›

Đồ án Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh trên sản phẩm thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám

pdf 54 trang thiennha21 12/04/2022 5810
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh trên sản phẩm thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_danh_gia_cac_chi_tieu_vi_sinh_tren_san_pham_thit_bo_ta.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh trên sản phẩm thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRÊN SẢN PHẨM THỊT BÒ TẠI CHỢ HOÀNG HOA THÁM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. PHẠM MINH NHỰT Sinh viên thực hiện : VÕ THỊ HẢI YẾN MSSV: 1191111049 Lớp: 11HSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2013
  2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay vấn đề chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) đang được đặc biệt quan tâm bởi thực phẩm ngày càng trở nên mất an toàn cho người sử dụng. Thực phẩm bị nhiễm hóa chất, chất tồn dư cũng như chứa đựng các vi sinh vật gây ngộ độc đang đe dọa sức khỏe của con người. Trong đó, thịt bò là một loại thực phẩm được sử dụng phổ biến hiện nay nhờ có thành phần dinh dưỡng cao, dễ sử dụng trong chế biến các món ăn hằng ngày. Tuy nhiên, thực trạng thịt bò mất an toàn đang trở thành vấn đề đáng lo ngại do việc sử dụng thuốc thú y không đúng cách để trị bệnh cho bò đã để lại dư lượng quá mức cho phép, ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng. Nguồn nước cho ăn không đủ tiêu chuẩn có thể bị nhiễm bẩn bởi môi trường như một số kim loại nặng: chì, asen khi bò ăn vào sẽ gây tích lũy trong các mô cơ làm giảm chất lượng thịt và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Không những vậy, quá trình giết mổ không đảm bảo vệ sinh, việc vận chuyển, bày bán thịt bò không đúng quy định làm tăng khả năng lây nhiễm vi sinh vật gây bệnh vào thịt. Chính vì thế, việc đánh giá chất lượng của thịt bò sẽ giúp giảm tình trạng ngộ độc do loại thực phẩm này gây ra đối với người tiêu dùng. Trước tình hình thực tế đó, đồng thời để làm quen với việc nghiên cứu và vận dụng kiến thức đã học vào thực tiễn nên chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh trên sản phẩm thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám”. Đề tài này được thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt tại Phòng thí nghiệm, Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. 2. Mục đích Tìm hiểu nguyên nhân biến chất và hư hỏng mẫu thịt, đánh giá một số chỉ tiêu vi sinh vật trên mẫu thịt bò ở các quầy tại chợ Hoàng Hoa Thám. 1
  3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3. Mục tiêu đề tài - Khảo sát mức độ nhiễm tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC), Coliforms và E.Coli trên mẫu thịt bò lấy ở 10 quầy thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám. - Đề ra các biện pháp xử lý thích hợp cho các quầy thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám. 4. Phạm vi nghiên cứu - Tiến hành lấy mẫu thịt bò ngẫu nhiên ở 10 quầy tại chợ Hoàng Hoa Thám. - Phân tích 3 chỉ tiêu vi sinh có khả năng hiện diện trong mẫu: TPC Coliforms E.Coli - Đánh giá và ghi nhận kết quả dựa trên 3 chỉ tiêu phân tích. 2
  4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về thịt [9][10] Thịt là 1 loại có giá trị dinh dưỡng cao đối với người tiêu dùng và rất thích hợp cho sự phát triển của vsv, nhất là vi khuẩn và nấm. 1.1.1. Cấu trúc của thịt Phụ thuộc vào vai trò, chức năng thành phần hóa học mà người ta chia ra thịt thành các loại mô như sau: mô cơ, mô liên kết, mô xương, mô mỡ. - Mô cơ Đây là loại mô chiếm tỷ lệ cao nhất trong cấu tạo của thịt. Nó gồm nhiều sợi tơ cơ xếp thành bó, các sợi cơ được cấu tạo từ miozin hoặc actin, chức năng chủ yếu là thực hiện hoạt động co giãn. Thành phần hóa học của mô cơ: H2O (72 - 75%), protein (18 - 21%), còn lại các thành phần khác như: glucid, lipid, khoáng, vitamin - Mô liên kết Cũng là loại mô được phân bố rộng rãi, có vai trò liên kết với các sợi tơ cơ, các bó cơ lại với nhau tạo cấu trúc chặt chẽ cho thịt. - Mô mỡ Được tạo thành từ tế bào mỡ liên kết với nhau dưới dạng lưới xốp. Lượng mô mỡ trong cấu trúc thịt nhiều hay ít phụ thuộc vào giống loài, giới tính của nó và điều kiện môi trường. Bảng 1.1. Tỷ lệ của các mô trong thịt bò (% tính theo khối lượng thịt xẻ) Loại mô Thịt bò Mô cơ 57 - 62% Mô mỡ 3 - 16% Mô liên kết 9 - 12% Mô xương – sụn 17 - 29% Mô máu 0,8 - 1% 3
  5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tính chất của các mô và thành phần cấu tạo của các mô đều khác nhau. Do đó tùy theo đặc tính và tỷ lệ của các thành phần cấu tạo trong mỗi loại mô sẽ quyết định tính chất của thịt. Người ta thừa nhận mô mỡ và mô cơ có giá trị sử dụng cao nhất. Vì con người sử dụng thịt làm thực phẩm là để thỏa mãn nhu cầu về protein và lipid. 1.1.2. Thành phần hóa học của thịt gồm có: [10] Protid 20% Lượng lipid dao động nhiều từ 1 ÷ 30% Glucid trong thịt chỉ có rất ít. Lượng tro khoảng 1%. Độ đồng hóa protein thịt 96 ÷ 97%. Về chất khoáng thịt là nguồn phospho (116 ÷ 117mg%), kali (212 ÷ 259mg%), Fe (1,2 ÷ 2,3mg%) tập trung nhiều ở gan. Ngoài ra còn vi yếu tố Cu, Zn, Coban Lượng canxi trong thịt rất thấp (10 ÷ 15mg%). Thịt là nguồn vitamin nhóm B. - Nước Nước chiếm 50 - 75%, là thành phần hóa học phong phú nhất trong thịt, nó là thành phần quan trọng trong cơ thể động vật. Trong cơ thể động vật còn sống, nước có nhiều chức năng khác như: cần thiết cho quá trình trao đổi chất, điều chỉnh nhiệt độ, là dung môi để hòa tan các chất dinh dưỡng - Protein Giá trị dinh dưỡng của thịt chủ yếu là nguồn protein. Người ta đã tìm ra 30 acid amin trong tự nhiên, trong đó có 20 loại acid amin thường được tìm thấy trong hầu hết các protein thịt. Tất cả các acid amin không thay thế đều có thể dễ dàng tìm thấy trong mô cơ, vì vậy thịt có giá trị sinh học cao. Một nhóm khác có trong thịt là những chất cũng liên quan đến protein (nhưng không phải là protein thực sự) như purines, pyrimidines và nucleopeptides. Đây là những thành phần tan nhiều trong nước, có giá trị dinh dưỡng ít nhưng chúng là 4
  6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP những hợp chất sinh hóa có thể tồn tại trong dịch tiêu hóa. Chúng tạo cho thịt có màu và mùi đặc trưng. Ngoài ra trong thành phần của protein có myosin, actin, tropmyozin đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên những đặc tính chức năng của thịt. - Muối khoáng, vitamin. Ngoài ra, trong thành phần hóa học còn có muối khoáng, vitamin, các nguyên tố đa lượng như Ca, Fe, Mg, Na ảnh hưởng lớn đến tính chất keo của các protein của tế bào, duy trì những hoạt động bình thường của quá trình sống và cân bằng áp suất thẩm thấu trong tế bào và mô. Những yếu tố này có vai trò rất quan trọng trong sự teo cơ, hồi phục cơ trong suốt quá trình sống và trong bắp cơ sau khi chết, chúng có ảnh hưởng rất lớn đến tính chất mềm của thịt và khả năng giữ nước của thịt. Bảng 1.2. Thành phần các chất dinh dưỡng của thịt Chất dinh dưỡng Thịt bò loại 1 Nước (%) 70,5 Protein (%) 18 Lipid (%) 10,5 Canxi (%) 10 Phospho (mg%) 191 Sắt (mg%) 2,7 Vitamin A (mg%) 0,01 Vitamin B1 (mg%) 0,17 Vitamin B2 (mg%) 0,17 Vitamin PP (mg%) 4,22 Vitamin C (mg%) 1 1.1.3. Tính chất vật lý của thịt [1] Tính chất vật lý của thịt cũng là một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượng của thịt. 5
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Màu sắc của thịt Màu sắc của thịt là do màu sắc của cơ thịt và chất béo quyết định. Nó không chỉ do giống loài, giới tính, tuổi, trạng thái trước lúc giết mổ gia súc và tình hình chế biến (cắt tiết, ướp lạnh, đông kết, nóng chảy, ) quyết định mà còn chịu ảnh hưởng của quá trình chín hóa học và thối rửa. Màu sắc của tổ chức cơ thịt đầu tiên là do lượng hemoglobin và myoglobin của tổ chức cơ thịt quyết định. Chất béo trong cơ thịt và hàm lượng của tổ chức liên kết cũng là nhân tố ảnh hưởng đến màu sắc của thịt. Cơ thịt có nhiều chất béo thì màu của nó là màu hoa quỳ nhạt, nếu lượng tổ chức liên kết nhiều thì có màu hồng sẫm và hơi xanh nhạt. Có nhiều nguyên nhân đột ngột làm cho màu sắc của thịt thay đổi. Thí dụ khi ướp lạnh thì màu sắc mặt ngoài của thịt hầu như không biến đổi nhưng nếu cắt thịt ra thì phía trong thường có màu hồng nhạt hay màu tro. Thịt giải đông và ướp đông hai lần có màu hồng sẫm, thịt qua nhiều lần cấp đông và giải đông thì màu sắc không đồng đều, lúc đó thịt có màu anh đào sẫm. Thịt đã thối rửa hoặc sắp thối rửa thì có màu vàng hoặc màu tro, màu lục tối hoặc màu tro đen. - Mùi vị của thịt Mùi vị của thịt các loài động vật khác nhau tùy theo lượng acid béo bay hơi có trong cơ thịt. Ví dụ cho thịt vào trong dung dịch acid sulfuric nấu sôi thì mùi vị đó bốc lên rất rõ. Tính chất và số lượng của acid béo trong cơ thịt phụ thuộc vào giống loài, tình hình chăn nuôi vỗ béo, giới tính, độ tuổi, của động vật. Nếu súc vật trước khi giết mổ đem nuôi ở chuồng có mùi đặc biệt hoặc cho ăn thức ăn có mùi, khi làm thịt thì thịt của nó cũng có thể có mùi vị như vậy. Thí dụ: động vật trước khi giết mổ cho uống thuốc thì thịt của nó cũng có mùi thuốc. Vì những chất gây nên mùi vị là những chất béo có tính bay hơi do đó thịt súc vật có mùi vị đặc biệt, nếu được để ở nơi thông gió với điều kiện bảo quản tốt thì mùi vị hắc nặng sẽ được giảm bớt. - Độ mềm của thịt (độ vững chắc) 6
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Độ mềm của thịt phụ thuộc vào các nhân tố của động vật khi sống và sau khi giết. Những nhân tố khi sống gồm có: loài, giống, giới tính, tuổi và trạng thái con vật trước lúc giết. Ngoài ra, trạng thái về số lượng và tính chất của mô liên kết, kích thước các bó cơ và đường kính của sợi cơ Cấu trúc mô cơ là chỉ tiêu liên quan mật thiết với độ mềm của thịt. Cấu trúc mềm mịn, thịt càng mềm mại. 1.2. Các dạng hư hỏng của thịt [10][11] Thịt là môi trường giàu thức ăn cho nhiều loài vi sinh vật vì trong thịt có nhiều nước, giàu chất dinh dưỡng nhất là protein, muối khoáng, chất kích thích tăng trưởng Vì vậy, thịt trong quá trình bảo quản có thể bị biến chất và hư hỏng. Thịt tươi là thịt mới chưa biến chất, nhưng giữ thịt lâu chưa kịp tiêu thụ hoặc cất giữ ở những điều kiện không thích hợp sẽ bị biến chất bởi các enzyme có sẵn trong thịt và vi sinh vật, dẫn tới ôi thiu hư hỏng về trạng thái cảm quan, hình thành những chất có hại. Những hiện tượng hư hỏng của thịt thường gặp là: nhớt (nhầy), thối rửa, lên men chua, biến đổi sắc tố, phát sáng, có các chấm màu trên bề mặt và mùi mốc, còn bị ôi do sự biến đổi mỡ có trong thịt. 1.2.1. Sinh nhớt Thường xuất hiện trên bề mặt thịt ướp lạnh ở các buồng có độ ẩm không khí tương đối cao hơn 90%. Đây là giai đoạn đầu của sự hư hỏng. Trên bề mặt thịt hình thành một lớp dày đặc gồm có nhiều vi khuẩn khác nhau: E.Coli, Streptococcus liquefaciens, Bacillus subtilis Tốc độ sinh nhớt còn phụ thuộc vào độ ẩm không khí, nhiệt độ bảo quản. Nhiệt độ thích hợp cho bảo quản thịt là 0 - 20C và độ ẩm tương đối của không khí là 85 - 90%. Ở điều kiện này thịt không có các dấu hiệu hư hỏng trong 3 tuần lễ. 1.2.2. Thịt bị lên men chua Do vi khuẩn lactic, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn gây thối hoặc các enzyme có sẵn trong thịt phân hủy tạo ra mà không có sự tham gia của vi sinh vật. Trong thịt có càng nhiều glycogen thì càng dễ bị chua. 7
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong quá trình lên men chua, các sản phẩm lên men thường là các acid hữu cơ, ban đầu các acid này ức chế các vi khuẩn gây thối rữa phát triển làm cho pH của thịt giảm. Sản phẩm của quá trình là các acid: formic, acetic, butyric, lactic thịt bị chua có màu xám và mùi khó chịu. Môi trường acid kìm hãm vi sinh vật gây thối phát triển, song ở môi trường này nấm mốc mọc rất tốt và tạo thành amoniac và các bazơ nitric làm cho môi trường trung tính, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối phát triển (trong đó có Proteus, Bacillus subtilis). Vì vậy, lên men chua là thời kỳ trước của quá trình thối rữa. 1.2.3. Sự thối rữa thịt Vi khuẩn gây thối rữa phát triển và hoạt động mạnh trên bề mặt thịt. Những vi khuẩn này có hoạt tính proteinase cao, chính chúng tiết ra enzyme proteinase làm phân giải protein tới các sản phẩm có mùi hôi thối như NH3. Do các vi sinh vật hiếu khí cũng như kỵ khí phát triển sinh ra các enzyme protease phân giải protein. Thịt các gia súc bị bệnh hoặc gầy yếu dễ bị thối rữa. Những thịt này ít glycogen, trong thời gian thuần thục của thịt, acid lactic trong thịt ít được tạo thành vì ít glycogen, cho nên khó kìm hãm được các vi sinh vật gây thối phát triển. Còn trong thịt có nhiều glycogen thì acid lactic dễ được tạo thành trong quá trình bảo quản và môi trường acid lại ức chế vi khuẩn gây thối rữa phát triển. Bảng 1.3. Bảng quy định đánh giá chất lượng thịt Chất lượng thịt pH của thịt Số lượng vsv trong thịt Thịt tươi 5,9 ÷ 6,5 Một vài cầu khuẩn, không có cầu khuẩn Thịt kém chất lượng 6,6 20-30 cầu khuẩn, một vài trực khuẩn Thịt ươn 6,7 Dày đặc cả trực khuẩn và cầu khuẩn 8
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.4. Sự biến màu của thịt Dưới tác dụng của các vi khuẩn hô hấp hiếu khí, trên bề mặt thịt sẽ xuất hiện các vết màu khác nhau dưới tác dụng của các vi khuẩn khác nhau. Màu của thịt trong quá trình bảo quản có thể chuyển từ đỏ biến thành màu xám, nâu hoặc xanh lục do các vi khuẩn hiếu khí phát triển trên bề mặt. Khi mỡ bị ôi và xuất hiện peroxide, thì màu vàng sẽ biến thành màu xám tối và sau đó trở nên tím nhạt, xanh. Nếu thịt vẫn có mùi bình thường và không tìm thấy các độc tố, thì sau khi tẩy sạch các vết màu, vẫn có thể sử dụng bình thường. 1.2.5. Sự phát quang của thịt Do các vi khuẩn Photobacterium phát triển trên bề mặt thịt gây ra. Đặc biệt là khi bảo quản thịt chung với cá dễ sinh hiện tượng này. Trong thịt thối rữa không phát quang. 1.2.6. Thịt mốc Do các Mucor và Aspergillus phát triển trên thịt, làm cho thịt giảm tuyệt đối các chất hòa tan, tăng tính kiềm, làm xảy ra quá trình phân hủy protein và các chất béo tạo acid bay hơi. Mốc mọc trên bề mặt của thịt và ăn sâu vào trong tới 2 - 5mm, sau đó phát triển các nhánh sinh bào tử và làm cho thịt có mùi mốc, nhớt dính, biến màu; không nên bảo quản và vận chuyển thịt mốc. 1.2.7. Thịt bị ôi do sự biến đổi mỡ có trong thịt Vi khuẩn phân giải mỡ thúc đẩy quá trình oxi hóa của mỡ. Mỡ bị oxi hóa do tác dụng đồng thời của ánh sáng và không khí. Một số chất béo bị ôi sau khi bị thủy phân. Các vi khuẩn Pseudomonas, Achromobacter và một số nấm men tác dụng làm cho mỡ bị ôi. 1.3. Các phương pháp bảo quản thịt [11] 1.3.1. Bảo quản ở nhiệt độ thấp Bảo quản lạnh: sử dụng nhiệt độ thấp để ức chế, hạn chế vi sinh vật gây hại phát triển và thịt vẫn giữ nguyên trạng thái, tính chất ban đầu. Ví dụ ở nhiệt độ 0 - 20C, ẩm độ 85 - 90% bảo quản thịt bò được 20 ngày. Tuy nhiên có những loại vi 9
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP khuẩn ưa lạnh còn sống sót sẽ gây hư hỏng thịt như: Pseudomonas, Lactobacillus, Micrococcus. Bảo quản đông lạnh: bảo quản thịt ở nhiệt độ từ -20 ÷ -180C, bảo quản bằng phương pháp này thì thời gian bảo quản lâu và có thể kìm hãm gần hết vi sinh vật gây hại, vi sinh vật ưa lạnh cũng giảm đáng kể. Chỉ còn dạng bào tử của vi khuẩn chịu lạnh. Thời gian bảo quản lâu nhưng hạn chế là làm thay đổi chất lượng thịt. Khi sử dụng cần phải phá đá nên làm thành tế bào bị vỡ ra và chất dinh dưỡng sẽ theo nước ra ngoài. Đặc biệt là không bảo quản đông lạnh hai lần, nếu bảo quản lần hai thì bào tử vi sinh vật chịu lạnh đã thích ứng và phát triển thành vi sinh vật sẽ gây hư hỏng thịt. 1.3.2. Muối thịt Dùng muối có nồng độ cao để hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây hư hỏng. Nồng độ muối cao làm cho nước từ trong tế bào vi sinh vật ra ngoài (do sự chênh lệch nồng độ) dẫn đến hiện tượng co nguyên sinh, vi sinh vật mất nước và chết. Tuy nhiên nấm mốc và vi khuẩn gây bệnh cũng không chết. Khi muối thịt phải bổ sung thêm NaNO3, đường saccharose làm cho sản phẩm thịt có màu tươi và mềm. Ngoài ra, việc bổ sung thêm đường sẽ làm cho vi khuẩn lactic phát triển tạo thành một lượng acid lactic nhỏ làm độ pH giảm nên sẽ ức chế vi khuẩn gây thối rữa phát triển. 1.3.3. Sấy khô Sấy khô: làm giảm độ ẩm của sản phẩm thịt bằng nhiệt độ sẽ hạn chế sự phát triển của vi sinh vật hay làm chết vi sinh vật. Một số vi sinh vật sẽ chuyển sang dạng bào tử. Nếu để sản phẩm thịt hút nước thì bào tử sẽ phát triển thành vi sinh vật và gây hư hỏng thịt. Vì vậy để bảo quản tốt thịt cần kết hợp giữa sấy khô và muối sơ bộ. Xông khói: làm cho một phần nước mất đi, ngoài ra trong khói có chất sát khuẩn là aldehyde formic nên thời gian bảo quản lâu hơn. Ta nên kết hợp muối sơ bộ và xông khói. 10
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.3.4. Đóng hộp Nhiệt độ cao làm cho 90% vi sinh vật chết đi, bào tử cũng bị chết. Thường sử dụng nhiệt độ cao để khử trùng vi sinh vật từ 115 - 1210C trong khoảng thời gian từ 45 - 60 phút. Sau đó kiểm tra bằng cách giữ ở 370C trong vòng 7 ngày nếu hộp nào bị phồng lên thì ta loại ra. Một trong những loài vi sinh vật chịu nhiệt độ cao: Clostridium botulinum, Bacillus subtilis 1.4. Tình hình ngộ độc thực phẩm [11][12] Theo thống kê về tình hình ngộ độc thực phẩm của Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm cho thấy: Bảng 1.4: Tình hình NĐTP và chết do NĐTP giai đoạn 2007 - 2011 Chỉ số Năm Vụ ngộ độc (vụ) Số mắc (người) Chết (người) 2007 247 7.329 55 2008 205 7.828 61 2009 152 5.212 35 2010 175 5.664 51 2011 (9 tháng) 122 3.857 17 (Số liệu từ Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm – Bộ Y Tế cung cấp) Năm 2011 so với năm 2010 giảm 21% về số vụ; giảm 23,9% số người mắc; giảm 15,5% số người đi viện và số tử vong giảm 62,2%. Nguyên nhân gây NĐTP do vi sinh vật ô nhiễm vào thực phẩm giảm 15,5%, nguyên nhân do thực phẩm ô nhiễm hóa chất tăng 55,5%, do độc tố tự nhiên giảm 41,4% và số vụ NĐTP không xác định được nguyên nhân là 16,3%. Một trong những nguyên nhân gây NĐTP trong những năm gần đây do sử dụng phụ gia thực phẩm không đúng quy định. 1.4.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm trong năm 2010 Thông tin từ Bộ Y Tế cho biết, trong năm 2010 toàn quốc đã xảy ra 132 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.676 người mắc, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp tử vong. 11
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong quý I năm 2010, toàn quốc đã xảy ra 25 vụ ngộ độc thực phẩm với 734 người mắc, 611 người đi viện và 12 người tử vong. So sánh với 3 tháng đầu năm 2009, số vụ ngộ độc thực phẩm tăng 2 vụ (8,7%), số người tử vong cũng tăng 1 trường hợp (9%). Tuy nhiên, số người mắc có giảm308 người (29,6%) và số người đi viện giảm 313 người (33,9%). Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là độc tố trong tự nhiên có trong thức ăn (44% số vụ), do vi sinh vật chiếm 28%, do hóa chất chiếm 8% và 20% số vụ không xác định nguyên nhân. Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Số người bị ngộ độc là 323 người với 242 người nhập viện. So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi viện giảm 186 người. Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người. Số vụ ngộ độc thực phẩm có quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người, số người đi viện giảm 174 người. Nguyên nhân chính là do vi sinh (gồm 4 nhóm vi khuẩn chính là: Salmonella, Streptococcus, E.Coli và Staphylococcus), do độc tố tự nhiên và hóa chất. Có 5/18 vụ ngộ độc không xác định được nguyên nhân, do không lấy được mẫu thực phẩm lưu tại cơ sở. Trong năm 2010, hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xác định nhanh nguyên nhân và xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xác hơn. Công tác quản lý ngộ độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực. Mặc dù vậy, ngộ độc thực phẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng số vụ ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt là ngộ độc cá nóc, điều đó cho thấy, các vụ ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ gia đình chưa có xu hướng giảm. Do đó, người dân cần phải nâng cao ý thức trong việc thực hiện ATVSTP ngay chính tại bếp ăn của gia đình mình. 1.4.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm năm 2011 Trong quý I năm 2011, số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 50% và số ca tử vong giảm tới 75% so với cùng kỳ năm ngoái (2010). 12
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong 5 tháng đầu năm 2011, trên cả nước xảy ra 37 vụ ngộ độc thực phẩm, làm 1.613 người mắc, 1.513 người phải nhập viện và 8 người tử vong. Số liệu thống kê của Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm cho thấy, trong 3 tháng đầu năm, toàn quốc xảy ra 16 vụ ngộ độc thực phẩm với 442 người mắc và 5 người tử vong, trong đó có 1 vụ ngộ độc tập thể gồm 30 người. So với cùng kỳ năm ngoái thì số vụ ngộ độc này giảm 10 vụ (50%), số người tử vong giảm 11 trường hợp (75%). Có nhiều nguyên nhân xảy ra ngộ độc thực phẩm như môi trường sản xuất nông nghiệp bị ô nhiễm, các kỹ thuật canh tác trong trồng trọt và chăn nuôi cũng như công nghệ sau thu hoạch, lưu thông phân phối thực phẩm không đúng quy trình công nghệ Nhưng tình trạng quảng cáo thực phẩm sai quy định, sai sự thật khá phổ biến là nguyên nhân chính. 1.4.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm năm 2012 Theo Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm (Bộ Y Tế), tình hình số vụ ngộ độc thực phẩm 6 tháng đầu năm 2012 không tăng so với cùng kỳ của các năm trong giai đoạn 2007 – 2011. Số vụ ngộ độc thực phẩm lớn tăng 1 vụ so với cùng kỳ năm 2011. Số vụ ngộ độc thực phẩm các bếp ăn tập thể giảm 1 vụ, số người mắc và đi viện đều giảm so với cùng kỳ năm 2011. Số vụ ngộ độc thực phẩm dưới 30 người tăng cả số vụ, số người mắc và tử vong. Trong đó tử vong chủ yếu do rượu không rõ nguồn gốc và bánh trôi ngô. Tại các hộ gia đình, việc ngộ độc thực phẩm có xu hướng tăng so với các năm trước. Đây là điều đáng lo ngại, bởi vì các hộ gia đình không phải là đối tượng sản xuất, kinh doanh thực phẩm nên khó quản lý. Do đó, công tác tuyên truyền cũng cần phải tập trung vào đối tượng này. Trong 6 tháng đầu năm 2012, số vụ ngộ độc thực phẩm lớn (từ 30 người trở lên) chỉ tăng 1 vụ. Số người chết do ngộ độc thực phẩm giảm 100%. Vụ ngộ độc thực phẩm bếp ăn tập thể giảm 1 vụ, số mắc giảm 419 người (34,6%), số đi viện giảm 623 người (52,1%) và không có tử vong. Số vụ ngộ độc thực phẩm có quy mô nhỏ (dưới 30 người) tăng 24 vụ. Trong đó ngộ độc thực phẩm tại bếp ăn gia đình tăng 18 vụ, số mắc tăng 497 người, số đi viện tăng 346 người và số người chết tăng 13
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 9 người. Trong số đó có những vụ ngộ độc thực phẩm tại đám cưới với gần 400 người mắc. Tỷ lệ các vụ ngộ độc thực phẩm có nguyên nhân từ vi sinh vật, độc tố tăng, trong khi số vụ ngộ độc do hóa chất giảm 20%. 1.5. Các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm 1.5.1. Tác nhân hóa học Các chất ô nhiễm trong công nghiệp và môi trường như: dioxin, các chất phóng xạ, các kim loại nặng (chì, thủy ngân, asen, cadimi ). Các kim loại nặng nhiễm vào thực phẩm với lượng lớn thường gây ngộ độc cấp tính và tỷ lệ tử vong rất cao. Các chất hóa học sử dụng trong nông nghiệp, đặc biệt là thuốc bảo vệ thực vật, phân bón, chất kích thích tăng trưởng. Thuốc bảo vệ thực vật nhiễm vào thực phẩm là tác nhân thường gặp trong các vụ ngộ độ gây rối loạn thần kinh trung ương, nhức đầu, mất ngủ, giảm trí nhớ, mức độ nặng hơn có thể tổn thương thần kinh ngoại biên dẫn đến liệt. Một số loại phụ gia thực phẩm như màu auramin, đỏ Scarlet, Sudan III, Rhodamin đã được thử nghiệm trên động vật xác định khả năng gây ung thư, gây đột biến gen và đã bị loại ra khỏi danh mục các chất cho phép dùng trong chế biến thực phẩm. Các độc tố có sẵn trong thực phẩm gây ngộ độc: nhiều thực phẩm có chứa sẵn các độc tố tự nhiên như chất độc solamin trong mầm khoai tây, cyanogen glucoside có trong sắn, đậu lima hoặc mytilotoxin ở một số loài nhuyễn thể. Độc tố bufetenin tạo thành trong da cóc rất nguy hiểm. Tetrodotoxin có trong gan, thận, cơ quan sinh sản (buồng trứng và túi tinh), mắt, mang và da cá nóc tác động vào hệ thần kinh gây rối loạn hoạt động chân tay, hô hấp. Ngộ độc do độc tố cá nóc thoạt đầu có cảm giác ngứa ngáy, đau bụng dữ dội, đờ đẫn, cứng mồm, sùi bọt mép, nôn mửa, trường hợp nặng có thể cấm khẩu, co giật, liệt hô hấp và tử vong. 1.5.2. Tác nhân sinh học gây ngộ độc trên thịt bò 1.5.2.1 . Tổng số vi sinh vật hiếu khí [4] 14
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Chỉ tiêu này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc cho phép ước đoán được số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối. Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm đó. Ngoài ra, chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về sự ô nhiễm vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, vận chuyển và bảo quản thực phẩm. 1.5.2.2 .Coliforms [4] Giới thiệu Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị, bởi vì số lượng của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong thực phẩm. Nguồn gốc Vào cuối những năm 1800 khi Von Fritsch được mô tả Klebsiella pneumoniae và Klebsiella rhinoscleromatis như là vi sinh vật đặc trưng được tìm thấy trong phân người (Gedreich 978). Năm 1885 Percy và Grace Frankland đầu tiên thường xét nghiệm vi khuẩn trong nước ở London. Robert Koch sử dụng chất keo rắn nấu bằng phương tiện truyền thống để đếm vi khuẩn (Hutchison và Ridgway 1977). Đầu thập niên 1900 (Cabelli, 1977), ông cho rằng sự vắng mặt của Coliforms như là dấu hiệu cho thấy không xuất hiện bệnh do vi khuẩn gây nên, và sau khi sản xuất khí đốt với việc giới thiệu ống Durham (Durham năm 1983) thì khái niệm về vi 15
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP khuẩn Coliforms và các vi khuẩn khác dạng Coli được sử dụng ở nước Anh năm 1901. Năm 1908 Bergey và Deehan xác định có 256 loài khác nhau của vi khuẩn Coliforms. Năm 1909 Macconkey công nhận 128 loài khác nhau của vi khuẩn Coliforms. Đến đầu thập niên 1920, sự khác biệt của các dạng vi khuẩn Coli được đem ra sản xuất indole, hóa lỏng gelatin, lên men đường sucrose và Voges – Proskauer nhằm xác định sự ô nhiễm faecal (Hendricks 1978). Năm 1938 Parr có những phát minh lên đến đỉnh điểm trong thử nghiệm IMViC (Indole, Methyl Red, Voges – Proskauer và muối của acid Citric). Đặc điểm Coliforms là những trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, có phản ứng oxidase âm tính và thể hiện hoạt tính của β-galactosidase. Vi khuẩn này có khả năng phát triển trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính bề mặt khác có tính ức chế tương tự, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ. Coliforms gồm bốn chi trong họ Enterobacteriaceae: Escherichia Coli, Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter (Metcalf và Eddy, 1991). Chúng thường có mặt trong đường ruột động vật có vú (ví dụ: Escherichia Coli phổ biến trong đất, trên cơ thể người). Chúng bao gồm vi khuẩn lên men lactose như Escherichia cloacae, Citrobacter freundii có thể tìm thấy trong phân và ngoài môi trường (nước giàu chất dinh dưỡng, đất và động vật) cũng như trong nước uống có nồng độ các chất dinh dưỡng tương đối cao. Coliforms chịu nhiệt có khả năng lên men đường lactose ở 44 – 450C, nó bao gồm Escherichia và loài Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter. Hiện diện Vi khuẩn Coliforms hiện diện khắp nơi, kể cả trong đất, da, thực phẩm, nước sông, ao hồ, rau cải 16
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sự có mặt của chúng trong nước và rau củ được xem là một chỉ số về sự tinh khiết của nước hay rau. Tuy nhiên chỉ số này cũng không đáng tin cậy, vì vi khuẩn Coliforms vẫn có khả năng sống sót trong nước uống. Sự hiện diện của Coliforms trong nước không hẳn là nước bị nhiễm phân. Coliforms chịu nhiệt từ nơi có nguồn nước giàu chất hữu cơ như nước thải công nghiệp từ xác thực vật thối rữa hoặc đất. 1.5.2.3. Escherichia Coli [4][14] Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Escherichia Loài: E.Coli Đặc điểm  Hình thái và đặc điểm nuôi cấy E.Coli là trực khuẩn Gram âm, di động do có lông quanh thân, một số chủng E.Coli có vỏ polysaccharide, không sinh bào tử. E.Coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản. Thường sống trong ruột già của người và động vật và theo phân đi ra ngoài. Đây là những vi sinh vật có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 7 – 500C. Nhiệt độ thích hợp 370C, pH tối ưu là 4,4, phát triển mạnh trong môi trường Mac Conkey, EMB. Trên môi trường EMB, E.Coli cho khuẩn lạc có màu ánh kim, tròn, bờ đều, đường kính khoảng lớn hơn 0,5µm. Trong môi trường lỏng, E.Coli làm đổi màu môi trường, sinh hơi hoặc làm đục môi trường.  Đặc tính sinh hóa 17
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP E.Coli lên men nhiều loại đường sinh acid và sinh hơi như: glucose, lactose, ramnose; khử nitrate thành nitric, gây nhầy nhớt hư hỏng thực phẩm, indole dương tính, methyl red dương tính, VP âm tính, citrate âm tính, urease âm tính, H2S âm tính. Hình 1.1: Vi khuẩn Escherichia Coli Yếu tố độc lực  Nhóm STEC STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt) còn gọi là Shiga toxin (Stx) hay Verotoxin (VT). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều Subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e, Stx2g. Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1, Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2.  Nhóm EPEC Các yếu tố độc lực chính bao gồm gene eae mã hóa protein itimin cần thiết cho việc tạo ra tổn thương dạng A/E, plasmid 50 - 70 Mda (EAP): mã hóa BFP (bundle – forming pilus), PER (plasmid – encoded regulator) và LER (LEE – encorded regulator). Các protein tiết: Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG và MAP (mitochondria – associated protein), EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô và CDT (Cytolethan distending toxin).  Nhóm ETEC Nhóm ETEC có hai nhóm quyết định độc lực chính là độc tố ruột (enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF). 18
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Độc tố ruột enterotoxin Nhóm ETEC gồm những E.Coli tạo ra ít nhất một trong hai độc tố đường ruột là ST và LT. ETEC gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhầy ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch. Nhóm ETEC gây tiêu chảy thông qua sự tiết độc tố đường ruột LT và ST. E.Coli nhóm này có thể chỉ tiết độc tố LT, hoặc chỉ tiết ST, hoặc có thể tiết cả LT và ST. . Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin – LT): độc tố LT của E.Coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố tả (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về receptor, hoạt tính enzyme và tác động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào. . Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin – ST): ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành hai nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gene mã hóa cho cả hai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gene mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon. STa (hay còn gọi là ST-I) được tạo bởi ETEC và một vài vi khuẩn Gram âm khác như Yersinia enterocolitica và V.cholerae non – O1. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của ETEC. Gần đây, còn có báo cáo cho rằng một vài dòng của ETEC cũng có thể sản sinh độc tố EAST1 ngoài độc tố STa. Còn STb chỉ được tìm thấy ở ETEC.  Yếu tố định vị (colonization factor – CF): Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF). Gene của 19
  21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CFA thường được mã hoá trên plasmid, cũng là nơi mã hóa cho độc tố ST và/hoặc LT.  Nhóm EAEC Những yếu tố độc lực chính của EAEC bao gồm các diềm bám dính kết tập AAF (aggregative adhesion fimbriae), yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR, protein Pet và độc tố EAST – 1 (enteroaggregative heat – stabe toxin – 1). AAF được xem là yếu tố quyết định độc lực.  Nhóm EIEC EIEC gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Khả năng xâm nhập được mã hóa bởi gene trên plasmid 140 MDa. Các gene trên plasmid này mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa: Invasion plasmid antigen). EIEC còn có khả năng sản xuất độc tố ruột giống một số Shigella. Gene mã hóa cho độc tố này có tên là sen (Shigella enterotoxin), cơ chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ. EIEC xâm nhập vào trong tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu các túi thực bào và nhân lên trong bào tương, phá hủy tế bào và xâm lấn sang các tế bào khác. Khả năng gây bệnh Khả năng gây bệnh rất đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu, với cơ thể yếu thì gây nhiễm khuẩn máu, gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, gây tiêu chảy. - Bệnh tiêu chảy do E.Coli - Các nhiễm khuẩn khác do E.Coli E.Coli có thể gây nên nhiễm khuẩn đường tiết niệu: sự ứ đọng nước tiểu do sỏi, thai nghén tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu dễ xảy ra. Mặt khác, khi thông niệu đạo, người ta có thể gây ra nhiễm khuẩn ngược dòng. E.Coli có thể gây ra nhiễm khuẩn đường sinh dục, nhiễm khuẩn gan mật, viêm màng não ở trẻ còn bú, nhiễm khuẩn huyết 1.5.2.4. Salmonella sp 20
  22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Salmonella Loài: Salmonella sp Đặc điểm Salmonella là trực khuẩn Gram âm. Hầu hết các loài Salmonella đều có lông xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullorum), vậy có khả năng di động, không sinh bào tử. Có kích thước tế bào vào khoảng 0,5 - 3µm. Salmonella là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, thích hợp ở 370C, pH tối ưu 7,2 – 7,6.  Đặc điểm sinh hóa Salmonella lên men glucose có sinh hơi (trừ S.typhi lên men glucose không sinh hơi), không lên men lactose, Indole âm tính, Methyl Red dương tính, VP âm tính, Citrate thay đổi, Urease âm tính, H2S dương tính (trừ S.paratyphi A: H2S âm tính). Lên men sinh hơi các đường glucose, manitol, sorbitol, lên men không đều saccharose, không lên men đường lactose, salicin, raffinose Hình 1.2: Salmonella vi khuẩn chở bệnh thương hàn 21
  23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Yếu tố độc lực Có hai loại độc tố là nội độc tố và ngoại độc tố Ngoại độc tố đường ruột (enterotoxin) có hai loại là LT và ST. . Độc tố LT không bền với nhiệt, LT hoạt hóa enzyme adenylcyclase trong tế bào niêm mạc ruột, làm gia tăng c-AMP (cyclo adenosine 5- - - monophosphate), c-AMP sẽ kích thích tiết Cl và HCO3 ra khỏi tế bào, đồng thời ức chế Na+ vào bên trong tế bào. Hậu quả tích nước trong ống ruột dẫn đến tiêu chảy. . Độc tố ST bền với nhiệt, cơ chế tác động tương tự như LT. ST hoạt hóa enzyme guanosylcyclase làm tăng c-GMP (cyclo guanosine 5- monophosphate) ở trong tế bào dẫn tới hiện tượng tiêu chảy. 1.5.2.4.4. Khả năng gây bệnh Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng và hầu hết là do ăn phải thức ăn bị nhiễm như thực phẩm, sữa, nước uống Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp túc chui qua một màng nhầy và vào thành ruột. Salmonella nhiễm vào cơ thể từ hai nguồn: từ phân người hoặc động vật, từ người bệnh. Trong đó phải kể đến tác động của động vật lông vũ, trứng và phân của chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng hơn. Ngoài ra chuột, mèo, ruồi cũng là tác nhân gián tiếp dẫn đến việc Salmonella lan rộng rãi hơn khi phân của chúng nhiễm vào các thực phẩm không được bảo quản kỹ. Trong quá trình giết mổ cũng cần đề phòng sự nhiễm Salmonella nếu không thực hiện đúng quy trình an toàn thực phẩm. Bệnh thương hàn Ở nước ta, bệnh thương hàn chủ yếu do S.typhi, sau đó đến S.paratyphi A, còn S.paratyphi B và S.paratyphi C thì ít gặp. Bệnh lây từ người này sang người khác, qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn. Sinh bệnh học: trực khuẩn thương hàn vào cơ thể qua đường tiêu hóa đến ruột non thì chui qua niêm mạc ruột rồi vào các hạch mạc treo ruột. Ở đó chúng 22
  24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nhân lên và một phần vi khuẩn bị dung giải, giải phóng ra nội độc tố, nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm ở bụng, gây tổn thương, xuất huyết tiêu hóa, có thể gây thủng ruột. Các bệnh khác Các bệnh không phải thương hàn do Salmonella gây ra thường là một nhiễm trùng giới hạn ở ống tiêu hóa trong các trường hợp nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn mà S.typhimurium, là tác nhân hay gặp nhất, sau đó là S.enteritidis, Nhiễm trùng nhiễm độc do Salmonella có thời gian nung bệnh từ 10 – 48 giờ, bệnh biểu hiện có sốt, nôn, tiêu chảy, bệnh khỏi sau 2 – 5 ngày, không có biến chứng. 1.5.2.5 Staphylococcus aureus [7][8][15] Phân loại Giới: Eubacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Staphylococcaceae Chi: Staphylococcus Loài: S.aureus Hình 1.3: Tụ cầu vàng dưới kính hiển vi Đặc điểm Staphylococcus aureus (thường gọi là tụ cầu vàng) là vi khuẩn hình cầu, Gram dương, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, không di động, sắp xếp theo mọi hướng thành cụm giống chùm nho. S. aureus có mặt khắp nơi, thường thấy trên da, xoang mũi, tóc Tạo sắc tố màu vàng sau 1 – 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ tăng trưởng thích hợp nhất 35 – 370C. Chúng có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl. Do đó, nếu như hầu hết các vi sinh vật gây bệnh bị ức chế trong nhóm thực phẩm có độ ẩm thấp hoặc nồng độ muối cao thì S. aureus vẫn có thể sinh trưởng được. Tuy nhiên, khả năng cạnh tranh dinh dưỡng của S. aureus 23
  25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thường yếu hơn các vi sinh vật khác. Đó là lý do S. aureus thường được tìm thấy trong các thực phẩm đã được nấu chín hoặc đã qua chế biến. Đặc điểm quan trọng của S. aureus có thể phân biệt được với các loài Staphylococci khác là khả năng sinh tổng hợp coagulase và khả năng sử dụng manitol. Yếu tố độc lực S. aureus tạo nhiều yếu tố độc lực: - Protein bề mặt: thúc đẩy việc bám dính vào tế bào chủ. Ngoài ra, hầu hết các dòng đều tạo protein gắn kết fibrinogen và fibronetin làm kích thích sự kết dính các khối máu và mô bị chấn thương. Các protein gắn kết chất tạo keo cũng thường gặp ở những dòng gây bệnh viêm xương tủy và viêm khớp. - Yếu tố xâm lấn (hemolysins, leukocidin, kinase, hyaluronidase): giúp vi khuẩn lan ra trên mô, phân hủy màng tế bào eukaryote.  Hemolysin . α – toxin (α – hemolysin): đây là độc tố khử màng mạnh nhất của S. aureus. Nó ở dạng một monomer gắn kết với màng tế bào mẫn cảm. Ở người, tiểu cầu và bạch cầu đặc biệt nhạy với α – toxin do chúng có thụ thể chuyên biệt nhận diện và cho phép độc tố gắn kết hình thành lỗ nhỏ mà cation hóa trị một có thể qua được. . β – toxin: đây là một mạch enzyme phân hủy màng giàu lipid. Thử nghiệm đối với β – toxin là phản ứng phân hủy hồng cầu cừu. . δ – toxin: là một độc tố có peptide nhỏ. δ – toxin có thể phân hủy một số dạng tế bào khác nhau.  Leukocidin: là protein đa thành phần, do nhiều thành phần riêng rẽ hợp lại phân hủy màng. Leukocidin cũng phân hủy máu nhưng yếu hơn α – hemolysin. Chỉ 2% trong tất cả các dòng S. aureus có thể tạo leukocidin, nhưng đến gần 90% các dòng phân lập từ vết xước trên da có tạo độc tố này.  Hyaluronidase: làm giảm chất gian bào của tế bào chủ và có thể giúp tụ cầu lan rộng sang các vùng xung quanh. 24
  26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Catalase: có chức năng bất hoạt hydrogen peroxide và các gốc tự do hình thành do hệ thống myeloperoxidase trong tế bào chủ.  Coagulase và yếu tố gây đông: coagulase là một enzyme ngoại bào sẽ gắn với prothrombin trong tế bào chủ hình thành phức hợp staphylothrombin. Coagulase là một chỉ thị thường dùng để phát hiện S. aureus ở các phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, đa số bằng chứng cho thấy rằng đây không phải là yếu tố gây độc, mặc dù chúng có thể tự bảo vệ khỏi sự thực bào và đáp ứng miễn dịch bằng cách gây đông. Có một số nhầm lẫn về mối liên quan giữa coagulase và yếu tố gây đông đâu là yếu tố quyết định sự gắn kết fibrinogen trên bề mặt tế bào S. aureus. Một vài nghiên cứu cho thấy thật sự chỉ có một lượng nhỏ coagulase trên bề mặt tế bào vi khuẩn và chúng phản ứng với prothrombin làm đông sợi fibrin. Nhưng những nghiên cứu di truyền chỉ ra rằng không thể giải thích rõ là coagulase và yếu tố gây đông có tồn tại riêng biệt hay không. Bởi vì những đột biến thiếu coagulase vẫn duy trì hoạt tính yếu tố gây đông và những đột biến thiếu yếu tố gây đông vẫn biểu hiện hoạt tính coagulase bình thường.  Staphylokinase: đây là yếu tố phân giải fibrin. Một phức hợp sẽ được hình thành giữa staphylokinase và plasminogen kích hoạt hoạt tính phân giải protein giúp phân hủy fibrin. Cũng như coagulase, không có đủ bằng chứng để cho thấy staphylokinase là yếu tố gây độc, mặc dù việc phân giải fibrin giúp cho sự lan rộng của tụ cầu.  Các enzyme ngoại bào khác . TNase: là enzyme kháng nhiệt, có khả năng hidro hóa DNA và RNA của tế bào chủ. . DNase, protease, lipase: cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn, có tác động gây bệnh thấp. . FAME (fatty acid modifying enzyme): là enzyme rất quan trọng ở những chỗ bị abscess, đó là nơi chúng có thể biến đổi những lipid kháng khuẩn và kéo dài sự sống của vi khuẩn. 25
  27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khả năng gây bệnh Các dòng S. aureus đều có thể tổng hợp enterotoxin là loại độc tố bền nhiệt (không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút) gây các triệu chứng buồn nôn, nôn mửa, đau bụng, có hay không có tiêu chảy, ngoài ra còn có thể bị đau đầu, chuột rút, thay đổi huyết áp. Sự hiện diện của S. aureus cho thấy điều kiện vệ sinh kiểm soát nhiệt độ của thực phẩm kém. 26
  28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài - Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi Sinh – Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. - Thời gian: 24/06/2013 – 15/09/2013. 2.2. Địa điểm lấy mẫu Khu vực: chợ Hoàng Hoa Thám, đường Hoàng Hoa Thám, P.24, Q.Tân Bình, TP.HCM. 27
  29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chợ Hải Hoàng Hoa Thám Sản 10 0 6 7 Rau 5 Quả Hải Sản 8 9 Cửa hàng 4 gia vị 3 2 1 Hình 2.1: Sơ đồ lấy mẫu Chú thích: : quầy thịt bò : quầy thịt heo : cống thải 28
  30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3. Vật liệu 2.3.1. Mẫu Mẫu thực phẩm phân tích: thịt bò 2.3.2. Hóa chất, môi trường nuôi cấy - Saline Pepton Water (SPW) (Himedia - Ấn Độ) - Plate Count Agar (PCA) (Himedia - Ấn Độ) - Tryptone Soya Agar (TSA) (Himedia - Ấn Độ) - Violet Red Bile Agar (VRB) (Himedia - Ấn Độ) - Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) (Himedia - Ấn Độ) - Eosine Methylene Blue Agar (EMB) (Himedia - Ấn Độ) - Canh Tryptone (Himedia - Ấn Độ) - Canh Methyl Red – Voges Proskauer (MR – VP) (Himedia - Ấn Độ) - Thạch Simmon Citrate (Himedia - Ấn Độ) - Thuốc thử Kovac (Merck - Đức) - Thuốc thử Methyl Red (Merck - Đức) - Thuốc thử α-naphtol 5% (Merck - Đức) - KOH 40% (Merck - Đức) - NaCl 0,85% (Trung Quốc) - Cồn 700 và cồn 960 - Nước cất 2.3.3. Dụng cụ - Ống nghiệm có nắp - Đĩa petri vô trùng - Cân điện tử - Cốc thủy tinh - Bình chứa môi trường - Đũa thủy tinh - Kéo 29
  31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Túi nylon vô khuẩn - Đèn cồn - Que cấy - Bông không thấm nước - Micropipette 2.3.4. Thiết bị - Autoclave - Tủ lạnh, tủ cấy - Bếp từ, bếp đun - Tủ ấm 300C - Tủ ấm 370C - Bể ổn nhiệt 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp đánh giá cảm quan (TCVN 7046 : 2002) Tên chỉ tiêu Yêu cầu 1.Trạng thái - Bề mặt khô, không dính lông và tạp chất lạ. - Mặt cắt mịn. - Có độ đàn hồi, ấn ngón tay vào thịt không để lại dấu ấn trên bề mặt khi bỏ tay ra. - Tủy bám chặt vào thành ống tủy (nếu có). 2.Màu sắc Màu đặc trưng của sản phẩm. 3.Mùi Đặc trưng của sản phẩm, không có mùi lạ 4.Nước luộc thịt Thơm, trong, váng mỡ to. 30
  32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2.2: Mẫu thịt bò tươi 2.4.2. Phương pháp thu mẫu và chuẩn bị mẫu 2.4.2.1. Thu mẫu và xử lý mẫu Mẫu được lấy từ 10 quầy thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám, cho vào nylon sạch và vận chuyển về phòng thí nghiệm. Các mẫu thực phẩm sau khi lấy phải đảm bảo không nhiễm lẫn nhau. Cho các mẫu vào các túi PE vô trùng, kí hiệu chính xác từng mẫu. 2.4.2.2. Chuẩn bị mẫu  Cân mẫu Cân chính xác một lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầu của chỉ tiêu phân tích. Lượng mẫu này được cho vào các bao PE vô trùng. Trong đề tài này khối lượng mẫu cân là 10g.  Đồng nhất mẫu Do sự phân bố không đồng đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên mẫu cần được đồng nhất trước khi phân tích. Việc đồng nhất các mẫu lỏng được thực hiện bằng cách lắc kỹ trước khi phân tích, các mẫu rắn được lắc hay đảo trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng, ví dụ như: thiết bị dập mẫu (Stomacher), có thể đồng nhất mẫu bằng tay (nếu không có đủ điều kiện). 31
  33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.3. Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC) bằng phương pháp đổ đĩa 2.4.3.1. Nguyên tắc Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm. Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy, các khuẩn lạc hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như chúng hình thành từ một tế bào riêng lẻ. Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 300C trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 370C trong 48 giờ ± 6 giờ. 32
  34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.3.2. Quy trình phân tích Cân 10g mẫu và 90ml môi trường SPW đồng nhất trong 30 giây độ pha loãng 10-1 -2 -3 -4 Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý độ pha loãng 10 , 10 , 10 Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 450C. Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội úp ngược ủ ở 300C trong 72 giờ Đọc kết quả các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 - 250 Tính toán kết quả tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu Hình 2.3: Quy trình phân tích chỉ tiêu TPC 2.4.3.3. Thuyết minh quy trình  Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 10g mẫu cho vào bao PE vô trùng, thêm vào 90ml môi trường SPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất bằng tay trong 30 giây. Khi đó, ta sẽ được độ pha loãng 10-1. 33
  35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette vô trùng chuyển 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta sẽ có được dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục thực hiện tương tự đến độ pha loãng 10-4. Ống số 1 2 3 4 1 1 1 1 Tỷ lệ pha loãng 10 100 1000 10000 Thể tích mẫu 0,1 0,01 0,001 0,0001 ban đầu (ml) Độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4  Cấy mẫu Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4, dùng micropipipette với các đầu tip vô trùng để chuyển 1ml dịch pha loãng vào giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa. Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45 – 500C. Trộn đều mẫu vào môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3 – 5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc, lật ngược đĩa ủ 300C trong 72 giờ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 để đếm. 2.4.3.4. Đọc kết quả Kết quả 10-2 10-3 10-4 Đĩa 1 Đĩa 2  Công thức tính toán A= (cfu/g) 푛1 1 1 +⋯ +푛푖 푖 푖 34
  36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1g mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường f: độ pha loãng tương ứng 2.4.4. Định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 2.4.4.1. Nguyên tắc Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ 370C sau 24 – 48 giờ. Ngoài lactose môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn Gram dương. Trên môi trường này khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, đường kính > 0,5cm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tủa muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như canh BGBL. Để phát hiện được bộ phận tế bào bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không phát triển được trong môi trường chọn lọc, do đó trước tiên mẫu phải được cấy vào môi trường tăng sinh không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc. 35
  37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.4.2. Quy trình phân tích Cân 10g mẫu và 90ml môi trường SPW đồng nhất trong 30 giây độ pha loãng 10-1 Cấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó, đổ môi trường TSA đã được làm nguội đến 450C và chờ trong 30 phút Đổ môi trường VRB lên môi trường TSA RB Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0,5mm Ở mỗi đĩa chọn 3 – 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả Hình 2.4: Quy trình phân tích chỉ tiêu Coliforms 36
  38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.4.3 Thuyết minh quy trình  Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 10g mẫu cho vào bao PE vô trùng, thêm vào 90ml môi trường SPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất bằng tay trong 30 giây. Khi đó, ta sẽ được độ pha loãng 10-1.  Cấy mẫu Cấy chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào 2 đĩa petri. Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 450C, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ. Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ nhằm phục hồi khả năng của Coliforms. Đổ thêm 10 – 15ml môi trường VRB. Chờ môi trường đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 370C trong 24 giờ. Chọn các đĩa có số đếm từ 10 – 100 khuẩn lạc Coliforms để tính. Khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến đỏ đậm và đường kính > 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tủa muối mật.  Thử nghiệm khẳng định Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường canh BGBL và ủ ở 370C trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi vi sinh vật sinh khí trong ống Durham. Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khuẩn lạc khẳng định. 2.4.4.4. Đọc kết quả Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ xác nhận, tính mật độ của Coliforms theo công thức: A = × 푅 푛1 1 1 +⋯ +푛푖 푖 푖 Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được ni: số đĩa có số lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng V: thể tích cấy vào mỗi đĩa 37
  39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm R = số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL / số khuẩn lạc đã cấy 2.4.5. Phương pháp định tính E.Coli trong thực phẩm 2.4.5.1. Nguyên tắc Phương pháp này dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong một khối lượng mẫu xác định. Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh (BGBL), kiểm tra trên môi trường phân lập (EMB) và thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC). 2.4.5.2. Quy trình phân tích 38
  40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cân 10g mẫu và 90ml môi trường SPW đồng nhất trong 30 giây độ pha loãng 10-1 Cấy 1ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào 10ml môi trường BGBL Ủ ở 440C ± 0,5 trong 24 giờ Chọn các ống sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB. Mẫu không sinh hơi được coi là âm tính E.Coli Ủ ở 370C ± 0,5 trong 24 giờ Khuẩn lạc đặc trưng của E.Coli trên EMB: tròn lồi, đường kính < 0,5mm, có ánh kim tím Cấy vào môi trường 1 Tryptone, 2 MR – VP, 1 Simmons Citrate Ủ ở 370C ± 0,5 trong 24 giờ Sử dụng các loại thuốc thử để test thử nghiệm IMViC Kết luận: phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong 10g mẫu Hình 2.5: Quy trình phân tích chỉ tiêu E.Coli 39
  41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.5.3. Thuyết minh quy trình  Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 10g mẫu cho vào bao PE vô trùng, thêm vào 90ml môi trường SPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất bằng tay trong 30 giây. Khi đó, ta sẽ được độ pha loãng 10-1.  Cấy mẫu Tăng sinh: cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1 vào ống nghiệm chứa 10ml canh BGBL, ủ 440C trong 24 giờ. Phân lập: sau 24 giờ, chọn các ống nghiệm cho phản ứng dương tính (môi trường đục và có sinh hơi) cấy chuyển sang môi trường phân lập EMB. Ủ ở 370C trong 24 giờ. Nhận dạng khuẩn lạc E.Coli: khuẩn lạc tròn, màu tím, có bờ đều, đường kính 0,5mm, có ánh kim tím.  Thử nghiệm khẳng định Những khuẩn lạc nghi ngờ được thực hiện qua các bước thử nghiệm sinh hóa (thực hiện nghiệm pháp IMViC) như sau: Thử nghiệm khả năng sinh Indole: cấy vi sinh vật qua môi trường canh Tryptone, ủ 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, nhỏ thêm thuốc thử Kovac vào và quan sát. Nếu trên bề mặt có vòng đỏ cánh sen xuất hiện là phản ứng Indole dương tính, âm tính khi không có vòng đỏ xuất hiện. Thử nghiệm Methyl red: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose phosphate, ủ 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, nhỏ thêm thuốc thử methyl red vào. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ, âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng. Thử nghiệm Voges – Proskauer: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose phosphate, ủ 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, nhỏ thêm thuốc thử α-napthol 5% và KOH 40%. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút. Phản ứng Voges – Proskauer dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ, phản ứng âm tính khi không có sự đổi màu. 40
  42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thử nghiệm Citrate: cấy vi sinh vật vào môi trường thạch nghiêng Simmon Citrate có màu xanh lục, ủ 370C trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi trường đổi sang màu xanh dương, âm tính khi môi trường không đổi màu. Bảng 2.1 : Ghi nhận kết quả thử nghiệm sinh hóa Kết TT Thử nghiệm sinh hóa quả 1. Indole + 2. Methyl red + 3. Voges - Proskauer - 4. Khả năng sử dụng Citrate - 2.4.5.4. Đọc kết quả Phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong 10g mẫu. 41
  43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hiện trạng khu vực thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám 3.1.1. Đặc điểm khu vực chợ Có tính hợp lý, rõ ràng, gồm một số khu vực điển hình: khu vực thịt, khu vực hải sản, khu vực rau quả Số lượng người mua rất đông, nhất là vào các giờ cao điểm (từ 9h – 11h30). Do có một số lượng lớn khách hàng đi xe máy vào chợ, nên có nhiều bụi bẩn và nguy cơ ngoại nhiễm rất cao. 3.1.2. Đặc điểm quầy thịt bò (nơi thu mẫu) - Các quầy thịt bò được bố trí không hợp lý, không tập trung mà nằm một cách rải rác, không có trật tự tại chợ. Có một số quầy (Q3, Q8, Q9) được bày bán gần khu vực cống thải. - Môi trường không sạch sẽ, có quá nhiều nguồn nước bẩn xung quanh khu vực. Dựa vào những nguyên nhân trên, có thể nhận thấy rằng việc bố trí khu vực bày bán thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám không hợp lý do các quầy hàng buôn bán tự do, không chuyên biệt cho từng loại sản phẩm nên dễ dẫn đến tình trạng nhiễm chéo, làm cho nguy cơ nhiễm vi sinh vật gây bệnh trên thịt bò là khá cao. Chính vì vậy, cần phải có những biện pháp nhằm ngăn chặn khả năng nhiễm vi sinh trên thực phẩm. 3.2. Kết quả đánh giá cảm quan mẫu thịt bò - Về màu sắc của mẫu: có màu sắc đặc trưng của thịt bò, lớp thịt có màu đỏ, lớp mỡ có màu vàng nhạt. Không có mảng bầm tím, tụ máu. - Về trạng thái của mẫu: bề mặt ngoài của mẫu thịt khô, không nhớt, không dính lông và tạp chất lạ. Mặt cắt mịn, khối thịt rắn chắc, có độ đàn hồi, ấn ngón tay vào thấy thịt mềm, có độ dính và không để lại dấu ấn trên bề mặt thịt khi bỏ tay ra. - Về mùi của mẫu: có mùi đặc trưng của thịt bò, không có mùi lạ. 42
  44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dựa vào kết quả đánh giá cảm quan có thể nhận thấy rằng, phần lớn các mẫu thịt bò được lấy từ chợ vẫn trong tình trạng rất tốt, màu sắc và mùi vị vẫn còn tính đặc trưng của sản phẩm. Do thời điểm lấy mẫu bắt đầu lúc 7h30 – 8h30, đây là thời điểm thịt vừa được vận chuyển từ lò mổ về nên sản phẩm thường có trạng thái tươi ngon và mới. Tuy nhiên vẫn có mẫu thuộc Q5 và Q9 không ổn định về mùi và độ đàn hồi, điều này có thể lý giải do một số nguyên nhân: sản phẩm thịt còn thừa của ngày hôm qua, sản phẩm đã trải qua quá trình bảo quản lạnh qua đêm, nơi buôn bán gần các nguồn nhiễm (rác thải, cống ngầm). Việc đánh giá cảm quan của sản phẩm sẽ có cái nhìn sơ bộ về tình trạng mẫu trước khi phân tích. Đối với những mẫu thịt có dấu hiệu cảm quan không tốt, điều này có thể dẫn đến sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong mẫu khá cao. Tuy nhiên, đối với các mẫu đạt trạng thái cảm quan tốt cũng không chứng tỏ chúng không mang các vi sinh vật gây bệnh. Do đó, các mẫu thịt này đạt chất lượng hay không còn phụ thuộc vào kết quả đánh giá sự hiện diện của các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh sẽ khảo sát sau đây. 3.3. Kết quả đánh giá chỉ tiêu vi sinh vật hiện diện trong thịt Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046 : 2002 – Thịt tươi – quy định kỹ thuật thì các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi thể hiện ở bảng 4.1. Bảng 3.1. Chỉ tiêu vi sinh trên thịt tươi [16] Giới hạn Tên chỉ tiêu tối đa 1.Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1 g sản phẩm 106 2. E.Coli, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 102 3. Salmonella, số vi khuẩn trong 25 g sản phẩm 0 4. B. cereus, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 102 5. Staphylococcus aureus, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 102 6. Clostridium perfringens, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 10 7. Clostridium botulinum, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 0 43
  45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.3.1. Kết quả đánh giá chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC) Kết quả đánh giá mức độ hiện diện tổng vi sinh vật hiếu khí trong sản phẩm thịt bò được trình bày trên hình 3.1 1200000 1000000 800000 600000 CFU/g 400000 200000 0 Tiêu Q1 Q2 Q3 Q4 Q5 Q6 Q7 Q8 Q9 Q10 chuẩn Quầy Hình 3.1: Mức độ nhiễm khuẩn TPC trong 10 quầy thịt bò Dựa vào hình 3.1, có thể thấy rằng mỗi quầy thịt đều nhiễm TPC với những mật độ khác nhau, trong đó quầy có mức độ nhiễm cao nhất là Q2 và Q10 là quầy có mức độ nhiễm thấp nhất. Mức độ nhiễm giữa các quầy có sự chênh lệch rất lớn, không đồng đều. Mặc dù có sự khác biệt về mật độ TPC nhưng trong 10 quầy thịt bò được khảo sát với 3 lần lặp lại, không có bất kỳ mẫu nào vượt quá chỉ tiêu cho phép (theo TCVN 7046 :2002, 106 CFU/g). Điều này chứng tỏ rằng chất lượng của sản phẩm thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám khá tốt. Có thể lý giải cho kết luận trên là do mẫu được thu vào buổi sáng và đây là thời điểm chợ chưa đông khách, tình trạng vệ sinh ở chợ còn tương đối sạch sẽ đồng thời các mẫu vừa được vận chuyển từ lò mổ về nên thịt vẫn còn tươi ngon. 44
  46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.2: Khuẩn lạc TPC trên môi trường PCA 3.3.2. Kết quả đánh giá chỉ tiêu Coliforms Kết quả đánh giá mức độ hiện diện Coliforms trong sản phẩm thịt bò được trình bày trên hình 3.3 250 200 150 100 CFU/g 50 0 Tiêu Q1 Q2 Q3 Q4 Q5 Q6 Q7 Q8 Q9 Q10 chuẩn Quầy Hình 3.3: Mức độ nhiễm khuẩn Coliforms trong 10 quầy thịt bò 45
  47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.3. cho thấy trong tổng số các mẫu tại 10 quầy được phân tích có 4 quầy vượt quá tiêu chuẩn về “tiêu chuẩn Coliform tổng số cho phép trong thực phẩm, Bộ Y Tế” (102 CFU/g). Tất cả các mẫu còn lại cho kết quả Coliforms thấp hơn tiêu chuẩn cho phép. Mặc dù đối với chỉ tiêu TPC, mức độ nhiễm vượt quá chỉ tiêu cho phép là không có trên 10 quầy, nhưng đối với chỉ tiêu Coliforms có đến 4 quầy có mức độ nhiễm cao (Q3, Q4, Q9, Q10) chiếm 40% tổng số quầy. Xét riêng từng quầy lấy mẫu: - Tại Q3 với 3 mẫu đem phân tích thì có 1 mẫu đạt tiêu chuẩn cho phép (chiếm 33,3%) và 2 mẫu vượt mức chỉ tiêu (chiếm 66,6%). - Tại Q4 với 3 mẫu đem phân tích thì có 2 mẫu đạt tiêu chuẩn cho phép và 1 mẫu vượt mức chỉ tiêu (chiếm 33,3%). - Tại Q9, Q10 mỗi quầy đem phân tích 3 mẫu thì cả 3 mẫu đều vượt mức chỉ tiêu cho phép (chiếm 100%). Đáng lưu ý ở đây là Q9 mức độ nhiễm Coliforms cao gấp 2 lần chỉ tiêu cho phép của Bộ Y Tế. Sự hiện diện của Coliforms trong mẫu với mật độ cao có thể do hiện trạng khu vực xung quanh mẫu có nhiều nguy cơ nhiễm Coliforms. Việc bố trí các quầy không hợp lý cũng là một nguyên nhân gây ra sự nhiễm chéo giữa các quầy khác nhau (quầy cá, quầy hải sản ). Đối với những người bán tại chợ, họ không thực hiện đúng các nguyên tắc đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm. Đối với Q9, như đã đánh giá cảm quan ở trên và nhìn nhận về hiện trạng lấy mẫu, có thể nhận định rằng quầy này nhiễm Coliforms chủ yếu thông qua tác nhân bên ngoài: khu vực bày bán gần cống thải, đây chính là nguyên nhân tiền đề làm tăng mối nguy nhiễm Coliforms trên các quầy thịt bò tại chợ Hoàng Hoa Thám. 46
  48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms 3.3.3. Kết quả đánh giá chỉ tiêu E.Coli Tỷ lệ nhiễm E.Coli Dương tính Âm tính 23% 77% Hình 3.5: Mức độ nhiễm khuẩn E.Coli trong 10 quầy thịt bò 47
  49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.5. cho thấy rằng trong 30 mẫu được phân tích, có 7 mẫu được xác định là dương tính với E.Coli (chiếm 23% tổng số mẫu). Xét riêng từng quầy lấy mẫu: - Tại Q2, Q3 và Q5, cứ mỗi quầy với 3 lần lặp lại thì có 1 mẫu dương tính với E.Coli (chiếm 33.3%) và 2 mẫu còn lại âm tính. - Tại Q9, Q10 với 3 lần lặp lại thì tỷ lệ dương tính với E.Coli cao hơn (chiếm 66,6%). Việc các mẫu thịt bò ở Q9 và Q10 tỷ lệ nhiễm E.Coli cao hơn là điều có thể dự báo được vì kết quả đánh giá cảm quan các mẫu thịt thu từ quầy này không tốt. Không những vậy, kết quả đánh giá chỉ tiêu Coliforms của 2 quầy này cũng cao hơn so với tiêu chuẩn rất nhiều lần. Sự hiện diện của E.Coli trong mẫu có thể do một số nguyên nhân: việc bố trí các quầy thịt bò không hợp lý giữa các quầy, phân bố không đều mà nằm rải rác từng khu vực, việc này đã dẫn đến hiện tượng nhiễm E.Coli từ các mẫu khác trong chợ: quầy cá, quầy hải sản Một số quầy (Q3, Q9) tập trung gần khu vực cống thải làm cho một lượng lớn mẫu thịt bò có thể bị nhiễm ngay từ môi trường ngoài. Vi khuẩn E.Coli có thể lan truyền từ người không rửa tay sau khi đi vệ sinh mà tiếp xúc trực tiếp với các mẫu thịt. Hình 3.6: Khuẩn lạc E.Coli 48
  50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tóm lại, trong tổng số 30 mẫu thịt bò thu từ 10 quầy tại chợ Hoàng Hoa Thám, chúng tôi nhận thấy: phần lớn thịt bò tại các quầy có đặc điểm cảm quan tốt, chỉ tiêu TPC có mức độ nhiễm vừa phải tuy nhiên không có mẫu nào vượt mức tiêu chuẩn. Riêng đối với chỉ tiêu Coliforms thì có đến 4 quầy vượt mức cho phép và cao nhất ở các mẫu của Q9, Q10. Đặc biệt cũng chính các mẫu thịt bò ở 2 quầy này có sự hiện diện của vi khuẩn E.Coli. Như vậy, nhìn chung tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm của các quầy thịt bò cũng không đáng mức báo động ngoại trừ các mẫu ở Q9 và Q10. Do đó, chúng tôi khuyến cáo với người tiêu dùng nên cân nhắc khi sử dụng sản phẩm thịt bò từ 2 quầy này. Riêng đối với các sản phẩm thịt từ chợ Hoàng Hoa Thám thì người tiêu dùng không nên ăn sống, tái mà phải chế biến kỹ để tránh tình trạng rối loạn tiêu hóa do vi khuẩn đường ruột gây ra. 49
  51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận  Đánh giá cảm quan Hầu hết các mẫu thịt bò (28/30) đều được đánh giá tốt về mặt cảm quan từ trạng thái đến mùi vị vẫn còn tính đặc trưng của sản phẩm.  Chỉ tiêu TPC Trong tổng số 30 mẫu thịt bò được lấy tại 10 quầy để phân tích thì tất cả 30 mẫu đều nhiễm TPC với mật độ khác nhau, tuy nhiên không có mẫu nào nhiễm TPC vượt quá chỉ tiêu cho phép (106 CFU/g).  Chỉ tiêu Coliforms Ở chỉ tiêu này, phát hiện 4 quầy trên tổng số 10 quầy (chiếm 40% tổng số quầy được phân tích) có mức độ nhiễm Coliforms vượt quá giới hạn cho phép (102CFU/g).  Đánh giá mức độ nhiễm E.Coli Ở thí nghiệm này, phát hiện có 7 mẫu nhiễm E.Coli trong tổng số 30 mẫu được phân tích và tỷ lệ mẫu không đạt chiếm 23%. 4.2. Kiến nghị Đối với đề tài: Cần nhiều thời gian để có thể phân tích nhiều mẫu hơn và đánh giá thêm một số chỉ tiêu vi sinh vật như Salmonella, S. aureus Vì với những mẫu có mức độ nhiễm Coliforms cao nhưng lại không có sự hiện diện E.Coli cũng không chứng tỏ chúng không mang các vi sinh vật đường ruột khác như Salmonella, Shigella. Đối với các quầy thịt tại chợ: Vệ sinh thực phẩm là tất cả những điều kiện và biện pháp nhằm đảm bảo an toàn và tính hợp lý của thực phẩm. Vì thế các tiểu thương phải: - Đảm bảo được nguồn gốc nơi lấy mẫu. 50
  52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Đảm bảo điều kiện bảo quản mẫu trong suốt quá trình vận chuyển. Phương tiện vận chuyển được chế tạo bằng vật liệu không làm ô nhiễm mẫu và dễ làm sạch. - Địa điểm, diện tích buôn bán thích hợp, có khoảng cách an toàn đối với nguồn gốc gây hại, nguồn gây ô nhiễm. - Có hệ thống xử lý nước, rác thải để bảo vệ môi trường xung quanh khu vực quầy hàng. - Phòng ô nhiễm chéo các thực phẩm lẫn nhau, các dụng cụ sang thực phẩm như dao, thớt , bàn tay, trang phục của người bán hàng trực tiếp bị bẩn. 51
  53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu tiếng Việt [1]. GSTSKH. Nguyễn Trọng Cẩn, GVC. Đỗ Minh Phụng, GV.ThS. Nguyễn Lê Hà. Công nghệ đồ hộp thủy sản và gia súc gia cầm. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. [2]. Trần Linh Thước (2003). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo dục. [3]. PGS.TS. Nguyễn Phùng Tiến, GS.TS. Bùi Minh Đức, GS.TS. Nguyễn Văn Dịp (2003). Vi sinh vật trong thực phẩm – Kỹ thuật kiểm tra và chỉ tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm. NXB Y Học Hà Nội. [4]. Nguyễn Tiến Dũng (2006). Tài liệu bài giảng Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh trong thực phẩm. Đại học Khoa Học Tự Nhiên. [5]. Phạm Minh Nhựt (2007). Tài liệu bài giảng Phương pháp đánh giá chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm. Lưu hành nội bộ Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM. [6]. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2006). Thực tập vi sinh vật học thực phẩm. NXB Đại học Quốc Gia TPHCM. [7]. Lê Huy Chính (2001). Vi sinh y học. Nhà xuất bản Y học Hà Nội. II. Tài liệu tiếng Anh [8]. Kenneth Todar, (2005) Todar’s Online Textbook of Bacteriology University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology (Staphylococcus). Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology. III. Tài liệu internet [9]. 211505 [10]. va-cac-san-pham-tu-thit-37834/ [11]. 52
  54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [12]. [13]. san-pham-tu-tinh-bot-dam-bao-ve-sinh-an-toan-thuc-pham-ve-cac-chi-tieu-ly-hoa- vi-sinh-vat-33371 [14]. [15]. [16]. 53