Khóa luận Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương cô đặc (soy whey protein isolate) và bột protein đậu tương thủy phân (soy whey protein hydrolysate) từ đậu tương

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương cô đặc (soy whey protein isolate) và bột protein đậu tương thủy phân (soy whey protein hydrolysate) từ đậu tương

1. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN THỊ PHƯỢNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT SẢN PHẨM BỘT PROTEIN ĐẬU TƯƠNG (SOY WHEY PROTEIN ISOLATE) VÀ BỘT PROTEIN THỦY PHÂN (SOY WHEY PROTEIN HYDROLYSATE) TỪ ĐẬU TƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 – 2019 THÁI NGUYÊN, NĂM 2019
2. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN THỊ PHƯỢNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT SẢN PHẨM BỘT PROTEIN ĐẬU TƯƠNG (SOY WHEY PROTEIN ISOLATE) VÀ BỘT PROTEIN THỦY PHÂN (SOY WHEY PROTEIN HYDROLYSATE) TỪ ĐẬU TƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ Sinh học Lớp : K47 – CNSH Khoa : CNSH – CNTP Khóa học : 2015 – 2019 Người hướng dẫn : 1. TS. Phạm Bằng Phương 2. ThS. Vi Đại Lâm THÁI NGUYÊN, NĂM 2019
3. i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp, em đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Phạm Bằng Phương, cùng các thầy cô công tác tại Khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Đại học Nông lâm Thái Nguyên cùng toàn thể cán bộ công tác tại Bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Khoa học Sự sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, những người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thiện khoá luận tốt nghiệp. Xin được bày tỏ sự cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự Sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, ủng hộ và động viên em, giúp đỡ em vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 02 tháng 6 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Phượng
4. ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần axit amin trong hạt đậu tương 4 Bảng 3.1. Danh mục thiết bị được sử dụng 17 Bảng 3.2. Danh mục các loại hóa chất được sử dụng 18 Bảng 3.3. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein theo Lowry 23 Bảng 3.4. Kết quả đo sự ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hàm lượng protein 24 Bảng 3.5: Thành phần dung dịch pha gel SDS - PAGE 25 Bảng 4.1. Hàm lượng protein đậu tương hòa tan ở bước thu dịch sữa đậu 30
5. iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Quá trình biến tính protein của SDS 12 Hình 4.1. Đậu tương xanh 27 Hình 4.2. Sơ đồ quy trình nghiên cứu sản xuất bột đậu tương protein Isolate 28 Hình 4.3. Đường chuẩn xác định hàm lượng protein 29 Hình 4.4. Một số hình ảnh sản xuất thử nghiệm bột protein đậu tương cô đặc 31 Hình 4.5. Sơ đồ quy trình thủy phân protein đậu tương 32 Hình 4.6. Một số hình ảnh sản xuất thử nghiệm bột protein đậu tương thủy phân 33 Hình 4.7: Thử nghiệm sản xuất bột protein thủy phân từ dịch chiết thô enzyme thực vật 34 Hình 4.8. Kết quả điện di mẫu protein thủy phân 35
6. iv DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis BSA Albumin huyết thanh bò HCl Axit clohydric µl Microlit µg Microgram Ml Mililit SPH Soy Protein Hydrolazed SPI Soy Protein Isolate RPM Revolutions Per Minute kDa Kilodalton
7. v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan về đậu tương 3 2.1.1. Giới thiệu chung 3 2.1.2. Cấu tạo và thành phần hóa học chung của hạt đậu tương 3 2.2. Sản xuất protein đậu tương 5 2.3.Thủy phân protein bằng enzyme 8 2.4. Các phương pháp định lượng protein 10 2.4.1. Định lượng protein bằng phương pháp Kjendahl 10 2.4.2. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry 11 2.4.3. Phương pháp điện di protein bằng gel acrylamide 11 2.5. Phương pháp sấy thăng hoa 12 2.5.1. Định nghĩa 12 2.5.2. Nguyên lí hoạt động của hệ thống sấy thăng hoa 13 2.5.3. Ưu nhược điểm của phương pháp sấy thăng hoa 14
8. vi 2.6. Tổng quan tình hình nghiên cứu sản xuất bột protein đậu tương trong nước và trên thế giới 14 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 14 2.6.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15 PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1. Đối tượng, thiết bị và dụng cụ 17 3.1.1. Đối tượng 17 3.1.2. Thiết bị nghiên cứu 17 3.1.3. Hóa chất 18 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu 18 3.2.2. Thời gian tiến hành nghiên cứu 18 3.2.3. Nội dung nghiên cứu 18 3.3. Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1. Lựa chọn nguyên liệu 19 3.3.2. Quy trình nghiên cứu sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương cô đặc 19 3.3.3.Quy trình sản xuất bột protein đậu tương thủy phân 20 3.3.4.Định lượng protein tổngsố bằng phương pháp Kjeldahl 21 3.3.5. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry 23 3.3.6.Phương pháp điện di SDS – PAGE để đánh giá mức độ thủy phân của protein 24 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1. Lựa chọn nguyên liệu và đánh giá hàm lượng protein khô trong đậu tương bằng phương pháp Kjeldahl 27 4.1.1. Lựa chọn nguyên liệu 27 4.1.2. Đánh giá hàm lượng protein khô theo phương pháp Kjeldahl 27
9. vii 4.2. Kết quả nghiên cứu sản xuất thử nghiệm bột đậu tương cô đặc 28 4.3. Kết quả nghiên cứu sản xuất thử nghiệm bột protein đậu tương thủy phân 32 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1. Kết luận 36 5.2. Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37
10. 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L) Merrill) là một nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng, chúng chứa khoảng 40% protein, 20% dầu cũng như các vitamin, muối khoáng và các hợp chất khác. Các thực phẩm giàu protein thường có khả năng giúp cơ thể tăng nhanh cơ bắp, cung cấp đầy đủ năng lượng và giúp cơ thể khỏe mạnh, giúp hỗ trợ quá trình chữa bệnh. Nguồn dinh dưỡng giàu protein có nguồn gốc từ đậu tương có thể cung cấp cho người cần bổ sung dinh dưỡng như người bệnh, người tập thể hình, người ăn kiêng, ăn chay Hiện nay các sản phẩm giàu protein trên thị trường chủ yếu là “whey protein” được làm từ sữa. Những sản phẩm dạng này thường có giá thành cao. Một số sản phẩm vẫn còn lượng chất béo nhất định có nguồn gốc từ động vật có nguy cơ liên quan tới các vấn đề về hệ tuần hoàn như bệnh tim hay xơ vữa thành động mạnh. Vì vậy việc tạo ra một sản phẩm bột protein từ đậu tương (Soy whey protein) với hàm lượng protein cao (≥80%) làm thực phẩm giàu dinh dưỡng cho mọi đối tượng có nguồn gốc từ thực vật với giá thành phù hợp sẽ mang lại nhiều tiềm năng về mặt kinh tế, xã hội đáp ứng nhu cầu của thị trường Việt Nam. Nhằm góp phần chủ động nguồn nguyên liệu protein từ đậu tương có chất lượng tốt phục vụ cho sản xuất các sản phẩm dinh dưỡng, thay thế một số sản phẩm với giá thành cao chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương cô đặc (soy whey protein isolate) và bột protein đậu tương thủy phân (soy whey protein hydrolysate) từ đậu tương”.
11. 2 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất bột protein đậu tương cô đặc và bột đậu tương thủy phân với hàm lượng protein trên 85% để cung cấp cho người cần bổ sung dinh dưỡng như người bệnh, người tập thể hình, người ăn kiêng, ăn chay 1.2.2. Mục tiêu cụ thể Tiến hành các thử nghiệm nghiên cứu làm cơ sở để sản xuất và đưa ra thị trường bột protein đậu tương cô đặc và bột protein đậu tương thủy phân với hàm lượng protein cao, tự chủ sản xuất trong nước, để cung cấp cho người cần bổ sung dinh dưỡng với chất lượng cao và giá thành hợp lý.
12. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về đậu tương 2.1.1. Giới thiệu chung Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) hay còn gọi là đậu nành, là một trong số cây trồng có lịch sử lâu đời nhất của loài người. Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc. Hiện nay đậu tương đã lan truyền khắp thế giới. Các sản phẩm làm từ đậu tương đã được tiêu thụ ở các nước châu Á trong hàng trăm năm. Ở phương Tây, đậu tương chỉ được sử dụng chủ yếu để làm thức ăn chăn nuôi và khai thác dầu cho đến những năm 1950. [5] Hiện nay, đậu tương là một nguồn protein tuyệt vời, cung cấp các axit amin thiết yếu cho dinh dưỡng của con người như lysine và methionine. Việc tiêu thụ protein đậu tương được quan tâm đáng kể từ khi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ chấp thuận tuyên bố về khả năng có thể làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim của chế độ ăn ít chất béo và cholesterol chứa 25% protein đậu nành trong một ngày. Tuyên bố này được thành lập bằng cách xem xét nhiều nghiên cứu dài hạn về tác dụng của protein đậu tương đối với các bệnh tim mạch. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tiêu thụ protein đậu tương có một số tác động tích cực khác đối với sức khỏe, bao gồm hạ huyết áp, giảm mức cholesterol và mỡ cơ thể, phòng chống loãng xương và giảm tỷ lệ mắc ung thư dạ dày, ung thư đại trực tràng và ung thư vú.[14] 2.1.2. Cấu tạo và thành phần hóa học chung của hạt đậu tương 2.1.2.1. Cấu tạo của hạt đậu tương Hạt đậu tương có nhiều hình dạng khác nhau như: Hình tròn, hình dẹt Màu sắc của hạt có nhiều loại khác nhau trong đó đậu tương màu vàng
13. 4 xanh được đánh giá là tốt, được trồng và sử dụng nhiều, có giá trị thương phẩm cao. Hạt đậu tương gồm 3 phần chính: - Vỏ hạt (seed coats) chiếm 8% trong toàn hạt - Phôi (embryo) chiếm 2% trong toàn hạt -Tử diệp (cotyledon) chiếm 90% trong toàn hạt, chứa hàm lượng protein và dầu cao nhất trong toàn hạt.[2] 2.1.2.2. Thành phần hóa học của hạt đậu tương Trong thành phần hóa học của đậu tương, thành phần protein chiếm một tỷ lệ lớn (từ 35 – 40 %). Thành phần axit amin trong protein của đậu tương ngoài methionine và tryptophan còn có các axit amin khác với số lượng khác cao tương đương lượng axit amin có trong thịt (Bảng 2.1). Bảng 2.1: Thành phần axit amin trong hạt đậu tương STT Axit amin Hàm lượng (%) 1 Izoleusine 1,1 2 Leucine 7,7 3 Lyzine 5,9 4 Methionine 1,6 5 Cysteine 1,3 6 Phenylalanine 5 7 Treonine 4,3 8 Tritophan 1,3 9 Valine 5,4 10 Histidine 2,6
14. 5 Lipid trong hạt cũng chiếm tỉ lệ khá lớn, khoảng 18 – 24 % tùy theo giống và điều kiện khí hậu. Trong nhóm lipid của đậu tương có 2 thành phần được xem là quan trọng chiếm khoảng 20% trọng lượng chất khô trong hạt là glyceride và lecithin. Ngoài ra hạt đậu tương còn chứa các thành phần khác như hydratcacbon, chiếm khoảng 30%, các vitamin, đặc biệt là hàm lượng vitamin B1 và B2 cùng các vitamin, A, E, K, C, các khoáng đa lượng, vi lượng. Hàm lượng vitamin D trong đậu tương được đánh giá cao và được khuyến khích sử dụng cho phụ nữ mang thai. Khi tiến hành nghiên cứu, những phụ nữ mang thai sử dụng protein từ đậu tương cũng có được những lợi ích về sức khỏe giống như những phụ nữ sử dụng các protein từ sữa. Tuy nhiên các sản phẩm từ sữa thường không chứa hoặc chứa ít vitamin D so với đậu tương.[12] 2.2. Sản xuất protein đậu tương Việc sản xuất protein đậu tương bao gồm nhiều quá trình tách chiết phức tạp dựa theo mức độ tinh khiết của protein mong muốn đạt được. Protein đậu tương được chiết xuất từ các loại đậu sau khi tách chất béo thường chia thành 4 dạng chính: “Concentrate”- đậm đặc, “Isolate”- cô đặc với độ tinh khiết cao, “Hydrolysate” - thủy phân và “Soy Flour”- bột.[11] Dạng bột (Soy Flour) của đậu tương chứa tối thiểu 50% protein, lượng protein ít nhất so với ba dạng protein đậu tương còn lại. Hình thức thường ở dạng mảnh thô, các mảnh được loại bớt chất béo. Loại sản phẩm này chủ yếu được sử dụng trong sản xuất các sản phẩm dạng nướng, nước sốt và nước thịt. Protein đậu tương cô đặc sở hữu khoảng 70 ~ 80% protein theo trọng lượng khô. Sản xuất protein đậu tương cô đặc bắt đầu bằng cách khử các hạt xay thô và sau đó chiết xuất protein hòa tan bằng cách xử lý nhiệt hoặc trộn
15. 6 với dung môi hữu cơ. Protein đậu tương cô đặc có các hạt mịn hơn, ứng dụng chủ yếu trong thực phẩm như thịt, sản phẩm thay thế thịt, đồ nướng và các thanh dinh dưỡng (thanh, miếng đồ ăn).[11] Dạng Protein đậu tương cô đặc tinh khiết nhất thường được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm là protein đậu tương dạng “isolate” (SPI). Hàm lượng protein của dạng isolate cao (> 90%), các đặc điểm chức năng và thuộc tính cảm quan tuyệt vời, chủ yếu là hương vị nhẹ và màu sáng, SPI được sử dụng trong một loạt các ứng dụng thực phẩm như: Đồ uống dinh dưỡng, sữa bột trẻ em, thịt chế biến, thanh dinh dưỡng và sản phẩm thay thế sữa. SPI được sản xuất từ mảnh đậu tương đã khử chất béo, sau đó là chiết xuất bằng kiềm. Protein hòa tan được kết tủa ở pH 4,5 và ly tâm để tách protein khỏi các polysacarit hòa tan. Kết tủa được phân tán trong nước, sau đó được trung hòa với dung dịch thích hợp và đông khô.[11] Một dạng sản phẩm khác từ protein đậu nành là các sản phẩm thủy phân (SPH). Hiện nay có thể thủy phân protein bằng enzyme từ nhiều nguồn như động vật, thực vật, vi sinh vật. Các enzyme rất đa dạng như: Trypsin, chymotrypsin, substilisin, pepsin, thermolysin, papain, bromelain, ficin, và alcalase. Protein ban đầu được thủy phân để tăng khả năng tiêu hóa protein cho những người bị rối loạn tiêu hóa. Protein sau thủy phân sẽ dễ dàng được hấp thụ ở ruột non do chuỗi a xít amin đã được rút ngắn. Do khả năng tiêu hóa được cải thiện, SPH phù hợp để kết hợp sản xuất sữa bột trẻ em cũng như sử dụng cho những người bị dị ứng với các sản phẩm từ sữa. Cũng như các dạng protein đậu tương khác, SPH được sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm khác nhau như thanh dinh dưỡng và đồ uống.[11] Protein đậu tương chiếm 40 đến 45% toàn bộ đậu tương.Hai loại protein lưu trữ chính là glycinin và-conglycinin, đóng góp khoảng 65 đến
16. 7 80% tổng lượng protein trong một hạt đậu tương điển hình. Protein đậu tương cũng cấu thành nhiều loại enzyme khác nhau như lipoxygenase, chalconesynthase, catalase và urease, tuy nhiên, chúng chiếm ít hơn 1% tổng số protein. Dựa trên hệ số lắng của chúng, glycinin và-conglycinin được phân loại lần lượt là 11S và 7S.[16,17] Glycinin và-conglycinin có các tính chất hóa lý khác nhau đáng kể, bao gồm thành phần hóa học và cấu hình phân tử. Glycinin là một hexamer bao gồm sáu monome có trọng lượng phân tử trung bình từ 320 đến 375 kDa. Ba monome được liên kết với nhau để tạo thành một trimer thông qua các tương tác kỵ nước và hai trimer được xếp chồng lên nhau để tạo thành hexamer bằng các tương tác tĩnh điện và liên kết hydro. Năm loại tiểu đơn vị chính có thể tồn tại trong glycinin, G1, G2, G3, G4 và G5. Ba tiểu đơn vị G1, G2 và G3 sở hữu khoảng 90% tương đồng trình tự với hàm lượng phân tử và axit amin lưu huỳnh cao hơn so với G4 và G5, cũng có khoảng 90% tương đồng trình tự.[21] β-conglycinin là một tông đơn vị có trọng lượng phân tử khoảng 180 kDa, bao gồm ba tiểu đơn vị được tổ chức bởi các tương tác kỵ nước. Bốn loại tiểu đơn vị đã được tìm thấy trong β-conglycinin, bao gồm ba tiểu đơn vị chính là α, α, và và một tiểu đơn vị nhỏ. Protein bao gồm: Protein dự trữ (Globulin) có thể bị thủy phân trong thời gian hạt nảy mầm để làm chất dinh dưỡng cho phôi sinh trưởng Protein cấu trúc (protein chức năng) như enzyme và chất kìm hãm enzyme thì được định vị trong phầ còn lại của tế bào Trong hạt còn có một lượng nhỏ các hợp chất như oestrogen, goitrogen, saponin, Các hợp chất này và một số oligosaccharide không có lợi.
17. 8 Bằng phương pháp ly tâm, người ta đã tách được bốn đoạn 2,7,11,15. Các globulin 7S và 11S chiếm trên 70% tổng lượng protein của hạt. Phương pháp này được phát triển những năm 1970. Globulin 2S (gồm chất kìm hãm trypsin và cytochrome) chiếm 35% trọng lượng protein của hạt. Globulin 11S (Glycinin) được cấu tạo từ 12 tiểu phần tương đối ưa béo: 6 tiểu phần có tính axit và 6 tiểu phần có tính kiềm. Trong phân tử có từ 42 – 46 nguyên tử lưu huỳnh dưới dạng các cầu disulfua nối các đơn vị hay trong nội bộ một tiểu phần. Globulin 7S là β- conglycinin thường chiếm 35% trọng lượng protein của hạt, là một glucoprotein. Phân tử cấu tạo nên từ 3 tiểu phần có tính chất acid: α, α’ và β. Các tiểu phần α, α’ có thành phần acid amin rất giống nhau, thiếu cysteine và cystine. Dưới đon vị β không chưa cysteine và methionine. Trong đoạn 7S còn có các hemaglutine (lectin) mà phân tử của chúng có thể tạo thành phức bền với các hợp chất glucid.[7] Globulin chiếm 85 – 95% hàm lượng protein, khả năng tan của protein đậu tương phụ thuộc chủ yếu vào khả năng tan của globulin. Protein đậu tương chủ yếu thuộc loại tan trong nước. Nếu không bị biến tính trong quá trình chế biến, 85% protein đậu tương sẽ tan trong nước ở pH = 7 và pH = 2, 95% tan ở pH = 11.[7] 2.3.Thủy phân protein bằng enzyme Protein phân hủy và giải phóng các peptide nhỏ hơn ở điều kiện thủy phân tối ưu. Đặc tính của các peptide được giải phóng phụ thuộc vào loại enzyme và điều kiện thủy phân. Đặc tính của các peptide được thoát ra có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, chẳng hạn như nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme và khả năng chọn lọc, mức độ enzyme trên cơ chất, và điều kiện
18. 9 thủy phân bao gồm pH, nhiệt độ và thời gian. Các peptide được giải phóng dẫn đến các tính chất chức năng nâng cao tùy thuộc vào tính chất hóa lý của chúng. Ngoài ra, thủy phân có thể tạo ra những thay đổi trong sự cân bằng của các phần tích điện (chuỗi bên axit amin) dẫn đến tăng độ hòa tan của phân tử. Tuy nhiên, những nghiên cứu này được thực hiện ở nồng độ protein tương đối thấp 0,2 - 1% mà không cần xử lí nhiệt. Độ hòa tan protein bị ảnh hưởng bởi nhiệt và nồng độ, vì vậy tạo ra một loại protein có hàm lượng cao là một trong những thách thức lớn nhất trong ngành thực phẩm. Do đó, cần nhiều nghiên cứu hơn nữa để làm rõ các vấn đề ảnh hưởng của nhiệt độ cũng như nồng độ cao tới tính ổn định của các protein bị thủy phân và hàm lượng protein. Ngoài các hoạt tính chức năng, các peptide hoạt tính sinh học có thể được giải phóng từ thực phẩm có nguồn gốc protein trong quá trình thủy phân enzyme bị hạn chế. Các peptide hoạt tính sinh học có đặc tính là các chuỗi axit amin có nguồn gốc từ protein có thể có tác dụng điều hòa sinh lý đối với cơ thể con người. Các a xít amin có thể lien quan tới vị đắng khi sử dụng enzyme để thủy phân. Đây cũng là nguyên nhân có thể làm hạn chế việc sử dụng enzyme thủy phân làm nguyên liệu thực phẩm. Thủy phân protein đậu tương một phần có vị đắng do sự hình thành các peptide trọng lượng phân tử thấp bao gồm các a xít amin kỵ nước. Độ kỵ nước của một peptide và vị trí của các a xít amin kỵ nước nói chung có thể lieen quan nhiều đến vị đắng của sản phẩm. Để giảm những bất lợi đến chất lượng cảm quan trong khi vẫn giữ được chức năng và hoạt tính sinh học mong muốn, mức độ thủy phân có kiểm soát và hạn chế ở mức 2 - 8%. Nghiên cứu về whey protein đã chỉ ra rằng hàm lượng mức độ thủy phân thấp (2 - 8%) là đủ để đạt được các đặc tính chức năng cao và tối đa giải phóng các peptide hoạt tính sinh học với các peptide trọng lượng phân
19. 10 tử thấp. Do đó, điều quan trọng là duy trì lượng mức độ thủy phân để đạt được các đặc tính chức năng và hoạt động sinh học mong muốn với việc giảm tác dụng phụ đối với chất lượng cảm quan. Thông thường, nhiều peptide hoạt tính sinh học là chuỗi dài tương đối ngắn, bao gồm từ 2 đến 9 axit amin. Tuy nhiên, một số peptide chứa hơn 20 a xít amin vẫn có thể có hoạt tính sinh học. Các peptide hoạt tính sinh học không hoạt động một cách tự nhiên trong một chuỗi protein lớn và có thể được giải phóng thông qua quá trình phân giải enzyme, cả trong đường tiêu hóa của con người và trong quá trình chế biến thực phẩm. Trong khi phân giải enzyme in vivo là ngẫu nhiên và do đó có thể hoặc không dẫn đến việc giải phóng các peptide hoạt tính sinh học, thủy phân enzyme in vitro có thể được kiểm soát để giải phóng các peptide với hoạt tính sinh học quan tâm. Sau khi được giải phóng, các peptide này có đặc tính sinh học tùy thuộc vào trình tự a xít amin được giải phóng, bao gồm cả hạ huyết áp, chống ung thư, chống oxi hóa, kháng khuẩn, điều hòa miễn dịch và khả năng lien kết khoáng chất.[11] 2.4. Các phương pháp định lượng protein 2.4.1. Định lượng protein bằng phương pháp Kjendahl Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc: Hàm lượng nitơ trong protein chiếm tỉ lệ 15-18% khối lượng phân tử, do đó vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác, sau đó dùng kiềm mạnh (NaOH hay KOH) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do. Định lượng NH3 bằng H2SO4 0,1N.[5]
20. 11 2.4.2. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660nm. Cường độ mầu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.[5] 2.4.3. Phương pháp điện di protein bằng gel acrylamide a) Nguyên lí hoạt động của SDS- PAGE: SDS-PAGE (điện di gel natri dodecyl sulphate-polyacrylamide) thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm để tách protein dựa trên trọng lượng phân tử của chúng. Tốc độ di chuyển chênh lệch của protein qua gel dưới tác động của điện trường. SDS được dùng để phá vỡ cấu trúc bậc 3 của protein. SDS được thêm vào đệm điện di cùng với những chất khử như DDT (dithiotheitol) hoặc B- ME (beta-mercaptoethanol) để phá vỡ liên kết disulfide trong protein, biến protein từ dạng không gian (cấu trúc bậc 3) về dạng thẳng (cấu trúc bậc 1). Đồng thời SDS tích điện âm cho protein, làm cho điện tích của phân tử protein lớn hơn hẳn điện tích có sẵn của nó (tồn tại ở gốc R trong amino acid). SDS bám lên protein theo một tỷ lệ ổn định (xấp xỉ 1.4g SDS/ 1g protein), và điều này làm cho điện tích mới của phân tử protein tỷ lệ với khối lượng phân tử của nó.[4] SDS được thêm vào trong thành phần gel để duy trì trạng thái biến tính của protein (duỗi thẳng, tích điện âm) trong suốt quá trình điện di.
21. 12 Hình 2.1. Quá trình biến tính protein của SDS Yếu tố duy nhất ảnh hưởng tới sự di chuyển của các phân tử protein được biến tính bởi SDS chính là kích thước phân tử của chúng. Phân tử protein được biến tính và tích điện âm sẽ tồn tại ở dạng thẳng, có chiều rộng khoảng 18 Å, chiều dài tỷ lệ với khối lượng phân tử (do tồn tại ở dạng thẳng). Kích thước phân tử protein (cùng với đó là tốc độ di chuyển trong gel) được quyết định bởi khối lượng phân tử của protein. Điện tích của protein không ảnh hưởng tới quá trình điện di, do các phân tử protein đã được tích điện âm bởi SDS, và điện tích của mỗi protein lại tỷ lệ với khối lượng phân tử của chính nó.[4] 2.5. Phương pháp sấy thăng hoa 2.5.1. Định nghĩa Sấy: là quá trình tách ẩm ra khỏi vật liệu nhằm tránh hư hỏng trong quá trình bảo quản, tang độ bền cho sản phẩm, giảm trọng lượng, giảm chi phí chuyên trở và đồng thời nó cũng làm tang giá trị cảm quan cho sản phẩm. Sấy thăng hoa: là quá trình tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng sự thăng hoa của nước. Quá trình thăng hoa là quá trình chuyển trực tiếp từ thể rắn qua thể hơi, ở điều kiện bình thường ẩm trong thực phẩm ở dạng lỏng, nên để thăng hoa chúng cần chuyển qua thể rắn bằng phương pháp lạnh đông, chính vì vậy còn gọi là phương pháp sấy lạnh (Freeze Drying hay Liophillisation).
22. 13 Phương pháp sấy thăng hoa do kĩ sư G.I.Lappa Stajenhexki phát minh năm 1921, được ứng dụng lần đầu tiên ở Nga. [1] 2.5.2. Nguyên lí hoạt động của hệ thống sấy thăng hoa Quá trình sấy được tiến hành ở áp suất khí quyển, tác nhân sấy là không khí được đưa vào thiết bị bay hơi của một hệ thống lạnh (bơm nhiệt) để hạ thấp nhiệt độ của chúng xuống dưới điểm động sương, hơi nước trong không khí bị ngưng tụ tách ra làm cho không khí có độ chứa hơi giảm về không, áp suất riêng phần hơi nước trong không khí giảm về không (nhưng không thể bằng không), không khí này được dẫn qua thiết bị ngưng tụ của hệ thống lạnh (bơm nhiệt) để đốt nóng, nhiệt độ không khí tăng lên và lớn nhất bằng nhiệt độ ngưng tụ môi chất lạnh ở thiết bị ngưng tụ. Sau đó, chúng được dẫn vào buồng sấy chứa sản phẩm, dưới sự chênh lệch áp suất riêng của hơi nước trên bề mặt sản phẩm với áp suất riêng của hơi nước trong không khí (tác nhân sấy), hơi nước ở sản phẩm tự bay bốc hơi và làm khô. [1] Nguyên lý hoạt động của phương pháp sấy thăng hoa: Giai đoạn 1 – Giai đoạn tiền đông (prefreezing): Trong giai đoạn này,vật liệu sấy được chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái khí, vật liệu đông khô trước tiên phải được làm lạnh đến nhiệt độ thích hợp nhiệt độ cấp đông trong khoảng từ -50°C đến -80°C (-58°F đến -112°F). Giai đoạn này là quan trọng nhất trong toàn bộ quá trình vì sản phẩm có thể hư hỏng nếu không thực hiện đúng cách. Phương pháp đông lạnh và nhiệt độ cuối của sản phẩm lạnh đông có thể ảnh hưởng đến khả năng đông khô thành công của vật liệu sấy. Giai đoạn 2 – Giai đoạn sấy chủ yếu (giai đoạn sấy thăng hoa): Một số yếu tố có thể gây ảnh hưởng tới khả năng đông khô một hỗn hợp huyền phù đóng băng.
23. 14 Giai đoạn 3 – Giai đoạn sấy thứ cấp (Giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại): Sau khi kết thúc giai đoạn 2, tất cả băng đã thăng hoa. Tuy nhiên vẫn còn hơi ẩm tồn tại bên trong vật sấy. Sản phẩm nhìn về ngoài giống như có trạng thái đã khô, nhưng thực tế độ ẩm còn lại tương đối cao khoảng 7-8%. Giai đoạn sấy thứ cấp này tại nhiệt độ cao hơn là quá trình cần thiết để bốc hơi ẩm còn lại, giúp quá trình sấy đạt hiệu suất tối đa nhất. Quá trình này được gọi là sự giải hấp đẳng nhiệt vì độ ẩm liên kết sẽ được bay hơi khỏi sản phẩm.[1] 2.5.3. Ưu nhược điểm của phương pháp sấy thăng hoa Ưu điểm: Sấy thăng hoa có ưu điểm rất lớn đó là sản phẩm có chất lượng rất cao (giữ nguyên hương vị, màu sắc, cấu trúc và tính thủy hóa) giữ được các hoạt tính sinh học không làm mất các vitamin. Tiêu hao năng lượng để bay hơi hàm lượng ẩm thấp. Nhược điểm: Giá thành thiết bị cao, vận hành cần có trình độ kỹ thuật cao, tiêu thụ điện năng lớn. [1] 2.6. Tổng quan tình hình nghiên cứu sản xuất bột protein đậu tương trong nước và trên thế giới 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Trên thị trường Việt Nam đã có các sản phẩm làm từ đậu tương như là: Bột đậu nành, bột ngũ cốc, bột mầm đậu nành, đậu phụ, nước tương, bánh đậu lên men đó là những sản phẩm được người tiêu dùng biết đến nhiều nhất hiện nay trên thị trường. Tuy nhiên, protein trong những sản phẩm đó chủ yếu ở dạng thô, khó có thể phù hợp cho những trường hợp đặc biệt, ví dụ như các bệnh nhân gặp vấn đề về rối loạn tiêu hóa. Sản phẩm dạng cô đặc (concentrate) cũng đã được giới thiệu trên thị trường trong nước ở một số công ty có liên doanh với công ty, tổ chức với
24. 15 nước ngoài. Tuy nhiên hàm lượng protein chỉ khoảng 65% và chủ yếu sử dụng làm thức ăn chăn nuôi. Các nghiên cứu về sản xuất protein từ đậu tương với mức tinh sạch như dạng “isolate” và dạng thủy phân chưa thấy công bố trên các tạp chí khoa học có uy tín của Việt Nam. Các công bố chủ yếu tập trung về bột protein từ sữa vốn có nhiều nguồn ý kiến phản đối, ủng hộ đa chiều (Việc tách bê con lấy sữa và thu nhận thịt bê con bị nhiều tổ chức và cá nhân phê phán về mặt đạo đức). Do đó, nghiên cứu nguồn protein tinh sạch mới từ thực vật là một hướng đi mới, có giá trị về mặt thực phẩm và kinh tế đồng thời vượt qua các rào cản từ các ý kiến đa chiều. 2.6.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Đậu tương là nguồn dinh dưỡng quan trọng ở nước châu Á và ngày càng được ưa chuộng ở châu Mỹ, châu Âu. Nhờ việc ứng dụng các công nghệ tiến bộ, người ta đã trích ly riêng protein vốn rất nhiều trong đậu tương. Các chế phẩm protein đậu tương được sử dụng để chế biến các thực phẩm chức năng như thực phẩm cho trẻ sơ sinh, thực phẩm trong điều trị bệnh. Nhiều nghiên cứu đã và đang được tiến hành để làm rõ và khai thác các lợi ích thiết thực của nguồn protein từ thực vật này. Năm 2003, Kristen S. Montgomery - tại trường đại học USC (University of South Carolina) đã công bố trên tạp chí TJPE (The Journal of Perinatal Education) về các protein và khẳng định những protein này rất tốt cho sức khỏe của trẻ em và phụ nữ.[12] Năm 2004, Miroljub B. Barać và cộng sự cũng công bố những quan điểm, lập luận đồng tình về những lợi ích của protein từ đậu tương. Một số yếu tố làm giảm dinh dưỡng của sản phẩm từ đậu tương như: Hemagglutinins, phytic acid, saponins và isoflavones cũng được đề cập tới. Đây là những chất ức chế
25. 16 các enzyme proteases. Tuy nhiên khi ở nồng độ thấp, chúng lại có những tác dụng có lợi cho sức khỏe. Vì vậy, trong các khuyến cáo về việc phát triển công nghệ, các vấn đề liên quan tới biến đổi protein như nhiệt độ, chất hóa học, enzyme được chú ý và đào sâu.[17] Gần đây nhất, tháng 02 năm 2019, một công bố mới của Eric Banan- Mwine Daliri và cộng sự về việc thành công trong việc sử dụng protein từ đậu tương sản xuất sản phẩm sử dụng cho bệnh nhân cao huyết áp với sự kết hợp của các enzyme từ vi sinh vật cho thấy xu hướng sử dụng và khai thác nguồn protein thực vật, đồng thời việc kết hợp nhiều thành tựu của các lĩnh vực khoa học như vi sinh, hóa sinh, là một xu thế tất yếu.[11]
26. 17 PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, thiết bị và dụng cụ 3.1.1. Đối tượng Đậu tương hạt (đậu tương thương phẩm): Đậu tương xanh, được mua tại các đại lý bán buôn, bán lẻ tại khu vực chợ Đồng Quang – Thái Nguyên. 3.1.2. Thiết bị nghiên cứu Bảng 3.1. Danh mục thiết bị được sử dụng STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ 1 Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany 2 Bộ điện di Scie – plas Ltd – Uk 3 Bể ủ nhiệt Techne – OSI 4 Máy nước cất Canada Bio Water system – Pall Co.Uk 5 Máy chụp gel Gel Logic 1500 – Kodak – USD 6 Máy đo pH F – 51 BW – Horiba - Japan 7 Máy xay Panasonic 8 Máy ly tâm Eppendorf – CHLB Đức 9 Tủ lạnh Super freezer Eco 130 – Ficchetti – Italy 10 Máy sấy lạnh Metech Việt Nam 11 Máy nghiền bột IKA – WERKE 12 Máy đo quang phổ Thermofisher 13 Cốc đong, ống đong Dinlab – Đức
27. 18 3.1.3. Hóa chất Bảng 3.2. Danh mục các loại hóa chất được sử dụng STT Tên hóa chất Hãng sản xuất 1 Ethanol Merck 2 Isopropanol Merck 3 Tris Base Merck 4 Comassia Brilliant Blue R-250 Bio Basic 5 Bromophenol blue Bio Basic 6 Protein ladder Thermo scientific 7 HCl Trung Quốc 8 NaOH Trung Quốc 9 Acetic acid Trung Quốc 10 Glycerol Biogenix inc private limited 11 Coomassie Brilliant Blue G-250 Bio Basic 12 Temed Bio – Rad 13 Albumin (BSA) Bomei 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu Bộ môn sinh học phân tử và Công nghệ gen – Viện Khoa học Sự Sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên – Tổ 10 – Xã Quyết Thắng – Tp Thái Nguyên. 3.2.2. Thời gian tiến hành nghiên cứu Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 01/01/2019 – 30/05/2019. 3.2.3. Nội dung nghiên cứu - Lựa chọn nguyên liệu và đánh giá hàm lượng protein khô theo phương pháp Kjeldahl
28. 19 - Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất bột protein isolate - Định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry - Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất bột protein thủy phân - Đánh giá mức độ thủy phân của protein bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Lựa chọn nguyên liệu Tạp chất trong nội dung này được hiểu là các yếu tố không mong muốn như: Cát, sỏi, các hạt teo lép. Cân 100g đậu sau đó loại bỏ tạp chất, rồi đem cân lại khối lượng. Nguyên liệu ít tạp chất nhất được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.2. Quy trình nghiên cứu sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương cô đặc Dựa vào các trang thiết bị có sẵn tại Viện Khoa học Sự sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương cô đặc và protein thủy phân được nghiên cứu xây dựng như sau: Bước 1: Tiến hành ngâm đậu tương ở các mức thời gian khác nhau: 4h, 7h, 10h, 12h. Lượng nước ngâm là 250ml/100g đậu, nhiệt độ phòng. Bước 2: Đậu tương đã ngấm nước, tiến hành loại bỏ vỏ hạt bằng cách chà xát thủ công sau đó nhúng vào nước. Lớp vỏ đậu tương sau khi tách sẽ nổi trên mặt nước, dùng tay hoặc rổ hớt bỏ hoàn toàn phần vỏ ra khỏi hạt đậu tương. Bước 3: Tiếp theo sau khi tách vỏ, hạt đậu tương được cho vào máy và cho thêm nước để xay nhỏ mục đích để phá vỡ hạt và giải phóng protein. Giai đoạn này có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tách protein, đồng thời dùng nước hòa tan các chất để thu được dung dịch “sữa đậu”, thời gian xay khoảng 3 – 5 phút.
29. 20 Bước 4: Sau khi xay, thu được hỗn hợp đậu tương gồm có dịch sữa đậu tương và những chất rắn không tan trong nước. Lọc ít nhất 2 lần để có thể thu được phần dịch sữa đậu nhiều nhất và loại hoàn toàn phần bã ra khỏi dung dịch sữa đậu tương. Bước 5: Sau khi thu được dịch lỏng, tiến hành ly tâm lạnh 14000 vòng trong 30 phút. Ly tâm bỏ dịch nổi thu cặn và sử dụng phương pháp sấy thăng hoa để sấy khô. Bước 6: Dùng phương pháp sấy thăng hoa để tạo ra được sản phẩm dạng bột mịn, thời gian bảo quản lâu. 3.3.3.Quy trình sản xuất bột protein đậu tương thủy phân Nguyên liệu: Chuẩn bị nguyên liệu sạch tạp chất. Quá trình sản xuất bột protein thủy phân gồm các công đoạn sau: Công đoạn 1: Tiến hành ngâm đậu tương ở các mức thời gian khác nhau: 4h, 7h, 10h, 12h. Lượng nước ngâm là 250ml/100g đậu, nhiệt độ nước ngâm là 15 – 20˚C (nhiệt độ phòng). Công đoạn 2: Đậu tương sau khi ngâm được loại bỏ vỏ hạt bằng cách chà xát thủ công và nhúng vào nước. Lớp vỏ đậu tương sau khi tách sẽ nổi trên mặt nước, dùng tay hoặc rổ hớt bỏ hoàn toàn phần vỏ ra khỏi hạt đậu tương. Công đoạn 3: Tiếp theo sau khi tách vỏ, hạt đậu tương được cho vào máy và cho thêm nước để xay nhỏ nhằm giải phóng protein, đồng thời dùng nước hòa tan các chất để thu được dung dịch sữa đậu, xay trong thời gian khoảng 3 – 5 phút. Công đoạn 4: Hỗn hợp đậu tương sau khi xây gồm có hai thành phần: Dịch sữa đậu tương và những chất rắn không tan trong nước. Lọc ít nhất 2 lần
30. 21 để có thể thu được phần dịch sữa đậu nhiều nhất và loại hoàn toàn phần bã ra khỏi dung dịch sữa đậu tương. Công đoạn 5: Để thu nhận protein trong dịch sữa đậu, dùng axit HCl để tủa protein hòa tan trong dung dịch. Với sự có mặt của HCl, pH của dung dịch được đưa về 4,5 là pH đẳng điện của protein globulin. Nhiệt độ kết tủa ở 45˚C với các mức thời gian khác nhau 1h, 2h, 3h. Sau khi tủa rửa lại bằng nước để loại bỏ một phần axit ra khỏi dịch thủy phân protein. Công đoạn 6: Dùng NaOH để trung hòa đưa pH về 7 – 9 Công đoạn 7: Sử dụng máy ly tâm lạnh để ly tâm thu protein bỏ phần dịch trên, ly tâm 14000 vòng trong thời gian 30 phút. Công đoạn 8: Sử dụng máy sấy lạnh để sấy với nhiệt độ - 60˚C, áp suất 120mmTorr trong 10h đến 16h. 3.3.4.Định lượng protein tổngsố bằng phương pháp Kjeldahl Trong phương pháp Kjeldahl, mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 98%, kết hợp với chất xúc tác để chuyển Nitơ hữu cơ ra dạng vô cơ (NH4)2SO4, rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối amoni. Các phân tử NH3 sau khi được giải phóng ra sẽ được cuốn đi bằng dòng hơi nóng. Sau khi được làm nguội sẽ hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có mầu xanh trong. Để xác định lượng ammoniac (NH3) giải phóng ra trong quá trình chưng cất, tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang màu tím nhạt. Dư lượng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ cho phép tính được lượng protein có trong mẫu. Thuốc thử và vật liệu: + Axit sunfuaric, (H2SO4) = 1,84g/mol
31. 22 + Chất xúc tác, (Viên xúc tác Kjeltao ST và Kjeltab CM của hang Gerhardt) + Hydroxit natri, (NaOH) 33% + Chất chỉ thị màu Tashiro + Axit Boric (H3BO3) 4% + Axit sunfuric (H2SO4) 0,1N + Nước cất + Chất chuẩn Dụng cụ và thiết bị Hệ thống phân tích Nitơ bao gồm: Bộ công phá mẫu Turbortherm – Gerhardt và hệ thống chưng cất mẫu Vapodest 40 – Gerhardt, tủ hút có hệ thống thông gió, máy khuấy từ, Buvet điện tử, cân phân tích điện tử với độ chính xác 0,0001, ống công phá mẫu Kjeldahl 250ml. Kết quả Để có thể biết được hàm lượng protein tổng số ta tính toán theo công thức V – V1 × f × 0,0014 x 6,25 × 100 X= m Trong đó: X: là lượng protein có trong mẫu V: là lượng H2SO4 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ cho mẫu phân tích (ml) V1: là lượng H2SO4 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ cho mẫu trắng (ml) f: là hệ số chuẩn độ a xít (hệ số sử dụng dung dịch) 0,0014: là lượng Nitơ tương ứng với 1ml dung dịch a xít sulphuaric 0,1N m: là khối lượng mẫu (g) Chúng ta biết rằng trong chất đạm có chứa khoảng 16% N, vì vậy việc tính toàn lượng đạm hàm lượng N thường được dùng hệ số 100/16 = 6,25.
32. 23 3.3.5. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry Nguyên tắc: Dựa vào cường độ màu xanh của phức đòng chất, protein khử hỗn hợp Phosphomolipdate – phosphovonphramate (thuốc thử Foling – Ciocalteau). Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein.[5] Lập đồ thị chuẩn định lượng protein: Nguyên liệu và hóa chất: Albumin tiêu chuẩn 100%. Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N Dung dịch B : CuSO4 0,5% trong Natri, kali tactrate 1N Dung dịch C : 49 ml dung dịch A: 1 ml dung dịch B Thuốc thử Folling. Pha dung dịch albumin 0,02% từ albumin gốc tinh khiết 100%. Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6, cho các chất tham gia phản ứng trong bảng 3.1. Sau đó đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 660nm. Bảng 3.3. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein theo Lowry Các ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Hóa chất Protein 0,02% 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Nước cất (ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Lượng protein (ml) 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 Dung dịch C (ml) 4 4 4 4 4 4 Thuốc thử Follin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Kết quả đo OD ở 660 nm 0,00 0,091 0,182 0,252 0,332 0,377
33. 24 - Cách tiến hành: + Mẫu thí nghiệm: Lấy 0,5 ml dung dịch đậu tương, thêm vào 0,5ml H2O và 4 ml dung dịch C, lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Sau đó thêm chính xác 0,5 ml thuốc thử Follin nồng độ 1N, lắc đều, để 30 phút sau đó đem so màu trên máy với bước sóng 660nm. + Từ số đọc của mẫu thí nghiệm, đối chiếu với đồ thị để tính ra hàm lượng protein có trong mẫu. + Mẫu đối chứng: Song song với mẫu thí nghiệm, làm ống đối chứng trong đó thay dung dịch protein bằng nước cất và tiếp tục làm như mẫu thí nghiệm. Bảng 3.4. Kết quả đo sự ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hàm lượng protein Thí nghiệm (T/g) Đ/c 4h 7h 10h 12h Hóa chất Dd protein mẫu(ml) 0 0,5 0,5 0,5 0,5 Nước cất (ml) 1 0,5 0,5 0,5 0,5 Dd C (ml) 4 4 4 4 4 Dd folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Kết quả OD ở 660nm 0,00 0,0157 0,016 0,0159 0,058 3.3.6.Phương pháp điện di SDS – PAGE để đánh giá mức độ thủy phân của protein SDS-PAGE phân tách protein theo trọng lượng phân tử của chúng, dựa trên tốc độ di chuyển chênh lệch của chúng (gel) dưới tác động của điện trường. Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau:
34. 25 Bảng 3.5: Thành phần dung dịch pha gel SDS - PAGE Stacking Seperating Gel Gel 7.5% 10% 12.5% 15% 17.5% 20% 4% Monomer  2ml 2.67ml 3.34ml 4ml 4.67ml 5.34ml 0.67ml 4☓resolving gel buffer 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 1.25ml  Water  3.86ml 3.19ml 2.53ml 1.86ml 1.19ml 5.25ml 3ml 10% SDS  80μl 80μl 80μl 80μl 80μl 80μl 50μl 10% APS 60μl 60μl 60μl 60μl 60μl 60μl 25μl TEMED  4μl 4μl 4μl 4μl 4μl 4μl 5μl Chuẩn bị gel Seperating 12.5% và Stacking 4%: - Các bước tiến hành: + Chuẩn bị dung dịch + Lau sạch 2 tấm kính làm khuôn gel và miếng đệm + Rót dung dịch gel vào giữa 2 tấm kính rồi gắn lược vào + Để trong nhiệt độ phòng trong 30 phút + Rút lược, tháo băng, gắn khuôn gel vào buồng điện di + Đổ dung dịch đệm Running buffer 1x vào bể điện di đủ để ngập hết bản gel. - Tra mẫu điện di: + Sử dụng Loading Buffer => tỉ lệ mẫu được pha trộn là 20µl mẫu + 5µl loading buffer rồi để 100˚C trong 5 phút. + Cài đặt chương trình điện di ở hiệu điện thế:
35. 26 Step1: 50V, 100mA, 15W trong 30 phút Step2: 100V, 200mA, 30W trong 1 giờ 30 phút - Nhuộm gel với dung dịch Coomassie Blue Stain: + Bản gel được lấy ra khỏi bể điện di sau khi điện di xong và được nhuộm qua đêm. + Rửa gel bằng dung dịch Isopropanol Fixing Solution + Kiểm tra kết quả điện di và chụp ảnh bản gel.
36. 27 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Lựa chọn nguyên liệu và đánh giá hàm lượng protein khô trong đậu tương bằng phương pháp Kjeldahl 4.1.1. Lựa chọn nguyên liệu Để lựa chọn nguyên liệu đậu tương thích hợp cho chế biến sản phẩm bột protein đậu tương. Loại “đậu tương xanh” có kích cỡ hạt tương đối đồng đều, màu vàng xanh và ít hạt bị hỏng được lựa chọn làm nguyên liệu ban đầu. Những tạp chất không mong muốn bị loại bỏ, thu được những hạt chắc và tốt để đảm bảo cho quá trình sản xuất sản phẩm không bị ảnh hưởng bởi những yếu tố khác (Hình 4.1). Hình 4.1. Đậu tương xanh Đậu tương sau chọn lọc được bảo quản ở nhiệt độ thường, trong túi zip để tránh côn trùng, hơi ẩm hoặc các tác nhân bên ngoài không mong muốn. 4.1.2. Đánh giá hàm lượng protein khô theo phương pháp Kjeldahl Kết quả được kiểm tra bằng phương pháp Kjeldahl tại phòng Phân tích Hóa sinh – Viện Khoa học Sự sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Kết quả cho biết trong đậu tương hàm lượng protein thô chiếm
37. 28 37,2%. Nồng độ này phù hợp với hàm lượng protein trong đậu tương nói chung. Vì vậy, đậu tương xanh là nguyên liệu phù hợp cho nghiên cứu tạo ra sản phẩm bột protein ở Việt Nam cùng với ưu điểm giá thành thấp, dễ kiếm, được đông đảo người dân sử dụng. 4.2. Kết quả nghiên cứu sản xuất thử nghiệm bột đậu tương cô đặc Bột đậu tương cô đặc thường có màu trắng sữa, mịn và có hàm lượng protein cao. Quy trình sản xuất gồm nhiều công đoạn phức tạp (hình 4.2). Hình 4.2. Sơ đồ quy trình nghiên cứu sản xuất bột đậu tương protein Isolate Đầu tiên, những hạt đậu tương có màu sáng, không bị mốc hỏng được ngâm trong thời gian từ 7h đến 10h ở nhiệt độ phòng. Trong giai đoạn này hạt hút nước và trương nở đều, nước ngâm không tạo bọt, hạt đậu không bị nhũn, bề mặt không có màu thâm đen hay màu sắc bất thường.
38. 29 Sau khi ngâm, đậu tương được tách và loại bỏ hết phần vỏ thu được phần hạt chứa nhiều chất dinh dưỡng. Tiếp đến, đậu tương được xay ướt để thu được dung dịch có màu trắng sữa chứa protein. Sử dụng một chiếc khăn sạch để lọc phần dịch sữa đậu và bỏ phần bã. Cần tiến hành lọc tối thiểu hai lần. Dịch sữa đậu sau lọc có màu trắng sữa và không còn dính phần bã. Tiến hành đo hàm lượng protein hòa tan của dịch đậu tương sau lọc theo phương pháp Lowry. Đường chuẩn được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Hóa sinh, viện Khoa học Sự sống, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên (Hình 4.3). Hình 4.3. Đường chuẩn xác định hàm lượng protein Từ kết quả đo OD và công thức đường chuẩn, xác định được hàm lượng protein của các mẫu đậu tương với thời gian ngâm khác nhau. Theo đó giá trị OD là x, hàm lượng protein trong dung dịch cần xác định là y. Kết quả hàm lượng protein tính được cho thấy thời gian ngâm đậu cũng ảnh hưởng đến kết quả thu protein trong quá trình nghiên cứu (bảng 4.1). Thời gian ngâm quá ngắn sẽ làm đậu trương nở không hoàn toàn, ảnh hưởng tới quá trình xay kế tiếp, các mảnh hạt còn nhiều. Thời gian ngâm trong nước lâu, bề mặt nước
39. 30 thường tạo váng, có mùi chua. Nguyên nhân có thể do thay đổi pH trong quá trình trao đổi chất của hạt hoặc sự phát triển của vi sinh vật. Điều này sẽ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Bảng 4.1. Hàm lượng protein đậu tương hòa tan ở bước thu dịch sữa đậu Thời gian STT Mật độ quang (A) Hàm lượng protein (%) ngâm mẫu 1 4h 0,0157 40 2 7h 0,016 45 3 10h 0,0159 43 4 12h 0,0158 42 Dung dịch sữa đậu sau lọc được ly tâm và loại bỏ dịch nổi. Cuối cùng, sử dụng phương pháp sấy thăng hoa ở nhiệt độ -60˚C. Kết quả cho thấy sản phẩm thu được có dạng bột mịn và có màu trắng sữa (hình 4.3E). Hình thức bột đẹp mắt tạo cảm quan tích cực, có mùi rất nhẹ đặc trưng của đậu tương. Bột đậu tương cô đặc sau khi sản xuất thử nghiệm được kiểm tra hàm lượng protein tại phòng Phân tích Hóa sinh – Viện Khoa học Sự sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên bằng phương pháp Kjeldahl thu được kết quả protein là 44,22%. Từ kết quả trên cho thấy hàm lượng protein sau thu nhận chưa thực sự cao. Nguyên nhân có thể do quá trình thu nhận protein bằng ly tâm không thu nhận được toàn bộ protein hòa tan, hoặc quá trình lọc gây thất thoát protein. Các nghiên cứu nhằm tối ưu hóa quá trình thu nhận protein vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu và thử nghiệm.
40. 31 A-Đậu tương nguyên hạt B- Sau khi tách vỏ C- Sau khi xay ướt D- Sau khi lọc Chú thích: - Hình A và B: Nguyên liệu ban đầu - Hình C: Hỗn hợp đậu tương trước lọc - Hình D: Hỗn hợp đậu tương sau lọc - Hình E: Bột đậu tương cô đặc thử nghiệm E- Sau khi sấy khô Hình 4.4. Một số hình ảnh sản xuất thử nghiệm bột protein đậu tương cô đặc
41. 32 4.3. Kết quả nghiên cứu sản xuất thử nghiệm bột protein đậu tương thủy phân Bột đậu tương có thể được thủy phân bằng enzyme hoặc axit HCl. So với bột protein cô đặc, trong protein thủy phân có nhiều thành phần peptide, có ý nghĩa trong việc sản xuất các sản phẩm cho người có chế độ ăn đặc biệt. Quy trình sản xuất tổng quát gồm nhiều bước với những điều kiện riêng (hình 4.4). Hình 4.5. Sơ đồ quy trình thủy phân protein đậu tương Sự khác biệt trong quá trình sản xuất protein đậu tương cô đặc và protein thủy phân là quá trình thủy phân bằng axit HCl loãng và trung hòa bằng NaOH loãng để đưa pH về mức trung tính hoặc kiềm nhẹ. Nếu thay thế
42. 33 HCl bằng enzyme sẽ rút ngắn được bước trung hòa bằng kiềm trong quá trình sản xuất. Phần protein sau ly tâm được sấy bằng phương pháp sấy thăng hoa ở nhiệt độ - 60, áp suất 120mmTorr trong 10 đến 16h (hình 4.5). A- Sau khi thủy phân bằng HCl B- Trung hòa C- Sau khi ly tâm D- Bột khi sấy khô E-Bột sau nghiền Hình 4.6. Một số hình ảnh sản xuất thử nghiệm bột protein đậu tương thủy phân
43. 34 Kết quả cho thấy, sau khi thủy phân bằng axit HCl, hỗn hợp sữa đậu tương chia thành hai phần rõ rệt (Hình 4.5 A). Dịch trong phía trên là nước và các tạp chất, phần dịch trắng phía dưới chứa các protein đậu tương đang được quan tâm. Sau khi trung hòa, ly tâm và sấy khô, thu nhận được bột đậu tương có màu vàng nhạt, mềm, mịn. Sử dụng phương pháp đo Kjeldahl, xác định được hàm lượng protein trong mẫu thủy phân là 60,74%. Thay thế HCl bằng hỗn hợp enzyme bromelain từ dứa cũng thu được kết quả đáng chú ý. Sau khi bổ sung dịch chiết dứa vào dịch đậu tương sau hai lần lọc, dung dịch cũng chia thành hai pha (Hình 4.6). Tuy nhiên sản phẩm cuối dạng bột có độ mịn kém. Mặt khác dịch chiết dứa có chứa enzyme protease nhưng ở dạng thô, còn nhiều tạp chất, có thể làm ảnh hưởng hoạt động của enzyme vì vậy cần nghiên cứu thêm. A B Hình 4.7: Thử nghiệm sản xuất bột protein thủy phân từ dịch chiết thô enzyme thực vật A: Dung dịch sữa đậu tương sau thủy phân; B: Bột protein.
44. 35 4.3.1 Kết quả phân tích đánh giá mức độ thủy phân của protein bằng phương pháp điện di Để biết được mức độ thủy phân protein đậu tương, phương pháp chạy điện di protein SDS – PAGE được sử dụng. Sử dụng dung dịch protein sau thủy phân bằng HCl và thử nghiệm thủy phân trong 1h, 2h, 3h (hình 4.7). Hình 4.8. Kết quả điện di mẫu protein thủy phân Kết quả cho thấy giếng số 1(đối chứng) có nhiều băng đậm do hàm lượng protein còn nhiều, chưa bị thủy phân. Giếng số 2, số 3, số 4 có mẫu tương ứng với lượng protein thủy phân sau 1,2,3 giờ. Các băng protein thu được theo thứ tự có kích thước nhỏ dần do lượng protein bị thủy phân ngày càng nhiều. Điều này cho thấy thời gian thủy phân có tác động rõ rệt tới sản phẩm thủy phân.
45. 36 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Đã xác định được đậu tương xanh là nguyên liệu phù hợp để sản xuất bột protein đậu tương. - Đã đánh giá được thời gian ngâm xử lí đậu tương xanh trong quá trình nghiên cứu sản xuất. - Đã bước đầu sản xuất thành công bột protein cô đặc và bột protein thủy phân từ đậu tương. - Đã xác định được hàm lượng protein trước và sau khi sản xuất. - Đã đánh giá được mức độ thủy phân của protein trong nhiều giờ khác nhau. - Đã xác định được hiệu quả lọc chưa cao là nguyên nhân gây thất thoát protein trong quá trình nghiên cứu sản xuất. 5.2. Đề nghị Do thời gian nghiên cứu ngắn nên nhiều vấn đề phát sinh trong quá trình nghiên cứu vẫn chưa được giải quyết triệt để, vì vậy nhóm nghiên cứu xin đưa ra một số đề nghị như sau: - Tiếp tục tiến hành nghiên cứu để có thể đưa ra được sản phẩm bột protein đậu tương có hàm lượng cao ≥ 90%. - Tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện khả năng ứng dụng các enzyme thực vật, vi sinh vật vào quá trình thủy phân để tăng năng suất thu hồi, tăng khả năng thủy phân và đánh giá mức độ an toàn thực phẩm.
46. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Trần Đức Ba – Phạm Văn Bôn – Chuomk L.G – Larianovski C.I – Parkkaladze E.G – “Công nghệ lạnh thực phẩm nhiệt đới”, NXB ĐHBK TpHCM 1993. 2. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp Hà Nội. 3. Đàm Sao Mai (2010), “Hóa sinh thực phẩm” –, NXB ĐHQG TP Hồ Chí Minh 4. Võ Công Thành (2004), “Giáo trình kỹ thuật điện di”, Khoa Nông Nghiệp trường ĐH Cần Thơ. 5. Nguyễn Quang Vinh, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa, “Thực tập hóa sinh”, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, (2004). Tài liệu nước ngoài 6. Cynthia Chatterjee, Stephen Gleddie, and Chao-Wu Xiao (2018), “Soybean Bioactive Peptides and Their Functional Properties”. 7. Chun Liu, Hongling Wang, Zhuimei Cui, Xiaoling Hia, Xiaseng Wang (2006). “Otimizaion of extration and isolation for 11S and 7S globulis of soybean seed strage protein”. 8. De Angelis E., Pilolli R., Bavaro S.L., Monaci L (2017). “Insight into the gastro-duodenal digestion resistance of soybean proteins and potential implications for residual immunogenicity”, Food Funct. 9. Erdman và Fordyce, (1989).Soy products and the human diet. 10. Eric Banan-Mwine Daliri, Fred Kwame Ofosu, Ramachandran Chelliah, Mi Houn Park, Jong-Hak Kim 2 and Deog-Hwan Oh (2019) “Development of a Soy Protein Hydrolysate with an Antihypertensive Effect”, International Journal of Molecular Sciences, 20, 1496.
47. 38 11. Jookyeong Lee (2011), “Soy protein hydrolysate; solubility, thermal stability, bioactivity, and sensory acceptability in a tea beverage”, University of Minnesota. 12. Kristen S. Montgomery (2003), “Soy Protein, The Journal of Perinatal Education”, The Journal of Perinatal Education, Vol. 12, No. 3 13. Ma, C – Y (2015), “Soy bean/ Soy Concentrates and Isolates”, Reference Module in food science. 14. Messina MJ, Loprizi CL (2001), “Soy for breast cancer survivors”. 15. Miroljub B. Barać, Slađana P. Stanojević, Snežana T. Jovanović and Mirjana B. Pešić (2004), “Soy protein modification - A review”, University of Belgrade, Faculty of Agriculture. 16. Nutritional Aspects, and Utilization – Joseph G. Enders, Ph.D, “Soy protein products Characteristics”, The Endres Group, Inc.Fort Wayne, Indiana. 17. Park J.H., Jeong H.J., Lumen B.O.(2007), “In vitro digestibility of the cancer-preventive soy peptides lunasin”, Food Chem. 18. Song W.O., Chun O.K., Hwang I., Shin H.S., Kim B.G., Kim K.S., Lee S.Y., Shin D., Lee S.G,(2007), “Soy isoflavones as safe functional ingredients”, J. Med. Food. 19. W. J. Stadelman, A. Watrins, (1997),“Analysis of Food Constiunents”, Wiley – VCH. 20. Wang Q., Ge X., Tian X., Zhang Y., Zhang J., Zhang P.(2013), “Soy isoflavone: The multipurpose phytochemical (Review) Biomed”,Rep. 21. Wang W., De Mejia E.G.(2005), “A new frontier in soy bioactive peptides that may prevent age-related chronic diseases”,Comp. Rev. Food Sci. Food Saf.
48. 39 22. Yamada Y., Muraki A., Oie M., Kanegawa N., Oda A., Sawashi Y., Kaneko K., Yoshikawa M., Goto T., Takahashi N., et al.(2012), “Soymorphin, a soy-derived mu-opioid peptide, decreases glucose and triglyceride levels through activating adiponectin and PPARalpha systems in diabetic KKAy mice”. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.