›

Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình tăng trưởng và tạo chồi của cây bạc hà á Mentha Arvensis L

pdf 99 trang thiennha21 12/04/2022 7650
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình tăng trưởng và tạo chồi của cây bạc hà á Mentha Arvensis L", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_anh_huong_cua_mot_so_yeu_to_len_qua_trinh_tan.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình tăng trưởng và tạo chồi của cây bạc hà á Mentha Arvensis L

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA CNSH–TP–MT  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN QUÁ TRÌNH TĂNG TRƯỞNG VÀ TẠO CHỒI CỦA CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh SVTH: Phạm Thụy Ngọc Trân Lớp: 12DSH02 TP.HCM, tháng 8/ 2016
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA CNSH–TP–MT  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN QUÁ TRÌNH TĂNG TRƯỞNG VÀ TẠO CHỒI CỦA CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh SVTH: Phạm Thụy Ngọc Trân Lớp: 12DSH02 TP.HCM, tháng 8/2016
  3. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC HÌNH vii LỜI MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nội dung đề tài 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 5. Kết quả đạt được của đề tài 3 6. Kết cấu của đồ án 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Giới thiệu sơ lược kỹ thuật nuôi cấy in vitro 5 1.1.1. Khái niệm 5 1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam 5 1.1.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô 6 1.1.4. Ưu và nhược điểm của kỹ thuận nhân giống in vitro 8 1.1.5. Thành phần các chất khoáng vô cơ 9 1.1.5.1. Các nguyên tố đa lượng 9 1.1.5.2. Các nguyên tố vi lượng 11 1.1.6. Dinh dưỡng hữu cơ 12 1.1.7. Các hợp chất tự nhiên 14 1.1.8. Carbon và nguồn năng lượng 17 1.1.9. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 18 1.1.10. Các thành phần khác 18 i
  4. Đồ án tốt nghiệp 1.1.11. Sự phát sinh hình thái thực vật 20 1.2. Giới thiệu sơ lược về Bạc hà 21 1.2.1. Tình hình nghiên cứu Bạc hà trên thế giới và Việt Nam 21 1.2.2. Giới thiệu sơ lược về giống Bạc Hà Á Mentha arvensis L. 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 31 2.2. Vật liệu 31 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 31 2.2.2. Môi trường nuôi cấy 31 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm 31 2.3. Phương pháp 31 2.4. Bố trí thí nghiệm 32 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L 32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hàm lượng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Bạc hà Á Mentha arvensis L. 33 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. 33 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. 34 2.5. Chỉ tiêu theo dõi 35 2.6. Thống kê và xử lý số liệu 35 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy. 37 ii
  5. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của hàm lượng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 45 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 52 3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 60 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 4.1. Kết luận 67 4.2. Kiến nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 iii
  6. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic Acid ACC 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid ACS ACC synthase AND Acid deoxiribonucleic AOA Aminooxyacetic acid ARN Acid ribonucleic AVG Aminoethoxyvinylglycine B1 Thiamine B3 Nicotinic Acid B6 Pyridoxine BAP 6-benzylaminopurin IBA Indole-3-butyric acid MET Methionine MS Murashige và Skoog, 1962 NAA Alpha-naphtalenacetic acid PVP Polyvinylpyrolidone SAM S-adenosine-methionine TDZ Thidiazuron 2,4,5-T Acid Trichlorophenoxyacetic 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid iv
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa 15 Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của 100 g đậu xanh 16 Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của 100 g đậu đen 17 Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. 32 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. 33 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. 34 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. 35 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính khác nhau lên quá trình hình thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 38 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 46 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu đen khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 53 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu xanh khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 60 v
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 39 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 39 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 40 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 47 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 47 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của nước dừa đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 48 Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của đậu đen đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 54 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của đậu đen đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 54 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của đậu đen đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 55 Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của đậu xanh đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 61 Biểu đồ 3.11. Ảnh hưởng của đậu xanh đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 61 Biểu đồ 3.12. Ảnh hưởng của đậu xanh đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy 62 vi
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Bạc Hà Á Mentha arvensis L. 23 Hình 3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính khác nhau lên quá trình hình thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 41 Hình 3.2. Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 49 Hình 3.3. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu đen khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 56 Hình 3.4. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu xanh khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 63 vii
  10. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam có điều kiện tự nhiên, khí hậu thuận lợi nên là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Tổng số loài thực vật ở Việt Nam được ước tính có khoảng 12.000 loài. Trong số này, nguồn tài nguyên dược liệu rất phong phú và đa dạng, chiếm một phần lớn đáng kể. Qua các số liệu điều tra đã thống kê được trên 4.000 loài thực vật được dùng làm thuốc. Từ lâu, cộng đồng các dân tộc Việt Nam đã biết dùng cây thuốc để chữa bệnh, với kinh nghiệm điều trị nhiều loại bệnh khác nhau. Hàng năm, nước ta có nhu cầu từ 40.000 - 60.000 tấn dược liệu và công tác phát triển dược liệu đã được Nhà nước quan tâm. Nhiều địa phương đã đầu tư các vùng trồng dược liệu bền vững, góp phần tăng thu nhập cho người dân và đáp ứng nhu cầu nguyên liệu đảm bảo chất lượng. Hiện nay người ta có xu hướng quay trở về với cây thuốc và thuốc có nguồn gốc thiên nhiên tạo ra. Xu hướng này đã tác động đến việc sản xuất, thu hái, chế biến, lưu thông, tiêu thụ và sử dụng dược liệu thảo mộc. Trước nhu cầu về dược liệu thiên nhiên, do sự tác động của người thu mua, nhận thức và ý thức của người dân, công tác quản lý chưa đáp ứng yêu cầu, nên việc khai thác tài nguyên dược liệu thường diễn ra bừa bãi, không chú ý đến khả năng tái sinh của các loài. Do vậy đã làm nguồn tài nguyên dược liệu của Việt Nam suy giảm nghiêm trọng. Trong số các loài thảo dược phổ biến, thì cây Bạc hà Mentha arvensis L. thuộc họ hoa môi (Lamiaceae) là một trong những loài thảo mộc quý đang rất được ưa chuộng, đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dược liệu, có giá trị kinh tế, sử dụng rộng rãi cả trong Tây y và Đông y ở nước ta và trên thế giới. Cây Bạc hà tuy được sử dụng rộng rãi, có tác dụng dược lý cao trong Đông y và Tây y ở hầu hết các nước trên thế giới nhưng các nghiên cứu về chúng còn ít so với nhiều cây trồng và cây dược liệu khác. Theo Khotin (1963), nhiều loài Bạc hà để lấy tinh dầu có nguồn gốc ở một số nước phía Tây châu Âu; điều này phù hợp 1
  11. Đồ án tốt nghiệp với các nghiên cứu về phân loại thực vật bậc cao là bộ, họ Hoa môi phân bố tập trung ở vùng Địa Trung Hải, Tiểu Á và Trung Á, (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978). Ở Việt Nam theo GS.TS Đỗ Tất Lợi, cây Bạc hà mọc hoang dại và được trồng ở nhiều vùng, chúng mọc hoang dại cả ở đồng bằng, trung du và miền núi như ở Sa Pa (Lào Cai); Tam Đảo (Vĩnh Phúc); Ba Vì (Hà Nội) và Bắc Kạn, Sơn La, Hải Dương, Hưng Yên, Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang, Từ năm 1955 nước ta đã trồng Bạc hà, đến năm 1972 cả nước đã tự sản xuất được khoảng 60 tấn tinh dầu Bạc hà và 1 tấn menthol tinh thể. Hầu hết cây Bạc hà được nhân giống chủ yếu bằng các phương pháp truyền thống như giâm cành, gieo hạt, Trong những nơi khô hạn, việc nhân giống của Bạc hà gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, kỹ thuật vi nhân giống được coi là phương pháp hữu hiệu cho phép nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật, trong đó có loài dược thảo quan trọng như Bạc hà Mentha arvensis L. Nhân giống in vitro đã được chứng minh là công nghệ tiềm năng cho sản xuất quy mô lớn các loài thực vật (Wawrosch et al., 2001; Martin, 2003; Azad, 2005; Hassan và Roy, 2005; Hassan et al., 2009). Hiện nay, các công trình nghiên cứu về nhân nhanh giống cây trồng đã đạt nhiều thành tựu trên các loài thực vật có giá trị như Lan, Cúc, Lily, tuy nhiên về cây Bạc hà vẫn còn hạn chế. Một số công trình nghiên cứu nổi bật về Bạc hà như: nhân giống in vitro Mentha arvensis L. thông qua nuôi cấy mô sẹo (Maity, 2013), Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình tăng trưởng và tạo chồi của cây bạc hà Á Mentha arvensis L.”. Với mục đích ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phát triển nông nghiệp bền vững, vừa tăng năng suất cây trồng, giống không bị thoái hoá,không sâu, bệnh. 2. Mục đích nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính, bột từ đậu đen, đậu xanh, và nước dừa lên khả năng tăng trưởng của cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp Xây dựng môi trường cải tiến để nhân giống cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. tốt nhất bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro. 3. Nội dung đề tài Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. Khảo sát bổ sung nước dừa vào môi trường nhân nhanh cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. Khảo sát ảnh hưởng của bột đậu đen lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. Khảo sát ảnh hưởng của bột đậu xanh lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra một biện pháp kỹ thuật nhân giống Bạc hà Á Mentha arvensis L. bằng phương pháp in vitro để đánh giá hoạt tính kích thích tăng trưởng khi bổ sung hoặc thay thế các yếu tố trong môi trường nuôi cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. Duy trì hình thái và khắc phục các trường hợp hay gặp trong nuôi cấy mô khi môi trường đặc biệt sử dụng agar, cấy chuyền mẫu nhiều lần. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của nghiên cứu là cơ sở để tạo môi trường nuôi cấy thích hợp nhân nhanh giống Bạc hà Á Mentha arvensis L. ở quy mô lớn, cây sạch bệnh nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 5. Kết quả đạt được của đề tài Xác định được nồng độ thích hợp của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. Xác định được nồng độ thích hợp của nước dừa lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. 3
  13. Đồ án tốt nghiệp Xác định được nồng độ bột đậu đen thích hợp lên khả năng tăng trưởng của cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. Xác định được nồng độ bột đậu xanh thích hợp lên khả năng tăng trưởng của cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. 6. Kết cấu của đồ án Đồ án bao gồm các chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
  14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro 1.1.1. Khái niệm Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý, Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, các phytohormone, vitamin và đường. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm 1980. Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô này và đã mang lại nhiều thành tựu nổi bật: Ở miền Bắc, nhân giống vô tính ở thực vật được ứng dụng ở hầu hết các loài thực vật nông, lâm sản, bảo tồn thành công các loại gỗ quý như: Vù hương (loại gỗ tiết tinh dầu dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm), cây Đăng lấy gỗ, Chè vang (một loại chè rất khó trồng). Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống Lúa chịu hạn DR1, nhân giống nhiều loại khoai tây, mía, Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống Bạch đàn Eucalyptus urophylla. 5
  15. Đồ án tốt nghiệp Trung tâm ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây Lô hội, một loài dược liệu quý ở địa phương. Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất Phong lan lớn trong khu vực. Chỉ với 3 người, phòng nuôi cấy mô – trung tâm giống và kỹ thuật cây trồng Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách hàng. Hiện nay 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô. Năm 2002, Lê Thị Kim Đào và cộng sự tại Trung tâm Ứng dụng Khoa học Kỹ thuật Bình Định đã nhân giống thành công 4 loại cây Trầm hương, Bạch đàn Urophylla, cây Hông, Giổi xanh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho chất lượng cây giống tốt và hiệu quả kinh tế cao. Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) quý hiếm từ một số tế bào gốc của sâm Ngọc Linh bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên cứu học viện Quân y đã thành công trong việc nuôi cấy thành số lượng lớn, toàn bộ quy trình chỉ mất 10 đến 20 ngày, trong khi bình thường phải mất khoảng 6 năm sâm mới cho thu hoạch. Đã khôi phục nhiều loài lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là loài lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) – loài lan duy nhất có hương thơm trên thế giới, 1.1.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô Các bước nhân giống: Giai đoạn 1: chọn lọc cây mẹ và khử trùng mô nuôi cấy. Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá. 6
  16. Đồ án tốt nghiệp Giai đoạn 2: tái sinh mẫu nuôi cấy. Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hoá sâu. Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi. Giai đoạn 3: nhân nhanh. Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Ở giai đoạn này bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Để tăng hệ số nhân, người ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng thực vật như: auxin, cytokynin, gibberellin, và các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Giai đoạn 4: tạo cây hoàn chỉnh. Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormone thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Giai đoạn 5: đưa cây ra vườn ươm. Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra vườn ươm là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể, ) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ở đồng ruộng. 7
  17. Đồ án tốt nghiệp 1.1.4. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro Ưu điểm  Phương pháp nhân giống in vitro có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp nhân giống truyền thống (giâm, chiết, ghép, ) như:  Cây con đồng nhất về mặt di truyền;  Cây có hệ số nhân cao, sản xuất được số lượng cây giống trong một thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại;  Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn, mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được;  Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng;  Tạo dòng toàn cây cái (cây Chà là) hoặc toàn cây đực (cây Măng tây) theo mong muốn;  Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,  Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm;  Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen;  Ngoài ra, phương pháp nhân giống in vitro còn giảm được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu dự trữ lâu dài và chiếm ít không gian so với phương pháp nhân giống truyền thống. Nhược điểm:  Dễ xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy;  Quá trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm;  Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình; 8
  18. Đồ án tốt nghiệp  Nhân giống trên môi trường bán rắn có giá thành sản xuất vẫn còn cao (do sử dụng agar) và thời gian cấy chuyền dài. Khi sản xuất ở quy mô công nghiệp, chi phí cho năng lượng và nhân công vẫn còn rất lớn. 1.1.5. Thành phần các chất khoáng vô cơ: Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môi trường Murashige và Skoog (1962) viết tắc là MS, môi trường Linsmainer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), Trong số đó, môi trường MS được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật (Smith và Gould) và chính Murashige (1974) đã dùng môi trường này để nuôi cấy nhiều loại cây trồng. Theo Lê Văn Hòa và cộng sự (1999) khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc. Các nguyên tố khoáng đa lượng gồm các nguyên tố được sử dụng ở nồng độ trên 30 mg/l. Các nguyên tố khoáng vi lượng là các nguyên tố được sử dụng với nồng độ thấp hơn 30 mg/l. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme (Nguyễn Xuân Linh, 1998). 1.1.5.1. Các nguyên tố đa lượng: Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng trong tự nhiên. Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính: N, P, K. Nitrogen (N) Nitrogen là thành phần cấu tạo nên nucleotide, acid amine, protein, diệp lục và một số hormone thực vật nên nitrogen là nguyên tố dinh dưỡng hàng đầu trong + môi trường nuôi cấy, được cung cấp dưới dạng muối ammononium (NH4 ) và dạng - nitrate (NO3 ). Các muối phổ biến dùng cung cấp nguồn nitrate là: KNO3: Potassium nitrate (14% N) NH4NO3: Ammonium nitrate (34% N) NaNO3: Sodium nitrate (16,4% N) Ca(NO3)2: Calcium nitrate (15,5% N) 9
  19. Đồ án tốt nghiệp Các muối phổ biến dùng cung cấp nguồn ammononium là: CO(NH2)2: Urea (46% N) (NH4)2SO4: Ammonium sunfate (22% N) Phosphosrus (P) Có tác dụng quan trọng đối với việc phân chia tế bào, tích lũy và chuyển hóa năng lượng trong quá trình quang hợp, hô hấp, đồng thời là thành phần cấu tạo nên acid nucleid, protein và nhiều hợp chất có tính sinh học quan trọng. - 2- Dạng phosphorus mô thường hấp thu là H2PO4 và HPO4 có tác dụng như một hệ đệm làm ổn định pH của môi trường nuôi cấy. Các dạng muối thường gặp: • (NH4)2HPO4: Diammonium hydrogen phosphate (46% P2O5) • (NH4)3HPO4.3H2O: Triammonium hydrogen phosphate (15,21% P) • KH2PO4: Monopotassium phosphate (10,35% P). Potassium (K) Potassium tham gia vào việc phân chia tế bào, hợp thành protein và diệp lục tố, oxy hóa khử muối nitrate, tạo các bó mạch trong cây, giúp cây cứng cáp, chắc, đứng thẳng, giúp cây ra hoa, Trong môi trường nuôi cấy, muối potassium thường được sử dụng là: KH2PO4: Monopotassium phosphate (40% K2O). K2SO4: Potassium sulfate (48% K2O). KNO3: Potassium nitrate (44% K2O). KCl: Potassium chlorur (60% K2O). Calcium (Ca) Tác dụng trọng yếu nhất của calcium là calcium được xem là tín hiệu thứ cấp trong phản ứng của cây đối với môi trường và hormone. Ngoài ra còn giúp cây tạo vách tế bào, giúp cây cứng chắc, Các muối thường dùng (với nồng độ trung bình 2,57 mmol/l) là: CaCl2.4H2O: Calcium chlorur Ca(NO3)2.2H2O: Calcium nitrate 10
  20. Đồ án tốt nghiệp Magnesium (Mg) Là thành phần của diệp lục tố làm lá cây xanh phát triển, rất nhiều enzyme cần Mg biểu hiện hoạt tính sinh học của nó. Hàm lượng Mg2+ trong môi trường nuôi dưỡng tương đối thấp, trung bình khoảng 1,43 mmol/l. Muối Magnesium thường dùng là: MgSO4.7H2O: Magnesium sulphate MgHPO4: Dimagnesium phosphate MgCl2.6H2O: Magnesium chloride Ngoài ra còn có nguyên tố sodium và chlorine (thường được bổ sung với nồng độ thấp) để điều tiết nồng độ ion các nguyên tố cần thiết khác. 1.1.5.2. Các nguyên tố vi lượng Mặc dù sử dụng với nồng độ rất ít (không quá 5 mg/l) nhưng nhóm này là các nguyên tố vô cùng thiết yếu cho tế bào thực vật. Một số nguyên tố vi lượng là: Mn, Zn, Cu, Bo, Fe, Mo, Sắt (Fe) Là thành phần của diệp lục, giúp cây quang tổng hợp tốt, làm cho lá cây có màu xanh. Thiếu sắt làm lá cây có màu xanh nhạt, cây không quang hợp được, cây ngừng phát triển, đầu rễ kém phát triển có thể dùng FeEDTA để cung cấp Fe cho cây. Đồng (Cu) Thiếu đồng dễ làm ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồi nhiều ở dưới gốc. Lá bạc mất màu xanh và đầu lá đốm trắng rồi héo khô. Dùng CuSO4 để cung cấp cho cây. Kẽm (Zn) Giữ vai trò sinh tổng hợp protein và auxin. Thiếu Zn làm thân ngắn lại, lá mọc chụm ở đầu. Nguyên nhân là do tưới phân lân quá nhiều để kích thích ra hoa. Có thể dùng ZnSO4 để cung cấp Zn cho cây đồng thời giảm tưới lân. 11
  21. Đồ án tốt nghiệp Manganse (Mn) Thiếu Mangan lá vàng nhạt, ở lá già thường có chấm vàng. Dùng MnSO4 để cung cấp Mn cho cây. Molydenum (Mo) Điều hòa tăng trưởng cho cây. Dùng Na2MoO4 để cung cấp Mo cho cây. 1.1.6. Dinh dưỡng hữu cơ Vitamin Các vitamin rất cần thiết cho sự phát triển và tăng trưởng của thực vật. Vitamin thường có chức năng xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng thấp, không đủ để duy trì sự sinh trưởng của nó nên cần bổ sung từ môi trường nuôi cấy. Các vitamin thường được dùng trong nuôi cấy mô là thiamine (Vitamin B1), Acid nicotinic (B3), Pyridoxine (B6) và myo-inositol, B5, B12. Vitamin được thêm vào môi trường nuôi cấy ở nhiều dạng và nồng độ khác nhau. Vitamin cần thiết trong các chuỗi phản ứng sinh hóa của cây. Hầu hết các môi trường nuôi cấy mô thực vật, Thiamine (Vitamin B1) được thêm vào. Linsmaier và Skoog (1965) xác nhận rằng sau khi bổ sung vitamin vào môi trường MS thì ảnh hưởng đến sự phát triển của cây. Tầm quan trọng của Thiamine cũng được nhấn mạnh bởi nhiều nhà nghiên cứu khác. Vitamin B1 (thiamine) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzyme xúc tác quá trình oxy hoá khử cacbon ở acid hữu cơ. Nồng độ thường dùng từ 0,1- 10 mg/l. Vitamin B6 (piridoxin) tham gia vào thành phần các enzyme khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các acidamin. Nồng độ dùng từ 0,1 - 1 mg/l. Inositol thường được đề cập như là một loại vitamin ảnh hưởng quan trọng đến quá trình lớn và phát triển của cây. Myo - inositol cần được bổ sung một lượng khá lớn từ 50 - 500 mg/l và tỏ ra có tác dụng rất rõ đến sự phân chia của mô. Vitamin có tác dụng thúc đẩy sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn carbon của môi trường nuôi cấy. 12
  22. Đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên, Vitamin không phải là nhân tố chính cho sự phát triển của cây. Đối với các loại vitamin khác, thật khó để nói tầm quan trọng của chúng. Ảnh hưởng của Vitamin trong nuôi cấy mô in vitro khác nhau tùy theo loài hoặc cũng có thể gây hại cho mô. Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng nên phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin nhóm B. Pepton Pepton là tên gọi chung các sản phẩm chuyển hóa chưa hoàn toàn của protein có nguồn gốc khác nhau như thịt, casein, gelatin được thủy phân bằng protease hoặc bằng các acid sau đó làm khô thành dạng bột. Pepton có chứa các chất đạm hữu cơ, đường, muối khoáng và các vitamin. Pepton tan trong nước, không tan trong ether, có màu vàng nhạt. Pepton được sử dụng như là một nguồn nitrogen hữu cơ trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật cho nhiều loại vi khuẩn và nấm. Trong nuôi cấy in vitro, nguồn nitrogen giúp giữ vai trò tạo lập protein cho cây, giúp hình thành cơ quan, thân, lá, rễ phát triển, quang tổng hợp mạnh. Việc bổ sung nguồn nitrogen hữu cơ vào môi trường nuôi cấy in vitro nhằm thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, đặc biệt là những cây sinh trưởng chậm và khó nhân giống như lan Hồ điệp. Những nghiên cứu trước đây đã cho thấy những ảnh hưởng tích cực của pepton lên sự nảy mầm và phát triển của các loại lan. Pepton nâng cao tỷ lệ nảy mầm và phát triển của PLB ở lan Cattleya (Curtis et al., 1943); Dendrobium (Alberts, 1953); Vanilla (Bouriquet, 1947). Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2007) khi nghiên cứu ảnh hưởng của pepton lên sự phát sinh phôi và tế bào lan Dendrobium đã đưa ra kết quả khi bổ sung 1g/l pepton vào môi trường VW thì tỷ lệ phôi soma đạt được là 100% trên các mẫu nuôi cấy. 13
  23. Đồ án tốt nghiệp Pepton đã được chứng minh có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành PLB lan Dendrobium . Các nghiên cứu cho thấy rằng khi bổ sung 2g/l pepton thì số lượng PLB đạt được là cao nhất (Kanjilal và Datta, 2008). 1.1.7. Dịch chiết các hợp chất tự nhiên Bổ sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy in vitro thường được thực hiện với mục đích thúc đẩy quá trình trao đổi chất của một số cây sinh trưởng chậm. Dịch chiết hữu cơ có thể kích thích có hiệu quả qua việc cung cấp các thành phần dinh dưỡng acid hữu cơ không xác định và các thành phần có tác dụng như chất kích thích sinh trưởng (Trần Văn Minh, 2004). Sự bổ sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy in vitro nhằm thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, đặc biệt là những cây sinh trưởng chậm và khó nhân giống. Các nghiên cứu của Pierik và cộng sự (1988), Li và cộng sự (2001), Chyuam và cộng sự (2010), Songjun và cộng sự (2012, 2013) đều cho thấy, khi bổ sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh cây, hệ số nhân chồi của một số loài cao hơn hẳn môi trường không bổ sung các chất này. Các hợp chất hữu cơ được dùng phổ biến trong nuôi cấy in vitro như nước dừa, dịch chiết chuối, cà rốt, khoai tây, pepton và triptone, đây là những nhân tố đóng vai trò không kém phần quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro. Ngày càng nhiều các hợp chất hữu cơ khác nhau được phát hiện và bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro như mầm ngô, mầm đậu, dịch chiết cà chua, để nâng cao hiệu quả nhân giống. Nước dừa Nước dừa được sử dụng vào nuôi cấy in vitro từ những năm 1941, được ứng dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in vitro. Theo kết quả phân tích thành phần nước dừa của Tulecke và cộng sự (1990) trong nước dừa có các amino acid, acid hữu cơ, đường sucrose, glucose, fructose, các hợp chất có hoạt tính auxin, cytokinin dạng glycoside với thành phần và hàm lượng rất cân đối. 14
  24. Đồ án tốt nghiệp Trong nuôi cấy in vitro thực vật từ năm 1941, nước dừa đã được sử dụng để nuôi cấy phôi Datura metel L. và năm 1949 nuôi cấy mô Daucus carota. Nước dừa thường chứa các acid amin, acid hữu cơ, đường, ARN, ADN. Đặc biệt trong nước dừa có chứa các hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in vitro đó là myo-inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucose của cytokinin (Pierik, 1987). Nước dừa được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô lan giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegarty, 1955; Niimoto và Sagawa, 1961). Nước dừa giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật khó nuôi cấy (Trần Văn Minh. 2004) . Một lít nước dừa có 40 g carbohydrate, 2-3 g acid amin, 4 g chất khoáng (48 meq potassilum, 2 meq sodium, 45 meq chlorur, 7 meq calcium, 6 meq magnesium và các yếu tố vi lượng như sắt, manganese, lithium), vitamin, hầu như không có lipid và có rất ít. Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa Thành phần Hàm lượng Nước 95,5 % Nitrogen 0,05 % Acid phosphoric 0,56 % Potassium 0,25 % Calcium 0,69 % Magnesium oxid 0,59 % Sắt 0,5 g Chất khô tổng số 4,71 g Đường khử 0,80 g Đường tổng số 2,08 g Tro 0,62 g (Nguồn: Pandalai, 1958) Đậu xanh Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ và Trung Á, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, là cây trồng khá quen thuộc ở Châu Á và rất phổ biến ở 15
  25. Đồ án tốt nghiệp nước ta. Cây đậu xanh có khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể thích nghi với các vùng có điều kiện khắc nghiệt. Đậu xanh còn là nguồn cung cấp chất xơ hòa tan. Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của 100 g đậu xanh Thành phần Hàm lượng Đạm 23,4 g Protein 2,4 g Tinh bột 53,1 g Sắt 4,8 mg Phosphorus 377,0 mg Vitamin B1 0,7 mg Vitamin B2 0,2 mg Vitamin C 4,0 mg Vitamin PP 2,4 g β-caroten 30,0 mg Chất xơ 4,7 g Potassium 1,132 mg Sodium 6,0 mg (Nguồn: Viện dinh dưỡng quốc gia Việt Nam) Đậu đen Đậu đen là loài cây phân họ Đậu mọc hằng năm, toàn thân không lông. Lá kép gồm 3 lá chét mọc so le, lá chét giữa to và dài hơn lá chét hai bên. Hoa màu tím nhạt. Quả giáp dài, tròn, trong chứa 7 đến 10 hạt màu đen. Đậu đen có: glucid 53%, protein 24%, lipid 1,7%, các vitamin A, B1, B2, PP, C; giàu acid amin: lysin, tryptophan, phenylalanin, threonin, valin, leucin, isoleusin, arginin, histidin; các nguyên tố vô cơ: Ca, P, Fe 16
  26. Đồ án tốt nghiệp Đậu đen có chứa nhiều sinh tố A, B, C, PP, protein, carbohydrat, lipid, muối khoáng. Hàm lượng acid amin cần thiết trong đậu đen rất cao gồm: lysin, methionin, tryptophan, phenylalanin, alanin, valin, leucin, Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của 100 g đậu đen Thành phần Hàm lượng Đạm 24,2 g Chất béo 1,7 g Tinh bột 53,3 g Phosphorus 354,0 mg Vitamin B1 0,5 mg Vitamin B2 0,2 mg β-caroten 30,0 mcg Vitamin PP 1,8 g Vitamin C 3,0 mg Chất xơ 4,0 g Calcium 56,0 mg Sắt 6,1 mg (Nguồn: Viện dinh dưỡng quốc gia Việt Nam) 1.1.8. Carbon và nguồn năng lượng Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose. Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy. Nồng độ sucrose có thể ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy. 17
  27. Đồ án tốt nghiệp 1.1.9. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ngoài thành phần vô cơ và hữu cơ, chất điều hòa sinh trưởng thực vật hay phytohormone là một thành phần không thể thiếu được cho sự cảm ứng phân chia tế bào, sinh trưởng và phân hóa của mô nuôi cấy. Tùy thuộc vào mục đích nuôi cấy mà loại và liều lượng sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau. Có 5 nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid và ethylene. Trong đó, hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật quan trọng là auxin và cytokinin quyết định sự kích thích phân chia và biệt hóa tế bào của các mô được nuôi cấy in vitro. Nhóm auxin (gồm IAA, IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T, ) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ. Ở liều lượng cao, auxin thường gây nên các đột biến. Nhóm cytokinin (gồm kinetin, zeatin, BA, ) đẩy nhanh sự phân chia tế bào, nhân chồi và phát triển của chồi. 1.1.10. Các thành phần khác Các chất hấp phụ phenol Khi phát triển phương pháp nuôi cấy mô để giống Phalaenopsis, vấn đề thường gặp nhất là hàm lượng phenol tiết ra từ mô nuôi cấy quá cao, phenol sẽ khuếch tán vào môi trường, làm oxy hóa các chất trong môi trường, gây độc cho mô nuôi cấy, kết quả là mẫu cấy sẽ bị hóa nâu và chết (Morel, 1974; Flemee và Boesman, 1977; Fast, 1979). Nhiều phương pháp loại trừ chất tiết này và đặc biệt là các sản phẩm oxy hóa của chúng được thực hiện, chẳng hạn như dùng chất chống oxy hóa, enzyme ức chế phenol, polyvinyl pyrolidone (PVP), than hoạt tính và nhiều loại chất hấp thụ khác. Hầu hết các phương pháp này đều kèm với việc cấy chuyền mẫu sau 2 – 3 tuần sang môi trường mới. Đối với nuôi cấy mô lan trong môi trường lỏng thường bổ sung chất PVP. 18
  28. Đồ án tốt nghiệp Trước đây, than hoạt tính thường được sử dụng để phòng độc, lọc không khí và các chất lỏng. Hiện nay, than hoạt tính đã được tinh chế và sản xuất rộng rãi như một chất có tính hấp thụ cao và được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô nhờ có tác động lên sự phát sinh hình thái và phát sinh cơ quan của thực vật. Vai trò của than hoạt tính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật như các phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ mẫu môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, than hoạt tính cũng có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin, làm thay đổi tỉ lệ thành phần các chất cótrong môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường . Từ khi than hoạt tính được ứng dụng trong nuôi cấy mô, các nhà khoa học chủ yếu tập trung nghiên cứu và công bố về ảnh hưởng của nó trong việc cải tiến môi trường nuôi cấy, tăng cường khả năng tái sinh cây, phát sinh phôi, tăng sinh tế bào trần, ngăn cản sự phát triển bất thường của cây con, kích thích quá trình hình thành và phát triển chồi, thúc đẩy hay ức chế sự tăng trưởng và hình thành rễ. Ngoài ra, than hoạt tính còn có khả năng làm giảm hiện tượng thủy tinh thể ở một số loài thực vật. Trong khi đó, các nghiên cứu về khả năng định hướng rễ in vitro dưới tác động của than hoạt tính lại rất hạn chế và hầu như chưa có công bố nào về vấn đề này. Sử dụng than hoạt tính là biện pháp thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thương mại. Khi bổ sung than hoạt tính ở nồng độ xác định vào môi trường nuôi cấy Phalaenopsis các hợp chất phenol trong môi trường sẽ được loại bỏ, giúp mô sinh trưởng tốt (Arditti và Ernst, 1993; Park et al., 2000). Agar Agar là một sản phẩm tự nhiên được ly trích từ các loại tảo đỏ như Rhodophycean, Gelidium, Gracillaria và Pterocladia. Agar là một polisaccharide gồm 2 phân đoạn: agarose và agaropectin. Agarose là một polymer trung tính, tạo nên tính đông của agar. Agaropectin là một polymer tích điện âm, làm cho agar có tính nhầy. Phân đoạn agarose trong agar chiếm 50 – 90% (Adrian và Assoumani, 19
  29. Đồ án tốt nghiệp 1983). Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel, tan ra ở nhiệt độ 60 – 100oC và đặc lại khi nhiệt độ xuống dưới 45oC. Từ đây, chúng ta có thể lý giải: pH càng thấp thì nồng độ H+ càng cao, agar chuyển sang trạng thái nhầy (không đông), pH càng cao thì nồng độ H+ càng bị trung hòa nhiều khiến agar cứng (hay còn gọi là trạng thái gel). Agar là chất trơ nên không phản ứng với các chất trong môi trường, ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật. Người ta hòa agar vào trong môi trường, làm tan ở nhiệt độ cao (trên 60oC) và làm đặc lại ở nhiệt độ phòng. Agar đóng vai trò là chất làm bán rắn hay làm đông môi trường, đóng vai trò làm giá thể để nâng đỡ mô và chồi, giữ cây đứng vững trong môi trường nuôi cấy. 1.1.11. Sự phát sinh hình thái thực vật Sự phát sinh chồi bất định Bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, nghiên cứu sự tạo chồi nhằm nhân nhanh để tạo một số lượng chồi lớn với những đặc tính đồng nhất và giống với cây mẹ. Sự tạo chồi in vitro có thể từ nuôi cấy cơ quan, mô hay tế bào trên môi trường có hàm lượng cytokinin kết hợp với auxin. Tỷ lệ về hàm lượng của hai loại phytohormone này là rất quan trọng. Nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì mẫu có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại, nếu nồng độ auxin cao hơn cytokinin thì mẫu có khuynh hướng tạo rễ. Trong sự tạo chồi, hoặc là chồi được tạo trực tiếp hoặc thông qua mô sẹo. Các tế bào của mô cấy được cảm ứng bởi môi trường để phản biệt hóa trở về trạng thái sinh mô. Những tế bào sinh mô được cảm ứng để có khả năng biệt hóa trở lại tạo một cơ quan chồi mới được gọi là chồi bất định. Chồi thường được cảm ứng và tạo thành ở vùng ngoại vi (vùng nhu mô vỏ) nên thường được xem là có nguồn gốc ngoại sinh. 20
  30. Đồ án tốt nghiệp Sự phát sinh rễ bất định Sự tạo rễ trên nhánh cây hoặc chồi in vitro gọi là sự tạo rễ bất định, gồm ít nhất là hai giai đoạn có thể phân biệt được dưới kính hiển vi (Mai Trần Ngọc Tiếng và cộng sự, 1980): Giai đoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe-mộc hoặc chu luân, giai đoạn này ñược khởi phát bởi auxin ở nồng độ cao. Auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng, đồng thời giúp sự phân hóa của các mô dẫn. Giai đoạn kéo dài sơ khởi rễ được kích thích bởi auxin ở nồng độ thấp. Điều quan trọng là nồng độ của auxin kích thích giai đoạn tạo sơ khởi rễ nhưng có thể ức chế giai đoạn kéo dài rễ và ngược lại. 1.2. Giới thiệu sơ lược về Bạc hà 1.2.1. Tình hình nghiên cứu Bạc hà trên thế giới và ở Việt Nam Tình hình nghiên cứu trên thế giới Từ thời xa xưa, người Hy Lạp và La Mã biết cho Bạc hà vào sữa để bảo quản sữa khỏi chua và dùng lá Bạc hà để trợ giúp tiêu hóa. Người Do Thái rắc lá Bạc hà trong các hội đường để tạo hương thơm dịu mát khi bước trên lá. Theo nghiên cứu thực vật học thì Bạc hà lục có trước, sau đó là Bạc hà cay do được lai tạo tự nhiên (Bạc hà cay được chính thức ghi nhận là một giống mới vào năm 1696 và được ghi nhân vào Dược Điển Anh năm 1721). Năm 1771 tinh dầu Bạc hà bắt đầu được nghiên cứu và sản xuất ở phương Tây bởi Gaubius. Vài năm sau tiến sĩ Muhiy cho biết: tinh dầu Bạc hà không màu hoặc màu vàng xanh, có mùi hương đặc trưng và vị hơi đắng. Bạc hà chứa nhiều hợp chất như acetate, mentyl, menthone và lượng nhỏ α-pinen, β-phellandrene, terpinene, cineole, ester, limoninecarfon, Bạc hà được người Pilgrims đưa sang Mỹ vào thế kỷ XVII. Từ năm 1816, Bạc hà được trồng trong vùng Rochester, New York. Năm 1840, Bạc hà đã phát triển ở Ohio, Michigan và sau đó là khắp miền Bắc Hoa Kỳ. Ngày nay, Bạc hà được trồng tại California, Oregon, Washington và nhiều tiểu bang khác nữa. 21
  31. Đồ án tốt nghiệp Năm 1990, Erk và Kitto tiến hành nghiên cứu tạo mô sẹo và tái sinh Bạc hà. Nuôi cấy huyền phù tế bào và mô sẹo của Mentha piperita và mentha spicata đã được báo cáo nhằm cho phép sản xuất và sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp (Lin và Staba, 1961; Wang và Staba, 1963). Huyền phù tế bào đã được báo cáo sau đó để biến đổi tiền chất vào monoterpene (Aviv và Gulan, 1978; Aviv và etal, 1983). Triterpene được sản xuất bởi các mô sẹo của Mentha arvensis (Karasawa và Shimzu, 1980). Năm 1986, Rech và Pires nghiên cứu nhân chồi từ chồi nách của mentha spp bởi các kỹ thuật nuôi cấy mô. Năm 1986, Repcakoa và cộng sự nghiên cứu vi nhân giống Mentha piperita L. thông qua nuôi cấy mô Herba hungarica. Năm 2000, Shanany và cộng sự nghiên cứu sự tương quan của tinh dầu Bạc hà nuôi cấy in vitro và trong tự nhiên. Năm 2013, Maity nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro Mentha arvensis L. thông qua nuôi cấy mô sẹo. Năm 2013, Moghtader và cộng sự nghiên cứu các hoạt tính kháng nấm của tinh dầu Mentha piperita L. và so sánh nó với tinh dầu bạc hà tổng hợp trên Aspergillus niger. Năm 2014, Dar và cộng sự tiến hành sàng lọc hóa thực vật và khả năng chống oxy hóa của rễ cây Mentha arvensis L. từ khu vực Kashmir. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Cây Bạc hà đã được trồng nhiều ở tỉnh để khai thác tinh dầu như ngoại thành Hà Nội, Nam Hà, Quảng Nam, Đà Nẵng, TP Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Long An. Năm 1977, nước ta đã tự sản xuất được 50 tấn tinh dầu và 10 tấn menthol chiết xuất từ tinh dầu Bạc hà mỗi năm. Nuôi cấy các cây dược liệu quý để bảo tồn nguồn gene và tạo dòng các tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng đang được phát triển (Phan Huy Báo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan Thị Bảy và cộng sự, 1995; Bùi Ba Đồng, 1995). 22
  32. Đồ án tốt nghiệp Năm 1998, Trần Việt Hưng cho rằng: Bạc hà là vị thuốc cảm thông dụng nhất thế giới trong cuốn “Thuốc Nam trên đất Mỹ”. Năm 2008, Nguyễn Trung Tín, Nguyễn Phương Vỹ đã nghiên cứu khảo sát hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone ở Mentha arvensis L. bằng phương pháp khác nhau. Năm 2009, Viện hóa học Công nghiệp nghiên cứu hoàn thiện công nghệ tách menthol tinh thể từ tinh dầu Bạc hà Việt Nam phục vụ ngành Dược và Mỹ phẩm. Năm 2009, Trần Thị Lệ Minh và cộng sự nghiên cứu một số phương pháp trồng, chiết xuất tinh dầu, phân tích hàm lượng và thành phần các hợp chất trong cây Bạc hà Mentha arvensis L. Năm 2011, Bùi Thị Hồng Gấm và cộng sự đã khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma lên mô sẹo của cây Bạc hà Mentha arvensis L. 1.2.2. Giới thiệu sơ lược về giống Bạc Hà Á Mentha arvensis L. Vị trí phân loại Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Lamioles Họ : Lamiaceae Chi : Mentha Loài : Mentha arvensis L. Hình 1.1. Bạc Hà Á Mentha arvensis L. Nguồn gốc và sự phân bố Trên thế giới có 2 loại Bạc hà chính cho 2 loại tinh dầu khác nhau. Đã được trồng cách đây khoảng 2000 năm tại nhiều quốc gia khác nhau: - Bạc hà Châu Á (hay Bạc hà Nam) mọc nhiều ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, Brazil. Ở Việt Nam, Bạc hà Châu Á mọc hoang nhiều ở Việt Bắc (Lào Cai, Sơn 23
  33. Đồ án tốt nghiệp La, Lai Châu) được di thực về đồng bằng để trồng trọt nhưng không phát triển. Do vậy, đã di thực nhiều chủng có năng suất cao hơn như: Bạc hà 974, 975, 976 và Bạc hà Đài Loan. Riêng chủng loài 974 được trồng nhiều ở cả 2 miền Nam Bắc vì chủng này có ưu điểm: chịu hạn, chịu rét, chịu sâu bệnh. - Bạc hà Châu Âu: trồng nhiều ở Anh (vùng Mitsam), Pháp điển hình là giống bạc hà có nguồn gốc Mitsam (Anh) đây là giống lai như vẫn giữ nguyên được tính chất từ thế kỷ XIX đến nay. Vào những năm cuối thế kỷ XIX (1840) và những năm đầu của thế kỷ XX các nước Pháp, Italia, Đức, Bungari, Nam Tư và Liên Xô cũ đã trồng Bạc hà trên diện rộng để lấy tinh dầu và thị trường quốc tế đã có nhiều nước xuất khẩu tinh dầu Bạc hà. Trong thời gian này các nước Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên, cũng đã có mặt hàng này xuất khẩu, vào năm 1986 Nhật Bản đã có sản lượng tinh dầu xuất khẩu lớn, chiếm 50% sản lượng tinh dầu toàn thế giới. + Giống Bạc hà Á phổ biến ở Việt Nam có 2 nguồn gốc: Bạc hà bản địa: mọc hoang ở các tỉnh Sơn La, Lào Cai, Lai Châu. Cây có thể cao đến 1,50 m. Thân màu xanh, xanh lục hoặc tím. Loại này đưa về đồng bằng trồng cho năng suất cây xanh cao, nhưng hiệu suất tinh dầu và hàm lượng methol trong tinh dầu thấp nên không có giá trị kinh tế. Ngoài ra, còn phát hiện các chủng mọc hoang khác ở một số vùng khác nhau, phổ biến nhất là chủng giàu piperiton oxyd và pulegon. Hiện nay ở vùng Nghĩa Trai (Hưng Yên) có trồng một loại Bạc hà hoa màu trắng hồng, mọc vòng quanh kẽ lá. Thành phần menthol trong tinh dầu loài Bạc hà này rất thấp (3,6 – 8,2%), trong khi đó tỷ lệ pulegon lại khá cao (33,0 – 56,5%). Loại này được bán trong vùng để sử dụng làm thuốc. Bạc hà di thực có nhiều chủng loại: Bạc hà 974 là giống Bạc hà 974 được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và các tỉnh phía Nam, Bạc hà 976, Bạc hà Đài Loan, Một số giống đang nghiên cứu TN8 và TN26, Bạc Hà Nhật. 24
  34. Đồ án tốt nghiệp Đặc điểm thực vật học Rễ: Rễ Bạc hà thuộc loại rễ chùm. Rễ mọc từ các đốt thân ngầm dưới mặt đất và phân bố ở tầng đất có độ sâu 20 – 30 cm. Thân ngầm phát triển đến đâu thì bộ rễ lan rộng tới đó. Do bộ rễ phân bố nông nên khả năng hút dinh dưỡng và nước yếu cho nên trong trồng trọt phải chú ý đến biện pháp kỹ thuật làm đất trước khi trồng đảm bảo cho đất tơi xốp thông thoáng, việc lên luống tạo tầng đất mặt dày, tơi xốp; tưới nước đủ và trồng mật độ thích hợp là rất cần thiết để cây Bạc hà đạt sinh khối lớn. Rễ cây Bạc hà thích hợp với ẩm độ đất khá cao khoảng 70 – 80 %. Tuy nhiên chúng không chịu được ngập úng, kể cả vùng đất úng ngập cục bộ. Khi bị úng ngập thường ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của cả bộ rễ và các thân ngầm, trong điều kiện ẩm độ đất quá lớn cả thân ngầm và bộ rễ đều có thể bị nấm gây bệnh thối thân, thối rễ. Thân và cành: Thân bạc hà là loại cây thân thảo, chiều cao của cây, chiều dài của cành gồm có nhiều đốt, các đốt ở thân, cành đều có khả năng phát sinh rễ và phát sinh các mầm cành thứ cấp tại các mắt đốt. Chiều cao của cây biến động trung bình từ 0,6– 1,2 m và là cây trồng một năm. Các mầm cành phát sinh và trở thành đoạn thân trên mặt đất (thân khí sinh). Ở phần thân này mỗi mắt đốt mang một đôi lá, mỗi nách có hai mầm cành (mọc đối nhau từng đôi một, bên dưới mỗi mầm cành có nhiều mầm rễ và có khả năng phát triển thành các rễ ở một vài đốt gần mặt đất. Thân, cành Bạc hà có góc cạnh khá rõ, màu sắc tuỳ thuộc vào giống (xanh đậm, xanh nhạt hoặc tím). Màu sắc của thân cành cũng tương ứng với màu sắc của lá và hoa. Tuy phát sinh trong đất nhưng các thân ngầm này vẫn tiếp tục phân các nhánh thân ngầm cấp 2. Đốt thân ngầm càng nhiều thì khả năng ra rễ cũng như các nhánh thân càng nhiều. Khi phần thân trên mặt đất ở giai đoạn ra hoa thì phần thân ngầm và rễ đã phát triển mạnh đan xen nhau nhiều trong tầng đất mặt từ 0 – 20 cm. 25
  35. Đồ án tốt nghiệp Lá: Lá là bộ phận chính chứa tinh dầu nên đây là bộ phận kinh tế của cây Bạc hà. Lá là cơ quan dinh dưỡng quan trọng nhất, không chỉ thực hiện các chức năng quang hợp, thoát hơi nước mà còn chứa các túi tinh dầu. Lá là bộ phận thu hoạch để chưng cất tinh dầu, chiếm 50 % tổng khối lượng phần sinh khí trên mặt đất. Tỷ lệ tinh dầu trong lá phụ thuộc vào bản chất di truyền của giống và thường dao động 2 – 6 % so với khối lượng khô. Lá Bạc hà là lá đơn, mọc đối trên thân, có màu xanh hoặc đỏ tím, chiều dài lá 4 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm, phía trên và phía dưới của bề mặt lá đều có các túi tinh dầu, thường thì số lượng túi tinh dầu ở phía trên nhiều hơn. Túi tinh dầu ở dạng lông tiết (loại lông ngắn chủ yếu chứa tinh dầu), loại lông tiết dài chủ yếu làm nhiệm vụ che chở cho cây. Trên bề mặt phiến lá số lượng túi tinh dầu tăng từ mũi lá đến gốc lá, từ hai bên mép vào giữa phiến lá. Trên cây, lá từ đốt thứ 8 từ dưới lên phát triển nhất và chứa nhiều tinh dầu nhất trong cây. Hoa: Hoa Bạc hà là loại hoa chùm, hoa lưỡng tính nên có các bộ phận như đài, cánh hoa, nhị và nhuỵ. Đài có 5 cánh đối xứng hai bên, màu sắc của cánh hoa có màu tím, hồng nhạt hay trắng. Hoa có 4 nhị nhưng chỉ có 2 nhị là phát triển và có hai bao phấn, 2 nhị kia thoái hoá phát triển kém trở thành nhị lép cho nên khả năng thụ phấn thụ tinh thấp. Trong điều kiện Việt nam không thể kết hạt được, do đó phương pháp nhân giống Bạc hà chủ yếu là nhân giống vô tính. Các loài bạc hà châu Âu (M. piperita L.) là loại ra hoa hữu hạn, các hoa sắp xếp thành cụm trên đầu cành nở hoa trước. Bạc hà châu Á (M. avensis L.) hoa ra theo hình xim ở hai nách lá tạo thành vòng và ra hoa vô hạn (các đốt dưới của thân cành ra hoa trước). Khi Bạc hà bắt đầu có hoa là lúc cho thân lá cao nhất (trong một ngày có thể tạo ra 280 kg thân lá/ha) và hàm lượng tinh dầu trong lá cao. Đây là thời điểm thu hoạch tốt nhất, nếu để trên cây đã có 100% số hoa nở thì năng suất chất xanh giảm do lá bị rụng ở các đốt ra hoa sớm. 26
  36. Đồ án tốt nghiệp Thành phần hóa học Tinh dầu Bạc hà tinh dầu được chưng cất từ cây Bạc hà. Nó là một hỗn hợp có hàng chục các hợp chất có nguồn gốc khác nhau; trong đó có Menthol và Menthola là thành phần chính. Tinh dầu tập trung chủ yếu trong lá của cây Bạc hà và khối lượng lá thường chiếm khoảng 40 – 50 % tổng lượng phần cây trên mặt đất (thân, cành, lá, hoa, quả). Hàm lượng tinh dầu trong cây Bạc hà đạt từ 0,50% – 5,6%. Sự biến động này phụ thuộc vào giống và điều kiện ngoại cảnh. Giống Bạc hà châu Âu có hàm lượng tinh dầu cao hơn Bạc hà Châu Á. Tuy nhiên do lai tạo hiện nay một số giống Bạc hà Châu Á cũng có lượng tinh dầu cao. Tinh dầu Bạc hà là một chất lỏng linh động trong suốt hoặc có màu vàng nhạt hay xanh vàng, có khối lượng riêng (ở 20oC) từ 0,897– 0,940, có mùi thơm đặc trưng và vị mát lạnh. + Hoạt chất Menthol và Menthola Menthol có công thức hóa học là C10H18O, Menthola là C10H10OH. Khi đem tinh dầu chiết xuất thì hai hoạt chất này là một chất rắn dạng tinh thể màu trắng, còn ở trong tinh dầu chưng ở dạng tự do hay kết hợp. Hàm lượng các hoạt chất này trong tinh dầu biến động từ > 80 – 90%. Menthola trong tinh dầu chủ yếu ở trạng thái tự do, phần còn lại kết hợp với acid acetic. Loài bạc hà nào có lượng menthola tự do cao sẽ cho chất lượng tinh dầu cao. Vì vậy Menthola là chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dầu. Điều kiện sinh thái • Nhiệt độ Cây bạc hà sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ mát mẻ từ 18 – 27oC, trong thời kỳ ra hoa nhiệt độ thích hợp nhất là 25 – 27oC. Tuy nhiên trong điều kiện nhiệt độ >10oC cây vẫn có thể sinh trưởng được. Trong thời kỳ tiềm sinh, bạc hà có thể chịu được nhiệt độ rất thấp dưới -1oC. 27
  37. Đồ án tốt nghiệp • Độ ẩm Cây Bạc hà không yêu cầu ẩm độ một cách nghiêm ngặt, tuy nhiên trồng để đạt năng suất cao về chất xanh và tỷ lệ tinh dầu nên chú ý và coi trọng vấn đề tưới tiêu nước, do rễ cây Bạc hà phát triển ở trên tầng đất mặt nên sức hút nước và dinh dưỡng kém hơn so với các loại cây trồng khác. Tưới tiêu, giữ ẩm là cơ sở cho việc tạo năng suất cao của cây Bạc hà quá trình sinh trưởng phát triển của cây cần đảm bảo đủ độ ẩm đất, ẩm độ biến động lớn sẽ gây rụng lá và tích lũy tinh dầu kém. Ẩm độ đất thích hợp là 70 – 75 %, ẩm độ không khí từ 75 – 80 %. • Ánh sáng Cây Bạc hà rất mẫn cảm với thời gian chiếu sáng (ngày dài, ngày ngắn) và cường độ chiếu sáng mạnh, đầy đủ. Để cây sinh trưởng và phát triển bình thường thì yêu cầu độ chiếu sáng trong ngày ≤ 12h. Độ dài ngày chiếu sáng 8 – 10 h, cây sẽ sinh trưởng yếu và không nở hoa, hầu hết các dạng thân ngầm không chuyển sang dạng thân khí sinh, số cây trên đơn vị diện tích sẽ làm giảm năng suất chất xanh và lượng tinh dầu. Cây Bạc hà là cây ưa sáng và phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng trực xạ. Trong quá trình trồng bạc hà phải chú ý đến thời vụ trồng mật độ, không trồng xen để đảm bảo ánh sáng hợp lý cho chúng sinh trưởng và phát triển tốt. Ở nước ta thời vụ trồng thích hợp nhất là vụ xuân hàng năm. • Đất đai: Cây bạc hà ưa đất tơi xốp, có thành phần cơ giới nhẹ, giàu dinh dưỡng, giữ nước và thoát nước tốt. Các loại đất phù sa ven sông suối, các loại đất đen có tầng canh tác tương đối dày, mực nước ngầm thấp thích hợp cho bạc hà. Các loại đất có thành phần cơ giới nặng như đất sét, đất không có cấu tượng như đất cát không thích hợp với bạc hà. Độ pH thích hợp cho bạc hà là 6 – 7,5, trên các loại đất trồng liên tục từ 2 – 3 năm nên phá đi để trồng lại, nên tiến hành luân canh với các loại cây trồng khác để giảm tỷ lệ sâu bệnh hại, không ảnh hưởng đến năng suất. 28
  38. Đồ án tốt nghiệp • Dinh dưỡng: Trong từng giai đoạn sinh trưởng Bạc hà cần lượng dinh dưỡng khác nhau. Chú ý bón phân vào các thời kỳ: khi cây cao 10 cm, khi phân cành và khi nụ hoa bắt đầu phát sinh. Nguyên tố potassium cần bón kết thúc sớm (vào lúc cây phân cành) để không ảnh hưởng tới tích lũy tinh dầu. Giá trị kinh tế và tình hình sản xuất Bạc Hà Á Mentha arvensis L. a) Giá trị kinh tế: Tinh dầu Bạc hà là nguyên liệu cho công nghiệp dược, chủ yếu trong sản xuất các loại thuốc kháng vi khuẩn (như thuốc đánh răng, thuốc chữa viêm xoang mũi, trán), các loại thuốc làm tan vết bầm dập trên cơ thể, đau xương khớp và thuốc chống cảm lạnh, thuốc chữa loét dạ dày. Tinh dầu Bạc hà còn là nguồn nguyên liệu, nguyên liệu phụ cho công nghiệp thực phẩm (như làm rượu, bia, bánh kẹo) và công nghệ chế biến mỹ phẩm. Bã dầu khi chưng cất có khối lượng lớn, người ta để thật hoai mục làm phân bón cho cây lúa nước. Diện tích trồng Bạc hà chỉ có một số nước trên thế giới, nhưng nhu cầu để duy trì thì hầu hết có ở các nước nên tinh dầu và dạng hoạt chất của tinh dầu luôn có giá trị nên thị trường ổn định ít mất giá. b) Tình hình sản xuất Trên thế giới: Trên thế giới có nhiều nước trồng Bạc hà để thoả mãn nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Châu Mỹ trồng nhiều bạc hà nhất, Brazil có diện tích lớn. Tỷ trọng xuất khẩu của châu lục này chiếm 70 – 90% của thế giới, sản lượng tinh dầu Bạc hà trên thế giới ước đạt 3000 tấn/năm. Châu Á ít trồng chỉ có Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam trồng bạc hà và có mặt hàng xuất khẩu, Ở Việt Nam: Cây Bạc hà Châu Á mọc hoang ở nước ta rất nhiều nhưng tập trung nhiều ở các vùng như: Hoàng Liên Sơn, Tam Đảo, Ba Vì. Cây Bạc hà Châu Á được trồng thành vùng ở đồng bằng Bắc Bộ như Hưng Yên, Nam Định, Hà Nam, các vùng ở ngoại thành Hà Nội, Các chủng loại được nhập và trồng phổ biến ở nước ta mang 29
  39. Đồ án tốt nghiệp mã số 701, 974, 976, Các chủng này có thể đạt 60 – 100 lít tinh dầu/ha/năm. Điều kiện nước ta rất thích hợp cho trồng Bạc hà, đầu ra của sản phẩm có triển vọng nhưng chính sách và các nghiên cứu về Bạc hà chưa được chú trọng. Công dụng Cây Bạc hà, tinh dầu và hoạt chất menthol trong cây Bạc hà được người ta sử dụng với nhiều cách khác nhau như: Lá Bạc hà giúp cho tiêu hóa, trừ co thắt, trị nôn (do có tinh dầu). Các Flavonid có tác dụng lợi mật. Dạng dùng là chè thuốc. Trong y học cổ truyền người ta dùng bạc hà làm thuốc chữa cảm nóng, nhức đầu, ho, viêm khí quản, mụn nhọt, lở ngứa. Tinh dầu Bạc hà và menthol bốc hơi nhanh, tinh dầu Bạc hà là thành phần của Cao Sao Vàng và các Cao, dầu xoa khác để chữa cảm lạnh, nhức đầu, chóng mặt, say tàu xe, Nó còn là chất thơm dùng trong công nghiệp thuốc lá, kem đánh răng, kẹo, mỹ phẩm, Menthol có tính sát khuẩn, tiếp xúc với da gây cảm giác mát và tê tại chỗ (do hiện tượng bay hơi). Thuốc bôi chữa đau răng (có tên là thuốc lỏng Bonain) gồm có một phần Menthol, một phần phenol và một phần cocain. Nhu cầu hàng năm trong nước khoảng 50 tấn tinh dầu. 30
  40. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài Địa điểm: Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, Khoa CNSH – TP – MT, trường Đại Học Công nghệ Tp.HCM Thời gian tiến hành Đề tài từ tháng 11 / 2015 đến tháng 8 / 2016. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu: Nguồn mẫu được sử dụng trong đề tài được tạo từ các đoạn thân in vitro, của giống Bạc hà Á Mentha arvensis L. in vitro ở phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy Các thí nghiệm sử dụng môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung thêm đường sucrose, agar, than hoạt tính và bột từ các loại ngũ cốc, nước dừa tuỳ theo từng thí nghiệm. 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm Nhiệt độ: 25 ± 2oC Cường độ sáng từ 2500 – 3000 1ux. Thời gian chiếu sáng 16 giờ / ngày. Ẩm độ không khí: từ 30 – 40%. 2.3. Phương pháp Pha môi trường a. Chuẩn bị dung dịch mẹ Sử dụng môi trường MS: môi trường này được coi là môi trường thích hợp với nhiều loại cấy do giàu và cân bằng về mặt dinh dưỡng. Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy khi không cần cân hóa chất mỗi lần pha mà thường chuẩn bị trước dưới dạng các dung dịch đậm đặc, sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng. Các stock này thường được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh nhiệt độ thường. 31
  41. Đồ án tốt nghiệp b. Môi trường nuôi cấy: Môi trường có bổ sung than hoạt tính: MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose, và nồng độ than hoạt tính tương ứng 0; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625 g/l. Môi trường có bổ sung nước dừa: MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose và nồng độ nước dừa tương ứng 0; 25; 50; 75; 100 ml. Môi trường có bổ sung đậu đen: MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose và hàm lượng đậu đen tương ứng 0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l. Môi trường có bổ sung đậu xanh: MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose và hàm lượng đậu xanh tương ứng 0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l. Tất cả đều được định mức tới 1000 ml và điều chỉnh pH bằng NaOH và HCl. 2.4. Bố trí thí nghiệm 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này nhằm xác định nồng độ than hoạt tính thích hợp lên khả năng tăng trưởng của đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cắt cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose và hàm lượng than hoạt tính thay đổi theo từng nghiệm thức như bảng 2.1. Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. Nghiệm thức Nồng độ (g/l) A0 0 A1 0,125 A2 0,25 A3 0,375 32
  42. Đồ án tốt nghiệp A4 0,5 A5 0,625 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hàm lượng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này nhằm xác định hàm lượng nước dừa thích hợp lên khả năng tăng trưởng của đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cắt cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose và hàm lượng nước dừa thay đổi theo từng nghiệm thức như bảng 2.2. Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. Nghiệm thức Nồng độ (ml) B0 0 B1 25 B2 50 B3 75 B4 100 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của bột đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này nhằm xác định hàm lượng đậu đen thích hợp cho quá trình nhân nhanh chồi, hình thành rễ ở cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. 33
  43. Đồ án tốt nghiệp • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cắt cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose và thêm hàm lượng đậu đen thay đổi theo từng nghiệm thức như bảng 2.3. Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. Nghiệm thức Nồng độ (g/l) C0 0 C1 3 C2 6 C3 9 C4 12 C5 15 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của bột đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này xác định hàm lượng đậu xanh thích hợp lên khả năng tăng trưởng của đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cắt cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose và thêm hàm lượng đậu xanh thay đổi theo từng nghiệm thức như bảng 2.4. 34
  44. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. Nghiệm thức Nồng độ (g/l) D0 0 D1 3 D2 6 D3 9 D4 12 D5 15 2.5. Chỉ tiêu theo dõi Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) Số lá (lá/cây) Đường kính lá (mm) Chiều dài lá (mm) Số rễ (rễ/mẫu) Chiều dài rễ (mm) Số chồi (chồi/mẫu) Chiều cao cây (mm) Đặc điểm hình thái của mẫu 2.6. Thống kê và xử lý số liệu Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Kết quả ghi nhận số liệu là giá trị trung bình. Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Execel 2013® và SAS 9.1. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và 35
  45. Đồ án tốt nghiệp biểu diễn dưới dạng các số liệu giá trị trung bình cùng kí tự a, b thì không có sự sai khác về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. 36
  46. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy Đoạn cắt thân mẫu cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. có chiều dài 1,5 – 2 cm được dùng làm mẫu in vitro được cấy trực tiếp vào môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose, và nồng độ than hoạt tính tương ứng (0; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625 g/l) dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ / ngày. Sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy không có nhiều sự khác biệt về hình thái. Sau 2 tuần, các mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi. Sau 3 tuần, ở các đốt thân xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy nhờ nuôi trong điều kiện ánh sáng liên tục. Đến tuần thứ 4 và thứ 5, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát than hoạt tính ở các nồng độ khác nhau trong môi trường in vitro Bạc hà nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh. Các kết quả thí nghiệm thu được và trình bày ở bảng 3.1; đồ thị 3.1, 3.2, 3.3 và hình 3.1. 37
  47. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính lên quá trình hình thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy Trọng Trọng Đường Chiều Chiều Chiều Số lá Số chồi Số rễ NT lượng lượng kính lá dài lá cao cây dài rễ Đặc điểm (lá/mẫu) (chồi/mẫu) (rễ/mẫu) tươi (g) khô (g) (mm) (mm) (mm) (mm) Mẫu cấy phát triển bình thường lá ít, A0 1,9250b 0,1226bc 78,66b 5,33ab 6,00c 4,33d 61,00d 22,33ab 47,33b và nhỏ, thân chồi mảnh, ốm, rễ dài Mẫu cấy xanh tốt, cây cao, đốt thân A1 1,8123b 0,1406b 56,66c 4,66b 5,33c 4,33d 93,66b 16,33ab 21,66d dài, rễ ngắn và ít chồi, ít lá Cây phát triển tốt, rễ ít ngắn, số chồi A2 1,1297bc 0,0840c 84,00b 4,66b 6,33c 6,66c 96,66b 26,33ab 19,66d ít, cây cao, thân mảnh, đốt thân dài Cây phát triển rất tốt, nhiều cây và A3 4,7627 a 0,3010a 139,33a 6,33a 11,66a 8,66b 76,00c 31,00a 51,33a chồi, thân mảnh lá nhiều, rễ nhiều nhưng ngắn. Cây phát triển bình thường lá ít, kích A4 0,3667c 0,0330d 26,33d 4,33b 6,66c 1,00e 109,00a 0,25ab 20,33d thước lá nhỏ, ít chồi nhưng cây cao. Cây phát triển chậm, cây thấp, ốm, đốt A5 1,9017b 0,1253bc 52,33c 4,33b 9,00b 10,66a 55,33e 7,67b 30,00c thân ngắn, lá nhỏ, nhiều chồi. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau chỉ sai khác thống kê với p < 0,05. 38
  48. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là 0; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625 g/l) Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là 0; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625 g/l) 39
  49. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là 0; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625 g/l) 40
  50. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính lên quá trình hình thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là 0; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625 g/l) 41
  51. Đồ án tốt nghiệp • Nhận xét và thảo luận Từ kết quả ở bảng 3.1, biểu đồ 3.1, 3.2, 3.3 và hình 3.1 cho thấy khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy, việc bổ sung 0,375 (g/l) than hoạt tính cho sự tăng trưởng của chồi và cây là tốt nhất. Ở nghiệm thức A3 nồng độ than hoạt tính 0,375 (g/l) cho trọng lượng tươi là tốt nhất (4,7627 g) gấp 2,4 lần so với A0 (1,9250 g). Cũng ở nghiệm thức A3 cho số lá cây là nhiều nhất (139,333 lá/mẫu), Cây phát triển rất tốt, nhiều cây và chồi, thân mảnh lá nhiều, rễ nhiều nhưng ngắn. Nghiệm thức A0 cho số rễ (22,33 rễ/mẫu) và chiều dài rễ là cao nhất (47,333 cm). Nồng độ than hoạt tính 0,625 (g/l) (A5) cho số chồi tạo nhiều nhưng cây phát triển chậm, cây thấp, ốm, đốt thân ngắn, lá nhỏ. Nồng độ than hoạt tính 0,125 (g/l) (A1) mẫu cấy xanh tốt, cây cao, đốt thân dài, rễ ngắn và ít chồi, ít lá. Nồng độ than hoạt tính 0,25 (g/l) (A2) mẫu phát triển tốt, rễ ít ngắn, số chồi ít, cây cao, thân mảnh, đốt thân dài. Nồng độ than hoạt tính 0,5 (g/l) (A4) mẫu cây phát triển bình thường lá ít, kích thước lá nhỏ, ít chồi nhưng cây cao. Ở các nồng độ than hoạt tính khác nhau thì hình thái của cây cũng khác nhau, cụ thể: • Ở nghiệm thức A0: không bổ sung than hoạt tính thì cây vẫn phát triển bình thường nhưng không đều giữa các mẫu. Lá cây xanh nhưng mau chóng ngả vàng, ít chồi, lá và cho số rễ và chiều dài là cao nhất. • Ở nghiệm thức A1: môi trường bổ sung than hoạt tính với nồng độ 0,125 (g/l) thì số lượng cây và chồi tạo ra nhiều hơn, nhưng cây sau khoảng 3 tuần tăng trưởng ổn định thì bắt đầu tăng trưởng chậm. Chiều cao giữa các cây không đều. Lá cây không được xanh và tốt. • Ở nghiệm thức A2: khi tăng nồng độ than hoạt tính lên 0,25 g/l thì cây phát triển chậm lại ở tuần thứ 4, số chồi ít và ngắn, thân ốm cao, lá nhỏ, số rễ ít. 42
  52. Đồ án tốt nghiệp • Ở nghiệm thức A3: nồng độ than hoạt tính khi được tăng lên 0,375 g/l cây phát triển hơn. Cây xanh, tươi, chồi, lá, rễ là tốt nhất, cây cao, lá to và nhiều. Cây tăng trưởng nhanh và ổn định trong 8 tuần nuôi cấy. • Ở nghiệm thức A4: nồng độ than hoạt tính là 0,5 g/l cây phát triển bất thường, thân cây ốm, rễ ít và ngắn, lá nhỏ và ít, ngả màu vàng trong tuần thứ 8. • Ở nghiệm thức A5: nồng độ than hoạt tính tăng lên 0,625 g/l cây phát triển chậm, lá cây xanh tốt, cây thấp, ốm, lá nhỏ, nhiều chồi. Theo đó, than hoạt tính có tác dụng hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp Và đặc biệt,than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do làm cho môi trường sẫm màu, nên có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ (Vũ Văn Vụ, 2006). Than hoạt tính có tác dụng khử độc, kích thích sự tăng trưởng. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của tế bào mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy. Than hấp thu các hợp chất ức chế sự phát triển của cây, hấp thu các hợp chất hữu cơ, tăng khả năng hình thành phôi và tăng việc hình thành rễ (George,1993). Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy, bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy rõ ràng là có ảnh hưởng tích cực hơn đến sự hình thành của rễ cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. Ở tất cả các môi trường bổ sung than hoạt tính đều cho tỷ lệ tạo rễ là 100%. Bổ sung than hoạt tính ở nồng độ 0,375g/l cho số lượng rễ nhiều nhất (31,00 rễ/chồi). Trong khi đó ở các nồng độ khác thì số lượng rễ thấp hơn. Chất lượng rễ của mẫu cấy ở môi trường có bổ sung 0,375g/l than hoạt tính là dài và rất khỏe, ở các nồng độ khác thì rễ ngắn và yếu hơn. Theo Trần Thanh Huyền và cộng sự (2014) môi trường MS bổ sung nồng độ BA 1,0 mg/l thích hợp cho việc nhân chồi dưa hấu tam bội, số chồi khỏe, không bị thủy tinh thể. Đồng thời, nồng độ BA 1,0 mg/l cùng than hoạt tính 2,0 g/l cho số lá, chiều cao cây tốt sau 3 tuần nuôi cấy. Môi trường bổ sung IBA 0,5 mg/l và than hoạt tính 2,0 g/l thích hợp cho việc ra rễ với số rễ, chiều dài rễ cũng như số lá và 43
  53. Đồ án tốt nghiệp chiều cao cây dưa hấu tam bội tốt nhất. Các kết quả thu được cho thấy, so với môi trường không có than hoạt tính, các cây sinh trưởng và phát triển trên môi trường có than hoạt tính cho các chỉ tiêu về số lượng chồi, chiều cao, số lá, đường kính lá, chiều dài rễ và số rễ đều vượt trội hơn khi môi trường không bổ sung than hoạt tính. Nguyễn Thị Nhật Linh và cộng sự (2012) đã chỉ ra kết quả so với môi trường không có than hoạt tính, các cây sinh trưởng và phát triển trên môi trường có than hoạt tính cho các chỉ tiêu về khối lượng chồi, chiều cao chồi, khối lượng rễ, chiều dài rễ và số rễ đều vượt trội hơn khi môi trường không bổ sung than hoạt tính. Đối với sự sinh trưởng và phát triển cây in vitro, nồng độ than thích hợp nhất bổ sung vào môi trường MS cho sự sinh trưởng phát triển chồi với mật độ khí khổng gia tăng đáng kể và sự hình thành rễ của chồi Hồng môn là 2 g/l và Cúc là 3 g/l. Vị trí lớp than hoạt tính nằm dưới với thể tích 20 ml là tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển của cây Hồng môn và Cúc nuôi cấy in vitro. Đối với sự định hướng rễ in vitro, sự phát triển và kéo dài của đa số các rễ đều phụ thuộc vào vị trí lớp than hoạt tính và hầu hết các rễ của hai loại cây trồng này đều chỉ tăng trưởng trong lớp than hoạt tính [Hồng môn (trên 95%), Cúc (trên 80%)]. Ngoài ra, ở Hồng môn thì vị trí lớp than hoạt tính nằm dưới cho thấy hệ thống mạch dẫn tăng kích thước rõ ràng hơn Cúc. Hơn nữa, ở rễ Cúc khi thay đổi vị trí lớp than hoạt tính sẽ ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của lông hút và tại vị trí lớp môi trường nằm dưới cho thấy số lượng lông hút hầu như không giảm so với ở môi trường không có than hoạt tính. Tóm lại, qua thí nghiệm này, chúng tôi thấy rằng, than hoạt tính ở nồng độ 0,375g/l than hoạt tính (nghiệm thức A3) là có tác dụng kích thích sự hình thành và phát triển rễ Bạc hà Á Mentha arvensis L. tốt nhất. 44
  54. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy Đoạn cắt thân mẫu cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. có chiều dài 1,5 – 2 cm được dùng làm mẫu in vitro được cấy trực tiếp vào môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose, và nồng nước dừa tương ứng (0; 25; 50; 75; 100 ml) dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ ngày. Sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy không có nhiều sự khác biệt về hình thái. Sau 3 tuần, các mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi. Sau 4 tuần, ở các đốt thân xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy nhờ nuôi trong điều kiện ánh sáng liên tục. Đến tuần thứ 5 và thứ 6, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát nước dừa ở các nồng độ khác nhau trong môi trường in vitro Bạc hà nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh. Các kết quả thí nghiệm thu được và trình bày ở bảng 3.2; đồ thị 3.4, 3.5, 3.6 và hình 3.2. 45
  55. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các nồng nước dừa lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy Trọng Trọng Đường Chiều Chiều Chiều Số lá Số chồi Số rễ NT lượng lượng kính lá dài lá cao cây dài rễ Đặc điểm (lá/mẫu) (chồi/mẫu) (rễ/mẫu) tươi (g) khô (g) (mm) (mm) (mm) (mm) Mẫu cấy phát triển bình thường lá ít, B0 2,4787b 0,1570b 78,66b 7,33b 7,66c 4,33b 61,00bc 22,33d 47,33ab xanh và nhỏ, thân mảnh, ốm, rễ ngắn. Mẫu cấy phát triển bình thường lá ít, B1 1,5987c 0,1250b 80,33b 6,66b 9,66b 3,33c 56,00cd 37,66c 35,33c xanh và nhỏ, thân mảnh, ốm, rễ ngắn, đốt thân dài. Mẫu cấy phát triển tốt, lá thưa, xanh và B2 4,7627a 0,3010a 98,33a 10,33a 12,00a 4,66b 75,00a 71,00a 36,33c to, thân mảnh, ốm, rễ nhiều nhưng ngắn, đốt thân dài. Mẫu cấy phát triển chậm, lá ít nhưng to, B3 2,0450bc 0,1626b 94,66a 7,33b 10,00b 3,00c 51,33d 57,00b 42,33b xanh và nhỏ, thân mảnh, ốm, rễ dài Mẫu cấy phát triển chậm lá xanh nhiều B4 1,9717bc 0,1566b 87,00ab 10,66a 13,00a 7,33a 64,33b 65,33ab 52,33a nhưng nhỏ, thân mảnh, ốm, rễ dài Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau chỉ sai khác thống kê với p < 0,05. 46
  56. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; tương ứng với nồng độ nước dừa lần lượt là 0; 25; 50; 75; 100 ml) Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; tương ứng với nồng độ nước dừa lần lượt là 0; 25; 50; 75; 100 ml) 47
  57. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của nước dừa đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; tương ứng với nồng độ nước dừa lần lượt là 0; 25; 50; 75; 100 ml) 48
  58. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Ảnh hưởng của các nồng nước dừa lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; tương ứng với nồng độ nước dừa lần lượt là 0; 25; 50; 75; 100 ml) 49
  59. Đồ án tốt nghiệp • Nhận xét và thảo luận Từ bảng 3.2, biểu đồ 3.4, 3.5, 3.6 và hình 3.3, 3.4 cho thấy khi bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và hình thái của cây. Nghiệm thức B2 50 (ml) nước dừa cây phát triển xanh tốt với các chỉ tiêu về số chồi, số lá và số rễ là tốt nhất, trọng lượng tươi đạt (4,7627 g) gấp 1,9 lần so với B0 (2,4787 g), trọng lượng khô đạt (0,3010g) gấp 1,9 lần so với B0 (0,1570g). Mẫu cấy phát triển ổn định trong 8 tuần nuôi cấy. Ở các nghiệm thức B3, B4 cây phát triển chậm hơn, số lượng cây gần bằng B2, cây ốm, thấp, lá nhỏ bị uốn cong. Từ tuần nuôi cấy thứ 5 trở đi sức sống của cây giảm dần. Ở nghiệm thức B1 cây phát triển bình thường, số lượng cây và chồi ít, cây cao, lá ít, đốt thân dài ngắn không đều, rễ ít và ngắn, lá nhỏ và bị cong xuồng. Ở các nồng độ nước dừa khác nhau thì hình thái của cây cũng khác nhau, cụ thể: • Ở nghiệm thức B0: không bổ sung nước dừa thì cây vẫn phát triển bình thường nhưng chậm, than chồi mảnh, ít lá và nhỏ, rễ ngắn. Sau khoảng 3 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu vẫn rất ít, đến tuần thứ 4 số lượng chồi ở mẫu bắt đầu tăng lên nhưng không đáng kể, cây tăng trưởng ổn định nhưng chậm, rễ cây ít và ngắn chiều cao cây thấp. • Ở nghiệm thức B1: môi trường bổ sung nước dừa với nồng độ 25 (ml) cây phát triển bình thường. Cây xanh, thân chồi mảnh, đốt than dài, lá ít và cong, cây cao hơn ở nghiêm thức B0 nhưng rễ ít và ngắn. Cây sau khoảng 5 tuần tăng trưởng ổn định thì bắt đầu tăng trưởng chậm về số lá, số rễ, thân chồi mảnh. • Ở nghiệm thức B2: khi tăng nồng độ lên 50 (ml) nước dừa thì số lượng chồi được tạo ra nhiều hơn, cây phát triển rất tốt, lá to và nhiều nhưng rễ ngắn. Sau 3 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu rất nhiều, đến tuần thứ 4 số lượng chồi ở mẫu vẫn bắt đầu tăng lên, cây tăng trưởng nhanh. Đến tuần thứ 5 và thứ 6 mẫu vẫn tiếp tục tạo thêm chồi, thân cây mập hơn, lá cây phát triển lớn hơn. 50
  60. Đồ án tốt nghiệp • Ở nghiệm thức B3: nồng độ nước dừa khi được tăng lên 75 (ml) cây phát triển chậm lại, số lượng chồi tạo ra ít, cây mập hơn B0 và B1 nhưng lại thấp hơn, rễ cây nhiều và dài. Sau 3 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu nhiều, nhưng đến tuần thứ 4 số lượng chồi ở mẫu bắt đầu giảm dần, cây tăng trưởng ổn định, rễ cây phát triển nhiều và dài. Đến tuần thứ 5, thứ 6 mẫu ít sinh chồi, cây phát triển chậm, rễ bắt đầu phát triển nhiều và tốt hơn. • Ở nghiệm thức B4: khi nồng độ nước dừa tăng lên 100 (ml) thì mẫu cấy phát triển kém, số lượng cây và chồi được tạo ra ít hơn, lá ít, nhỏ, đốt thân thưa, rễ cây phát triển rất tốt. Sau khoảng 3 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu rất ít, đến tuần thứ 4 số lượng chồi tăng ít, cây tăng trưởng chậm, rễ cây dài, ít. Ở tuần nuôi cấy thứ 5 và thứ 6, cây phát triển về chiều cao, các đốt thân dài, lá nhỏ và rất ít, mẫu không phát triển thêm chồi mới, rễ cây bắt đầu dài ra. Kết quả thu được cho thấy nước dừa có tác dụng tốt lên quá trình hình thành chồi và sinh trưởng của cây. Các nồng độ nước dừa khác nhau, sự hình thành chồi và sinh trưởng chồi cây cũng khác nhau. Trong nước dừa non rất giàu clorua, kali, magie, vitamin A, E, đồng thời, chứa một lượng muối, đường, protein phù hợp cho sự tạo thành chồi và sinh trưởng chồi cây (Nguyễn Văn Uyển, 1984). Nước dừa được sử dụng trong nuôi cấy in vitro cho nhiều loại cây trồng, môi trường nuôi cấy có bổ sung nước dừa làm tăng hiệu quả nhân giống in vitro. Theo nghiên cứu nhân giống in vitro cây hoa lan Miltonia sp. (Phan Xuân Huyên và cộng sự , 2004). Sau 90 ngày nuôi cấy trên môi trường 1/2MS bổ sung các nồng độ nước dừa khác nhau, kết quả thu được cho thấy nước dừa có tác dụng tốt lên quá trình hình thành chồi và sinh trưởng của cây. Các nồng độ nước dừa khác nhau, sự hình thành chồi và sinh trưởng chồi cây cũng khác nhau. Với hàm lượng bổ sung nước dừa 50 ml này tuy khác với hàm lượng bổ sung trong nuôi cấy mô nhiều cây khác như dó bầu (Aquiliria crassna Pierre ex. Lecomte) (Đinh Trung Chánh, 1998), cây nhãn (Euphoria longan L.) (Trần Văn Minh, 2004), Caribê (Pinus caribaea) (Hà Thị Loan, 2003) nhưng đều cho kết quả 51
  61. Đồ án tốt nghiệp tốt khi bổ sung hàm lượng nước dừa phù hợp. Mặt khác, một số loài cây không cần bổ sung nước dừa trong nuôi cấy vẫn cho kết quả tốt như cây xoài (Mangifera india L.), cây sầu riêng (Duriozibethinus Mur) (Trần Văn Minh, 2004). Qua thí nghiệm này, chúng tôi thấy rằng nước dừa thích hợp cho sự nhân nhanh mẫu cấy cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. từ đốt thân. Nồng độ nước dừa 50 (ml) (nghiệm thức B2) là thích hợp nhất với các chỉ tiêu của cây cao nhất. 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của bột đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy Đoạn cắt thân mẫu cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. có chiều dài 1,5 – 2 cm được dùng làm mẫu in vitro được cấy trực tiếp vào môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose và nồng đậu đen tương ứng (0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l) dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ ngày. Sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy không có nhiều sự khác biệt về hình thái. Sau 3 tuần, các mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi. Sau 5 tuần, ở các đốt thân xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy nhờ nuôi trong điều kiện ánh sáng liên tục. Đến tuần thứ 5 và thứ 6, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát bột đậu đen ở các nồng độ khác nhau trong môi trường in vitro Bạc hà nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh. Các kết quả thí nghiệm thu được và trình bày ở bảng 3.3, đồ thị 3.7, 3.8, 3.9 và hình 3.2. 52
  62. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy Trọng Trọng Đường Chiều Chiều Chiều Số lá Số chồi Số rễ NT lượng lượng kính lá dài lá cao cây dài rễ Đặc điểm (lá/mẫu) (chồi/mẫu) (rễ/mẫu) tươi (g) khô (g) (mm) (mm) (mm) (mm) 35,66ab Mẫu phát triển tốt, lá xanh, khá nhiều C0 1,8123c 0,1626b 28,66e 8,66c 8,66b 6,33b 33,66c 58,33a c chồi, rễ nhiều và ngắn, đốt thân ngắn 31,33cb Mẫu phát triển bình thường, lá xanh, ít C1 1,8037c 0,1150c 34,66d 9,66bc 10,33a 4,33d 51,66b 49,00b d chồi, rễ ít và ngắn. Mẫu phát triển tốt, lá xanh, ít chồi, chồi C2 2,4017b 0,1516b 46,66b 11,66a 10,66a 4,66cd 60,33a 47,66b 41,66ab cao, rễ ít và ngắn. Mẫu phát triển rất tốt, lá nhiều, xanh và C3 3,3903a 0,2226a 53,33a 10,66ab 10,33a 8,66a 53,00b 61,66a 44,33a nhỏ, nhiều chồi, chồi cao, rễ nhiều và dài Mẫu phát triển bình thường, lá xanh và C4 1,0783d 0,0776d 42,66c 11,33a 10,33a 6,00bc 49,33b 28,66c 22,66d to, ít chồi, đốt thân đều, rễ ít và ngắn. Mẫu phát triển kém, lá vàng và rụng, ít C5 1,5843c 0,1406b 33,66d 5,66d 7,33c 2,33e 11,66d 22,33c 28,33cd hoặc không có chồi, rễ ít và ngắn. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau chỉ sai khác thống kê với p < 0,05. 53
  63. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của đậu đen đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5; tương ứng với nồng độ đậu đen lần lượt là 0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l) Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của đậu đen đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5; tương ứng với nồng độ đậu đen lần lượt là 0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l) 54
  64. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của đậu đen đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5; tương ứng với nồng độ đậu đen lần lượt là 0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l) 55
  65. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3. Ảnh hưởng của các nồng bột đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5; tương ứng với nồng độ đậu đen lần lượt là 0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l) 56
  66. Đồ án tốt nghiệp • Nhận xét và thảo luận Từ bảng 3.3, biểu đồ 3.7, 3.8, 3.9 và hình 3.5, 3.6 cho thấy khi bổ sung đậu đen vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và hình thái của cây. Nghiệm thức C3 9 (g/l) đậu đen cây phát triển xanh tốt với các chỉ tiêu về số chồi, số lá và số rễ là tốt nhất, trọng lượng tươi đạt (3,3903 g) gấp 1,8 lần so với C0 (1,8123 g), trọng lượng khô đạt (0, 2226 g) gấp 1,3 lần so với C0 (0,1626 g). Mẫu cấy phát triển ổn định trong 8 tuần nuôi cấy. Ở các nghiệm thức C5 cây phát triển chậm hơn, số lượng cây rất ít, lá úa vàng, cây rất thấp, rễ ngắn. Từ tuần nuôi cấy thứ 5 trở đi sức sống của cây giảm dần. Ở nghiệm thức C1 và C2 cây phát triển bình thường, lá cây xanh tốt, số lượng cây ngang ngửa với C0, ít chồi , cây cao, lá nhiều và nhỏ, rễ ít và ngắn Ở nghiệm thức C3 cây phát triển tốt nhất, lá cây xanh tốt, nhiều và nhỏ, số lượng cây nhiều, nhiều chồi, cây cao và thẳng, rễ nhiều và dài. Ở nghiệm thức C4 cây phát triển bình thường, số cây ít nhưng than cây mập, lá xanh và to, ít chồi, đốt thân đều, rễ ít và ngắn. Ở các nồng độ đậu đen khác nhau thì hình thái của cây cũng khác nhau, cụ thể: • Ở nghiệm thức C0: không bổ sung đậu đen thì cây vẫn phát triển bình thường, thân cây mập, lá tương đối nhiều và nhỏ, rễ ngắn. Sau khoảng 4 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu tăng lên nhưng không đáng kể, cây tăng trưởng ổn định, rễ cây ít và ngắn. • Ở nghiệm thức C1: môi trường bổ sung đậu đen với nồng độ 3 (g/l) cây phát triển bình thường. Cây xanh, thân cây mập, lá ít và không đều trên thân, cây thấp hơn ở nghiêm thức C0 nhưng rễ nhiều hơn và dài hơn. Cây sau khoảng 4 tuần tăng trưởng ổn định thì bắt đầu tăng trưởng chậm về số lá, chiều cao. • Ở nghiệm thức C2: khi tăng nồng độ lên 6 (g/l) đậu đen thì số lượng chồi được tạo ra nhiều hơn, cây phát triển tốt, lá nhỏ và nhiều nhưng rễ ngắn. Sau 4 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu nhiều, đến tuần thứ 5 số lượng chồi ở mẫu ít lại. Đến 57
  67. Đồ án tốt nghiệp tuần thứ 6 và thứ 7 mẫu vẫn tiếp tục tạo thêm chồi nhưng tốc độ tạo chồi chậm lại, thân cây mập hơn, lá cây phát triển lớn hơn. • Ở nghiệm thức C3: nồng độ đậu đen khi được tăng lên 9 (g/l) cây phát triển rất tốt, số lượng chồi tạo ra nhiều, thân cây mập và nhiều lá, lá nhỏ hơi uống cong, rễ cây nhiều và dài. Sau 4 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu nhiều, đến tuần thứ 5 số lượng chồi ở mẫu bắt đầu tăng lên, cây tăng trưởng ổn định, rễ cây phát triển nhiều và dài. Đến tuần thứ 6, thứ 7 mẫu vẫn tiếp tục sinh chồi, cây phát triển nhanh, xanh tốt, rễ bắt đầu phát triển nhiều và tốt hơn. • Ở nghiệm thức C4: khi nồng độ đậu đen tăng lên 12 (g/l) thì mẫu cấy phát triển bình thường, số lượng cây và chồi được tạo ra ít hơn, lá ít, to, rễ cây ngắn và ít. Sau khoảng 4 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu rất ít, đến tuần thứ 5 số lượng chồi không thay đổi nhưng lá cây to hơn và thân mập hơn, rễ cây ngắn, ít. Ở tuần nuôi cấy thứ 6 và thứ 7, cây phát triển về chiều cao, mẫu không phát triển thêm chồi mới. • Ở nghiệm thức C5: khi nồng độ đậu đen tăng lên 15 (g/l) thì mẫu cấy phát triển kém, số lượng cây và chồi được tạo ra ít, lá ít, nhỏ và ngả vàng, rễ cây phát triển chậm, ngắn. Sau khoảng 4 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu không phát triển thêm, đến tuần thứ 5 không thấy mọc thêm chồi mới, cây tăng trưởng chậm, rễ cây ngắn, ít. Ở tuần nuôi cấy thứ 6 và thứ 7, cây hầu như không phát triển mà lại có hiện tượng héo úa. Ở nghiệm thức C5 cây sinh trưởng không tốt vì nồng độ đậu đen quá cao có khả năng làm giảm hay thay đổi cân bằng các chất điều hòa tăng trưởng nội sinh trong cây, làm thay đổi áp suất thẩm thấu của môi trường. Theo Nguyễn Thị Cúc (2014) nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ lên quá trình sinh trưởng và phát triển cây Lan Hài hồng in vitro, khi bổ sung khoai tây ở các nồng độ 10 g/l, 20 g/l. 30 g/l, hầu như không có tác dụng đối với quá trình tạo chồi, tạo lá và gia tăng chiều cao của chồi nhưng làm tăng tỷ lệ sống của mẫu cấy. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng môi trường tinh bột nhưng không phải dịch chiết khoai tây, thay vào đó là dùng bột đậu đen để nuôi cấy in vitro cây Bạc 58
  68. Đồ án tốt nghiệp hà. Kết quả cho thấy, khi sử dụng môi trường đậu thì cây bạc hà có khả năng sinh trưởng và phát triển trong môi trường nuôi cấy in vitro. Qua thí nghiệm này, việc sử dụng môi trường có chứa tinh bột là nguồn carbohydrate kết hợp chiếu sáng bằng ánh sáng đèn giúp cây phát triển vượt 30% so với đối chứng. Chúng tôi thấy rằng nồng độ đậu đen 9 (g/l) (nghiệm thức C3) thích hợp cho sự nhân nhanh mẫu cấy cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. từ đốt thân với các chỉ tiêu của cây cao nhất. 3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của bột đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. Đoạn cắt thân mẫu cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. có chiều dài 1,5 – 2 cm được dùng làm mẫu in vitro được cấy trực tiếp vào môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose, và nồng đậu xanh tương ứng (0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l) dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ / ngày. Sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy không có nhiều sự khác biệt về hình thái. Sau 3 tuần, các mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi. Sau 4 tuần, ở các đốt thân xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy nhờ nuôi trong điều kiện ánh sáng liên tục. Đến tuần thứ 5 và thứ 6, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát bột đậu xanh ở các nồng độ khác nhau trong môi trường in vitro Bạc hà nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh. Các kết quả thí nghiệm thu được và trình bày ở bảng 3.4; đồ thị 3.10, 3.11, 3.12 và hình 3.4. 59
  69. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các nồng dịch bột xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy Trọng Trọng Đường Chiều Số lá Chiều dài Số chồi Chiều cao Số rễ NT lượng lượng khô kính lá dài rễ Đặc điểm (lá/mẫu) lá (mm) (chồi/mẫu) cây (mm) (rễ/mẫu) tươi (g) (g) (mm) (mm) Mẫu phát triển tốt, lá nhiều và D0 1,8123c 0,1626b 28,66d 8,66b 8,66bc 6,33b 33,66b 52,66ab 37,66b xanh, nhiều chồi, rễ nhiều và dài. Mẫu phát triển tốt, lá nhiều và D1 3,2247a 0,2256a 26,33d 9,33b 9,66b 6,33b 35,33ab 61,66c 35,66b xanh, nhiều chồi, rễ nhiều và ngắn. Mẫu phát triển tốt nhất, cây cao, D2 3,2473a 0,2203a 53,33a 9,33b 9,66b 5,33b 38,33a 64,66a 42,33a lá nhiều và xanh, nhiều chồi, rễ nhiều và dài. Mẫu phát triển tốt, lá xanh, khá D3 2,6937b 0,1840ab 46,66b 10,66a 11,33a 7,66a 29,33c 62,33ab 37,66b nhiều chồi, rễ nhiều tương đối dài, Mẫu phát triển chậm, cây thấp, lá D4 1,9493c 0,1800ab 38,33c 7,33c 9,66b 4,00c 22,66d 56,66cb 33,33b xanh, ít chồi, rễ nhiều và ngắn. Mẫu phát triển rất chậm, lá xanh, D5 1,1627c 0,2176a 15,33e 6,33c 7,66c 3,00c 15,33e 27,67d 28,66c ít lá, ít chồi, rễ ít và ngắn Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau chỉ sai khác thống kê với p < 0,05. 60
  70. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của đậu xanh đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5; tương ứng với nồng độ đậu xanh lần lượt là 0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l) Biểu đồ 3.11. Ảnh hưởng của đậu xanh đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5; tương ứng với nồng độ đậu xanh lần lượt là 0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l) 61
  71. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.12. Ảnh hưởng của đậu xanh đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5; tương ứng với nồng độ đậu xanh lần lượt là 0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l) 62
  72. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4. Ảnh hưởng của các nồng bột đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5; tương ứng với nồng độ đậu xanh lần lượt là 0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l) 63
  73. Đồ án tốt nghiệp • Nhận xét và thảo luận Từ bảng 3.4, biểu đồ 3.10, 3.11, 3.12 và hình 3.7, 3.8 cho thấy khi bổ sung đậu xanh vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và hình thái của cây. Nghiệm thức D2 6 (g/l) đậu xanh cây phát triển xanh tốt với các chỉ tiêu về số chồi, số lá và số rễ là tốt nhất, trọng lượng tươi đạt (3,2473 g) gấp 1,7 lần so với D0 (1,8123 g), trọng lượng khô đạt (0,2203 g) gấp 1,3 lần so với D0 (0,1626 g). Mẫu cấy phát triển ổn định trong 8 tuần nuôi cấy. Ở các nghiệm thức D4 cây phát triển chậm, số lượng cây rất ít, lá to, cây rất thấp, rễ ngắn, ít chồi . Từ tuần nuôi cấy thứ 5 trở đi cây không phát triển thêm về chiều cao nhưng vẫn xanh tốt. Ở các nghiệm thức D5 cây phát triển rất chậm, số lượng cây rất ít, lá nhỏ xanh có chiều hướng ngã vàng, rễ ít và ngắn, không có chồi. Từ tuần nuôi cấy thứ 5 trở đi cây không phát triển thêm. Ở nghiệm thức D1 cây phát triển tốt, lá cây xanh tốt, số lượng cây cao thấp khác nhau, ít chồi, lá nhiều và to, rễ ít và ngắn, rễ nhiều và ngắn. Ở nghiệm thức D2 cây phát triển tốt nhất, cây cao nhất trong các nghiệm thức, lá cây xanh tốt, nhiều và to, chiều cao cây bằng nhau , nhiều chồi, rễ nhiều và dài. Ở nghiệm thức D3 cây phát triển tốt, số cây ít nhưng lá xanh và to, ít chồi, đốt thân đều, rễ nhiều dài. Ở các nồng độ đậu xanh khác nhau thì hình thái của cây cũng khác nhau, cụ thể: • Ở nghiệm thức D0: không bổ sung đậu xanh thì cây vẫn phát triển bình thường, thân cây mập, lá tương đối nhiều và to, rễ dài. Sau khoảng 5 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu tăng lên, cây tăng trưởng ổn định, lá phát triển to hơn và cong, rễ cây nhiều và dài. • Ở nghiệm thức D1: môi trường bổ sung đậu xanh với nồng độ 3 (g/l) cây phát triển tốt. Cây xanh, lá nhiều hơn ở nghiệm thức D0, rễ nhiều hơn D0 nhưng 64
  74. Đồ án tốt nghiệp ngắn hơn. Tuy trong cùng một môi trường nhưng phát triển về chiều cao không đều nhau. Cây duy trì ổn định trong tuần thứ 5 trở đi. • Ở nghiệm thức D2: khi tăng nồng độ lên 6 (g/l) đậu xanh thì số lượng chồi được tạo ra nhiều hơn, cây phát triển tốt nhất, lá nhiều nhưng hơi cong. Sau 4 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu nhiều, đến tuần thứ 5 số lượng chồi tiếp tục phát triển, rễ dài hơn. Đến tuần thứ 6 và thứ 7 mẫu vẫn tiếp tục tạo thêm chồi, lá cây phát triển lớn hơn, rễ nhiều và phát triển dài. • Ở nghiệm thức D3: nồng độ đậu xanh khi được tăng lên 9 (g/l) cây phát triển tốt, số lượng chồi tạo ra ít, đốt thân cây đều và nhiều lá, lá nhỏ hơi uống cong, rễ cây nhiều và dài. Sau 4 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu nhiều, đến tuần thứ 5 số lượng chồi ở mẫu bắt đầu tăng lên, cây tăng trưởng ổn định, rễ cây phát triển nhiều và dài. Đến tuần thứ 6, thứ 7 mẫu vẫn sinh chồi nhưng chậm lại, cây phát triển xanh tốt, rễ bắt đầu phát triển nhiều hơn. • Ở nghiệm thức D4: khi nồng độ đậu xanh tăng lên 12 (g/l) thì mẫu cấy phát triển chậm lại, cây thấp, số lượng cây và chồi được tạo ra ít hơn, lá ít, to, rễ cây ngắn và ít. Sau khoảng 4 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu rất ít, đến tuần thứ 5 số lượng chồi không thay đổi nhưng lá cây to hơn và xanh hơn. Ở tuần nuôi cấy thứ 6 và thứ 7, cây không phát triển thêm nhưng màu lá vẫn xanh tốt. • Ở nghiệm thức D5: khi nồng độ đậu xanh tăng lên 15 (g/l) thì mẫu cấy phát triển kém, số lượng cây và chồi được tạo ra ít, lá ít và nhỏ, rễ cây phát triển rất chậm. Sau khoảng 4 tuần nuôi cấy nhận thấy cây phát triển rất chậm, rễ cây ngắn và ít, số lượng chồi ở mẫu không phát triển thêm, đến tuần thứ 5 không thấy sự khác biệt rõ rệt. Ở tuần nuôi cấy thứ 6 và thứ 7, cây hầu như không phát triển về chiều cao, số lá, số chồi nhưng phát triển về chiều dài của rễ. Theo Nguyễn Thị Cúc (2014) nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ lên quá trình sinh trưởng và phát triển cây Lan Hài hồng in vitro, khi bổ sung khoai tây ở các nồng độ 10 g/l, 20 g/l. 30 g/l, hầu như không có tác dụng đối với quá trình tạo chồi, tạo lá và gia tăng chiều cao của chồi nhưng làm tăng tỷ lệ sống của mẫu cấy. 65
  75. Đồ án tốt nghiệp Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng môi trường tinh bột nhưng không phải dịch chiết khoai tây, thay vào đó là dùng bột đậu xanh để nuôi cấy in vitro cây Bạc hà. Kết quả cho thấy, khi sử dụng môi trường đậu thì cây bạc hà có khả năng sinh trưởng và phát triển trong môi trường nuôi cấy in vitro. Qua thí nghiệm này, việc sử dụng môi trường có chứa tinh bột là nguồn carbohydrat kết hợp chiếu sáng bằng ánh sáng đèn giúp cây phát triển vượt 30% so với đối chứng. Chúng tôi thấy rằng nồng độ đậu xanh 6 (g/l) thích hợp cho sự nhân nhanh mẫu cấy cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. từ đốt thân với các chỉ tiêu của cây cao nhất. 66
  76. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Khi nuôi cấy đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 0,375 g/l than hoạt tính thích hợp cho sự tăng trưởng, hình thành rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. Khi nuôi cấy đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 50 ml nước dừa thích hợp cho sự tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. Khi nuôi cấy đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 9 g/l đậu đen thích hợp cho sự tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. Khi nuôi cấy đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 6 g/l đậu xanh thích hợp cho sự tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. 4.2. Kiến nghị Do thời gian tiến hành đồ án có hạn, thiết bị và hóa chất còn hạn chế nên chúng tôi chưa thể thực hiện nhiều nghiên cứu sâu hơn, vì vậy chúng tôi có những kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu, khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính, nước dừa đến khả năng nhân nhanh cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. từ các bộ phận khác của cây như mô sẹo, lá, Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ bột từ ngũ cốc lên khả năng sinh trưởng của Bạc hà Á Mentha arvensis L. Nghiên cứu thêm tỷ lệ giữa đậu và agar bổ sung vào môi trường nuôi cấy. 67
  77. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu Tiếng Việt [1]. Vũ Lan Anh (2006), Hoàn thiện quy trình nhân nhanh hoa Lilium topgum bằng phương pháp nuôi cấy lát cắt mỏng vảy củ trong nhân giống in vitro. Báo cáo khoá luận tốt nghiệp. [2]. Tạ Thục Như Anh (2007), Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái của mô lá cây Hoắc hương (Pogostemon cablin (Blaco) Benth) nuôi cấy in vitro. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ, 24, 44 – 49. [3]. Ngô Xuân Bình và Nguyễn Thuý Hà, (2000), Giáo trình công nghệ sinh học (giáo trình bậc đại học). NXB Nông nghiệp - Hà nội. [4]. Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Văn Kết, Dương Tấn Nhật và Nguyễn Thị Kim Lý – Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ lên quá trình sinh trưởng và phát triển cây Lan Hài hồng in vitro – Tạp chí sinh học 2014, 36(1se): 250 -256. [5]. Dương Công Kiên (2006), Nuôi cấy mô. NXB Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. [6]. Trần Văn Minh, (1995), Nuôi cấy mô tế bào thực vật. Giáo trình Đại học, Viện Đại Học mở bán công TP. Hồ Chí Minh. [7]. Dương Tấn Nhựt (2011), Công nghệ sinh học thực vật, tập 1. NXB Nông Nghiệp. [8]. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y Học. [9]. Nguyễn Trung Tín, Nguyễn Phương Vỹ (2008), Khảo sát hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone trong cây Bạc hà (Mentha arvensis L.) bằng các phương pháp khác nhau. Luận văn Kỹ sư Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. [10]. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh và Nguyễn Thị Phương Thảo, 2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp. NXB Nông nghiệp Hà Nội . 68