Khóa luận Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống đậu tương

65 trang thiennha21 14/04/2022 3120

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống đậu tương", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_kha_nang_tai_sinh_in_vitro_cua_mot_so_g.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  ĐỖ THỊ ÁNH TUYẾT Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2015 – 2019 Thái Nguyên, năm 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  ĐỖ THỊ ÁNH TUYẾT Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Lớp : K47 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2015 – 2019 Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Tiến Dũng Thái Nguyên, năm 2019
i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trong thời gian thực tậptốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống đậu tương”. Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thànhđề tài nghiên cứu này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS. Nguyễn Tiến Dũng, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thờigian thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn làchỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hếtlòng động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tậpthời gian có hạn, trình độ và kỹ năng bản thân còn nhiều hạn chế nên đề tài khôngthể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đónggóp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồngnghiệpsức khoẻ, thành công trong cuộc sống. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2019 Sinh viên thực hiện Đỗ Thị Ánh Tuyết
ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đâyBảng 2.2. Tình hình sản xuất đậu tương của các nước đứng đầu thế giới 7 Bảng 2.3. Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam những năm gần đây 9 Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng thời gian của dung dịch NaClO 5% đến khả năng vô trùng hạt đậu tương (sau 5 ngày) 32 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi hạt đậu tương sau 4 ngày 35 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 tới khả năng kéo dài chồi đậu tương sau 4 ngày 38 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA tới khả năng ra rễ tạo cây đậu tương hoàn chỉnh 41
iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu nhân giống đậu tương bằng phương pháp in vitro 29 Hình 4.1. Mẫu đậu tương sau khi khử trùng và nuôi cấy sau 5 ngày trên môi trường MS cơ bản 34 Hình 4.2. Mẫu đậu tương nuôi ở CT 3 sau 4 ngày 37 Hình 4.3. Mẫu đậu tương nuôi cấy trong môi trường kéo dài chồi sau 4 ngày 40
iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BAP : 6-Benzylaminopurine CS : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/c : Đối chứng FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations GA3 : Gibberellic Acid IAA : Indole-3-acetic acid Kinetin : Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashige & Skoog (1962) MT : Môi trường NAA : α-Naphthalene acetic acid
v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 2 DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 1.1.Mục tiêu của đề tài 2 1.1.1.Mục tiêu tổng quát 2 1.1.2.Mục tiêu cụ thể 2 1.2.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 1.2.1.Ý nghĩa khoa học của đề tài 3 1.2.2.Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 4 2.1. Giới thiệu về đậu tương 4 2.1.1. Nguồn gốc 4 2.1.2. Phân loại 4 2.1.3. Giá trị cây đậu tương 4 2.1.4. Đặc tính sinh học của giống đậu tương DT84 và DT22 5 2.2. Tổng quan tình hình sản xuất đậu tương trong nước và trên thế giới 6 2.2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới 6 2.2.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 9 2.3. Khả năng tái sinh in vitro ở cây đậu tương 11 2.3.1. Ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy đến khả năng tái sinh in vitro 11 2.3.2. Ảnh hưởng của môi trường và iđ ều kiện nuôi cấy đến khả năng tái sinh in vitro 12
vi 2.4. Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương 16 2.4.1. Trên thế giới 16 2.4.2. Ở Việt Nam 22 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 26 3.2. Nội dung nghiên cứu 26 3.2.1. Nội dung 1: Xác định ảnh hưởng thời gian khử trùng của dung dịch NaClO 5% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. 26 3.2.2. Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi 26 3.2.3. Nội dung 3: Xác định ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi 26 3.2.4. Nội dung 4: Xác định ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 26 3.3. Phương pháp nghiên cứu 26 3.3.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 26 3.3.2. Phương pháp khử trùng mẫu 26 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi 27 3.3.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 tới khả năng kéo dài chồi 28 3.3.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 28 3.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm 29 3.4.1. Nội dung 1: Xác định ảnh hưởng thời gian của dung dịch NaClO 5% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. 29 3.4.2. Nội dung 2: Xác ịđ nh ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi . 30 3.4.3. Nội dung 3: Xác ịđ nh ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi . 30
vii 3.4.4. Nội dung 4: Xác định ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 31 3.5. Các phương pháp xử lý số liệu 31 Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch NaClO 5% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng 32 4.2. Kết quả nghiên cứu: Ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi 35 4.3. Kết quả nghiên cứu: Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi 38 4.4. Kết quả nghiên cứu: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 40 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 5.1. Kết luận 44 5.2. Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây Đậu Tương (Glycine max(L)Merrill) đã được biết đến và trồng rất lâu đời. Năm 2016 di01iết đến và trồng rất lâu đời.của nồng độ NA triệu ha vớinăng suất bình quân đạt 27,56 tạ/ha. S di01iết đến và trồng rất lâu đời.của . Điều đó khẳng định cây đậu tương là một trong những cây trồng quan trọng trong nền nông nghiệp [16]. Đậu tương là loại cây họ Ðậu (Fabaceae), chứa hàm lượng protein cao, giàu giá dinh dưỡng chính vì vậy là cây thực phẩm có vai trò quan trọng cho conngười và gia súc. Từ hạt đậu tương có thể chế biến được nhiều các sản phẩm khácnhau như: sản xuất dầu thực vật, sản xuất dầu ăn, đậu phụ, tào phớ, sữa đậu tương, là những sản phẩm công nghiệp được chế biến từ đậu tương rất có lợi cho sứckhoẻ con người, góp phần chống suy dinh dưỡng và các bệnh thần kinh, tim mạch. Ngoài việc cung cấp 40-50% lượng protein thì trong hạt đậu tương có chứa hàm lượng lớn lipit cụ thể là 12-24%. Bên cạnh đó, do có khả năng cố định đạm tự do nhờ cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium Japonicum mà đậu tương là cây trồng bảo vệ đất chống xói mòn. Cuối cùng cây đậu tương còn góp phần giải quyết công ăn việclàm, tăng thu nhập cho người nông dân [4]. Nền nông nghiệp nước ta đã phát triển cùng với nền văn minh lúa nước, tất nhiên không vì thế mà cây đậu tương mất đi chỗ đứng của nó. Đậu tương nằm trong những cây trồng quan trọng và việc phát triển đậu tương cũng đã được chú trọng. Tuy nhiên, năng suất của cây đậu tương thường rất thấp bởi đang bị ảnh hưởng của hạn hán và dịch bệnh. Tình trạng thiếu nước ảnh hưởng xấutới sự sinh trưởng và năng suất của cây đậu tương. Bên cạnh đó còn có sự phá hoại của năm loạidịch bệnh phổ biến tấn công đậu tương, đó là bệnh: nấm, thối thân, hội chứng đột tử,tàn lụi vi khuẩn, đốm lá. Các loại bệnh hại này và hạn hán đã gây tổn thấtkhông nhỏ đối với năng suất đậu tương. Nếu sử dụng thuốc trừ sâu hoá học thì chi phí sảnxuất cao và gây ảnh hưởng đến môi trường.
2 Rõ ràng, đậu tương là cây thực phẩm thiết yếu, nhưng năng suấtcủacác giống đậu tương hiện nay lại đang bị ảnh hưởng bởi hạn hán và sâu bệnh hại. Chính vì lẽ đó cần có biện pháp cải tạo các giống hiện nay nhằm đem lại hiệu quảcao trong nông nghiệp. Với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học, đặc biệt trong lĩnhvực công nghệ sinh học thì có lẽ phương pháp chuyển gene là lựa chọn tốiưu và phù hợp với tình hình hiện nay. Có nhiều phương pháp chuyển gene vào thực vật, trong đó phương pháp chuyển gene thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mô in vitro nhằm tạo cây trồng biến đổi gene đem lại tỷ lệ thành công cao nhất. Tuy nhiên hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó khả năng tái sinhcó vai trò quyết định [2]. Đã có nhiều nghiên cứu về việc tái sinh đậu tương thông qua các cơquan như: lá mầm, mắt lá thật đầu tiên [28], lá thật đầu tiên của cây non, phôi soma. Các nghiên cứu cho rằng khả năng tái sinh ở đậu tương phụ thuộc rất nhiều vào kiểu gen (giống). Chính vì thế cần phải có các nghiên cứu cơ bản về khả năng tái sinhcủa các giống đậu tương trước khi tiến hành các nghiên cứu về chuyển gen [15]. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống đậu tương” phục vụ nghiên cứu chuyển gen. 1.1. Mục tiêu của đề tài 1.1.1. Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu khả năng tái sinh ở đậu tương DT84, DT22 bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để phục vụ các nghiên cứu về chuyển gene, nhân giống, bảo tồn 1.1.2. Mục tiêu cụ thể - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh in vitro của cây đậu tương DT84 và DT22 - Nghiên cứu khả năng tái sinh của một số giống đậu tương DT84 và DT22 trên môi trường nuôi cấy
3 1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn. - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, thu nhận được nhiều kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm ệvi c khoa học phục vụ cho công tác sau này. 1.2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Tạo cây đậu tương nuôi cấy mô thành công sẽ ứng dụng trong việc nhân giống đậu tương sạch bệnh và tạo tiền đề để phát triển cây đậu tương biến đổi gen sau này, góp phần vào sự phát triển của nền nông nghiệp bền vững.
4 Phần 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1. Giới thiệu về đậu tương 2.1.1. Nguồn gốc Đậu tương là một loài cây trồng mà loài người đã phát hiện và sử dụng từ lâu, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng được các nhà khoa học quan tâm và sớm được xác minh. Những bằng chứng lịch sử đều công nhận rằng đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cây đậu tương được thuần hóa từ Trung Quốc qua nhiều triều đại tiền phong kiến và đưa vào trồng trọt, khảo sát có thể trong triều đại Shang (năm 1700-1100 B.C) trước công nguyên [10]. Theo một số tài liệu, ở Việt Nam cây đậu tương cũng đã xuất hiện từ thời các vua Hùng. Hiện nay, trong công nghiệp cây đậu tương chiếm một vai trò quan trọng cơ cấu cây nông nghiệp phục vụ cho công nghiệp chế biến [7]. 2.1.2. Phân loại Đậu tương hay đỗ tương, đậu tương có tên khoa học là Glycine max(L.) Merr theo khóa phân loại của (Ottawa và cs, 1996) căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể, nó thuộc: Bộ đậu: Fabales Họ đậu: Fabaceae Phân họ: Leguminosae Chi: Glycine Đậu tương trồng có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40 là loại cây trồng mang lại giá trị kinh tế cũng như giá trị dinh dưỡng cao [30]. 2.1.3. Giá trị cây đậu tương Đậu tương (Glycine max (L) Merr.) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu, cây cải tạo đất tốt. Bởi vậy cây đậu tương được đánh giá là có giá trị toàn diện [22].
5 Giá trị về mặt thực phẩm Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng từ 35,5-40%, lipit từ 15-20%, hydrat cacbon từ 15-16% và nhiều loại sinh tố và muối khoáng quan trọng cho sự sống. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong số các protein có nguồn gốc thực vật. Hiện nay, các sản phẩm làm từ đậu tương rất phong phú có cả thực phẩm được chế biến bằng phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới dạng tươi, khô và lên men như: làm giá, đậu phụ, tương, xì dầu đến các sản phẩm cao cấp khác như sửa đậu lành, bánh kẹo [16] Giá trị về mặt công nghiệp Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, nhưng chủ yếu đậu tương được dùng để ép dầu. Từ dầu đậu tương người ta có thể tạo ra hàng tră sản phẩm công nghiệp khác như: làm nền, xà phòng, ni lông [26] Giá trị về mặt nông nghiệp Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc. Toàn cây đậu tương (thân, lá, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc [10]. Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt, 1 ha trồng đậu tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60 kg N. Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón phân hóa học [1]. 2.1.4. Đặc tính sinh học của giống đậu tương DT84 và DT22 Giống DT84: Nguồn gốc: Giống đậu tương DT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp chọn tạo bằng phương pháp xử lí đột biến dòng lai 3-33 giữa giống DT80 x ĐH (D9T) bằng tác nhân phóng xạ gama - Co60 [6].
6 Đặc điểm chính: Giống đậu tương DT84 được sản xuất trên diện rộng, có tiềm năng năng suất cao, có khả năng thích ứng rộng, đang được áp dụng trồng cơ cấu 3 vụ/ năm (xuân, hè, thu đông). DT84 sinh trưởng hữu hạn, cây cao trung bình 45 - 50cm, cứng cây, phân cành vừa phải, bộ lá gọn phân bố đều trên các tầng, hoa tím, hạt to vàng sáng. Rốn hạt màu nâu nhạt, tỉ lệ quả chắc 2-3 hạt cao trong các mùa vụ. Khối lượng 1000 hạt 150 - 160 gam. Tiềm năng năng suất 15 - 30 tạ/ha, năng suất trung bình 13 - 18 tạ/ha [24]. Giống DT22: - Nguồn gốc: Giống DT22 do trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ dòng đột biến của hạt lai (DT 95 x DT 12) [5]. - Đặc điểm chính: Thời gian sinh trưởng trung bình của giống DT22 là 85 - 90 ngày. Giống đậu tương DT22 có hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chín có màu nâu. Khối lượng 1000 hạt155-160 g. Giống DT22 kháng bệnh phấn trắng. Năng suất 18- 27 tạ/ha, tuỳ thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh [20]. 2.2. Tổng quan tình hình sản xuất đậu tương trong nước và trên thế giới 2.2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới Đậu tương là ộm t trong những cây trồng có vị trí quan trọng trong hệ thống nông nghiệp ở nhiều quốc gia trên thế giới và lâu đời nhất của nhân loại, là cây trồng có vị trí thứ tư trong các cây làm lương thực thực phẩm sau lúa mì, lúa nước và ngô. Vì thế, sản xuất đậu tương trên thế giới tăng nhanh về cả diện tích, năng suất và sản lượng. Số liệu thống kê về diện tích, năng suất và sản lượng trên thế giới được thể hiện ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây Diện tích Năng suất Sản lượng Năm (triệu ha) (tạ/ha) (triệu tấn) 2011 103,81 25,19 261,59 2012 105,35 22,89 141,19 2013 111,02 25,00 277,54 2014 117,64 26,04 306,37 2015 120,79 26,76 323,20 2016 121,53 27,56 334,89 (Nguồn: FAOSTART,2018).
7 Qua số liệu bảng 2.1 cho thấy: Về diện tích: Từ năm 2011 – 2016 diện tích trồng đậu tương trên thế giới không ngừng tăng lên và dao động trong khoảng từ 103,81 – 121,53 (triệu ha). Trong đó diện tích trồng đậu tương đạt cao nhất là năm 2016 với 121,53 (triệu ha), tăng khoảng 17 (triệu ha) so với năm 2011 [29]. Về năng suất: Năng suất đậu tương trên thế giới những năm gần đây tương đối ổn định, dao động từ 25,19 – 27,56 (tạ/ha). Năng suất đạt thấp nhất vào năm 2012 với 22,89 (tạ/ha) và năng suất cao nhất vào năm 2016 với 27,56 (tạ/ha). Về sản lượng: Do hàng năm diện tích trồng liên tục tăng lên nên sản lượng đậu tương trên thế giới cũng tăng lên dao động từ 141,19 – 334,89 (triệu tấn), năm 2012 đạt thấp nhất 141,19 (triệu tấn). Năm 2012 sản lượng giảm khoảng một nửa so với 2011, đến năm 2013 thì sản lượng phục hồi lại gần gấp đôi. Trong vòng 5 năm từ 2012 – 2016 sản lượng đạu tương tăng 193 (triệu tấn). Năm 2016 sản lượng đậu tương đạt lớn nhất 334,89 (triệu tấn). Sản lượng tăng như vậy là do diện tích trồng trong những năm gần đây tăng lên và đã được sử dụng các tiến bộ khoa học tiên tiến vào sản xuất Bảng 2.2. Tình hình sản xuất đậu tương của các nước đứng đầu thế giới Năm 2015 Năm 2016 Diện Sản Diện Sản Năng Năng Quốc gia tích lượng tích lượng suất suất (triệu (triệu (triệu (triệu (tạ/ha) (tạ/ha) ha) tấn) ha) tấn) Mỹ 106,95 32,29 33,12 117,21 35,00 33,48 Brazil 97,46 30,29 32,18 96,30 29,05 33,15 Argentina 61,40 31,76 19,33 58,80 30,15 19,50 TrungQuốc 11,79 18,11 6,51 11,97 18,02 6,60 (Nguồn: FAOSTAT, 2018) Theo dự đoán trong thời gian tới tốc độ phát triển đậu tương trên thế giới sẽ chậm hơn so với các năm trước. Kết quả nghiên cứu của trên 200 chuyên gia ở các
8 ngành khác nhau thuộc công ty Elanco và hiệp hội đậu tương Mỹ cho thấy rằng khoảng hơn 20 năm nữa trung bình hàng năm nhu cầu về sản lượng đậu tương tăng 4%/năm. Trong tương lai với sự trợ giúp của công nghệ sinh học, di truyền phân tử, nghiên cứu về cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng sẽ thu được nhiều kết quả tốt. Công nghệ sinh học là một trong những yếu tố quan trọng để cải tiến chất lượng hạt đậu tương và khả năng chống chịu của cây [29]. Đậu tương có khả năng thích ứng rộng nên nó đã được trồng ở khắp năm châu lục nhưng tập trung chủ yếu ở 4 nước: Mỹ, Brazil, Argentina và Trung Quốc. Sản lượng đậu tương của 4 nước này chiếm 90 – 95% sản lượng đạu tương của toang thế giới. Đặc biệt Mỹ là quốc gia sản xuất đậu tương lớn nhất thế giới. Hiện nay Mỹ là quốc gia đứng đầu về sản xuất đậu tương với diện tích 33,12 triệu ha đạt 106,95 triệu tấn năm 2015 lên 33,48 triệu ha với sản lượng 117,21 triệu tấn năm 2016. Đồng thời Mỹ cũng là quốc gia xuất khẩu đậu tương lớn nhất, phần lớn sản lượng đậu tương của Mỹ hoặc để nuôi gia súc, hoặc để xuất khẩu, mặc dù lượng đậu tương tiêu thụ ở người dân Mỹ đang tăng lên. Đậu tương đối với Mỹ được coi là mặt hàng chiến lược trong xuất khẩu và thu ngoại tệ. Dầu đậu tương chiếm tới 80% lượng dầu ăn được tiêu thụ ở Mỹ. Nước sản xuất lớn thứ 2 thế giới là Brazil, trong 2 năm 2015 và năm 2016 diện tích trồng đậu tương tăng lên từ 32,18 triệu ha lên 33,15 triệu ha năm 2016 nhưng năng suất và sản lượng lại giảm xuống. Hiện nay, Brazil đang tiếp tục đẩy mạnh công tác chọn, tạo giống mới chống chịu sâu bệnh, giống chuyển nạp gen, ứng dụng thành tựu khoa học kỹ thuật của thế giới và nghiên cứu kết hợp giữa trong và ngoài nước, phát triển mạnh lúa mỳ và ngô luân canh với đậu tương. Quốc gia đứng thứ 3 về sản xuất đậu tương là Argentina. Tại quốc gia này đậu tương thường được trồng luân canh với lúa mì. Chính phủ nước này đã có chính sách hỗ trợ cho việc phát triển cây đậu tương do đó mà cây đậu tương phát triển khá mạnh đưa nước này lên xếp thứ 3 về sản xuất đậu tương trên thế giới. Trung Quốc là nước đứng thứ 4 về diện tích trồng cây đậu tương. Ở Trung Quốc; diện tích, năng suất, sản lượng đậu tương trong năm 2015 và năm 2016 đang
9 tăng dần lên. Tuy sản xuất đậu tương của Trung Quốc còn đứng sau Mỹ, Brazil và Argentina nhưng đâu vẫn là nước có diện tích, năng suất và sản lượng đậu tương lớn nhất châu Á [29]. 2.2.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam Ở Việt Nam, cây đậu tương là cây thực phẩm có truyền thống lâu đời, quan trọng, cung cấp protein chủ yêu cho con người, là thành phần không thể thiếu của bữa ăn truyền thống và hiện đại. Trước những năm 80 của thếkỷ trước, năng suất đậu tương của Việt Nam còn thấp do bộ giống cũ và kỹ thuật sản xuất canh tác lạchậu [31]. Nhìn chung, diện tích đậu tương Việt Nam không ổn định, sản xuất đậu tương nội địa mới chỉ đủ cung cấp cho khoảng 8–10 % nhu cầu, đến năm 2017, diện tích trồng đậu tương trên cả nước đạt khoảng 100 ngàn ha, năng suất khoảng 1,57 tấn/ha, sản lượng đạt 157 ngàn tấn. Dự kiến năm 2018 diện tích đậu tương cả nước đạt 105 ngàn ha, năng suất trung bình 1,6 tấn/ha, sản lượng đạt 168 ngàn tấn (Bảng 2.3) Bảng 2.3. Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam những năm gần đây Diện tích Sản lượng Năng suất Năm (ngàn ha) (ngàn tấn) (tấn/ha) 2012 120,8 175,3 1,45 2013 180 270 1,5 2014 200 300 1,5 2015 100,8 146,4 1,45 2016 94 147,5 1,57 2017 100 157 1,57 (Nguồn:Tổng cục Thống kê (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) Theo Bheo cục Thống kê (GSO), Bộ Nông nghiệ (2006), lượng đậu tương nhập khẩu hàng năm đã vào khoảng 2,8 triệu tấn quy hạt (0,2 triệu tấn hạt, 2,2triệu tấn khô dầu với giá 400–500 USD/tấn với kim ngạch 1,5 tỷ USD, tăng 60–70% so với năm trước), dự kiến tới năm 2015-2020, Việt Nam thiếu hụt tới 3,5–4,0 triệu
10 tấn/năm trở thành một nước nhập khẩu đậu tương lớn với kim ngạch 2,0–2,5 USD/năm, hơn cả kim ngạch xuất khẩu gạo hiện nay [3]. Với lợi thế thị trường tại chỗ giảm được cước phí vận chuyển, lưuthông, chất lượng hạt tươi mới, thích hợp chế biến thức ăn cho người, đậutương Việt Nam sẽ cạnh tranh được với đậu tương ngoại nhập, cạnh tranh với các cây trồng khác về mặt thu nhập như lúa, ngô. Để phát triển cây đậu tương, vấn đề chủ yếu là phải phấn đấu giảm giá thành trên cơ sở tăng năng suất từ 15 tạ/ha hiện nay lên ít nhất trên 18 tạ/ha, trên cơ sở giảm được giá thành, tăng diện tích để tăng sức cạnh tranh cho sản phẩmđậutương của Việt Nam, tiến tới giảm nhập khẩu, cơ cấu chủ yếu làđậutương trồng trên đất màu luân canh với 1 triệu ha ngô, đậu tương đất ướt luân canh với lúa trên 3,7 triệu ha đất lúa của các vùng sinh thái hiện nay. Việt Nam có điều kiện diện tích đểphát triển cây đậu tương, song cần có giống chịu hạn, năng suất cao, ổn định, chống chịu các điều kiện bất lợi khác tốt. Mặc dù sản xuất đậu tương ở trong nước không bị cạnh tranh, kế hoạch của chính phủ Việt Nam ưu tiên phát triển sản xuất cây có dầu với mục tiêu đưadiện tích lên 350.000 ha và sản lượng đạt 700.000 tấn vào năm 2020. Kế hoạch nàytập trung phát triển ở đồng bằng sông Hồng, vùng đồi núiở phía Bắc và Tây Nguyên. Tuy nhiên kế hoạch này đang gặp khó khăn do chi phí đầu tư cao, năng suất thấp và tốc độ mở rộng diện tích chậm. Theo các nhà máy chếbiếnđậu tương, giá đậu tương trong nước 16.000-17.000 đồng/kg (0,77-0,82 USD/kg), cao hơn so với đậu tương nhập khẩu, chỉ từ 14,600- 15,000 đồng/kg ($0.70-$0.71). Đây là trở ngại chính của phát triển sản xuất đậutương trong tương lai [29]. Hi29ng tương laitừ 14,600- 15,00ười29đang ban hành quy địng ban hàđánh giá và xét duyệt các giống cây trồng chuyển gene và sử dụng chúng trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Bộ cũng đang xây dựng quy trình chứng nhận an toàn sinh học cho các sản phẩm chuyển gene. Quy trình này sẽ là khung pháp lý cơ bản để hợp thức hóa các giống cây trồng chuyển gene đã quakhảo nghiệm của Btrình này sẽ là khung như bông vải, bắp, đậu tương. Bộ Nông nghiệp và PTNT cũng xây
11 dựng các thông tư hướng dẫn xét duyệt các sản phẩm chuyển gene (Circulars onthe approval of GMO) được phép sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Sản xuất đậu tương Việt Nam tiếp tục không đáp ứng được nhu cầucủa ngành công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi (TACN) và thức ăn thủy sản, công nghiệp ép dầu. Mặc dù không bị cạnh tranh bởi điều kiện tự nhiên, kế hoạch của chính phủ Việt Nam dành ưu tiên phát triển trồng đậu tương lên đến 350.000 ha với sản lượng 700.000 tấn vào năm 2020. Nhưng kế hoạch này đang gặp khó khăndo chi phí sản xuất cao, năng suất thấp và quỹ đất nông nghiệp không còn [29]. 2.3. Khả năng tái sinh in vitro ở cây đậu tương 2.3.1. Ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy đến khả năng tái sinh in vitro Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô– tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơquan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá ), các cấu trúc củaphôi(lá mầm, trụ lá mầm ), các cơ quan dự trữ (củ, thân, rễ ) [11]. Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau, trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy,vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý vàtuổicủa mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu,mụcđích và khả năng nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năngtiêu diệt vi sinh vật. Hoá chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu quảvô trùng tuỳ thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinhvật của hoá chất. Một số hoá chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫulà: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaClO-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2- thuỷ ngân clorua, chất kháng sinh(gentamicin, ampixilin ) [18].
12 2.3.2. Ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy đến khả năng tái sinh in vitro 2.3.2.1. Điều kiện nuôi cấy - Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô– tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng gồm buồng cấy vôtrùng,các dụng cụ cấy vô trùng và môi trường cấy vô trùng nhằm đảm bảo mẫu cấy sẽ khôngbị nhiễm vi sinh vật. Để tạo điều kiện vô trùng, buồng cấy phải dùng đèn tửngoại chiếu trong 30 phút sau đó được lau sạch bằng cồn 90°,dụng cụ và môi trường nuôi cấy thường được khử trùng ở 121°C trong 25-30 phút [21]. - Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn địnhvề ánh sáng và nhiệt độ. 2.3.2.2. Môi trường dinh dưỡng Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận, các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấynhư duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [23]. Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồmcác thành phần chính sau: a. Nguồn Cacbon Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không cón khả năng tự dưỡng do không tiến hành quang hợp đầy đủ. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôicấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồncacbon cung cấp cho môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với hàm lượng từ 20-30 g/l. Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như fructose, rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose, những loại đường này chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt. b. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng có trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành phầncơ bản để tổng hợp chất hữu cơ [2]. Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quan
13 trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm thấu vàđiện thế màng. - Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S[10]. - + + Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3 hoặc NH4 , hầu hết các loại thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sản phẩm hữucơ. + Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường. + Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O + Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O + Magie: Sử dụng chủ yếu là MgSO4 + Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4 - Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni các nguyên tố vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bàocủa mô, tế bào nuôi cấy. c. Vitamin Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không đủvề lượng nên cần bổ sung, nhất là nhóm vitamin B [25]. - Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid. - Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất. - Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp. - Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon. d. Các chất hữu cơ tự nhiên - Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin.
14 - Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid. - Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B [21]. - Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, khoai tây, nước épchuối xanh e. Các thành phần khác - Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữucơ như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh dưỡng cho tế bào, mô nuôi cấy. - Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chấtthứ cấp gây ức chế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxyhoá khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascorbic. f. pH của môi trường Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhậnchất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều chỉnhtrong khoảng từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm domẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ. g. Các chất điều hoà sinh trưởng Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật. Hiệuquả của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hoà sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy. Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sửdụng. - Nhóm Auxin: Được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch, Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này.Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn
15 hoa. Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật,tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất. Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh(sựsinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc hình thành rễbên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì– nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì. Ngoài ra, auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụnglá [11]. Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhântạo), IAA (các auxin tự nhiên). Hoạt tính của các chất này được xếp theothứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA, 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân huỷ trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy môi. NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuynhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus. - Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, câylá kim. Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn. Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh. Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất. Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịuảnh hưởng của cytokinin. Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá [14]. Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì kinetin và BAP được sử dụng phổ biến vì hoạt tính mạnh: kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea [14]. - Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nấm bởi cácnhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Giberellin được tổng hợp trong các
16 mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Giberellin cótácdụng chính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây.Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi nuôicấy. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [14]. 2.4. Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương 2.4.1. Trên thế giới Công tác tuyển chọn giống đậu tương trên thế giới hiện nay được tổ chức bởi các tổ chức nghiên cứu quốc tế như INTSOY (Chương trình Nghiên cứu Đậu tương Quốc tế), Trung Tâm nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ASIAR), Viện Quốc tế Nông nghiệp nhiệt đới (IITA), Mạng lưới Đậu đỗ và NgũcốcChâuÁ (CLAN) [3]. Với sự phát triển mạnh mẽ của di truyền học và công nghệsinhhọc,các hướng nghiên cứu và thành tựu nổi bật cải biến giống đậu tương chống chịu trên thế giới hiện nay là: - Hướng nghiên cứu chính vẫn tập trung về giống, kỹ thuật canh tác, năng suất và chất lượng, khả năng chống chịu các điều kiện bất thuận như sâu bệnh,ngập úng, hạn hán, tình trạng chua mặn và đất nghèo dinh dưỡng. - Đậu tương cao sản: Năng suất đã đạt tới 61 tạ/ha, thời gian sinhtrưởng 120–150 ngày, Việt Nam đã đạt 40 –50 tạ/ha (85–100 ngày). Theo báo cáo của ISAAA, diện tích đậu tương chuyển gen Glyphosate chịu thuốc diệt cỏ hiện chiếm 62% (54 triệu ha trong tổng số 87,2 triệu ha diện tích cây chuyển gen của thế giới và chiếm 30% diện tích đậu tương thế giới) tập trung ở các nước: Mỹ, Achentina, Braxin, Paragoay, Canada, Urugoay, Rumani, Nam Phivà Mexico. Đây là một bước đột phá trong công tác cải tiến giống cây trồng bằng công nghệ sinh học đem lại lợi nhuận 14,33 tỷ USD trong 10 năm (1996–2005). Năm 2006, trạm Thử nghiệm Nông Nghiệp thuộc Đại học Bắc Dakota (NDSU) đã phát triển giống đậu tương chuyển gen “G7008RR” kháng thuốc trừ cỏ Roundup năng suất 6 tấn/ha. Đang nghiên cứu đưa vào sản xuất giống Đậu tương có tính chịu hạn, chịu sâu [27].
17 Chương trình nghiên cứu nông nghiệp toàn Ấn Độ (1960–1972). Lấy hệ số thâm canh tăng vụ chu kỳ một năm làm hướng phát triển sản xuất nông nghiệp đã chỉ rõ: hệ canh tác ưu tiên cho cây lương thực chu kỳ 1 năm 2 vụ lúa (lúa nước- lúa nước hoặc lúa nước - lúa mì). Khi đưa thêm một vụ đậu đỗ đã đáp ứng được bamục tiêu: Khai thác tối đa tiềm năng đất đai, ảnh hưởng tích cực đến độ phì đất và tăng thu nhập cho người nông dân. Như vậy họ đã xác định được việc tăng 1 vụ đậuđỗ không chỉ làm tăng hiệu quả kinh tế mà còn làm cho đất đai màu mỡhơn [8]. Trong tình hình biến đổi khí hậu toàn cầu như hiện nay, khô hạn gâyảnh hưởng bất lợi đến sự sinh trưởng và năng suất cây trồng. Trong các điều kiện hạn, cây trồng thường có những phản ứng sinh lý chung, phức tạp để thích nghi vàtồn tại. Thực vật có cơ chế điều tiết chống chịu sự phân giải nước trong các cơquancó chức năng quang hợp. Riêng với các cây đậu đỗ trong đó có cây đậu tương, một đặc tính bất lợi khi gặp khô hạn là khí khổng không đóng kín hoàn toàn, làm trầmtrọng sự thiếu nước của cây. Để thích ứng, loài cây này dựa vào một loại protein gọilà Betta được cảm ứng tiết ra khi cây gặp hạn. Bộ Nông nghiệp Mỹ, tháng 6/2004 đã thiết lập một dự án nghiên cứulàm tăng vị trí cạnh tranh của đậu tương Mỹ trên thị trường thế giới dựa vào đa dạng di truyền và tạo giống (Dự án nghiên cứu: Tăng cường vị thế cạnh tranh về đậutương trên thị trường toàn cầu thông qua sự đa dạng di truyền và nhân giống cây trồng– Increasing the competitive position of us soybeans in global markets through genetic diversity and plant breeding). Trong dự án này, chọn tạo các dòng giống đậu tương có khả năng chịu hạn là một trong những mục tiêu chính. Dự án đã thành lập đội ngũ nghiên cứu tính chịu hạn gồm 3 lĩnh vực nghiên cứu chính: Sinh lýhọc – tìm hiểu và đánh giá khả năng chịu hạn; Chọn giống- thực hiện các phép lai di truyền và thử nghiệm đồng ruộng; Di truyền phân tử - sử dụng chỉ thị ADN để xác định vị trí lập bản đồ các gen chịu hạn. Từ một tập đoàn đậu tương trong nước, cùng với những giống đậu tương nhập nội, các nhà nghiên cứu đã chọn ra được mộtsố giống có khả năng chống chịu tốt với điềukiện khô hạn, bản đồ di truyền ADN của
18 một số gen liên quan đến tính chống hạn đã được thiết lập và đã chuyển côngnghệ phục vụ cho mục đích thương mại [13] Tại Mỹ, nước sản xuất đậu tương lớn nhất thế giới, các nghiên cứu cơ bản, các hướng chiến lược chọn tạo, cải thiện giống đậu tương rất được quan tâm. Ngân hàng dữ liệu đã được thành lập, hộp tracứu cho các nhà chọn giống đậu tương, đây là các kết quả nghiên cứu liên kết giữa các nhà nghiên cứu ditruyền và sinh học phân tử đậu tương dùng để tra cứu, cập nhật, liên kết nghiên cứu cơ bảnphục vụ chọn giống đậu tương: (SoyBase and the Soybean Breeder's Toolbox) đang thực hiện Chương trình SOYBEAN GENOMICS, đồng thời đưa ra Chiến lược chọn giống đậu tương trong những năm tới, hy vọng sẽ có nhiều kết quả nghiên cứu ứng dụng có tính chất đột phá về cây đậu tương như được cải thiện rõ rệt về năng suất, tính chống chịu và chất lượng.  Phát triển giống đậu tương kháng bệnh rỉ Nhà di truyền học của Đại học Illinois, Ram Singh, đã tìm cách lai giống đậu tương phổ biến, Dwight (Glycine max) với một loại cây lâu năm hoang dã mọc như cỏ dại ở Australia, để lần đầu tiên có được những cây đậu tương thụ phấn với khả năng kháng các bệnh gỉ sắt, u nang tuyến trùng và các mầm bệnhkhác [9]. Theo Singh, có 26 loài cây hoang dại lâu năm Glycine mọc ở Australia. Loài Glycine tomentella, nhận được quan tâm đặc biệt vì nó có gen kháng bệnh gỉ sắtvà u nang tuyến trùng. Những nỗ lực trước đó để lai nó với đậu đậu tương chỉ sinh ra giống đậu bất dục. Singh tiếp tục thử nghiệm và cuối cùng phát triển phương pháp xử lý nội tiết tố làm gián đoạn quá trình đó, làm cho các hạt giống lai bịloạibỏ. Nghiên cứu của Singh đã mang lại các giống cây có khả năng chống bệnh gỉ, u nang tuyến trùng hoặc thối rễ Phytophthora.  Đậu tương có chất dị ứng thấp Các nhà khoa học của Đại học Arizona là Monica Schmidt và Eliot Herman và Theodore Hymowitz của Đại học Illinois đã tạo ra một giống đậutương mới với mức giảm đáng kể của ba protein chính gây ra dị ứng và các hiệu ứng kháng dinh
19 dưỡng. Herman và các đồng nghiệp của mình ở Bộ Nông nghiệp Mỹ đã xácđịnh vào năm 2003 rằng P34 là chất gây dị ứng chủ yếu ở đậu tương [19]. Nhóm nghiên cứu đã kiểm tra 16.000 giống đậu tương khác nhau và họ đã tìm thấy một giống gần như không có chất gây dị ứng P34. Nhóm này đã kếthợp giống thiếu P34 với hai giống trước đây được xác định bởi Hymowitz vốnthiếu agglutinin và các chất ức chế trypsin, protein, chịutrách nhiệm về các hiệu ứng kháng dinh dưỡng của đậu tương ở gia súc và con người. Sau gần một thậpkỷ, nhóm nghiên cứu đã tạo ra một giống đậu gần như không có P34, trypsin inhibitor protein và hoàn toàn thiếu agglutinin. Họ gọi giống đậu tương mới là "Triple Null".  Đậu tương hiệu quả hơn trong việc tạo nốt sần và cố định đạm Nhà thực vật học Senthil Subramanian của South Dakota State University (SDSU) đang dẫn đầu một nghiên cứu mới để xác định các cơ chế thực vật chỉhuy và phối hợp sự hình thành các nốt sần đậu tương [19]. Với kiến thức này, Subramanian hy vọng sẽ phát triển các giống đậutương có hiệu quả hơn trong việc tạo ra các nốt sần và cố định nitơ bằng cách làm chủmột cơ chế phân tử điều chỉnh các chức năng này. Subramanian giải thích: Thực vật không thể sử dụng nitơ trong khí quyển mặc dù nó có rất nhiều. Cây họ đậu như cây đậutương, có khả năng hình thành các mối quan hệ cùng có lợi với vikhuẩn Rhizobium trong đất để cố định nitơ. Rhizobium đi vào các tế bào gốc của cây non vàgây nên sự hình thành nốt sần để chứa vi khuẩn. Trong các nốt sần, có hai khu vực riêng biệt - một khu vực cố định nitơ và khu vực khác đã vận chuyển nó đến cho cây - được hình thành từ cùng các tế bào gốc từ trước đó. Subramanian cho rằng sự biểu hiện củacác gen cụ thể trong một tế bào gốc cụ thể xác định khu vực trong đó nó sẽ hoạt động,do đó ông xác định những micro-RNA điều khiển sự biểu hiện gen để đạt được sự khác biệt này [21].
20  Đậu tương có hệ thống bảo vệ chống lại tuyến trùng nang (Cyst Nematodes) Những nghiên cứu trước đây trên cây Arabidopsis thaliana đã cho thấy rằng salicylic acid (SA) là hoocmon có chức năng kích hoạt hệ thống tự vệ của thực vật chống lại các yếu tố gây bệnh có tính chất ký sinh trên tế bào sống và kýsinhtrên cả tế bào sống và tế bào đã hoại tử cũng như hạn chế được sự sinh sản củatuyến trùng ký sinh cây [30]. Mặt khác, jasmonic acid (JA) rất cần thiết cho hệ thống tự bảo vệ của cây chống lại yếu tố gây bệnh có tính chất ký sinh trên tế bào hoại tử. Kiến thứcnàycó từ những nghiên cứu trên cây Arabidopsis được ứng dụng vào cây đậutương. Một số gen của Arabidopsis mã hóa cáchợp phần của sinh tổng hợp SA và JA và truyền tín hiệu tạo ra tính kháng đối với tuyến trùng ungnang(SCN: Heterodera glycines) đã được thử nghiệm. Có 3 genArabidoposis được biểu hiện quá mức trong rễ đậu tương chuyển gen. Điều ấy làm giảm đáng kể sốlượng các cysts hình thành bởi tuyến trùng SCN đến con số 50% so với đối chứng. Ba gennày là AtNPR1, AtTGA2 và AtPR-5. Ba gen khác của Arabidopsis giảm số lượng của SCN cysts ít nhất 40%, đó là AtACBP3, AtACD2 và AtCM-3. Trong khi đó, sự biểu hiện quá mức của gen AtDND1 gia tăng mạnh sự nhiễm tuyến trùng SCN. Sự hiểu biết về hệ thống tự vệ của cây chống tác nhân gây bệnhh trongcác nghiên cứu trên cây Arabidopsis có thể được chuyển vào cây đậutương thông qua sự biểu hiện quá mức những gen ấy. Điều đó thểhiện sự tương thích về chức năng của các gen của đậu tương và có thể sử dụng để tạo ra tính kháng tuyến trùng.  Các nhà nghiêu cứu của USDA phát triển dụng cụ mới để xác định gen cơ bản của đậu tương Các nhà nghiên cứu từ Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA) đã phát triển một dụng cụ mới để tìm kiếm các gen trong cây đậutương làm cho cây có năng suất cao hơn và có khả năng chống lại sâu bệnh tốt hơn [17]. Dụng cụ được phát triển bởi các nhà khoa học Perry Cregan, Qijian Song và Charles Quigley của Cục nghiên cứu nông nghiệp (ARS), cho phép các nhà khoa
21 học thu thập thông tin di truyền trong ba ngày, một quá trình mà trước đây phải mất nhiều tuần mới thực hiện được. Có tên gọi là SoySNP50K iSelect SNP BeadChip, dụng cụ gồm một chip thủy tinh dài khoảng 3 inch với một bềmặt đánh dấu có chứa hàng ngàn mẫu ADN. Các nhà nghiên cứu sử dụng chip để lấy thông tincủa96 giống đậu tương hoang dã và 96 giống đậu tương đã canh tác và xác định các khu vực của hệ gen có vai trò quan trọng trong quá trình thuần hóa loại câynày.  Đậu tương kháng côn trùng mới Dow AgroSciences đã phát triển đậu tương kháng sâu bệnh mới với hai protein Bt để tối đa hóa việc kiểm soát sâu bướm có hại. Đây là giống đậu tương đầu tiên với hai protein Bt đã được đệ trình để xin phê duyệt [32]. Tính trạng mới đã được trình lên cơ quan có thẩm quyền ở các nước trồng đậu chính như là một phần của quá trình cấp phép toàn cầu. Ban đầu giống đậunày có mục tiêu được thương mại hóa ở Nam Mỹ [18].  Đậu tương kháng Phytophthora Các nhà nghiên cứu từ Đại học Purdue do Jianxin Ma và Teresa Hughes đã xác định được hai gen trong hệ gen của đậu tương có tính kháng cao chống lại mầm bệnh gây ra rỉ thân và thối rễ Phytophthora. Theo Ma, tính kháng Phytophthora sojae tồn tại tự nhiên trong tế bào mầm đậutương, nhưng phần lớn các gen kháng trước đã mất khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh. Hai gen mới được xácđịnh tỏ ra mạnh hơn các gen trước đó. Nhóm nghiên cứu đã có được phát hiện này trong khi tìm kiếm tính kháng bênh rỉ sắt đậu tương châu Á. Hughes nói: "Các địa điểm thử nghiệm của chúng tôi có áp lực cao của bệnh Phytophthora và chúng tôi thấy rằng các gen này đãchống lại rất tốt căn bệnh đó. Đó là manh mối đầu tiên cho thấy chúng có thể cósứcđề kháng tốt Phytophthora sojae". Phát hiện này có thể dẫn đến việcphát triển giống đậu tương trong tương lai với sức đề kháng tốt hơn với mầm bệnh Phytophthora [8]
22 2.4.2. Ở Việt Nam Công tác chọn tạo giống đậu tương ở Việt Nam hiện do 8 cơ quan nghiên cứu tham gia: Viện Di truyền Nông nghiệp, Trung tâm Nghiên cứu Đậu đỗ– Viện Cây lương thực và Cây Thực phẩm, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, Viện Nghiên cứu Ngô, Học việnNông nghiệp Việt Nam, Đại học Cần Thơ, Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu. Trong giai đoạn 1977–2010 đã cho ra đời và được công nhận 45 giống đậu tương mới. Về thành tựu chọn giống đậu tương, có thể tạm thời chia làm 3 giai đoạn: Giai đoạn thứ 1 - Chọn tạo giống đậu tương chuyên vụ Trong các năm 70–80 của thế kỷ trước, đậu tương ở nước ta đạt năng suất thấp 6,8 tạ/ha (1980), trong sản xuất đậu tương ở nước ta tồn tại 2 nhóm giống đậu tương chính: Nhóm giống chuyên cho vụ lạnh (vụ Xuân, vụ Đông): Có các giống TBKT nhập nội như V74 (ĐT74), AK02, AK03, AK04, AK05, VX92, VX93, ĐT92; Giống chọn tạo: DN42, TLA57, 98-04, ĐT2000, ĐT26, Đ2101 , ngoài ra còn có các giống địa phương như Vàng xanh Hà Giang, Vàng Mường Khương, Xanh Bắc Hà Nhóm giống chuyên cho vụ nóng (Xuân Hè và Hè Thu): ở phía Bắc chủ yếu là ĐH4 (ĐT76), M103, ĐT80, Lơ Hà Bắc, Cúc, Đậu Lạng ở phía Nam: HL25, MTD176, HL92, G87-5, OMON 25-20, OMDN 16-4, OMDN 22-11, OMDN 21- 75, OMDN 16-5-2, VDN 1, TN12 và CM 60 Các nhóm gichuyên cho vụ nóng (Xuân Hè và Hè Thu): ở phía Bắc chủ yếu là ĐH4 (ĐT76), M103, ĐT80, Lơ Hà Bắc, Cúc, Đậu Lạng ở phía Nam: HL25, MTD176, HL92, G87-5, OMON 25-20, OMDN 16-4, OMDN 22-11, OMDN 21-75, OMDN 16-5-2, VDNa Bắc khó nhân giống, giá thành sản xuất giống cách vụ cao làm tăng giá trị đầu vào nên khó phát triển diện tích, đặc biệt nhu cầu giống cho vụ Đông trên đất sau 2 vụ lúa [7]. Giai đoạn 2 - Chọn tạo giống đậu tương 3 vụ Từ những năm 90 của thế kỷ trước, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Cây lương thực, Cây thực phẩm, Viện Nghiên cứu Ngô bằng phương pháp lai và đột
23 biến đã chọn tạo thành công và chuyển giao thắng lợi vào sản xuất bộ giốngđậu tương 3 vụ gồm: DT84, DT90, DT96, DT55 (AK06), DT99, ĐT12, DT94, DT95, DT83, DT2001, ĐVN5, ĐT22, ĐVN6, đậu tương rau DT02 và hàng chục giống có triển vọng KNQG: DT2003, DT2005, ĐVN9. các giống này hiện đã chiếm trên 50% diện tích đậu tương cả nước, riêng phía Bắc chiếm 85-90%. Đặc điểm mang tính đột phá của bộ giống này là thích ứng rộng, sinh trưởng hữu hạn, phản ứngyếu với ánh sáng ngày ngắn, chịu nóng và chịu lạnh với biên độ rộng từ10–15 0C đến 38–40 0C, đề kháng với các loại bệnh nguy hiểm tốt, trồng được cả3vụ/năm (Xuân, Hè, Đông) thích hợp trên các vùng sinh thái từ Bắc vào Nam, năng suất cao, khá ổn định từ 18–40 tạ/ha, hạt to, vàng đẹp, chất lượng tốt, protein đạt 40–47%. Các giống này dễ để giống, giống từ vụ trước có thể chuyển sang vụ sau không phải lưu kho lạnh, giá thành giống giảm được 30%, tạo điều kiện mở rộng diện tích trên qui mô lớn, đặc biệt diện tích đậutương vụ Đông (vụ III) sau lúa mùa. Tuy nhiên, khả năng chịu hạn của các giống 3 vụ phần lớn còn yếu [4]. Giai đoạn 3 - Chọn tạo giống đậu tương chống chịu cao, thích ứng rộng Công trình nghiên cứu có hệ thống tập đoàn giốngđậu tương chịu hạn, nghiên cứu phương pháp tuyển chọn, đánh giá tính chịu hạn thông qua phương pháp đánh giá trong phòng nảy mầm trên nước đường sachasose, phương pháp làm héo khô. Kết quả từ trên 1000 mẫu giống nhập nội từ 45 nước, đã phân lập được 148 mẫu giống có khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây con [2]. Nghiên cứu phân tích sự liên hệ giữa thành phần acid amine, tổnghợp protein, enzim α-amylase với tính chịu hạn của 11 giống đậutương địa phương Sơn La cho thấy, có sự đa dạng di truyền về tính chịu hạn của cácgiốngđậu tương, trong điều kiện hạn, cây đậu tương giảm tổng hợp protein và tăng hàm lượng proline, đường, hoạt độ của enzym α-amylase [12]. Các nghiên cứu về giống đậu tương chuyển gen chống chịu sâu đang được tiến hành tại Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu long. Nghiên cứu tuyển chọn đánh giá giống đậutương chịu hạn đã được tiến hành tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, bằng các phương pháp đánh giá tại giai đoạn
24 hạt qua xử lý áp suất thẩm thấu trong dung dịch polyethylene glycol 6000, giai đoạn hoa, làm quả bước đầu đã kết luận được một số giống có triển vọng chịu hạn,đềtài này đã góp phần xác định phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn củađậutương phù hợp với điều kiện nghiên cứu ở nước ta. Tại Viện Di truyền Nông nghiệp, từ năm 1992 đã bắt đầu chú trọng nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương chịu hạn, kết quả sau 17 năm, từ trên 67 tổ hợp lai và xử lý đột biến trên 6 giống (tia Gamma – Co60 liều lượng 150, 180, 200, 250 Gy) đã chọn tạo được 2 giống DT95 (đột biến từ giống AK04) và DT96 (xử lý độtbiến trên con lai DT84 x DT90) có khả năng chịu hạn, kháng bệnh khá. Từ năm 2001, Viện Di truyền Nông nghiệp cũng là cơ quan đại diện cho Việt Nam tham gia phối hợp trong khuôn khổ Diễn đàn Hợp tác Hạt Nhân ChâuÁ (FNCA) về Chương trình Chọn giống Đột biến Phóng xạ với sự tham dự của 9nước trong Diễn đàn và 5 nước tham gia đề tài “Chọn tạo giống Đậu tương đột biến chịu hạn”, Giống DT96 được Hội nghị tổng kết đánh giá cao về sự cố gắngcủa Việt Nam trong chọn tạo giống theo hướng chịu hạn. Việt nam đã thu thập nguồn gen các giống chịu hạn, bước đầu sơ bộ xác định một số giống triển vọng chịu hạntừ Mehico như HC.200, HC.100, từ Philippines như Psy 4, Psy5 . Kết quả lai hữu tính giữa 2 giống DT2001/HC100 kết hợp gây tạo đột biến ở F4 và chọn lọc phảhệ theo các tiêu chí chống chịu hạn, bệnh, chịu nhiệt [2]. Việc chuyển nạp gen được TS. Trần Thị Cúc Hòa thực hiện thông qua đề tài “Nghiên cứu chuyển nạp gen ở đậu tương và tạo dòng đậu tương biến đổi gen kháng sâu ở Việt Nam”, tiến hành thử nghiệm trên 4 phương pháp lây nhiễm khác nhau. Trong đó, hiệu quả chuyển nạp gen ở phương pháp 4, tạo vết thương tại mặt trong của nốt lá mầm với dung dịch có chứa vi khuẩn được nuôi cây ở nhiệt độ 21C. Với việc tạo vết thương ở nốt lá mầm, sẽ giúp kích thích sự xâm nhập của vikhuẩn - một trong những yếu tố quyết định sự thành công trong chuyển nạp gen vàocây đậu tương. Phương pháp này được đánh giá là tốt hơn cả, với tỷ lệ mẫu sống sótvà phát triển nhiều, tỷ lệ nạp chuyển gen đạt cao hơn.
25 Học viện Nông nghiệp Việt Nam phối hợp với Viện Cây Lương thưc vàCây thực phẩm, Viện Bảo vệ thực vật đã nghiên cứu xác định hiệu quả của mộtsốgen kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tương Việt Nam và chỉ thị phân tử liên kết với chúng, đã kết luận Gen kháng Rpp2, Rpp4 và Rpp5 biểu hiện tính kháng tốt với bệnh gỉsắt đậu tương ở Việt Nam, các gen kháng này rất có giá trị sử dụng trong chương trình chọn tạo giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt ở Việt Nam theo các vùng sinh thái đặc trưng. Chỉ thị phân tử: Satt620 (liên kết với genkháng Rpp2 ở khoảng cách di truyền 3,33cM), Satt288 (liên kết với gen kháng Rpp4 ở khoảng cách di truyền 2,50cM) và Sat_275 (liên kết với gen kháng Rpp5 ở khoảng cách di truyền 4,16cM) là các chỉ thị liên kết chặt với gen kháng mục tiêu, có độ tin cậy cao trong nghiên cứu ứng dụng. Các chỉ thị này sẽ được sử dụng để nhận diện gen kháng trong laitạo và chọn lọc giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt ở Việt Nam [5].
26 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng: Sử dụng giống đậu tương DT22, DT84. - Phạm vi nghiên cứu: + Xác định ảnh hưởng thời gian khử trùng của dung dịch NaClO 5% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. + Xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi + Xác định ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi + Xác định ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 3.2. Nội dung nghiên cứu 3.2.1. Nội dung 1: Xác định ảnh hưởng thời gian khử trùng của dung dịch NaClO 5% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. 3.2.2. Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi 3.2.3. Nội dung 3: Xác định ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi 3.2.4. Nội dung 4: Xác định ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro Sử dụng môi trường MS có bổ sung agar 6,0 – 7 g/l, đường 30g/l (MT nền hay môi trường MS cơ bản), các chất BAP, GA3, NAA có hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm, pH= 5,6-5,8. Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào MT nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm. Môi trường được hấp khử trùng ở 121o C, áp suất 1atm trong 60 phút 3.3.2. Phương pháp khử trùng mẫu Cách tiến hành: trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủ yếu các hóa chất là NaClO, cồn 70o.
27 Trước tiên, hạt đậu tương được ngâm bằng cồn 70o trong 30 giây để sơ loại các mầm bệnh và tăng hiệu quả khử trùng. Sau khi ngâm trong 30 giây, đổ bỏ cồn và rửa lại bằng nước cất vô trùng 2 - 3 lần. Sau đó ẫm u được ngâm trong dung dịch NaClO 5% trong các thời gian khác nhau Cuối cùng, rửa lại mẫu 4-5 lần bằng nước cất vô trùng. Sau khi rửa sạch mẫu, tiến hành bóc vỏ và cấy vào môi trường cơ bản – môi trường Murashige Skoog (MS). Các đĩa nuôi cấy được chuyển vào phòng nuôi cấy mô trong điều kiện chiếu sáng 10h/ngày, cường độ chiếu sáng 2000 lux, ở nhiệt độ 25oC Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, nhắc lại 3 lần. Tổng số mẫu sống Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%) = x 100% Tổng số mẫu cấy Tổng số mẫu chết Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu cấy x 100% Tổng số mẫu nhiễm Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)= x 100% Tổng số mẫu cấy 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi Sau khi hạt đậu tương được khử trùng và nuôi 5 ngày trên môi trường MS, tiến hành gieo hạt trên các môi trường dinh dưỡng có nồng độ BAP khác nhau để thăm dò khả năng tái sinh của từng môi trường. Mẫu sau khi cấy được nuôi trong điều kiện: Ánh sáng: 2500- 3000 lux Thời gian chiếu sáng: 8 - 10 h/ngày Nhiệt độ: 23 ± 2oC
28 Độ ẩm : 60 - 70% Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, cấy 10 mẫu/1 đĩa, cấy 3 đĩa cho 1 công thức. Chỉ tiêu theo dõi: Tổng số mẫu nảy mầm Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%) = x 100% Tổng số mẫu đưa vào 3.3.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 tới khả năng kéo dài chồi Sử dụng chồi đã được tái sinh ở thí nghiệm 2 khi chiều cao chồi đạt khoảng 1- 2cm tiến hành cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, cấy 10 mẫu/ đĩa, cấy 3 đĩa cho mỗi công thức. Mẫu được nuôi trong điều kiện: Ánh sáng: 2500- 3000 lux Thời gian chiếu sáng: 8 - 10 h/ngày Nhiệt độ: 25 ± 2o C Độ ẩm : 60 - 70% Chỉ tiêu theo dõi: Tổng số chồi được kéo dài Tỷ lệ chồi kéo dài(%) = x 100% Tổng số chồi nuôi cấy 3.3.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Sử dụng chồi được kéo dài ở thí nghiệm 3 khi kích thước cây đạt khoảng 4- 5cm tiến hành cấy chuyển sang môi trường ra rễ. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, cấy 10 mẫu/ đĩa, cấy 3 đĩa cho mỗi công thức. Mẫu được nuôi trong điều kiện [11]: Ánh sáng: 2500- 3000 lux Thời gian chiếu sáng: 10 - 16 h/ngày
29 Nhiệt độ: 25 ± 2o C Độ ẩm : 60 - 70% Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi ra rễ, chất lượng rễ. Tổng số chồi ra rễ Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = ×x 100% x100% Tổng số chồi nuôi cấy Mẫu hạt + NaClO và cồn 70o Khử trùng mẫu + BAP Tái sinh chồi + GA3 Kéo dài chồi + NAA Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu nhân giống đậu tương bằng phương pháp in vitro 3.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm 3.4.1. Nội dung 1: Xác định ảnh hưởng thời gian của dung dịch NaClO 5% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. - Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian của dung dịch NaClO 5% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1: 30” cồn 70 + 5’ NaClO 5% CT 2: 30” cồn 70o + 10’ NaClO 5% CT 3: 30” cồn 70o + 15’ NaClO 5%
30 - Các mẫu sau khi được khử trùng sẽ tiến hành tác vỏ và đưa vào môi trường MT nền (môi trường MS cơ bản) và nuôi cấy trong điều kiện thích hợp. Tiến hành theo dõi, quan sát. - pH môi trường: 5,6 – 5,8 3.4.2. Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi - Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi - Sau khi hạt đậu tương được khử trùng và nuôi 5 ngày trên môi trường MS, tiến hành tạo đa chồi rồi gieo hạt trên các môi trường MT nền có nồng độ BAP ở các nồng độ khác nhau để thăm dò khả năng tái sinh của từng môi trường - Đưa mẫu vào phòng nuôi. Quan sát và theo dõi số chồi và chất lượng chồi tạo ra Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0 mg/l BAP CT 2: MT nền + 1,0 mg/l BAP CT 3: MT nền + 1,5 mg/l BAP CT 4: MT nền + 2,0 mg/l BAP - pH môi trường: 5,6 – 5,8 3.4.3. Nội dung 3: Xác định ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi - Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi - Sử dụng chồi đã được tái sinh ở thí nghiệm 2 khi chiều cao chồi đạt khoảng 1- 2cm tiến hành cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi gồm: MT nền + GA3 ở các nồng độ khác nhau. - Đưa mẫu vào phòng nuôi cấy. Tiến hành quan sát, theo dõi chất lượng chồi của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0 mg/l GA3 CT 2: MT nền + 0,5 mg/l GA3
31 CT 3: MT nền + 1,0 mg/l GA3 CT 4: MT nền + 1,5 mg/l GA3 - pH môi trương: 5,6 – 5,8 3.4.4. Nội dung 4: Xác định ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả ra rễ tạo cây hoàn chỉnh - Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả ra rễ - Chồi được nuôi cấy ở thí nghiệm 3 sau khi đạt kích thước khoảng 4 – 5cm tiến hành cấy chuyển sang môi trường ra rễ có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau nhằm đánh giá khả năng tạo mô rễ và chất lượng của rễ tạo ra. - Đưa mẫu vào phòng nuôi cấy. Tiến hành theo dõi và quan sát chất lượng rễ tạo ra. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0 mg/l NAA CT 2: MT nền + 0,5 mg/l NAA CT 3: MT nền + 1,0 mg/l NAA CT 4: MT nền + 1,5 mg/l NAA - pH môi trường: 5,6 – 5,8 3.5. Các phương pháp xử lý số liệu - Các số liệu được tính toán bằng phần mềm excel. - Các số liệu phân tích là số liệu trung bình của các lần theo dõi. Quá trình xử lý thực hiện trên máy theo chương trình IRRISTAT 4.0.
32 Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch NaClO 5% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu hạt bằng NaClO 5% được thể hiện ở bảng 4.1. Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng thời gian của dung dịch NaClO 5% đến khả năng vô trùng hạt đậu tương (sau 5 ngày) Tổng số Tổng Tổng số Tỷ lệ Công Số mẫu mẫu nảy số mẫu mẫu nảy Chất lượng Giống thức đưa vào mầm chết nhiễm mầm mẫu (CT) (hạt) (hạt) (hạt) (hạt) (%) CT1 30,00 16,67 4,33 9,00 55,56 Hạt tái trắng Hạt xanh CT2 30,00 27,33 1,34 1,33 91,11 đậm DT84 Hạt xanh CT3 30,00 19,67 6,66 3,67 65,56 nhạt LSD05 3,98 CV% 2,50 CT1 30,00 16,33 4,34 9,33 54,44 Hạt tái trắng Hạt xanh CT2 30,00 27,00 1,33 1,67 90,00 DT22 đậm Hạt xanh CT3 30,00 20,33 5,00 4,67 67,78 nhạt LSD05 2,51 CV% 1,60 Sau 5 ngày nuôi cấy chúng tôi nhận thấy: Đối với giống DT84 Ở các thời gian khử trùng khác nhau, khả năng nảy mầm của mẫu là khác nhau. Cụ thể: Ở CT 1 với 30 giây khử trùng bằng cồn 70o và 5 phút khử trùng NaClO 5% cho tổng số mẫu DT84 nảy mầm là 16,67 hạt với tỷ lệ nảy mầm tương ứng là 55,56%, chất lượng chồi nảy mầm kém- hạt tái, trắng.
33 Ở CT 2 với 30 giây khử trùng bằng cồn 70o và 10 phút khử trùng NaClO 5% cho tổng số mẫu DT84 nảy mầm là 27,33 hạt với tỷ lệ nảy mầm tương ứng là 91,11%, chất lượng chồi nảy mầm tốt- hạt xanh đậm. Ở CT 3 với 30 giây khử trùng bằng cồn 70o và 15 phút khử trùng NaClO 5% cho tổng số mẫu DT84 nảy mầm là 19,67 hạt với tỷ lệ nảy mầm tương ứng là 65,56%, chất lượng chồi nảy mầm trung bình- hạt xanh nhạt. Ở CT 1 tổng số mẫu DT84 nhiễm là cao nhất: 9,00 hạt, có thể do thời gian khử trùng chưa đủ để loại bỏ các tế bào nấm, khuẩn trong mẫu. Ở CT 3 tỷ lệ mẫu chết lại cao nhất 6,66 hạt, có thể do thời gian khử trùng lâu làm ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của mẫu. Kết quả thí nghiệm cho thấy hạt đậu tương DT84 có thể nảy mầm tốt ở thời gian khử trùng là 30 giây cồn 70o kết hợp 10 phút khử trùng bằng NaClO 5%. Còn đối với thời gian khử trùng 30 giây cồn 70o kết hợp 5 phút khử trùng bằng NaClO 5% cho tỷ lệ mẫu nảy mầm thấp nhất. Từ kết quả trên, chúng tôi chọn CT2 là công thức khử trùng phù hợp cho quá trình nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo. Theo bảng 4.1 chúng tôi nhận thấy hiệu quả khử trùng đối với giống DT22 được thể hiện như sau: Ở CT 1 với 30 giây khử trùng bằng cồn 70o và 5 phút khử trùng NaClO 5% cho tổng số mẫu đậu tương DT22 nảy mầm là 16,33 hạt với tỷ lệ nảy mầm tương ứng là 54,44%, chất lượng chồi nảy mầm kém- hạt tái, trắng. Ở CT 2 với 30 giây khử trùng bằng cồn 70o và 10 phút khử trùng NaClO 5% cho tổng số mẫu đậu tương DT22 nảy mầm là 27,00 hạt với tỷ lệ nảy mầm tương ứng là 90,00%, chất lượng chồi nảy mầm tốt- hạt xanh đậm. Ở CT 3 với 30 giây khử trùng bằng cồn 70o và 15 phút khử trùng NaClO 5% cho tổng số mẫu nảy mầm là 20,33 hạt với tỷ lệ nảy mầm tương ứng là 67,78%, chất lượng chồi nảy mầm trung bình- hạt xanh nhạt. Ở CT 1 tổng số mẫu đậu tương DT22 nhiễm là cao nhất: 9,33 hạt, có thể do thời gian khử trùng chưa đủ để loại bỏ các tế bào nấm, khuẩn trong mẫu. Ở CT 3 tỷ
34 lệ mẫu chết lại cao nhất 5,00 hạt, có thể do thời gian khử trùng lâu làm ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của mẫu. Kết quả thí nghiệm cho thấy hạt đậu tương DT22 có thể nảy mầm tốt ở thời gian khử trùng là 30 giây cồn 70o kết hợp 10 phút khử trùng bằng NaClO 5%. Còn đối với thời gian khử trùng 30 giây cồn 70o kết hợp 5 phút phút khử trùng bằng NaClO 5% cho tỷ lệ mẫu nảy mầm thấp nhất. Từ kết quả trên, chúng tôi chọn CT 2 là công thức khử trùng phù hợp cho quá trình nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo. Phương pháp khử trùng bằng cồn 70o và NaClO là một phương pháp khử trùng đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Tác giả Nguyễn Thị Thúy Hường và Cs sử dụng phương pháp khử trùng bằng cồn 70o và NaClO 60% trong vòng 20 phút đạt hiệu quả nảy mầm khá cao từ 82,3 – 85,70% giảm 5,41 – 7,7% so với thí nghiệm 1 của đề tài. Có thể do trong thực tế hạt đậu tương là đối tượng rất khó khử trùng, nếu khử trùng bằng cồn và NaClO với nồng độ quá cao và thời gian quá dài thì hạt bị tổn thương và không nảy mầm được. Ngược lại, nếu nồng độ cồn và NaClO quá thấp thì không đủ khử nhiễm nên tỷ lệ nhiễm cao sau khi cấy. Vì vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp này để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. A B Hình 4.1. Mẫu đậu tương sau khi khử trùng và nuôi cấy sau 5 ngày trên môi trường MS cơ bản A. Hạt đậu tương DT84 được khử trùng và nuôi cấy sau 5 ngày B. Hạt đậu tương DT22 được khử trùng và nuôi cấy sau 5 ngày
35 4.2. Kết quả nghiên cứu: Ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi Những chồi có chất lượng tốt ở thí nghiệm 1 được tách hạt, gây tổn thương vào chuyển vào môi trường có nồng độ BAP khác nhau, tiến hành theo dõi, quan sát. Các kết quả cụ thể được thể hiện ở bảng 4.2. Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi hạt đậu tương sau 4 ngày Công Nồng độ Số mấu Tổng số Tỷ lệ mẫu Hình thái Giống thức BAP nuôi cấy mẫu nảy nảy chồi chồi (CT) (mg/l) (hạt) chồi (hạt) (hạt) CT1 (đ/c) 0,00 30,00 2,33 7,78 Ngắn, gầy CT2 1,00 30,00 16,67 55,56* Ngắn, gầy DT84 Ngắn, CT3 1,50 30,00 27,33 91,11* mập CT4 2,00 30,00 25,67 85,56* Ngắn, gầy LSD05 2,94 CV (%) 2,50 CT1 (đ/c) 0,00 30,00 2,00 6,67 Ngắn, gầy CT2 1,00 30,00 16,67 55,56* Ngắn, gầy DT22 Ngắn, CT3 1,50 30,00 26,67 88,89* mập CT4 2,00 30,00 24,67 82,22* Ngắn, gầy LSD05 5,08 CV (%) 4,40 Ghi chú: *: CT có ý nghĩa so với đối chứng Từ kết quả bảng 4.2 cho thấy: Với giá trị LSD.05 = 2,94 các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Nồng độ BAP có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành chồi đối với hạt đậu tương DT84
36 Trong thí nghiệm này, tỷ lệ mẫu đậu tương DT84 nảy chồi cao nhất đạt được ở CT3 là 91,11%, chất lượng chồi thu được ngắn, mập. Tiếp theo là CT4đạt 85,56%, CT2 đạt 55,56%, CT1 đạt 7,78%, chồi thu được ngắn, gầy. Kết quả trên được giả thích như sau: BAP có tác dụng kích thích nảy chồi. Ở CT đối chứng (CT1) vì không bổ sung BAP nên số mẫu đậu tương DT84 nảy chồi không lớn và chồi ngắn và gầy. Nồng độ BAP 1,5 mg/l (CT3) cho nhiều hạt nảy chồivàchất lượng chồi tốt nhất là do BAP ở nồng độ này có tác dụng kích thích nảy chồi từ hạt mạnh nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinhtrưởngvà phát triển tốt nhất. Ở CT2, CT4, nồng độ BAP lần lượt là 1,0 mg/l, 2,0 mg/l cho thấy tỷ lệ ra chồi thấp, bởi vì BAP ở nồng độ cao gây ức chế chồi phát triển, chồi tạo ra ít và ngắn, gầy. Còn ở BAP ở nồng độ thấp không đủ để kích thích hạt tạo chồi,vàchất lượng chồi cũng kém hơn. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy khi bổ sung BAP ở nồng độ 1,5 mg/l cho tỷ lệ cây đậu tương DT84 hình thành chồi cao nhất đạt 91,11%. Từ bảng 4.2 chúng tôi nhận thấy ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khảnăng hình thành chồi hạt đậu tương DT22 được thể hiện như sau: Với giá trị LSD.05 = 5,08 các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Nồng độ BAP có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành chồi đối với hạt đậu tương DT22 Trong thí nghiệm này, tỷ lệ mẫu đậu tương DT22 nảy chồi cao nhất đạt được ở CT3 là 88,89%, chất lượng chồi thu được ngắn, mập. Tiếp theo là CT4 đạt 82,22%, CT2 đạt 55,56%, CT1 đạt 6,67%, chồi thu được ngắn, gầy. Kết quả trên được giả thích như sau: BAP có tác dụng kích thích nảy chồi. Ở CT đốichứng (CT1) vì không bổ sung BAP nên số mẫu đậu tương DT22 nảy chồi không lớn và chồi ngắn và gầy. Nồng độ BAP 1,5 mg/l (CT3) cho nhiều hạt nảy chồivàchất lượng chồi tốt nhất là do BAP ở nồng độ này có tác dụng kích thích nảy chồi từhạt mạnh nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triểntốtnhất.Ở CT2, CT4, nồng độ BAP lần lượt là 1,0 mg/l; 2,0 mg/l cho thấy tỷ lệ ra chồi thấp, bởi vì BAP ở nồng độ cao gây ức chế chồi phát triển, chồi tạo ra ít và ngắn, gầy.
37 Còn ở BAP ở nồng độ thấp không đủ để kích thích hạt tạo chồi, và chất lượngchồi cũng kém hơn. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy khi bổ sung BAP ởnồng độ 1,5 mg/l cho tỷ lệ hạt đậu tương DT22 nảy chồi cao nhất đạt 88,89%. Giai đoạn cảm ứng tạo chồi là giai đoạn quan trọng trong quá trình phát triển chồi từ nách lá mầm. Môi trường cảm ứng tạo chồi ở đa số các loài thực vậtcầnsử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và xytokinin như IAA, IBA, BAP Trong đó BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng xytokinin được sử dụng phổ biến để tạo cảm ứng chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau. Khả năng tạocảm ứng chồi là một thông số quan trọngdùng để đánh giá tính thích ứng của giống trong hệ thống nuôi cấy in vitro nhằm sử dụng cho mục đích chuyển gen sau này. Trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thúy Hường và cs môi trường có bổsung 1,5 mg/l BAP cho tỷ lệ tạo chồi cao nhất đạt 89,5% ở giống DT22 và 91,6% ở giống DT84 không có sự chênh lệch nhiều so với thí nghiệm 2 của đề tài (<1%). Do vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ 1,5 mg/l BAP là nồng độ phụ hợp cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi ở hai đối tượng đậu tương này. A B Hình 4.2. Mẫu đậu tương nuôi ở CT 3 sau 4 ngày A. Giống đậu tương DT84 B. Giống đậu tương DT22
38 4.3. Kết quả nghiên cứu: Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi Những chồi có chất lượng tốt ở thí nghiệm 2 được cấy chuyển sang môi trường có bổ sung các nồng độ GA3 khác nhau để nghiên cứu khả năng kéo dài chồi. Các kết quả sau khi quan sát được thể hiện ở bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 tới khả năng kéo dài chồi đậu tương sau 4 ngày Công Nồng độ Số mấu Tổng số Tỷ lệ Hình thái Giống thức GA nuôi cấy mẫu kéo mẫu kéo 3 chồi (CT) (mg/l) (hạt) dài (hạt) dài (hạt) CT1 (đ/c) 0,00 30,00 2,67 8,89 Ngắn, mập CT2 0,50 30,00 17,33 57,78* Ngắn, mập DT84 CT3 1,00 30,00 25,67 85,56* Dài, mập CT4 1,50 30,00 22,67 75,56* Dài, mập LSD05 3,33 CV (%) 2,90 CT1 (đ/c) 0,00 30,00 1,67 5,56 Ngắn, mập CT2 0,50 30,00 16,67 55,56* Ngắn, mập DT22 CT3 1,00 30,00 25,00 83,33* Dài, mập CT4 1,50 30,00 22,33 74,44* Dài, mập LSD05 2,48 CV (%) 2,30 Ghi chú: *: CT có ý nghĩa so với đối chứng Chúng tôi nhận thấy đối với giống DT84 ảnh hưởng của nồng độ GA3 được thể hiện như sau: Với giá trị LSD.05 = 3,33 các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Nồng độ GA3 có tác dụng rõ rệt đến sự kéo dài chồi đối với hạt đậu tương DT84 Trong thí nghiệm này, tỷ lệ kéo dài chồi đậu tương DT84 cao nhất đạt được ở CT3 là 85,56%, chất lượng chồi thu được dài, mập . Tiếp theo là CT4 đạt 75,56%, CT2 đạt 57,78%, CT1 đạt 8,89%, chồi thu được ngắn, mập. Kết quả trên được giải thích như sau: GA3 có tác dụng kích thích kéo dài chồi. Ở CT đối chứng (CT1) vì không bổ sung GA3 nên số mẫu chồi được kéo dài không lớn và chồi ngắn và mập.
39 Nồng độ GA3 1,0 mg/l (CT3) cho tỷ lệ kéo dài chồi và chất lượng chồi tốt nhất là do GA3 ở nồng độ này có tác dụng kích thích kéo dài chồi đậu tương DT84 nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất. Ở CT2,CT4, nồng độ GA3 lần lượt là 0,5 mg/l; 1,5 mg/l cho thấy tỷ lệ kéo dài chồi thấp, bởi vì GA3 ở nồng độ cao gây ức chế chồi phát triển, chồi tạo ra ít và ngắn, mập. Còn ở GA3 ở nồng độ thấp không đủ để kích thíchchồi kéo dài, và chất lượng chồi cũng kém hơn. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy khi bổ sung GA3 ở nồng độ 1,0 mg/l cho tỷ lệ kéo dài chồi đậu tương DT84 cao nhất đạt 85,56%. Đ.ao nhất đạt 85, Với giá trị LSD.05 = 2,48 các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Nồng độ GA3 có tác dụng rõ rệt đến sự kéo dài chồi đối với hạt đậu tươngDT22 Trong thí nghiệm này, tỷ lệ kéo dài chồi đậu tương DT22 cao nhất đạt được ở CT3 là 83,33%, chất lượng chồi thu được dài, mập. Tiếp theo là CT4 đạt 74,44%, CT2 đạt 55,56%, CT1 đạt 5,56%, chồi thu được ngắn, mập. Kết quả trên được giả thích như sau: GA3 có tác dụng kích thích kéo dài chồi. Ở CT đối chứng (CT1) vì không bổ sung GA3 nên số mẫu chồi đậu tương DT22 được kéo dài không lớn và chồi ngắn và mập. Nồng độ GA3 1,0 mg/l (CT3) cho tỷ lệ kéo dài chồi và chất lượng chồi tốt nhất là doGA3 ở nồng độ này có tác dụng kích thích kéo dài chồi nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất. Ở CT2,CT4, nồng độ GA3 lần lượt là 0,5 mg/l; 1,5 mg/l cho thấy tỷ lệ kéo dài chồi thấp, bởivì GA3 ở nồng độ cao gây ức chế chồi phát triển, chồi tạo ra ít và ngắn, mập. Còn ở GA3 ở nồng độ thấp không đủ để kích thích chồi kéo dài, và chất lượng chồicũng kém hơn. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy khi bổ sung GA3 ở nồng độ 1,0 mg/l cho tỷ lệ kéo dài chồi đậu tương DT22 cao nhất đạt 83,33%. Sau khoảng 4-5 ngày chồi được hình thành cấy chuyển sang môi trương tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chồi và chuẩn bị cho cây ra rễ. Trong đócó
40 bổ sung GA3 thuộc nhóm kích thích sinh trưởng gibberellin, hiệu quả sinh lý rõ nhất của GA3 là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân doGA3 kích thích lên pha giãn của tế bào theo chiều dọc. Chính vì vậy nó có tác dụng kéo dàichồi. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy Nhường và cs khi bổ 1mg/l GA3 sẽ cho kết quả kéo dài chồi tốt nhất đạt 85,20% đối với giống DT84 và 83,32% đối với giống DT22 (chồi kéo dài có kích thước 5-7cm). So với thí nghiệm 3 của đề tài kết quả của tác giả Nguyễn Thị Thúy Hường không có sự chênh lệch đáng kể (< 1%).Do vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ 1mg/l GA3 làm nồng độ phù hợp nhất trong giai đoạn kéo dài chồi ở hai giống đậu tương DT84 và DT22. A B Hình 4.3. Mẫu đậu tương nuôi cấy trong môi trường kéo dài chồi sau 4 ngày A. Mẫu đậu tương DT84 B. Mẫu đạu tương DT22 4.4. Kết quả nghiên cứu: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Những mẫu tốt nhất ở thí nghiệm 3 sẽ được tuyển chọn và chuyển sang môi trường ra rễ có bổ sung các nồng độ NAA khác nhau để nghiên cứu khả năng ra rễ của hai giống đậu tương. Từ kết quả bảng 4.4 cho thấy:
41 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA tới khả năng ra rễ tạo cây đậu tương hoàn chỉnh Công Nồng độ Số mấu Tổng số Tỷ lệ mẫu Hình Giống thức NAA nuôi cấy mẫu ra rễ ra rễ thái rễ (CT) (mg/l) (cây) (cây) (cây) CT1 0,00 30,00 2,33 7,78 Ngắn, nhỏ (đ/c) DT84 CT2 0,50 30,00 15,00 50,00* Ngắn, nhỏ CT3 1,00 30,00 25,67 85,55* Dài, mập CT4 1,50 30,00 22,00 73,33* Ngắn, nhỏ LSD05 3,32 CV (%) 4,90 CT1 0,00 30,00 1,67 5,56 Ngắn, nhỏ (đ/c) DT22 CT2 0,50 30,00 15,00 52,22* Ngắn, nhỏ CT3 1,00 30,00 25,67 83,33* Dài, mập CT4 1,50 30,00 22,00 68,89* Ngắn, nhỏ LSD05 4,30 CV (%) 4,10 Ghi chú: *: CT có ý nghĩa so với đối chứng Chúng tôi nhận thấy ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ tạo cây đậu tương DT84 hoàn chỉnh được thể hiện như sau: Với giá trị LSD.05 = 3,32 các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Nồng độ NAA có tác dụng rõ rệt đến hình thành rễ đối với hạt đậu tương DT84 Trong thí nghiệm này, tỷ lệ ra rễ cao nhất đạt được ở CT3 là 85,55%, chất lượng rễ thu được dài, mập. Tiếp theo là CT4 đạt 73,33%, CT2 đạt 50,00%, CT1 đạt 7,78%, rễ thu được ngắn, nhỏ. Kết quả trên được giả thích như sau: NAA có tác dụng kích thích hình thành môrễ. Ở CT đối chứng (CT1) vì không bổ sung NAA nên số mẫu hình thành rễ không lớn và rễ ngắn, nhỏ. Nồng độ NAA 1,0 mg/l (CT3)
42 cho tỷ lệ ra rễ và chất lượng rễ tốt nhất là do NAA ở nồng độ này có tác dụng kích thích ra rễ nhất đồng thời tạo điều kiện cho rễ sinh trưởng và phát triển tốt nhất. Ở CT2, CT4, nồng độ NAA lần lượt là 0,5 mg/l; 1,5 mg/l cho tỷ lệ ra rễ thấp, bởi vì NAA ở nồng độ cao gây ức chế chồi phát triển, rễ tạo ra ngắn, nhỏ. Còn khi NAA ở nồng độ thấp không đủ để kích thích tái sinh mô rễ, và chất lượng rễ cũng kém hơn. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chothấết quả ngng NAA ết quả ngng NAAứu của chúng tôi cho thriển, CT4ư rễ không lớn và rễ ngắn, nh. Ả. rnồng độ 1,0 mg/l cho tỷ lệ ôi cho thriển, CT4ễ. rnồng độ 1,0 mg/l cho tn chỉnh được thể hiện như sau: Với giá trị LSD.05 = 4,30 các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Nồng độ NAA có tác dụng rõ rệt đến hình thành rễ đối với hạt đậu tương DT22 Trong thí nghiệm này, tỷ lệ ra rễ cao nhất đạt được ở CT3 là 83,33%, chất lượng rễ thu được dài, mập. Tiếp theo là CT4 đạt 68,89%, CT2 đạt 52,22%, CT1 đạt 5,56%, rễ thu được ngắn, nhỏ. Kết quả trên được giả thích như sau: NAA có tác dụng kích thích hình thành mô rễ. Ở CT đối chứng (CT1) vì không bổ sung NAA nên số mẫu hình thành rễ không lớn và rễ ngắn,nhỏ. Nồng độ NAA 1,0 mg/l (CT3) cho tỷ lệ ra rễ và chất lượng rễ tốt nhất là do NAA ở nồng độnàycó tác dụng kích thích ra rễ nhất đồng thời tạo điều kiện cho rễ sinh trưởng và phát triển tốt nhất. Ở CT2, CT4, nồng độ NAA lần lượt là 0,5 mg/l; 1,5 mg/l chotỷ lệ ra rễ thấp, bởi vì NAA ở nồng độ cao gây ức chế chồi phát triển, rễ tạo ra ngắn, nhỏ. Còn khi NAA ở nồng độ thấp không đủ để kích thích tái sinh môrễ, và chất lượng rễ cũng kém hơn. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy đối với giống đậu tương DT22 khi bổ sung NAA ở nồng độ 1,0 mg/l cho tỷ lệ ra rễ cao nhất đạt 83,33%. Trong môi trường ra rễ chúng tôi có bổ sung NAA với các nồng độ 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l. NAA thuộc nhóm kích thích trưởng auxin có khả năng kích thích rễ phát triển. Tuy nhiên khi sử dụng NAA trong giai đoạn sinh trưởng của rễ thì cần
43 nồng độ NAA thấp, nếu dùng nhiều có khả năng gây ức chế. Kết quả nghiên cứuthí nghiệm 4 của đề tài cho thấy NAA ở nồng độ 1mg/l thích hợp cho sự ra rễ củahai giống đậu tương DT84 và DT22 với tỷ lệ ra rễ tương ứng là 85,55% và 83,33%. So với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thúy Hường và cs tỷ lệ ra rễtăng 1,22 – 1,96%. Do vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ 1,0mg/l NAA là nồng độ phùhợp nhất cho sự hình thành mô rễ của cây đậu tương 2giống DT84 và DT22.
44 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Sau khi tiến hành các thí nghiệm đề tài xin đưa ra ộm t số kết luận sau trong nhân giống đậu tương từ hạt bằng phương pháp nuôi ấc y in vitro như sau: 1. Thời gian khử trùng phù hợp nhất để tạo hạt đậu tương vô trùng bằng cồn 70o và NaClO 5% là: 10 phút.Tạo hiệu quả khử trùng 91,11% đối với giống DT84 và 90% với giống DT22. 2. Bổ sung 1,5mg/l BAP vào môi trường MS cơ bản + 30g đường + 7 - 8g/l agar, pH = 5,6 – 5,8 là thích hợp nhất cho sự tạo chồi của hai giống đậu tương DT22 và DT84. Hiệu quả cảm ứng tạo chồi đạt được là 91,11% với giống DT84 và 88,89% với giống DT22. 3. Bổ sung 1,0mg/l GA3 vào môi trường MS cơ bản + 30g đường + 7 - 8g/l agar, pH = 5,6 – 5,8 là thích hợp nhất cho sự kéo dài chồi của hai giống đậu tương DT22 và DT84. Hiệu quả kéo dài chồi đạt được là 85,56% với giống DT84 và 83,33% với giống DT22 4. Bổ sung 1,0 mg/l NAA vào môi trường MS cơ bản + 30g đường + 7 - 8g/l agar, pH = 5,6 – 5,8 là thích hợp nhất cho sự hình thành mô rễ của hai giống đậu tương DT22 và DT84. Hiệu quả hình thành mô rễ đạt được là 85,55% với giống DT84 và 83,33% với giống DT22. 5.2. Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu thêm ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng khác đến khả năng tái sinh cây đậu tương hoàn chỉnh - Nghiên cứu thêm giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển cây con in vitro.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tài liệu tiếng việt 1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (2002), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Nxb Khoa học và Kỹ thuật. 2. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam, Nxb Khoa học tự nhiên và công nghệ. 3. Quy trình khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dựng giống cây nông nghiệp (2006), Bộ NN&PTNT, tr.80-88. 4. Nguyễn Mạnh Chính, Nguyễn Mạnh Cường (2008), Trồng đậu xanh, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, tr.3-9. 5. Vũ Đình Chính, Đinh Thái Hoàng (2010), Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất của một số giống đậu tương Úc nhập nội trong vụ hè thu trên đất Gia Lâm – Hà Nội, Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 8, số 6: 868 -875. 6. Mai Văn Chung, Trần Ngọc Toàn (2015), Stress “ôxy hóa” và phản ứng bảo vệ của cây đậu tương DT84 đối với chì, Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 13, số 5: 783-789. 7. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 8. Đường Hồng Dật (2006), Cây đậu xanh. Kỹ thuật thâm canh và biện pháp tăng năng suất, chất lượng sản phẩm, Nxb Lao Động – Xã Hội, tr.5-31. 9. Nguyễn Danh Đông (1983), Kỹ thuật trồng cây đậu tương, Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội 10. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 11. Lê Thị Ánh Hồng (2000), Cơ sở khoa học công nghệ chuyển gen ở thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 12. Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Hà Tấn Thụ, Đinh Thị Kim Phương, Trần Thị Trường (2006), Sưu tập, phân loại và đánh giá chất lượng
hạt của một số giống đậu tương địa phương tại tỉnh Sơn La, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, số 11 kỳ I tháng 6/2006. 28-32 13. Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2008), Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen P5CS của một số giống đậu tương (Glycine max L.Merrili), Tạp chí công nghệ sinh học, 6(4): 459-466. 14. Phạm Thành Hổ (2008), Nhập môn công nghệ sinh học, Nxb Giáo dục. 15. Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), Phát triển hệ thống tái sinh invitro ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill) phục vụ cho chuyển gen, Tạp chí khoa học và công nghệ, tr.82-83. 16. Nguyễn Đăng Khôi (1997), Các cây đậu ăn hạt ở Việt Nam, Tạp chí sinh học, số 2, tr. 5-6. 17. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1998), Cây đậu xanh, Nxb Nông nghiệp. 18. Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 19. Kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp 2000 (2001), Nxb Nông nghiệp. 20. Lương Thành Quang (2016), Nghiên cứu chuyển gen GmNAC004 vào giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn Agrobacterium để nâng cao khả năng chịu hạn, Nxb Đại học Nông Nghiệp. 21. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp. 22. Phạm Văn Thiều (2002), Cây đậu tương kỹ thuật trồng và chế biến sản phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 23. Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình sinh lý học thực vật. Nxb Giáo dục, Hà Nội. 24. Trần Thị Thúy, Nguyễn Thị Thu Hoài, Tống Thị Mơ (2018), Đánh giá hàm lượng một số yếu tố dinh dưỡng và enzyme trong giai đoạn nảy mầm sớm của hai giống đậu tương (Glycine max) DT84 và DT2008, Tạp chí sinh học.
25. Đỗ Năng Vịnh, (2005). Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng. NXB Nông Nghiệp 26. Kết quả nghiên cứu khoa học đậu đỗ 1991-1995 (1996), Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, Việt Nam, tr. 4-188. I.Tài liệu nước ngoài 27. American Seed Trade Association Conference Proceedings, 2006 28. Barwale, Meyer MM Jr, Widholm JM (1986), Screening of Glycine max and Glycine soja genotypes for multiple shoot formation at the cotyledonary node, Theor Appl Genet, 72:423-428 29. FAO STAT 2018 30. Ottawa, Ontario (1996), The Biology of Glycine max (L.) Merr. (Soybean), Canadian food inspection Agency. 31. Vander Maesen L.J.G. (1996), Tài nguyên thực vật Đông Nam Á, tập 1 – Các cây đậu ăn hạt, Nxb Khoa học và kỹ thuật, tr. 16-86. 32. Zhao Q, Du Y, Wang H, Rogers HJ, Yu C, Liu W, Zhao M, Xie F (2019), 5- Azacytidine promotes shoot regeneration during Agrobacterium-mediated soybean transformation, Plant Physiol Biochem, 141: 40-50. doi: 10.1016
PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 1. Môi trường MS Marcro 10X STT Thành phần Nồng độ (g/l) 1 KNO3 19 2 NH4NO3 16,5 3 CaCl2.2H2O 4,4 4 MgSO4.7H2O 3,7 5 KH2PO4 1,7 2. Môi trường MS Micro 1000X STT Thành phần Nồng độ (g/l) 1 MnSO4.4H2O 22,3 2 ZnSO4.7H2O 8,6 3 H3BO3 6,2 4 KI 0,83 5 Na2MoO4.2H2O 0,25 6 CuSO4.5H2O 25 mg/l 7 CoCl2.6H2O 25 mg/l
3. Môi trường MS Vitamins 100X STT Thành phần Nồng độ (g/l) 1 Myo-inositol 10 2 Nicotinic acid 50 3 Pyridoxine-HCl 50 4 Thiamine-HCl (10mg/ml) 1 ml 5 Glycine (100mg/ml) 20 ul 4. FeSO4 EDTA Iron 100X STT Thành phần Nồng độ (g/l) 1 FeSO4.7H2O 2,78 2 Na2EDTA 3,72 5. Môi trường MS cơ bản STT Thành phần Thể tích (ml/l) 1 MS Marcro 10X 50 ml 2 MS Micro 1000X 1 ml 3 Fe EDTA 10 ml 4 MS Vitamin 100X 10 ml 5 Đường 30g/l 6 Agar 7-8g/l
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU Kết quả 1: nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch NaClO 5% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng 1. Giống DT84 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL FILE SL1 28/ 5/19 9:10 :PAGE 1 VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 NL 2 9.88642 4.94321 1.60 0.309 3 2 CT 2 2017.01 1008.51 325.84 0.000 3 * RESIDUAL 4 12.3805 3.09511 * TOTAL (CORRECTED) 8 2039.28 254.910 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL1 28/ 5/19 9:10 :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TL 1 3 70.0000 2 3 70.0000 3 3 72.2233 SE(N= 3) 1.01573 5%LSD 4DF 3.98144 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TL 1 3 55.5567 2 3 91.1100 3 3 65.5567 SE(N= 3) 1.01573 5%LSD 4DF 3.98144 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL1 28/ 5/19 9:10 :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NL |CT | (N= 9) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TL 9 70.741 15.966 1.7593 2.5 0.3095 0.0004 2. Giống DT22 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL FILE SL2 28/ 5/19 10: 8 :PAGE 1 VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 NL 2 32.0864 16.0432 13.04 0.020 3 2 CT 2 1935.87 967.936 786.76 0.000 3
* RESIDUAL 4 4.92110 1.23027 * TOTAL (CORRECTED) 8 1972.88 246.610 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL2 28/ 5/19 10: 8 :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TL 1 3 68.8900 2 3 73.3333 3 3 70.0000 SE(N= 3) 0.640384 5%LSD 4DF 2.51017 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TL 1 3 54.4433 2 3 90.0000 3 3 67.7800 SE(N= 3) 0.640384 5%LSD 4DF 2.51017 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL2 28/ 5/19 10: 8 :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NL |CT | (N= 9) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TL 9 70.741 15.704 1.1092 1.6 0.0196 0.0002 Kết quả 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh chồi 1. Giống DT84 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL FILE SL2 29/ 5/19 10:41 :PAGE 1 VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 NL 2 16.8002 8.40012 3.88 0.083 3 2 CT 3 13103.2 4367.74 0.000 3 * RESIDUAL 6 12.9949 2.16581 * TOTAL (CORRECTED) 11 13133.0 1193.91 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL2 29/ 5/19 10:41 :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TL 1 4 58.3250 2 4 60.8350 3 4 60.8350
SE(N= 4) 0.735834 5%LSD 6DF 2.54537 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TL 1 3 7.78000 2 3 55.5467 3 3 91.1100 4 3 85.5567 SE(N= 3) 0.849668 5%LSD 6DF 2.93914 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL2 29/ 5/19 10:41 :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NL |CT | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TL 12 59.998 34.553 1.4717 2.5 0.0828 0.0000 2. Giống DT22 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL FILE SL4 29/ 5/19 10:51 :PAGE 1 VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 NL 2 5.56111 2.78055 0.43 0.673 3 2 CT 3 12544.3 4181.44 644.84 0.000 3 * RESIDUAL 6 38.9069 6.48448 * TOTAL (CORRECTED) 11 12588.8 1144.43 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL4 29/ 5/19 10:51 :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TL 1 4 58.3325 2 4 57.5000 3 4 59.1675 SE(N= 4) 1.27323 5%LSD 6DF 4.40431 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TL 1 3 6.66667 2 3 55.5567 3 3 88.8900 4 3 82.2200 SE(N= 3) 1.47020 5%LSD 6DF 5.08566
ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL4 29/ 5/19 10:51 :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NL |CT | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TL 12 58.333 33.829 2.5465 4.4 0.6729 0.0000 Kết quả 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi 1. Giống DT84 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL FILE SL5 29/ 5/19 10:54 :PAGE 1 VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 NL 2 12.9648 6.48240 2.33 0.178 3 2 CT 3 10425.0 3475.00 0.000 3 * RESIDUAL 6 16.6944 2.78240 * TOTAL (CORRECTED) 11 10454.7 950.424 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL5 29/ 5/19 10:54 :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TL 1 4 55.8350 2 4 58.3350 3 4 56.6675 SE(N= 4) 0.834027 5%LSD 6DF 2.88503 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TL 1 3 8.89000 2 3 57.7800 3 3 85.5567 4 3 75.5567 SE(N= 3) 0.963051 5%LSD 6DF 3.33135 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL5 29/ 5/19 10:54 :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NL |CT | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TL 12 56.946 30.829 1.6681 2.9 0.1778 0.0000
2. Giống DT22 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL FILE SL6 29/ 5/19 10:56 :PAGE 1 VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 NL 2 35.2815 17.6408 11.41 0.010 3 2 CT 3 10876.4 3625.47 0.000 3 * RESIDUAL 6 9.27428 1.54571 * TOTAL (CORRECTED) 11 10921.0 992.814 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL6 29/ 5/19 10:56 :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TL 1 4 52.4975 2 4 55.0000 3 4 56.6700 SE(N= 4) 0.621633 5%LSD 6DF 2.15033 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TL 1 3 5.55667 2 3 55.5567 3 3 83.3333 4 3 74.4433 SE(N= 3) 0.717800 5%LSD 6DF 2.48299 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL6 29/ 5/19 10:56 :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NL |CT | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TL 12 54.722 31.509 1.2433 2.3 0.0096 0.0000 Kết quả 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ 1. Giống DT84 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL FILE SL7 29/ 5/19 10:59 :PAGE 1 VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 NL 2 38.9111 19.4556 2.74 0.142 3 2 CT 3 10564.7 3521.57 496.43 0.000 3 * RESIDUAL 6 42.5625 7.09375 * TOTAL (CORRECTED) 11 10646.2 967.834
TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL7 29/ 5/19 10:59 :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TL 1 4 52.5000 2 4 53.3325 3 4 56.6675 SE(N= 4) 1.33170 5%LSD 6DF 4.60658 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TL 1 3 7.78000 2 3 50.0000 3 3 85.5533 4 3 73.3333 SE(N= 3) 1.53772 5%LSD 6DF 5.31922 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL7 29/ 5/19 10:59 :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NL |CT | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TL 12 54.167 31.110 2.6634 4.9 0.1421 0.0000 2. Giống DT22 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL FILE SL8 29/ 5/19 11: 2 :PAGE 1 VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 NL 2 38.8778 19.4389 4.20 0.072 3 2 CT 3 10269.2 3423.08 739.68 0.000 3 * RESIDUAL 6 27.7666 4.62777 * TOTAL (CORRECTED) 11 10335.9 939.626 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL8 29/ 5/19 11: 2 :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TL 1 4 50.8350 2 4 51.6650 3 4 55.0000 SE(N= 4) 1.07561 5%LSD 6DF 3.72072 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TL 1 3 5.55667 2 3 52.2200