›

Đồ án Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của Escherichia coli phân lập trong thực phẩm được kiểm nghiệm tại Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh

pdf 97 trang thiennha21 12/04/2022 2930
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của Escherichia coli phân lập trong thực phẩm được kiểm nghiệm tại Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_do_nhiem_khuan_va_kha_nang_khang_khang_sinh_c.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của Escherichia coli phân lập trong thực phẩm được kiểm nghiệm tại Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐỘ NHIỄM KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TRONG THỰC PHẨM ĐƯỢC KIỂM NGHIỆM TẠI VIỆN PASTEUR THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. BS Cao Hữu Nghĩa Sinh viên thực hiện : Huỳnh Lê Trung MSSV: 1211100222 Lớp: 12DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐỘ NHIỄM KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TRONG THỰC PHẨM ĐƯỢC KIỂM NGHIỆM TẠI VIỆN PASTEUR THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. BS. CAO HỮU NGHĨA Họ và tên sinh viên: HUỲNH LÊ TRUNG Mã số sinh viên: 1211100222 Lớp: 12DSH01 Tp. Hồ Chí Minh, Năm 2016
  3. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐỘ NHIỄM KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TRONG THỰC PHẨM ĐƯỢC KIỂM NGHIỆM TẠI VIỆN PASTEUR THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. BS. CAO HỮU NGHĨA Họ và tên sinh viên: HUỲNH LÊ TRUNG Mã số sinh viên: 1211100222 Lớp: 12DSH01 Tp. Hồ Chí Minh, Năm 2016
  4. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1. Họ và tên sinh viên được giao đề tài HUỲNH LÊ TRUNG MSSV: 1211100222 Lớp: 12DSH01 Ngành: Công nghệ sinh học 2. Tên đề tài: Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của Escherichia coli phân lập trong thực phẩm được kiểm nghiệm tại Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. 3. Các dữ liệu ban đầu: Các mẫu thực phẩm được khách hàng trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh khác đem đến Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh để kiểm nghiệm. 4. Các yêu cầu chủ yếu: - Xác định tỷ lệ nhiễm E.coli trong các mẫu thực phẩm. - Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của các chủng E.coli phân lập được. - So sánh tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli với các nghiên cứu trước đó. 5. Kết quả tối thiểu phải có: - Tỷ lệ nhiễm E.coli trong các mẫu thực phẩm. - Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli phân lập được. - Tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli so với các nghiên cứu trước đó. Ngày giao đề tài: 27/01/2016 Ngày nộp báo cáo: 15/07/2016 TP. HCM, ngày tháng năm Chủ nhiệm ngành Giảng viên hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)
  5. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là bài báo cáo nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả trong đồ án tốt nghiệp này có được để bàn luận là trung thực, không sao chép đồ án, khoá luận tốt nghiệp khác dưới bất kỳ hình thức nào. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời can đoan của mình. Tác giả đồ án Huỳnh Lê Trung
  6. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung LỜI CẢM ƠN Đồ án tốt nghiệp được hoàn thành với sự giúp đỡ tận tình, quý báu từ các Thầy cô, Anh chị tại Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến: TS. BS. Cao Hữu Nghĩa, Trưởng khoa Xét nghiệm Sinh Học lâm Sàng, Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tâm hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp. Quý Thầy, Cô giảng viên Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập ở trường. ThS. Nguyễn Thị Nguyệt và ThS. Vũ Lê Ngọc Lan, khoa Xét nghiệm Sinh học lâm sàng, Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này. Các Cô, các Anh Chị phòng vi sinh Nước – Thực phẩm và phòng vi sinh Bệnh Phẩm, Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Các bạn lớp 12DSH01 và 12DSH02 đã giúp đỡ, động viên tôi. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã luôn nuôi dạy, yêu thương, động viên và chỗ dựa vững chắc cho tôi. Tác giả đồ án Huỳnh Lê Trung
  7. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải BTNMT Bộ Tài Nguyên Môi trường BYT Bộ Y tế CFU Colony Forming Unit DNA Axit Deoxyribo Nucleic E.coli Escherichia coli EHEC Enterohaemorrgenic E.coli EMB Eosin Methylene Blue Agar EPEC Enteropathogenic E.coli ETEC Enterotoxingenic E.coli I Intermediate: Trung gian ISO International Organization for Standardization KIA Kligler Iron Agar LB Luria Broth MH Mueller Hinton MR Methyl Red Broth pH Độ pH QCVN Quy Chuẩn Việt Nam R Resistant: Kháng RNA Ribonucleic acid S Susceptible: Nhạy cảm SP Sản phẩm STEC Shiga toxin-producing E.coli TBX Tryptone Bile Agar with X-Glucuronide TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TLS Trypose Lauryl Sulfate TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh TSA Tryptic Soya agar
  8. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Chữ viết tắt Diễn giải VP Voges-Proskauer VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm VTEC Verocytotoxigenic E.coli WHO World Health Organization
  9. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC SƠ ĐỒ - QUY TRÌNH vii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 2.1. Mục tiêu tổng quát 2 2.2. Mục tiêu cụ thể 2 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. Các khái niệm về an toàn thực phẩm 3 1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 3 1.2.1. Ngộ độc thực phẩm do ô nhiễm các chất hoá học 3 1.2.2. Ngộ độc do ăn phải thực phẩm có sẵn chất độc 4 1.2.3. Ngộ độc do ăn phải thức ăn bị biến chất, thức ăn ôi thiu 4 1.2.4. Ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn nhiễm vi sinh vật 4 1.3. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm 5 1.4. An toàn thực phẩm đối với sức khoẻ và kinh tế xã hội 6 1.4.1. An toàn thực phẩm đối với sức khoẻ 6 1.4.2. An toàn thực phẩm đối với kinh tế – xã hội 7 i
  10. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 1.5. Thực trạng nhiễm E.coli trong thực phẩm trên thế giới và Việt Nam 7 1.5.1. Tình hình nhiễm khuẩn E.coli trên thế giới 7 1.5.2. Tình hình nhiễm khuẩn E.coli ở Việt Nam 8 1.6. Mức độ kháng kháng sinh trên thế giới và ở Việt Nam 9 1.6.1. Mức độ kháng kháng sinh của E.coli trên thế giới 9 1.6.2. Mức độ kháng kháng sinh của E.coli ở Việt Nam 9 1.7. Tổng quan về Escherichia coli 10 1.7.1. Đặc tính sinh lý 10 1.7.2. Đặc tính sinh hoá 10 1.7.3. Định danh E.coli 11 1.7.4. Đặc tính gây bệnh 15 1.8. Tổng quan về kháng sinh 17 1.8.1. Khái niệm 17 1.8.2. Phân loại 18 1.8.3. Cơ chế tác động 21 1.9. Sự đề kháng kháng sinh 25 1.9.1. Hình thức đề kháng kháng sinh 25 1.9.2. Cơ chế đề kháng kháng sinh 26 1.9.3. Một số biện pháp hạn chế nguy cơ kháng kháng sinh 28 CHƯƠNG 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1. Đối tượng – Địa điểm – Thời gian nghiên cứu 29 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 29 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 29 ii
  11. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 2.1.3. Thời gian nghiên cứu 29 2.2. Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1. Cỡ mẫu 29 2.2.2. Đánh giá kết quả 29 2.2.3. Dụng cụ – Thiết bị – Môi trường – Hoá chất 30 2.2.4. Các loại kháng sinh dùng để khảo sát 31 2.2.5. Tiến trình nghiên cứu 33 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40 3.1. Tỷ lệ nhiễm khuẩn E.coli trong thực phẩm 40 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong thực phẩm 40 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong các nhóm thực phẩm 41 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm khuẩn E.coli trong các nhóm thực phẩm 43 3.2. Khảo sát mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli 50 3.2.1. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli trong thực phẩm 50 3.2.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli đối với nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt 52 3.2.3. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli đối với nhóm rau và các sản phẩm rau 53 3.2.4. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli đối với nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản 55 3.2.5. So sánh mức độ kháng của E.coli với một số nghiên cứu trước đây 56 3.3. Khảo sát mức độ đa kháng của các chủng E.coli phân lập được 57 3.3.1. Mức độ đa kháng của E.coli trong thực phẩm 57 CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 iii
  12. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 4.1. Kết luận 59 3.3.2. Tỷ lệ nhiễm khuẩn E.coli trong các mẫu thực phẩm 59 3.3.3. Mức độ kháng kháng sinh của E.coli 60 4.2. Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 65 iv
  13. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Lớp, phụ lớp và kháng sinh nhóm β-lactams 18 Bảng 1.2. Lớp, phụ lớp và kháng sinh nhóm Non β-lactams 19 Bảng 2.3. Các loại kháng sinh dùng để khảo sát 32 Bảng43.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli trong thực phẩm 40 Bảng53.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli theo nhóm thực phẩm 41 Bảng63.3. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt. 43 Bảng73.4. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản 45 Bảng83.5. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc. 47 Bảng93.6. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm rau và các sản phẩm rau 48 Bảng103.7. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli trong thực phẩm 51 Bảng113.8. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt 52 Bảng123.9. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối rau và các sản phẩm rau 54 Bảng133.10. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối cá, thuỷ sản và sản phẩm từ thuỷ sản 55 Bảng143.11. So sánh tỷ lệ kháng Ampicillin của E.coli với một số nghiên cứu trước đây 56 Bảng153.10. Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của E.coli phân lập được 57 Bảng164.4. Kết quả vòng vô khuẩn ghi nhận được khi tiến hành kháng sinh đồ với 35 chủng E.coli 73 Bảng174.5. Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT 82 Bảng184.6. QCVN số 8-3/2011/QĐ-BYT 82 v
  14. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ13.1. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong thực phẩm 40 Biểu đồ23.2. Tỷ lệ nhiễm của E.coli trong các nhóm thực phẩm 42 Biểu đồ33.3. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt. 43 Biểu đồ43.4. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản. 45 Biểu đồ53.5. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc. 47 Biểu đồ63.6. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm rau và các sản phẩm rau. 49 Biểu đồ73.7. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli trong thực phẩm 51 Biểu đồ83.8. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt 53 Biểu đồ93.9. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm rau và các sản phẩm rau 54 Biểu đồ103.10. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm cá, thuỷ sản và sản phẩm từ thuỷ sản. 55 vi
  15. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung DANH MỤC CÁC HÌNH Hình11.1. Vị trí tác động của kháng sinh 21 Hình21.2. Sự ức chế tổng hợp protein ở tế bào vi khuẩn của kháng sinh 24 Hình31.3. Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 26 Hình44.1. Phản ứng IMViC dương tính của E.coli 69 Hình54.2. Khuẩn lạc đặc trưng tím ánh kim của E.coli trên môi trường EMB 69 Hình64.3. Khuẩn lạc đặc trưng tím ánh kim của E.coli trên môi trường EMB 70 Hình74.4. Khuẩn lạc đặc trưng của E.coli trên môi trường BCP 70 Hình84.5. Một vài hình ảnh thể hiện khả năng kháng kháng sinh của E.coli trên môi trường MH 71 DANH MỤC SƠ ĐỒ - QUY TRÌNH • Sơ đồ1phân lập E.coli 33 • Quy trình1kháng sinh đồ 37 vii
  16. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề được quan tâm ngày càng sâu sắc trên phạm vi mỗi quốc gia và quốc tế bởi sự liên quan trực tiếp của nó đến sức khỏe và tính mạng con người. Nó ảnh hưởng đến sự duy trì và phát triển nòi giống, cũng như quá trình phát triển và hội nhập kinh tế quốc tế [12], [20]. Cùng với xu hướng phát triển của xã hội và toàn cầu hóa, bệnh truyền qua thực phẩm và ngộ độc thực phẩm đang đứng trước nhiều thách thức mới, diễn biến mới về cả tính chất, mức độ và phạm vi ảnh hưởng [23]. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hơn 1/3 dân số các nước phát triển bị ảnh hưởng của các bệnh do thực phẩm gây ra mỗi năm [33]. Các vụ ngộ độc thực phẩm (NĐTP) có xu hướng ngày càng tăng. Nước Mỹ mỗi năm vẫn có 76 triệu ca NĐTP với 325.000 người phải vào viện và 5.000 người chết [21]. Ở các nước phát triển khác như EU, Hà Lan, Nga, Trung Quốc, Hàn Quốc có hàng ngàn trường hợp người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm và phải chi phí hàng tỉ USD cho việc ngăn chặn nhiễm độc thực phẩm [19], [34]. Tại các nước đang phát triển, tình trạng ngộ độc thực phẩm lại càng trầm trọng hơn nhiều. Năm 1998, khoảng 1,8 triệu trẻ em bị tử vong do nhiễm độc thực phẩm (tiêu chảy), và đến bây giờ con số đó là hơn 2,2 triệu người tử vong hàng năm, trong đó cũng hầu hết là trẻ em [16], [18]. Tỷ lệ tử vong do ngộ độc thực phẩm chiếm 1/3 đến 1/2 tổng số trường hợp tử vong [31]. Ở khu vực châu Phi (2004) có khoảng 800.000 trẻ em tử vong do tiêu chảy [17]. Ở các nước Đông Nam Á như Thái Lan, trung bình mỗi năm có 1 triệu trường hợp bị tiêu chảy. Riêng trong năm 2003, có 956.313 trường hợp tiêu chảy cấp, 23.113 ca bị bệnh lỵ, 126.185 ca ngộ độc thực phẩm. Trong 9 tháng đầu năm 2007, ở Malaysia, đã có 11.226 ca ngộ độc thực phẩm, trong đó có 67% là học sinh, tăng 100% so với cùng kỳ năm trước. Tại Ấn Độ 400 ngàn trẻ em bị tử vong do tiêu chảy mỗi năm [22],[36]. Theo Tổ chức Y tế thế giới, trong khoảng 2,5 triệu lượt trẻ em bị tiêu chảy hàng năm trên thế giới, có 8% bị tử vong . Năm 2014, có khoảng 1.100 trẻ em Việt Nam dưới 5 tuổi tử vong do tiêu chảy [40]. 1
  17. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Escherichia coli là một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm thường gặp và điều đáng chú ý nhất là sự gia tăng khả năng kháng thuốc của vi khuẩn này. Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli đã được báo cáo nhiều ở các nước phát triển và cả những nước đang phát triển [30]. Tại Việt Nam, theo số liệu giám sát trong năm 2012 tại bệnh viện nhiệt đới trung ương tỉ lệ kháng Ampicilin của E.coli lên tới 81,4%; kháng Amoxicillin/Clavunanic và Ampicillin/Sulbactam khoảng 40%. Các kháng sinh nhóm Cephalosporin thế hệ ba cũng bị kháng đến gần một nửa và nhóm Fluoro- quinolon cũng bị kháng khoảng 45% [2]. Qua các kết quả khảo sát của các tác giả trong nước và trên thế giới cho thấy: tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm khuẩn E.coli và khả năng kháng sinh của các loài vi khuẩn này ngày càng tăng. Xuất phát từ tình hình trên, tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của Escherichia coli phân lập trong thực phẩm được kiểm nghiệm tại Viện Pasteur TP. HCM”. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu tổng quát - Khảo sát tình hình nhiễm E.coli trong thực phẩm do khách hàng gửi tới kiểm nghiệm tại Viện Pasteur TP. HCM. - Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của các chủng E.coli phân lập được từ các mẫu thực phẩm do khách hàng gửi tới kiểm nghiệm tại Viện Pasteur TP. HCM. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định tỷ lệ nhiễm khuẩn E.coli trong các mẫu thực phẩm. - Đánh giá mức độ kháng các loại kháng sinh của vi khuẩn E.coli trong thực phẩm. - So sánh tính đề kháng kháng sinh của E.coli với các nghiên cứu đã thực hiện trước đây. 2
  18. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Các khái niệm về an toàn thực phẩm Thực phẩm là sản phẩm mà con người ăn, uống ở dạng tươi sống hoặc đã qua sơ chế, chế biến, bảo quản. Thực phẩm không bao gồm mỹ phẩm, thuốc lá và các chất sử dụng như dược phẩm. [15] An toàn thực phẩm là việc bảo đảm để thực phẩm không gây hại đến sức khỏe, tính mạng con người [15]. Chế biến thực phẩm là quá trình xử lý thực phẩm đã qua sơ chế hoặc thực phẩm tươi sống theo phương pháp công nghiệp hoặc thủ công để tạo thành nguyên liệu thực phẩm hoặc sản phẩm thực phẩm [15]. Kinh doanh thực phẩm là việc thực hiện một, một số hoặc tất cả các hoạt động giới thiệu, dịch vụ bảo quản, dịch vụ vận chuyển hoặc buôn bán thực phẩm [15]. Ô nhiễm thực phẩm là sự xuất hiện tác nhân làm ô nhiễm thực phẩm gây hại đến sức khỏe, tính mạng con người [15]. Nguy cơ ô nhiễm thực phẩm là khả năng các tác nhân gây ô nhiễm xâm nhập vào thực phẩm trong quá trình sản xuất, kinh doanh [15]. Ngộ độc thực phẩm là hội chứng cấp tính do ăn, uống phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng triệu chứng dạ dày – ruột, thần kinh hoặc những triệu chứng khác tùy theo tác nhân gây ngộ độc [1]. 1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Nguyên nhân rất đa dạng và biểu hiện cũng rất phức tạp. Tuy nhiên các nhà khoa học phân chia ngộ độc ra 4 nhóm nguyên nhân chính sau: [1]. 1.2.1. Ngộ độc thực phẩm do ô nhiễm các chất hoá học Do ô nhiễm các kim loại nặng: thường gặp do ăn các thức ăn đóng hộp hay ăn thực phẩm được nuôi trồng từ những vùng đất nước ô nhiễm kim loại nặng. Các kim loại thường gây ô nhiễm như: Chì, Đồng, Asen, Thuỷ ngân, Cadimi 3
  19. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Do thuốc bảo vệ thực vật: thường là các loại thuốc diệt côn trùng, thuốc trừ động vật ăn hại, thuốc diệt mối, mọt. Nguyên nhân thường do ăn rau xanh, hoa quả có lượng tồn dư thuốc bảo vệ thực vật quá cao. Do các loại thuốc thú y: thường gặp là các loại thuốc kích thích tăng trưởng, tăng trọng, các loại kháng sinh dùng để điều trị bệnh cho vật nuôi. Do các loại phụ gia thực phẩm: thường gặp là các loại thuốc dùng bảo quản thực phẩm (cá, thịt, rau, quả ), các loại phẩm màu độc đùng trong chế biến thực phẩm. Do các chất phóng xạ. 1.2.2. Ngộ độc do ăn phải thực phẩm có sẵn chất độc Bản thân chất độc có sẵn trong thực phẩm nên khi chúng ta ăn các thực phẩm có chứa sẵn các chất độc này rất có thể bị ngộ độc. Động vật độc: Thường do ăn phải các loại nhuyễn thể, cá nóc độc, gan cóc, mật cá trắm Thực vật độc: Nấm độc, khoai tây mọc mầm, sắn, một số loại đậu quả, lá ngón 1.2.3. Ngộ độc do ăn phải thức ăn bị biến chất, thức ăn ôi thiu Một số loại thực phẩm khi để lâu hoặc bị ôi thiu thường sinh ra các chất độc như: các chất amoniac, hợp chất amin sinh ra trong thức ăn nhiều đạm (thịt, cá, trứng ) hay các peroxit có trong dầu mỡ để lâu hoặc rán đi rán lại nhiều lần, là các chất độc hại trong cơ thể. Các chất độc này thường không bị phá huỷ hay giảm khả năng gây độc khi được đun sôi. 1.2.4. Ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn nhiễm vi sinh vật Do vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn: đây là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm nhiều và phổ biến nhất. Thường gặp do vi khuẩn gây bệnh thương hàn (Salmonella), vi khuẩn gây bệnh lỵ (Shigella), vi khuẩn gây tiêu chảy ở trẻ em (E.coli) hoặc nhiễm các độc tố của vi khuẩn tụ cầu (Staphylococcus aureus), vi khuẩn gây bệnh tả (V. cholerae). 4
  20. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Do virut: thường gặp do các loại virus gây viêm gan A (Hepatitis virus A), virus gây bệnh bại liệt (Polio Picornavirus), virus gây tiêu chảy (Rota virus). Do kí sinh trùng: Sán lá gan, sán bò, ấu trùng sán lợn, các loại đơn bào (Amip, trùng lông ), các loại giun và ấu trùng giun. Do nấm mốc và nấm men: Thường gặp do loài Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Candida Nguy hiểm hơn là một số loài nấm Aspergillus có khả năng sinh độc tố như Aflatoxin gây ung thư. 1.3. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm Buồn nôn và nôn: xuất hiện sớm nhất trong ngộ độc thực phẩm, là phản ứng của cơ thể nhằm loại bỏ độc chất. Bệnh nhân thường nôn ra hết thức ăn trong dạ dày, sau nôn ra cả dịch mật hoặc nôn khan. Đau bụng cũng là triệu chứng xuất hiện sớm, vị trí đau thường ở trên rốn hoặc quanh rốn, mức độ đau bụng từ nhẹ, âm ỉ đến đau dữ dội, toát mồ hôi, mặt tái mét. Tiêu chảy phân lỏng thường xuất hiện muộn hơn với đặc điểm: đi ngoài nhiều lần, phân nhiều nước, thể ngộ độc nặng, bệnh nhân đi ngoài không tự chủ, phân tự chảy. Màu sắc phân thường màu vàng, mùi tanh nếu tác nhân gây bệnh là virus, độc tố, hóa chất nếu do vi khuẩn hay amip thì có màu nâu, nhầy có máu, mùi khẳn. Một số trường hợp ngộ độc thực phẩm không hề có triệu chứng tiêu chảy phân lỏng do khi bệnh nhân nôn đã thải trừ hết tác nhân gây ngộ độc. Dấu hiệu mất nước: tùy theo mức độ nôn và tiêu chảy phân lỏng mà bệnh nhân có các biểu hiện khác nhau, nếu nhẹ thì thấy khát nước, môi miệng khô, chân tay lạnh, tiểu tiện ít, nặng thì có triệu chứng hoa mắt chóng mặt, mệt lã, da nhăn nheo mất đàn hồi, mắt trũng, vô niệu, mạch nhanh nhỏ, huyết áp tụt hoặc mạch và huyết áp không đo được. Bệnh nhân bị mất nước nặng có thể vào sốc mất nước rồi tử vong nếu không được cấp cứu kịp thời. Có thể xuất hiện dấu hiệu tê bì, chuột rút một hoặc nhiều cơ, giảm trương lực cơ, chướng bụng do sự thiếu hụt của các chất điện giải như Kali, Canxi bị mất ra ngoài theo phân. 5
  21. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung • Ngoài ra còn có các triệu chứng khác tùy theo nguyên nhân gây bệnh như Sốt: thường gặp trong các trường hợp ngộ độc thực phẩm có nhiễm vi khuẩn gây bệnh. Đau đầu hay gặp trong ngộ độc thực phẩm do các tác nhân là độc tố hay hóa chất. Ngộ độc do ăn phải đồ hộp bị nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum có thể gây yếu, liệt chi, nuốt khó, liệt cơ hô hấp gây khó thở [2]. 1.4. An toàn thực phẩm đối với sức khoẻ và kinh tế xã hội 1.4.1. An toàn thực phẩm đối với sức khoẻ An toàn thực phẩm ảnh hưởng quan trọng trực tiếp đến sức khỏe con người và liên quan chặt chẽ đến tình hình phát triển kinh tế, an sinh xã hội, là gánh nặng lớn cho chi phí chăm sóc sức khỏe cộng đồng và phát triển bền vững trên phạm vi toàn cầu [6], [11]. Tổ chức Y tế Thế giới ước tính các bệnh tiêu chảy liên quan đến thực phẩm và nước uống giết chết 2,2 triệu người mỗi năm, trong đó có 1,9 triệu trẻ em [35]. Ngay cả ở các nước phát triển vẫn có tới 30% dân số hàng năm bị mắc các bệnh truyền qua thực phẩm. Tại Mỹ hàng năm cũng có tới 9,4 triệu lượt người mắc; 55.961 người phải nằm viện và 1.351 ca tử vong. Hàng năm Hà Lan có 4,5 triệu người mắc bệnh đường ruột; 300.000 đến 750.000 ca mắc mới ngộ độc thức ăn, tử vong từ 20 - 200 người [20]. Gioocdani có khoảng 4,4 triệu lượt người bị tiêu chảy mỗi năm (không tính trẻ dưới 24 tháng), trong đó 1,3 triệu người phải điều trị. Tính theo nguyên nhân gây bệnh có ít nhất khoảng 16.260 ca mắc Shigella; 6.612 Salmonella, và 6.912 ca do Brucella. Đôi khi còn có các vụ ngộ độc bùng phát, ví dụ ở Mỹ năm 1994 xảy ra vụ Salmonella nhiễm vào kem làm khoảng 224.000 người ngộ độc; Trung Quốc năm 1988 bùng phát dịch viêm gan A do ăn phải trai hến nhiễm loại vi rút này với khoảng 300.000 người mắc. Ở các nước đang phát triển, gánh nặng bệnh tật do bệnh truyền qua thực phẩm còn trầm trọng hơn 6
  22. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung nhiều. Tuy nhiên, thường ở các nước nghèo các tài liệu, báo cáo, nghiên cứu về lĩnh vực này thường không đầy đủ [34], [36]. Theo số liệu từ Chương trình Mục tiêu quốc gia về An toàn thực phẩm, hàng năm có khoảng 150 - 250 vụ ngộ độc thực phẩm được báo cáo với từ 3.500 đến 6.500 người mắc, 37 - 71 người tử vong [3]. Tuy nhiên trong thực tế con số này có thể cao hơn nhiều. Ngày nay, có nhiều vụ ngộ độc thực phẩm tại các bếp ăn tập thể của các nhà máy, xí nghiệp liên doanh, khu công nghiệp hoặc tại các đám cưới, đám tang Ngộ độc thực phẩm do hóa chất, đặc biệt là hóa chất sử dụng trong nông nghiệp như hóa chất bảo vệ thực vật, một số hóa chất bảo quản thực phẩm, chiếm khoảng 25% tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm. Hàng năm Việt Nam có khoảng 1,3 đến 1,6 triệu ca ngộ độc thực phẩm và đáng lo ngại là thực phẩm bị nhiễm các tác nhân hóa học [4]. 1.4.2. An toàn thực phẩm đối với kinh tế – xã hội Thực phẩm đảm bảo chất lượng, an toàn vệ sinh không những làm giảm tỷ lệ bệnh tật, tăng cường khả năng lao động mà còn góp phần phát triển kinh tế, văn hoá, xã hội và thể hiện nếp sống văn minh của một dân tộc [9]. Thực phẩm đã có vai trò quan trọng trong nhiều ngành kinh tế. Chất lượng an toàn thực phẩm là chìa khoá tiếp thị của sản phẩm. Tăng cường chất lượng an toàn thực phẩm đã mang lại uy tín cùng với lợi nhuận lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp, công nghiệp chế biến thực phẩm cũng như dịch vụ du lịch và thương mại. Thực phẩm là một loại hàng hoá chiến lược, thực phẩm đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn sẽ tăng nguồn thu xuất khẩu sản phẩm, có tính cạnh tranh lành mạnh và thu hút thị trường thế giới [5]. 1.5. Thực trạng nhiễm E.coli trong thực phẩm trên thế giới và Việt Nam 1.5.1. Tình hình nhiễm khuẩn E.coli trên thế giới Theo ước tính của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Bệnh của Mỹ, mỗi năm có khoảng 79.420 người mắc bệnh “nhiễm khuẩn E.coli” [27]. E.coli O157:H7 là EHEC serotype quan trọng nhất liên quan đến các dịch bệnh. Tỷ lệ nhiễm EHEC thay đổi theo nhóm tuổi nhưng tỷ lệ mắc cao nhất thường xảy ra 7
  23. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung ở trẻ em độ tuổi dưới 15 với khoảng 100.000 trường hợp tại Hoa Kỳ vào năm 1982. Năm 1996, một ổ dịch của E.coli O157:H7 liên quan đến thức ăn và đồ uống đường phố tại Nhật Bản làm hơn 6.300 học sinh bị ảnh hưởng và kết quả là 2 ca tử vong. Ngày 15-5-2000, các đơn vị y tế công cộng cho biết tại thị trấn Walkerton, Ontario, Canada, với dân số 5000 đã có một ổ dịch của E.coli O157:H7 làm 5 người thiệt mạng và 27 ca nằm viện [13]. 2-4-2015, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), công bố số liệu thống kê cho thấy mối đe doạ từ các bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm do vi khuẩn gây nên là hết sức nghiêm trọng. Trong đó, số ca tử vong do vi khuẩn E.coli gây ra là 37.000 [40]. 1.5.2. Tình hình nhiễm khuẩn E.coli ở Việt Nam Năm 2007 tại Trung tâm Y tế dự phòng Đà Nẵng cho thấy: 53% mẫu thức ăn và đồ uống đường phố nhiễm Coliforms và 25,3% thức ăn nhiễm E.coli [14]. Năm 2013, tại Bến Tre đã có 163 người nhập viện do ăn phải bánh mì nhiễm E.coli và Coliforms ở mức cao [38]. Theo báo cáo tổng kết của Cục An toàn Thực phẩm, trong năm 2014 (tính đến ngày 15/12), toàn quốc ghi nhận 189 vụ ngộ độc thực phẩm với hơn 5.100 người mắc, 4.100 người đi viện và 43 trường hợp tử vong. Thanh tra hơn 500.000 cơ sở chế biến thực phẩm, đoàn liên ngành cho biết tỷ lệ vi phạm là gần 22%, phổ biến nhất là vi phạm điều kiện vệ sinh, dụng cụ, trang thiết bị sản xuất. Hơn 14.000 mẫu thực phẩm được lấy xét nghiệm, kết quả có 13% số mẫu không đảm bảo chất lượng. Trong đó, có những mẫu sai phạm nghiêm trọng như: thực phẩm chức năng chứa tân dược, thực phẩm nhiễm E.coli, Coliforms, gấp nhiều lần tiêu chuẩn cho phép [38]. Năm 2015, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm tỉnh Nghệ An đã công bố kết luận kiểm nghiệm mẫu thức ăn khiến hàng trăm công nhân Nhà máy sản xuất hàng may sẵn và trang phục của Công ty Nam Sung Vina bị ngộ độc bị nhiễm E.coli ở mức cao [39]. 8
  24. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 1.6. Mức độ kháng kháng sinh trên thế giới và ở Việt Nam 1.6.1. Mức độ kháng kháng sinh của E.coli trên thế giới Số liệu gần đây (2015), tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli phân lập từ thực phẩm đối với các kháng sinh như sau: • Tetracycline, Ampicillin, Sulfamethoxazole/Trimethoprim và Cephalotin lần lượt là 26%, 20.2%, 15.4% và 6%. Tất cả nhạy cảm với Ceftriaxone [25]. • Tetracycline 88.9%, Sulphonamide 75.0%, Ampicillin 69.4% và Trimethoprim 66.7% (Đối với thịt gà tại địa phương). Tetracycline 57.5%, Sulphonamide 46.6%, Ampicillin 61.6% và Trimethoprim 38.4% (Đối với thịt gà nhập khẩu). Tất cả số liệu trên được khảo sát tại 4 chợ ở Ghana [28]. • Sulfamethoxazole 61.6%, tetracycline 61.2%, ampicillin 48.2%, cefalotin 29.8% và kanamycin 22.4% [37]. • Kháng hoàn toàn với Cefotaxime. Đối với Gentamicin, Trimethoprim/Sulfamethoxazole và Ciprofloxacin lần lượt là 73.7%, 63.2%, 26.3% [24]. 1.6.2. Mức độ kháng kháng sinh của E.coli ở Việt Nam Năm 2008, Van và cộng sự khảo sát khả năng kháng kháng sinh của E.coli trên thịt (gà, bò, ) và hải sản. Tỷ lệ đề kháng được ghi nhận là: Tetracycline (77.8%), Sulfafurazole (60.6%), Ampicillin (50.5%), Amoxicillin (50.5%), Trimethoprim (51.5%), Chloramphenicol (43.4%), Streptomycin (39.4%), Nalidixic Acid (34.3%), Gentamicin (24.2%), Ciprofloxacin (16.2%), Norfloxacin (17.2%) và Enrofloxacin (21.2%) [32]. Số liệu thống kê năm 2014, tỷ lệ (%) kháng kháng sinh E.coli phân lập từ thực phẩm: Cotrimoxazol (58,3%); Ampicillin (55%); Tetracyline (53,3%); Gentamicin (30%); Piperacillin (13,3%); Cephalexine (12,5%); Amoxicillin/clavulanic acid (11,7%); Nitrofurantoin (10%); Mecillinam (10%); Ciprofloxacin (8,3%); Colistin (3,3%); Ceftazidime (1,7%) và 100% các chủng E.coli nhạy cảm với Amikacin và Netrilmicin [14]. 9
  25. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Vào năm 2016, Nguyen Do và cộng sự đã phân lập và khảo sát khả năng đề kháng của E.coli trên các loại thịt và hải sản tại các lò mổ, chợ và siêu thị tại TP.HCM., tỷ lệ kháng kháng sinh được ghi nhận là: Ciprofloxacin (80.5%), fosfomycin (50.8%). [26]. 1.7. Tổng quan về Escherichia coli 1.7.1. Đặc tính sinh lý E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thước trung bình từ 0,5x1-3µm hai đầu tròn, di động bằng tiên mao quanh tế bào, đứng riêng lẽ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có vỏ bao capsule, loại không có độc lực thì không có vỏ bao capsule. Phân loại khoa học Giới (domain) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gamma Proteobacteria Bộ (ordo) Enterobacteriales Họ (familia) Enterobacteriaceae Chi (genus) Escherichia Loài (species) E.coli 1.7.2. Đặc tính sinh hoá E.coli lên men sinh hơi với nguồn cacbon là glucose, galactose, lactose, maltose, arabinose, xylose, ramose, mannitol, fructose, có thể lên men hay không lên men đường saccharose, rafinose, esculin, duncid, glycerol, ít khi lên men inulin, pectin, adonite, không lên men dextrin, amidon, glycogen, inositol, cellobise. Vi khuẩn thường sinh indol, không sinh urea và H2S, có sinh lysine decarboxylase, không sử dụng citrate. Sự tăng trưởng của vi khuẩn bị ức chế bởi chlorine, các dẫn xuất của muối mật, brilliant green, sodium dexycholate, sodium tetrathionate, selenite Để phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác, 4 tính chất sinh 10
  26. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung hóa thường được dùng là Indol, Methyl Red, Voges Proskauer và Citrate (còn được gọi là thửu nghiệm IMViC). E.coli có kết quả thử nghiệm IMViC là như sau: I (+), MR (+), VP (-) và C (-). 1.7.3. Định danh E.coli Quan sát hình thái: hình thái khuẩn lạc mọc trên các môi trường nuôi cấy - Trên môi trường TBX: khuẩn lạc tròn, màu xanh dương. - Trên môi trường EMB: khuẩn lạc tím ánh kim, tròn, bờ điều, đường kính khoảng 0,5mm. - Nhuộm Gram hình dạng Gram (-) đặc trưng. Thử nghiệm sinh hóa định danh E.coli Sau khi quan sát khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn được nhuộm Gram, nhận thấy các khuẩn lạc có hình dạng giống E.coli nên tiến hành các bước tiếp theo. • Thử nghiệm Indol Mục đích: Phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase. Nguyên tắc: Vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase chuyển hóa triptophan tạo thành các sản phẩm chứa gốc indol. Nhân pyrol của indol phản ứng với gốc aldehyde của para – dimethyllaminobenzaldehyd trong thuốc thử Kovac’s qua 2 giai đoạn tạo thành phức chất dạng quinine có màu đỏ Môi trường và thuốc thử: ✓ Môi trường: Canh tryptone ✓ Thuốc thử Kovac’s. Thực hiện: Cấy sinh khối vi sinh vật vào môi trường canh tryptone, ủ ở 440C/24 – 48h. Sau đó nhỏ 3 – 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào mỗi ống nghiệm. Quan sát màu của thuốc thử. Kết quả Indol (+): Lớp trên bề mặt môi trường xuất hiện 1 vòng đỏ. Indol (-): Lớp mặt môi trường có màu vàng chanh của thuốc thử.  E.coli cho kết quả dương tính (+). • Thử nghiệm Methyl – Red Mục đích: xác định vi sinh vật có khả năng tạo ra các acid bền trong quá trình lên men glucose. 11
  27. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Nguyên tắc: xác định vi sinh vật có khả năng tạo ra các acid bền trong quá trình lên men glucose. Chỉ thị methyl red thay đổi màu môi trường khi pH thay đổi. Môi trường và thuốc thử: ✓ Môi trường: Clark – Clubs. ✓ Thuốc thử: Methyl red Thực hiện: Cấy sinh khối khuẩn lạc lên môi trường Clark – Clubs, ủ 370C trong khoảng 2 – 5 ngày. Sau đó nhỏ thêm vào các ống nghiệm 2 – 5 giọt thuốc thử methyl red. Quan sát và đọc kết quả Kết quả MR (+): Môi trường vẫn giữ nguyên màu đỏ. MR (-): Môi trường chuyển từ đỏ sang vàng.  E.coli cho kết quả dương tính (+). • Thử nghiệm Voges Proskauer Mục đích: phân biệt các loài trong Enterobacteriaceae dựa trên sự ô xi hóa acetoin từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Nguyên tắc: vi sinh vật chuyển hóa glucose thành acid pyruvic, rồi tiếp tục chuyển hóa acid pyruvic thành acetyl methyl carbinol (AMC). AMC tác dụng với α – naphtol trong môi trường kiềm tạo thành diacetyl. Diacetyl tác dụng với nhân guandine có trong peptone tạo thành phức Biacetyl – guandine có màu đỏ. Môi trường và thuốc thử Môi trường: Clark – Clubs. Thuốc thử: α – naphtol và KOH 40%. Thực hiện: cấy sinh khối khuẩn lạc lên môi trường Clark – Clubs, ủ 370C/24h. Sau đó, nhỏ lên môi trường Clark – Clubs vài giọt KOH 40%, hơ nóng nhẹ, nhỏ tiếp khoảng 10 giọt α – naphtol, lắc đều. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất là 4 giờ. Kết quả VP (+): Môi trường chuyển màu đỏ cam. VP (-): Không đổi màu môi trường.  E.coli cho kết quả âm tính (-). 12
  28. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung • Thử nghiệm Simmon citrate Mục đích: phát hiện vi sinh vật có hệ enzyme citrate permease có khả năng sử dụng citrate là nguồn cacbon duy nhất trong môi trường. Nguyên tắc Một số vi sinh vật có enzyme permease có khả năng sử dụng citrate là nguồn cacbon duy nhất trong môi trường. - Khi sử dụng citrate vi sinh vật giải phóng NH3 ra môi trường làm pH tăng, đồng thời vi sinh vật sử dụng NH4H2PO4 làm nguồn nitơ tạo ra NH3 góp phần làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng pH này được phát hiện bằng sự đổi màu của chỉ thị màu. Môi trường và chỉ thị Môi trường: Simmons citrate agar (SCA). Chỉ thị màu: Bromothymol blue. Kết quả Citrate (+): Môi trường chuyển từ màu lục sang màu xanh dương. Citrate (-): Môi trường giữ nguyên màu xanh lục.  E.coli cho kết quả âm tính (-). • Thử nghiệm KIA Mục đích: phát hiện vi sinh vật có các khả năng: khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau (glucose và lactose), khả năng sinh H2S và khả năng sinh hơi. Nguyên tắc Được sử dụng để thử nghiệm đồng thời các khả năng: khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau (glucose và lactose) của vi sinh vật, khả năng sinh H2S và khả năng sinh hơi. Khả năng sử dụng cacbon có 3 trường hợp xảy ra, nhận biết nhờ vào sự thay đổi pH của môi trường với chất chỉ thị màu là phenol red. ▪ Chỉ sử dụng glucose Sau 18 – 24 giờ nuôi cấy, phần thạch nghiêng trở nên pH kiềm và phần thạch sâu có pH acid. Sau khi sử dụng hết glucose, để đáp ứng nhu cầu năng lượng cho 13
  29. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung tăng trưởng, vi sinh vật tiếp tục dị hóa peptone giải phóng NH3 làm trung hóa phần thạch nghiêng của môi trường. Trong khi đó phần thạch sâu trong môi trường có điều kiện O2 không đủ, glucose bị lên men kị khí sinh acid hữu cơ làm pH môi trường giảm nên phần thạch nghiêng sẽ có pH kiềm và phần thạch sâu sẽ có pH acid. ▪ Sử dụng cả glucose và lactose Sau 18 – 24 giờ nuôi cấy, toàn bộ môi trường đều có pH acid vì sự biến dưỡng đồng thời cả 2 loại đường giúp vi sinh vật đủ năng lượng để tăng trưởng mà chưa cần sử dụng đến peptone. Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian nuôi cấy quá 24 giờ thì vi sinh vật sẽ sử dụng đến peptone làm phần thạch nghiêng trở nên kiềm. Làm sai lệch kết quả. ▪ Không sử dụng glucose và lactose Vi sinh vật sẽ biến dưỡng peptone để lấy năng lượng và làm kiềm hóa phần thạch nghiêng của môi trường. ▪ Khả năng sinh H2S Trong môi trường có sodium thiosunfate, vi sinh vật tiết ra enzyme thiosunfate reductase khử sodium thiosunfate có trong môi trường và giải phóng H2S. H2S sẽ phản ứng với ion Fe2+ của chỉ thị ferric ammonium citrate tạo kết tủa màu đen với FeS. ▪ Khả năng sinh hơi Nếu sự lên men đường tạo sản phẩm khí thì sẽ kết tụ thành bọt khí trong ống nghiệm hoặc làm vỡ thạch. Môi trường và thuốc thử ✓ Kligler Iron Agar (KIA) chứa 2 loại đường 0.1% glucose, 1% lactose. ✓ Chỉ thị màu là phenol red. Thực hiện Lấy sinh khối vi sinh vật cấy ria lên môi trường thạch nghiêng, sau đó cấy đâm sâu vào ống nghiệm nhưng tránh chạm đáy ống, ủ ở 37oC trong 18 - 24h. 14
  30. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Đọc kết quả ✓ Thạch nghiêng đỏ, thạch sâu vàng: chỉ lên men đường glucose. ✓ Thạch nghiêng và thạch sâu đều chuyển vàng: lên men cả glucose và lactose. ✓ Môi trường vẫn đỏ, phần bề mặt có màu đỏ đậm hơn: không lên men glucose và lactose. ✓ Trong ống nghiệm có sinh kết tủa đen: có khả năng sinh H2S. ✓ Có bọt khí, làm vỡ thạch hoặc đẩy khối thạch lên trên: có khả năng sinh hơi. • Thử nghiệm oxidase Nguyên tắc Phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrom oxidase ở vi sinh vật. Hệ thống enzyme cytochrom có ở vi sinh vật hiếu khí, kỵ khí tùy ý. Hệ thống này hoạt động như chất liên kết trong quá trình hô hấp, vận chuyển H+ O2 tạo thành nước. Trong điều kiện có enzyme cytochrom oxidase, thuốc thử p - phenylenediamine bị oxi hóa thành hợp chất iodolphenol có màu xanh dương. Thực hiện Dùng que thủy tinh lấy một ít sinh khối vi sinh vật chấm lên giấy có tẩm thuốc thử tetra methyl - p - phenylenediamine. Đọc kết quả trong vòng 10 - 30 giây. Đọc kết quả ✓ Oxidase (+): Xuất hiện màu xanh dương đậm. ✓ Oxidase (-): Không đổi màu thuốc thử. 1.7.4. Đặc tính gây bệnh E.coli sống cộng sinh trong ruột người. Bình thường vi khuẩn này không gây bệnh và ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác, tổng hợp vitamin C và K rất cần thiết cho con người. Khi tỷ lệ E.coli giảm xuống dưới 20% so với tổng số vi sinh vật đường ruột thì mới xuất hiện các triệu chứng rối loạn tiêu hóa do loạn khuẩn. 15
  31. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Một số chủng E.coli có khả năng gây bệnh. Bệnh gây ra bởi E.coli thay đổi theo vị trí xâm nhập và chủng gây bệnh. Một số biểu hiện lâm sàng thường gặp là: • Nhiễm khuẩn đường tiểu: E.coli có thể gây bệnh nhiễm khuẩn đường tiểu với các triệu chứng như tiểu nhiều lần, tiểu lắt nhắt, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Có trường hợp biến chứng thành nhiễm khuẩn tử cung, đường niệu ống dẫn trứng, thận và nhiễm khuẩn máu. • Nhiễm khuẩn máu: khi sức đề kháng của cơ thể người giảm, vi khuẩn có thể vào máu và gây nhiễm khuẩn. Thường gặp ở trẻ sơ sinh và sau khi nhiễm khuẩn đường tiểu. • Viêm màng não: E.coli và Streptococci nhóm B là những nguyên nhân hàng đầu gây viêm màng não ở trẻ em. E.coli chiếm khoảng 40% các trường hợp gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, trong đó 75% E.coli có kháng nguyên K1. • Tiêu chảy và các bệnh đường ruột: trước đây, vai trò gây tiêu chảy của E.coli ít được đề cập đến. Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của kĩ thuật xét nghiệm, người ta ngày càng phát hiện được nhiều chủng E.coli gây tiêu chảy và các bệnh đường ruột khác. E.coli được xem là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy, đặc biệt là trẻ em. Bệnh gặp khắp nơi trên thế giới, ở các nước phát triển lẫn các nước đang phát triển. Nhiều nơi phát sinh thành dịch do khả năng lây lan rất nhanh và gây hiệu quả nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng. Người ta thường chia các chủng E.coli gây bệnh đường ruột thành các nhóm sau: • EPEC (Enterophathogenic E.coli): là các chủng E.coli đầu tiên được xác định gây bệnh tiêu chảy ở người. Nhóm này gồm một số type huyết thanh cổ điển gây viêm ruột và tiêu chảy dạng nước hoặc lẫn máu ở trẻ em cũng như ở người lớn. • EIEC (Enteroinvavise E.coli): gây tiêu chảy với triệu chứng lâm sàng lỵ giống Shigella. Bệnh thường gặp ở trẻ em lẫn người lớn và được xác định khi thấy có máu và đờm xuất hiện trong phân. 16
  32. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung • ETEC (Enteroxigenic E.coli): gây tiêu chảy cho trẻ em và 20 – 65% khách du lịch đến những nước đang phát triển hoặc những vùng mà điều kiện vệ sinh còn kém. ETEC xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa từ nước và thức ăn. Khả năng gây bệnh của ETEC tùy thuộc vào khả năng bám dính vào thành ruột và tạo một hay nhiều độc tố. Độc tố ETEC gồm 2 loại là ST và LT. Độc tố ST (Heat stable toxin) là độc tố bền nhiệt gồm 2 loại là STI (STa) và STII (STb). Độc tố LT (Heat labile toxin) là độc tố không bền với nhiệt, có cấu trúc và chức năng tương đương như độc tố Vibrio cholerae là một protein được cấu tạo bởi một tiểu đơn vị A (30kDa) và 5 tiểu đơn vị B. Độc tố LT gồm 2 loại LT1 và LT2. • EHEC (Enterohemorrhagic E.coli): gây xuất huyết ruột, còn có tên là VTEC (Verocytocin – producing E.coli), do có khả năng sản xuất độc tố verocytocin có độc tính đối với tế bào vero. VTEC không những là nguyên nhân gây tiêu chảy mà còn là nguyên nhân gây hai biến chứng có thể dẫn tới tử vong là viêm đại tràng xuất huyết và hội chứng tan máu ure huyết (50% ca bệnh dẫn tới tử vong). E.coli O157:H7 là đại diện của nhóm này, tạo ra một loại độc tố mạnh. Triệu chứng gây bệnh bởi E.coli O157:H7 là tiêu chảy nặng, ít khi bị sốt. Bệnh sẽ khỏi sau 5 -10 ngày. Ở một số người, đặc biệt là trẻ em dưới 5 tuổi và người già, bệnh có thể biến chứng thành hội chứng tán huyết do ure cao [7]. 1.8. Tổng quan về kháng sinh 1.8.1. Khái niệm Kháng sinh (antibiotic, chemotherapeutica) là những chất ngay ở nồng độ thấp đã có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật một cách đặc hiệu (mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vi khuẩn hay một nhóm vi khuẩn) bằng cách gây rối loạn quá trình sinh tổng hợp tế bào vi sinh vật ở tầm phân tử [8]. 17
  33. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 1.8.2. Phân loại Dựa trên sự liên quan về cấu tạo hóa học, đưa đến sự liên quan về cơ chế và hoạt phổ tác dụng, kháng sinh được chia thành 2 nhóm lớn: β-lactams và non β- lactams [8]. 1.8.2.1. β-lactams Gọi là β-lactams vì phân tử của chúng có một vòng β-lactams. Cơ chế tác động chung là ức chế tổng hợp vách của tế bào vi khuẩn. Nhóm này gồm các lớp và phụ lớp: Bảng 1.1. Lớp, phụ lớp và kháng sinh nhóm β-lactams Lớp Phụ lớp Kháng sinh Penicillin Penicillin Amino-penicillin Ampicillin, Amoxillin Ureido- penicillin Azlocillin, Mezlocillin, Piperacillin Penicillin Carboxy- penicillin Carpenicillin, Ticarcillin Penicillinase-stable Cloxacillin, Dicloxacillin, Methicillin, Penicillin Nafcillin, Oxacillin Amidinopenicillin Mecillinam Amoxillin-clavulanic acid β-lactams/yếu Ampicillin-sulbactam tố kết hợp ức Ceftaroline-avibactam chế β- Piperacillin-tazobactam lactamase Ticarcillin-clavulanic acid Cefazolin, Cephalothin, Cephapirin, Cephalosporin I Cephradine Cephalosporin II Cefamandole, Cefonicid, Cefuroxime Cepems (tiêm) Cefoperazone, Cefotaxime, Ceftriaxone, Cephalosporin III Ceftizoxime, Ceftazidime Cephalosporin IV Cefepime 18
  34. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Lớp Phụ lớp Kháng sinh Cephalosporin kháng sự hoạt động của Ceftaroline, Ceftopiprole MRSA Cephamycin Cefmetazole, Cefotetan, Cefoxitin Oxacepem Moxalactam Cefaclor, Cefadroxil, Cefdinir, Cefditoren, Cefetamet, Cefixime, Cephalosporin Cepems (uống) Cefpodoxime, Cefprozil, Ceftibuten, Cefuroxime, Cephalexin, Cepharadine Carbacepem Loracarbef Monobactams Aztreonam Doripenem, Ertapenem, Imipenem, Carbapenem Penems Meropenem, Razupenem Penem Faropenem, Sulopenem 1.8.2.2. Non β-lactams Gọi là Non β-lactams vì phân tử của chúng không có vòng β-lactams. Cơ chế tác động chung là ức chế chức năng màng tế bào, ức chế tổng hợp acid nucleic, ức chế tổng hợp protein. Bảng 1.2. Lớp, phụ lớp và kháng sinh nhóm Non β-lactams Lớp Lớp phụ Kháng sinh Aminocyclitols Spectinomycin Amikacin, Streptomycin, Gentamicin, Aminoglycosides Kanamycin, Netilmycin, Plazomicin, Tobramycin Ansamycins Rifampin Folate pathway Iclaprim, Sulfonamides, inhibitors Trimethoprim, Trimethoprim- 19
  35. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Lớp Lớp phụ Kháng sinh sulfamethoxazole Fosfomycins Fosfomycin Glycopeptide Vancomycin Glycopeptides Dalbavanco, Oritavancin, Teicoplanin, Lipoglycopeptide Telavancin, Ramoplanin Lincosamides Clindamycin Daptomycin Lipopeptides Polymyxins Colistin, Polymyxin B Macrocyclic Fidaxomicin Ezithromycin, Clarithromycin, Dirithromycin, Erythromycin Macrolides Ketolide Telithromycin Flouroketolide Solithromycin Nitrofurans Nitrofurantoin Nitroimidazoles Metronidazole, Tinidazole Oxazolidinones Linezolid, Tedizolid Phenicols Chloramphenicol Pseudomonic Mupirocin acid Cinoxacin, Garenoxacin, Nalidixic Quinolones acid Besifloxacin, Ciprofloxacin, Quinolone Clinafloxacin, Enoxacin, Finafloxacin, Flouroquinolone Fleroxacin, Gatifloxacin, Gemifloxacin, Grepafloxacin, Levofloxacin, Lomefloxacin, Moxifloxacin, Norfloxacin, 20
  36. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Lớp Lớp phụ Kháng sinh Sparfloxacin, Trovafloxacin, Ulifloxacin (prulifloxacin) Steroidal Fusidanes Fusidic acid Linopristin-flopristin, Quinupristin- Streptogramins dalfopristin Doxycyline, Minocycline, Tetracycline Tetracyclines Glycylcyclines Tigecycline Aminomethylcycline Omadacycline Thiazolide Nitazoxanide, Tizoxanide 1.8.3. Cơ chế tác động Hình11.1. Vị trí tác động của kháng sinh 1.8.3.1. Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào Tế bào vi khuẩn có một lớp vỏ cứng bên ngoài gọi là vách tế bào, có nhiệm vụ giữ hình dạng tế bào được nguyên vẹn trước áp lực thẩm thấu cao ở bên trong tế bào. Áp lực nội bào ở vi khuẩn Gram dương lớn hơn vi khuẩn Gram âm từ 3 – 5 21
  37. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung lần. Khi sự tổng hợp vách tế bào bị ức chế do tác dụng của kháng sinh, các vi khuẩn Gram dương biến thành dạng hình cầu không có vách (protoplast) và các vi khuẩn Gram âm có vách không hoàn chỉnh (sphaeroplast). Những hình thức này làm tế bào dễ bị vỡ ở trương lực bình thường. Các kháng sinh tác động lên thành tế bào đa phần thuộc nhóm diệt khuẩn (bactericide). Có nhiều cách tác động lên thành tế bào tùy vào loại kháng sinh. Để có được tác dụng, các β-lactam phải đạt các yêu cầu sau: - Tiếp xúc được với màng sinh chất: các β-lactam thấm dễ dàng qua lớp murein để tiếp xúc với màng sinh chất nên thuốc có hiệu lực với vi khuẩn Gram dương. Chúng không thấm qua màng bọc phospholipid của vi khuẩn Gram âm, chúng chỉ vào được nhờ các kênh ưa nước porin. Các chất ưa nước như Ampicillin, Amoxicillin, Cephalosporin thấm qua vỏ Gram âm tốt hơn Penicillin. - Gắn vào các thụ thể PBPs (Penicillin – binding proteins) của tế bào. Có khoảng 3 – 6 thụ thể PBP, trong đó một số thụ thể là những emzym transpeptidase. Sau khi kháng sinh gắn vào một hay nhiều thụ thể thuốc sẽ phong bế transpeptidase, làm ngăn chặn việc tổng hợp peptidoglycan, một thành phần quan trọng của vách tế bào. Giai đoạn tiếp theo có liên quan đến việc hoạt hóa các emzym tự tiêu (autolytic emzymes) gây ra sự ly giải của tế bào ở môi trường đẳng trương. Trong môi trường ưu trương những tế bào bị biến đổi thành protoblast hay sphaeroplast chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào nên rất dễ vỡ. Một số thuốc khác như Bacitracin, Vancomycin, Novobiocin ức chế giai đoạn đầu của việc tổng hợp peptidoglycan, Bacitracin ngăn cản việc dephosphoryl hóa phospholipid cần thiết cho việc tổng hợp chuỗi peptidoglycan. Vancomycin ngăn cản sự di chuyển đường pentapeptide thành chuỗi đa phân tử bên ngoài màng tế bào. Do việc tổng hợp ở giai đoạn đầu này xảy ra ở bên trong màng tế bào chất nên thuốc phải ngấm vào bên trong màng mới có tác dụng [8]. 22
  38. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 1.8.3.2. Ức chế chức năng màng tế bào Tế bào chất của tất cả tế bào sống đều được bao bọc bởi một màng tế bào chất. Màng này được xem như là một hàng rào có khả năng thẩm thấu chọn lọc, điều hòa sự trao đổi với môi trường bên ngoài. Nếu sự toàn vẹn chức năng màng tế bào bị phá vỡ thì những đại phân tử và những ion sẽ thoát khỏi tế bào làm tế bào chết. Các kháng sinh thuộc nhóm Polypeptide (Colistin, Polymycin, ), kháng sinh này gắn kết trên các chất hóa học riêng biệt làm xáo trộn chức năng thẩm thấu, làm cho các chất trong bào tương như Mg2+, K+, Ca2+ thoát ra ngoài và tế bào bị chết [8]. Ức chế tổng hợp acid nucleic Gồm các kháng sinh: Actinomycin, Rifampin, Nalidixic acid, Mitomycin, Sulfonamides, Trimethoprin, Actinomycin gắn vào DNA tạo nên một phức hợp, phức hợp này ức chế các polymerase tổng hợp các RNA tương ứng, đặc biệt là RNA thông tin. Actinomycin cũng ức chế việc sao chép DNA của virus. Mitomycin gắn vào 2 chuỗi DNA ngăn cản 2 chuỗi tách rời và như vậy DNA không được sao chép. Tuy nhiên Actinomycin và Mitomycin đều ức chế tế bào vi khuẩn lẫn tế bào động vật nên ít được dùng trong điều trị. Nalidixic acid và Oxolinic ức chế sự tái tạo DNA do ức chế hoạt động của enzyme DNA gyrase là các enzyme nối các DNA trong quá trình tổng hợp và tạo thành các vòng xoắn. Rifampin ức chế sự tổng hợp RNA do ức chế RNA polymerase. Sulfonamides: là một nhóm phân tử có cấu trúc tương tự với acid para – amino – benzoic (PABA – là một chất biến dưỡng cần thiết, được dùng như là một tiền chất để tổng hợp acid folic, cần thiết cho việc tạo ra các purin và pyrimidin, một giai đoạn quan trọng để tổng hợp acid nucleic). Các Sulfonamides có tác dụng cạnh tranh vị trí hoạt động với PABA, tạo ra những chất tương tự acid folic nhưng không có chức năng dẫn đến việc cản trở sự phát triển của vi khuẩn [8]. 23
  39. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 1.8.3.3. Ức chế tổng hợp protein Hình21.2. Sự ức chế tổng hợp protein ở tế bào vi khuẩn của kháng sinh Lớp Aminoglycosides (Streptomycin, Gentamycin, Kanamycin ): Kháng sinh gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosome dẫn đến thông tin trên mRNA bị đọc sai nên tổng hợp được các protein không giống như thông tin được mã hóa. Lớp Macrolides (Erythromycin, Ezithromycin ) gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribosome và ngăn cản việc chuyển vị trí trong quá trình tổng hợp protein. Tương tự ở vị trí này là kháng sinh thuộc lớp Lincosamides (Clindamycin). Lớp Phenicols (Chloramphenicol) gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyl tranferase, ngăn chặn việc thành lập liên kết peptide. Lớp Tetracycline (Tetracycline, Minocyline, Doxocycline ) tác động đến sự tổng hợp protein theo nhiều cơ chế: - Gắn vào thụ thể (receptor) trên tiểu đơn vị 30S của ribosome làm ribosome không gắn vào mRNA được. - Gắn với thụ thể (receptor) trên tiểu đơn vị 50S của ribosome làm tRNA vận chuyển không gắn vào ribosome được. 24
  40. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Ngoài ra, sự gắn kết của các Tetracycline với ion Mg2+, Ca2+ (các ion có trong ribosome cần thiết cho sự tổng hợp chuỗi peptide). Do vậy quá trình tổng hợp protein bị ngăn chặn. Ngoài các cơ chế trên còn có các cơ chế khác như: ức chế tổng hợp glucid: Nitrofurantoin ức chế acetyl – coenzyme A, làm ảnh hưởng đến chu trình chuyển hóa glucid của vi khuẩn [8]. 1.9. Sự đề kháng kháng sinh 1.9.1. Hình thức đề kháng kháng sinh Có hai dạng đề kháng kháng sinh là đề kháng giả và đề kháng thật. - Đề kháng giả: có biểu hiện là đề kháng nhưng không phải là bản chất, tức là không do nguồn gốc di truyền. - Đề kháng thật: Chia thành 2 nhóm là đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được. • Đề kháng tự nhiên: một số vi khuẩn không chịu tác động của một số kháng sinh nhất định . Ví dụ: Pseudomonas không chịu tác dụng của Penicillin, vi khuẩn không có vách như Mycoplasma sẽ không chịu tác dụng của kháng sinh ức chế sinh tổng hợp vách như β-lactam. Đề kháng thu được: do một biến di truyền là đột biến hoặc nhận được gene đề kháng làm cho một vi khuẩn đang từ không có trở nên có gene đề kháng. Các gene đề kháng nằm trên nhiễm sắc thể hay plasmid của vi khuẩn hoặc trên transposons. Chúng có thể lan truyền được từ vi khuẩn này sang vi khuẩn kia thông qua các hình thức vận chuyển di truyền khác nhau như biến nạp, tải nạp, tiếp hợp và chuyển vị trí [8]. 25
  41. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 1.9.2. Cơ chế đề kháng kháng sinh Gen đề kháng kháng Bơm thoát sinh dòng Enzym Kháng sinh phá hủy kháng sinh Enzym biến đổi Kháng sinh kháng sinh Kháng sinh Màng tế bào Hình31.3. Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Vi khuẩn phát triển nhiều cơ chế đề kháng kháng sinh, những cơ chế chính mà vi khuẩn dùng để chống lại tác dụng của kháng sinh được chia thành các loại sau: [8]. - Khả năng gây bất hoạt của enzyme: β-lactam, Chloramphenicol - Biến đổi đích tác động của kháng sinh: β-lactam, Rifampicin, Quinolone, Tetracycline - Làm giảm hay loại trừ khả năng thấm của kháng sinh vào vi khuẩn, gọi là tính không thấm: β-lactam, Quinolone, Tetracycline - Thải trừ tích cực ra ngoài tế bào vi khuẩn: β-lactam, Tetracycline - Thay đổi đường chuyển hóa làm mất tác dụng của thuốc. - Biến đổi các enzyme. 1.9.2.1. Khả năng gây bất hoạt của enzyme Vi khuẩn sản xuất enzyme có thể thay đổi hoặc làm giảm tác dụng của kháng sinh, bằng cách này chúng có thể phá hủy hoạt tính của kháng sinh. Cơ chế này được biết đến nhiều nhất và sớm nhất với penicillinase phá hủy vòng β-lactam, biến 26
  42. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Penicillinase thành penicilloic acid, làm mất tác dụng của thuốc. Chloramphenicol được biết đến với sự bất hoạt kháng sinh bởi enzyme acetyltransferase acetyl hóa 2 nhóm hydroxyl của Chloramphenicol. Các kháng sinh thuộc Aminoglycosides và Macrolides cũng bị đề kháng bằng cơ chế này [8]. 1.9.2.2. Thay đổi điểm tác động Mỗi kháng sinh có đích tác động, điểm gắn kết khác nhau ở vi khuẩn. Các đích cho kháng sinh có thể bị thay đổi hoặc được bảo vệ bởi sự gắn kết của một protein, do đó thuốc không thể gắn vào hoặc tác động đến vi khuẩn. Cơ chế đề kháng này xảy ra với hầu hết kháng sinh. Kháng sinh nhóm β-lactam tác động bằng cách gắn vào cấu trúc trên thành tế bào vi khuẩn gọi là penicillin binding protein (PBP). Staphylococus aureus đề kháng Methicillin có một yếu tố di truyền gọi là SCCmec (Staphylococcal cassette chromosome mec) chứa gene mecA mã hóa cho sự sản xuất một PBP biến đổi (PBP2a), không bị tác động bởi sự gắn kết của kháng sinh β- lactam. Những vi khuẩn có gene này có khả năng đề kháng nhiều kháng sinh nhóm β-lactam, ngay cả Carbapenem. Các vi khuẩn Gram âm mất receptor P10 trên tiểu đơn vị 30S của ribosome nên Aminoglycosides không còn tác động được nữa [8]. 1.9.2.3. Làm giảm hay loại trừ khả năng thấm của kháng sinh vào vi khuẩn Đây là một cơ chế quan trọng của sự đề kháng ở vi khuẩn Gram âm. Thuốc đi vào tế bào vi khuẩn thông qua kênh ở ngoài màng, sự đột biến dẫn tới đóng hoặc làm giảm kích thước của kênh, thường đem lại đề kháng kháng sinh với mức độ thấp. Những thay đổi ở thành tế bào vi khuẩn Gram âm dẫn đến giảm hấp thu kháng sinh vào trong tế bào vi khuẩn cũng dẫn đến đề kháng. Cơ chế này xảy ra với các kháng sinh nhóm β-lactam, Quinolones, Aminoglycosides, Sulfamethoxazole và Trimethoprim [8]. 1.9.2.4. Thải trừ tích cực ra ngoài tế bào vi khuẩn Hệ thống bơm thoát dòng có tác dụng chuyển kháng sinh ra ngoài, làm giảm nồng độ thuốc trong tế bào vi khuẩn. Trước đây, cơ chế này được biết đến như là một trong những cơ chế chính của vi khuẩn đề kháng với các kháng sinh Tetracycline mã hóa bởi gene Tet (Tet-pumb). Hiện nay cơ chế này được đề cập đến 27
  43. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung như là một cơ chế đề kháng nhiều nhóm kháng sinh (đa đề kháng) với các bơm được mã hóa bởi các gene MefA/E (Macrolides), AmrAB-OprA, MexXY-OprM và AcrD (Aminoglycosides), MexAB-OprM (nhóm β-lactam), [8]. 1.9.2.5. Thay đổi đường chuyển hóa làm mất tác dụng của thuốc Sulfonamides bị kháng do vi khuẩn tìm được đường khác tổng hợp folic acid mà không cần dùng PABA ở ngoài tế bào nữa [8]. 1.9.2.6. Biến đổi enzyme Enzyme bị thay đổi vẫn còn thực hiện được chức năng biến dưỡng , nhưng ít bị ảnh hưởng của thuốc so với enzyme ở vi khuẩn nhạy cảm. Ví dụ: ở vi khuẩn nhạy cảm Sulfonamides, tetrahydropteroic acid synthetase có ái lực với Sulfnamides cao hơn nhiều so với PABA, còn ở vi khuẩn kháng Sulfonamides do đột biến thì ngược lại. Một số cơ chế trên có ở những vi khuẩn Gram dương và cả vi khuẩn Gram âm: do enzyme gây bất hoạt kháng sinh, thay đổi đích của vi khuẩn. Ngược lại giảm hay loại trừ khả năng thấm của kháng sinh chỉ thuộc về vi khuẩn Gram âm (vi khuẩn Gram dương không có màng ngoài nên rất dễ thấm ở lớp peptidoglycan nên thường cho phép kháng sinh đi qua). Hiện tượng thải trừ tích cực đã được mô tả ở các vi khuẩn Gram dương như một hệ thống thải trừ thuộc ATP bơm Macrolides ra khỏi tế bào vi khuẩn ở các Staphylococcus spp [8]. 1.9.3. Một số biện pháp hạn chế nguy cơ kháng kháng sinh - Chỉ dùng kháng sinh để điều trị những bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra. - Chọn kháng sinh theo kết quả kháng sinh đồ; nên ưu tiên những kháng sinh có hoạt phổ hẹp có tác dụng đặc hiệu trên vi khuẩn gây bệnh. - Dùng kháng sinh đủ liều lượng và đủ thời gian. - Đề cao các biện pháp khử trùng và tiệt trùng, hạn chế lan truyền vi khuẩn đề kháng. - Liên tục giám sát sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn [8]. 28
  44. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung CHƯƠNG 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng – Địa điểm – Thời gian nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn E.coli phân lập được từ thực phẩm do khách hàng gửi tới kiểm nghiệm tại Phòng Vi sinh Thực phẩm – Nước, Khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng, Viện Pasteur TP. HCM. Chủng chuẩn quốc tế Escherichia coli ATCC®* 25922 (Dùng làm đối chứng trong phương pháp thử nghiệm kháng sinh đồ). 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu Phòng Vi sinh Thực phẩm – Nước, Khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng, Viện Pasteur TP. HCM. 2.1.3. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 01/01/2016 đến tháng 30/06/2016. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Cỡ mẫu Được tính theo công thức sau: Trong đó: - N: Cỡ mẫu cần thiết cho nghiên cứu - Z: trị số tra từ bảng phân phối chuẩn, mà z = 1-α/2 - α: mức ý nghĩa thống kê - p: tỷ lệ mẫu thực phẩm nhiễm E.coli - d: độ chính xác mong muốn 2.2.2. Đánh giá kết quả - Ghi nhận và xử lý số liệu bằng phần mềm Excel 2013, SAS. - Dựa vào quy định số 46/2007/BYT và QCVN 8-3:2012/BYT của Bộ Y tế để đánh giá kết quả đạt hay không đạt tiêu chuẩn vi sinh. 29
  45. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung - Dựa theo tiêu chuẩn CLSI 2015 để xác định mức độ kháng kháng sinh của các chủng E.coli phân lập được. 2.2.3. Dụng cụ – Thiết bị – Môi trường – Hoá chất Dụng cụ: ống nghiệm, giá ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, que cấy, lame, lamelle, kẹp, thước đo đường kính (mm), pipette điện tử, Thiết bị: dùng trong nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn và kháng sinh đồ - Kính hiển vi dùng để soi: Olympus CH20, kiểu loại CH20bIMF200, Nhật. - Tủ an toàn sinh học - Tủ ấm 44oC - Tủ ấm 37oC - Máy vortex Heidolph, kiểu loại: Top-mix 94323, Đức. - Máy đo độ đục McFarland. - Tủ đông sâu giữ chủng -20oC, Nhật. - Tủ lạnh bảo quản môi trường • Môi trường - Nước peptone đệm. - Tryptic Soya Agar (TSA). - Môi trường Eosin Methylene Blue Lactose Agar (EMB). - Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (canh BGBL). - Môi trường thử nghiệm sinh hóa: ✓ Simmons Citrate ✓ Trypton water (canh trypton) ✓ Môi trường Methyl Red Vosger – Proskauer (MR – VP) ✓ Môi trường Kligler iron agar (KIA) - Môi trường làm kháng sinh đồ MHA (MUELLER - HINTON AGAR) - Môi trường dùng để tăng sinh chủng vi khuẩn: Thạch Trypticase Soy Agar. - Môi trường LB + 25% Glycerol dùng để bảo quản chủng vi khuẩn. 30
  46. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung • Hoá chất: dùng định danh E.coli và làm kháng sinh đồ Nước muối sinh lý, dung dịch tím kết tinh (crystal violet); dung dịch lugol; cồn tuyệt đối; dung dịch safarin; dung dịch Methyl red; dung dịch KOH 40%; dung dịch Kovac; dầu soi cedre; khoanh giấy kháng sinh của BioRad. 2.2.4. Các loại kháng sinh dùng để khảo sát Dựa theo CLSI (2015), mà ta chọn các loại kháng sinh sau để khảo sát [29]. 31
  47. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Bảng 2.3. Các loại kháng sinh dùng để khảo sát Tên kháng STT Nhóm kháng sinh Tên viết tắt Hàm lượng Nhạy Trung gian Kháng sinh 1 Penicillins Ampicillin AMP 10 µg ≥ 17 mm 14 - 16 mm ≤ 13 mm Β-lactam/β- Amoxicillin- 2 AMC 20/10 µg ≥ 18 mm 14 - 17 mm ≤ 13 mm lactamase clauvulanate Cephems 3 Ceftazidime CAZ 30 µg ≥ 21 mm 18 - 20 mm ≤ 17 mm (Parenteral) Ertapenem ETP10 10 µg ≥ 22 mm 19 - 21 mm ≤ 18 mm 4 Carbapenems Meropenem MEM10 10 µg ≥ 23 mm 20 - 22 mm ≤ 19 mm Gentamicin CN 10 µg ≥ 15 mm 13 - 14 mm ≤ 12 mm 5 Aminoglycosides Amikacin AK 30 µg ≥ 17 mm 15 - 16 mm ≤ 14 mm Netilmicin NET 30 µg ≥ 15 mm 13 - 14 mm ≤ 12 mm 7 Fluoroquinolones Ciprofloxacin CIP 5 µg ≥ 21 mm 16 - 20 mm ≤ 15 mm 8 Nitrofurans Nitrofurantoin F 300 µg ≥ 17 mm 15 - 16 mm ≤ 14 mm 32
  48. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 2.2.5. Tiến trình nghiên cứu - Lấy mẫu. - Phân lập và định lượng vi khuẩn E.coli trong thực phẩm. - Định danh lại vi khuẩn E.coli bằng quan sát hình thái và bằng các phản ứng sinh hoá. - Bảo quản chủng vi khuẩn E.coli. - Xác định khả năng kháng kháng sinh của E.coli bằng thử nghiệm kháng sinh đồ. 2.2.5.1. Phương pháp lấy mẫu - Nguồn gốc mẫu thí nghiệm: mẫu thực phẩm do khách hàng gởi tới kiểm nghiệm tại Viện Pasteur trong thời gian từ 12/2015 đến tháng 05/2016. - Lấy mẫu: lấy đại diện khoảng 500g mẫu thực phẩm đã chọn, bảo quản trong túi nylon vô trùng và bảo quản lạnh (4 – 8)oC trong suốt thời gian vận chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu phải được phân tích ngay trong vòng 24 giờ. 2.2.5.2. Phương pháp phân lập và định lượng vi khuẩn E.coli trong thực phẩm Phương pháp nuôi cấy cổ điển ISO 7251:2005 [10]. • Nguyên lý Tăng sinh những vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose và sinh gas trong môi trường TLS. Tiếp tục tăng sinh chọn lọc trong môi trường EC. Khẳng định E.coli giả định bằng phản ứng Indol trong môi trường canh tryptone bằng cách nhỏ thuốc thử Kovac`s xuất hiện vòng đỏ cánh sen. Sau đó khẳng định E.coli trên môi trường EMB với khuẩn lạc đặc trưng là tròn, bờ đều và có ánh kim tím. Rồi kiểm tra lại bằng các phản ứng sinh hoá IMViC với kết quả lần lượt là (+)(+)(-)(-). • Sơ đồ1phân lập E.coli 33
  49. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 34
  50. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung • Cách tiến hành Pha loãng mẫu: - Đối với mẫu rắn: cân chính xác 25g mẫu  pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1/10 với peptone đệm hoặc nước muối sinh lý  nghiền mẫu bằng máy dập mẫu trong 1 phút  ta được dung dịch có nồng độ pha loãng 10-1  Ta tiếp tục pha loãng các nồng độ tiếp theo 10-2, 10-3, - Đối với mẫu lỏng: sử dụng trực tiếp  dung dịch nồng độ 100  Ta tiếp tục pha loãng các nồng độ tiếp theo 10-1, 10-2, Cấy mẫu - Từ mỗi nồng độ pha loãng: ✓ Hút 10ml dung dịch có độ pha loãng 10-1 vào ống TLS kép. ✓ Hút 1ml dung dịch vào ống TLS đơn. - Đem ủ ở 37°C / (24-48)giờ. - Quan sát những ống sinh hơi và mờ đục. Cấy chuyển sang môi trường trypton Đem ủ ở 44°C / 48h. - Sau thời gian ủ các ống môi trường trypton, nhỏ thuốc thử Kovac’s và chờ 1- 2 giây. ✓ (+): vòng tròn đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường. ✓ (-): không xuất hiện vòng đỏ trên bề mặt môi trường.  Xác định được số E.coli giả định bằng phương pháp MPN Cấy chuyển sang môi trường EMB và ủ ở (37±1)oC / (24±2)giờ để khẳng định chắc chắn E.coli với khuẩn lạc có hình thái là tròn, bờ đều, có ánh kim tím, Ø khoảng 0,5mm. Sau đó ta kiểm tra lại bằng các phản ứng sinh hoá IMViC lần lượt là (+)(+)(-)(-). 2.2.5.3. Phương pháp giữ chủng Sau khi định danh, môi trường LB (20% glycerol) được dùng để giữ chủng, ta cấy chủng đã định danh từ môi trường KIA sang thạch dinh dưỡng TSA, sau đó ta gặt chủng, tube giữ chủng được bảo quản ở tủ -20oC. Chủng được lưu giữ để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 35
  51. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 2.2.5.4. Phương pháp kháng sinh đồ • Nguyên lý Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Meuller – Hinton (MH) có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh. 36
  52. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung • Quy trình1kháng sinh đồ 37
  53. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung • Cách tiến hành - Lấy khoanh giấy kháng sinh ra khỏi tủ lạnh hoặc tủ âm, không được mở nắp, để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ để ổn định và làm giảm hơi nước tích tụ khoanh giấy kháng sinh. - Đĩa thạch MH lấy ra từ tủ lạnh (4 – 8oC) được ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng. ✓ Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn có độ đục 0,5 McFarland: cấy vi khuẩn vào môi trường BHI, ủ ở 37oC, để qua đêm. Dùng pipet lấy 2 giọt huyền dịch vi khuẩn cho vào ống nước muối sinh lý 2ml, vortex, đo độ đục McFarland bằng máy đo độ đục. Điều chỉnh độ đục của huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn tương đương với độ đục 0,5 McFarland (1 – 2 x 108 CFU/ml). ✓ Pha loãng 100 lần huyền dịch trên để được huyền dịch nồng độ 106 CFU/ml. ✓ Láng vi khuẩn lên đĩa thạch: Sử dụng ngay huyền dịch nống độ 106 CFU/ml dịch pha loãng (trong vòng 15 phút) láng đều lên mặt thạch Mueller – Hinton. Hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi. Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào tủ ấm 15 phút trước khi đặt kháng sinh. ✓ Đặt khoanh giấy kháng sinh: Khoang giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch, sử dụng dụng cụ để đặt kháng sinh (Disk – dispensing apparatus) để phân phối kháng sinh lên đĩa thạch. Sau đó dụng cụ này phải được đóng nắp chặt, cất giữ, bảo đảm vô trùng. - Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh được đặt từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch. Lật ngược các đĩa thạch và ủ ở 35±2oC/24h. ✓ Đọc và phân tích kết quả: Sau khi ủ lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn (dùng thước kẹp đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp). So sánh kích thước vòng vô khuẩn của 38
  54. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung chủng thử nghiệm với vòng ức chế theo tiêu chuẩn CLSI 2015, sau đó ghi lại kết quả đường kính vòng ức chế vi khuẩn của từng loại kháng sinh được thử nghiệm: nhạy cảm (S), trung bình (I) và kháng (R). Lưu ý: Luôn luôn phải làm song song thủ nghiệm với các chủng chuẩn quốc tế Escherichia coli ATCC®* 25922 để kiểm tra chất lượng của quy trình. Giữ các chủng chuẩn ở - 20oC trong môi trường canh thang có chứa 20% glycerol trong vòng 3 năm. Trước khi sử dụng phải cấy và kiểm tra lại các đặc tính sinh hóa của chủng chuẩn. Các chủng chuẩn có thể được giữ trong ống thạch nghiêng ở nhiệt độ 2 – 8oC trong vòng 2 tuần. 39
  55. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tỷ lệ nhiễm khuẩn E.coli trong thực phẩm Trong thời gian từ 01/01/2016 đến 30/06/2016, chúng tôi đã phân tích 250 mẫu thực phẩm do khách hàng gửi đến kiểm nghiệm tại Viện Pasteur Tp. HCM. Qua quá trình phân lập và định danh, chúng tôi thu được kết quả như sau: 3.1.1. Tỷ lệ nhiễmE.coli trong thực phẩm Bảng43.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli trong thực phẩm Kết quả Số mẫu kiểm nghiệm Không nhiễm E.coli Nhiễm E.coli 250 215 (86%) 35 (14%) Biểu đồ13.1. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong thực phẩm Kết quả từ bảng 3.1 và biểu đồ 3.1, cho thấy từ 01/01/2016 đến 30/06/2016 có 86% mẫu (215/250 mẫu) thực phẩm không nhiễm E.coli và có 14% mẫu (35/250 mẫu) thực phẩm bị nhiễm E.coli. Nếu người tiêu dùng sử dụng các mẫu thực phẩm bị nhiễm vi E.coli này sẽ có nguy cơ bị ngộ độc thực phẩm, điều này gây ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng. 40
  56. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 3.1.2. Tỷ lệ nhiễmE.coli trong các nhóm thực phẩm Trong thời gian thực hiện nghiên cứu, các mẫu thực phẩm được khách hàng gửi đến kiểm nghiệm tại Viện Pasteur gồm 4 nhóm như sau: - Thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt. - Rau và các sản phẩm rau. - Cá, thuỷ sản và các sản phẩm từ thuỷ sản. - Ngũ cốc và các sản phẩm từ ngũ cốc. Bảng53.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli theo nhóm thực phẩm Tổng Kết quả STT Nhóm thực phẩm số Không nhiễm Nhiễm E.coli mẫu E.coli Thịt và các sản phẩm chế 1 100 76 (76%) 24 (24%) biến từ thịt 2 Rau và các sản phẩm rau 50 46 (92%) 4 (8%) Cá, thuỷ sản và các sản 3 50 44 (88%) 6 (12%) phẩm từ thuỷ sản Ngũ cốc và các sản phẩm 4 50 49 (98%) 1 (2%) từ ngũ cốc 41
  57. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Biểu đồ23.2. Tỷ lệ nhiễm của E.coli trong các nhóm thực phẩm Nhận xét: Theo trình bày ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.2, các nhóm thực phẩm được kiểm nghiệm có kết quả như sau: - Nhóm thịt và các sản phẩm thịt có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 76% (76/100 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 24% (24/100 mẫu). - Nhóm cá, thuỷ sản và các sản phẩm từ thuỷ sản có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 88% (44/50 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 12% (6/50 mẫu). - Nhóm rau và các sản phẩm rau có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 92% (46/50 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 8% (4/50 mẫu). - Nhóm ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 98% (49/50 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 2% (1/50 mẫu). Qua xử lý thống kê trong giữa các nhóm thực phẩm với nhau (phụ lục), có xác xuất p = 0,0012 < 0,05 khác biệt có ý nghĩa thống kê. 42
  58. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm khuẩnE.coli trong các nhóm thực phẩm 3.1.3.1. Nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt Qua phân tích 100 mẫu thực phẩm thuộc nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt được gửi đến kiểm nghiệm, chúng tôi chia thành 3 nhóm nhỏ sau: - Thịt tươi, đông lạnh. - Thịt và sản phẩm chế biến từ thịt dùng trực tiếp không qua xử lý nhiệt - Thịt và sản phẩm chế biến từ thịt dùng trực tiếp đã qua xử lý nhiệt. Kết quả số mẫu nhiễm E.coli trong từng nhóm như sau: Bảng63.3. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt. Kết quả STT Nhóm thực phẩm Tổng số mẫu Không Nhiễm E.coli nhiễm E.coli 1 Thịt tươi, đông lạnh 13 2 (15.39%) 11 (84.61%) Thịt và SP chế biến từ 2 37 30 (81.08%) 7 (18.92%) thịt không xử lý nhiệt Thịt và SP chế biến từ 3 50 44 (88%) 6 (12%) thịt đã qua xử lý nhiệt Biểu đồ33.3. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt. 43
  59. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Nhận xét: Qua bảng 3.3 và biểu đồ 3.3, nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt có tỷ lệ nhiễm E.coli khá cao: - Nhóm thịt tươi, đông lạnh có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 15,39% (2/13 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 84,61% (11/13 mẫu). - Nhóm thịt và sản phẩm chế biến từ thịt không xử lý nhiệt có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 81,08% (30/37 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 18,92% (7/37 mẫu). - Nhóm thịt và sản phẩm chế biến từ thịt đã qua xử lý nhiệt có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 88% (44/50 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 12% (6/50 mẫu). Qua số liệu trên, ta thấy được nhóm thịt tươi, đông lạnh là nhóm có tỷ lệ nhiễm E.coli cao nhất: 84,61%, chứng tỏ nhóm này có nguy cơ bị E.coli nhiễm vào thực phẩm rất cao. Nhóm thực phẩm này có mức độ nhiễm E.coli cao có thể là do những người chăn nuôi, các cơ sở giết mổ, buôn bán và những người chế biến, bảo quản, đã không tuân thủ các quy định về vệ sinh an toàn thực phẩm. Qua xử lý thống kê trong các nhóm thịt với nhau (phụ lục), có xác xuất p < 0,0001 < 0,05 khác biệt rất có ý nghĩa thống kê. 3.1.3.2. Nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản Qua phân tích 50 mẫu thực phẩm thuộc nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản được gửi đến kiểm nghiệm, chúng tôi chia thành 3 nhóm nhỏ sau: - Cá và thuỷ sản tươi. - Sản phẩm chế biến từ cá và thuỷ sản. - Thuỷ sản khô sơ chế. Kết quả số mẫu nhiễm E.coli trong từng nhóm như sau: 44
  60. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Bảng73.4. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản Kết quả STT Nhóm thực phẩm Tổng số mẫu Không Nhiễm E.coli nhiễm E.coli 1 Cá và thuỷ sản tươi 12 11 (91,67%) 1 (8,33%) SP chế biến từ cá và 25 21 (84%) 4 (16%) 2 thuỷ sản 3 Thuỷ sản khô sơ chế 13 12 (92,31%) 1 (7,69%) Biểu đồ43.4. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản. Nhận xét: Qua bảng 3.4 và biểu đồ 3.4, nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản có tỷ lệ nhiễm E.coli tương đối cao: - Nhóm cá và thuỷ sản tươi có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 91,67% (11/12 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 8,33% (1/12 mẫu). 45
  61. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung - Nhóm sản phẩm chế biến từ cá và thuỷ sản có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 84% (21/25 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 16% (4/25 mẫu). - Nhóm thuỷ sản khô sơ chế có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 92,31% (12/13 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 7,69% (1/13 mẫu). Qua số liệu trên, ta thấy nhóm sản phẩm chế biến từ cá và thuỷ sản có tỷ lệ nhiễm E.coli cao nhất: 16%. Nhóm cá và thuỷ sản tươi có tỷ lệ thấp hơn nhóm sản phẩm chế biến từ cá và thuỷ sản đến 7,67%. Lẽ ra nhóm cá và thuỷ sản tươi là nhóm có nguy cơ nhiễm E.coli cao hơn các nhóm khác, thế nhưng kết quả ở đây thì ngược lại. Nguyên nhân có thể là do khả năng ngoại nhiễm, nhiễm trong quá trình sơ chế, bảo quản, nhiễm từ người chế biến, nhiễm từ dụng cụ vào, Phân nhóm cá và thuỷ sản tươi có tỷ lệ bị nhiễm E.coli khá cao (8,33%) có thể là do nguyên nhân người nuôi bắt, chế biến, mua bán, không tuân thủ các quy tắc an toàn vệ sinh thực phẩm nên dẫn đến việc vi khuẩn xâm nhập từ các nguồn khác vào thực phẩm. Điểu này có thể gây ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiếp xúc với thực phẩm nhiễm E.coli, gây thiệt hại về kinh tế cho người đánh bắt và nuôi thuỷ hải sản. Ở phân nhóm thuỷ sản khô sơ chế cũng có tỷ lệ nhiễm E.coli đáng lo ngại (7,69%). Nguyên nhân có thể là do quy trình thực hiện, quy trình bảo quản và quá trình vận chuyển không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. Qua xử lý thống kê trong các nhóm cá, thuỷ sản với nhau (phụ lục), có xác xuất p = 0,6839 > 0,05 khác biệt không có ý nghĩa thống kê. 3.1.3.3. Nhóm ngũ cốc và các sản phẩm từ ngũ cốc. Qua phân tích 50 mẫu thực phẩm thuộc nhóm ngũ cốc và các sản phẩm từ ngũ cốc được gửi đến kiểm nghiệm, chúng tôi chia thành 2 nhóm nhỏ sau: - Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc dùng trực tiếp. - Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc phải qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng. Kết quả số mẫu nhiễm E.coli trong từng nhóm như sau: 46
  62. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Bảng83.5. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc. Kết quả STT Nhóm thực phẩm Tổng số mẫu Không Nhiễm E.coli nhiễm E.coli Sản phẩm chế biến từ 32 31 (96,87%) 1 (3,13%) 1 ngũ cốc dùng trực tiếp Sản phẩm chế biến từ 2 ngũ cốc phải qua xử lý 18 18 (100%) 0 (0%) nhiệt trước khi sử dụng Biểu đồ53.5. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc. Nhận xét: Qua bảng 3.5 và biểu đồ 3.5, nhóm nhóm ngũ cốc và các sản phẩm từ ngũ cốc có tỷ lệ nhiễm E.coli: - Nhóm sản phẩm chế biến từ ngũ cốc dùng trực tiếp có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 96,87% (31/32 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 3,13% (1/32 mẫu). 47
  63. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung - Nhóm sản phẩm chế biến từ ngũ cốc phải qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 100% (18/18 mẫu). Qua số trên, ta thấy nhóm sản phẩm chế biến từ ngũ cốc phải qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng không bị nhiễm E.coli, chứng tỏ rằng quá trình xử lý nhiệt đủ để E.coli không còn tồn tại và quá trình chế biến đã đảm bảo an toàn vệ sinh. Nhóm sản phẩm chế biến từ ngũ cốc dùng trực tiếp có tỷ lệ nhiễm không quá cao: 3,13%. Nguyên nhân có là do quá trình sản xuất, vận chuyển, bảo quản, tiêu thụ, không đảm bảo vệ sinh an toàn nên vi khuẩn E.coli xâm nhập vào thực phẩm từ nhiều nguồn khác nhau như từ người chế biến, từ máy móc thiết bị, Chính vì vậy, ta cần phải chú ý hơn đến vệ sinh an toàn thực phẩm để có được thực phẩm tươi, sạch và an toàn. Qua xử lý thống kê trong các nhóm ngũ cốc và các sản phẩm từ ngũ cốc (phụ lục), có xác xuất p = 0,4487 > 0,05 khác biệt không có ý nghĩa thống kê. 3.1.3.4. Nhóm rau và các sản phẩm rau Qua phân tích 50 mẫu thực phẩm thuộc nhóm rau và các sản phẩm rau được gửi đến kiểm nghiệm, chúng tôi chia thành 2 nhóm nhỏ sau: - Rau tươi. - Sản phẩm chế biến từ rau đã qua xử lý nhiệt. Kết quả số mẫu nhiễm E.coli trong từng nhóm như sau: Bảng93.6. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm rau và các sản phẩm rau. Kết quả STT Nhóm thực phẩm Tổng số mẫu Không Nhiễm E.coli nhiễm E.coli 1 Rau tươi 23 23 (100%) 0 (0%) Sản phẩm chế biến từ 27 23 (84,19%) 4 (14,81%) 2 rau đã qua xử lý nhiệt 48
  64. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Biểu đồ63.6. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm rau và các sản phẩm rau. Nhận xét: Qua bảng 3.6 và biểu đồ 3.6, nhóm nhóm rau và các sản phẩm rau có tỷ lệ nhiễm E.coli: - Nhóm sản phẩm rau tươi có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 100% (23/23 mẫu) và nhóm này không bị nhiễm E.coli. - Nhóm sản phẩm chế biến từ rau đã qua xử lý nhiệt có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 84,19% (23/27 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 14,81% (4/27 mẫu). Số liệu trên cho thấy rằng ở nghiên cứu này thì nhóm rau tươi lại an toàn hơn nhóm rau đã qua xử lý nhiệt. mặc dù, thực tế thì nhóm rau tươi chính là nhóm có nguy cơ nhiễm E.coli cao hơn nhóm rau đã qua xử lý nhiệt vì nhóm rau tươi dễ bị nhiễm E.coli từ nguồn nước bị nhiễm phân, từ phân động vật, Còn nhóm rau đã qua xử lý nhiệt thì sẽ có nguy cơ nhiễm E.coli thấp hơn do đã qua xử lý nhiệt. Kết quả ở nghiên cứu này đã cho thấy có thể khả năng bị nhiễm E.coli của nhóm rau đã qua xử lý nhiệt là do ngoại nhiễm. Có thể do quy trình sơ chế, chế biến, bảo quản, chưa đạt vệ sinh an toàn. Hoặc có thể do quy trình xử lý nhiệt chưa đạt đến nhiệt độ tối thiểu để tiêu diệt E.coli. Phân nhóm này thể hiện tỷ lệ cao như vậy là điều đáng 49
  65. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung lo ngại vì thực phẩm rau đã qua xử lý nhiệt là để dùng ngay, dùng trong các nhà máy, bếp ăn cho công nhân, học sinh, sinh viên, chính vì vậy khả năng ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng rất cao. Qua xử lý thống kê trong các nhóm rau và các sản phẩm rau (phụ lục), có xác xuất p = 0,0543 > 0,05 khác biệt không có ý nghĩa thống kê. 3.2. Khảo sát mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli 3.2.1. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli trong thực phẩm Sau khi phân lập và định danh 35 chủng vi khuẩn E.coli từ 250 mẫu thực phẩm, chúng tôi tiếp tục làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby – Bauer để khảo sát mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli. Trong đó: - Nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt: 24 chủng. - Nhóm rau và các sản phẩm rau: 4 chủng. - Nhóm cá và thuỷ sản: 6 chủng. - Nhóm ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc: 1 chủng. Chúng tôi đã khảo sát khả năng kháng kháng sinh của các chủng E.coli phân lập được với 10 loại kháng sinh sau: AMP: Ampicillin CN: Gentamicin AMC: Amoxicillin-clauvulanate AK: Amikacin CAZ: Ceftazidime NET: Netilmicin ETP: Ertapenem CIP: Ciprofloxacin MEM: Meropenem F: Nitrofurantoin Qua quá trình khảo sát, phân tích và tổng hợp kết quả kháng sinh đồ, chúng tôi ghi nhận kết quả theo bảng sau: 50
  66. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Bảng103.7. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli trong thực phẩm Kháng sinh AK AMP NET CIP MEM F CN ETP CAZ AMC Kết quả R 0 45,71 0 8,57 0 2,86 8,57 0 0 14,29 I 0 5,71 0 0 0 0 2,86 0 0 31,43 S 100 48,58 100 91,43 100 97,14 88,57 100 100 54,28 Biểu đồ73.7. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli trong thực phẩm Nhận xét: Qua bảng 3.7 và biểu đồ 3.7, tỷ lệ kháng kháng sinh của 35 chủng E.coli đã phân lập được như sau: - Đối với Ampicillin: 45.71% (16/35 chủng); Amoxicillin-clauvulanate: 14,29% (5/35 chủng); Gentamicin: 8.57% (3 chủng); Ciprofloxacin: 8.57% (3 chủng); Nitrofurantoin: 2.86% (1 chủng). 51
  67. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung - 100% các chủng E.coli nhạy cảm với Ceftazidime; Ertapenem; Meropenem; Amikacin; Netilmicin. Như vậy 35 chủng E.coli phân lập từ thực phẩm có tỷ lệ kháng cao với Ampicillin, Amoxicillin-clauvulanate, Ciprofloxacin và Gentamicin; 4 loại kháng sinh này đại diện cho nhóm là Penicillins, β-Lactam/β-Lactamase; Fluoroquinolones và Aminoglycosides; 4 nhóm này thường được sử dụng nhiều trong chăn nuôi để kích thích tăng trưởng cũng như phòng ngừa bệnh cho vật nuôi, đây có thể là nguyên nhân đưa đến tỷ lệ kháng cao. 3.2.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli đối với nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt Qua 24 chủng phân lập được từ nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt, chúng tôi ghi nhận được kết quả như sau Bảng113.8. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt Kháng sinh AK AMP NET CIP MEM F CN ETP CAZ AMC Kết quả R 0 62,5 0 12,5 0 4,17 12,5 0 0 20,83 I 0 8,33 0 0 0 0 4,17 0 0 29,17 S 100 29,17 100 87,5 100 95,83 83,33 100 100 50 52
  68. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Biểu đồ83.8. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt Nhận xét: Qua bảng 3.8. và biểu đồ 3.8., có thể nhận thấy rằng các chủng E.coli đã kháng các loại kháng sinh với tỷ lệ khá cao: - Kháng với Ampicillin: 62,5% (15/24 chủng), Amoxicillin-clauvulanate: 20,83% (5/24 chủng), Gentamicin: 12,5% (3/24 chủng), Ciprofloxacin: 12,5% (3/24 chủng). - Tỷ lệ trung gian của Amoxicillin-clauvulanate, Ampicillin cao, lần lượt là 29,17 (7/24 chủng)% và 8,33% (2 chủng). Điều này cho thấy chúng đang có xu hướng kháng các loại kháng sinh này rất cao. Nguyên nhân có thể là do người dân đã sử dụng các loại kháng sinh này một cách bừa bãi, không định hướng trong chăn nuôi nhằm phòng ngừa, điều trị bệnh cho vật nuôi, hoặc dùng để kích thích tăng trưởng nhằm thu được lợi nhuận cao mà không quan tâm đến những hậu quả mà nó để lại. 3.2.3. Tỷ lệ kháng kháng sinh củaE.coli đối vớinhóm rau và các sản phẩmrau Qua 4 chủng phân lập được từ nhóm rau và các sản phẩm rau, chúng tôi ghi nhận được kết quả như sau: 53
  69. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Bảng123.9. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối rau và các sản phẩm rau Kháng sinh AK AMP NET CIP MEM F CN ETP CAZ AMC Kết quả R 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 I 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 S 100 100 100 100 100 100 100 100 100 50 Biểu đồ93.9. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm rau và các sản phẩm rau Nhận xét: Bảng 3.9. và biểu đồ 3.9. thể hiện rằng các chủng E.coli biểu hiện trung gian với kháng sinh Amoxicillin-clauvulanate là 50% (2/4 chủng) . Đây là điều đáng lo ngại vì dường như chúng đang bắt đầu xu hướng đề kháng với loại kháng sinh thông dụng. Đối với nhóm thực phẩm rau và các sản phẩm rau tỷ lệ đề kháng như vậy rất 54
  70. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung đáng quan tâm vì chúng ta hầu như sử dụng các loại thực phẩm này hàng ngày. Nguyên nhân có thể là do nông dân sử dụng các loại thuốc hoá học, thuốc bảo vệ thực vật một cách quá nhiều không theo liều lượng chỉ dẫn, 3.2.4. Tỷ lệ kháng kháng sinh củaE.coli đối vớinhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản Qua 6 chủng phân lập được từ nhóm cá, thuỷ hải sản và sản phẩm từ thuỷ sản, chúng tôi ghi nhận được kết quả như sau Bảng133.10. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối cá, thuỷ sản và sản phẩm từ thuỷ sản Kháng sinh AK AMP NET CIP MEM F CN ETP CAZ AMC Kết quả R 0 16,67 0 0 0 0 0 0 0 0 I 0 0 0 0 0 0 0 0 0 33,33 S 100 83,33 100 100 100 100 100 100 100 66,67 Biểu đồ103.10. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm cá, thuỷ sản và sản phẩm từ thuỷ sản. 55
  71. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Nhận xét: Qua bảng 3.10 và biểu đồ 3.10, kết quả phân tích đã chỉ ra rằng: các chủng E.coli thuộc nhóm này đã kháng Ampicillin với tỷ lệ khá cao: 16,67% (1/6 chủng) và nhạy với kháng sinh Amoxicillin-clauvulanate với tỷ lệ 33,33% (2/6 chủng). Kết quả cho thấy các vi khuẩn E.coli đã bắt đầu kháng với các loại kháng sinh thông thường. Nguyên nhân là do người nuôi thuỷ sản đã sử dụng các loại kháng sinh trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh, kích thích tăng trưởng một cách bừa bãi không theo liều lượng hợp lý, dẫn đến việc các chủng vi khuẩn E.coli đã bắt đầu đề kháng lại các kháng sinh thông thường. Điều này thật sự nguy hiểm vì đây là nhóm thực phẩm thiết yếu cho nhu cầu của con người. 3.2.5. So sánh mức độ kháng củaE.coli với một số nghiên cứu trước đây Bảng143.11. So sánh tỷ lệ kháng Ampicillin của E.coli với một số nghiên cứu trước đây % Kháng Tác giả Ampicillin Marwa E.A. Aly, Tamer M. Essam and Magdy A. Amin 95 (80 chủng) Muhamad Idrees, Muhammand Ali Shah, Shazia Michael, 44 Raheel Qamar and Habib Bokhari (121 chủng) Muhammand Ali Akond, Saidul Alam, S.M.R. Hassan 89 Venglovsky, Alexander Feher (48 chủng) Trần Thị Thuỳ Giang và cộng sự (60 chủng) 55 Chúng tôi (35 chủng) 45,71 Trong nghiên cứu của chúng tôi, khả năng kháng kháng sinh của E.coli với Ampicillin hầu như phù hợp với kết quả các khảo sát năm 2011, 2012, 2014 của các tác giả trên thế giới và Việt Nam [14]. 56
  72. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Qua xử lý thống kê ở nghiên cứu này với năm 2014 của tác giả Trần Thị Thuỳ Giang và cộng sự [14] (phụ lục), có xác xuất p = 0,9806 > 0,05 khác biệt không có ý nghĩa thống kê. 3.3. Khảo sát mức độ đa kháng của các chủng E.coli phân lập được 3.3.1. Mức độ đa kháng củaE.coli trong thực phẩm Qua 35 chủng E.coli đã phân lập và làm kháng sinh đồ, ở nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy tỷ lệ đa kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập được trong thực phẩm được gửi đến kiểm nghiệm tại Viện Pasteur như sau: Bảng153.10. Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của E.coli phân lập được Số kháng sinh Số chủng đa kháng Loại kháng sinh kháng đã kháng AMP + AMC (3 chủng) 2 6 chủng AMP + CN (2 chủng) AMP + CIP (1 chủng) 3 1 chủng AMP + AMC + F 4 1 chủng AMP + AMC + CIP + CN Nhận xét: Qua bảng 3.10, tỷ lệ đa kháng của ở E.coli trong nghiên cứu này là 22,86% (8/35 chủng). Tỷ lệ này khá cao, chứng minh rằng các chủng E.coli đã bắt đầu xuất hiện hiện tượng đa kháng với các loại kháng sinh. Điều này thật sự là một mối lo cho tất cả mọi người chúng ta. Các loại kháng sinh thông thường như: Ampicillin, Amoxicillin-clauvulanate, Gentamicin đã bị các chủng E.coli này kháng. Chúng đang bắt đầu kháng đến các loại kháng sinh: Gentamicin và Nitrofurantoin. Qua số liệu ở nghiên cứu này cho thấy, tất cả các chủng đa kháng đều thuộc nhón thực phẩm thịt và các sản phẩm từ thịt. Điều này có thể dễ dàng giải thích được cho hiện tượng đa kháng vì người dân thường sử dụng các loại kháng sinh trong chăn nuôi nhằm mục đích kích thích tăng trưởng, phòng bệnh và điều trị. Chính điều này gây ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến sưc khoẻ con người và đã được cảnh báo từ rất lâu. Lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi có thể phá vỡ cân bằng tự 57
  73. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung nhiên của hệ vi sinh vật đường ruột gây rối loạn tiêu hoá. Mối nguy chính của lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi chính là sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn. Bất cứ kháng sinh nào dùng để chữa bệnh cho người và động vật, nếu còn tồn dư một lượng dù nhỏ nhất cũng có thể gây kháng thuốc của vi khuẩn E coli. Khi E.coli đã kháng thuốc thì nó có thể truyền plasmid kháng kháng sinh của nó cho các loại vi khuẩn gây bệnh khác sống trong đường ruột. Sự tồn dư kháng sinh có trong thực phẩm không chỉ ảnh hưởng trước tiên đến vật nuôi mà còn gây nguy hại cho sức khoẻ người tiêu dùng khi tiêu thụ thực phẩm. Nó gây ảnh hưởng ngay lập tức sau khi tiêu thụ sản phẩm như xảy ra phản ứng quá mẫn cảm đối với người nhạy cảm kháng sinh, gây dị ứng sau khi tiêu thụ thịt tồn dư kháng sinh, Bên cạnh đó, nó ảnh hưởng muộn hơn khi tiêu thụ thịt tồn dư kháng sinh như tạo ra thể vi sinh vật kháng thuốc, gây khó khăn cho công tác điều trị nhiễm khuẩn, làm giảm sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Đặc biệt, một số kháng sinh hoá dược có thể gây ung thư cho người tiêu thụ. Người tiêu dùng thực phẩm từ động vật khó nhận biết được những sản phẩm có tồn dư kháng sinh nếu không có chuyên môn. Chính vì vậy, vấn đề này cần phải được bắt đầu giải quyết từ người nuôi gia súc, gia cầm. Khi đó, mới có hy vọng cải thiện được chất lượng của thực phẩm chế biến từ động vật cũng như tránh được tình trạng kháng kháng sinh cho người. 58
  74. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua việc khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng sinh của E.coli tại viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh, chúng tôi rút ra kết luận 3.3.2. Tỷ lệ nhiễm khuẩnE.coli trong các mẫu thực phẩm Từ 250 mẫu thực phẩm, chúng tôi khảo sát được 14% mẫu thực phẩm (35/250 mẫu) bị nhiễm vi khuẩn E.coli. Nhóm thực phẩm có số lượng mẫu nhiễm E.coli cao nhất là nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt: 24% (24/100 mẫu). Trong đó: - Nhóm thịt tươi, đông lạnh tỷ lệ nhiễm E.coli là 84,61% (11/13 mẫu). - Nhóm thịt và sản phẩm chế biến từ thịt không xử lý nhiệt có tỷ lệ nhiễm E.coli là 18,92% (7/37 mẫu). - Nhóm thịt và sản phẩm chế biến từ thịt đã qua xử lý nhiệt có tỷ lệ nhiễm E.coli là 12% (6/50 mẫu). Nhóm cá, thuỷ sản và các sản phẩm từ thuỷ sản có tỷ lệ nhiễm E.coli là: 12% (6/50 mẫu). Trong đó: - Nhóm cá và thuỷ sản tươi có tỷ lệ nhiễm E.coli là 8,33% (1/12 mẫu). - Nhóm sản phẩm chế biến từ cá và thuỷ sản có tỷ lệ nhiễm E.coli là 16% (4/25 mẫu). - Nhóm thuỷ sản khô sơ chế có tỷ lệ nhiễm E.coli là 7,69% (1/13 mẫu). Nhóm rau và các sản phẩm rau có tỷ lệ nhiễm E.coli là: 8% (4/50 mẫu). - Nhóm sản phẩm rau tươi có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 100% (23/23 mẫu). - Nhóm sản phẩm chế biến từ rau đã qua xử lý nhiệt có tỷ lệ nhiễm E.coli là 14,81% (4/27 mẫu). Nhóm ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc có tỷ lệ nhiễm E.coli là: 2% (1/50 mẫu). - Nhóm sản phẩm chế biến từ ngũ cốc dùng trực tiếp có tỷ lệ nhiễm E.coli là 3,13% (1/32 mẫu). 59
  75. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung - Nhóm sản phẩm chế biến từ ngũ cốc phải qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 100% (18/18 mẫu). 3.3.3. Mức độ kháng kháng sinh của E.coli Tỷ lệ (%) kháng kháng sinh của 35 chủng E.coli phân lập từ thực phẩm như sau: Ampicillin (45,72%); Amoxicillin-clauvulanate (17,14%); Gentamicin (8,57%); Ciprofloxacin (8,57%); Nitrofurantoin (2,86%) và 100% các chủng E.coli nhạy cảm với Ceftazidime; Ertapenem; Meropenem; Amikacin; Netilmicin. Tỷ lệ đa kháng sinh là 22,86% (8/35 chủng). 4.2. Kiến nghị Qua 6 tháng khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của E.coli tại viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh, chúng tôi có một số kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu vi khuẩn E.coli kháng thuốc trên thực phẩm và người với số lượng mẫu nhiều hơn để có cái nhìn toàn diện hơn về chiến lược sử dụng kháng sinh cũng như các hậu quả do việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong chăn nuôi. - Hạn chế sử dụng các loại kháng sinh thuộc nhóm Penicillins, β-Lactam/β- Lactamase; Fluoroquinolones và Aminoglycosides trong trị liệu bệnh ở người, kể cả trong chăn nuôi để điều trị bệnh cho gia súc, gia cầm vì các chủng E.coli kháng với các loại kháng sinh thuộc các nhóm này với tỷ lệ khá cao. - Tập trung khảo sát E.coli kháng kháng sinh được phân lập từ thực phẩm có nguồn gốc động vật. - Kiểm soát vấn đề sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, góp phần làm giảm sự lây truyền các vi sinh vật kháng kháng sinh sang người thông qua chuỗi thực phẩm. Tăng cường việc kiểm tra các cơ sở sản xuất, chế biến, kinh doanh thực phẩm để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm. 60
  76. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: [1] An toàn vệ sinh thực phẩm, Trung tâm truyền thông giáo dục sức khỏe trung ương – Bộ Y tế. [2] Bệnh viện nhiệt đới (2011), Quy trình thao tác chuẩn về thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh, tiêu chuẩn đọc kết quả và kháng sinh đồ, phiên bản cập lần 21 năm 2011. [3] Bộ Y tế (2011), Chiến lược quốc gia An toàn thực phẩm giai đoạn 2011- 2020 và tầm nhìn 2009, Hà Nội. [4] Cục An toàn thực phẩm (2009), Báo cáo giao ban trực tuyến 63 tỉnh, thành về công tác kiểm nghiệm chất lượng ATVSTP, Hà Nội. [5] Đoàn Thị Hường và cộng sự (2008), “Đánh giá tình trạng ô nhiễm hóa học trong một số loại rau bán ở cửa hàng rau sạch và thực phẩm khác trên địa bàn Hà Nội năm 2008”, Kỷ yếu hội nghị khoa học An toàn thực phẩm lần thứ 5- 2009, Nhà xuất bản Hà Nội, tr 158 – 63 [6] Hà Huy Khôi và cộng sự (2004), Dinh dưỡng và an toàn thực phẩm, Nhà xuất bản Y học, tr. 353-355. [7] Lê Thị Hoài (2008), Xác định vai trò gây bệnh của vi khuẩn E.coli và C.perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi tại tỉnh Hưng Yên và thử nghiệm phác đồ điều trị, Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại Học Thái Nguyên. [8] Ngô Thị Hồng Phương, Nguyễn Quốc Hiệu, Cao Hữu Nghĩa, Vũ Lê Ngọc Lan, Trần Thái Thanh (2013), “Tình hình kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii phát hiện được tại Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh”, Tạp chí khoa học ĐHSP TP. Hồ Chí Minh, 47, tr 112-118. [9] Phan Thị Kim, Bùi Minh Đức, Hà Thị Anh Đào (2002), An toàn thực phẩm- Sức khỏe, đời sống và kinh tế xã hội, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 10-35. [10] TCVN 6848:2007; ISO 7251:2005. Phát hiện và định lượng Escherichia coli. [11] Trần Đáng (2007), An toàn thực phẩm, Nhà xuất bản Hà Nội, tr 509- 21. 61
  77. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung [12] Trần Đáng (2007), Thực trạng và giải pháp ATVSTP, Hội thảo An toàn thực phẩm năm 2007, Hà Nội. [13] Trần Minh Tùng, Khảo sát khả nảng nhiễm E.coli và Coliformss trong nước uống, nước uống có gas trên địa bàn quận Bình Thạnh, Tp. HCM. [14] Trần Thị Thùy Giang, Nguyễn Thị Nguyệt, và Nguyễn Văn Trí. "Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của E.coli phân lập từ thực phẩm tại Viện Pasteur, TP Hồ Chí Minh." Tạp chí Khoa học 61 (2014): 164. [15] Ủy ban Thường vụ Quốc hội (2010), Luật An toàn thực phẩm, số 55/2010/QH12. Tài liệu nước ngoài: [16] Black R.E, Lanata C.F. (1995), “Epidepiology of diarrhoeal diseases in developing countries”, In Blazer M.J, Smith P.D, Ravdin J.I, Greenberg H.B, Guerrant R.L, infection of the gastrointestinal tract, New York, Raven Press, pp. 13-36. [17] DeWaal C S, Robert N (2005), “African Region”, Food Safety Around the World, Washington, D.C., pp. 23-29. [18] DeWaal C S, Robert N (2005), “Central and South American Region”, Food Safety Around the World, Washington, D.C, pp. 46-50. [19] DeWaal C S, Robert N (2005), “European Region”, Food Safety Around the World, Washington, D.C, pp. 30-44. [20] DeWaal C S, Robert N (2005), Food Safety Around the World, Washington, D.C, pp. 1-6. [21] DeWaal C S, Robert N (2005), “North American Region”, Food Safety Around the World, Washington, D.C, pp. 53- 65. [22] DeWaal C S, Robert N (2005), “South East Asian Region”, Food Safety Around the World, Washington, D.C, pp. 14-16. [23] Havelaar A H, Brul S, de Jong A, de Jonge R, Zwietering M H, ter Kuile B H (2009 ), Future challenges to microbial food safety. 62
  78. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung [24] Kim HS, Chon JW, Kim YJ, Kim DH, Kim MS, Seo KH (2015), Prevalence and characterization of extended-spectrum-β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in ready-to-eat vegetables. [25] Melo DB, Menezes AP, Reis JN, Guimarães AG (2015), Antimicrobial resistance and genetic diversity of Escherichia coli isolated from humans and foods. [26] Nguyen do P, Nguyen TA, Le TH, Tran NM, Ngo TP, Dang VC, Kawai T, Kanki M, Kawahara R, Jinnai M, Yonogi S, Hirai Y, Yamamoto Y,Kumeda Y (2016), Dissemination of Extended-Spectrum β-Lactamase- and AmpC β-Lactamase-Producing Escherichia coli within the Food Distribution System of Ho Chi Minh City, Vietnam. [27] Paul S. Mead, Laurence Slutsker, Vance Dietz, Linda F. McCaig, Joseph S. Bresee, Craig Shapiro, Patricia M. Griffin, and Robert V. Tauxe (1999), “Food-related illness and death in the United States”, Emerging Infectious Diseases, pp. 607 – 625. [28] Rasmussen MM, Opintan JA, Frimodt-Møller N, Styrishave B (2015), Beta- Lactamase Producing Escherichia coli Isolates in Imported and Locally Produced Chicken Meat from Ghana. [29] The Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI (2015). [30] Thi Thu Hao Van, George Moutafis, Linh Thuoc Tran, and Peter J. Coloe (2007), “Antibiotic Resistance in Food – Borne Bacteria Contaminants in Vietnam”, Applied And Enviroment Microbiology, Vol. 73, No. 24, pp.7906- 7911. [31] UNCTAD/WTO. (2004), Challenges for Developing Countries. Influencing and Meeting International Standards. Volume One – Standards and Quality Management. International Trade Centre. Geneva: UNCTAD/WTO Commonwealth Secretariat. 63
  79. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung [32] Van TT, Chin J, Chapman T, Tran LT, Coloe PJ (2008), Safety of raw meat and shellfish in Vietnam: an analysis of Escherichia coli isolations for antibiotic resistance and virulence genes. [33] WHO (2002), “WHO Global Strategy for Food Safety”, (ISBN 92 4 154574 7), “WHO Global Strategy for Food Safety, pp. 5. [34] WHO (2004), “Food Safety in Developing Countries-Building Capacity”, Weekly Epidemiological Record 18,79: 173-180. [35] WHO/ UNICEF, Management of the child with a serve infection or serve malnutrition. Guideline for care at first referral level in developing country. Geneva . WHO . 2000. pp. 29-39. [36] WHO/SEARO, (2008), ''Nutrition and Food Safety in the South-East Asia Region'', Report and Documentation of the Technical Discussions, New Delhi. [37] Zhang A, He X, Meng Y, Guo L, Long M, Yu H, Li B, Fan L, Liu S, Wang H, Zou L (2015), Antibiotic and Disinfectant Resistance of Escherichia coli Isolated from Retail Meats in Sichuan, China. Trang web: [38] [39] an.html [40] 64
  80. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trường ➢ Peptone Dùng để đồng nhất mẫu. Thành phần Peptone Chlorure de sodium Phosphate disodique Phosphate Monopotassium Nước cất ➢ TLS (Trypose Lauryl Sulfate) Môi trường tiền tăng sinh các vi khuẩn gram (-) như Coliformss, E.coli. Thành phần Tryptose Lactose Sodium chloride Dipotassium hydrogen phosphate Potassium dihydrogen phosphate Sodium lauryl sulphate ➢ EC Broth (Canh EC) Môi trường tăng sinh chọn lọc E.coli, môi trường EC chứa muối mật ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram (+). Thành phần Tryptone Lactose Dipotassium Hydrogen Phosphate Potassium Dihydrogen Phosphate 65
  81. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Sodium Chloride Bile Salts N ➢ Eosin Methyl Blue Agar (EMB) Môi trường chọn lọc và phân lập E.coli. Thành phần Pepton Lactosa Dikalihydrophotphate Eosinf Methylen Blue Agar Nước cất ➢ Indol - Urea Broth Thử khả năng khử Urea và sinh Idol của vi sinh vật. Thành phần: L-Tryptophan KH2PO4 K2HPO4 NaCl Ure Cồn 90o Dung dịch đỏ phenol 1% Nước cất 66
  82. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung ➢ Môi trường Clark – clubs Môi trường dùng làm thử nghiệm cho phản ứng sinh hoad của Methyl red và Voges Prauskauer. Thành phần Peptone Glucose NaCl K2PO4 ➢ Citrate Thử khả năng sử dụng Citrate của vi sinh vật. Thành phần Magnesium sulphate Ammonium dihydrogen phosphate Sodium ammonium phosphate Sodium citrate, tribasic Sodium chloride Bromothymol blue Agar ➢ Kligler Iron Agar (KIA) Môi trường được sử dụng để thử nghiệm đồng thời các khả năng: sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose), khả năng sinh H2S và sinh hơi của các chủng vi sinh vật. Thành phần: Extrait de viande Extrait de levure Digestat enzymatique de caseine NaCl 67
  83. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Lactose Glucose Sulfate ferreux ammaniacal Thiosulfate de sodium (Na2S2O3, 5H2O) Rouge de phenol Agar-agar Nước cất ➢ TSA (Tryptone soya agar) Môi trường dinh dưỡng cho sự phát triển của tất cả các loại vi sinh vật. Thành phần Pancreatic digest of casein Enzymatic* digest of soya bean Sodium chloride Agar ➢ MH (MUELLER-HINTON AGAR) Môi trường dùng để làm kháng sinh đồ. Thành phần Beef, dehydrated infusion from Casein hydrolysate Starch Agar 68
  84. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Phụ lục 2: Hình ảnh Hình44.1. Phản ứng IMViC dương tính của E.coli Khuẩn lạc đặc trưng của E.coli trên môi trường EMB Hình54.2. Khuẩn lạc đặc trưng tím ánh kim của E.coli trên môi trường EMB 69
  85. Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Khuẩn lạc đặc trưng của E.coli trên môi trường EMB Hình64.3. Khuẩn lạc đặc trưng tím ánh kim của E.coli trên môi trường EMB Hình74.4. Khuẩn lạc đặc trưng của E.coli trên môi trường BCP 70