithine + decarboxylase 16 Lên men glucose + 17 Lên men sucrose + 18 Lên men sorbitol + 19 Lên men fructose - 20 Lên men xylose - 21 Lên men rhaminose - 22 Lên men lactose - 23 Lên men arabinose - 1.2.5 Đặc điểm phân bố Trong nƣớc và đất: đã có 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sông và Serratia marcescens chiếm 75%. Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế. Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bênh tiềm năng đối với côn trùng, chúng làm côn trùng chết bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau khi xâm nhập (Francine và Patrick, 2006). Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001). Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae. 9
  23. Đồ án tốt nghiệp 1.3 Giới thiệu về Prodigiosin 1.3.1 Khái niệm vê Prodigiosin Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochlodride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI). 1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)- methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006;Williamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). 10
  24. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) Các sắc tố màu đỏ của S. marcescens đã đƣợc phân lập là đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin tổng hợp bởi S. marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một loạt các chất đều mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế alkyl khác nhau (Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thƣờng gắn trở lại để tạo thành vòng tròn hoặc macrocycles. Furstner (2003) cho rằng danh pháp truyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất cả. Đƣợc phân lập là đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan đƣợc trong nƣớc. Prodigiosin có thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether. Bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự, 2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một số bƣớc sóng nhất định và sự biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ. 11
  25. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Trọng lƣợng Loài Tên sắc tố Danh pháp Prodigiosin phân tử và công thức Serratia Prodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da marcescens methoxy-prodigiosene C20H25N3O Serratia Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da marcescens hydroxy-prodigiosene C10H23N3O Serratia Dipyrrolyldipyrromelh 2-(2-pyrryl)-4,6- 334,4 Da marcescens enr prodigiosin dimethoxypyprodigiosen C19H18N4O2 e Nocardia Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- 363,5 Da (Actinomadura) methoxyprodigiosene C23H31N3O Nocardia Cyclononylprodigiosin 2,10-Nonano-6- 265,5 Da (Actinomadura) melhoxy-prodigiosene C23H33N3O Nocardia Methylcyclode 2,10-Nonano-6- 391,5 Da (Actinomadura) cylprodigiosin Methoxy-prodigiosene C25H33N3O Streptomyces Undecyl- prodigiosin 2-Undecyl-6- 393,6 Da Longisporusr Rnethoxyprodigiosene C25H35N3 uber O Streplonlyces Metacycloprodigiosin 2,4-(9-Ethylnonano) -6- 391,6 Da longisporusr methoxyprodigiosene C25H33N3 uber O 12
  26. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loài vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA gyrase, topoisomerase IV, dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira,2009). Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng một số loài vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012). Theo nghiên cứu của Chandni và cộng sự (2012) về khả năng kháng nấm của hợp chất màu thu nhận từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens cho thấy hợp chất màu có khả năng kháng một số loài nấm men nhƣ: Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp. Prodigiosin khi đƣợc đƣa vào cơ thể sâu sẽ thấm vào tế bào và ức chế quá trình phát triển của tế bào, từ đó, dẫn đến sự từ vong của sâu Spodoptera litura (Nguyễn Hiếu Dân, 2013). Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả năng chống ung thƣ (Pandey và cộng sự 2009; Pérez – Tomás và Vi as, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự 2007). 1.3.4 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274) đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Nhiều chủng Serratia marcescens sản xuất sắc tố thông qua con đƣờng ngƣng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5- carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất 13
  27. Đồ án tốt nghiệp tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl-6- methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và Qadri, 1980). Dauenhauer và cộng sự (1984) đã phân lập đƣợc một chủng Serratia marcescens có khả năng tạo MAP và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy nhiên, không có tài liệu nào về trình tự của dòng tế bào này đƣợc báo cáo. Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm). Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000). Nhóm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốm gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mô tả ở hình 2.18. Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia 14
  28. Đồ án tốt nghiệp marcescens ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001). Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp.Tuy nhiên, có một protein còn lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích thƣớc và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno et al, 2001). Các cụm gene giữa Streptomyces coelicolor và Serratia có những vị trí tƣơng đồng. Gene quy định của các cụm màu đỏ đƣợc hiển thị trong màu đen, chịu trách nhiệm tổng hợp phân nửa bipyrrole là màu đỏ và chịu trách nhiệm tổng hợp phân nửa monopyrrole là màu xanh lam. Các gene không có chức năng tổng hợp đƣợc thể hiện qua màu trắng và những gene không nằm trong cụm gene sinh tổng hợp đƣợc thể hiện qua màu xám. Các mũi tên đen chỉ đơn vị phiên mã của các cụm màu đỏ. Cụm màu đỏ (gồm 23 gene) lớn hơn cụm pig (14 – 15 gene), có thể phản ánh sự phức tạp hơn về các sản phẩm undercylprodigiosin đƣợc tổng hợp bởi Streptomyces coelicolor (Harris và cộng sự, 2004). Tuy nhiên, prodigiosin có thể tổng hợp trong sự tái tổ hợp giữa Escherichia coli và Erwinia, điều này đòi hỏi hoạt động chức năng tƣơng ứng của Escherichia coli và enzyme Erwinia để bổ sung cho các hoạt động của enzyme đƣợc mã hóa bởi các nhóm sắc tố (Harris và cộng sự, 2004). 15
  29. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. 16
  30. Đồ án tốt nghiệp 1.4 Enzyme Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease, chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase, Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng nhƣ kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc, (Joshi và cộng sự, 1989). Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme chitinase (ChiA, ChiB, ChiC), một chitobiase và một protein chitin-binding (CBP21) (Fuchs và cộng sự, 1986; Jones và cộng sự, 1986; Sundheim và cộng sự, 1988; Harpster và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự, 1996;Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998, Suzuki và cộng sự, 1998), chúng có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 57, 52, 48, 36, và 21 kDa, cùng với các hoạt động phân giải chitin (Fuchs và cộng sự, 1986). 1.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens Yếu tố độc lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của các tác nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân gây bệnh nhập vào vật chủ, tránh sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trƣởng phát triển, gây ảnh hƣởng đến vật chủ, mà phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (Weiss và Hewlett, 1986). Một số yếu tố độc lực của Serratia marcescens đã đƣợc nghiên cứu, bao gồm sự bám dính, tính kị nƣớc, mannose - resistant, mannose - sensitive, LipoPolySaccharide (LPS). Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính. Các yếu tố bám dính của vi sinh vật có bản chất là polypeptide hoặc polysaccharide. Serratia marcescens thuộc loại vi khuẩn Gram âm, có khuẩn mao nên yếu tố bám dínhla Polypeptide. Bên cạnh đó, LPS hay còn đƣợc gọi là Lipoglycan Saccharide, là các phân tử lớn lƣỡng tính nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và 17
  31. Đồ án tốt nghiệp polysaccharide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS đƣợc coi nhƣ nội độc tố, bảo vệ màng tế bào khỏi các tác động từ bên ngoài. Cấu tạo của LPS gồm 3 phần: O – antigen, lõi oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là thành phần gây độc của phân tử LPS, gây bên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm. Ngoài ra, các enzyme khác của Serratia marcescens tạo ra cũng đƣợc xem nhƣ một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme lipase, chitinase, chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997). Theo Kenichi Ishii và cộng sự (2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm lành vết thƣơng, dẫn đến tổn thất lớn huyết tƣơng từ ấu trùng tằm Silkworm larvae. 1.6 Khả năng diệt sâu của vi khuẩn Serratia marcescens Serratia marcescens đã đƣợc khảo sát về sự tăng trƣởng và khả năng gây bệnh của nó trong các ấu trùng sâu bƣớm sáp (Galleria mellonella). Tất cả các chủng gây bệnh cho ấu trùng của G. Mellonella dẫn đến tử vong trong vòng 48 giờ. Chủng S.marcescens đã đƣợc chứng minh có một gen mã hóa protein metalloprotease serrlaiysin đƣợc xác định vai trò góp phần vào quá trình gây chết côn trùng. (J.T. Tambong; Xu, R; Sadiku, 2014). Serratia marcesccens đƣợc biết đến với khả năng tiết nhiều enzyme ngoại bào nhƣ chitinase, lecthinase, hemolysin, lipase, protease, nuclease. Mặc dù S.marcescens có thể sản xuất nhiều loại enzyme protease khác nhau, trong đó có metalloprotease kẽm, serralysin. Meada và cộng sự năm 199 báo cáo ràng serralysin đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của sinh vật này. Nghiên cứu đã chứng minh serralysin nhanh chóng làm suy giảm một loạt cấu trúc protein và huyết thanh. Theo đó, protease vi khuẩn nhƣ serralysin đóng một vai trò quan trọng nhƣ một yếu tố độc lực (Yutaka Kida và cộng sự, 2007). Theo K Ishii et al. (J Invertebr Pathol 117, 61-67. 2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào cơ chế 18
  32. Đồ án tốt nghiệp gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm lành vết thƣơng, dẫn đến tổn thất lớn huyết tƣơng từ ấu trùng tằm (silkworm larvae). Hình 1.6 Cơ chế gây bệnh của enzyme serralysin metallprotease của S. marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishi et al; 2014) Serratia marcescens còn đƣợc biết đến với khả năng lây nhiễm cho trứng, ấu trùng, nhộng và sâu trƣởng thành của loài heliothines-thuộc chi bƣớm đêm gây hại cho nông nghiệp (Sikorowski và Lawrence, 2009). Ấu trùng lớn tuổi bị nhiễm vi khuẩn thƣờng bộc lộ phản ứng là giảm các kích thích bên ngoài, và cái chết xảy ra một hoặc hai ngày sau đó. Vi khuẩn sau khi xâm nhập vào trong đƣờng máu của vi khuẩn và gây ra nhiễm trùng huyết và gây tử vong. Theo kết quả nghiên cứu của Estrada và cộng sự năm 2012 thì ấu trùng bị nhiễm trở thành màu đỏ sau khi chết, và tỉ lệ sống sót của những ấu trùng bị nhiễm là rất ít. Một số ấu trùng bị nhiễm trong giai đoạn cuối của ấu trùng thì sau khi hóa nhộng nó cũng sẽ bị chết do nhiễm khuẩn và khi chết nó cũng xuất huyết có màu đỏ của S. marcescens. Đến giai đoạn sâu trƣởng thành, nó có thể đƣợc lây nhiễm bằng cách cho ăn thực phẩm bị ô nhiễm, các vi khuẩn sẽ xâm nhập vào các mô của côn trùng và gây chết. Serratia marcescens có khả năng lây nhiễm và loại bỏ cao đối với bộ H. Zea và H virescens . Serratia marcescens còn có thể kết hợp với một số loại tuyến trùng hay giun tròn để gây bệnh cho côn trùng ví dụ nhƣ: O. Carolinensis kết hợp với Serratia marcescens gây bệnh côn trùng trên lớp biểu bì bên ngoài của nó. Ngoài ra cũng có thể tạo đƣợc 19
  33. Đồ án tốt nghiệp mối quan hệ nhân tạo giữa vi khuẩn và các tuyến trùng, bằng cách trộn chung tuyến trùng với vi khuẩn và nuôi chúng trong một khoảng thời gian. Cũng trong nghiên cứu của Estrada và cộng sự, năm 2012 thì khi Steinernema carpocapsae kết hợp với S. marcescens mang đến hiệu quả diệt 100% ấu trùng Galleria mellonella chỉ sau 48 giờ. Mặc dù vậy sự tồn tại của S.marcescens cũng không ảnh hƣởng đến vi khuẩn cộng sinh X. Nematophila. 1.7 Một số nghiên cứu trên thế giới 1.7.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens Brigida và cộng sự (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của S.marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng nhƣ ảnh hƣởng của S. marcescens lên thúc đẩy tăng trƣởng của cây thuộc chi cam chanh. Jaiganesh và cộng sự (2007), đã thực hiện thử nghiệm kiểm soát nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên cây lúa bằng cách sử dụng S.marcescens. Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm S. marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria mellonella và đạt đƣợc kết quả gây chết 100% ấu trùng. Các nghiên cứu trƣớc đã chứng minh prodigiosin từ Serratia marcescens (phân lập từ tuyến trùng EPN) có hiệu lực diệt sâu khá mạnh. Khi cho ăn theo phƣơng pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá khi cho ăn ở nồng độ 27,66 ng/cm2 gây chết 90% sâu khoang sau 120 giờ (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2014). Prodigiosin trong dịch nuôi cấy Serratia marcescens đã qua xử lý diệt tế bào sau khi phối hợp với các chất phụ gia với tỷ lệ 0,2%, CMC, 0,2% rỉ đƣờng và 0,04% Tween 80 để tạo chế phẩm. Chế phẩm diệt sâu tơ Plustella xylostella tốt nhất ở nồng độ pha loãng 104 (OD 499 = 0,924) có nồng độ Prodigiosin 14,9 ng/cm2. Sau 96 giờ, tỷ lệ sâu chết đã đạt 100% theo phƣơng pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá tƣơng đƣơng với thuốc trừ sâu sinh học Reasgant 3.6EC (Trƣơng Hoài Nguyên, 2017). Để phát triển một chế phẩm diệt sâu cần đơn giản hóa tối đa các quá trình Downstream Processing đối với dịch nuôi cấy lên men vi khuẩn. Vì vậy, ngoài việc 20
  34. Đồ án tốt nghiệp sử dụng phƣơng pháp xử lý acid để tiêu diệt tế bào có ƣu điểm là giữ lại phần lớn các hoạt tính từ dịch nuôi cấy vi khuẩn và không làm ảnh hƣởng đến Prodigiosin trong dịch nuôi cấy vi khuẩn (Trƣơng Hoài Nguyên, 2017) nhƣng khi áp dụng trên chủng Serratia marcescens HB ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy tế bào vẫn còn khả năng sống sót. Do vậy việc tìm ra phƣơng pháp xử lý mới có thể khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của phƣơng pháp này nhƣng vẫn không làm ảnh hƣởng đến Prodigiosin sau quá trình xử lý cũng là mục đích mà đề tài hƣớng tới. 1.7.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hóa sản xuất prodigiosin bởi S. marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigiosin. Kết quả cho thấy prodigiosin thu nhận đƣợc có tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm. Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh nhƣ Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp Nghiên cứu của San và cộng sự (2012) cho thấy prodigiosin có khả năng diệt côn trùng. Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ Alteromonas sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 g/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 g/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD 50 khoảng 50 g/ml. 21
  35. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 26/12/2017 đến hết ngày 31/07/2017 2.1.2 Địa điểm Phòng thí nghiệm Vi sinh Viện Khoa học ứng dụng HUTECH, Trƣờng Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh (HUTECH). 2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens Giống vi khuẩn Serratia mascescens SH1, SH4, SH5, SB, HB đƣợc phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Hoàng Anh Kha (2014) và Lê Quốc Vũ (2015), lƣu trữ tại phòng thí nghiệm Vi sinh trƣờng Đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh (HUTECH). 2.2.2 Nguồn nấm Nấm Trichoderma sp, Paecilomyces lilacinus do TS. Nguyễn Thị Hai, Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. 2.2.3 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura Trứng sâu khoang Spodoptera litura đƣợc cung cấp tại phòng thí nghiệm Vi sinh trƣờng Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2.4 Môi trường nuôi cấy và hóa chất a. Môi trƣờng (Thành phần môi trƣờng xem phụ lục A) Môi trƣờng Peptone Glycerone Agar (PGA) Môi trƣờng Peptone Glycerone Broth (PG) Môi trƣờng Lipid Môi trƣờng Casein Môi trƣờng huyền phù Chitin b. Hóa chất sử dụng Cồn 70, cồn 96 NaCl 22
  36. Đồ án tốt nghiệp HCl, NaOH b. Hóa chất sử dụng Cồn 70, cồn 96 NaCl HCl, NaOH Lugol Crystal Violet Fucshin Nƣớc muối bão hòa Formalin Xanthangum Carboxyl Methyl Cellulose(CMC) Sodium Alginate 2.2.5 Dụng cụ, thiết bị a. Dụng cụ Phễu chiết Ống nghiệm Đĩa petri Erlen 50ml, 100 ml, 250ml Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml Pipetman 100μl, 1000μl. Đầu típ Đũa thủy tinh Bao hấp, giấy gói, thun Đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy vòng Bông không thấm, bông thấm Chai syrum 100ml. 23
  37. Đồ án tốt nghiệp b. Thiết bị Tủ cấy vi sinh Tủ lạnh Cân phân tích Bếp từ Máy nƣớc cất Autoclave Tủ hút Máy ly tâm Bể điều nhiệt 2.3 Mục tiêu nghiên cứu Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB 2.4 Nội dung nghiên cứu Chọn chủng vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng tổng hợp prodigiosin nồng độ cao và hoạt lực enzyme ngoại bào mạnh. Xác định phƣơng pháp xử lý diệt tế bào vi khuẩn sau khi lên men. Khảo sát hoạt lực diệt sâu khoang Spodoptera litura của chế phẩm khi phối trộn tỷ lệ phụ gia khác nhau trong điều kiện phơi nắng và không phơi nắng 5 ngày. Khảo sát khả năng kháng nấm có lợi Trichoderma sp., Paecilomyces lilacinus. 2.5 Phƣơng pháp thí nghiệm 2.5.1 Phương pháp luận Khảo sát chọn chủng Serratia marcescens phù hợp từ bộ sƣu tập đƣợc phân lập từ tuyến trùng EPN Heterorhabditis indica CP-16. Các nghiên cứu trƣớc đƣợc thực hiện trên các chủng Serratia marcescens SH1 (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) và Serratia marcescens SH4 (Trƣơng Hoài Nguyên, 2017). Nhƣng ở nghiên cứu 24
  38. Đồ án tốt nghiệp này, ngƣời nghiên cứu tiến hành khảo sát trên chủng Serratia marcescens HB đƣợc phân lập bởi Lê Quốc Vũ (2015). Dựa trên các kết quả nghiên cứu trƣớc đó, để hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens bao gôm các nội dung sau: Từ bộ sƣu tập các chủng Serratia marcescens đƣợc phân lập từ tuyến trùng EPN Heterorhabditis indica CP 16 tiến hành chọn lọc chủng thể hiện khả năng sinh tổng hợp prodigiosin cao nhất và ổn định nhất. Xác định phƣơng pháp và chế độ xử lý tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens sống hiệu quả không ảnh hƣởng đến nồng độ prodigiosin và hoạt tính enzyme là hai yếu tố độc học đối với sâu. Thiết lập công thức phụ gia thích hợp để tăng hiệu lực diệt sâu, từ đó đề nghị quy trình sản xuất chế phẩm. Để chứng tỏ tính an toàn của chế phẩm, đề tài có sự đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm lên một số tác nhân bảo vệ thực vật nguồn gốc sinh học nhƣ nấm Trichoderma sp và Paecilomyces lilacinus. 25
  39. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3 Tóm tắt những nghiên cứu liên quan đến chế phẩm diệt sâu từ các chủng Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN Heterorhabditis CP 16 đã thực hiện Năm Tác giả Chủng Kết quả đạt đƣợc 2011 Đinh Thị Minh Châu SH1 Chứng minh prodigiosin diệt sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 2013 Nguyễn Hoàng Anh Kha SH1 Chứng minh prodigiosin gây chết 90% sâu khoang (Spodoptera litura) sau 120 giờ ở nồng độ 27,66 ng/cm2. 2015 Lê Quốc Vũ HB, SB Chứng minh hai chủng SB và HB có hiệu lực diệt sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) rất mạnh. 2016 Lê Thị Ngọc Dung SH1 Sản xuất chế phẩm diệt sâu khoang từ dịch nuôi cấy chủng SH1. 2017 Trƣơng Hoài Nguyên SH4 Sản xuất chế phẩm diệt sâu tơ (Plutella xylostella) từ dịch nuôi cấy chủng SH4. Từ những nghiên cứu trên, ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy: Các chủng Serratia marcescens đã khảo sát trên thực tế có sự biến động về nồng độ prodigiosin sau thời gian giữ giống. Nhu cầu tuyển chọn chủng có khả năng tổng hợp hoạt chất diệt sâu nồng độ cao và ổn định hơn. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu trên chủng đó. 26
  40. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2 Bố trí thí nghiệm Các bƣớc thí nghiệm đƣợc trình bày tóm tắt theo sơ đồ: Chủng vi sinh vật (S.marcescens SH1, SH4, SH5, SB, HB) Nuôi cấy lỏng lắc, MTPG Trích ly thu Thử nghiệm enzyme prodigiosin ngoại bào protease, chitinase. Trích ly lỏng - lỏng Trích ly lỏng - rắn EtOH:HCl (95:5, [v:v]) Hình 2.1 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật 27
  41. Đồ án tốt nghiệp Giống vi khuẩn S. marcescens HB Tăng sinh 48 giờ, lắc 150 vòng/phút Xử lý Formalin 0,5 % (30 phút) Khảo sát lại hoạt tính enzyme Chuẩn bị dịch Phối trộn phụ gia Thử nghiệm khả năng diệt sâu Kháng nấ m có lợi Hình 2.2 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả năng diệt sâu và độc tính của chế phẩm. 28
  42. Đồ án tốt nghiệp Giống vi khuẩn S. marcescens HB Tăng sinh 48 giờ, lắc 150 vòng/phút Xử lý acid HCl 1N, 4 giờ, Xử lý Formalin (0,125%, Xử lý nhiệt trung hòa bằng NaOH 1N 0,25%, 0,5%, 0,75%, 1%) 0 0 65 C, 100 C trong 15 phút Ria trên thạch PGA để kiểm tra khả năng sống sót của vi khuẩn Quét phổ hấp thụ UV-VIS ở 380 nm – 700 nm Chọn ra phƣơng pháp xử lý thích hợp Hình 2.3 Quy trình thử nghiệm khảo sát chọn phƣơng pháp tiêu diệt tế bào tối ƣu. 29
  43. Đồ án tốt nghiệp 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu bố trí thí nghiệm 2.6.1 Phương pháp chọn lọc chủng seratia marcescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào Protease mạnh nhất. 2.6.1.1 Phương pháp định tính enzyme Định tính enzyme protease Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn : Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng Peptone Glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 vòng/phút và ủ tối trong 48 giờ. Pha môi trƣờng Gelatin agar, hấp 1210C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 500C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính giếng thạch (d) bằng 5 mm. Cho 20 µl dịch trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào các giếng thạch. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng TCA 10%. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d) mm, với D là đƣờng kính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme Protease thì sẽ xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme Protease thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải Gelatin đƣợc đánh giá thông qua hiệu số (D-d) mm. Hiệu số càng lớn , vi khuẩn có khả năng sinh enzyme Protease càng nhiều. Định tính enzyme chitinase Pha môi trƣờng thạch huyền phù chitin 1%, hấp 1210C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 650 C, đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch (d) bằng 5 mm. 30
  44. Đồ án tốt nghiệp Đối chứng dƣơng: Dùng pipetman hút 20 µl sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính chitin. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tráng lugol, đo đƣờng kính vòng phân giải trên bề mặt môi trƣờng. Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 10ml, tiến hành pha loãng canh trƣờng lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ phaloãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 µl ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng thạch ở môi trƣờng thử hoạt tính chitinase, nhƣ hình 2.7 Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng lugol lên đĩa môi trƣờng: Nếu dịch nuôi cấy có enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải chitin đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme chitinase sau xử lí acid càng lớn. Trong đó : D: đƣờng kính vòng phân giải (mm) d: đƣờng kính giếng thạch (mm 2.6.1.2 Phương pháp trích ly thu Prodigiosin Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng Peptone Glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 vòng/phút và ủ tối trong 48 giờ. Sau khi tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH=2 trong 4 giờ: cho 450µl HCl 1N vào canh trƣờng, để trên máy lắc trong 4 giờ, sau đó thêm 450 µl NaOH 1N để trung hòa đƣa về pH = 7, đem ly tâm trích ly lỏng rắn và 31
  45. Đồ án tốt nghiệp đo OD 499 nm phần dịch thô vừa thu đƣợc. Sau đó tiến hành trích ly lỏng lỏng theo sơ đồ hình 2.4. Canh trƣờng sau nuôi cấy Xử lý acid Trung hòa NaOH Ly tâm 4000 vòng/phút trong Đo Prodigiosin 15 phút OD 499 nm EtOH: HCl 1N (95:5;[v:v]) Dịch Sinh Ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút Sắc tố thô Dịch trong Đo Prodigiosin sau Trích ly lỏng trích ly đo OD535 nm lỏng Hình 2.4 Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men các chủng vi khuẩn 32
  46. Đồ án tốt nghiệp 2.6.2. Khảo sát phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu quả Mục đích của việc khảo sát phƣơng pháp tiêu diệt tế bào sống của vi khuẩn Serratia marcescens là để nhằm đảm bảo tính An toàn sinh học trong nghiên cứu sản xuất và sử dụng. Và đối tƣợng khảo sát của thử nghiệm này là chủng vi khuẩn Serratia marcescens đã đƣợc chọn lọc từ thí nghiệm chọn chủng vừa rồi. 2.6.2.1 Phương pháp xử lý tế bào bằng acid. Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong chai có chứa 20 ml môi trƣờng Peptone Glycerol Broth vô trùng, với tỷ lệ cấy giống 1%. Nuôi ủ vi khuẩn ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút, tránh ánh sáng, trong 48 giờ. Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy và đem xử lý với acid HCl 1N. Với mục đích đƣa môi trƣờng về pH = 2, tiêu diệt tế bào vi khuẩn, dung pipetman hút 450 µl dung dịch acid HCl 1N cho vào chai dịch nuôi cấy lên men. Lắc 150 vòng/phút, ủ trong tối trong 4 giờ sau đó trung hòa pH bằng 450 µl dung dịch NaOH 1N (Trƣơng Hoài Nguyên, 2017). Đối chứng dƣơng: vi khuẩn khảo sát sau khi tăng sinh 48 giờ tiến hành cấy ria trên đĩa PGA. Ủ tối ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. 2.6.2.2 Phương pháp xử lý nhiệt Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong chai có chứa 20 ml môi trƣờng Peptone Glycerol Broth vô trùng, với tỷ lệ cấy giống 1%. Nuôi ủ vi khuẩn ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút, tránh ánh sáng, trong 48 giờ. Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy và đem xử lý nhiệt bằng cách đun cách thủy ở 2 nghiệm thức nhiệt độ 650C và 1000C trong vòng thời gian 15 phút. Sau xử lý nhiệt tiến hành cấy ria dịch canh trƣờng lên thạch PGA. Ủ tối 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Đối chứng dƣơng: vi khuẩn khảo sát sau khi tăng sinh 48 giờ tiến hành cấy ria trên đĩa PGA. Ủ tối nhiệt độ phòng trong 24 giờ. 33
  47. Đồ án tốt nghiệp Đọc kết quả: Sau 24 giờ ủ đĩa trong tối, tiến hành quan sát khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens trên môi trƣờng Peptone Glycerol Agar (PGA). 2.6.2.3 Phương pháp xử lý tế bào bằng Formalin Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong chai có chứa 20 ml môi trƣờng Peptone Glycerol Broth vô trùng, với tỷ lệ cấy giống 1%. Nuôi ủ vi khuẩn ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút, tránh ánh sáng, trong 48 giờ. Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy và đem xử lý Formalin ở các nồng độ 0,125%; 0,25%; 0,5%; 0,75%; 1% tƣơng ứng với 25, 50, 100, 150, 200 µl Formalin trong 20 ml dịch nuôi cấy. Đối chứng dƣơng: vi khuẩn khảo sát sau khi tăng sinh 48 giờ tiến hành cấy ria trên đĩa PGA. Ủ tối nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Đọc kết quả: Sau 24 giờ ủ đĩa trong tối, tiến hành quan sát khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens trên môi trƣờng Peptone Glycerol Agar (PGA). 2.6.3 Phương pháp định tính enzyme của dịch nuôi cấy sau khi xử lý tế bào Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng PG ở nhiệt độ phòng, ủ tối trong 48 giờ. Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lí: Sau khi tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng PG broth vô trùng, dùng pipetman hút 100 µl Formalin cho vào dịch nuôi cấy lên men, lắc 150 vòng/ phút, trong 30 phút. Hút 20 µl Tween 80 vô trùng cho vào 10 ml dịch nuôi cấy đã đƣợc xử lý tế bào. Chuẩn bị Tween 80 0,02%: Hút 20 µl Tween 80 cho vào lần lƣợt các dịch pha loãng với thể tích 10 ml. 34
  48. Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm hoạt tính protease Pha môi trƣờng gelatin agar, hấp 1210C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 650C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch (d) bằng 5 mm. Đối chứng dƣơng: Dùng pipetman hút 20µl dịch nuôi cấy lên men vi khuẩn thử nghiệm cho vào giếng thạch. Ủ 24 giờ, tráng TCA 10%, đo đƣờng kính vòng phân giải. Các thử nghiệm: Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lí formalin, dùng pippet thủy tinh10ml, tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ pha loãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 µl ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng thạch ở môi trƣờng thử hoạt tính gelatin, nhƣ hình 2.5. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần. Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch gelatin agar. Đọc kết quả: Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng TCA 10% lên đĩa môi trƣờng: Nếu dịch nuôi cấy có enzyme protease thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme protease thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. 35
  49. Đồ án tốt nghiệp Khả năng phân giải gelatin đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme protease sau xử lí Formalin càng lớn. Trong đó : D: đƣờng kính vòng phân giải (mm) d: đƣờng kính giếng thạch (mm) Thử nghiệm hoạt tính Chitinase Pha môi trƣờng thạch huyền phù chitin 1%, hấp 1210C trong 15 phút. Đểmôi trƣờng nguội đến khoảng 650 C, đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch (d) bằng 5 mm. Đối chứng dƣơng: Dùng pipetman hút 20 sinh khối của chủng vi sinh vật thửnghiệm vào đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính chitin. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tráng lugol, đo đƣờng kính vòng phân giải trên bề mặt môi trƣờng. Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 10ml, tiến hành pha loãng canh trƣờng lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ phaloãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng thạch ở môi trƣờng thử hoạt tính Chintase, nhƣ hình 2.7 Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hinh 2.7 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch huyền phù Chitin Đọc kết quả: Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng lugol lên đĩa môi trƣờng: 36
  50. Đồ án tốt nghiệp Nếu dịch nuôi cấy có enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải chitin đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme chitinase sau xử lí acid càng lớn. Trong đó : D: đƣờng kính vòng phân giải (mm) d: đƣờng kính giếng thạch (mm) 2.6.4. Phƣơng pháp khảo sát sự ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đối với hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở các công thức phụ gia. 2.6.4.1 Tỷ lệ các chất phụ gia trong chế phẩm Các loại phụ gia thử nghiệm cho khảo sát này bao gồm: Carboxyl methyl cellulose (CMC), rỉ đƣờng, Tween 80 đƣợc phối trộn với dịch lên men vi khuẩn Serratia marcescens đã xử lý tế bào theo tỷ lệ đƣợc trình bày ở bảng 2.1. Bảng 2.1 Bảng bố trí các nghiệm thức. CMC Rỉ đƣờng Tween 80 Điều kiện Nghiệm thức (%) (%) (%) bảo quản NT1 0,2 0,2 0,04 Phơi nắng NT2 0,2 0,4 0,04 Phơi nắng NT3 0,2 0,2 0,08 Phơi nắng NT4 0,2 0,4 0,08 Phơi nắng NT5 0,2 0,2 0,04 Không phơi nắng 37
  51. Đồ án tốt nghiệp Chuẩn bị dịch lên men: dịch nuôi cấy Serratia marcescens HB đƣợc xử lý tế bào bằng cách hút 100 µl dung dịch Formalin cho vào 20 ml thể tích dịch sau lên men bình nuôi cấy với thời gian xử lý là 30 phút. Sau đó, tiến hành pha loãng dịch 20 lần (OD 499 nm = 0,5) bằng môi trƣờng PG vô trùng và pha loãng tiếp đến nồng độ sử dụng là 104 lần. Theo nhƣ kết quả của các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, hợp chất prodigiosin không có khả năng diệt sâu cao ở nồng độ cao nhƣng khi ở nồng độ 10-4 lại thể hiện khả năng này khá mạnh (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). Chuẩn bị phụ gia: Ở từng nghiệm thức tiến hành cân các chất phụ gia theo tỷ lệ khảo sát. Chẳng hạn, ở nghiệm thức 1(NT1) cân 0,2 g CMC, 0,2 g rỉ đƣờng, 0,04 g Tween 80 cho vào cốc rồi sau đó định mức lên 100 ml bằng nƣớc cất, đun cho CMC tan hoàn toàn và mang hỗn hợp phụ gia hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, 1atm. Tƣơng tự với các nghiệm thức phụ gia còn lại. Sau khi phụ gia đƣợc tiệt trùng, để nguội và tiến hành phối trộn với dịch lên men vi khuẩn Serratia marcescens đã xử lý tiêu diệt tế bào bằng cách hút 1ml dịch lên men pha loãng ở nồng độ 10-4 bổ sung thêm 9 ml phụ gia vô trùng ta đƣợc chế phẩm thử nghiệm. Thực hiện tạo chế phẩm tƣơng tự cho các nghiệm thức còn lại. Chuẩn bị dung dịch đối chứng âm: 20 ml môi trƣờng PG vô trùng có bổ sung 100µl Formalin. Chuẩn bị đối chứng dƣơng: hút 1ml thuốc trừ sâu sinh học Reasgant pha loãng trong 100 ml nƣớc cất vô trùng. Hút tiếp 4,2 ml dịch Reasgant đã pha loãng bổ sung thêm 5,8 ml nƣớc cất vô trùng ta đƣợc 10 ml. Hút 100 µl trong 10 ml này để tiến hành thử nghiệm, nồng độ đối chứng dƣơng đạt 1 mg/cm2 khi thí nghiệm. 2.6.4.2. Khảo sát hiệu lực diệt sâu khoang bằng phương pháp quét lá Sâu thí nghiệm – sâu khoang Spodoptera litura. Trứng sâu khoang sau khi ấp nở đợi đến đầu tuổi 3 mới tiến hành thử nghiệm bằng cách chọn ra 20 con và cho vào hộp nuôi sâu đã đƣợc khử trùng có thể tích 38
  52. Đồ án tốt nghiệp 950 ml. Mỗi hộp tƣơng đƣơng với một nghiệm thức thử nghiệm, và đƣợc lặp lại 3 lần ở mỗi nghiệm thức. Sâu khoang phát triển đến tuổi 3 mất khoảng 8-10 ngày từ khi trứng bắt đầu nở. Kích thƣớc sâu ở tuôi này từ 19 - 25 mm, trọng lƣợng trung bình từ 0,3 - 0,6 mg. Ngoài ra, đặc điểm nhận dạng sâu ở đầu tuổi 3 thể hiện ở 3 vạch chính màu đen nổi bật xuất hiên trên cơ thể, hoạt động mạnh vào lúc sáng sớm và chiều tối, ăn thủng lá tạo thành những lỗ nhỏ. Khi có ánh sáng mặt trời, sâu ẩn phía dƣới lá hoặc trốn vào trong đất. Tiến hành thí nghiệm. Phƣơng pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá (Maureen và cộng sự, 2012). Phƣơng pháp này mô phỏng gần giống với các điều kiện phun thuốc trực tiếp ngoài đồng nhằm khảo sát khả năng diệt sâu qua đƣờng tiêu hoá của hợp chất prodigiosin của chủng HB. Lá thầu dầu đƣợc rửa sạch và để ráo nƣớc, cắt với diện tích 15 x 10 (cm2). Hút 100 µl dịch pha loãng lên lá, vô trùng que cấy để tiến hành trang đều dịch ở các nồng độ pha loãng lên lá thầu dầu. Sau đó cho lá vào hộp nuôi sâu. Theo dõi số lƣợng sâu chết trong 5 ngày. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Ở hộp sâu đối chứng âm: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang đều 100 µl canh trƣờng PG vô trùng đã đƣợc bổ sung 0,5% Formalin. Ở hộp đối chứng dƣơng: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang đều 100 µl thuốc trừ sâu Reasgant đã đƣợc pha loãng nhƣ đã mô tả ở trên đạt nồng độ 1 mg/cm2. Đọc kết quả kháng sâu: Dựa vào số lƣợng sâu khoang Spodoptera litura chết ở từng mốc thời gian để đánh giá hiệu quả diệt sâu của hợp chất. Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức Abbott (1925). 39
  53. Đồ án tốt nghiệp 2.6.6 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm Thí nghiệm đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp đục giếng thạch dựa vào khả năng khuếch tán của các hợp chất có khả năng kháng khuẩn vào môi trƣờng thạch. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện nhƣ sau: Nấm thử nghiệm – Trichoderma sp., Paecilomyces lilacinus. Pha môi trƣờng PDA bổ sung thêm kháng sinh choramphenycol 0,25%, vô trùng que cấy thẳng, tiến hành cấy điểm nấm từ môi trƣờng thạch nghiêng sang môi trƣờng PDA có bổ sung kháng sinh, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó, đục thạch có đƣờng kính 5 mm cấy sinh khối nấm vào đĩa PDA không bổ sung kháng sinh. Nuôi ủ tơ nấm trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng. Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh và xử lý formalin nhƣ phƣơng pháp định tính enzyme nhƣ mục 2.6.3 Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1,10- 2,10-3,10-4. Chọn nồng độ 10-4 để tiến hành thử nghiệm. Bổ sung vào 9ml dịch pha loãng 1ml phụ gia bao gồm: CMC, Tween 80 và rỉ đƣờng với tỷ lệ 0,2%, 0,04% và 0,2%. Đối chứng âm: Chuẩn bị 10 ml môi trƣờng PG vô trùng thêm 50 µl Formalin và hút bỏ ra 1ml thay bằng 1ml phụ gia. Đối chứng dƣơng : Chế phẩm Daconil hút 0,15 g pha loãng với 100 ml nƣớc cất vô trùng. Tiến hành kháng nấm: Chuẩn bị môi trƣờng PDA vô trùng. Tiến hành đục giếng thạch 5 mm. Vô trùng cây đục thạch và đục lấy khối thạch với đƣờng kính 5 mm có sinh khối nấm từ đĩa PDA phía trên và đặt vào tâm đĩa PDA nhƣ hình 2.8. Hút 20 µl dịch nuôi cấy đã xử lí Formanlin 0,5% ở nồng độ pha loãng 10-4 sau khi bổ sung phụ gia cho vào giếng thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng, từ 3 – 5 ngày. 40
  54. Đồ án tốt nghiệp NNấmấm Hình 2.8 Bố trí nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA Đọc kết quả thí nghiệm: Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ bị ức chế và đƣờng kính nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ nhỏ hơn đƣờng kính của nấm ở đĩa đối chứng. Nếu không xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ không bị ức chế, phát triển bình thƣờng nhƣ nấm ở đĩa đối chứng. Tỷ lệ ức chế đƣợc đánh giá theo công thức sau (Pander và cộng sự, 1982) Đo đƣờng kính khuẩn lạc (cm) trong 3, 5 và 7 ngày sau cấy Tỷ lệ (%) ức chế đƣợc tính theo công thức: U = x100 Trong đó: U: % khuẩn lạc bị ức chế. D: đƣờng kính khuẩn lạc đƣợc đo ở nghiệm thức đối chứng. X: đƣờng kính khuẩn lạc đƣợc đo ở nghiệm thức xử lý thuốc. Trong đó: đƣờng kính khuẩn lạc bằng đƣờng kính sau khi đo trừ đi đƣờng kính khối thạch. 41
  55. Đồ án tốt nghiệp Chỉ tiêu đánh giá ảnh hƣởng của thuốc đƣợc đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989): + Cấp 1: không ảnh hƣởng ( 90%) 42
  56. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và prodigiosin cao nhất. Để đạt mục tiêu trên, các chủng S.marcscens SH1, SH4, SH5, SB, HB đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng peptone glycerol. Dịch nuôi cấy đƣợc đƣa đi khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch. Đồng thời prodigiosin đƣợc trích ly từ dịch nuôi cấy bằng Ethanol : HCl (95:5,v:v) và xác định nồng độ nhờ phƣơng pháp đo OD535nm (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). 3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào. Sau khi bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn sống vào giếng thạch môi trƣờng chứa gelatin, ủ 24 giờ và nhỏ thuốc thử Trichloroacetic acid (TCA) 10% đo vòng phân giải gelatin. Phần còn lại là gelatin chƣa bị thủy phân sẽ tác dụng với thuốc thử tạo thành phức hợp tủa có màu trắng đục. Kết quả khi tiến hành trên môi trƣờng gelatin thì tất cả các chủng đều có khả năng phân giải gelatin là nhƣ nhau . Xung quanh vòng phân giải là phức hợp TCA – gelatin trắng đục dễ dàng nhận thấy (hình 3.1 và bảng 3.1). A B C E D Hình 3.1 Khả năng tiết enzyme protease của 5 chủng Serratia marcescens SH1, SH4, SH5, SB, HB tƣơng ứng với các ký hiệu A, B, C, D, E. 43
  57. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescen SH1, SH4, SH5, SB và HB. Đƣờng kính vòng phân giải STT Chủng (D-d) mm Protease Chitinase 1 SH1 6,67a ± 0,57 - 2 SH4 5,33b ± 0,57 - 3 SH5 5,33b ± 0,57 - 4 SB 5,33b ± 0,57 20,5a ± 0,5 5 HB 6ab ± 0 19,5a ± 0,5 SB HB Hình 3.2. Khả năng tiết enzyme chitinase của chủng SB và HB. Nhƣ vậy dịch nuôi cấy các chủng S.marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN trên môi trƣờng peptone glycerol thể hiện hoạt tính enzyme protease và riêng hoat tính chitinase đối với chủng SB và HB, các chủng còn lại chƣa xác định đƣợc. Theo Brurberg và cộng sự, 2010; Shingh và cộng sự, 2007 và nhiều tác giả khác thì S.marcescens có khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase. Điều này cho thấy hoạt 44
  58. Đồ án tốt nghiệp tính chitinase của các chủng SH1, SH4 và SH5 có thể không ổn định hoặc trong thời gian bảo quản enzyme chitinase đã mất bị hoạt tính . Do đó ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy việc bảo quản giống và thƣờng xuyên kiểm tra hoạt tính enzyme mong muốn là một khâu cực kỳ quan trọng trong quá trình nghiên cứu. Theo K Ishii et al. (J Invertebr Pathol 117, 61-67. 2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm lành vết thƣơng, dẫn đến tổn thất lớn huyết tƣơng từ ấu trùng tằm (silkworm larva). Kết quả của thí nghiệm sau khi xử lý thống kê theo cột cho thấy khả năng tổng hợp protease cao nhất thể hiện ở chủng SH1(6,67a ± 0,57) và chủng HB (6ab ± 0 ) sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê góp phần vào hoạt tính diệt sâu của các chủng S.marcescens. Bên cạnh đó, hoạt tính chitinase thể hiện ở chủng SB (20,5a ± 0,5) và HB (19,5a ± 0,5) cũng không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê. 3.1.2. Trích ly thu prodigiosin Prodigiosin đƣợc biết đến là sắc tố đỏ có bản chất là một chất chuyển hóa thứ cấp chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn S.marcescens và đƣợc nghiên cứu từ lâu để ứng dụng hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học nhƣ hoạt động ức chế miễn dịch, kháng ung thƣ, kháng khuẩn và một số nấm mốc cũng nhƣ có khả năng diệt sâu Những nghiên cứu trƣớc đó cho thấy prodigiosin thể hiện hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) và sâu xanh da láng Spodoptera exigua (Lê Quốc Vũ, 2015). Để sản xuất chế phẩm diệt sâu chứa prodigiosin ta có có hai cách là sử dụng trực tiếp dịch canh trƣờng vi khuẩn sau lên men hoặc trích ly thu hồi prodigiosin. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài so sánh khả năng sinh tổng hợp prodigiosin từ các chủng SH1,SH4, SH5, SB và HB trong môi trƣờng peptone glycerol. Với mục đích tiêu diệt tế bào vi khuẩn nhằm đảm bảo an toàn sinh học ngƣời thực hiện đề tài tiến hành xử lý dịch canh trƣờng bằng acid HCl 1N và trung hòa bằng NaOH về pH trung tính. Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp prodigiosin của các chủng nghiên cứu ngƣời thực hiện đề tài đo OD499 nm dịch canh 45
  59. Đồ án tốt nghiệp trƣờng sau xử lý acid (Mekhael và Yuosif, 2009) và song song đó tiến hành trích ly thu prodigiosin bằng dung môi Ethanol:HCl 1N (95:5, v:v) để thu sắc tố đỏ. Sau khi cô quay mẫu sau trích ly lỏng lỏng, định mức lên 10ml và pha loãng 20 lần mỗi mẫu bằng dung môi Ethanol:HCl 1N (95:5, v:v), ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đo OD535nm. Bảng 3.2. Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm), OD535nm sau khi trích ly sắc tố của các chủng SH1, SH4, SH5, SB, HB. STT Chủng vi khuẩn OD499nmhiệu chỉnh OD535nmhiệu chỉnh 1 SH1 10,407 ± 0,37ab 14,073 ± 1,95a 2 SH4 9,140 ± 1,36bc 8,880 ± 1,37b 3 SH5 7,407 ± 1,26c 6,593 ± 1,58bc 4 SB 4,820 ± 1,58d 5,873 ± 1,26c 5 HB 12,413 ± 1,72a 15,487 ± 1,42a 18 a 16 a 14 a ab 12 bc b 10 c bc 8 c OD 499nm d 6 OD 535nm OD OD chỉnh hiệu 4 2 0 SH1 SH4 SH5 SB HB Chủng vi khuẩn Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện giá trị OD hiệu chỉnh của 5 chủng SH1, SH4, SH5, SB, HB. 46
  60. Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.4, ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy rằng các chủng có khả năng sinh prodigiosin cao nhất là chủng SH1 và HB thể hiện qua giá trị OD499 nm (đo prodigiosin trực tiếp trong canh trƣờng) và kết quả OD535nm (đo prodigiosin sau trích ly). Tóm lại hai chủng SH1 và HB vừa có khả năng sinh tổng hợp prodigiosin và enzyme protease nhƣ nhau và cao hơn so với các chủng còn lại ở cùng điều kiện khảo sát. Do đó, sẽ chọn hai chủng này để tiếp tục khảo sát. 3.1.3. So sánh hình thái của chủng SH1 và HB. Hình thái khuẩn lạc A B C D Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc và hình thái nhuộm Gram của hai chủng SH1 và HB A. Hình thái khuẩn lạc chủng SH1 trên môi trƣờng PGA B. Hình thái khuẩn lạc của chủng HB trên môi trƣờng PGA C. Hình thái tế bào chủng SH1 khi nhuộm Gram D. Hình thái tế bào chủng HB khi nhuộm Gram 47
  61. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả soi khuẩn lạc (hình 3.5) thì chủng SH1và HB đều tạo khuẩn lạc tròn, lồi, đỏ sẫm, có quầng sáng bao quanh trên môi trƣờng PGA nhƣ theo mô tả của các tài liệu về khả năng tổng hợp sắc tố của Serratia marcescens (Grimont và Grimont, 2006; Anita và cộng sự, 2006; Chidambaram và cộng sự, 2009; Antony và cộng sự, 2011) Về kính thƣớc khuẩn lạc thì chủng HB lớn hơn chủng SH1. Kết quả hình thái nhuộm Gram Sau khi tiến hành nhuộm Gram, tế bào hai chủng Serratia marcescens SH1 và HB đều có hình que ngắn, bắt màu hồng với thuốc nhuộm Fuchsin. Điều này cho thấy hai chủng đều là Gram âm, phù hợp với những mô tả về Serratia marcescens (Williams và Qadri, 1980; Grimont và Grimont, 2006; David R.C., 2012). Phổ hấp thu cực đại max hai chủng SH1 và HB Dịch lên men của hai chủng sau khi đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng PG trên máy lắc (150 vòng/phút, 48 giờ). Sau đó tiến hành quét phổ UV-VIS trong khoảng 700-380nm trên máy đo quang phổ JASCO V-730. Tiếp theo, dịch nuôi cấy sẽ đƣợc tiêu diệt tế bào bằng cách xử lý nhiệt ở 1000C trong 15 phút (Lê Thị Ngọc Dung, 2016) và đem mẫu đi quét lại trên máy đo quang phổ. HB SH1 Hình 3.5. Kết quả quét phổ hấp thu dịch lên men hai chủng Serratia marcescens SH1 và HB 48
  62. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6. Kết quả quét phổ sau trích ly bằng hệ dung môi Ethanol:HCl (95:5,v:v) của chủng SH1. Hình 3.7. Kết quả quét phổ sau trích ly bằng hệ dung môi Ethanol:HCl (95:5,v:v) của chủng HB. 49
  63. Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả quét phổ của dịch sau lên men (hình 3.5) và dịch sau trích ly (hình 3.6 và 3.7 ) cho thấy cả hai chủng SH1 và HB đều có bƣớc sóng hấp thu cực đại ở 499 nm đối với dịch lên sau men và hấp thụ bƣớc sóng 535 nm đối với dịch trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl (95:5 ; v:v). Điều này trùng khớp với kết quả nghiên cứu của Krishna J.G (2008) và Nguyễn Hoàng Anh Kha (2013). Dựa trên các kết quả đã nghiên cứu trƣớc đây liên quan đến sản xuất chế phẩm trừ sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1 (Lê Thị Ngọc Dung, 2016) và SH4 (Trƣơng Hoài Nguyên, 2017) . Kết hợp với các kết quả vừa thu đƣợc, ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy Serratia marcescens HB là một chủng tiềm năng, có thể ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học trừ sâu. Chính vì vậy, ngƣời thực hiện sẽ chọn chủng HB để nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ chủng này. 3.2. Kết quả khảo sát phƣơng pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu quả nhất. Prodigiosin đƣợc biết đến là sắc tố phần lớn gắn liền với màng ngoài tế bào vi khuẩn Gram âm Serratia marcescens. Dịch nuôi cấy Serratia marcescens thông thƣờng cần trích ly lỏng-rắn bằng ethanol/methanol, sau đó trích ly lỏng-lỏng bằng dung môi kém phân cực hơn để thu đƣợc prodigiosin tinh sạch một phần. Chất này thể hiện hoạt tính diệt sâu nhƣ đã trình bày trong phần tổng quan. Việc thu hồi prodigiosin và tinh sạch một phần prodigiosin cho mục đích sản xuất thuốc trừ sâu rất tốn kém, vì vậy đề tài này muốn sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy (canh trƣờng sau lên men) Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu. Tuy nhiên, Serratia marcescens đƣợc báo cáo có thể gây bệnh cơ hội, là vi khuẩn phát triển rất mạnh trong nhiều hệ sinh thái khác nhau. Vì vậy, những thí nghiệm trong mục này nhằm mục đích tiêu diệt tế bào mà không gây ảnh hƣởng lên hoạt tính sinh học của prodigiosin và các hoạt tính sinh học khác của tế bào nhƣ enzyme ngoại bào có thể hỗ trợ diệt sâu nhƣ: protease, chitinase. Ba phƣơng pháp khả thi, rẻ tiền mà ngƣời thực hiện sẽ hƣớng đến đó là xử lý acid, xử lý nhiệt hoặc xử lý Formalin. 50
  64. Đồ án tốt nghiệp Để thực hiện mục tiêu hoàn thiện quy trình tạo chế phẩm trừ sâu, bƣớc đầu tiên phải xử lý đƣợc số tế bào sống trong canh trƣờng lên men. Vì các chủng vi khuẩn Seratia marcescens đƣợc biết đến nhƣ là một trong những tác nhân gây bệnh cơ hội bệnh viện. Với phƣơng thức lây truyền trực tiếp hoặc bằng ống thông, chúng có khả năng gây hại cho cơ thể con ngƣời và động vật máu nóng. Serratia marcescens có thể gây nên bệnh viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm màng não và áp xe não, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu và nhiễm trùng mắt ( Việc tìm ra phƣơng pháp xử lý thích hợp nhằm tiêu diệt 100% tế bào sống của vi khuẩn là một bƣớc vô cùng quan trọng để đảm bảo tính an toàn cho chế phẩm trừ sâu. 3.2.1. Phương pháp xử lý acid Dựa trên sự ảnh hƣởng của nồng độ ion H+ lên thành tế bào vi khuẩn, tiến hành xử lý acid HCl 1N đƣa môi trƣờng về pH 2 để tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn trong thời gian 4 giờ (Trƣơng Hoài Nguyên, 2017). Kết quả sau khi cấy ria dịch canh trƣờng vi khuẩn S. marcescens HB có xử lý acid trên môi trƣờng thạch PGA sau khi ủ cho thấy: sau 4 giờ xử lý, không thấy sự xuất hiện khuẩn lạc đặc trƣng của chủng Serratia marcescens. Để khẳng định vi khuẩn đã chết tại pH 2 sau 4 giờ xử lý hay pH môi trƣờng chỉ tạm thời làm chậm sự phát triển của vi khuẩn. Tiến hành ủ tối các đĩa PGA thêm 24 giờ. Kết quả cho thấy, sau 48 giờ trong điều kiện không có ánh sáng, các đĩa môi trƣờng PGA đã có sự xuất hiện các khuẩn lạc hình tròn, lồi, bóng và có màu đỏ đậm. Nhƣ vậy do pH môi trƣờng bị thay đổi đột ngột về pH acid (pH2) đã làm mất cân bằng ion giữa trong và ngoài màng tế bào, do đó làm chậm sự phát triển của tế bào vi khuẩn. Vì Serratia marcescens HB thuộc họ vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae nên có khả năng sống sót trong điều kiện môi trƣờng acid, nên việc xử lý acid HCl 1N trong 4 giờ không khả thi cho việc tiêu diệt tế bào. Do đó sẽ không chọn phƣơng pháp xử lý nhƣ Trƣơng Hoài Nguyên (2017) vì chủng S.marcescens HB vẫn có khả năng sống sót. 51
  65. Đồ án tốt nghiệp A B Hình 3.8 Khuẩn lạc Serratia marcescens xuất hiện trên thạch PGA ở đĩa đối chứng (A) và đĩa khảo sát (B) sau 48 giờ ủ. 3.2.2. Phương pháp xử lý nhiệt Dựa vào kết quả trên, tiến hành xử lý canh trƣờng ở nhiệt độ 650C và 1000C trong vòng 15 phút (Lê Thị Ngọc Dung, 2016). Thí nghiệm này nhằm tạo tạo môi trƣờng nghiên cứu an toàn bằng phƣơng pháp xử lý nhiệt canh trƣờng sau tăng sinh chủng Serratia marcescens HB đảm bảo vi sinh vật bị tiêu diệt hoàn toàn. Kết quả nhận đƣợc từ đĩa môi trƣờng PGA đƣợc trang canh trƣờng Serratia marcescens HB sau khi xử lý nhiệt 650C/15 phút ủ tối 24 giờ cho thấy vẫn có sự hiện diện khuẩn lạc đặc trƣng Serratia marcescens trên đĩa môi trƣờng Có thể nói chủng Serratia marcescens HB có thể sống sót ở mức nhiệt độ khá cao 650C, vì vậy sử dụng phƣơng pháp xử lý nhiệt ở 650C/15 phút đối với chủng Serratia marcescens HB là không khả thi. Bên cạnh đó, tại nhiệt độ 1000C sau 15 phút xử lý thì kết quả không thấy xuất hiện khuẩn lạc trên thạch PGA sau 24 giờ ủ, kết quả xử lý ở mức nhiệt 1000C này trùng khớp với kết quả của Lê Thị Ngọc Dung (2016). Tuy nhiên, tại khi nhiệt độ 1000C trong 15 phút enzyme ngoại bào bị bất hoạt (Lê 52
  66. Đồ án tốt nghiệp Thị Ngọc Dung, 2016). Do đó ngƣời thực hiện đề tài sẽ không chọn phƣơng pháp xử lý này đối với chủng Serratia marcescens HB. A Hình 3.9. Kết quả sau khi ria lại trên thạch PGA sau 24 giờ ủ ở hai nghiệm thức 1000C (A) và 650C (B). B 53
  67. Đồ án tốt nghiệp 3.2.3. Phương pháp xử lý tiêu diệt tế bào bằng dung dịch Formalin. Formanldehyde có công thức hóa học là HCHO, thƣờng đƣợc gọi là Formol. Dung dịch nƣớc chứa 37% gọi là Formalin. Tác dụng: Tiêu diệt vi sinh vật bằng cách alkyl hóa amino acid và nhóm sulfhydrate của protein. Ở nồng độ phù hợp có khả năng tiêu diệt cả nha bào. Công dụng: Mặc dù có thể sử dụng để làm chất kháng khuẩn mức độ cao hay chất tiệt khuẩn nhƣng rất ít đƣợc sử dụng ngày nay do khí kích ứng, có khả năng gây ung thƣ. Ƣu điểm: - Phổ diệt khuẩn rộng, bao gồm cả nha bào. - Giá thành thấp. - Không ăn mòn. Nhƣợc điểm: - Khí trong, không màu nên khó nhìn thấy. - Mùi cay, kích ứng. - Có thể gây ung thƣ, đột biến gen. (Hƣớng dẫn khử khuẩn, tiệt trùng dụng cụ trong các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh_Bộ y tế, 2012). Dựa vào đặc tính này, tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng tiêu diệt tế bào của dung dịch Formalin với liều lƣợng sử dụng khảo sát ở các mức: 0,125%; 0,25%; 0,5%; 0,75% và 1% tƣơng ứng với 25 µl, 50 µl, 100 µl, 150 µl và 200 µl trong 20ml dịch canh trƣờng ở thời gian 30 phút. Sau đó ria lại trên thạch PGA, ủ 24 giờ để kiểm chứng. Đồng thời theo dõi sự ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp sắc tố prodigiosin bằng cách quét phổ dịch nuôi cấy trƣớc và sau khi xử lý. 54
  68. Đồ án tốt nghiệp Kết quả nhận đƣợc trên đĩa môi trƣờng PGA sau 24 giờ ủ tối cho thấy ở nồng độ 0,25% và 0,125% Formalin có sự xuất hiện của khuẩn lạc . Tuy nhiên ở các nồng độ còn lại thì không có sự hiện diện của khuẩn lạc đặc trƣng Serratia marcescen HB. Điều này chứng tỏ Formalin có khả năng tiêu diệt tế bào sống của vi sinh vật, bằng cách alkyl hóa amino acid và nhóm sulfhydrate của protein làm cho phân tử protein của chúng bị biến tính, đặc biệt là các protein xuyên màng dẫn đến sự trao đổi chất không xảy ra là nguyên nhân gây nên sự tử vong của tế bào. A B C F E D Hình 3.10 Kết quả sau khi cấy ria dịch canh trƣờng Serratia marcescens HB đã xử lý Formalin ở các nồng độ. Các ký hiệu A, B, C, D, E tƣơng ứng với các nghiệm thức: đối chứng, 0,125%, 0,25%, 0,5%, 0,75%, 1% Formalin trong 30 phút. Và dịch canh trƣờng lên men sau khi xử lý Formalin ở các nồng độ sẽ đƣợc quét phổ UV-VIS để xem lƣợng prodigiosin còn lại sau quá trình xử lý tế bào cũng nhƣ là xác định nồng độ Formalin thử nghiệm thích hợp. 55
  69. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Bảng kết quả so sánh lƣợng prodigiosin còn lại sau quá trình xử lý tế bào ở các giá trị nồng độ Formalin. Nồng độ Formalin xử lý (%) Lƣợng prodigiosin còn lại (%) 0,125 90,18a ± 1,99 0,25 115,11a ± 19,46 0,5 110,75a ± 12.43 0,75 98,30a ± 16,35 1 53,34b ± 14,89 Từ kết quả ở bảng 3.3 cho thấy, sau 30 phút xử lý bằng Formalin thì lƣợng prodigiosin còn lại ở các nghiệm thức 0,125%, 0,25%, 0,5% và 0,75% Formalin không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê vì đều có cùng hạng a nhƣng có sự khác biệt đối với nghiệm thức tại nồng độ 1% Formalin (53,34b ± 14,89). Qua đó, ngƣời thực đề tài nhận thấy hợp chất thứ cấp prodigiosin chứa trong dịch sau lên men của S. marcescens HB có thể không bị ảnh hƣởng khi xử lý Formalin tại nồng độ thấp ở mức 0,125%, 0,25%, 0,5 và 0,75%. Với mục đích chọn ra phƣơng pháp xử lý tế bào hiệu quả, đảm bảo không ảnh hƣởng đến hợp chất thứ cấp prodigiosin có trong canh trƣờng sau lên men của chủng vi khuẩn S.marcscens HB. Dựa trên tất cả các kết quả xử lý tế bào vừa thu đƣợc. Ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy, ở phƣơng pháp xử lý bằng Formalin với nồng độ thấp trong khoảng từ 0,5% đến 0,75% trong 30 phút cho kết quả xử lý tế bào hiệu quả cao mà không ảnh hƣởng nhiều đến hợp chất prodigiosin sau khi xử lý. Nhƣng xét về bản chất, Formalin là một chất có tính độc cho nên ngƣời thực hiện sẽ chọn tại nồng độ xử lý thấp nhất tại nồng độ 0,5% vì có khả năng tiêu diệt tế bào S.marcescens HB mà vẫn không ảnh hƣởng đến lƣợng prodigiosin có trong dịch sau lên men, làm tiền đề tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 56
  70. Đồ án tốt nghiệp 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào của dịch nuôi cấy Serratia marcescens HB sau khi xử lý tế bào. Ngoài prodigiosin là tác nhân gây chết côn trùng thì enzyme Serralysin metalloprotease cũng đƣợc coi là yếu tố độc lực của S. marcescens trên sâu vì vậy dịch nuôi cấy phải thể hiện hoạt tính này. 3.3.1. Thử nghiệm hoạt tính protease Sau quá trình ủ, khả năng phân giải gelatin của vi sinh vật bằng Trichloroacetic acid (TCA). Gelatin sẽ tác dụng với TCA tạo thành phức hợp tủa có màu trắng đục do enzyme protease có mặt trong canh trƣờng lên men vi khuẩn, enzyme này phân giải gelatin trong môi trƣờng nên TCA tạo phức với gelatin.Vùng có sự phân giải gelatin sẽ trong suốt vì không có phức hợp tủa giữa gelatin với TCA 10% Kết quả khi tiến hành trên môi trƣờng gelatin thì tất cả các nồng độ đều có khả năng phân giải. Xung quanh vòng phân giải là phức hợp TCA 10% – gelatin trắng đục dễ dàng nhận thấy. 3.3.2. Thử nghiệm hoạt tính chitinase Tiến hành thí nghiệm trên môi trƣờng huyền phù chitin 1%, kết quả cho thấy có sự xuất hiện vòng phân giải trong suốt xung quanh giếng thạch khi cho thuốc thử lugol vào. Điều này chứng tỏ rằng chủng Serratia marcescens HB vẫn có khả năng tạo ra enzyme chitinase và còn khả năng thể hiện hoạt lực enzyme sau quá trình xử lý bằng Formalin với nồng độ 0,5%. 57
  71. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Kết quả enzyme ngoại bào còn lại trong canh trƣờng lên men sau xử lí 0,5% Formalin . Đƣờng kính vòng phân giải (D-d) mm trên môi Hệ sô pha STT trƣờng tƣơng ứng loãng Gelatin agar Chitin agar 1 21 15,33b ± 0,577 14,33a ± 3,055 2 22 15,33b ± 0,577 12,66ab ± 2,08 3 23 11,33c ± 1,527 8,66bc ± 3,211 4 24 8,33c ± 0,577 8bc ± 5,190 5 25 6d ± 0 6,67c ± 0,577 6 26 5,66 d ± 4,041 5,33c ± 0,577 7 ĐC (+) 20,67a ± 4,0 15,33a ± 0,577 Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát định tính các enzyme ngoại bào gồm: protease và chitinase. Kết quả cho thấy việc bổ sung Formalin với nồng độ 0,5% vào canh trƣờng sau lên men vẫn giữ đƣợc hoạt tính của enzyme chitinase nhƣng hoạt tính protease bị ảnh hƣởng. Bảng kết quả đƣợc xử lý thống kê theo cột cho thấy hoạt tính enzyme protase đều bị ảnh hƣởng, tại hệ số pha loãng 21 và 22 đều ở mức 15,33b ± 0,577 (mm) so với đối chứng dƣơng chứa dịch vi khuẩn không xử lý đạt 20,67a ± 4,0 (mm). Bên cạnh đó, hoạt tính enzyme chitinase theo nhƣ kết quả xử lý cho thấy không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa đƣờng kính vòng phân giải ở hệ số pha loãng 21 (14,33a ± 3,055 ) mm so với mẫu đối chứng dƣơng (15,33a ± 0,577) mm. 58
  72. Đồ án tốt nghiệp 3.5. Ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở các nồng độ phụ gia khảo sát. Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp quét lá với các nồng độ chất phụ gia khác nhau để xác định giá trị nào diệt sâu tốt nhất. Tiến hành thí nghiệm với 1 đối chứng dƣơng là thuốc trừ sâu sinh học Reasgant 3.6EC với nồng độ hoạt chất Abamectin sử dụng là 1 mg/cm2 và 1 đối chứng âm là môi trƣờng PG broth có bổ sung 0,5% Formalin cùng 5 nghiệm thức chế phẩm ở các nồng độ phụ gia và điều kiện bảo quản nhƣ sau: Công thức 1: 0.2% CMC + 0.2% Rỉ đƣờng + 0.04% Tween 80 (phơi nắng) Công thức 2: 0.2% CMC + 0.4% Rỉ đƣờng + 0.04% Twen 80 (phơi nắng) Công thức 3: 0.2% CMC + 0.2% Rỉ đƣờng + 0.08% Tween 80 (phơi nắng) Công thức 4: 0.2% CMC + 0.4% Rỉ đƣờng + 0.08% Tween 80 (phơi nắng) Công thức 5: 0.2% CMC + 0.2% Rỉ đƣờng + 0.04% Tween 80 (không phơi nắng) Theo dõi số lƣợng sâu sống sau mỗi ngày trong vòng 6 ngày. Ngoài hoạt chất diệt sâu là prodigiosin thì chế phẩm đƣợc bổng sung phụ gia trong đó có rỉ đƣờng, CMC và Tween 80 giúp nâng cao khả năng kháng sâu. Bổ sung CMC giúp tăng độ kết bám của chế phẩm lên trên lá, giảm thất thoát prodigiosin. Bên cạnh đó, rỉ đƣờng kích thích khẩu vị của sâu giúp sâu ăn ngon miệng nên sâu ăn nhiều hấp thu lƣợng prodigiosin lớn trên bề mặt lá. Đồng thời rỉ đƣờng còn là chất che giúp bảo vệ prodigiosin dƣới tác động của ánh sáng, đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu dễ gây biến tính prodigion ngoài tự nhiên. Khi sâu khoang tiêu hóa chế phẩm, lƣợng Tween 80 bổ sung vào trong chế phẩm giúp prodigiosin khuếch tán tốt vào cơ thể sâu, ngoài ra còn có các enzyme ngoại bào nhƣ protease giúp cho hoạt chất prodigiosin hoạt động tốt và gây chết sâu nhanh hơn. 59
  73. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5. Hiệu lực diệt sâu khoang tuổi 3 Hình 3.11. Hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura của chế phẩm với các nồng độ phụ gia theo thời gian theo công thức Abbott (1925). 60
  74. Đồ án tốt nghiệp Kết quả sau khi xử lý thống kê cho thấy tỷ lệ phụ gia ở công thức 5: 0.2% CMC + 0.2% Rỉ đƣờng +0.04% Tween 80 (không phơi nắng) cho kết quả kháng sâu tốt nhất đạt 100% sau 3 ngày thử nghiệm tƣơng đƣơng với khả năng diệt sâu của thuốc trừ sâu sinh học Reasgant 3.6EC. Mặc dù, dịch lên men ở tất cả các nghiệm thức đều có cùng nồng độ pha loãng 104 nhƣng với tỷ lệ phối trộn phụ gia và đƣợc bảo quản trong điều kiện khác nhau thì hoạt lực diệt sâu thể hiện khác nhau. Chẳng hạn, ở công thức 1 (CT1) so với công thức 5 (CT5) thì không có sự khác biệt về thành phần phụ gia nhƣng khác nhau về phƣơng thức bảo quản. Kết quả cho thấy, tuy sau 1 ngày CT1 và CT5 hiệu lực diệt sâu đều bằng nhau, nhƣng sau 2 ngày thì bắt đầu có sự khác biệt rõ rệt về mặt ý nghĩa thống kê giữa hai công thức này. Ở các công thức còn lại, hoạt lực diệt sâu sau 5 ngày nằm ở mức tƣơng đối từ 70% trở lên. Do chế phẩm bảo quản trong điều kiện dƣới ánh nắng trực tiếp ngoài trời nên có thể phần lớn hoạt lực của hợp chất thứ cấp prodigiosin bị biến tính. So sánh công thức 2 (CT2) với công thức 4 (CT4), tỷ lệ sâu chết sau 5 ngày có sự khác biệt thống kê thề hiện ở giá trị 70,0c ± 0,13 (%) ở công thức 2 và 83,0b ± 0,07 (%) ở công thức 4 cho nên việc bổ sung gấp đôi lƣợng Tween ở công thức 4 là có ý nghĩa. Bên cạnh đó, công thức 1 (CT1) và công thức 3 (CT3) kết quả diệt sâu sau 24 giờ đến sau 5 ngày không có sự khác biệt mặc dù có cùng tỷ lệ rỉ đƣờng và điều kiện bảo quản ngoài sáng. Do đó, ngoài việc sử dụng rỉ đƣờng làm chất che chắn ánh sáng cần phải tìm một phƣơng pháp bảo vệ hợp chất prodigiosin trong chế phẩm hữu hiệu hơn. 61
  75. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12 Sâu khoang chết sau khi thử nghiệm chế phẩm 3.6. Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm có lợi Trichoderma sp và Paecilomyces lilacinus đƣợc xác định là hai chủng nấm có lợi, chúng có khả năng đối kháng các loại nấm bệnh và tuyến trùng gây hại, giúp nâng cao sự sinh trƣởng và phát triển của cây trồng. Với mục tiêu khảo sát mức độ ảnh hƣởng của chế phẩm dịch nuôi cấy Serratia marcesens đối với các chủng vi nấm có lợi trong tự nhiên, từ đó làm cơ sở đánh giá tính an toàn của chế phẩm. Kết quả đối kháng đƣợc thể hiện ở các bảng 3.6 và 3.7. Bảng 3.6. Tỷ lệ ức chế nấm Trichoderma sp. Khả năng kháng nấm Trichderma sp. Nghiệm thức pha loãng Đƣờng kính vòng Tỷ lệ ức chế (%) nấm (mm) 104 lần 51.6 ± 4,7 7,8 ± 0,8b Đối chứng âm 56 ± 3,6 0 Đối chứng dƣơng – Daconil 1,5 g/l 0 100a 62
  76. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7. Tỷ lệ ức chế nấm Paecilomyces lilacinus. Khả năng kháng nấm Paecilomyces lilacinus Nghiệm thức pha loãng Đƣờng kính vòng Tỷ lệ ức chế (%) nấm (mm) 104 lần 35 ± 5 23,5 ± 1,4b Đối chứng âm 46,6 ± 10,4 0 Đối chứng dƣơng –Daconil 1,5 g/l 0 100a Dựa trên chỉ tiêu đánh giá ảnh hƣởng của thuốc đƣợc đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989) thì tỉ lệ kháng nấm của dịch nuôi cấy sau xử lý Formalin với nấm Trichoderma sp. Điều này chứng tỏ chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens có thể đƣợc sử dụng đồng thời cùng chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma sp., nấm có lợi trong việc hổ trợ sự phát triển của cây trồng và tăng khả năng diệt trừ các loại côn trùng gây hại, cạnh tranh với các loại nấm gây hại cây trồng. Tuy nhiên chế phẩm này có thể ức chế nấm Trichoderma sp.,. ở nồng độ khảo sát 104 với tỷ lệ kháng là 7,8 ± 0,8b (%) ≤ 50(%) ở cấp độ 1 đƣợc xem là không kháng. Kết quả thí nghiệm cho thấy ở nồng độ khảo sát, nấm Paecilomyces lilacinus với đƣờng kính vòng nấm 35± 5 (mm), tỉ lệ ức chế 23,5 ± 1,4 (%) ≤ 50(%) ở cấp độ 1 đƣợc xem là không kháng. Điều này chứng tỏ chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S.marcescens có thể đƣợc sử dụng đồng thời cùng chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma sp. và Paecilomyces lilacinus. 63
  77. Đồ án tốt nghiệp 3.8. Quy trình sản xuất chế phẩm chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB. Từ những kết quả đạt đƣợc, ngƣời thực hiện đề tài tiến hành thiết lập sơ đồ công nghệ sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB đƣợc đề xuất nhƣ sơ đồ hình 3.14. Vi khuẩn Serratia marcescens HB Nuôi cấy trong môi trƣờng PG vô trùng (V = 20 ml , lắc 150 vòng/phút ở 250C, 48h 0 ) Tiêu diệt tế bào 100 µl dung dịch (t = 30 phút) Formalin Pha loãng 20 lần điều chỉnh OD Nƣớc vô trùng 499nm về 0,5 (V1 = 400 ml) 8 kg CMC, 1,6 lít Pha loãng tiếp đến 100 lần bằng Tween 80, 8 kg rỉ đƣờng PG vô trùng (V2 = 40 lít) Phối trộn phụ gia Chế phẩm Hình 3.14. Sơ đồ sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB đã xử lý tế bào. 64
  78. Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn Serrastia marcescens HB đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng PG với 0 thể tích dịch nuôi cấy V0 = 20ml ở nhiệt độ 25 C, trên máy lắc 150 vòng / phút để tạo độ khuếch tán oxy tốt cho vi khuẩn phát triển sinh tổng hợp prodigiosin trong 48 giờ. Tiêu diệt tế bào vi khuẩn để đảm bảo tính an toàn sinh học bằng cách xử lý Formalin với nồng độ 0,5% trong thời gian 30 phút. Tiến hành pha loãng 20 lần bằng nƣớc vô trùng nhằm điều chỉnh giá trị OD 499nm của dịch nuôi cấy đã xử lý tế bào về 0,5.Thể tích dịch lúc này là 400 ml (V1=400 ml). Tiếp tục pha loãng 100 lần nữa và bổ sung các chất phụ gia đã tiệt trùng bao gồm: 8 kg CMC, 1,6 kg Tween 80 và 8 kg rỉ đƣờng. Chế phẩm thu đƣợc có thể tích là V2= 40 l, đƣợc chiết rót và đóng chai với dung tích 100ml. Khi sử dụng cần pha loãng thêm 100 lần để prodigiosin đạt hiệu lực diệt sâu tốt nhất. 65
  79. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 . Kết luận Chủng HB có khả năng sinh tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào tƣơng đƣơng chủng SH1 đƣợc sử dụng sản xuất chế phẩm. Xử lý dịch nuôi cấy S.marcescens HB bằng biện pháp dùng Formalin ở nồng độ 0,5% tiêu diệt toàn bộ tế bào, không ảnh hƣởng đến nồng độ prodigiosin mà vẫn giữ đƣợc hoạt tính enzyme ngoại bào chitinase của chủng. Chế phẩm sau khi thử nghiệm trên các chủng nấm đối kháng có lợi đều cho thấy không có khả năng ức chế các chủng nấm khảo sát: dịch có khả năng kháng cao nhất là 23,5% đối với nấm Paecilomyces lilacinus và thấp nhất là 7,8% đối với Trichoderma sp. Hiệu quả diệt sâu của dịch nuôi cấy pha loãng 20 lần (OD 499nm = 0,5) và pha loãng tiếp đến 104 lần khi bổ sung phụ gia 0,2% CMC, 0,2% rỉ đƣờng, 0,04% Tween 80 bảo quản trong tối thể hiện hoạt tính diệt sâu 100% sau 96 giờ, tƣơng đƣơng với hoạt chất Abamectin của thuốc trừ sâu sinh học Reasgant 3.6EC. 4.2 . Kiến nghị - Tiếp tục khảo sát để tìm ra phƣơng pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens đảm bảo tính an toàn sinh học và hiệu quả cao. - Khảo sát điều kiện bảo quản chế phẩm phù hợp mà không làm ảnh hƣởng đến hoạt tính của chế phẩm. - Tìm chất bảo vệ prodigiosin trong chế phẩm khỏi sự ảnh hƣởng của ánh sáng một cách hiệu quả. - Mở rộng đối tƣợng thử nghiệm của chế phẩm: côn trùng gây hại mùa màng (rệp, bọ xít, sâu đục thân, vv) , côn trùng gây hại cho sức khỏe con ngƣời (muỗi vằn, ), - Mở rộng thí nghiệm trên qui mô lớn, trên đồng ruộng. Khảo sát thời gian và hiệu lực bảo quản của chế phẩm để bảo quản chế phẩm đƣợc lâu dài. 66
  80. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trần Văn Mão (2002). Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích. Tập II. Hà Nội. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Nguyễn Hoàng Anh Kha (2013) Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng hợp bởi vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN, Đồ án tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Công nghệ TP. HCM. Nguyễn Hoài Hƣơng, Nguyễn Hoàng Anh Kha (2015) Khả năng diệt sâu khoang Spodoptera litura của vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN và hợp chất thứ cấp prodigiosin của vi khuẩn này, Tạp chí phát triển KH & CN, tập 18. Lê Quốc Vũ (2015) Khảo sát hiệu lức diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S-XT và H-CP16 trên sâu xanh da láng Spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng, đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học Công nghệ TP.HCM. Nguyễn Hoài Hƣơng, Nguyễn Hoàng Anh Kha, Nguyễn Hiếu Dân, Nguyễn Thị Hai (Phân lập vi khuẩn từ tuyến trùng EPN và khảo sát độc lực của chúng trên sâu Spodoptera litura), Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốckhu vực phía nam lần III-2013. Nguyễn Hoài Hƣơng, Trƣơng Hoài Nguyên, Hồ Trung Lộc (2018) Sản xuất chế phẩm diệt sâu tơ Plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH4. Hội nghị Khoa học HUTECH 2018. Lê Thị Ngọc Dung (2016) Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1, đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học Công nghệ TP.HCM. 67
  81. Đồ án tốt nghiệp Trƣơng Hoài Nguyên (2017) Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ Plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcesceens SH4, đồ án tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Công nghệ TP.HCM. Bộ y tế (9/2012) Hướng dẫn khử khuẩn, tiệt khuẩn dụng cụ trong các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh. Tài liệu nƣớc ngoài Anuradha V Giri et al (2004), A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil, BMC Microbiology 2004, 4:11. Anita Khanafari, Mahnaz Mazaheri Assadi and Fatemeh Ahmadi Fakhr (2006), Review of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens, Online Journal of Biological Sciences 6 (1): 1-13, 2006. Biological Sciences 6 (1): 1-13, 2006. Cang S., Sanada M., Johdo O., Ohta S., Nagamatsu Y., Yoshimoto A. (2000). High production of prodigiosin by Serratia marcescens grown on ethanol, Biotechnol Lett, 22:1761-1765. Chidambaram Kulandaisamy et al (2009), An Insightful Overview on Microbial Pigment, Prodigiosin, Electronic Journal of Biology, 2009, Vol. 5(3): 49- 61. Giri, A. V., Anandkumar, N., Muthukumaran, G. and Pennathur, G. (2004). A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil. BMC Microbiology 4: 1- 10. Grimont, P.A.D., Grimont, F., Irino, K.1982a. Biochemical characterization of Serratia liquefaciens sensu stricto, Serratia proteamaculans, and Serratia grimesiisp. nov.Current Microbiology 7:69–74. 68
  82. Đồ án tốt nghiệp Grimont, P.A.D., Grimont, F., Lysenko, O. 1979b. Species and biotype identification of Serratiastrainsassociated with insects.Current Microbiology 2:139–142. Grimont, P.A.D., Grimont, F., Richard, C., Davis, B.R., Steigerwalt, A.G., Brenner, D.J. 1978a. Deoxyribonucleic acid relatedness between Serratia plymuthica and other Serratia specieswith a description of Serratia odorifera sp. Hejazi, A. and Falkiner, F. R. (1997). Serratia marcescens. Journal of Medical Microbiology 46, 903-912. Hubbard, R. and Rimington, C. (1950). The biosynthesis of prodigiosin, the, tripyrrylmethene pigment from Bacillus prodigiosus (Serratia marcescens). Biochemical Journal 46: 220-225. Helvia W. Casullo de Araújo, K. Fukushima, and Galba M. Campos Takaki (2010), Prodigiosin Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using RenewableResources as a Low Cost Substrate, Molecules 2010, 15, 6931-6940. Hyung Wook Jeong, Hye Yeon Mun, Hyung Keun Oh, Seung Bum Kim, Kwang Yeol Yang, Iksoo Kim, and Hyang Burm Lee, Evalutation Evaluation of Insecticidal Activity of a Bacterial Strain, Serratia sp. EML-SE1 against Diamondback Moth, 2010, Vol. 48, No. 4, pp. 541-545. Jatala, P.1986. Biological control of plant parasitic nematodes. - Ann.Rev.Phytopath. 24: 453-489. Kamble K.D, Hiwarale V.D (2012), Prodigiosin production from Serratia marcescens strains obtained from farm soil, INTERNATIONAL JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCES Volume 3, No 1, 2012. Khanafari A., Assadi M.M. and Fakhr F.A. (2006). Review of prodigiosin, pigmentation in Serratia marcescens, Online J Biol Sci, 6: 1-13. Kenichi Ishii, Tatsuo Adachi, Takashi Hara, Hiroshi Hamamoto, Kazuhisa Sekimizu (2014), Identification of a Serratia marcescens virulence factor that 69
  83. Đồ án tốt nghiệp promotes hemolymph bleeding in the silkworm, Bombyx mori, Journal of Invertebrate Pathology 117 (2014) 61–67. Krishna J.G. (2008) Pigment production by marine Serratia sp. BTWJ8, PhD dissertation, Microbial Technology Laboratory, Department of Biotechnology Cochin University of Science and Technology, Kerala, India. Lapenda Lins et al (2014), Production and toxicological evaluation of Prodigiosin from Serratia marcescens UCP/WFCC1549 on Mannitol Solid Medium, International Journal of Applied Research in Natural Products, Vol. 7 (2), pp. 32-38. Lewis S.M., Corpe W.A. (1964). Prodigiosin producing bacteria from marine sources, Appl Microbiol, 12: 13-17. Mekhael, R., Yousif, S. Y. (2009). The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent. Journal of Duhok University12: 268-274. OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS, Fish Acute Toxicity Test 203, 1992. Qadri S.M.H. and Williams R.P. (1972). Induction of Prodigiosin Biosynthesis after Shift-Down in Temperature of Nonproliferating Cells of Serratia marcescens, Appl. Microbiol, 23: 704-709. Ramina M. và Samira Y.Y. (2009). The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent, University of Duhok, vol 12: 268- 274. SamsonR. A. (1974) Paecilomyces and some allied Hyphomycetes, Studies in Mycology, 1 –199. Vijayalakshmi et al (2016), Production of Prodigiosin from Serratia marcescens and its antioxidant and anticancer potential, International Journal of Advanced Research in Biological Sciences Volume 3, Issue 3 – 2016, 3(3): 75 – 88. 70
  84. Đồ án tốt nghiệp Zong Qi Liang , Yan Feng Han, Hua Li Chu and Ai Ying Liu (2005).Studies on the genus Paecilomyces in China. 71
  85. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG 1. Môi trƣờng Peptone Glycerol Agar (PGA) Peptone 5,00 gram/lít Glycerol 10,00 ml/lít Agar 18,00 gram/lít 2. Môi trƣờng Peptone Glycerol Broth Peptone 5,00 gram/lít Glycerol 10,00 gram/lít 3. Môi trƣờng Potato Dextro Agar Khoai tây 200,00 gram/lít Glucose 10,00 gram/lít Agar 20,00 gram/lít 4. Thành phần môi trƣờng gelatin agar Gelatin 10,00 gram/lít Agar 15,00 gram/lít 5. Thành phần môi trƣờng dịch huyền phù chitin Dịch huyền phù chitin 1% 100ml Agar 1,50 g Chuẩn bị dịch huyền phú chitin 1% theo phƣơng pháp của Dai et al., (2011) Do đặc tính của chitin không tan trong nƣớc nên để tiến hành xác định hoạt tính của enzyme chitinase cần huyền phù chitin. Lấy 1g chitin hòa tan trong 20ml HCl đậm đặc đặc khuấy đều và để ở 40C qua đêm. Thêm vào hỗn hợp 200ml ethanol lạnh (-100C) khuấy đều thật nhanh và ủ 72