›

Đồ án Nghiên cứu mã vạch di truyền cá Tra (Pangasianodon hypopthalmus) bằng chỉ thị sinh học phân tử cytochrome b

pdf 64 trang thiennha21 12/04/2022 4370
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu mã vạch di truyền cá Tra (Pangasianodon hypopthalmus) bằng chỉ thị sinh học phân tử cytochrome b", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_ma_vach_di_truyen_ca_tra_pangasianodon_hypo.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu mã vạch di truyền cá Tra (Pangasianodon hypopthalmus) bằng chỉ thị sinh học phân tử cytochrome b

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MÃ VẠCH DI TRUYỀN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPTHALMUS) BẰNG CHỈ THỊ SINH HỌC PHÂN TỬ CYTOCHROME B Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: ThS. Trần Nguyễn Ái Hằng SVTH: Huỳnh Long Anh MSSV: 1151110052 Lớp: 11DSH01 TP.HCM, tháng 8/ 2015
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MÃ VẠCH DI TRUYỀN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPTHALMUS) BẰNG CHỈ THỊ SINH HỌC PHÂN TỬ CYTOCHROME B Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: ThS. Trần Nguyễn Ái Hằng SVTH: Huỳnh Long Anh MSSV: 1151110052 Lớp: 11DSH01 TP.HCM, tháng 8/ 2015
  3. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do bản thân thực hiện và không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trong đề tài có nguồn gốc rõ ràng, tuân thủ đúng nguyên tắc. Kết quả trình bày trong đề tài được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực và chưa từng được công bố trước đây. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung khoa học của đề tài nghiên cứu này. TP.Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện đồ án Huỳnh Long Anh i
  4. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng LỜI CẢM ƠN Không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt quá trình thực tập và nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu mã vạch di truyền cá Tra (Pangasianodon hypopthalmus) bằng chỉ thị sinh học phân tử cytochrome b” đến nay, em đã nhận rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Quý Thầy Cô, gia đình, anh, chị, bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi đến Quý Thầy Cô của trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM nói chung, các Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường nói riêng đã tận tình dạy dỗ, giúp em hoàn thiện kiến thức, các kỹ năng chuyên môn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập. Em xin gửi đến Ths. Trần Nguyễn Ái Hằng, Ths. Bùi Thị Liên Hà, kỹ sư Lê Ngọc Thùy Trang cùng các anh chị của phòng thí nghiệm Di truyền phân tử, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II lời cảm tạ sâu sắc vì đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt em trong suốt quá trình thực tập và nghiên cứu đề tài. Xin cảm ơn toàn thể các bạn trong lớp 11DSH01 đã đóng góp ý kiến, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Lời cảm ơn con xin gửi đến Ba Mẹ và gia đình thân yêu đã luôn yêu thương, đùm bọc con, là điểm tựa vững chắc và niềm tin của con trong suốt cuộc đời. Bước đầu đi vào thực tế tìm hiểu nghiên cứu khoa học, kiến thức của em còn nhiều hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót, kính mong nhận được sự góp ý của Quý Thầy Cô để kiến thức của chúng em ngày càng hoàn thiện hơn và rút ra được những kinh nghiệm bổ ích cho quá trình học tập và làm việc sau này. Xin kính chúc các thầy cô của trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý của mình. Đồng kính chúc các Thầy Cô, anh chị của phòng thí nghiệm Di truyền phân tử, Viện Nghiên ii
  5. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II luôn dồi dào sức khỏe và đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong cuộc sống. TP.Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện đồ án Huỳnh Long Anh iii
  6. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về cá Tra (Pangasianodon hypophthamus) 3 1.1.1. Vị trí phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm chung 3 1.1.2.1. Đặc điểm sinh học 3 1.1.2.2. Đặc điểm sinh thái và môi trường sống 3 1.1.2.3. Đặc điểm sinh trưởng 4 1.1.2.4. Đặc điểm sinh sản 4 1.1.3. Tình hình nuôi và thương mại cá Tra ở Việt Nam 5 1.2. Các phương pháp định danh cá da trơn 7 1.3. Phân loại bằng sinh học phân tử (barcoding) 9 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu . 12 2.1. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 12 2.1.1. Hóa chất thí nghiệm 12 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 12 2.2. Hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR 13 2.3. Hóa chất sử dụng để chạy điện di 13 2.4. Phương pháp nghiên cứu 15 iv
  7. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 2.4.1. Phương pháp thu mẫu 15 2.4.1.1. Mẫu cá Tra 15 2.4.1.2. Mẫu cá da trơn khác 15 2.4.2. Phương pháp định danh 15 2.4.2.1. Phương pháp định danh bằng hình thái 15 2.4.2.2. Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử 17 2.4.3. Phương pháp thu và bảo quản mẫu phục vụ cho PCR 17 2.4.4. Phương pháp chạy PCR 18 2.4.4.1. Khái niệm 18 2.4.4.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR 20 2.4.5. Phương pháp tách chiết DNA 23 2.4.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 25 2.4.6.1. Chuẩn bị agarose gel 25 2.4.6.2. Đặt mẫu DNA vào giếng 25 2.5. Bố trí thí nghiệm 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. Thu mẫu cá Tra và các loài cá da trơn khác 28 3.2. Định danh bằng hình thái học 28 3.2.1. Định danh cá Tra tự nhiên (Pangasius hypophthalmus) 29 3.2.2. Định danh cá Hú (Pangasius conchophilus) 31 3.2.3. Định danh cá Basa (Pangasius bocourti) 32 3.2.4. Định danh cá Vồ Đém (Pangasius larnaudiei) 33 3.2.5. Định danh cá Xác Sọc (Pangasius macronemus) 35 3.2.6. Định danh cá Bông Lau (Pangasius krempfi) 36 3.2.7. Định danh cá Vồ Cờ (Pangasius sanitwongsei) 38 v
  8. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 3.3. Kết quả tách chiết DNA 40 3.3.1. Mẫu cá Tra chọn giống của Viện II 40 3.4. Định danh bằng sinh học phân tử 41 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi cytochrome b 41 3.4.2. Thí nghiệm 2: Kiểm định tính ổn định của phản ứng PCR 42 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát kích thước sản phẩm PCR của cá Tra và 6 mẫu cá da trơn 43 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1. Kết luận 45 4.2. Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 vi
  9. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ▪ bp : Base pair ▪ cm : Centimet ▪ Cyt b : Cytochrome b ▪ dNTP : Deoxynucleotide triphosphate ▪ DNA : Deoxyribonucleic acid ▪ ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long ▪ EDTA : Ethylene diaminetetra acetic acid ▪ µg : Microgam ▪ µM : Micromol/lít ▪ mM : Milimol/lít ▪ Kb : Kilobases ▪ TBE : Tris – borate-EDTA ▪ TE : Tris-EDTA ▪ Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp) ▪ RNA : Ribonucleic acid ▪ U : Đơn vị tính hoạt tính của Taq ▪ UV : Ultra Violet vii
  10. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Chỉ tiêu định danh hình thái 16 Bảng 2.2: Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR 22 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 22 Bảng 2.4: Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA 24 Bảng 3.1: Số lượng và kí hiệu mẫu cá 28 Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 41 Bảng 3.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 42 viii
  11. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) 3 Hình 1.2: Ty thể mtDNA 9 Hình 2.1: Thang chuẩn 1kp 14 Hình 2.2: Thang chuẩn 50 bp 14 Hình 2.3: Phản ứng PCR 21 Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách chiết DNA 23 Hình 2.5: Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel 26 Hình 2.6: Sơ đồ quy trình nghiên cứu 27 Hình 3.1: Cá Tra 29 Hình 3.2:Bong bong kéo dài qua lỗ hậu môn 30 Hình 3.3:Răng khẩu cái và răng lá mía nối với nhau thành hình vòng cung 30 Hình 3.4: Cá Hú 32 Hình 3.5: Cá Basa 33 Hình 3.6: Cá Vồ đém 34 Hình 3.7:Cá Xác sọc 36 Hình 3.8: Cá Bông lau 37 Hình 3.9: Cá Vồ cờ 39 Hình 3.10: Kết quả chạy điện di trên gel của mẫu cá Tra chọn giống của Viện Thủy sản II. 40 Hình 3.11: Kết quả tối ưu phản ứng PCR 41 ix
  12. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Hình 3.12: Kết quả chạy điện di 43 Hình 3.13: Kết quả điện di 7 mẫu cá da trơn 44 x
  13. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cá Tra là đối tượng chủ lực của Việt Nam với sản lượng xuất khẩu không ngừng tăng lên trong thời gian qua. Do hiệu quả kinh tế và nhu cầu tiêu dùng cá Tra, nhiều nước trong khu vực cũng đã xác định cá Tra là đối tượng quan trọng trong nuôi trồng thủy sản. Bên cạnh cá Tra, các loại cá da trơn như: cá Bông Lau, cá Hú, cá Xác Sọc, cá Vồ Đém, cá Vồ Cờ, cá Basa, cũng được xem là đối tượng nuôi trồng tiềm năng. Tuy nhiên, việc phân loại các loài cá này bằng phương pháp phân loại bằng hình thái gặp khá nhiều khó khăn. Phương pháp này đòi hỏi mẫu vật phải còn nguyên hình dạng hay nói cách khác là phải còn nguyên cả con, điều này sẽ rất bất tiện trong nhiều trường hợp. Thêm vào đó, sự lai tạp giữa các loài trong cùng giống hoặc cùng họ sẽ dẫn đến nhiều khó khăn trong việc phân loại bằng hình thái. Khắc phục những nhược điểm của phương pháp phân loại dựa vào hình thái, phương pháp định dạng sinh học phân tử (barcoding) được sử dụng trong một mức độ rộng, việc tạo ra DNA mã vạch ra cho mỗi loài cần được cung cấp một chìa khóa để định nghĩa các mẫu chưa biết. Trình tự mã vạch được tìm thấy từ cơ thể cá, cá khúc, vây, cá bột, trứng và ấu trùng từ bất cứ mẫu vật nào có thể tìm thấy với trình tự trong BOLD để thực hiện được mục đích này, gen ty thể (COI, cytochrome b, ) là những chỉ thị đầy triển vọng cho định danh các loài và đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu DNA mã vạch. Ngoài ra khi thị trường toàn cầu cho ngành thủy sản và các sản phẩm nuôi trồng thủy sản được mở rộng, dán nhãn sai của các sản phẩm này đã trở thành một mối quan tâm ngày càng tăng trong lĩnh vực an toàn thực phẩm. Kỹ thuật nhận dạng các loài cá Tra bằng phương pháp sinh học phân tử giữ tiềm năng, đánh giá chính xác nhanh chóng các dán nhãn sản phẩm trên thị trường thế giới. Do đó đề tài: “Nghiên cứu mã vạch di truyền cá Tra (Pangasianodon hypopthalmus) bằng chỉ thị sinh học phân tử cytochrome b”giúp giải quyết những khó khăn trên. 1
  14. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 2. Mục tiêu nghiên cứu Phân loại chính xác cá Tra (P. hypophthalmus). Xác định được bộ chỉ thị phân tử cytochrome b nhằm kiểm định cá Tra (P. hypophthalmus) có độ tin cậy > 95%. 3. Nội dung nghiên cứu Thu mẫu cá Tra và các loài cá da trơn khác thuộc họ cá Tra. Định danh bằng hình thái học. Định danh bằng sinh học phân tử. Tối ưu phản ứng PCR. Kiểm định tính ổn định của phản ứng PCR. Bước đầu thử nghiệm định danh trên cá Tra. 4. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Đồ án gồm các chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chương 3: Kết quả và thảo luận. Chương 4: Kết luận và kiến nghị. 2
  15. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cá Tra (Pangasius hypophthamus) 1.1.1. Vị trí phân loại Giới: Animalia Ngành: Chordata Phân ngành: Vertebrata Lớp: Actinopterygii Hình 1.1: Cá Tra Pangasius Phân lớp: Neopterygii hypophthalmus Bộ: Siluriformes Họ: Pangasiidae Chi: Pangasianodon Loài: Pangasianodon hypophthalmus 1.1.2. Đặc điểm chung 1.1.2.1. Đặc điểm sinh học Cá Tra là cá da trơn, thân dài, dẹp ngang, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng, đầu nhỏ vừa phải, mắt tương đối to. Vây lưng cao, có một gai cứng có răng cưa. Vây ngực có ngạnh, bụng có 8 tia phân nhánh, trong khi các loài khác có 6 tia. Cá Tra có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các loài cá khác. Cá có cơ quan hô hấp phụ và còn có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy hòa tan. Họ cá Tra (Pangasiidae) thuộc bộ cá da trơn hay cá nhéo (silurformes), phân bố tương đối rộng từ Tây Nam Á và bao gồm một số loài có kích thước lớn. Các loài cá thuộc họ Pangasiidae được nhiều khoa học trên thế giới quan tâm từ rất lâu do thịt ngon và đặc biệt có giá trị kinh tế cao. 1.1.2.2. Đặc điểm sinh thái và môi trường sống Cá có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, oxy hòa tan thấp, có thể nuôi với mật độ cao và có thể sống được ở vùng nước lợ (nồng độ muối 15oC, nhưng chịu nóng tới 39oC. 3
  16. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Cá Tra phân bố tự nhiên ở lưu vực sông Mê Kông và được coi là cá bản địa của Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan. Ở Việt Nam, cá bột và cá giống vớt được chủ yếu trên sông Tiền, cá trưởng thành thấy nhiều trong các ao nuôi và ít khi tìm thấy trong tự nhiên. Cá Tra có thân dài, không vẩy, màu sắc đen xám trên lưng, bụng hơi bạc, miệng rộng và có 2 đôi râu dài. Cá sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể chịu đựng được nước phèn với pH >= 5, ít chịu đựng được nhiệt độ thấp dưới 15oC nhưng có thể chịu nóng tới 39oC. 1.1.2.3. Đặc điểm sinh trưởng Cá Tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, lúc còn nhỏ cá tăng nhanh về chiều dài. Cá ương trong ao sau 2 tháng đạt chiều dài từ 10 – 12 cm, có khối lượng khoảng 14 – 15 g. Từ khoảng 2,5 kg trở đi, mức tăng trọng lượng nhanh hơn nhiều so với chiều dài cơ thể. Cá nuôi trong ao 1 năm đạt từ 1 - 1,5 kg/con (năm đầu), những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, có khi đạt tới 5 - 6 kg/năm tuỳ thuộc môi trường sống và sự cung cấp thức ăn cũng như loại thức ăn có hàm lượng đạm nhiều hay ít. Cá con thích ăn mồi tươi sống, có thể ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp. Khi lớn cá Tra ăn tạp, thiên về động vật và dễ chuyển đổi thức ăn. Trong ao nuôi, cá Tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn, kể cả thức ăn bắt buộc như: mùn, bã hữu cơ, cám, rau, phân hữu cơ, động vật đáy, do vậy khi nuôi trong ao, năm đầu tiên cá có thể đạt 1 – 1,5 kg/con, những năm tiếp theo cá tăng trọng nhanh hơn. Cá Tra đực thành thục ở tuổi thứ 2 và cá cái thành thục ở tuổi thứ 3 trở lên. Cá Tra không có cơ quan sinh dục thứ cấp nên khó phân biệt đực cái bằng hình thái. 1.1.2.4. Đặc điểm sinh sản Cá Tra không sinh sản trong ao nuôi, cá có tập tính di cư sinh sản trên những khúc sông có điều kiện sinh thái phù hợp. Trong tự nhiên chỉ gặp cá thành thục trên sông ở địa phận của Campuchia và Thái Lan. Ở Việt Nam, cá Tra cũng không có bãi sinh sản tự nhiên. Cá sinh sản ở Campuchia, cá bột theo dòng nước về Việt Nam. 4
  17. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Tuổi thành thục của cá Tra đực ở tuổi thứ 2 và cá Tra cái ở tuổi thứ 3. Cá Tra không có cơ quan sinh dục phụ, nếu chỉ nhìn hình dáng bên ngoài thì khó phân biệt được cá đực và cá cái. Ở thời kì thành thục, tuyến sinh dục ở cá đục phát triển lớn gọi là buồng tinh hay tinh sào, ở cá cái gọi là buồng trứng hay noãn sào. Mùa vụ sinh sản của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 – 7 âm lịch hàng năm. Trọng lượng cá thành thục lần đầu từ 2,5 – 3 kg. Trong sinh sản nhân tạo, có thể nuôi thành thục sớm và cho cá đẻ sớm hơn trong tự nhiên (từ tháng 3 dương lịch hàng năm), cá Tra có thể tái phát dục 1 – 3 lần trong một năm. 1.1.3. Tình hình nuôi và thương mại cá Tra ở Việt Nam Từ trước những năm 1970, kỹ thuật nuôi còn hạn chế thì nghề nuôi cá Tra còn rất mới. Nguồn cá giống trước đây hoàn toàn phụ thuộc vào việc vớt cá giống ngoài tự nhiên với sản lượng cá bột mỗi năm dạt khoảng 500 – 800 triệu con. Tuy nhiên, do biến động của điều kiện môi trường và sự khai thác quá mức của con người, sản lượng bột cá ngày càng suy giảm đáng kể, ngày nay chỉ đạt 15 – 25 % so với giai đoạn trước. Ở nước ta, nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá Tra được bắt đầu năm 1978 và hiện nay đã có thể chủ động giải quyết vấn đề số lượng con giống cho nghề nuôi cá Tra. Trong nhiều năm gần đây, cá Tra liên tiếp là một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực thủy sản Việt Nam, góp phần vào sự tăng trưởng của xuất khẩu thủy sản nói riêng và nền kinh tế đất nước nói chung. Cá Tra được nuôi tập trung tại khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) với sản lượng cá Tra nuôi đến hàng trăm nghìn tấn. Hình thức nuôi rất đa dạng, từ dạng ao nuôi quy mô nhỏ đến các quy mô lớn (quy mô công nghiệp). Các hệ thống nuôi cá Tra chính ở ĐBSCL là: ao đất, bè nỗi và nuôi đăng quầng ở vùng nước tự nhiên. Sự phát triển của hệ thống nuôi bè và nuôi đăng quầng đã giảm dần theo thời gian do mô hình nuôi này kém hiệu quả kinh tế như cá nuôi chậm lớn, tỷ lệ sống thấp, sự bùng phát dịch bệnh thường xuyên và sự ô nhiễm nước. Vì vậy nuôi cá Tra trong bè và đăng quầng phát triển chỉ trong khoảng thời gian ngắn từ năm 2000 đến 2004. Cho đến nay phương pháp nuôi cá Tra 5
  18. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng trong ao đang được xem là thành công trong hệ thống nuôi thủy sản ở Việt Nam. Các tỉnh nuôi cá Tra với sản lượng cao phục vụ xuất khẩu có thể kể đến là vùng ĐBSCL bao gồm: An Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Bến Tre, Hậu Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh, Kiên Giang và 2 tỉnh Tây Ninh và Quảng Nam với tổng diện tích nuôi 5509 ha (năm 2011) và dự kiến đến năm 2020 có thể đạt đến 13000 ha. Trong đó Cần Thơ, An Giang và Đồng Tháp là vùng nuôi cá Tra lớn nhất cả nước, sản lượng cá Tra chiếm trên 75 % so với tổng sản lượng cá Tra cả nước. Nuôi cá Tra thực sự phát triển nhanh từ năm 2000 do sản phẩm được xuất khẩu sang các nước ngày càng nhiều, mang lại hiệu quả cao và cá Tra đã trở thành một mặt hàng chiến lược quan trọng, góp phần đưa Việt Nam trở thành nước đứng thứ 6 thế giới về xuất khẩu thủy sản, thứ 5 về nuôi trồng (Dương Tiến Thể, 2009). Năm 2011, đã có trên 230 doanh nghiệp tham gia xuất khẩu cá Tra, sản lượng đạt khoảng 1,2 triệu tấn, chiếm 30 % tổng kim ngạch xuất khẩu cả nước, giá trị xuất khẩu đạt 1,856 tỷ USD, tăng gần 26,5 % so với năm 2010. Một số thị trường xuất khẩu cá Tra lớn ở Việt Nam: thị trường EU là thị trường tiêu thụ chính, thị trường Mỹ, thị trường Mehico, thị trường ASEAN, Trung Quốc và Hồng Kông. Việt Nam đang đối mặt với hàng rào thuế quan, sự thay đổi của thị trường và nhiều chính sách về an toàn thực phẩm từ các nước nhập khẩu. Cuối năm 2010, cá Tra Việt Nam bị các thành viên của quỷ quốc tế bảo vệ thiên nhiên (WWF) ở 6 nước EU (Đức, Áo, Thùy Sỹ, Bỉ, Na Uy và Đan Mạch) chuyển từ “danh sách da cam” (sản phẩm có thể cân nhắc sử dụng) sang “danh sách đỏ” (sản phẩm không nên sử dụng). Sau hơn 1 tháng kể từ buổi ký kết biên bản thỏa thuận hợp tác phát triển cá Tra Việt Nam theo hướng bền vững, WWF ở các nước EU đã cho cá Tra Việt Nam ra khỏi danh sách đó. Tuy nhiên, điều đó đã làm ảnh hưởng đến hình ảnh cá Tra Việt Nam trên thị trường thế giới. 6
  19. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Xuất khẩu cá Tra Việt Nam cũng đang đứng trước gian lận thượng mại do một số công ty Việt Nam câu kết với nước ngoài làm mất uy tín của cá Tra trên thị trường quốc tế, tình trạng bán phá giá lẫn nhau để giành hợp đồng, sự cạnh tranh không lành mạnh làm trầm trọng thêm tình trạng mất cân đối cung – cầu, ảnh hưởng tới chất lượng, hiệu suất kinh doanh. 1.2. Các phương pháp định danh cá da trơn 1.2.1. Phân loại bằng hình thái Ở Việt Nam, các nghiên cứu về phân loại và định dạng họ cá Tra (Pangasiidae) còn ít, gồm các công trình định loại của một số tác giả: Mai Đình Yên et al (1992), Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993). Các tác giả trên đều dựa vào số lượng các tia vây, hình dạng các tia vây, thân và miệng, hình dạng và số lượng răng để định danh một số loài cá thuộc họ Pangasiidae với 14 loài với tên Việt như sau: Pangasianodon hypophthalmus - Cá Tra nuôi, Pangasius – Cá Tra xiêm, Helicophagus waandersii – Cá Tra chuột, Pangasianodon gigas – Cá Tra dầu, Pangasius kunyit – Cá Tra nghệ, Pangasius micronema – Cá Tra, Pangasius macronema – Cá Xác Sọc, Pangasius larnaudii – Cá Vồ Đém, Pangasius sanitwongsei – Cá Vồ Cờ, Pangasius bocourti – Cá Basa, Pangasius pleurotaenia – Cá Xác Bầu, Pangasius conchophilus – Cá Hú, Pangasius polyuranodon – Cá Dứa, Pangasius krempfi – Cá Bông Lau. Trong đó, có 6 loài cá da trơn được xem là phổ biến và có giá trị kinh tế là: cá Tra nuôi, cá Basa, cá Xác sọc, cá Vồ đém, cá Hú, cá Bông lau (Cohen, 2009). Năm 2009, tác giả Phạm Đình Văn đã điều tra thành phần loài và xây dựng bộ mẫu về các loài cá có giá trị kinh tế, đặc biệt là các giống, loài trong họ cá Tra (Pangasiidae), theo tác giả, họ cá Tra có thân tương đối dài, phần bụng tròn hoặc có lườn bụng, miệng ở mút mõm hoặc dưới. Răng nhọn trên hai hàm, xương lá mía và xương khẩu cái mọc thành dãy ghép liền hoặc không ghép liền với các hình dạng khác nhau; cá biệt các loài không có răng. Trong 14 loài ghi nhận này, đặc biệt có loài cá Tra nghệ P. kunyit mới xác nhận gần đây tại An Giang (Vương Học Vinh et al, 2012). Theo tác giả cá Tra nghệ P. 7
  20. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng kunyit có 2 đặc điểm có thể phân biệt với cá da trơn khác là trên hai nắp mang có vết hình rẻ quạt và vi lưng cá có tia vi cứng luôn dựng thẳng đứng, không nằm sát xuống mặt lưng ngay cả khi chúng ta dùng tay áp sát vào. Theo tác giả Roberts và Vilenciennes (1991), họ cá Tra (Pangasiidae) vùng Đông Nam Á gồm có hai giống: giống Helicophagus Bleeker, 1858 và giống Pangasius Valemciennes, 1940 có 19 loài. Sau đó tác giả Rainboth (1996) đã bổ sung thêm 2 giống mới là: Pangasianodon Chevey, 1930 và Petropagasius Flowe, 1937. Một nghiên cứu nữa của Rainboth (1996) nghi vấn về giống Pseudolais như là một giống độc lập và được coi là một phân giống của Pangasius. Theo Wikipedia tiếng Pháp, họ Pangasiidae có ba giống: Sinopangasius (1 loài), Helicophagus (3 loài) và Pangasius (27 loài). Tuy nhiên theo vài tài liệu cùa FishBase, giống và loài Sinopangasius được coi là từ đồng nghĩa của Pangasius kempfi (cá Bông lau). Như vậy, có thể phân loại họ Pangasius có hai giống và giống Pangasius có 24 loài. Các loài hoặc dưới loài thuộc giống Pangasius có hình thái rất giống nhau, gây nhiều khó khăn trong việc phân loại trong thời gian vừa qua. Chẳng hạn đối với cá dứa, Pangiasius polyuranodon Bleeker 1931, việc phân loại chủ yếu dựa trên hình dạng cơ thể, số lượng râu, răng lá mía, răng khẩu cái, vị trí lỗ mũi, vị trí sắc tố xuất hiện và các đặc điểm ở bụng (Smith, 1945). Các loài cá Tra đặc trưng bởi sự kết hợp của bóng hơi, răng vòm miệng, vây, lược mang và màu sắc mẫu (Roberts và Vidthayanon, 1991; Vidthayanon và Roongthongbaisuree, 1993). Phân loại họ Pangasiidae cũng như các họ khác còn dựa trên sự khác biệt về giải phẫu bộ máy Weber (Nelson, 1967; Burgess, 1989) và giả thuyết này đã được chấp nhận rộng rãi. Bộ máy weber là một cấu trúc giải phẫu kết nối bóng hơi với hệ thống thính giác khi nó được phát triển đầy đủ trong cơ thể cá trưởng thành, các yếu tố của bộ máy đôi khi được gọi chung là các xương nhỏ Weber (FishBase, 2007). Các chỉ tiêu hình thái để tách giống Pangasianodon ra khỏi giống Pangasius là miệng có dạng trước (terminal mouth), có 8 – 9 tia vi ngực; loài P. gigas có 7 tia vi lưng và không có lược mang (gill rakers), trong khi loài P. hypophthalmus có 6 tia vây lưng và lược 8
  21. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng mang rất phát triển. Theo Roberts và Vidthayanon (1991), các giống Pangasianodon Chevey, 1930, Pteropangasius Fowler, 1937 và Sinopangasius Chang and Wu, 1965 là các đồng danh (synonyms) của giống Pangasius. Mặc dù phân loại hình dựa vào hình thái học đạt được những kết quả nhất định đối với họ Pangasiidae, nhưng không phải lúc nào cũng có các kết quả chính xác. Trong nhiều trường hợp, hình thái bị giới hạn do ảnh hưởng của điều kiện sống, hoặc sản phẩm cần phân loại ở dạng chế biến, Việc xác định trở nên khó khăn hoặc thậm chí không thể. Do đó, phát triển các phương pháp mới để xác định loài nhanh và chính xác là điều cần thiết. 1.2.2. Phân loại bằng sinh học phân tử 1.2.2.1. Ty thể Hình 1.2: Ty thể mtDNA Mặc dù hầu hết DNA được chứa trong NST nằm trong nhân, ty thể cũng có một số ít DNA riêng (được biết đến như DNA ty thể hay mtDNA). Ty thể là những cấu trúc nằm bên trong tế bào, chuyển hóa năng lượng từ thức ăn thành dạng tế bào có thể sử dụng được. Mỗi tế bào chứa đựng hàng trăm đến hàng ngàn ty thể, nằm lơ lửng trong tế bào chất xung quanh nhân. 9
  22. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Cytochrome b nằm ở vị trí giữa ubiquinon và cytochrom c. Nó có khối lượng phân tử vào khoảng 17.000 (monomer) và có khuynh hướng tự ngưng tụ mạnh mẽ để tạo thành dạng trùng hợp cao phân tử với khối lượng có thể lên tới trên 4 triệu cytochrome b liên kết rất chặt chẽ với màng trong ty thể. Cytochrome b nằm trong phức hợp III (ubiquinon-cytochrom c- reductase): có khối lượng tiểu phần vào khoảng 300.000 (protein + lipid) và có 6 đến 8 chuỗi polypeptid cấu thành. Trong đó, hai hay ba chuỗi polypeptid có chứa cytochrome b, một chuỗi chứa cytochrom c1 và một chuỗi chứa trung tâm sắt-lưu huỳnh-protein; một chuỗi polypeptid có thể liên kết với atimycin và các chuỗi còn lại chưa rõ chức năng. Protein của cytochrome b rất kỵ nước và người ta cho rằng: chất truyền điện tử này cũng giống như ubiquinon là định vị giữa lớp lipid kép của màng trong ty thể. DNA ty thể gồm 37 gen, tất cả đều là tiềm năng cho chức năng bình thường của ty thể. Ba mươi gen điều khiển sinh tổng hợp enzyme phosphoryl hóa oxi hóa. Những gen còn lại điều khiển tổng hợp những phân tử gọi là RNA vận chuyển (tRNA) và RNA ribosome (rRNA), những chất hóa học thân thiết với DNA. Ba loại phân tử RNA này giúp lắp ráp khuôn tổng hợp amino acid hình thành protein có chức năng. Trong số 37 gen của ty thể, trình tự COI, cytochrome b, tRNA được xem là những trình tự gen ổn định, có khả năng sử dụng cho việc định danh bằng sinh học phân tử. 1.2.2.2. Sử dụng gen ty thể cho việc định danh các loài thủy sản COI thuộc hệ gen ty thể thường được sử dụng trong các nghiên cứu quan hệ di truyền, phân loại và giám định các loài. Lợi ích từ việc sử dụng vùng gen COI là đoạn trình tự ngắn để có thể giải trình tự một cách nhanh chóng và không tốn kém. Thêm vào đó, trật tự nucleotit trong đoạn COI có tính bảo tồn rất cao nên lợi thế trong việc xác lập nên các bộ mã vạch di truyền cho nhiều loài động vật, trong đó có cá. Gene COI tham gia vào quá trình vận chuyển electron trong giai đoạn hô hấp của vi sinh vật. Theo đó, các gene được sử dụng cho nghiên cứu mã vạch được tham gia vào các phản ứng chìa khóa của sự sống: dự trữ năng lượng (khi cần giải phóng nó để tạo thành ATP). Do đó, 10
  23. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng các vùng trình tự thay thế đã được đề xuất sử dụng làm mã vạch DNA cho nhóm này. Bên cạnh COI, trình tự của cytochrome b và 16s RNA (16S) thuộc gen ty thể (mtDNA) cũng nằm trong số các chỉ thị di truyền được sử dụng rộng rãi nhất cho việc nhận dạng các loài cá (Kochzius, 2009; Telatchea, 2009), kiểm soát thủy sản (Marko, 2004) và định danh loài (Kochzius, 2003). Cơ sở dữ liệu đã được thiết lập, có chứa trình tự cytochrome b hoàn chỉnh (www.fishTrace.org), cho phép xác định, phân loại mẫu dựa trên một trình tự cytochrome b của mẫu. Các nghiên cứu xác định các loài sử dụng cytochrome b có thể kể đến là nghiên cứu trên cá bẹt, cá cơm, cá chình và nhiều loài cá biển khác (Teletchea et al., 2005; Santaclara và et al., 2006). Do mức độ tương đồng giữa các loài đa dạng cao và các loài cá có độ đa dạng thấp, trình tự cytochrome b có thể thể hiện đột biến và cho phép phân biệt các loài có liên quan chặt chẽ với nhau (Mackie et al., 1999; Aranishi et al., 2005a). Một số nghiên cứu cũng đã sử dụng vùng gen của mtDNA mã hóa cho cytochrome b và chuỗi tRNA lân cận (tRNA Glu – cyt b) để phát hiện các loài như cá bơn, cá tuyết, cá tầm và cá hồi (Wolf et al., 1999; Sanjuan và Comesana 2002; Akasaki et al., 2006). 11
  24. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Di truyền phân tử, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II (116 Nguyễn Đình Chiểu, Phường Đakao, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh). Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ 1/2015 đến 7/2015. 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.1. Hóa chất thí nghiệm Nước cất. Ethanol 70 %, 96 %, 100 %. Tris-HCl. Tris-Base. EDTA. SDS. NaCl Acid boric. NaOH. HCl. Bộ DNA mix (Promega). Bộ DNA maker (BIOLINE). 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm Eppendorf: 0.2 ml, 1.5 ml. Đầu tip các loại. Trip 8, 12. Plates 96 well PCR. Đèn cồn. Kéo, kẹp cắt mẫu. Cốc thủy tinh 100, 1000 ml. Ống đong 500, 1000 ml. Micropipet các loại: 0.5 – 10 µl, 10 -100 µl,100– 1000 µl (BIO-RAD). 12
  25. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Cân điện tử MS 204. Máy vortex. Máy khuấy từ gia nhiệt. Máy cất nước siêu sạch. Máy hút và tủ cấy vô trùng (Astec Microflow). Máy ly tâm lạnh. Máy PCR (BIO-RAD). Bộ thiết bị điện di (BIO-RAD). Thiết bị chụp ảnh gel điện di (BIO-RAD). Lò vi sóng (Electrolux – Thụy Điển). Tủ mát (4oC), tủ âm (- 25oC) (Sanyo – Nhật). Bể điều nhiệt. 2.3. Hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR Các hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR (đệm, MgCl2, dNTPs, enzyme Taq DNA polymerase, enzyme Pfu DNA polymerase ) của hãng Promega (Mỹ). 2.4. Hóa chất sử dụng để chạy điện di Gel agarose dạng bột Promega (Mỹ), TBE 0,5X, Dung dịch màu tải mẫu 6x (dịch nạp mẫu) chứa 30 % glycerol, 0,25 % bromophenol blue (BPB) và 0,25 % xylencyanol (XC); Ethidium bromide. 13
  26. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Thang sử dụng cho DNA Hình 2.1: Thang chuẩn 1kp Thang sử dụng cho sản phẩm PCR Hình 2.2: Thang chuẩn 50 bp 14
  27. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Phương pháp thu mẫu 2.5.1.1. Mẫu cá Tra Quần đàn tự nhiên: thu mẫu tại hai nhánh sông Tiền và sông Hậu. Quần đàn sản xuất: thu mẫu cá bố mẹ từ trại sản xuất giống thuộc Đồng bằng sông Cửu Long. Số lượng: 30 mẫu cá tự nhiên, 30 mẫu cá sản xuất. Trọng lượng: > 500 g/1con. 2.5.1.2. Mẫu cá da trơn khác Cá Bông lau, Cá Hú, Cá Xác sọc, Cá Vồ đém, Cá Vồ cờ, Cá Basa. Số lượng: 5 con/mẫu Trọng lượng: > 500 g/1con. 2.5.2. Phương pháp định danh 2.5.2.1. Phương pháp định danh bằng hình thái Dựa theo các nghiên cứu về hình thái học của Tyson et al. (1991), Ferrari (2007), Vương Học Vinh et al.,(2012), Trương Thủ Khoa (1993) là cơ sở cho việc phân loại cá Tra và một số cá da trơn khác trong họ Pangasiidea. 15
  28. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Bảng 2.1: Chỉ tiêu định danh hình thái theo Trương Thủ Khoa (1993) Chỉ tiêu Cá Tra Cá Hú Cá Basa Cá vồ Cá Xác Cá Bông Cá Vồ cờ đém sọc lau M (g) 550 - 850 600 - 820 520 - 840 540 - 810 350 - 670 600 - 750 580 - 850 L (cm) 32 - 40 33 - 45 31 - 44 30 - 42 26 - 30 30 - 40 28 - 36 Lo (cm) 28 - 32 29 - 39 26 - 35 25 – 37 22 - 26 24 - 33 21 - 29 H (cm) 4,0 – 5,6 3,8 – 5,2 4,2 – 5,4 4,1 – 4,8 3,8 – 4,1 3,6 – 4,9 3,8 – 4,2 T (cm) 5,2 – 7,4 6,2 – 7,8 6,6 – 7,5 5,2 – 7,8 5,2 – 6,5 6,1 - 7,3 6,0 – 7,6 O (cm) 0,9 – 1,2 0,8 – 1,2 0,9 – 1,1 0,9 – 1,0 0,9 – 1,1 0,8 – 1,0 0,8 – 1,1 OO (cm) 3,5 – 4,9 3,7 - 5,2 3,8 - 5,5 4,4 – 5,5 4,3 – 4,8 4,1 – 5,2 5,0 – 5,6 D 6 - 7 6 – 7 6 – 7 7 7 7 7 A 26 - 46 31 - 38 27 - 34 28 - 32 30 - 38 31 - 34 30 - 32 P 9 - 10 11 – 12 9 – 13 11 10 10 10 V 7 – 8 5 - 6 5 – 7 6 - 7 5 - 7 8 5 - 6 Trong đó: M (g): Khối lượng toàn thân (g) L (cm): Chiều dài toàn thân. Lo (cm): Chiều dài tiêu chuẩn của cá. H (cm): Chiều cao thân lớn nhất. T (cm): Chiều dài đầu. O (cm): Đường kính mắt. OO (cm): Khoảng cách hai mắt. D: Số tia vây lưng A: Số tia vây hậu môn P: Số tia vây ngực V: Số tia vây bụng Tiến hành lập tỉ lệ: 16
  29. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Dài chuẩn Dài đầu Dài chuẩn Cao thân Dài đầu Khoảng cách 2 Mắt Dài đầu Đường kính mắt Dài đầu Cao vòm miệng Dài cuống đuôi Cao cuống đuôi 2.5.2.2. Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử Khuếch đại gen cytochrome b được thực hiện với cặp mồi được sử dụng là: L14735 (5 "-AAA AAC CAC CGT TGT TAT TCA ACT A-3") và H15149ad (5 "-GCI CCT CAR AAT GAY ATT TGT CCT CA-3") của Li Lian Wong (2011). Kích thước của sản phẩm PCR trên cá Tra theo tác giả là từ 416 – 436 bp, sau đó dùng phần mềm tin sinh học để đánh giá sự khác biệt. Từ đó, đưa ra phương pháp định danh cá Tra. 2.5.3. Phương pháp thu và bảo quản mẫu phục vụ cho PCR Cá rửa sạch, cắt lấy vây đuôi, rửa lại vây đuôi bằng ethanol 96 % và cho vào ống fancol 1,5 ml có chứa ethanol 70 % để bảo quản. Chú ý phải luôn để mẫu ngập trong ethanol 70 %. Mẫu vây đuôi được cắt và bảo quản trong ethanol 70 % ở 4oC. Tiến hành thay ethanol định kỳ và luôn bảo đảm mẫu ngập hết trong ethanol. 17
  30. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 2.5.4. Phương pháp chạy PCR 2.5.4.1. Khái niệm PCR là phương pháp khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lượng DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ được thu nhận từ DNA mẫu. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR ➢ Mẫu DNA: Mẫu DNA sẽ được ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau. Đối với DNA thực vật thường được ly trích từ mô lá, DNA động vật thường được ly trích từ máu, long, mô, Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao, tuy nhiên để thu được kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết. Số lượng DNA cần cho một phản úng PCR vào khoảng 5 – 10 ng. Nồng độ DNA có thể xác định được nhờ đo OD (mật độ quang) ở bước sóng 260nm. Khi DNA tinh khiết, lượng DNA được tính theo công thức: ▪ 1 OD260nm = 50 ng/ µl (đối với DNA sợi kép). ▪ 1 OD260nm = 40 ng/ µl (đối với DNA sợi đơn). ➢ Primer (mồi): Là một đoạn nucleotide có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F- primer (mồi xuôi) và R-primer (mồi ngược). Cặp primer sẽ quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR, nếu primer được thiết kế đúng thì đoạn DNA đích mới được khuếch đại chính xác. dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP): Nồng độ dNTPs thường được sử dụng là 20 – 200 µM. Nồng độ cáo hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTPs cũng ảnh hưởng đến phẩn ứng PCR. Thông thường thì 18
  31. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng nồng độ của các dNTPs sẽ là như nhau. Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTPs sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase. Nồng độ dNTPs thích hợp cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm được khuếch đại. Vì thế, nồng độ dNTPs tối ưu cho từng phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm. ➢ Dung dịch buffer: Tạo môi trường tối ưu nhất cho Taq polymerase hoạt động. ➢ Taq polymerase: Ban đầu, khi chưa sử dụng enzyme Taq polymerase người ta phải thêm DNA polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA polymerase cần cho quá trình tổng hợp DNA nhưng không chịu được nhiệt độ lớn hơn 900C ở giai đoạn biến tính tách hai sơi của phân tử DNA. Năm 1988, Taq polymerase được phát hiện, đây là một loại DNA polymerase bền với nhiệt, được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng. Với enzyme này thì chỉ cần cho một lần Taq polymerase là được. Nồng độ Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0,5 – 5 đơn vị/100µl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ quá cao, những sản phẩm không mong muốn có thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ quá thấp thì sẽ không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo lượng sản phẩm PCR theo ý muốn. Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một nucleotide loại A vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trọng trong việc tạo dòng (TA – cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu, ➢ Ion kim loại Mg2+: Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động. 19
  32. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 2.5.4.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR Phản ứng PCR thường được thực hiện qua 25 – 35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các bước: denature (biến tính DNA), annealing (gắn mồi), extension (kéo dài). Giai đoạn denature (biến tính DNA): thường được tiến hành ở nhiệt độ từ 94 – 98oC, trong 40 – 60 giây (thời gian có thể dài hoặc ngắn hơn tùy theo độ dài của DNA mẫu). Đây là bước làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn dưới tác dụng của nhiệt độ bằng cách phá vỡ các liên kết hydro. Giai đoạn annealing (gắn mồi): 50 – 60oC trong 30 giây. Đây là bước primer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích (lúc này ở dạng sợi đơn). Nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc vào độ dài của từng cặp primer. Giai đoạn extension (kéo dài): 72oC, 30 – 90 giây tùy thuộc độ dài DNA đích. Đây là bước kéo dài primer nhờ hoạt động của Taq polymerase. Ở nhiệt độ 72oC, hoạt động của Taq polymerase sẽ đạt hiệu quả tối ưu. Sau 25 – 35 chu kỳ, phản ứng tiếp tục giai đoạn ủ ở 72oC trong 5 – 20 phút để hoàn thiện các sản phẩm. 20
  33. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Hình 2.3: Phản ứng PCR 21
  34. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Bảng 2.2: Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR Thành phần Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối (µl) DNA buffer 5X 4 1X MgCl2 25mM 2,4 - dNTPs 10mM mỗi dNTP 0,4 0,25 mM mỗi dNTP Primer Fcyt b 25pM 0,4 0,5pM Primer Rcyt b 25pM 0,4 0,5pM DNA mẫu - 1 - Taq polymerase 5u/µl 0,1 0,5u Nước cất - 50 - Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Bảng 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian 1 94 2 phút 94 30 giây 35 Ta 40 giây 72 1 phút 1 72 10 phút Ta: Nhiệt độ bắt cặp. Lưu ý: Sau khi phản ứng PCR hoàn thành, đem sản phẩm trữ ở 4oC hay –20oC để bảo quản và sử dụng trong các thí nghiệm sau này. Các thao tác tiến hành pha mix phải đảm bảo vô trùng và các thành phần phải luôn giữ trong điều kiện lạnh. 22
  35. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 2.5.5. Phương pháp tách chiết DNA Eppendorf chứa mẫu 500µl Solution 1 vây cá đã cắt mịn + 5 µl ProteinaseK Votex nhanh Ủ ở 55oC /3 giờ hoặc qua đêm Bỏ trên đá 10 phút 240 µl Solution 2 Đảo vài lần, bỏ trên đá 5 phút Ly tâm 8000 rpm /15 phút Cẩn thận hút 300 µl dịch trong 500 µl ethanol 100 % lạnh Ủ ở 4oC/2 giờ Ly tâm 11000 rpm /15 phút Bỏ dịch nổi 500 µl ethanol 70 % lạnh Ly tâm 11000 rpm /5 phút Bỏ dịch nổi, làm khô ở 37oC 100 µl TE Bảo quản ở -25oC Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách chiết DNA 23
  36. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Bảng 2.4: Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA HÓA CHẤT CÁCH PHA Cho 7,878 g Tris-HCl vào 1000 ml nước cất, khuấy tan, chỉnh pH 8 rồi cho tiếp 7,444 g EDTA vào, khuấy tan, Solution 1 chỉnh lại pH 8 rồi cho 20 g SDS vào khuấy đến khi tan hoàn toàn. Cân chính xác 350,64 g NaCl vào 1000 ml nước cất, Solution 2 khuấy đến khi tan hết. Proteinase K Dung dịch gốc. Ethanol 100 % Dung dịch gốc. Ethanol 70 % Dung dịch gốc. Cho 1,5764 g Tris-HCl vào 1000 ml nước cất, khuấy tan, TE chỉnh pH 8 rồi cho tiếp 0,3722 g EDTA vào khuấy đến khi tan hoàn toàn. Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích Mẫu DNA ly trích được điện di trên gel Agarose 1 %, trong dung dịch đệm TBE 0,5X ở hiệu điện thế 110 V, cường độ dòng diện 400 mA trong 30 phút. Sau khi chạy điện di xong, gel được đưa vào máy chụp ảnh DNA. Dưới tia UV, Ethidium Bromide đã liên kết với sợi DNA sẽ phát quang và tạo thành các vạch trên gel. Để ước lượng độ tinh sạch của mẫu ly trích, có thể tiến hành tính tỷ lệ OD260nm/OD280nm. Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2 thì mẫu ly trích được xem là sạch. Nếu tỷ lệ < 1,8 là mẫu nhiễm nhiều protein. 24
  37. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 2.5.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose Nguyên tắc chung của kỹ thuật điện di: trong cùng một điện trường, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau tùy thuộc vào kích thước và điện tích của chúng. Nếu hai phân tử có cùng khối lượng thì phân tử nào có diện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực trái dấu nhanh hơn. 2.5.6.1. Chuẩn bị agarose gel Cách tiến hành: Cho 1 g agarose vào 100 ml đệm TBE. Đun trong nồi khử trùng hoặc lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Nếu quá trình đun mất nước quá nhiều thì phải thêm nước cho đủ 100 ml. Để nguội khoảng 60oC và đổ vào buồng điện di có cài sẵn lược. Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp. Sau 30 – 40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra. 2.5.6.2. Đặt mẫu DNA vào giếng Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độ DNA cao hoặc thấp. Chẳng hạn theo tỷ lệ sau: DNA (1 µg/1 μl ): 1 µl Đệm màu bromophenol (x10 loading dye): 1 µl Nước cất 2 lần: 8 µl Tổng số : 10 µl Dùng micropipette hút 11 µl dung dịch trên cho vào giếng. Thường đặt mẫu sau khi đổ dịch đệm TBE vào buồng điện di cho ngập gel, ít khi đặt mẫu trước rồi đổ đệm sau. Thường dùng micropipette loại 20 – 200 µl và đặt buồng điện di trên bàn có nền đen. Khi tăng điện thế của quá trình điện di, các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với các đoạn nhỏ, DNA dịch chuyển từ cực âm đến cực dương. Quan sát sự dịch chuyển bằng màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di. 25
  38. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Đối với DNA, việc điện di được thực hiện trên giá thể bán rắn là gel. Bản gel agarose là giá thể bán rắn, xốp với những lỗ nhỏ cho phép các DNA đi qua. Khi cho các DNA cần phân tích vào các giếng của bản gel và đặt trong cùng một điện trường thì vẫn tốc di chuyển của các DNA sẽ phụ thuộc và kích thước và khối lượng của chúng. Kích thước phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Từ đó chúng ta sẽ phân tách được các nhóm DNA với kích thước khác nhau. Hình 2.5: Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel 26
  39. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Gel agarose: Lỗ có đường kính trung bình, cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thước 100 – 10000 bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau. Phát hiện vạch DNA sản phẩm: Sau khi chạy điện di, các phân tử DNA đã được nhuộm bởi Ethium Bromide. Ethium Bromide tập trung lại nơi có DNA và xen vào giữa 2 sợi DNA xắn kép. Gel này được cho vào máy chụp UV và hình ảnh sẽ hiển thị trên màn hình máy vi tính, sản phẩm DNA là những vạch trắng. Tia tử ngoại có bước sóng 300 nm, bị phức DNA-Ethidium Bromide hấp thụ không hoàn toàn nên nó sẽ phát ra ánh sáng với bước song 590 nm (màu đỏ cam). Trong nghiên cứu chỉ sử dụng phương pháp điện di trên agarose nhằm kiểm tra kết quả tách chiết DNA và phân tích sơ bộ sản phẩm PCR. 2.6. Bố trí thí nghiệm của đề tài Thu mẫu cá tra và các loại cá da trơn khác Định danh b ằng hình thái học Định danh bằng sinh học phân tử Tối ưu ph ản ứng PCR. Kiểm định tính ổn định của phản ứng PCR. Bước đầu thử nghiệm định danh trên cá Tra. Hình 2.6: Sơ đồ quy trình nghiên cứu 27
  40. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu mẫu cá Tra và các loài cá da trơn khác Bảng 3.1: Số lượng và kí hiệu mẫu cá STT Số lượng (con) Tên cá Kí hiệu 1 5 Cá Hú CH 2 5 Cá basa CBS 3 5 Cá Vồ Đém CVĐ 4 5 Cá Xác Sọc CXS 5 5 Cá Bông Lau CBL 6 5 Cá Vồ Cờ CVC 7 30 Cá Tra chọn giống của Viện II CTSXV2 8 30 Cá Tra tự nhiên CTTN 3.2. Định danh bằng hình thái học 3.2.1. Định danh cá Tra tự nhiên (Pangasius hypophthalmus) o Số mẫu phân tích: 30 mẫu o Kích thước: 280 – 328 mm D. II, (6 - 7) P. I, (9 - 10) V. 7 - 8 A. 26 - 46 Dài chuẩn = 4,04 (3,5 − 6,2) Dài đầu Dài chuẩn = 4,2 (3,4 − 5,9) Cao thân Dài đầu = 1,7 (1,5 − 2,3) Khoảng cách 2 Mắt Dài đầu = 4,1 (2,9 − 7,8) Đường kính mắt 28
  41. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Dài đầu = 5,3 (4,7 − 10,9) Cao vòm miệng Dài cuống đuôi = 1,3 − 2,27 Cao cuống đuôi Đầu rộng, dẹp bằng. Mõm ngắn, nhìn từ trên xuống chót mõm tròn. Răng nhỏ, răng vòm miệng chia thành 4 đám nhỏ, mỏng, nằm trên đường vòng cung, đôi khi bị che bởi nếp da vòm miệng. Lỗ mũi sau gần lỗ mũi trước hơn mắt và nằm trên đường thẳng kẻ từ lỗ mũi trước đến cạnh trên của mắt. Có hai đôi râu, râu mép kéo dài chưa chạm đến gốc vi ngực, râu cằm ngắn hơn. Mắt lớn, nằm trên đường thẳng kẻ ngang từ góc miệng. Phần trán giữa hai mắt rộng, cong lồi. Ở cá nhỏ, phần lưng của đầu và thân có màu xanh lục, ngoài ra còn có 2 sọc màu xanh lục chạy dọc theo chiều dài của thân. Ở cá lớn, mặt lưng của thân và đầu có màu xanh xám hoặc nâu đen và lợt dần xuống bụng, bụng có màu trắng bạc. Hình 3.1: Cá Tra 29
  42. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Hình 3.2: Bong bong kéo dài qua lỗ hậu môn Hình 3.3: Răng khẩu cái và răng lá mía nối với nhau thành hình vòng cung Quan sát thấy rằng bóng hơi có 1 ngăn kéo dài qua lỗ hậu môn, bốn đốm răng vòm miệng nhỏ, mỏng làm thành hình vòng cung, đôi khi bị che phủ bởi da do vòm miệng. Đồng thời, các khoảng cách đo được có sự tương đồng với khoảng tỷ lệ của Trương Thủ Khoa (1993). Như vậy khẳng định 30 con này thuộc loại cá Tra Pangasius hypophthalmus. 30
  43. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 3.2.2. Định danh cá Hú (Pangasius conchophilus) o Số mẫu phân tích: 5 mẫu o Kích thước: 290 – 420 mm D. II, (6 – 7) P. I, (11 – 12) V. 5 - 6 A. 31 - 38 Dài chuẩn = 4,0 (3,9 − 5,6) Dài đầu Dài chuẩn = 4,2 (3,2 − 4,6) Cao thân Dài đầu = 1,7 (1,2 − 2,1) Khoảng cách 2 Mắt Dài đầu = 5,3 (3,4 − 5,5) Đường kính mắt Dài đầu = 5,3 (4,7 − 5,7) Cao vòm miệng Dài cuống đuôi = 1,4 − 2,0 Cao cuống đuôi Đầu hình nón, mặt dưới phẳng. Miệng dưới không co duỗi được, có hình vòng cung, nằm trên mặt phẳng ngang. Răng hàm nhỏ, mịn, răng vòm chia làm 3 đám, đám răng là mía có dạng bầu dục hoặc lõm phía sau. Chiều dài hai bên tương đương với chiều rộng trước sau, hạt răng thô. Răng khẩu cái tạo thành hai đám nhỏ hai bên, hạt răng mịn. Thân dài, dẹp bên. Đường lưng từ chót mỗm đến vây lưng hơi cong lồi. Đường bên phân nhánh nhiều, bắt đầu từ mép trên lỗ mang đến điểm gốc giữa vây đuôi. Mặt sau gai vây lưng và gai vây ngực có răng cưa hướng xuống gốc, gai vây ngực phát triển hơn gai vây lưng. Bụng có màu trắng bạc, vây lưng màu đen lợt. Các vây khác có màu hơi vàng đến trắng. 31
  44. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Hình 3.4: Cá Hú Quan sát thấy rằng các đặc điểm hình thái của 5 mẫu cá thu được phù hợp với các đặc điểm hình thái của cá Hú. Đồng thời, các khoảng cách đo được có sự tương đồng với khoảng tỷ lệ của Trương Thủ Khoa (1993). Như vậy khẳng định 5 con này thuộc loại cá Hú Pangasius conchophilus. 3.2.3. Định danh cá Basa (Pangasius bocourti) o Số mẫu phân tích: 5 mẫu o Kích thước: 240 – 358 mm D. II, (6 – 7) P. I, (9 – 13) V. 5 – 7 A. 27 - 34 Dài chuẩn = 4,1 (2,9 − 5,5) Dài đầu Dài chuẩn = 3,5 (2,7 − 5,1) Cao thân Dài đầu = 1,7 (1,2 − 2,4) Khoảng cách 2 Mắt Dài đầu = 5,4 (4,3 − 6,9) Đường kính mắt Dài đầu = 7,1 (3,9 − 10,4) Cao vòm miệng Dài cuống đuôi = 1,6 − 2,7 Cao cuống đuôi Răng trên xương khẩu cái là một đám có vết lõm sâu ở giữa và hai đám răng trên xương lá mía nằm hai bên. Răng vòm miệng với dải răng trên xương khẩu cái ở giữa và răng trên xương lá mía ở hai bên. Mắt to nằm trên đường kẻ từ 32
  45. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng góc miệng gần chót mõm hơn gần điểm cuối nắp mang. Phần trán giữa hai mắt rộng và cong lồi. Mặt sau của thân và đầu có màu xám xanh, bụng có màu trắng bạc. Vây lưng, vây ngực có màu xám, vây hậu môn có màu trắng trong, màng da giữa các tiavây đuôi có màu đen lợt. Hình 3.5: Cá Basa Quan sát thấy rằng các đặc điểm hình thái của 5 mẫu cá thu được phù hợp với các đặc điểm hình thái của cá Basa. Đồng thời, các khoảng cách đo được có sự tương đồng với khoảng tỷ lệ của Trương Thủ Khoa (1993). Như vậy khẳng định 5 con này thuộc loại cá Basa Pangasius bocourti. 3.2.4. Định danh cá Vồ đém (Pangasius larnaudiei) o Số mẫu phân tích: 5 mẫu o Kích thước: 140 – 220 mm D. II, 7 P. I, 11 V. 6 - 7 A. 28 - 32 Dài chuẩn = 5,1 (4,8 − 5,7) Dài đầu Dài chuẩn = 4,3 (3,4 − 5,0) Cao thân Dài đầu = 1,3 (1,2 − 1,4) Khoảng cách 2 Mắt 33
  46. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Dài đầu = 6,6 (6,2 − 7,2) Đường kính mắt Dài đầu = 4,2 (3,6 − 5,1) Cao vòm miệng Dài cuống đuôi = 1,6 − 2,4 Cao cuống đuôi Thân dài, phần trước của thân có tiết diện tròn, phần sau thân dẹp bên. Đầu dẹp bằng, trán rộng. Tất cả các răng vòm miệng làm thành một đường vòng cung liên tục với nhiều chỗ lõm hoặc tách rời ở giữa thành 2 đám. Râu nhỏ, ngắn. Râu mép kéo dài đến hoặc không đến gốc vây ngực. Mắt lớn vừa nằm phía trên đường thẳng ngang kẻ từ góc miệng và cách đều chót mõm với điểm cuối nắp mang. Răng nhỏ và mịn: răng vòm miệng tạo thành một đường vòng cung liên tục với nhiều chỗ lõm hoặc tách rời ỡ giữa, thành 2 đám riêng. Phía trên của gốc vây ngực có một đốm đen to. Da trơn, không vảy. Mặt lưng của thân và đầu có màu xám đen ánh xanh lá cây, lợt dần xuống mặt bụng, bụng cá có màu trắng. Phía trên gốc vây ngực có một đốm đen, to. Hình 3.6: Cá Vồ đém 34
  47. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Quan sát thấy rằng các đặc điểm hình thái của 5 mẫu cá thu được phù hợp với các đặc điểm hình thái của cá Vồ đém. Đồng thời, các khoảng cách đo được có sự tương đồng với khoảng tỷ lệ của Trương Thủ Khoa (1993). Như vậy đã khẳng định 5 con này thuộc loại cá Vồ đém Pangasius larnaudiei. 3.2.5. Định danh cá Xác sọc (Pangasius macronemus) o Số mẫu phân tích: 5 mẫu o Kích thước: 110 – 140 mm D. II, 7 P. I, 10 V. 5 - 7 A. 30 - 38 Dài chuẩn = 3,2 (2,6 − 3,8) Dài đầu Dài chuẩn = 3,4 (3,0 − 3,6) Cao thân Dài đầu = 1,4 (1,2 − 1,8) Khoảng cách 2 Mắt Dài đầu = 3,5 (3,3 − 4,1) Đường kính mắt Dài đầu = 3,4 (3,3 − 3,9) Cao vòm miệng Dài cuống đuôi = 1,95 − 2,5 Cao cuống đuôi Thân dài, dẹp bên. Đường lưng từ chót mõm đến vây lưng hơi cong lồi. Đường bên phân nhánh nhiều, bắt đầu từ mép trên lỗ mang đến điểm gốc giữa vây đuôi. Có 1 đốm đen ở gốc vây lưng. Lược mang trên cung mang thứ I có khoảng 10 – 12 cái. Răng lá mía và răng khẩu cái gồm 4 đốm rời nhau. Gai cứng, vây lưng và vây ngực có răng của ở mặt sau. 35
  48. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Hình 3.7: Cá Xác sọc Quan sát thấy rằng các đặc điểm hình thái của 5 mẫu cá thu được phù hợp với các đặc điểm hình thái của cá Xác sọc. Đồng thời, các khoảng cách đo được có sự tương đồng với khoảng tỷ lệ của Trương Thủ Khoa (1993). Như vậy đã khẳng định 5 con này thuộc loại cá Xác sọc Pangasius macronemus. 3.2.6. Định danh cá Bông lau (Pangasius krempfi) o Số mẫu phân tích: 5 mẫu o Kích thước: 380 – 495 mm D. II, 7 P. I, 10 V. 8 A. 31 - 34 Dài chuẩn = 4,1 (3,9 − 4,5) Dài đầu Dài chuẩn = 4,2 (3,4 − 5,9) Cao thân Dài đầu = 1,31 (1,5 − 2,3) Khoảng cách 2 Mắt Dài đầu = 7 (2,9 − 7,8) Đường kính mắt Dài đầu = 5,9 (4,7 − 10,9) Cao vòm miệng 36
  49. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Dài cuống đuôi = 1,81 − 2,27 Cao cuống đuôi Đầu nhỏ, dẹp bên. Mõm nhọn ở cá con và tròn ở cá trưởng thành. Miệng cận dưới, hình nón, rộng ngang và không co duỗi được. Có hai đôi râu: đôi râu mép kéo dài đến hoặc vượt quá gốc vi ngực, đôi râu hàm kéo dài đến điểm cuối của xương nắp mang. Mắt tròn, nhỏ. Phần trán giữa hai mắt rộng và cong lồi. Răng vòm miệng gồm 4 đám: hai đám răng lá mía hình chữ nhật nằm kề nhau ở giữa (chiều rộng phải, trái tương đương 3 lần chiều dài trước sau), hai đám răng khẩu cái nằm ở hai bên. Lược mang trên cung mang thứ I có môt hàng (số lượng dao động trong khoảng 17 - 21 cái). Bóng hơi kín, kéo dài từ xoang bụng đến gốc các tia vây hậu môn cuối cùng, có 3 thuỳ: thuỳ trước ngắn, hai thuỳ sau nhỏ và dài. Thân trần, thon dài, dẹp bên. Bụng thon. Cuống đuôi thon dài. Vây lưng và vây ngực có gai cứng, mặt sau các gai này có răng cưa. Mặt lưng của thân và đầu màu xanh lục. Hình 3.8: Cá Bông lau Quan sát thấy rằng các đặc điểm hình thái của 5 mẫu cá thu được phù hợp với các đặc điểm hình thái của cá Bông lau. Đồng thời, các khoảng cách đo được có sự tương đồng với khoảng tỷ lệ của Trương Thủ Khoa (1993). Như vậy đã khẳng định 5 con này thuộc loại cá Bông lau Pangasius krempfi. 37
  50. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 3.2.7. Định danh cá Vồ cờ (Pangasius sanitwongsei) D. II, 7 P. I, 10 V. 5 - 6 A. 30 - 32 Dài chuẩn = 3,5 (3,5 − 3,8) Dài đầu Dài chuẩn = 3,02 (2,7 − 3,3) Cao thân Dài đầu = 1,3 (1,2 − 1,5) Khoảng cách 2 Mắt Dài đầu = 7,3 (5,2 − 9,4) Đường kính mắt Dài đầu = 5,3 (4,0 − 6,1) Cao vòm miệng Dài cuống đuôi = 1,64 − 1,8 Cao cuống đuôi Thân dài, phần trước thân có tiết diện tròn, phần sau dẹp bên. Đầu dẹp bằng, rộng. Răng nhỏ, mịn, răng lá mía kết hợp thành một đám, chiều rộng trước sau tương đương 1/3 chiều rộng phải trái răng khẩu cái có hình tam giác, nằm kề 2 bên răng lá mía, đáy lớn quay vào phía trong xoang miệng. Râu nhỏ, râu mép kéo dài chưa vượt khỏi điểm cuối xương nắp mang, râu cằm ngắn hơn râu mép. Mắt nằm phía trên đường ngang kẻ từ góc miệng, gần như cách đều chót mõm và điểm cuối xương nắp mang. Cuống đuôi thon dài, đường lưng từ chót mõm đến gốc vây lưng tương đối thẳng. Da trơn, không vảy. Mặt lưng của thân và đầu có màu xám và lợt dần xuống bụng, bụng cá có màu trắng. Phần ngọn của vây đuôi có màu đen 38
  51. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Hình 3.9: Cá Vồ cờ Quan sát thấy rằng các đặc điểm hình thái của 5 mẫu cá thu được phù hợp với các đặc điểm hình thái của cá Vồ cờ. Đồng thời, các khoảng cách đo được có sự tương đồng với khoảng tỷ lệ của Trương Thủ Khoa (1993). Như vậy đã khẳng định 5 con này thuộc loại cá Vồ vờ Pangasius sanitwongsei. 39
  52. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 3.3. Kết quả tách chiết DNA Tách chiết DNA là một bước khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Sản phẩm tách chiết DNA chạy điện di trên gel Agarose 1% cho thấy nồng độ DNA tách chiết tương đối cao với kích thước khá đồng đều. Các vạch điện di khá rõ nét, tạo smear không nhiều nên DNA ít bị đứt gãy trong quá trình tách chiết. 3.3.1. Mẫu cá Tra chọn giống của Viện II Hình 3.10: Kết quả chạy điện di trên gel của mẫu cá Tra chọn giống của Viện Thủy sản II. Kết quả hình ảnh 3.10 cho thấy sản phẩm tách chiết DNA chạy điện di trên gel agarose 1 % cho vạch DNA đều, nồng độ DNA khá cao. Sản phẩm DNA tách chiết ít bị đứt, gãy và các DNA cùng kích thước. Quy trình ly trích DNA đạt hiệu quả nhờ sử dụng proteinase K và dung dịch 1 (Solution 1) có vai trò như một dung dịch đệm gồm Tris, EDTA, phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường, phân hủy các protein liên kết với DNA. Đồng thời, việc sử dụng hai lần ethanol 70 % và 100 % cho hiệu quả rửa giải và loại bỏ tạp chất cao, hiệu quả kết tủa DNA cao, không bị lẫn tạp và nồng độ đủ lớn đảm bảo cho phản ứng PCR diễn ra. 40
  53. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 3.4. Định danh bằng sinh học phân tử 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi cytochrome b Bảng 3.2:Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 2 phút 94 30 giây 35 48 – 56 40 giây 72 1 phút 1 72 10 phút 400 bp Hình 3.11: Kết quả tối ưu phản ứng PCR Phản ứng PCR thực hiện tốt, không có hiện tượng bị nhiễm chéo. Từ kết quả hình 3.11 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho sản phẩm có cùng kích thước nhưng vạch sản phẩm không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Trong 8 giếng ứng với 8 nhiệt độ bắt cặp chỉ có giếng số 5 ứng với nhiệt độ 52,6oC cho vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Trong khi các còn lại cho vạch sản phẩm mờ có thể do không phù hợp với nhiệt độ bắt cặp. Nên 52,6oC được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi cytochrome b, nhiệt độ này chênh lệch tương đối lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 52oC. 41
  54. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Sau khi tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp cho mồi cytochrome b theo gradient nhiệt độ. Kích thước sản phẩm trùng khớp với công bố của Li Lian Wong (2011) là từ 416 – 436 bp. Điều này chứng tỏ phản ứng PCR đã khuếch đại được đúng vùng gen cytochrome b mong muốn. 3.4.2. Thí nghiệm 2: Kiểm định tính ổn định của phản ứng PCR Sau khi tối ưu phản ứng PCR, ta chọn nhiệt độ tối ưu là 52,6oC. Nhằm kiểm tra sự ổn định của phản ứng PCR, ta tiến hành chạy PCR trên 30 mẫu cá Tra chọn giống Viện II cho ra kết quả như sau: Bảng 3.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian 1 94 2 phút 94 30 giây 35 52,6 40 giây 72 1 phút 1 72 10 phút 42
  55. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Hình 3.12: Kết quả chạy điện di Dựa trên kết quả nhiệt độ bắt cặp đã được xác định qua thí nghiệm tối ưu phản ứng PCR, tiếp tục tối ưu hóa kiểm tra sự ổn định của phản ứng PCR như chu trình bảng 3.3. Từ kết quả hình 3.19 cho thấy sản phẩm khuếch đại ở nhiệt độ 52,6oC cho sản phẩm gần như là đồng đều. Vạch sản phẩm đậm, rõ nét dần. Tuy nhiên ở giếng số 22, 29, 30 thì vạch sản phẩm bắt đầu mờ. Điều này cho thấy rằng nhiệt độ ảnh hưởng đến kết quả PCR của mồi cytochrome b. Kết quả chạy điện di cho thấy khi chạy 30 mẫu cá Tra chọn giống Viện II thì cho ra sản phẩm PCR là đặc hiệu. Kích thước sản phẩm của 30 phản ứng PCR đều nằm trong khoảng 400 - 430 bp. Điều này cho thấy phản ứng PCR hoàn toàn ổn định. 43
  56. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát kích thước của sản phẩm PCR của cá Tra và 6 mẫu cá da trơn. Tiến hành chạy thử nghiệm phản ứng PCR trên 06 mẫu cá da trơn khác nhau và 01 mẫu cá tra nhằm bước đầu khảo sát sự khác nhau về kích thước của sản phẩm PCR. Dựa vào kết quả này, đề tài sẽ có bước đánh giá hiệu quả sử dụng marker định danh của mồi cytochrome b. 400 bp Hình 3.13: Kết quả điện di 7 mẫu cá da trơn Mẫu 1: Cá Hú Mẫu 2: Cá Vồ đém Mẫu 3: Cá Basa Mẫu 4: Cá Xác sọc Mẫu 5: Cá Vồ cờ Mẫu 6: Cá Bông lau Mẫu 7: Cá Tra Kích thước sản phẩm DNA của 7 mẫu cá da trơn khác nhau sau khi PCR so với vạch thang chuẩn là khoảng 400 - 430 bp. Các mẫu cá có sản phẩm DNA ngắn sẽ có khối lượng nhẹ hơn các vạch cao. Trong đó, kích thước sản phẩm DNA của cá Vồ đém là ngắn nhất, kề đó là cá Xác sọc, còn lại các mẫu cá khác có kích thước sản phẩm DNA nằm ngang nhau. Kết quả này cho thấy cặp mồi cytochrome b chưa đủ đặc hiệu để dùng cho việc định danh các loài các da trơn bằng sinh học phân tử. 44
  57. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Dựa trên các kết quả thu được, có thể rút ra được một số kết luận sau: Sử dụng mẫu vây đuôi để ly trích DNA cá Tra là phù hợp hơn so với mẫu thịt cá. Vì DNA thu được có độ tinh sạch cao, đồng nhất và không đứt gãy. Mồi cytochrome b dễ dàng sử dụng với điều kiện của phòng thí nghiệm tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, sản phẩm PCR rõ, đậm nét sau khi chạy điện di trên gel agarose. Không có sự khác biệt rõ ràng giữa cá Tra và 06 loài cá da trơn khác nếu chỉ dùng điện di trên gel agarose để xác định sự khác biệt. 4.2. Kiến nghị Do thời gian làm đồ án tốt nghiệp có hạn nên em không thể đi đến bước cuối cùng của đề tài, đồ án chỉ dừng lại ở bước định danh bằng điện di trên gel agarose. Do đó tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện phương pháp định danh cá Tra bằng chỉ thị sinh học phân tử cytochrome b nhằm phục vụ cho việc khắc phục những nhược điểm của phương pháp phân loại dựa vào hình thái với những đề xuất sau: Giải trình tự sản phẩm PCR được khuếch đại ban đầu trên gel agarose của những loài cá da trơn đã thu được (cá Hú, cá Vồ đém, cá Basa, cá Xác sọc, cá Vồ cờ, cá Bông lau) sau đó dùng phần mềm tin sinh học để đánh giá sự khác biệt. Từ đó, đưa ra phương pháp định danh cá Tra. Phát triển thêm các cặp mồi khuếch đại vùng khác trên gene cytochrome b phù hợp hơn cho việc định danh. Kết hợp với gen COI, tRNA, để đưa ra phương pháp định danh chính xác cá Tra (P. hypophthalmus) có độ tin cậy > 95%. 45
  58. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1]. Bùi Thị Liên Hà, Nguyễn Văn Sáng, Nguyễn Văn Hảo, David Hurwood, Peter Mather, 2011. Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền quần đàn cá Tra (Pangasianodon hypopthalmus) có nguồn gốc tự nhiên, các trại giống và chương trình chọn giống. Journal of Mekong Fisheries, 15 - 35. [2]. Mai Đình Yên, 1992. Một số dẫn liệu về hình thái học và phân loại học cá bột (ấu trùng) và cá con trên sông Hồng. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. [3]. Trương Thủ Khoa, Trần Thị Thu Hương, 1993. Định loại cá nước ngọt vùng đồng bằng sông Cửu Long. Khoa thủy sản trường đại học Cần Thơ. [4]. Dương Tiến Thể, 2009. Hiện trạng nuôi cá tra, sản xuất giống và giải pháp nâng cao chất lượng giống. Cục nuôi trồng thủy sản. [5]. Vương Học Vinh et al, 2012. Khảo sát một số đặc điểm hình thái của cá Tra nghệ Pangasius kunyit. Khoa thủy sản, Trường Đại học An Giang, tr 313 – 322. 2. TÀI LIỆU TIẾNG ANH [6]. Akasaki, T., Yanagimoto T., Yamakami K., Tomonaga H., Sato S., 2006. Species identification and PCR-RELP analysis of cytochrome b gene in cod fish (oder Gadiformes) products. J Food Sci 71 (3): 190 - 5 [7]. Aranishi, F., Okimoto T., Izumi S., 2005a.Identification of gadoid species (Pisces, Gadidae) by PCR-RFLP analysis. J Appl Genet 46(1): 69 - 73. [8]. Asensio, L., 2007. PCR based methods for fish and fishery products authentication. Trends food sci Technol 18:558 - 556 [9]. Asensio, L., Montero, A., 2008. Analysis of fresh fish labeling in Spanish fish retail shops. Food Control 19: 795-799. [10]. Burgess, W.E., 1989. An atlas of freshwater and marine catfishes.A prelimlnary survey of the Siluriformes.T.F.H. Publication, Neptune City, NJ, USA. 784p. 46
  59. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng [11]. Calo-Mata P, Sotelo C.G., Perez-Martin R.I., Rehbein H., Hold G.L., Russell V.J., Pryde S., Quinteiro J., Rey-Mendez M., Rosa C., Santos A.T., 2003. Identification of gadoid fish species using DNA based techniques. Eur Food Res Technol 217: 259-64 [12]. Civera, T., 2003. Species identification and safety of fish products. Vet Res Commun 27:481- 489. Doi: 10.1023/B:VERC. [13]. Cohen, N.J., Deeds, J.R., Wong, E.S., Hanner, R., Yancy, H.F., White, K.D., Thompson, T.M., Wahl, M., Pham, T.D., Guichard, F.M., Huh, I., Austin, C., Dizikes, G., Gerber, S.I., 2009. Public health response to puffer fish (tetrodotoxin) poisoning from mislabeled product. J Food Prot 72:810 - 817. [14]. Eaton, M.J., Meyers, G.L., Kolokotronis, S., Leslie, M.S., Martin, A.P., Amato, G., 2009. Barcoding bushmeat: molecular identification of central African and South American harvested vertebrates. Conservation Genetics 11: 1389-1404. [15]. Ferraris, C.J., 2007. Checklist of Catfishes, recent and fossil (Osteichthyes, Siluriformes), and catalogue of siluri form primary types. Zootaxa 1418, 2007 Magnolis Press. 628p. [16]. Hajibabaei, M., Smith, M.A., Janzen, D.H., Rodriguez, J.J., Whitfield, J.B., Hebert, P.D.N., 2006. A minimalist barcode can identify a specimen whose DNA is degraded. Mol Ecol Notes 6: 959 - 964. [17]. Hebert, P.D., Ratnasingham, S. and deWaard, J. R., 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc Biol Sci 270 (1). [18]. Hebert, P.D., Stoeckle, M.Y., Zemlak, T.S., Francis, C.M., 2004a. Identification of Birds through DNA Barcodes, ProS Biol 2(10): 312 [19]. Hebert, P.D.N., Penton, E.H., Burms, J.M., Janzen, D.H., Hallwachs, W., 2004. Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. Proc Natl Acad Sci USA 101:14812-14817 47
  60. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng [20]. Hubalkova, Z., Kralik, P., Tremlova, B., 2007. Methods of gadoid fish species identification in food and their economic impact in the Czech Republic: a review. Vet Med 52: 273 - 292 [21]. Hubert, N., Hanner, R., Holm, E., Mandrak, N.E., Taylor, E., Burridge, M., Watkinson, D., Dumont, P., Curry, A., Bentzen, P., Zhang, J., Apirl, J.,Bernatchez, L., 2008. Identifying Canadian freshwater fishes thruongh DNA barcodes. PLoS ONE 3: ẽ90 [22]. Kochzius, M., 2009.Trends in fishery genetics. In: Beamish RJ, Rothschild BJ, eds. The future of fisheries science in North America. Dordrecht, The Netherlands: Fish & Fisheries Series 31, Spinger. Pp 453 - 493. [23]. Kocher, T.D., Lee, W., Sobolewska, H., Penman, D., McAndrew, B., 1998. A genetic linkage map of a cichlid fish, the Tilapia (Oreochromis niloticus). Genetics 148, 1225 – 1232. [24]. Kasnicka, F., 2005. Capillary electrophoresis in food authenticity. J Sep Sci 28:813 – 825. [25]. Lin, W., Shiau, C.Y., Hwang, D.F., 2005. Identification of Thunnus species using mitochondrial cytochrome b gene sequence and PCR-RFLP analysis. Journal of food and Drug analysis, Vol 13, No. 4:382 - 387. [26]. Roberts, T.R., and Vidthayanon, C., 1991. Systematic revision of the Asian catfish family Pangasiidae with biological observations ang descriotion of three new speies. Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia 143: 406 – 252. [27]. Mackie, I.M., Pryde S.E., Gonzales – Sotelo C., Medina I., Perez – Martin R.I., Quinterio J., Rey – Mendez M., Rehbein H., 1999. Challenges indentification of species of canned fish. Trends Food Sci Technol 10: 9 – 14. [28]. Marko, P.B., Lee S.C., Rice A.M., Gramling J.M., Fitzhenry T.M., 2004. Misslabelling of a depleted reff fish. Nature 430: 309 – 310. [29]. Smith, H.M., 1945. Thr frieshwater fishes of Siam or Thailand. Bull. U.S. Natl. Mus. 188: 1 – 622. 48
  61. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng [30]. Sanjuan, A., Comesana A.S., 2002. Molecular indentification of nine commercial flaffish species by polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism analysis of a segment of the cytochrome b region. J Food Prot 65(6): 1016 – 23. [31]. Teletchea, T., Maudet, C., Hanni, C., 2005. Food and forensic molecular indentification: update and challenges. Trends Biotech 23: 265 – 293. [32]. Wolf, C.,Hubner P., Luthy J., 1999. Differentiation of sturgeon species by PCR – REFP. Food Res Inter 32: 699 – 705. [33]. Wong, L.L., Peatman, E., Lu, J., Kucuktas, H., He, S., Zhou, C., Na- nakorn, U. and Liu, Z. (2011). DNA Barcoding of Catfish: Species Authentication and Phylogenetic Assessment. [34]. Waiter, J., Rainboth, 1996. Fishes of The Cambodian MeKong. Food And Agrculture Oranization (FAO) of The United Nations. pp265. [35]. W. Karinthanyakit and A. Jondeung., 2012. Molecular phylogenetic relationships of pangasiid and schilbid catfishes in Thailand. Journal of Fish Biology80, 2549 - 2570. 49
  62. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng PHỤ LỤC A. Một số hình ảnh kết quả chạy điện di các loại cá da trơn Mẫu cá Hú Mẫu cá Basa 50
  63. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Mẫu cá Vồ đém Mẫu cá Xác sọc 51
  64. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Trần Nguyễn Ái Hằng Mẫu cá Bông lau Mẫu cá Vồ cờ 52