›

Đồ án Định danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (Pterapogon kauderni) dựa trên gen ITS và xác định sự lây nhiễm bằng kĩ thuật SEM

pdf 73 trang thiennha21 12/04/2022 6730
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Định danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (Pterapogon kauderni) dựa trên gen ITS và xác định sự lây nhiễm bằng kĩ thuật SEM", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_dinh_danh_nam_soi_gay_hong_trung_ca_ba_chu_pterapogon.pdf

Nội dung text: Đồ án Định danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (Pterapogon kauderni) dựa trên gen ITS và xác định sự lây nhiễm bằng kĩ thuật SEM

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐỊNH DANH NẤM SỢI GÂY HỎNG TRỨNG CÁ BÁ CHỦ (Pterapogon kauderni) DỰA TRÊN GEN ITS VÀ XÁC ĐỊNH SỰ LÂY NHIỄM BẰNG KĨ THUẬT SEM Ngành: Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : Ths. Võ Minh Sơn CN. Ngô Đức Duy Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thủy Tiên MSSV: 1151110524 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, năm 2015
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đồ án này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS. Võ Minh Sơn, CN. Ngô Đức Duy. Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực, đề tài không trùng với bất kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào. Những thông tin tham khảo trong khóa luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thủy Tiên
  3. LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy cô, các anh chị và các bạn , em đã hoàn thành tốt đồ án này. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: TS. Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đề tài. Thầy Ngô Đức Duy, TS. Nguyễn Hoàng Dũng và chị Loan phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án. Thầy Võ Minh Sơn đang công tác tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, đã nhiệt tình giúp em trong quá trình thu nhập mẫu bệnh trên trứng cá, và hỗ trợ giải đáp thắc mắc trong quá trình làm đề tài. Cô Nguyễn Hoài Hương, phòng Vi sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài. Các bạn lớp 11DSH04 đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. Cuối cùng, con xin cám ơn Ba Mẹ, đã nuôi nấng, chăm sóc và tạo mọi điều kiện cho con ăn học thành người có ích cho xã hội và anh hai, người đã luôn bên cạnh động viên, định hướng cho em những khi em gặp khó khăn trong công việc.
  4. Đồ Án Tốt Nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 1 3. Mục đích nghiên cứu 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 5. Phương pháp nghiên cứu 2 6. Các kết quả đạt được của đề tài 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Cá Bá Chủ 4 1.1.1. Hệ thống phân loại 4 1.1.2. Đặc điểm sinh thái học 5 1.1.2.1. Hình thái 5 1.1.2.2. Sinh học sinh sản 6 1.1.3. Quy trình ấp trứng cá Bá Chủ tại Việt Nam 9 1.2. Bệnh nấm thủy sản 9 1.2.1. Bệnh nấm thủy mi 10 1.2.2. Bệnh do nấm Lagenidium 10 1.2.3. Bệnh do nấm Haliphthoros 10 1.2.4. Bệnh do nấm Fusarium 11 i
  5. Đồ Án Tốt Nghiệp 1.2.5. Bệnh do nấm Plectosporium 11 1.3. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 11 1.3.1. Các phương pháp ly trích DNA 11 1.3.1.1. Nguyên tắc 11 1.3.1.2. Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật 12 1.3.2. PCR trong định danh vi sinh vật 13 1.3.2.1. Kỹ thuật PCR 13 1.3.2.2. Gen rDNA 14 1.3.2.3. Mồi 14 1.3.2.4. Ứng dụng của PCR trong quá trình định danh loài vi sinh vật 16 1.3.3. Xây dựng cây phát sinh loài 16 1.4. Kỹ thuật khuếch tán đĩa giấy kháng sinh vào môi trường thạch 17 1.4.1. Phạm vi áp dụng 17 1.4.2. Kháng sinh 17 1.5. Phương pháp chụp SEM 22 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất 24 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị 24 2.1.2. Nguồn mẫu 24 2.1.3. Hóa chất 24 2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy 24 2.1.3.2. Các hóa chất định danh 24 2.1.3.3. Các hóa chất phản ứng PCR 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu 25 ii
  6. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.2.1. Phân lập nấm gây bệnh 25 2.2.2. Phương pháp phòng ẩm 26 2.2.3. Định danh bằng sinh học phân tử 26 2.2.3.1. Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA bằng CTAB 26 2.2.3.2. Phản ứng PCR 27 2.2.3.3. Dùng PCR để khuếch đại đoạn gen ITS của nấm bệnh 30 2.2.3.4. Giải trình tự và định danh 32 2.2.4. Kháng sinh đồ 32 2.2.4.1. Nguyên lý 32 2.2.4.2. Đĩa giấy kháng sinh 32 2.2.4.3. Các bước thực hiện 33 2.2.5. Phương pháp cảm nhiễm 33 2.2.5.1. Chuẩn bị 33 2.2.5.2. Bố trí thí nghiệm 34 2.2.6. Phương pháp chụp SEM 34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35 3.1. Kết quả phân lập và làm thuần của nấm bệnh 35 3.1.1. Kết quả thu nhận mẫu trứng bệnh 35 3.1.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc 36 3.1.3. Kết quả quan sát sợi khuẩn ty và bào tử 38 3.2. Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS 40 3.2.1. Kết quả ly trích, thu nhận bộ gen DNA 41 3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS 41 iii
  7. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.3. Kết quả so sánh vùng gen ITS của 3 chủng M.1.1, M.1, M.4.1 và thiết lập cây phát sinh loài dựa trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI 42 3.3.1. Trình tự vùng gen ITS của các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 42 3.3.2. Thiết lập cây phát sinh loài 43 3.4. Kết quả độ nhạy cảm của các chủng nấm với kháng sinh 45 3.5. Kết quả hình ảnh quá trình lây nhiễm giữa nấm và trứng cá bằng kĩ thuật SEM 46 3.5.1. Kết quả hình ảnh lây nhiễm dưới kính hiển vi quang học 47 3.5.2. Kết quả hình ảnh quá trình lây nhiễm bằng kĩ thuật SEM 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 1. Kết luận 51 2. Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường 1 PHỤ LỤC B: Kết quả trình tự vùng gen bảo tồn ITS 2 PHỤ LỤC C: Kết quả trình tự vùng gen của các chủng so sánh trên NCBI 5 PHỤ LỤC D: Kết quả hình ảnh kĩ thuật SEM quá trình lây nhiễm giữa nấm và trứng cá Bá Chủ 7 iv
  8. Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Bp Base Pair CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleotide Acid EDTA Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid ITS Internal transcribed spacer PCR Polymerase Chain Reation PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth PYGSA Peptone Yeast extract Glucose Salt Agar SEM Scanning Electron Microscope TAE Tris-Acetic acid- Ethylenediamine- Tetraacetae TE Tris- Ethylenediamine- Tetraacet v
  9. Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS [22]. 15 Bảng 3.1. Kết quả độ nhạy cảm của chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 với kháng sinh 45 Bảng 3.2. Kích thước đường kính vòng kháng khuẩn và kháng nấm sau 72 giờ. 46 vi
  10. Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni) [28]. 5 Hình 1.2. Con đực đang nuốt trứng vào miệng để ấp [29]. 7 Hình 1.3. Trứng cá Bá Chủ sau khi thụ tinh [21]. 8 Hình 1.4. Hệ thống bể ươm [4]. 9 Hình 1.5. Bản đồ mồi trong vùng gen ITS [22]. 15 Hình 1.6. Hình thái bên ngoài của vật kí sinh chụp bằng SEM [14]. 23 Hình 1.7. Sự thay đổi hình thái xảy ra trên bề mặt tế bào chụp bằng SEM [14]. 23 Hình 3.1. Trứng cá Bá Chủ 35 Hình 3.2. Trứng cá Bá Chủ bị nhiễm bệnh 35 o Hình 3.3. Khuẩn lạc chủng M.1.1 trên môi trường PDA ở 28 C trong 72 giờ. 36 o Hình 3.4. Khuẩn lạc chủng M.1 trên môi trường PDA ở 28 C trong 72 giờ. 36 o Hình 3.5. Khuẩn lạc chủng M.4.1 trên môi trường PDA ở 28 C 37 Hình 3.6. Sợi khuẩn ty và sự hình thành bào tử của chủng M.1.1 (40X) 38 Hình 3.7. Sợi khuẩn ty và sự hình thành bào tử của chủng M.1 (100X) 39 Hình 3.8. Sợi khuẩn ty và bào tử của chủng M.4.1 (100X). 40 Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gen DNA của 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 trên gel agarose 1%. 41 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 trên gel agarose 1%. 42 Hình 3.11. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS các chủng M.1.1, M.1, M.4.1 với các chủng nấm trên ngân hàng gen NCBI. 43 vii
  11. Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.12. Kết quả mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.4.1 dưới kính hiển vi quang học (100X). 47 Hình 3.13. Kết quả mẫu đối chứng dưới kính hiển vi quang học (100X). 48 Hình 3.14. Kết quả mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1.1 dưới kính hiển vi quang học (100X). 48 Hình 3.15. Kết quả mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1 dưới kính hiển vi quang học (100X). 49 Hình 3.16. Bề mặt trứng mẫu đối chứng chụp bằng SEM. 49 Hình 3.17. Bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 chụp bằng SEM (100X và 500X) 50 Hình 3.18. Bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 chụp bằng SEM (500X và 1000X) 50 viii
  12. Đồ Án Tốt Nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ở Việt Nam có tiềm năng lớn cho phát triển cá cảnh do có khí hậu nhiệt đới, nguồn lợi thủy sinh tự nhiên phong phú và sự đa dạng của các hệ thống sông và kênh rất thuận lợi cho sự phát triển nghề cá cảnh, đặc biệt phù hợp cho sự sinh sản và phát triển các loài cá cảnh nhiệt đới. Người chơi cá cảnh ở nước ta đang có xu hướng chuyển dần sang chơi các loài cá cảnh biển do chúng có nhiều màu sắc đẹp, đa dạng về thành phần loài. Nguồn cá cảnh biển đa số được khai thác từ tự nhiên hoặc nhập từ nước ngoài. Hiện nay, cá Bá Chủ là loài có giá trị kinh tế cao, chúng có màu sắc đẹp và dễ nuôi nên đang được người chơi cá cảnh ngày càng ưa chuộng. Cá Bá Chủ đang trong quá trình nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình sản xuất giống cá Bá Chủ trong điều kiện nuôi nhốt tại Việt Nam. Việc phát triển quy trình sản xuất trong điều kiện nuôi nhốt sẽ giúp cho loài cá này được sinh sản nhân tạo tại chỗ, không cần phải mua và vận chuyển từ nguồn đánh bắt ngoài tự nhiên. Điều này sẽ giúp gia tăng số lượng cá Bá Chủ được sinh sản nhân tạo và làm giảm áp lực cho nguồn cá tự nhiên, đồng thời đem lại nguồn lợi to lớn cho nghề nuôi trồng cá cảnh của nước ta. Tuy nhiên, trong quá trình xây dựng quy trình sinh sản và ương nuôi cá bột thành cá giống, nấm bệnh gây hư hỏng trứng cá làm tỉ lệ trứng nở giảm mạnh, làm chậm tiến trình gia tăng số lượng cá Bá Chủ, ảnh hưởng nghiêm trọng đến quy trình sản suất. Cho nên việc xác định chủng nấm gây bệnh trên trứng cá Bá Chủ nhằm tìm ra biện pháp khắc phục mang tính cấp thiết. 2. Tình hình nghiên cứu Nghiên cứu ứng dụng quy trình sản xuất giống cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni Koumans, 1933) tại Việt Nam của Thạc sĩ Võ Minh Sơn được công bố năm 2013 [4] và đang được triển khai với mục đích xây dựng quy trình sản xuất giống cá Bá 1
  13. Đồ Án Tốt Nghiệp Chủ trong điều kiện nuôi nhốt tại Việt Nam. Trong phạm vi đề tài, quan tâm đến quy trình sinh sản và trứng cá bị nhiễm nấm bệnh gây hư hỏng. Cá Bá chủ được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1996 và được xem là một loài cá có khả năng kháng bệnh rất tốt. Tuy nhiên đã có nhiều nghiên cứu về bệnh trên loài cá này, nhưng đến nay vẫn chưa có nghiên cứu về sự nhiễm nấm bệnh trên trứng của cá Bá Chủ. 3. Mục đích nghiên cứu Mục đích của đề tài là xác định được nấm gây bệnh trên trứng cá Bá Chủ, sau khi xác định được nấm gây bệnh sẽ dựa vào những đặc điểm và những nghiên cứu về nấm bệnh rồi đưa ra các biện pháp khắc phục kịp thời, đảm bảo quy trình sản xuất đạt kết quả cao nhất. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập và làm thuần chủng nấm từ mẫu trứng bị nhiễm nấm bệnh. - Quan sát hình thái học (khuẩn lạc, khuẩn ty, bảo tử). - Định danh bằng sinh học phân tử. - Khảo sát khả năng kháng nấm của một số loại kháng sinh. - Cảm nhiễm bệnh bằng phương pháp Robert Koch. - Quan sát sự xâm nhiễm bằng phương pháp chụp SEM (kính hiển vi điện tử quét). 5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp phân lập và làm thuần nấm bệnh. - Phương pháp phòng ẩm (xem sợi khuẩn ty và bào tử). - Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA (theo phương pháp CTAB). - Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi ITS1F và ITS4R. - Phương pháp sinh tin học dựa trên các phần mềm (ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0). - Phương pháp kháng sinh đồ (theo phương pháp đĩa thạch). 2
  14. Đồ Án Tốt Nghiệp - Phương pháp cảm nhiễm (theo phương pháp Robert Koch). - Phương pháp chụp SEM. 6. Các kết quả đạt được của đề tài - Kết quả phân lập và làm thuần được các chủng nấm gây bệnh trên trứng cá Bá Chủ. - Kết quả thu nhận được bộ gen DNA. - Kết quả nhân bản được vùng gen ITS bằng phương pháp PCR. - Kết quả kháng sinh có khả năng kháng nấm bệnh. - Kết quả cảm nhiễm - Kết quả hình SEM 3
  15. Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cá Bá Chủ 1.1.1. Hệ thống phân loại Theo Koumans, 1933 cá có hệ thống phân loại như sau [4]. Giới (Kingdom) Animalia Ngành (Phylum) Chordata Lớp (Class) Actinopterygii Bộ (Order) Perciformes Họ (Family) Apogonidae Giống (Genus) Pterapogon Lòai (Species) Pterapogon kauderni Tên tiếng Anh: Banggai Cardinalfish, Cardinalfish, Highfin Cardinalfish, Banner Cardinalfish, Outhouse Cardinal và tên tiếng Việt gọi là cá Bá Chủ. Cá Bá Chủ là loài cá thuộc họ cá Sơn Apogonidae, tuy nhiên về di truyền loài cá này tiến hoá một nhánh khác và có tên khoa học riêng biệt. Đa số các loài thuộc họ cá Sơn là nhóm cá ăn đêm (nocturnal diet) và đóng vài trò quan trọng trong hệ sinh thái san hô. Tuy nhiên, chỉ riêng loài cá Bá Chủ thuộc họ này có tập tính ăn ban ngày (diurnal diet). Là loài ăn các động vật phù du và giáp xác nhỏ bao gồm chủ yếu là nhóm giáp xác chân chèo (copepod) và nhóm giáp xác Crustacean (tôm, cua). Chúng luôn luôn được tìm thấy sống cùng với các sinh vật khác bao gồm hải quỳ (anemone), san hô (branching coral), cầu gai (sea urchin), sao biển (sea star) và rễ cây ngập mặn. Khảo sát cho thấy vị trí cư trú của cá Bá Chủ có liên quan tuyến tính với sự hiện diện của của mật độ cầu gai và mật độ cá Bá Chủ. Theo khảo 4
  16. Đồ Án Tốt Nghiệp sát cho thấy khi khai thác cá Bá Chủ đã dẫn đến quần thể động vật không xương sống cũng giảm theo [7]. Hiện nay, cá Bá Chủ được ưa chuộng và đã xuất đi nhiều nước thuộc Châu Âu, Mỹ và Châu Á với mục đích phục vụ cho người chơi cá cảnh. Do nhu cầu tiêu thụ loài cá này càng tăng trên thế giới, cá Bá Chủ đã được nhiều nước sinh sản thành công như Hawai (Mỹ) và Indonesia [4]. 1.1.2. Đặc điểm sinh thái học 1.1.2.1. Hình thái Cá Bá Chủ có hình thái vẻ ngoài rất đặc biệt, toàn thân màu trắng bạc rực rỡ với những đường kẻ sọc màu đen. Cơ thể của nó còn được bao phủ bằng những đốm nhỏ màu trắng và rất dễ nhận thấy những đốm này trên các vây lưng, vây hông, vây đuôi và vây hậu môn. Sự bố trí, kích thước và số lượng của các đốm trắng nhỏ này hết sức độc đáo và riêng biệt, có thể sử dụng để xác định mẫu vật. Ngòai ra, vây lưng đầu tiên của cá Bá Chủ có núm tua và đuôi được chẻ nhánh sâu. Mắt của cá Bá Chủ (loài ăn ngày) rất to, thậm chí khi so sánh với cả những thành viên ăn đêm trong cùng một họ. Trọng lượng lớn nhất của loài cá này quan sát là khoảng 6,5 g [18]. Hình 1.1. Cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni) [28]. 5
  17. Đồ Án Tốt Nghiệp 1.1.2.2. Sinh học sinh sản Trong điều kiện phòng thí nghiệm, cá Bá Chủ đạt kích cỡ có thể tham gia sinh sản khoảng 8 – 9 tháng tuổi với chiều dài chuẩn từ 3,5 cm khi được nuôi ở nhiệt độ 25 – 26oC. Trong tự nhiên, khi nhiệt độ môi trường từ 29 – 31oC, con cái có khả năng sinh sản đạt chiều dài chuẩn từ 3,4 – 3,5 cm tương đương với 6 tháng tuổi. Trong khi đó, con đực nhỏ nhất có thể ấp trứng trong miệng được tìm thấy trong tự nhiên có chiều dài chuẩn là 3,1 cm. Cá Bá Chủ là loài cá sinh sản theo chu kỳ. Chu kì phát triển của noãn bào tương thích với kiểu phát triển đồng bộ theo nhóm, trong đó có ít nhất hai nhóm noãn bào có thể phân biệt được rõ ràng cùng một lúc, một nhóm noãn bào lớn phát triển một cách đồng bộ và một nhóm noãn bào nhỏ hơn phát triển không đồng bộ từ buồng trứng đang được phục hồi. Mỗi một chu kì sinh sản, con cái cần ít nhất là 20 ngày để buồng trứng có thể phát triển hoàn thiện. Tần suất sinh sản cao nhất được quan sát là mỗi 25 ngày cho cá Bá Chủ được nuôi ở nhiệt độ 26oC. Kích thước lớn nhất của noãn bào trưởng thành là khoảng 0,27 cm và trọng lượng trung bình là 0,013 g ở con cái có chiều dài lớn hơn 4,6 cm chiều dài chuẩn. Số lượng trứng trung bình trong mỗi lần ấp trứng (được tách ra khỏi miệng con đực) là 40 trứng với đường kính trung bình cỡ 0,03 cm. Trứng được kết dính với nhau bởi nhiều sợi đan xen lẫn nhau giúp cho trứng không bị tách ra khi con đực xoay khối trứng để cung cấp oxy. Ngoài ra, cá Bá Chủ là loài ít sinh sản nhất so với các loài khác trong họ Apogonidae và không thể hiện mối liên hệ giữa kích thước và sự mắn đẻ. Chiều dài chuẩn của con cái trưởng thành là từ 3,8 – 5,8 cm và số lượng trứng sinh ra là dao động từ 60 – 70 trứng. Khi kích thước của noãn bào càng lớn thì sức sinh sản sẽ giảm đi. Thêm vào đó, khả năng sinh sản của cá Bá Chủ trong điều kiện phòng thí nghiệm thường thấp hơn so với khả năng thực tế của nó. Nguyên nhân của hiện tượng này là do số lượng trứng bị mất đi trong suốt quá trình chuyển từ con cái sang con đực (khoảng 10 – 20 trứng) và một số trứng không được thụ tinh hoặc không 6
  18. Đồ Án Tốt Nghiệp phát triển được tìm thấy trong khoan miệng của cá đực trong vòng một giờ sau khi thụ tinh. Hình 1.2. Con đực đang nuốt trứng vào miệng để ấp [29]. Một điều thú vị nữa là cá Bá Chủ có chu kì sinh sản theo chu kì của trăng. Trong đó, 60 % trứng được đẻ trong thời kì trăng tròn, 30 % ở tuần trăng cuối và 10 % ở tuần trăng đầu. Do đó, khi tính toán thời gian đẻ trứng và thời gian phóng thích cá con nên dựa vào chu kì trăng. Khác với các loài cá ôn đới khác, quá trình sinh sản chỉ diễn ra vào các tháng ấm, cá Bá Chủ sinh sản quanh năm. Quá trình bắt cặp và ve vãn thường diễn ra vào buổi sáng, quá trình thụ tinh xảy ra từ 13:00 giờ đến 15:30 giờ. Quá trình giải phóng trứng diễn ra trong vòng 2 giây, khi cá cái giải phóng chùm trứng, cá đực lập tức bơi vòng quanh, thụ tinh và ngậm trứng vào miệng. Thời gian diễn ra của quá trình thụ tinh này không quá 3 giây. Sau khi thụ tinh, con cái thể hiện vai trò là người bảo vệ cho con đực nhưng biểu hiện này không dài quá 30 phút. Con đực sau khi ngậm trứng thường xuyên mở rộng miệng và xoay khối trứng, hành động này thường thu hút sự chú ý của những con đực khác và bị tấn công dành trứng nếu được nuôi chung một bể. Trứng của cá Bá Chủ có đường kính trứng lớn (trung bình 0,3 cm), nhiệt độ tại thời điểm sinh sản là 26oC, tuổi biến thái vào ngày thứ 20 - 25 sau khi nở (tương 7
  19. Đồ Án Tốt Nghiệp ứng chiều dài 0,10 – 0,11 cm). Loài cá này sinh sản tự nhiên trong bể nuôi cá cảnh ở nhiệt độ 27oC. Con đực ấp trứng trong miệng và tiếp tục giữ cá bột cho đến ngày thứ 21 – 24. Thời gian ấp trứng từ khoảng 25 - 28 ngày ở nhiệt độ 26oC, trong thời gian này con đực không ăn. Tuy nhiên, với các điều kiện nuôi không tốt, bị ép bắt cặp và sức khỏe con đực kém sẽ dẫn đến tình trạng con đực nuốt trứng. Trong quá trình ấp trứng, con đực có thể phát hiện ra trứng chết và tống nó ra ngoài. Điều này hạn chế quá trình nhiễm nấm và vi khuẩn từ trứng chết đồng thời tránh lây lan cho những trứng khỏe. Tỉ lệ thụ tinh đạt trung bình 60 % khi trứng được ấp trong miệng con đực. Tuy nhiên, trong điều kiện phòng thí nghiệm tỉ lệ thụ tinh đạt thấp hơn vào khoảng 40 – 60 % trong điều kiện tách riêng từng cặp sinh sản và khoảng 15 – 25 % khi nuôi chung trong bể nhiều con. Hình 1.3. Trứng cá Bá Chủ sau khi thụ tinh [21]. Sau khi nở từ 6 đến 8 ngày, cá con được phóng thích ra khỏi miệng con đực. Thời gian phóng thích thường vào lúc gần sáng, khi trời còn tối. Ngay sau đó, lập tức chúng bơi theo từng đàn nhỏ và có thể bắt đầu ăn thức ăn có kích thước lớn như ấu trùng Artermia. Chúng cũng bắt đầu tìm kiếm nơi để trú ngụ từ các giá thể có sẳn như đá, nhưng nếu có nhím biển Diadema, chúng lập tức lẫn vào giữa các ống gai của nhím hoặc các giá thể nhân tạo có hình dáng giống nhím biển hay bãi cỏ biển, 8
  20. Đồ Án Tốt Nghiệp kích thước của cá con sau khi được phóng thích là 0,8 cm và noãn hoàn hầu như đã được hấp thụ hết [19]. 1.1.3. Quy trình ấp trứng cá Bá Chủ tại Việt Nam Ấp trứng ngoài cơ thể cá đực: Trứng sau khi thụ tinh vài ngày và được con đực ấp trong miệng, trứng được tách ra từ con đực, ấp trong hệ thống nước chảy tràn với độ mặn 30 ppt, nhiệt độ 28oC cho đến khi trứng nở thành cá bột. Hệ thống ấp hình phiễu được đặt chìm trong bể ương [4]. Hình 1.4. Hệ thống bể ươm [4]. 1.2. Bệnh nấm thủy sản Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh nấm ở động vật thủy sản như một số loài nấm bất toàn thuộc các giống như Fusarium, Acremonium, Plectosporium, Ochroconis, Phoma, Exophiala và nhóm nấm thủy mi như Saprolegnia, Achlya, Leptolegnia và Aphanomyces là tác nhân gây bệnh ở động vật thủy sản [3]. 9
  21. Đồ Án Tốt Nghiệp 1.2.1. Bệnh nấm thủy mi Tác nhân chủ yếu gồm các giống Saprolegnia, Aphanomyces và Achlya. Nấm có dạng sợi, cấu tạo các sợi nấm đa bào và không có vách ngăn ngang. Các sợi nấm dầy và bện vào nhau trông giống như túi bông gòn bên ngoài cơ thể vật chủ, chúng có khả năng sinh sản vô tính và hữu tính. Nấm Saprolegnia là tác nhân cơ hội gây bệnh ở cá chép Cyprinus carpio, cá lóc Chanos chanos và cá Odonthetes bonariensis ở Nhật Bản. Loài S. diclina nhiễm ở trứng cá hồi Oncorhynchus mykiss ở Nhật Bản, trứng cá chép ở Thái Lan và S. salmonis sp. nov. nhiễm ở cá hồi O. nerka [20]. 1.2.2. Bệnh do nấm Lagenidium Nấm khi nuôi cấy trên môi trường PYGSA khuẩn lạc có màu trắng và đường kính 3,5 - 4,0 cm sau 5 ngày, ở 25oC. Sợi nấm không vách ngăn và không phân nhánh, có nhiều hạt nhỏ bên trong, đường kính 5 - 40 µm. Dấu hiệu nhận biết là xuất hiện đốm trắng bên ngoài vật chủ, đồng thời quan sát tiêu bản tươi cho thấy có sự hiện diện của sợi nấm. Tỷ lệ gây chết do nấm Lagenidium trên ấu trùng cua có thể lên đến 100 %. Loài L. callinectes gây bệnh ở giai đoạn trứng và ấu trùng ghẹ xanh Callinectes sapidus và Portunus pelagicus, ở ấu trùng cua biển Scylla serrata và ở tôm biển Pandalus hypsinotus. Loài nấm khác là L. thermophilum nhiễm ở giai đoạn trứng và ấu trùng cua biển và tôm sú và L. myophilum nhiễm ở tôm Pandalus hypsinotus. Nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển tốt là 25oC và độ mặn khoảng 0 - 50‰ [2]. 1.2.3. Bệnh do nấm Haliphthoros Nấm khi nuôi cấy trên môi trường PYGSA khuẩn lạc có màu trắng và đường kính 2,0 - 2,5 cm sau 5 ngày ở 25oC. Sợi nấm có nhiều hạt nhỏ sáng bên trong, không có vách ngăn, nhưng phân nhánh, đường kính 7,5 - 30 µm. Sợi nấm có điểm mấu tạo thành túi bào tử. Động bào tử có kích thước 6,5 x 8,5 µm, hình quả thận hay đế giày với hai tiên mao ở hai đầu. Loài nấm H. milfordensis và H. 10
  22. Đồ Án Tốt Nghiệp philippinensis nhiễm ở hàu Urosalpinx cinerea, tôm hùm Homarus americanus, bào ngư Haliotis sieboldii, ấu trùng cua S. serrata, ghẹ P. pelagicus và tôm he P. japonicas. Nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển từ 25- 30oC, pH 4 - 11 và độ mặn khoảng 10-50‰ [3]. 1.2.4. Bệnh do nấm Fusarium Một số loài như Fusarium solani, F. moniliforme và F. oxysporum là tác nhân gây bệnh đen mang ở tôm he P. japonicus. Tác nhân gây bệnh đen mang ở tôm sú P.monodon và trên tôm hùm Homarus americanus do nấm F. incarnatum. Ngoài ra, nấm F. solani nhiễm trên rùa biển Caretta caretta và nấm Fusarium sp. nhiễm trên tôm càng xanh [10]. 1.2.5. Bệnh do nấm Plectosporium Nấm Plectosporium khuẩn lạc phát triển rất chậm trên môi trường PYGSA, đường kính 1,0 - 1,3 cm sau 14 ngày ủ ở 25oC, bề mặt nhẵn có màu trắng đục hoặc hơi vàng. Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn đường kính 1 - 4 µm. Cuống sinh bào tử dạng thể bình không phân nhánh, có vách ngăn ở phần gốc. Bào tử dạng ellip, trụ hơi cong, có 0, 1, hoặc 3 vách ngăn, đường kính 12 - 16 x 3 - 4 µm. Loài Plectosporium oratosquillae trên môi trường PYGSA, khuẩn lạc 0,9 - 1,7 cm sau 15 ngày ở 25oC, có nguồn gốc từ nước mặn vì chúng phát triển tốt ở môi trường có 100 % nước biển và không phát triển trong môi trường nước ngọt. Nấm P.oratosquillae là tác nhân gây bệnh nâu mang ở tôm tít O. oratoria và loài này có khả năng gây bệnh đen mang ở tôm he P.japonicus trong điều kiện thí nghiệm [3]. 1.3. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 1.3.1. Các phương pháp ly trích DNA 1.3.1.1. Nguyên tắc Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp 11
  23. Đồ Án Tốt Nghiệp theo. Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease - DNase và ribonuclease - RNase). 1.3.1.2. Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi theo từng môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc là những quần thể vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ gen hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết. Quá trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo. Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp. Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên thường được sử dụng: - Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): được xem là phương pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. Phương pháp ly trích sử dụng nồng độ muối cao 11 (1,5 M NaCl) và ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyltrimethylammonium bromide, và proteinase K. - Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phương pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với 12
  24. Đồ Án Tốt Nghiệp vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích DNA cần phải có cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết. - Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia nhiệt đến 650C. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại kết quả khá cao. - Phương pháp đóng băng và tan băng: Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đóng băng và tan băng ở - 65oC trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên. 1.3.2. PCR trong định danh vi sinh vật 1.3.2.1. Kỹ thuật PCR Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen. PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về 13
  25. Đồ Án Tốt Nghiệp trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược [11]. 1.3.2.2. Gen rDNA Gen rDNA là nhóm gen mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật. Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA. Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ sở rDNA được phát triển những năm đầu của thập niên 90 đã tìm được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm sợi. 1.3.2.3. Mồi Internal transcribed spacer (ITS) là vùng phiên mã bên trong, có rất nhiều sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của vi sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài [9]. Các mồi vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5,8S và 28S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Mồi ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng 14
  26. Đồ Án Tốt Nghiệp lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8S của N. crassa, Szchiosaccharomyces prombe và S.cerevisiae, Viciafaba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28 S của S. prombe, S.cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Mồi ITS5 có trình tự giống với rDNA 18S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách mồi ITS1 25bp. Bảng 1.1. Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS [22]. ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G White và cộng sự. 1990 ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A Gardes và Bruns 1993 ITS2 GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC White và cộng sự. 1990 ITS3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC White và cộng sự. 1990 ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC White và cộng sự. 1990 ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG Gardes và Bruns 1993 ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G White và cộng sự. 1990 Hình 1.5. Bản đồ mồi trong vùng gen ITS [22]. 15
  27. Đồ Án Tốt Nghiệp 1.3.2.4. Ứng dụng của PCR trong quá trình định danh loài vi sinh vật Hoàng Quốc Khánh thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Phạm Thị Lan Thanh thuộc Trường Đại học Lạc Hồng với đề tài “Phân lập, định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng probiotic từ con người” Khoa, L. V., K. Hatai, và T. Aoki. 2004, “Fusarium incarnatum isolated from black tiger shrimp, Penaeus monodon Fabricius, with black gill disease cultured in Vietnam” Nguyễn Thị Thanh Thủy, Đỗ Ngọc Thúy và Nguyễn Bá Hiên với để tài:”Thiết lập phương pháp pcr để xác định vi khuẩn verotoxigenic e.coli (vtec) trong thịt” với phương pháp PCR phức với 3 loại cặp mồi (VT1, VT2 và eae), các điều kiện phản ứng như đã được thiết lập và chuẩn hóa trong nghiên cứu này có thể được áp dụng để xác định vi khuẩn Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC). M M Songe, A Willems, J Wiik-Nielsen, E Thoen, Ø Evensen, P van West và I Skaar 2015, “Saprolegnia diclina IIIA and S. parasitica employ different infection strategies when colonizing eggs of Atlantic salmon, Salmo salar L”. Văn Hồng Cầm, Phan Thị Thảo, Đặng Thúy Bình với đề tài:” Phân lập và định danh vi khuẩn phát sáng gây bệnh trên cá ngựa đen (Hippocampus kuda)” 1.3.3. Xây dựng cây phát sinh loài Các phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S - rDNA và việc xây dựng cây phát sinh loài hiện nay đã trở nên khá phổ biến và được xây dựng trên cơ sở dữ liệu của sinh học và tin học (sinh tin học). Những trình tự mới này sẽ được so sánh với những trình tự trong ngân hàng dữ liệu gen bằng cách sử dụng chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhất với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng các phần mềm sinh tin học như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 để xây dựng 16
  28. Đồ Án Tốt Nghiệp cây phát sinh loài, tập hợp những thông tin có liên quan đến tiến hóa. Một cây phát sinh loài gồm các thành phần như sau: - Một nhánh (một đơn vị huyết thống) là một nhóm vi sinh vật hay nhóm gen bắt nguồn từ tổ tiên chung. Trong phân tích cây phát sinh loài, chiều dài nhánh phát sinh diễn tả mức độ phân hóa giữa các loài. - Nút giao điểm của các nhánh - Hệ thống phát sinh loài dựa trên các phân tử mà đặc biệt là trình tự gen được sử dụng phổ biến trong định danh phân loại. 1.4. Kỹ thuật khuếch tán đĩa giấy kháng sinh vào môi trường thạch 1.4.1. Phạm vi áp dụng Kỹ thuật đĩa giấy kháng sinh khuếch tán có thể áp dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm vi sinh trong các bệnh viện và cho các trung tâm y tế dự phòng tuyến tỉnh. Phương pháp được áp dụng nhằm đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh để giúp cho các bác sĩ lựa chọn các thuốc kháng sinh phù hợp cho bệnh nhân. Sử dụng để giám sát dịch tễ học nhằm đánh giá về tình hình kháng thuốc của vi khuẩn qua đó sẽ đưa ra các biện pháp nhằm khống chế và ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện và cộng đồng. 1.4.2. Kháng sinh Kháng sinh là những chất có tác động chống lại sự sống của vi khuẩn ngăn vi khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của đời sống vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa. Kháng sinh có khả năng ức chế chọn lọc đối với một số khâu trong quá trình phát triển của vi khuấn gây bệnh. Căn cứ vào tác dụng trị bệnh, có thể chia kháng sinh thành 3 nhóm chính 17
  29. Đồ Án Tốt Nghiệp - Kháng sinh kháng khuẩn. - Kháng sinh trị nấm. - Kháng sinh chống ung thư. Trong phạm vi đề tài quan tâm đến một số loại kháng sinh kháng khuẩn thông dụng trong nuôi trồng thủy sản và kháng sinh kháng nấm như sau - Ampiciline (Am) Ampicillin là một kháng sinh rất hữu ích cho việc điều trị của một số vi khuẩn nhiễm trùng. Nó là một kháng sinh thuộc nhóm betalactam, một phần của nhóm aminopenicillin và tương đương với amoxicillin về hoạt động [5]. Ampicillin thực chất là một penicillin bán tổng hợp nhóm A có hoạt phổ rộng với nhiều chủng vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-). Ampicillin có tác dụng chống lại những vi khuẩn mẫn cảm gây nhiễm khuẩn đường hô hấp, dẫn mật, tiêu hoá, tiết niệu, một số bệnh ngoài da như viêm bì có mủ, áp -xe, đầu đinh viêm tai giữa, bàng quang và thận Hiệu quả đối với nhiễm trùng tai và bệnh nhiễm trùng đường hô hấp như viêm xoang do vi khuẩn, đợt cấp của COPD và viêm nắp thanh quản. Nó cũng được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm màng não , và nhiễm khuẩn salmonella [15]. Do bị lạm dụng nên hiện nay nhiều báo cáo cho thấy ampicillin đã bị vi khuẩn kháng lại với tỷ lệ khá cao. Xu hướng dùng những kháng sinh mới phổ rộng hơn để điều trị nhiễm khuẩn đã làm cho ampicillin trở thành loại thuốc bị nhiều người cho là cũ. - Chloramphenicol (Cl) Chloramphenicol là một kháng sinh rất hữu ích cho việc điều trị của một số vi khuẩn nhiễm trùng. Chloramphenicol, còn được gọi là chlornitromycin, có tác dụng chống lại nhiều loại vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm, bao gồm hầu hết 18
  30. Đồ Án Tốt Nghiệp các sinh vật kỵ khí. Chloramphenicol thường có tác dụng kìm khuẩn, nhưng có thể diệt khuẩn ở nồng độ cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm cao. Do sức đề kháng và tính an toàn , nó không còn là lựa chọn hàng đầu cho bất kỳ nhiễm trùng ở các quốc gia phát triển, ngoại trừ điều trị tại chỗ của vi khuẩn viêm kết mạc. Tuy nhiên, các vấn đề toàn cầu trong việc nâng cao sức đề kháng của vi khuẩn để loại thuốc mới đã dẫn đến sự ưa chuộng trong việc sử dụng nó [7]. Ở các quốc gia có thu nhập thấp, chloramphenicol vẫn được sử dụng rộng rãi bởi vì nó không tốn kém và có sẵn. - Penicilin (Pn) Penicillin là một trong một nhóm kháng sinh thu được từ nấm Penicillium hay được điều chế. Alexander Fleming đã tình cờ phát hiện ra penicillin vào năm 1928 nhưng phải 10 năm sau thì penicillin mới được nhà hoá sinh người Anh gốc Đức Ernest Chain và nhà nghiên cứu bệnh học Úc Howard Florey và một số nhà khoa học khác nghiên cứu kỹ. Penicillin sát trùng bằng cách giết vi khuẩn và hạn chế sự sinh trưởng của chúng. Chất này không giết các phần tử trong trạng thái nghỉ mà chỉ tiêu diệt các phần tử đang sinh trưởng và sinh sản. Penicillin tiêu diệt nhiều loài vi khuẩn gây bệnh khác nhau như pneumococci, streptococci, gonococci, meningococci, clostridium và syphilis spirochete. Penicillin được sử dụng làm dược phẩm trị các căn bệnh chết người như viêm nội tâm mạc, nhiễm trùng máu, gas gangrene, mủ lậu, sốt vàng da, giang mai, và viêm loét lưỡi cấp [30]. - Streptomycin (Sm) Strepxomycin là kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng diệt khuẩn, bằng cách ngăn cản quá trình tổng hợp bình thường protein của vi khuẩn. Phổ kháng khuẩn của strepxomycin bao gồm vi khuẩn Gram âm hiếu khí và một số vi khuẩn Gram dương; strepxomycin không có tác dụng với vi khuẩn yếm 19
  31. Đồ Án Tốt Nghiệp khí. Strepxomycin có hoạt tính đặc biệt chống M. tuberculosis và M. bovis. Strepxomycin cũng có hoạt tính chống một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm hiếu khí như: Brucella, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Calymmatobacterium granulomatis, Escherichia coli, Proteus spp., Aerobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Enterococci faecalis, Strepxococcus viridans, Haemophylus ducreyi và Haemophylus influenza. Có nguồn gốc từ các actinobacterium Streptomyces griseus. Streptomycin là một khuẩn kháng sinh [16]. Các tác dụng phụ của thuốc này là độc tính trên tai, độc với thận, độc tính thính giác của thai nhi và tê liệt thần kinh cơ. - Tetracycline (Te) Tetracycline là một kháng sinh thuộc thế hệ kháng sinh cũ được tìm ra, từ năm 1948, nhưng cho đến nay nó vẫn là một kháng sinh tốt. Trong quá trình sử dụng dù tỷ lệ kháng lại kháng sinh này khá nhiều nhưng nó vẫn là một kháng sinh công hiệu và chưa thể loại bỏ khỏi tủ thuốc kháng sinh của nhân loại. Tetracycline là một dòng kháng sinh phổ rộng, có hiệu lực với hầu như các vi khuẩn gram âm cũng như gram dương. Nó đã từng được coi là kháng sinh “bách bệnh” dùng cho mọi loại vi khuẩn và được sử dụng khá lạm dụng. Tỷ lệ kháng kháng sinh này khá cao nhưng không phải vì thế mà nó mất đi công hiệu vốn có của nó. Với những tác dụng đặc hiệu thì tetracycline vẫn được bảo toàn sau 70 - 80 năm và là kháng sinh đầu bảng của các bệnh nhiễm Chlamydiae, bệnh nhiễm Mycoplasma, Rickettsiae như sốt kiểu thương hàn, sốt hồi quy và đặc biệt là nhiễm phẩy khuẩn tả Vibrio cholerae gây ra bệnh dịch tả điển hình trong mùa hè [26]. - Amphotericin (AMB) Amphotericin là một kháng sinh chống nấm nhờ gắn vào sterol (chủ yếu là ergosterol) ở màng tế bào nấm làm biến đổi tính thấm của màng. Amphotericin B cũng gắn với sterol bào chất của người (chủ yếu cholesterol) nên giải thích được 20
  32. Đồ Án Tốt Nghiệp một phần độc tính của thuốc đối với người. Do đó thuốc đã được bào chế dưới dạng liposom hoặc phức hợp với lipid để giảm độc tính. Amphotericin B có tác dụng kìm nấm đối với một số nấm như: Absidia spp., Aspergillus spp., Basidiobolus spp., Blastomyces dermatitidis., Candida spp., Coccidioides immitis, Conidiobolus spp., Crypxococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Mucor spp., Paracoccidioides brasiliensis, Rhizopus spp., Rhodotorula spp. và Sporothrix schenckii. Nồng độ ức chế tối thiểu trong khoảng từ 0,03 - 1 microgam/ml đối với đa số các loài nấm này. Những loài khác như: Prototheca spp, Leishmania và Naegleria protozoa cũng được thông báo có nhạy cảm với amphotericin B. Thuốc không có tác dụng với vi khuẩn, Rickettsia và virus. Kháng thuốc: Dường như không có kháng thuốc invivo. Không thấy có chủng Candida nào kháng amphotericin trên lâm sàng mặc dù có một số ít chủng kháng invitro, nhưng chỉ thấy ở các chủng thứ cấp sau nhiều lần cấy [27]. - Flucytosine (AFY) Thuốc chống nấm phổ hẹp. Tác dụng trực tiếp trên nấm. Kết quả là nấm phát triển mất cân bằng và chết. Flucytosine được chỉ định điều trị các bệnh nhiễm trùng nhiêm trọng gây ra bởi các chủng nhạy cảm của Candida hoặc Cryptococcus neoformans. Nó cũng có thể được sử dụng để điều trị chromomycosis (Chromoblastomycosis), nếu chủng nhạy cảm gây ra nhiễm trùng. Do Flucytosine có tác dụng kháng nấm tương đối yếu nên thường được kết hợp với amphotericin B và azole chống nấm như fluconazole hoặc itraconazole. Nhiễm khuẩn nhẹ như candidal viêm bàng quan có thể được điều trị bằng flucytosine [23]. - Ketoconazole (KCA) Là thuốc kháng nấm phổ rộng, tác dụng trên nhiều nấm gây bệnh, bao gồm các loại nấm bề mặt da, niêm mạc và nấm nội tạng. 21
  33. Đồ Án Tốt Nghiệp Có hoạt tính diệt nấm hoặc kìm nấm đối với vi nấm ngoài da như nấm men (Cadida, Pityrosporum, Torulopsis, Cryptococcua), các nấm nhị độ và các Eumycetes. Kém nhạy cảm hơn là các chủng Aspergillus, Sporothrix schenckii, một số Dematiaceae, các chủng Mucor và các Phycomycetes khác ngoại trừ Entomophthorales. Ketoconazol ức chế sự sinh tổng hợp ergosterol ở nấm và làm thay đổi các thành phần lipid khác ở màng tế bào vi nấm, làm thay đổi tính thấm màng tế bào, ức chế chức năng màng và ức chế sự phát triển của nấm. - Nystatin (NY) Nystatin (tên ban đầu là Fungicidin) là một thuốc kháng nấm polyene mà có nguồn gốc từ một loại vi khuẩn Streptomyces noursei. Nhiều người nhiễm nấm mốc và nấm men đều nhạy cảm với nystatin, có tác dụng rất tốt trên Candida albicans. Nó được sử dụng chủ yếu cho các bệnh nhiễm trùng liên quan đến da, miệng, thực quản, và âm đạo. Nystatin có tác dụng chống bội nhiễm Candida albicans đường tiêu hóa trong quá trình điều trị kháng sinh [25]. 1.5. Phương pháp chụp SEM Kính hiển vi điện tử quét là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật. Ứng dụng của kĩ thuật SEM Nghiên cứu vật kí sinh bằng SEM cho phép chúng ta hình dung đặc điểm hình thái bên ngoài và là một công cụ hữu ích cho việc thu nhập dữ liệu về các nghiên cứu hệ thống phân loại của vật ký sinh nói chung. Kĩ thuật SEM là một công cụ mạnh mẽ để hình dung sự thay đổi hình thái xảy ra trên bề mặt tế bào. 22
  34. Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 1.6. Hình thái bên ngoài của vật kí sinh chụp bằng SEM [14]. Hình 1.7. Sự thay đổi hình thái xảy ra trên bề mặt tế bào chụp bằng SEM [14]. 23
  35. Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ: Pipet, pipetman, đầu tip, Erlen, Lame, Lamelle, que cấy, cân phân tích, máy chụp hình, ống đong, eppendorf Thiết bị: Kính hiển vi quang học, tủ lạnh, máy ly tâm lạnh, nồi hấp khử trùng, máy PCR sprint thermo Cycler, máy lắc 2.1.2. Nguồn mẫu Trứng bệnh của cá Bá Chủ được thu tại Trại nghiên cứu thực nghiệm Thủ Đức (đơn vị trực thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II), địa chỉ 658 Kha Vạn Cân, Phường Linh Đông, Quận Thủ Đức. 2.1.3. Hóa chất 2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) 2.1.3.2. Các hóa chất định danh Đệm CTAB (0,2 M Tris-Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,05M EDTA, 2 % CTAB), Chloroform_Isoamyl alchol (24:1), Isopropanol, Etanol 70 %, 6X LB Loading dye, TAE 1X, Agarose, Ethidium bromide, Thang DNA 1kb. 2.1.3.3. Các hóa chất phản ứng PCR Nước khử ion. Master Mix (2x My taq MixP). Mồi xuôi ITS1F: TCCGTAGGTGAACCTGCGG. 24
  36. Đồ Án Tốt Nghiệp Mồi ngược ITS4R :TCCTCCGCTTATTGATATGC. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập nấm gây bệnh Vì yêu cầu phải phân lập nấm gây bệnh trên trứng cá Bá Chủ nên các mẫu nấm sẽ được thu thập và phân lập từ các mẫu trứng bệnh. Có nhiều phương pháp phân lập nấm trong đó người ta có thể dùng các chất kháng khuẩn để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và thu nhận nấm, cụ thể trong đề tài này sử dụng chất kháng khuẩn Chloramphenicol, Sodium propionate. Các bước phân lập: - Chuẩn bị dụng cụ môi trường Môi trường PDA, đĩa petri và ống nghiệm thạch nghiêng, kéo, kẹp. Các dụng cụ trên được hấp khử trùng trong nồi áp suất ở 121oC, 1 atm trong 20 phút. - Phân lập Mẫu trứng bệnh sau khi thu về sẽ được đặt lên bề mặt đĩa thạch đã chuẩn bị trước, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 2 ngày. - Làm thuần Sau 2 ngày ủ, dùng que cấy thao tác vô trùng chấm nhẹ vào khuẩn lạc riêng lẻ có đặc trưng khác với các khuẩn lạc còn lại ria trên đĩa petri khác, và đem ủ để tạo khuẩn lạc đơn dòng. Lặp lại việc tách dòng nhiều lần để có được giống thuần. Kiểm tra tính thuần và giữ giống trong môi trường PDA thạch nghiên trong ngăn mát tủ lạnh. 25
  37. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.2.2. Phương pháp phòng ẩm Cách tiến hành: Trước hết ta chuẩn bị lame, lamelle, đĩa petri có giấy lọc ở dưới và thanh thủy tinh chữ “u” bên trên. Đem hấp khử trùng cùng với một ống môi trường PDA và một bình nước cất. Dùng pipetman hút môi trường và nhỏ vào lame sao cho môi trường trang mỏng khoảng 2/3 lame để môi trường đông tự nhiên. Dùng que cấy vòng ria tế bào nấm theo dấu “-” rồi đậy lamelle lại. Nhỏ nước cất vô trùng cho thấm đều giấy thấm. Đậy nắm đĩa lại và gói đĩa cẩn thận và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Quan sát dưới kính hiển vi. 2.2.3. Định danh bằng sinh học phân tử 2.2.3.1. Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA bằng CTAB [17] Các bước tiến hành Hút 200 µl dịch nuôi cấy nấm trong môi trường PDB sau 2 ngày vào eppendorf 1,5 ml Thêm vào 800 µl đệm CTAB sau đó đêm ủ 60oC trong 60 phút. Ly tâm 1300 rpm trong 5 phút Lấy ra 600 µl dịch nổi cho vào 1 tube 1,5 ml. Thêm một thể tích chloroform-isoamylalcohol (24:1) tương đương với thể tích phần dịch lấy ra (600 µl), trộn đều bằng cách lắc tube sau đó đem ly tâm 13000 rpm trong 10 phút ở 4oC và thu dịch nổi bên trên màng phân cắt. 26
  38. Đồ Án Tốt Nghiệp Chuyển phần dịch thu được vào 1 tube 1,5 ml mới ( phần dịch khoảng 400µl). Thêm vào isopropanol lạnh ( tỉ lệ thể tích 1:1). Trộn đều. Để lạnh -80oC 45 phút – 60 phút Ly tâm 1300 rpm trong 20 phút ở 4oC Thu tủa. Rửa tủa DNA với 700µl etanol 70%, lắc nhẹ rồi đem ly tâm 13000 rpm trong 1 phút Bỏ dịch, thu tủa và để khô tự nhiên (hoặc làm khô 1 giờ ở 60oC) Hòa tan tủa trong 30-50 µl nước cất tinh khiết, bảo quản -4oC. 2.2.3.2. Phản ứng PCR [5] Tất cả các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho nấm. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung cho một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và điện di trên gel agarose. - Các thành phần của phản ứng PCR 27
  39. Đồ Án Tốt Nghiệp DNA mẫu: chứa vùng DNA cần được khuếch đại. Mồi: là những đoạn oligonucleotide, bổ sung cho vùng DNA tại đầu 5’ và 3’ của vùng DNA cần được khuếch đại. DNA polymerase: (Taq DNA polymerase hay một polymerase khác mà có khả năng hoạt động tốt ở nhiệt độ khoảng 70OC) dùng để tổng hợp đoạn DNA của vùng cần khuếch đại. Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs): là vật liệu để polymerase tổng hợp DNA. Dung dịch Buffer: cung cấp môi trường thích hợp cho hoạt tính cao và bền vững của polymerase. Cation hóa trị 2 (Mg2+ hay Mn2+): thông thường Mg2+ được sử dụng, nhưng Mn2+ có thể được dùng cho phản ứng PCR tức thời. Tuy nhiên, nồng độ Mn2+ cao gia tăng tỉ lệ bắt cặp sai trong quá trình tổng hợp DNA. Cation hóa trị 1: K+. Một trong những DNA polymerase bền nhiệt đầu tiên được thu nhận từ Thermus acquaticus và thường được gọi là Taq polymerase. Taq polymerase hiện nay được sử dụng rộng rãi trong các phản ứng PCR. Một trong những nhược điểm của Taq polymerase là thỉnh thoảng chúng tổng hợp sai khi tổng hợp đoạn DNA dẫn đến những đột biến trong đoạn DNA, bởi vì chúng thiếu hoạt tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Một số polymerase khác như: Pwo và Pfu được thu nhận từ Archaea có cơ chế đọc và sửa sai (cơ chế kiểm tra lại sự sai) mà có thể giảm phần lớn những đột biến xảy ra trong quá trình tổng hợp DNA. Tuy nhiên những enzyme này có hoạt tính tổng hợp DNA thấp hơn Taq. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu polymerase cung cấp cả hoạt tính tổng hợp DNA cao và sự chính xác trong sự tổng hợp DNA. - Chu trình phản ứng 28
  40. Đồ Án Tốt Nghiệp Thông thường, PCR kéo dài 20 - 35 chu kì, hầu hết các phản ứng PCR bao gồm 3 bước: Bước 1 (biến tính DNA): Đầu tiên, phản ứng PCR thường được gia nhiệt đến nhiệt độ 94 - 96oC, nhiệt độ này được giữ 1 - 9 phút nhằm đảm bảo tất cả DNA mục tiêu và mồi bị biến tính , DNA được làm tách mạch bởi sự phá vỡ liên kết hydrogen giữa các base bổ sung của chuỗi DNA, tạo thành các chuỗi DNA mạch đơn. Sau đó, chu trình bắt đầu với một bước có nhiệt độ 94 - 980C khoảng 20 - 30 giây. Bước 2 (bước lai): Nhiệt độ phản ứng được làm thấp để mồi có thể bắt cặp với mạch khuôn DNA đơn. Liên kết hydrogen giữa mạch khuôn và mồi bắt đầu được hình thành. Liên kết này chỉ được bền vững khi mồi bắt cặp chính xác với mạch khuôn và đoạn ngắn DNA mạch đôi này là nơi DNA polymerase gắn vào và bắt đầu tổng hợp DNA. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi và thông thường khoảng 50-64oC trong thời gian 20 - 40 giây. Bước 3 (bước kéo dài): DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới bổ sung đối với DNA mạch khuôn. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ hoạt động tối ưu của DNA polymerase. Taq DNA polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu 70 - 74oC, trong hầu hết trường hợp nhiệt độ thường được dùng là 72oC. Nối hydrogen giữa đoạn mồi và DNA khuôn phải đủ bền để chịu đựng được nhiệt độ cao. Mồi đã lai với vùng DNA có nhiều base sai sẽ bị tách ra từ khuôn mẫu và không được kéo dài. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase được sử dụng và chiều dài đoạn DNA mục tiêu cần được khuếch đại. Bước kéo dài cuối cùng kéo dài khoảng 5 - 15 phút (phụ thuộc vào chiều dài mỗi đoạn DNA mẫu), chu kì cuối cùng này được dùng để chắc chắn phần còn lại của chuỗi DNA có thể được kéo dài hoàn toàn. Để kiểm tra có hay không phản ứng PCR tạo ra đoạn DNA cần khuếch đại, điện di trên gel agarose có thể được sử dụng cho sự phân tách các sản phẩm PCR. Kích thước của sản phẩm PCR được xác định bởi thang DNA, chứa đựng những đoạn DNA có kích thước đã được biết chạy dọc trên gel cùng với sản phẩm PCR. 29
  41. Đồ Án Tốt Nghiệp Các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy dưới tia UV (bước sóng 312 nm). Phương pháp PCR có độ nhạy rất cao, thao tác lại đơn giản nhưng mức độ ngoại nhiễm cao, sự kém trung thực trong quá trình tổng hợp của Taq polymerase Vì vậy, cần cẩn trọng khi tiến hành thí nghiệm cũng như phân tích kết quả. 2.2.3.3. Dùng PCR để khuếch đại đoạn gen ITS của nấm bệnh Thành phần phản ứng Mater mix 6,5 µl ITS1F 0,1 µl ITS4R 0,1 µl DNA 1 µl H2O 17,3 µl Tổng 25 µl Chu trình phản ứng PCR - Bước 1: Biến tính DNA, 94oC trong 5 phút - Bước 2: 30 chu kỳ 94oC trong 1 phút 55oC trong 30 giây 72oC trong 1 phút - Bước 3: Kết thúc, 72oC trong 10 phút - Bước 4: Bảo quản 4oC Kiểm tra kết quả PCR 30
  42. Đồ Án Tốt Nghiệp Ta sử dụng phương pháp điện di để kiểm tra mẫu PCR Các bước thực hiện - Bước 1: Đổ gel Dùng băng keo dán chặt hai đầu của khay điện di, đặt lược sẵn ở 1 đầu khay. Đặt khay ở nơi bằng phẳng, dùng miếng bọt khí để kiểm tra. Cân 0,4 g agarose cho vào bình tam giác 250 ml, thêm 50 ml nước cất. Lắc nhẹ cho agarose hòa lẫn trong nước. Đặt bình tam giác vào lò vi song đun khoảng 3 - 5 phút. Dung dich trong bình tam giác trở thành màu trắng trong. Lấy bình tam giác ra, đợi 15 phút rờ thấy vừa nóng (60oC) thì đổ nhẹ dung dịch vào khay điện di. Khoảng 45 phút thì agarose đặc lại, gel đổi thành màu trắng đục. - Bước 2: Chạy gel. Đặt khay vào bể điện di, lấy nhẹ lược ra, không làm động đến gel. Thêm dung dich đệm điện di phủ mặt gel khoảng 1 mm. Dùng pipette P100 hút 10 µl loading buffer chia thành 4 giọt trên paraffin Dùng pipette P100 hút 10 µl mẫu, trộn với 1 giọt loading buffer sau đó load vào giếng. Thêm một giếng nạp mẫu thang đối chứng có kích thước từ 500 bp - 10000 bp. Khởi động nguồn điện, chọn 80 voltage . Nhấn nút Run. DNA sẽ chạy từ cực âm sang cực dương. Do DNA mang điện tích âm (các gốc phosphate mang điện tích âm đưa ra ngoài) Sau khi DNA chạy được hơn 2/3 mẫu gel (khoảng 45 phút) thì nhấn nút stop. 31
  43. Đồ Án Tốt Nghiệp Lấy khay điện di ra. Nhuộm gel với Ethidium Bromide trong 15 phút. Xem gel dưới đèn UV. Chụp hình 2.2.3.4. Giải trình tự và định danh Công ty Nam Khoa, địa chỉ: 793/58 Trần Xuân Soạn - Phường Tân Hưng Quận 7 - Thành phố HCM - Việt Nam. Sau khi giải trình tự thì kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng để định danh loài và xây dựng cây phân loài. Chromas Pro, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và Ngân hàng gen 2.2.4. Kháng sinh đồ 2.2.4.1. Nguyên lý Kháng sinh ở trong đĩa giấy sẽ khuếch tán vào môi trường PDA có chứa các chủng nấm sợi thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của nấm sợi với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh đĩa giấy kháng sinh. 2.2.4.2. Đĩa giấy kháng sinh Sử dụng đĩa giấy kháng sinh của các hãng sản xuất có bán trên thị trường cho kỹ thuật đĩa giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch. Các đĩa giấy kháng sinh phải được bảo quản trong hộp riêng trong điều kiện khô ráo, ở trong tủ lạnh nhiệt độ 8oC hoặc -200C. Khi sử dụng xong đĩa giấy còn thừa phải được đóng kín và cất giữ trở lại tủ lạnh. 32
  44. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.2.4.3. Các bước thực hiện Chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng trong đĩa petri sau 2 - 4 ngày. Sau đó quan sát hình dạng khuẩn lạc. Cấy trãi chủng nấm trên đĩa petri. Đặt đĩa kháng sinh lên mặt môi trường đã được cấy trãi . Ủ trong điều kiện phòng thí nghiệm. Quan sát và đọc kết quả sau 72 giờ. 2.2.5. Phương pháp cảm nhiễm 2.2.5.1. Chuẩn bị - Dịch nuôi cấy nấm cảm nhiễm Các chủng nấm phân lập từ trứng bệnh đã được làm thuần trên môi trường PDA được cấy chuyển vào môi trường PDB. Ủ ở nhiệt độ phòng (28 – 300C) trong 5 ngày để tạo lượng sinh khối lớn. - Mẫu trứng sạch bệnh Mẫu trứng sạch bệnh được cung cấp từ Trại nghiên cứu thực nghiệm Thủ Đức (đơn vị trực thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II) được kiểm tra dưới kính hiển vi không có dấu hiệu nhiễm bệnh và sự phát triển bình thường của phôi. - Nước sử dụng ấp trứng Nước được sử dụng ấp trứng là nước biển có độ mặn là 30ppt, được lấy trực tiếp từ Trại nghiên cứu thực nghiệm Thủ Đức để có sự đồng nhất về độ mặn, tránh để ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường của trứng. Nước biển được hấp khử trùng trong nồi áp suất ở 121oC, 1 atm trong 20 phút. 33
  45. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.2.5.2. Bố trí thí nghiệm Trứng cá Bá Chủ đã thụ tinh không nhiễm các mầm bệnh (vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng) được bố trí thành 4 mẫu trứng thí nghiệm. - Mẫu đối chứng: trứng được ấp trong nước biển đã hấp khử trùng, không bổ sung dịch nuôi cấy nấm. - Mẫu trứng M.1.1, M.1, M.4.1 : trứng được ấp trong nước biển đã hấp khử trùng, bổ sung dịch nuôi cấy nấm. Mỗi mẫu được bố trí 20 trứng/mẫu, trứng được ấp ở nhiệt độ 280C, lắc với tốc độ 90 rpm, quan sát các mẫu mỗi 24 giờ. Các mẫu có dấu hiệu nhiễm bệnh sẽ được cố định và gửi mẫu chụp SEM để xác định sự xâm nhập của nấm vào trứng tại Viện Công nghệ Hóa học. 2.2.6. Phương pháp chụp SEM Mẫu đối chứng và mẫu trứng có dấu hiệu nhiễm bệnh sẽ được cho vào eppendorf có chứa dung dịch cố định mẫu và gửi mẫu đến Viện Công nghệ Hóa học, địa chỉ số 01 Mạc Đĩnh Chi, Phường Bến Nghé, Quận 1, Tp. Hồ Chí Minh – Việt Nam. 34
  46. Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả phân lập và làm thuần của nấm bệnh 3.1.1. Kết quả thu nhận mẫu trứng bệnh Hình 3.1. Trứng cá Bá Chủ Hình 3.2. Trứng cá Bá Chủ bị nhiễm bệnh Trứng cá Bá Chủ phát triển bình thường có màu đỏ cam (hình 3.1) sau khi nhiễm bệnh trứng chuyển sang màu trắng đục (hình 3.2), trứng dai và cứng hơn so với trứng phát triển bình thường. Các mẫu trứng bệnh được thu nhận và phân lập trên môi trường PDA có bổ sung Sodium propionate và Chloramphenycol. 35
  47. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.1.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc Từ 4 mẫu trứng nhiễm bệnh, đã phân lập, làm thuần và chọn lọc được 3 chủng nấm bệnh kí hiệu là M.1.1, M1, M.4.1. Mặt trước Mặt sau Hình 3.3. Khuẩn lạc chủng M.1.1 trên môi trường PDA ở 28oC trong 72 giờ. Chủng nấm M.1.1 được nuôi trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28oC trong thời gian 72 giờ có kích thước khuẩn lạc là 20 – 24 mm, sợi nấm màu trắng, mặt trên màu trắng ở giữa màu vàng nhạt, mặt dưới có màu vàng cam, hơi hồng, rìa khuẩn lạc có dạng răng cưa. Mặt trước Mặt sau Hình 3.4. Khuẩn lạc chủng M.1 trên môi trường PDA ở 28oC trong 72 giờ. Chủng nấm M.1 được nuôi trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28oC trong thời gian 72 giờ có kích thước khuẩn lạc là 12 – 15 mm, sợi nấm màu trắng dạng mặt nhung mịn, mặt trên màu trắng, mặt dưới ở giữa màu hơi vàng, mép mỏng. 36
  48. Đồ Án Tốt Nghiệp 24 giờ Mặt trước Mặt sau 48 giờ Hình 3.5. Khuẩn lạc chủng M.4.1 trên môi trường PDA ở 28oC Chủng nấm M.4.1 được nuôi trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28oC trong thời gian 24 giờ chủng M.4.1 phát triển nhanh và mọc tràn khắp đĩa peptri, khuẩn lạc không có hình dạng rõ rệt, màu trắng tơi như bông gòn. Sau 48 giờ, chủng M.4.1 sinh bào tử có màu vàng cam. Dựa vào hình thái học của khuẩn lạc trên môi trường PDA cho thấy chủng M.1.1 có khả năng thuộc chi Fusarium, chủng M.1 thuộc chi Lecanicillium và chủng M.4.1 thuộc chi Neurospora. Và tiếp tục khảo sát quá trình hình thành sợi khuẩn ty và bào tử của các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1. 37
  49. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.1.3. Kết quả quan sát sợi khuẩn ty và bào tử a b c d Hình 3.6. Sợi khuẩn ty và sự hình thành bào tử của chủng M.1.1 (40X) a,b: sợi khuẩn ty c,d: sự hình thành bào tử Dựa vào hình ảnh sự hình thành sợi khuẩn ty (hình 3.6) của chủng M.1.1 cho thấy sợi có dạng phân nhánh (hình 3.6a), hình thành vách ngăn( hình 3.6b) và tạo tế bào phân đốt (hình 3.6d) cuống bào tử đính hình thành cấu trúc bó sợi và bào tử hơi cong với một tế bào đỉnh nhọn và một tế bào hình chân từ thể bình đơn (hình 3.6c). Kết hợp với hình thái khuẩn lạc (hình 3.3) cho phép kết luận sơ bộ về chủng M.1.1 có thể thuộc chi Fusarium. 38
  50. Đồ Án Tốt Nghiệp a b c d Hình 3.7. Sợi khuẩn ty và sự hình thành bào tử của chủng M.1 (100X) a,b,c: sợi khuẩn ty d: sự hình thành bào tử Chủng M.1 cũng có dạng sợi phân nhánh và có sự hình thành vách ngăn (hình 3.7b) và tạo tế bào phân đốt (hình 3.7d). Kết hợp với hình thái khuẩn lạc (hình 3.4) cho phép kết luận sơ bộ về chủng M.1 có thể thuộc vào chi Lecanicillium. Chủng M.4.1 cũng có dạng sợi phân nhánh (hình 3.8a) và có sự hình thành vách ngăn (hình 3.7b,c) và tạo bảo tử (hình 3.7d). Kết hợp với hình thái khuẩn lạc (hình 3.5) cho phép kết luận sơ bộ về chủng M.4.1 có thể thuộc vào chi Neurospora. 39
  51. Đồ Án Tốt Nghiệp a b c d Hình 3.8. Sợi khuẩn ty và bào tử của chủng M.4.1 (100X). a,b,c: sợi khuẩn ty d: bào tử Qua các kết quả sơ bộ về hình thái học khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử của các chủng nấm gây bệnh được phân lập từ trứng cá Bá Chủ, tiếp tục định danh ở mức độ phân tử dựa vào vùng gen ITS với cặp mồi ITS1F và ITS4R. 3.2. Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS Sau khi phân lập và quan sát các đặc điểm hình thái học, các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 được tăng sinh trong môi trường PDB để thu sinh khối và sau đó tiến hành quá trình ly trích và thu nhận DNA bộ gen. 40
  52. Đồ Án Tốt Nghiệp Quá trình định danh bao gồm các bước tách chiết DNA, khuếch đại đoạn DNA bằng phản ứng PCR, điện di kiểm tra sản phẩm PCR, giải trình tự gen và so sánh đoạn trình tự với trình tự gen của các loài cơ sở dữ liệu. NCBI. 3.2.1. Kết quả ly trích, thu nhận bộ gen DNA M.1.1 M.1 M.4.1 Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gen DNA của 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 trên gel agarose 1%. Từ hình 3.9 cho thấy kết quả ly trích bộ gen DNA của 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 đều tốt. Từ đó, tiếp tục sử dụng sản phẩm ly trích dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen ITS. 3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS Đoạn gen bảo tồn ITS của các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 được nhân bản với cặp mồi ITS1F và ITS4R bằng kĩ thuật PCR. Từ hình 3.10 cho thấy kết quả điện đi của sản phẩm PCR đều có các vạch nằm tương đương ở vị trí khoảng 500 - 600 bp. Sản phẩm PCR được gửi đi công ty Nam Khoa để giải trình tự. 41
  53. Đồ Án Tốt Nghiệp M.1.1 M.1 M.4.1 Thang 500-600 bp Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 trên gel agarose 1%. 3.3. Kết quả so sánh vùng gen ITS của 3 chủng M.1.1, M.1, M.4.1 và thiết lập cây phát sinh loài dựa trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI Sau khi gửi sản phẩm PCR để giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa thì kết quả được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng như phần mềm ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và Ngân hàng gen dựng cây phát sinh loài. 3.3.1. Trình tự vùng gen ITS của các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 ChủngM.1.1:TCTCCTACGGATACGGTCGGTGGACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTG TGAACATACCTAAACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACT CTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGAT GAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC CCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAAC CCGCGTTCCCCAAATCGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGC GGCCACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA AGCGGAGGAA ChủngM.1:GCTTCGATTCTACGATCGGTGGACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCTTATGT GAACATACCAATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGTGTCCGGCAGGCCCTCGCGGCCGGCCGCGACCCGGATCCAGGC GGACGCCGGAGACCATCCAAAAACTCTTTGTATTTTAGCAAGTCTTCTGAATGAGCCGCAAGGCAACACAAATGAATCAA AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAT TCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAAC CCTCGAGCTCCCTTTGGGGAGCCCGGCGTTGGGGACCGGCCTCTACCGCCGGCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGC 42
  54. Đồ Án Tốt Nghiệp GGCGACCTCTGCGTAGTAACTCACCTCGCACCGGAACCCCGACGTGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAACGTT GACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAA ChủngM.4.1:CTCACGACTCTACCGATTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACAGAGTTGCAAAACTCCCACAAACC ATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGGAAAGGCCCTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTCT CCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACTAAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAATA AGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTG CAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCAT TTCAACCATCAAGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCA CACCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGTTGACCTC GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA 3.3.2. Thiết lập cây phát sinh loài Hình 3.11. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS các chủng M.1.1, M.1, M.4.1 với các chủng nấm trên ngân hàng gen NCBI. Tiến hành so sánh vùng gen của các mẫu phân lập được với vùng gen bảo tồn ITS của các chủng nấm sợi trên ngân hàng gen NCBI, các đặc điểm hình thái học của các chủng tương đồng và có được kết quả như sau. Chủng M.1.1 có mối quan hệ gần nhất với loài Fusarium incarnatum KM519192.1, Penicillium expansum FJ008994.1 và Fusarium longipes 43
  55. Đồ Án Tốt Nghiệp AB820724.1 có mức độ tương đồng là 100%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng M.1.1 là loài Fusarium incarnatum Fusarium incarnatum được phân lập từ tổn thương mang của tôm sú nuôi (Penaeus monodon), mỗi vụ thu hoạch trong thời gian 2000 - 2002 tại tỉnh Nghệ An, Việt Nam. Tôm bị nhiễm bệnh cho thấy dấu hiệu điển hình của bệnh mang đen và tỷ lệ chết khoảng một tháng trước khi thu hoạch [10]. Chủng M.1 có mối quan hệ gần nhất với loài Lecanicillium fusisporum KF766521.1 và Lecanicillium tenuipes JN036556.1 với mức độ tương đồng là 100%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và các nghiên cứu về đặc điểm hình thái thì chủng M.1 là loài Lecanicillium tenuipes. Lecanicillium tenuipes được phân lập từ 0,82% xác B. Piniaria được tìm thấy trong đất và được phân loại như là một nấm keratinophylic. Nó có thể gây ra một số bệnh hại cây trồng. L. tenuipes được tuyên bố hoạt động chitinolytic do đó nó có thể được kết hợp với côn trùng hoặc tuyến trùng trong đất [8]. Chủng M.4.1 có mối quan hệ gần nhất với loài Neurospora Crassa FJ360521.1, Neurospora pannonica KF881757.1 và Neurospora tetrasperma FJ904922.1 với mức độ gen tương đồng là 99%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng M.4.1 là loài Neurospora Crassa Các báo cáo được công bố đầu tiên của loại nấm này là từ một sự phá hoại của các tiệm bánh Pháp vào năm 1843 [24]. N. crassa có thể hoạt động không chỉ như là một thực vật ký sinh mà còn là một tác nhân gây bệnh trên cây thông Scots, khi cây chủ đã được phát triển trên môi trường thạch nước hoặc trong các môi trường có kiểm soát trong nhà kính. Nhiễm trùng với N. crassa kích thích các triệu chứng bệnh điển hình, cuối cùng gây ra cái chết của cây thông Scots [12]. 44
  56. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.4. Kết quả độ nhạy cảm của các chủng nấm với kháng sinh Trong phương pháp sử dụng các đĩa giấy có tẩm kháng sinh. Sau khi cấy trải các chủng nấm sợi trên môi trường PDA đặt các đĩa giấy kháng sinh lên bề mặt môi trường và ủ trong 72 giờ ở nhiệt độ phòng. Kháng sinh ở trong các đĩa giấy sẽ khuếch tán vào thạch PDA có chứa các chủng nấm sợi thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của các chủng nấm sợi thể hiện bằng đường kính các vòng xung quanh đĩa giấy kháng sinh. Bảng 3.1. Kết quả độ nhạy cảm của chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 với kháng sinh Chủng Kháng sinh kháng khuẩn Kháng sinh kháng nấm Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau M.1.1 M.1 M.4.1 Dựa vào bảng 3.2 và thí nghiệm được thực hiện với các đĩa giấy tẩm kháng sinh cho thấy, đối với 5 loại kháng sinh Ampiciline (Am), Chloramphenicol (Cl), Penicilin (Pn), Streptomycin (Sm) và Tetracycline (Te) thì hầu như không có tác dụng với các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1. 45
  57. Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 3.2. Kích thước đường kính vòng kháng khuẩn và kháng nấm sau 72 giờ. Kích thước đường kính (mm) Chủng Kháng sinh kháng khuẩn Kháng sinh kháng nấm Am Cl Pn Sm Te AMB AFY KCA NY M.1.1 0 0 0 0 0 13 0 13 18 M.1 0 0 0 0 0 0 0 0 17 M.4.1 0 0 0 0 0 14 0 14 30 Đối với kháng sinh Amphotericin (AMB), 2 chủng M.1.1 (Fusarium incarnatum) và M.4.1 (Neurospora crassa) có tính nhạy cảm. Với kháng sinh Flucytosin (AFY), hầu như không có tính kháng với các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1. Còn với kháng sinh Ketoconozole (KCA) chủng M.1.1 (Fusarium incarnatum) và M.4.1 (Neurospora crassa) có tính nhạy cảm. Cuối cùng với kháng sinh Nystatin (NY) là thuốc kháng nấm polyene có tính kháng mạnh với chủng M.4.1, kháng yếu với chủng M.1.1 (Fusarium incarnatum) và chủng M.1 (Lecanicillium tenuipes). Thí nghiệm chủ yếu khảo sát tính nhạy cảm với tính kháng của các chủng nấm đã định danh với một số loại kháng sinh kháng khuẩn và kháng sinh kháng nấm phổ biến trong nuôi trồng thủy sản, từ đó rút ra cơ sở để đưa ra các nghiên cứu các thuốc kháng sinh để trị các bệnh do nấm bệnh này gây ra, ức chế hoặc tiêu diệt nấm bệnh. 3.5. Kết quả hình ảnh quá trình lây nhiễm giữa nấm và trứng cá bằng kĩ thuật SEM Trứng cá Bá Chủ được ấp ở nhiệt độ 280C, lắc với tốc độ 90 rpm, quan sát cách mẫu mỗi 24 giờ. Khi trứng có dấu hiệu nhiễm bệnh, đem trứng quan sát dưới kính hiển vi quang học. 46
  58. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.5.1. Kết quả hình ảnh lây nhiễm dưới kính hiển vi quang học Mẫu trứng đã được cảm nhiễm chủng M.4.1 sau 48 giờ: trứng có màu trắng đục, có độ dai và cứng hơn so với mẫu đối chứng. Hình 3.12. Kết quả mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.4.1 dưới kính hiển vi quang học (100X). Kết quả hình 3.12 cho thấy mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.4.1 có sự hiện diện của sợi nấm chằng chịt trong trứng. Mẫu đối chứng: sau 48 giờ trứng không có hiện tượng bị nhiễm bệnh, trứng vẫn phát triển bình thường. 47
  59. Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.13. Kết quả mẫu đối chứng dưới kính hiển vi quang học (100X). Kết quả quan sát dưới kính hiển vi quang học (hình 3.13) cho thấy không phát hiện có sự hiện diện của sợi nấm trong trứng. Mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1.1: quan sát sau 48 giờ không có hiện tượng trứng bị nhiễm bệnh, trứng vẫn phát triển bình thường. Hình 3.14. Kết quả mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1.1 dưới kính hiển vi quang học (100X). Kết quả quan sát dưới kính hiển vi quang học (hình 3.14) cho thấy không phát hiện có sự hiện diện của sợi nấm trong trứng. Mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1: quan sát sau 48 giờ không có hiện tượng trứng bị nhiễm bệnh, trứng vẫn phát triển bình thường. 48
  60. Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.15. Kết quả mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1 dưới kính hiển vi quang học (100X). Kết quả quan sát dưới kính hiển vi quang học (hình 3.15) cho thấy không phát hiện có sự hiện diện của sợi nấm trong trứng. Mẫu trứng cảm nhiễm có dấu hiệu nhiễm bệnh, từ màu đỏ cam chuyển dần sang màu trắng đục, cứng và dai hơn. Trứng chết được cố định và gửi đi chụp bằng kĩ thuật SEM. 3.5.2. Kết quả hình ảnh quá trình lây nhiễm bằng kĩ thuật SEM Hình 3.16. Bề mặt trứng mẫu đối chứng chụp bằng SEM. Kết quả chụp SEM bề mặt mẫu đối chứng (hình 3.16) không có dấu hiệu nhiễm của sợi nấm. 49
  61. Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.17. Bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 chụp bằng SEM (100X và 500X) Kết quả chụp SEM bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 cho thấy vùng không nhiễm với độ phân giải 100X (hình 3.17a) và 500X (hình 3.17b). Hình 3.18. Bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 chụp bằng SEM (500X và 1000X) Kết quả chụp SEM bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 cho thấy sự thay đổi từ vùng không nhiễm sang vùng nhiễm nấm với độ phân giải 500X (hình 3.18a) và vùng nhiễm nấm với độ phân giải 1000X (hình 3.18b) so sánh với bề mặt trứng mẫu đối chứng (hình 3.16) cho thấy sự xâm nhiễm của chủng M.4.1 trên trứng. 50
  62. Đồ Án Tốt Nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Từ 4 mẫu trứng cá Bá Chủ bị nhiễm bệnh đã phân lập, làm thuần và chọn lọc được 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1.Kết quả hình thái học của khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử cho thấy rằng chủng M.1.1 có khả năng thuộc chi Fusarium, chủng M.1 thuộc chi Lecanicillium và chủng M.4.1 thuộc chi Neurospora. Dựa vào kết quả thu nhận bộ gen DNA và nhân bản vùng bảo tồn ITS của 3 chủng M.1.1, M 1 và M.4.1 cùng với so sánh các dữ liệu gen của các chủng trên ngân hàng gen NCBI cho kết quả là: chủng M.1.1 có mức độ tương đồng với loài Fusarium incarnatum là 100%, chủng M.1 có mức độ tương đồng với loài Lecanicillium tenuipes là 100% và tương tự chủng M.4.1 với loài Neurospora crassa là 99%. Kết quả cảm nhiễm của 3 chủng nấm với trứng cá Bá Chủ từ những hình ảnh kính hiển vi quang học và kĩ thuật SEM cho thấy rằng chủng Neurospora crassa có khả năng xâm nhiễm vào trứng cá Bá Chủ gây hỏng trứng trong quá trình ấp. Tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của các kháng sinh trên 3 chủng trên cho kết quả là: 5 loại kháng sinh kháng khuẩn Ampiciline (Am), Chloramphenicol (Cl), Penicilin (Pn), Streptomycin (Sm) và Tetracycline (Te) thì không có tác dụng với các loại nấm bệnh được định danh ở trên. Kháng sinh kháng nấm Amphotericin (AMB), Ketoconazole (KCA) và Nystatin (NY) đều có tác dụng khá tốt đối với chủng M.4.1 (Neurospora crassa), đặc biệt kháng tốt nhất là Nystatin (NY). Từ các kết quả thu được cho thấy nấm Neurospora crassa có khả năng gây bệnh và làm hỏng trứng cá Bá Chủ. 2. Kiến nghị Khảo sát các đặc tính sinh lý, sinh hóa của nấm Neurospora crassa. 51
  63. Đồ Án Tốt Nghiệp Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sự lây nhiễm giữa nấm Neurospora crassa và trứng cá Bá Chủ nhằm tăng hiệu suất trứng nở. Cần khảo sát thêm các loại kháng sinh. 52
  64. Đồ Án Tốt Nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Ts. Phạm Minh Đức, Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Tuấn, 2010. Tổng quan bệnh nấm ở động vậy thủy sản. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số 16b: 88-97. [2] Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Bùi Quang Tề và Đỗ Thị Muội, 2004. Giáo trình Bệnh học thủy sản. Đại học Thủy sản Nha Trang, 2004, NXB Nông Nghiệp, Thành phố HCM. [3] Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. 2005. Giáo trình bệnh học thủy sản. Đại học Cần Thơ. Trang 73 [4] Võ Minh Sơn (2013). Nghiên cứu ứng dụng qui trình sản xuất giống cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni Koumans, 1933) tại Việt Nam. Tài liệu tiếng Anh [5] AHFS DRUG INFORMATION 2006 (2006 ed.). American Society of HealthSystem Pharmacists. 2006. [6] "Aspergillus sydowii (Bainier & Sartory) Thom & Church 1926". MycoBank. International Mycological Association. Retrieved 2012-10-10. [7] Cites (2007). Convention on international trade in endangered species of wild fauna và flora. Fourteenth meeting of the Conference of the Parties The Hague (N etherlvàs), 3-15 June 2007. CoP14 Prop. 19. [8] Dalė Pečiulytė, Irena Nedveckytė, Vaidilutė Dirginčiūtė-Volodkienė, Vincas Būda (2010). Pine defoliator Bupalus piniaria L. (Lepidoptera: Geometridae) and its entomopathogenic fungi. EKOLOGIJA. Vol. 56. No. 1–2. P. 34–40 [9] Guarro Josep, Gené Josepa, and Stchigel Alberto M., 1999. Developments in fungal taxonomy. Clinical Microbiology Reviews Vol. 12, No. 3, p. 454-500 53
  65. Đồ Án Tốt Nghiệp [10] Khoa, L. V., K. Hatai, và T. Aoki. 2004. Fusarium incarnatum isolated from black tiger shrimp Penaeus monodon Fabricius, with black gill disease cultured in Vietnam. Journal of Fish Diseases 27: 507-515. [11] Handwerk, Brian (May 6, 2005) Egypt's "King Tut Curse" Caused by Tomb Toxins_National Geographic. [12] Hsiao-Che Kuo, Sun Hui, Jaeyoung Choi, Frederick O. Asiegbu, Jari P. T. Valkonen and Yong-Hwan Lee (2014). Secret lifestyles of Neurospora crassa. Scientific Reports 4, Article number: 5135 doi:10.1038/srep05135 [13] M M Songe, A Willems, J Wiik-Nielsen, E Thoen, Ø Evensen, P van West and I Skaar (2015), Saprolegnia diclina IIIA and S. parasitica employ different infection strategies when colonizing eggs of Atlantic salmon, Salmo salar L, Journal of Fish Diseases, doi:10.1111/jfd.12368 [14] Núria Cortadellas, Eva Fernández, and Almudena Garcia, Biomedical and Biological Applications of Scanning Electron Microscopy, Handbook of instrumental techniques from CCiTUB. [15] Petri WA in Brunton LL, Chabner BA, Knollmann BC (eds.) (2011 ) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th ed., Chapter 53. McGraw-Hill, New York [16] Singh B, Mitchison DA (16 January 1954). Bactericidal Activity of Streptomycin and Isoniazid Against Tubercle Bacilli. British Medical Journal 1 (4854): 130 – 132.doi:10.1136/bmj.1.4854.130. PMC 2084433. PMID 13106497. [17] T. R. Prabha, K. Revathi1, M. S. Vinod, S. P. Shanthakumar and Paul Bernard, 2013. A simple method for total genomic DNA extraction from water moulds. Current science. 104(3): 345-346. 54
  66. Đồ Án Tốt Nghiệp [18] Vagelli, A. (2007). Synopsis of the biology và conservation status of the Banggai cardinalfish Pterapogon kauderni. Presentation given by Dr Alejvàro Vagelli to the Indonesian CITES Authorities, Jakarta, 24 May 2007. [19] Vagelli, A. A. (2011). The Banggai Cardinalfish: Natural History, Conservation, và Culture of Pterapogon kauderni. Wiley, Hoboken. [20] Yanong, R. P. E. 2003. Fungal diseases of fish. Vet Clin Exot Anim. 6: 377– 400. Tài liệu từ Internet [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] dempsey [30] 55
  67. Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường Môi trường nuôi cấy : PDA (Potato Dextrose Agar) Dịch chiết khoai tây 20% Dextrose 2% Agar 2% Chloramphenycol 100 mg Sodium propionate 2 g pH 5.6 H2O 1000 ml 1
  68. Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC B: Kết quả trình tự vùng gen bảo tồn ITS Chủng M.1.1 2
  69. Đồ Án Tốt Nghiệp Chủng M.1 3
  70. Đồ Án Tốt Nghiệp Chủng M.4.1 4
  71. Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC C: Kết quả trình tự vùng gen của các chủng so sánh trên NCBI Lecanicillium fusisporum KF766521.1 CAACTCCCAAACCCTTATGTGAACATACCAATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGTGTCCGGCAGGCCC TCGCGGCCGGCCGCGACCCGGATCCAGGCGGACGCCGGAGACCATCCAAAAACTCTTTGTATTTTAGCAAG TCTTCTGAATGAGCCGCAAGGCAACACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCTCCCTT TGGGGAGCCCGGCGTTGGGGACCGGCCTCTACCGCCGGCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCG ACCTCTGCGTAGTAACTCACCTCGCACCGGAACCCCGACGTGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTTCTGA ACGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATC Lecanicillium tenuipes JN036556.1 CAACTCCCAAACCCTTATGTGAACATACCAATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGTGTCCGGCAGGCCC TCGCGGCCGGCCGCGACCCGGATCCAGGCGGACGCCGGAGACCATCCAAAAACTCTTTGTATTTTAGCAAG TCTTCTGAATGAGCCGCAAGGCAACACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCTCCCTT TGGGGAGCCCGGCGTTGGGGACCGGCCTCTACCGCCGGCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCG ACCTCTGCGTAGTAACTCACCTCGCACCGGAACCCCGACGTGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTTCTGA ACG-TGACCTCGAATCAGG Fusarium incarnatum KM519192.1 CAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGA CGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGT TCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGAT TGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCC GTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA AGCGGAGGAA Penicillium expansum FJ008994.1 CAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGA CGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGT 5
  72. Đồ Án Tốt Nghiệp TCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGAT TGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCC GTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA AGCGGAGGA Fusarium longipes AB820724.1 CAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAAAGGGA CGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGT TCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGAT TGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCC GTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA AGCGGAGGAA Neurospora tetrasperma FJ904922.1 CAGAGTTGCAAAACTCCCACAAACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGA AAGGCCCTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTCTCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACT AAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG AATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCATCA AGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGCCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCACA CCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGT TGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA Neurospora crassa FJ360521.1 CAGAGTTGCAAAACTCCCACAAACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGA AAGGCCTTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTCTCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACT AAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG AATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCATCA AGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCACA CCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGT TGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA Neurospora pannonica KF881757.1 CAGAGTTGCAAAACTCCCACAAACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGA AAGGCCCTCGGGTCCTCCCGGATCCTCGGGTCTCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACT AAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG 6
  73. Đồ Án Tốt Nghiệp GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG AATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCATCA AGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGCCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCACA CCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGT TGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA PHỤ LỤC D: Kết quả hình ảnh kĩ thuật SEM quá trình lây nhiễm giữa nấm và trứng cá Bá Chủ 7