Đề tài Vaccine phòng bệnh do vi khuẩn Leptospira

Nội dung text: Đề tài Vaccine phòng bệnh do vi khuẩn Leptospira

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC F G VACCINE PHÒNG BỆNH DO VI KHUẨN Leptospira Giáo viên giảng dạy: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên: Trần Nam Trung Lớp: DH06SH MSSV: 06126172 1
2. I. Đặt Vấn Đề Leptospirosis là bệnh do Leptospira interrogans gây ra. Bệnh xảy ra trên tất cả các loài thú. Nó là một trong các bệnh nội vùng lây lan quan trọng giữa thú và người. Bệnh gây nhiễm trùng máu, viêm thận kẽ, vàng da xuất huyết và sẩy thai ở hầu hết các loài, đồng thời cũng là nguyên nhân gây viêm vú ở bò và bệnh viêm mắt có tính chu kỳ ở ngựa (Blood, 1989). Theo các chuyên gia nghiên cứu về Leptospira thì bệnh này có tất cả mọi nơi trên thế giới, gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi và ảnh đến sức khỏe con người ở nhiều quốc gia, đặc biệt là các nước vùng nhiệt đới (Adolf Weil, 1886; Blood, 1989; Epstein, 1995; Trevejo, 1998; Ko, 1999). Bệnh Leptospirosis rất khó tiêu diệt vì nó đa dạng về nguồn nhiễm, như động vật ở những ao hồ, động vật hoang dã và đặc biệt là động vật nuôi trong gia đình, đồng thời Leptospira có thể tồn tại rất lâu trong môi trường tự nhiên. Đặc biệt bệnh này càng khó kiểm soát ở những nước nông nghiệp phát triển (kéo theo đàn gia súc đông đúc) và có tình trạng vệ sinh môi trường kém (tạo điều kiện mầm bệnh phát triển). Tại Việt Nam, bệnh này lâu nay ít được chú ý cả về mặt pháp luật cũng như về nhận thức của nhân dân. Việc mua bán gia súc bừa bãi không được kiểm tra chặt chẽ về mặt thú y làm cho nguy cơ nhiễm bệnh ở gia súc ngày một tăng, đồng thời nguy cơ lây nhiễm sang người cũng tăng theo. Do đó, nguy cơ nhiễm bệnh Leptospirosis ở Việt Nam tăng cao. Như đã nói ở trên, việc điều trị bệnh này là rất khó khăn nên chính vì vậy cần có những biện pháp phòng ngừa bệnh có hiệu quả cao. Cho nên sản xuất vaccine phòng bệnh do vi khuẩn Leptospira là một yêu cầu cấp thiết. 2
3. II. Tổng Quan 1. Leptopira 1.1 Lịch sử phát hiện bệnh Bệnh do Leptospira interrogans gây ra được phát hiện đầu tiên vào năm 1850 trên chó tại Stuttgart (Đức). Năm 1886, Adolf Weil ở Heidelberg (Đức) đã mô tả dấu hiệu lâm sàng của bệnh này là sốt phát ban, sưng mật, đặc biệt bệnh xuất hiện đột ngột kèm theo sốt, lách to, vàng da và viêm thận. Năm 1916, người ta đã phát hiện ra L. Icterohaemorrhagiae là một serovar của Leptospira interrogans gây bệnh Weil ở Nhật Bản. Inada và cộng sự (1918) đã phát hiện serovar L. Hebdomadis gây sốt 7 ngày ở Nhật Bản và ông cũng thấy chủng L. Autumnalis gây sốt mùa thu ở Nhật Bản vào năm 1925. Theo Blood (1989), bò ở Úc và Anh nhiễm chủ yếu là L. Hardjo và serovar này cũng là nguyên nhân chính gây sẩy thai ở bò (Ellis, 1982). Những nghiên cứu tiếp theo đã tìm thấy hàng loạt các serovars khác nhau của Leptospira: L. Pyrogenes và L. Bataviae được phát hiện đầu tiên ở Indonesia năm 1923 và 1926; L. Grippotyphosa ở Liên Xô năm 1928; L. Canicola ở Hà Lan năm 1933; L. Sejroe ở Đan Mạch năm 1939 Đến nay, người ta đã phát hiện ra hơn 200 serovars khác nhau của Leptospira interrogans ở khắp nơi trên thế giới (Terpstra, 2002). Tại Việt Nam, bệnh được Ragiot và Souchard phát hiện lần đầu tiên trên người năm 1931. Sau đó, xảy ra vụ dịch ở Lai Châu (1964) gây thiệt hại nhiều gia súc và nhiễm cho cả người (Trần Thanh Phong, 1996). Đến nay, bệnh có ở tất cả các vùng miền trong cả nước. 1.2 Tổng quát về Leptospira Leptospira gây bệnh xoắn khuẩn, gọi là Leptospirosis. Đây là một bệnh lây nhiễm truyền từ động vật sang người. Bệnh bắt đầu bằng những cơn sốt, có thể làm suy yếu thận, xuất huyết phổi, tác động đến gan (gây vàng da) và nhiều triệu chứng khác. Căn bệnh này tác động đến hàng chục triệu người mỗi năm và đặc biệt cao tại các khu vực nhiệt đới. Do tính đa dạng của các triệu chứng, bệnh Leptospira khó chẩn đoán nên tỉ lệ tử vong tại một số vùng có thể lên đến 20%-25%. Năm 1886, Weil (người Đức) đã phát hiện ra bệnh Leptospirosis ở người lần đầu tiên; nhưng đến năm 1915, các nhà khoa học Nhật Bản và Pháp mới cùng tìm thấy xoắn khuẩn L. interrogans. Về phân loại thì Leptospira thuộc giới Monera, ngành Spirochaetes, họ Leptospiraceae, giống Leptospira (Noguchi., 1917). Các loài gồm có:L. alexanderi, L. biflexa, L. broomii, L. borgpetersenii, L. fainei, L. inadai, L. interrogans, L. kirschneri, 3
4. L. licerasiae, L. meyeri, L. weilii, L. noguchii, L. santarosai, L. wolbachii, L. kmetyi, L. wolffii, L. genomospecies 1, L. genomospecies 3, L. genomospecies 4, L. genomospecies 5. Trong số đó, người ta phân ra thành các loài gây bệnh, không gây bệnh và loài trung gian Các loài gây bệnh Leptospira interrogans Leptospira kirschneri Leptospira noguchii Leptospira alexanderi Leptospira weilii Leptospira genomospecies 1 Leptospira borgpetersenii Leptospira santarosai Leptospira kmetyi Các loài trung gian Leptospira inadai Leptospira fainei Leptospira broomii Leptospira licerasiae Leptospira wolffii Các loài không gây bệnh Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachii Leptospira genomospecies 3 Leptospira genomospecies 4 Leptospira genomospecies 5 Đặc điểm sinh vật học 4
5. Hình thể: rất mảnh, đường kính 0,1- 0,2μm, dài 5- 25μm. Quan sát dưới kính vi khuẩn nền đen thấy vi khuẩn di động mạnh. Thường nhuộm theo phương pháp nhuộm thấm bạc Fontana-Tribondeau mới phát hiện được vi khuẩn, khi đó vi khuẩn nhìn thấy mảnh như sợi tóc, hai đầu cong như móc câu. Dưới kính hiển vi điện tử phóng đại khoảng x 10.000 lần mới thấy các vòng xoắn nhỏ, sát nhau Tính chất nuôi cấy: đây là xoắn khuẩn duy nhất nuôi cấy được trong điều kiện hiếu khí. Thường nuôi trong môi trường lỏng có thêm huyết thanh động vật (thỏ) tươi (sản xuất theo Terskich hoặc Korthoff); pH 7,2- 7,5; nhiệt độ 28-30oC và giàu oxy. Leptospira mọc chậm, sau 6- 10 ngày mới phát triển tốt (đặc điểm nuôi cấy là làm vẩn nhẹ môi trường như khói thuốc lá). Sức đề kháng: nói chung các Leptospira có sức đề kháng yếu, song cao hơn các xoắn khuẩn khác; chết nhanh trong môi trường acid. Leptospira có thể sống tự do ở trong đất, trong nước ngọt và trong môi trường mặn (sống được hàng tháng) nhưng có ánh sáng mặt trời thì nhanh chết. Cấu tạo kháng nguyên: dựa vào cấu trúc kháng nguyên mà phân loại thì Leptospira được chia ra làm 20 nhóm; mỗi nhóm có nhiều type huyết thanh. Các type huyết thanh có nhiều yếu tố kháng nguyên trùng chéo. Ở Việt Nam thường gặp 12 type huyết thanh sau: L. australis L. canicola L. autumnalis L. grippothyphosa L. bataviae L. hebdomalis L. ictero- haemorrhagiae L. ponoma L. mitis L. saxkoebing 5
6. L. poi L. sejroe 1.3 Cách sinh bệnh Cơ chế phát bệnh của Leptospira interrogans không được biết tường tận do sự phong phú về các serovars gây bệnh. Thông thường xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh cho động vật sau khi vào cơ thể, chúng xâm nhập vào máu và nhân lên nhanh chóng tại đây. Sau 1-2 ngày có khi đến 1 tuần, xoắn khuẩn gây hiện tượng nhiễm trùng huyết. Trong giai đoạn này, có thể phân lập Leptospira trong máu và hầu hết các phủ tạng cũng như trong dịch não tủy. Pha nhiễm trùng huyết sẽ chấm dứt cùng với sự xuất hiện kháng thể kháng Leptospira trong máu. Các kháng thể này được phát hiện sau 5-10 ngày và đạt mức tối đa khoảng 3 tuần sau đó. Hiệu giá kháng thể thường đạt từ 1/1.000 đến 1/100.000 (với thử nghiệm MAT) sau đó giảm dần. Sau giai đoạn nhiễm trùng huyết, Leptospira có thể định vị ở ống lượn gần của thận. Tại đây, chúng nhân lên và bài tiết vào nước tiểu. Tùy thuộc vào từng con vật mắc bệnh và từng serovars gây nhiễm và thời gian mà cường độ bài trùng qua nước tiểu có thể thay đổi. Ngoài ra, Leptospira còn sinh độc tố phá hủy hồng cầu, phá hủy thành mao mạch, gây vỡ hoặc tắc nghẽn mao mạch dẫn đến hoại tử và xuất huyết ở niêm mạc. 6
7. Leptospira sau khi xâm nhập vào cơ thể qua đường da và niêm mạc, chúng tự nhân lên và tạo tình trạng bạo huyết, sau 7-10 ngày gây nhiễm dẫn đến những biểu hiện lâm sàng (hoàng đản, thiếu máu ). Sau đó, Leptospira theo máu đến thận và sống trong tiểu quản thận gây viêm thận (albumine niệu, ure huyết), đến gan gây viêm gan, đến não gây viêm màng não và đau cơ. Thời kỳ nung bệnh kéo dài khoảng 10-20 ngày, tùy thuộc vào trạng thái cơ thể, mức độ chăm sóc, nuôi dưỡng, đường xâm nhập, số lượng và độc tố của mầm bệnh. Sau khi khỏi bệnh, vật có miễn dịch nhưng chỉ miễn dịch với serovars đã gây bệnh trước đó. 1.4 Triệu chứng 1.4.1 Dạng cấp tính Bại huyết phát triển nhanh sau vài giờ nhiễm, sốt cao 40-41oC và suy nhược nặng. Có thể chia làm 2 thể: - Thể thương hàn: Vật bệnh có biểu hiện xuất huyết trầm trọng viêm kết mạc mắt với nhũng điểm xuất huyết ở da và niêm mạc, ói ra máu và phân sậm màu có máu, thú bị mất nước rất nhanh và chết trong 24 ngày cùng với giảm thấp thân nhiệt, thường thấp hơn bình thường. - Thể hoàng đản : Chó bệnh có biểu hiện viêm kết mạc mắt, hoàng đản, vàng da khó thở tăng dần cùng với kém ăn, ói mửa, nếu không chữa trị trong giai đoạn cuối chó có sự tăng cao nhiệt độ khó thở, hơi thở hôi. Tiêu chảy đôi khi xuất huyết và những biểu hiện viêm não trước khi hắt hơi, thú chết trong khoảng 5-8 ngày mắc bệnh 1.4.2 Thể bán cấp tính và mãn tính - Thể này tương ứng với sự phát triển hội chứng sinh urea huyết hậu quả của viêm thận mà một trong những biểu hiện là chứng tiểu nhiều, chứng khát nước rất nhiều cùng với ói mửa và tiêu chảy. Sau một thời gian hôn mê do urea huyết chó sẽ chết. - Thể thở khó có mùi urea ở miệng và xáo trộn hô hấp –viêm màng móng mắt, viêm cơ . 1.5 Bệnh tích 1.5.1 Thể cấp tính - Thể thương hàn: + Viêm dạ dày ruột xuất huyết. 7
8. + Xuất huyết da và các niêm mạc. + Có thể gặp gan sưng, hạch bạch huyết xuất huyết - Thể hoàng đản: + Da vàng ở bụng, gang bàn chân, lỡ tai. + Niêm mạc vàng. + Bàng quang chứa nhiều nước tiểu vàng sậm và có thể xuất huyết. 1.5.2 Thể bán, mãn tính - Viêm thận kẻ hay viêm thận mãn tính. - Vết lở ở miệng và lưỡi có thể gặp trên chó có urea trong máu. 1.6 Tính miễn dịch Tính miễn dịch được hình thành vào giai đoạn 2 của bệnh do Leptospira gây ra. Thể cấp tính được đề cập như là giai đoạn miễn dịch, sự biến mất cảu vi trùng khỏi dòng máu xảy ra đồng thời với sự xuất hiện kháng thể. Sự trầm trọng về lâm sàng của bệnh thường xuất hiện cùng với những biểu hiện trầm trọng về mô học. Sự sinh phức hợp miễn dịch gây viêm ở hệ thần kinh trung ương. Phức hợp miễn dịch trong hệ tuần hoàn ở mức độ khác nhau có liên quan đến các mức độ trầm trọng về mặt triệu chứng. Ở những thú vượt qua được bệnh, phức hợp miễn dịch sẽ giảm cùng với sự cải thiện về mặt lâm sàng. 1.7 Bệnh do Leptospira trên người 8
9. Theo WHO (2002), bệnh do Leptospira xảy ra trên người biểu hiện như sau: a. Sự truyền lây sang người Bệnh có thể xảy khi người ta thao tác trên thú nhiễm bệnh hay những cơ quan của nó. Mầm bệnh truyền qua các vết thương. Các nhà chăn nuôi, bác sĩ thú y có thể nhiễm trực tiếp bởi nước tiểu thú bị bệnh trong trại chăn nuôi hay trong chuồng điều trị. Phần lớn bệnh truyền sang người qua nước ao hồ bị nhiễm bẩn, bùn lầy đã nhiễm Leptospira khi người ta tắm hoặc lội qua, mầm bệnh xâm nhập qua da hay niêm mạc hầu họng, niêm mạc mắt . của người vào cơ thể. b. Triệu chứng - Bệnh do Leptospira gây hoàng đản xuất huyết Biểu hiện hoàng đản xuất huyết thường thấy nhất ở người bị bệnh do Leptospira gây ra. Bệnh phát triển có tính chu kỳ. Thời kỳ ủ bệnh 7-12 ngày. Bệnh khởi phát đột ngột, đầu tiên người bệnh sốt cao 39-40oC kèm theo biểu hiện ớn lạnh và suy yếu. Biểu hiện hoàng đản chia thành 4 pha: + Pha tiền hoàng đản: người bệnh thường bị bại huyết kéo dài trong 4-5 ngày. Nhiệt độ lên cao, đau cơ và xáo trộn vận mạch, đôi khi nổi những vết đỏ sần, hội chứng màng não như ói mửa, cứng cơ vòng ót, đau đầu. + Pha hoàng đản: bệnh nhân bị hoàng đản là do Leptospira tác động lên gan, thận. Hoàng đản xuất hiện vào ngày thứ 5 và kéo dài trong 2-3 ngày. Hoàng đản quan sát được trên niêm mạc. Đi tiểu nhiều và có albimine trong nước tiểu. Ure trong máu tăng hơn 3 g/l, sau đó dần trở nên bình thường. Đôi khi có xuất huyết (chảy máu cam, xuất huyết đường tiêu hóa ). + Pha hình thành miễn dịch: ở pha này các kháng thể bắt đầu xuất hiện trong máu của bệnh nhân thường vào ngày thứ 10 của bệnh và những biểu hiện triệu chứng giảm dần. + Pha sốt hồi quy: thường đến ngày bị bệnh thứ 15, bệnh nhân bắt đầu sốt trở lại sau vài ngày không sốt. Nhiệt độ cơ thể tăng đến 39-40oC, kéo dài 5-8 ngày nhưng hội chứng màng não, hoàng đản và yếu thận có thể giảm. Mức độ nặng nhẹ của hoàng đản cho phép xác định bệnh nặng hay nhẹ. Hoàng đản trầm trọng thường đi kèm với viêm gan, viêm thận cấp tính, vô niệu (không có nước tiểu trong bàng quang), xuất 9
10. huyết, xáo trộn thần kinh và chết trong vài ngày. Hoàng đản nhẹ thường mang tính chất tạm thời và không rõ ràng. - Bệnh do Leptospira không gây ra hoàng đản Người bị bệnh do Leptospira không gây hoàng đản thường biểu hiện các triệu chứng nhẹ và ít thấy rõ, không có biểu hiện hoàng đản. Tuy nhiên, có thể gặp những thể bệnh sau: + Những thể màng não thuần túy. Ví dụ bệnh nhân bị nhiễm các serovars như L. Ponoma, L. Tarassovi từ heo. + Những xáo trộn thần kinh (lầm lẫn về cảm giác, ảo giác) thường do nhiễm serovars như L. Sejroe, L. Hardjo. + Những thể cúm do serovars L. Groppotyphosa và L. Hardjo. + Những thể sốt, sốt 7 ngày trong bệnh sốt Nhật Bản 7 ngày do L. Hebdomadis hay sốt đồng ruộng do L. Bataviae. Những thể bệnh không gây hoàng đản này có thể chữa trị mà không để lại di chứng (Hoeden, 1964; WHO, 2002). Những biểu hiện bệnh 10
11. 2. Vaccine phòng bệnh do Leptospira Có nhiều loại vaccine phòng bệnh Leptospira: vaccine protein tái tổ hợp, vaccine lipopolysaccharide (LPS), vaccine bất hoạt, vaccine DNA. Trong phần trình bày này chủ yếu tập trung đi sâu vào vaccine DNA (vì nó là 1 phương pháp mới). 2.1 Vaccine protein tái tổ hợp Vaccine protein tái tổ hợp là loại vaccine có tiềm năng lớn trong phòng bệnh do Leptospira. Nó được xây dựng với phương pháp công nghệ sinh học hiện đại. Những đặc trưng bảo vệ của vaccine omp tái tổ hợp đã được kiểm nghiệm, nó gồm: protein ngoại màng (ompL1), lipoprotein (lipL41), protein immunoglobin. Những đoạn DNA bộ gen mã hóa những protein ngoại màng sẽ được cắt bởi enzyme XhoI và XbaI, sau những DNA này sẽ được để dùng làm khuôn để khuếch đại đoạn gen mã hóa omp nhờ PCR. Sau khi được khuếch đại những đoạn đó gen đó sẽ được chèn vào vector (E.coli) để tổng hợp ra omp. Sau đó tách chiết những omp để tạo vaccine. 2.2 Vaccine LPS Những kết quả phân tích về LPSs đã mở ra 1 hướng mới phát triển cho vaccine. Quá trình tổng hợp LPS của Leptospira tương tự như các vi khuẩn Gram âm (-). Những LPS của Leptospira kích hoạt các đại thực bào thông qua CD14 và Toll- like receptor 2 (TLR2). Vaccine LPS không đặc hiệu cho từng dòng serovar độc lập, ví dụ như vaccine từ L bilexa serovar Patoc có thể chống lại L. interrogans serovar Manilae, hiệu quả bảo vệ của loại vaccine này phụ thuộc vào liều tiêm và thời gian tiêm bao lâu. Nhưng vaccine cũng được xem như 1 vaccine đặc hiệu cho từng serovar, ví dụ vaccine từ 1 vài dòng serovar khác nhau không thể tạo đáp ứng miễn dịch đối với 1 vài dòng serovar khác. Như vậy cần phải nghiên cứu để xác định về tính đặc hiệu hay không đặc hiệu của vaccine LPS. Nếu vaccine LPS này không đặc hiệu đối với con người và các động vật khác nhau thì có thể tạo ra 1 loại vaccine có hiệu quả và đơn giản hơn. 11
12. 2.3 Vaccine bất hoạt Vaccine bất hoạt là vaccine sử dụng những vi khuẩn đã làm yếu hoặc chết, hay sử dụng những kháng nguyên thu nhận được từ 1 hoặc nhiều dòng serovar phù hợp (như Leptospira borgpetersenii serovar hardjo, Leptospira interrogans serovar hardjo hoặc những dòng L. interrogans serovar khác). Vaccine này thường được sử dụng cho chủng ngừa gia súc. Trước khi đem đi sử dụng, vaccine này được kiểm tra nhiều lần. Mỗi lần kiểm tra sẽ được thử nghiệm trên 10 thú để xác đinh được liều dùng có hiệu quả nhất. Đợt thử nghiệm được tiến hành trong 14 ngày, 4 tiếng sau khi tiêm vaccine và mỗi ngày thú sẽ được kiểm tra nhiệt độ. Sau khi đã thử nghiệm hiệu quả của vaccine thì vaccine sẽ được đem ra sử dụng. Vaccine này chỉ sử dụng cho thú từ 6 tháng tuổi trở lên. Vaccine được tiêm 2 đợt để thú có thể được kích thích tạo kháng thể tốt chống lại những dòng serovar đã nói ở trên. 2.4 Vaccine DNA Vaccine DNA là 1 loại vaccine mới được nghiên cứu gần đây, nó có nhiều ưu thế hơn so với các vaccine cổ điển như: tạo kháng thể đặc hiệu (vì kháng nguyên được tạo ra trên cơ thể), dễ kiểm soát, dễ thực hiện. Phương pháp tạo vaccine DNA: 1. Chuẩn bị dịch chất thuần nhất của tế bào Leptospira Dung dịch chứa tế bào Leptospira được thu từ phase log của nuôi cấy vi khuẩn. Môi trường nuôi cấy được ly tâm ở 12000 v/p ở 25oC trong 30 phút. Thu lấy kết tủa, rửa bằng muối buffer phosphate, pH = 7,4 ; 3 lần bằng ly tâm. Cuối cùng cho phần thu được trở về trạng thái lỏng bằng nước chưng cất siêu tinh khiết (UDW). Dung dịch được mang đem đi đánh sóng âm 20 kHz trong nước đá khoảng 5 phút. Thu nhận được lượng protein thuần nhất. Lượng protein này được sử dụng để xác định chuẩn kháng thể huyết thanh của chuột đã được miễn dịch thông qua phương pháp ELISA gián tiếp. 2. Chuẩn bị DNA bộ gen của Leptospira DNA bộ gen được trích từ toàn bộ những tế bào của L.interrogans, serogroup Icterohaemorrhagiae, serovar Copenhageni đã được thu nhận ở phase log của quá trình nuôi cấy. Tế bào vi khuẩn được rửa sạch như các bước ở trên và phần tế bào thu được từ ly tâm lần cuối (ly tâm 3 lần như ở trên) sẽ chuyển vào buffer TE (10 mM Tris-HCl, pH = 8 và 1 mM EDTA). Phần chuẩn bị đó được cho thêm vào buffer lysis 12
13. chứa 10% SDS, 3 ul của 20 ul/ml proteinase-K, 5 ul của 20 mg/ml RNase A và được ủ ở 30oC trong 1 tiếng. Sau đó thêm vào 5 M sodium chloride và cetyltrimethylammonium bromide (CTAP) ngay lập tức. Cho 1 thể tích đúng bằng thể tích trên của phenol-chloroform-isoamyl để tạo hỗn hợp. Phần chuẩn bị được ly tâm ở 12000 v/p , 25oC trong 5 phút. Phần dung dịch bên trên được chuyển sang 1 ống mới, isopropanol được thêm vào để kết tủa DNA. Rửa phần kết tủa thu được sau khi ly tâm bằng ethanol 70% và sấy khô. DNA đã sấy khô sẽ hòa tan vào buffer TE. Chất lượng của phần chuẩn bị được đánh giá thông qua khuếch đại PCR đoạn gen 16S RNA (sử dụng 2 primer oligonucleotide, primer forward: 5’-GGCGGCGCGTCTAAACATG-3’ và primer reverse: 5’-TTCCCCCCATTGAGCAAG-3’ được tạo ra từ chuỗi 16S rDNA của L.interrogans, serovar Canicola dòng Moulton. PCR amplicon được thu nhận để điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide và được nhận diện dưới tia UV (Biodoc-ITTM Imaging System, UVP Transilluminator, Cambridge, UK). DNA chất lượng tốt được thu nhận và phần chuẩn bị sau đó được sử dụng làm khuôn để khuếch đại ompLI. 3. Thiết kế primer và khuếch đại ompLI bằng PCR Những đoạn primer oligonucleotide dùng để khuếch đại ompLI bằng PCR được thiết kế từ chuỗi DNA (ID LIC 10973) mã hóa ompLI của L.interrogans, serogroup Icterohaemorrhagiae, serovar Copenhageni của dữ liệu GenBank. Chuỗi primer forward là 5’-GGCTCGAGCCATGGCATTATCTTCGGCTGCA-3’ với chuỗi Kozak và vị trí giới hạn XhoI ở đầu 5’ ; chuỗi primer reverse là 5’- GCTCTAGACTGTAGATTTGCCCACCGA-3’ với vị trí giới hạn XbaI ở đầu 3’ . PCR gradient được sử dụng để xác định nhiệt độ tối ưu của primer. Hỗn hợp PCR gồm: 16,25 ul của UDW, 2,5 ul của buffer (10x), 2 ul của 200 nM dNTPs mix, 1 ul mỗi loại primer, 2 ul của DNA khuôn, 0,25 ul của Taq polymerase (2 U/ul). Gradient nhiệt độ là 52-61oC. Mỗi PCR amplicon được thu nhận để điện di trên gel agarose và nhuộm ethidium bromide để xác định nhiệt độ tối ưu của primer, tại nhiệt độ mà tạo ra số lượng DNA mục tiêu cao nhất với DNA nhiễm thấp nhất. 4. Cloning vị trí ompLI trong vector và chọn lọc E.coli mang vector-plasmid đã chuyển Những ompLI amplicon được tinh sạch bằng cách sử dụng ethanol để kết tủa. DNA sau khi được tinh sạch sẽ được gắn vào vector pGEM-Easy thông qua gắn kết sole (plasmid-T gắn với A-DNA). Vector tái tổ hợp sẽ được dòng hóa trong những tế bào E.coli JM 109 chuyên dùng thông qua phương pháp hóa biến nạp (hoặc súng bắn gen). Chọn lọc lại những E.coli mang gen đã chuyển (bằng cách nuôi cấy trên môi trường agar có kháng sinh Luria-Bertani(LB)-ampicillin (100 ug/ml), 100 mM IPTG và 5% X-gal, những khuẩn lạc có vòng sáng trắng bao quanh và phát triển mạnh thì sẽ là những E.coli có chứa vector mang gen) cho vào môi trường nước thịt có trộn LB- 13
14. ampicillin (50 ug/ml). Sau đó đem đi nuôi cấy lắc ở 37oC trong 18 tiếng. Thu nhận những tế bào sau khi đã nuôi cấy bằng cách ly tâm 4000 v/p ở 25oc trong 5 phút. Những plasmids được tách chiết từ những tế bào bằng phương pháp alkaline lysis tiêu chuẩn và được cắt bằng endonucleases XhoI và XhaI. Những phần plasmid đã được cắt sẽ điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide và được nhận diện dưới tia UV. Những dòng E.coli có mang ompLI-plasmid tái tổ hợp sẽ được chọn lọc để tiếp tục sử dụng. 5. Chuẩn bị vaccine ompLI-plasmid Đoạn ompLI được tạo dòng phụ trong vector pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Nói tóm lại, những plasmid ompLI-pGEM-T được tách chiết từ những tế bào E.coli JM109 chuyển gen, sau đó được cắt bằng enzyme endonucleasea và được nhận diện bằng điện di trên gel agarose 1%. Những đoạn DNA mang ompLI được tin sạch từ mảng gel đã được cắt tại vị trí xác định bằng cách sử dụng bộ kit GENECLEAN-II (Bio101, LA, USA) và được gắn kết vào pcDNA3.1(+) tương ứng nhờ enzyme ligase T4 DNA. Những plasmid tái tổ hợp được đưa vào E.coli Top10 nhờ phương pháp hóa biến nạp. Những tế bào mang plasmid tái tổ hợp này sẽ được nuôi chọn lọc trên môi trường agar LB-ampicillin. Về việc chuẩn bị DNA plasmid-ompLI, dòng đơn của E.coli Top10 mang plasmid tái tổ hợp được cho tăng trưởn qua đêm trên môi trường agar LB-ampicillin sẽ được cho vào 500 ml môi trường nước thịt có LB-ampicillin đựng trong bình 2 lít và được ủ ở 37oC, lắc ở 200 rpm trong 18 tiếng. Những tế bào thu sẽ được thu nhận thông qua ly tâm 4000 v/p ở 25oC trong 30 phút. Phần rắn thu được sẽ đem đi rửa sạch với dung dịch nước muối ; plasmid được tách chiết từ tế bào bằng phương pháp alkaline lysis và được tinh sạch bằng phenol-chloroform. 6. Quá trình sao chép DNA opmLI-plasmid trong tế bào động vật hữu nhũ Để chắc chắn plasmid ompLI-pcDNA3.1(+) được biểu hiện trong tế bào động vât, những plasmid tái tổ hợp thường được sử dụng để gây nhiễm trong những tế bào COS-7 thông qua nuôi cấy mô và những mRNA opmLI được phiên mã trong tế bào COS-7 sẽ được phát hiện bằng RT-PCR. Nói tóm lại, những tế bào COS-7 được phát triển trong môi trường thiết yếu tối thiểu Dulbecco với 10% huyết thanh nhau thai bò bất hoạt bởi nhiệt trên diện tích bề mặt nuôi cấy là 25 cm2 ở 37oC trong tủ ấm CO2 5% cho đến khi phát triển được 75% bề mặt nuôi cấy. Những tế bào trên bề mặt nuôi cấy được rửa sạch với PBS vô trùng, pH = 7,4 và sau đó được bổ sung thêm 5 ml huyết thanh tươi DMEM chứa 1% penicillin-streptomycin. Plasmid tái tổ hợp ompLI- pcDNA3.1(+) (10 ug trong 10 ul DMEM) được trộn với 15 ul Polyfect (Qiagen, Germany) và hỗn hợp trộn được giữ ở 25oC trong 15 phút trước khi cho vào tế bào trên bề mặt nuôi cấy. Plasmid pcDNA3.1(+) không có ompLI được trộn với Polyfect 14
15. rồi cho vào tế bào trên một bề mặt nuôi cấy khác. Cả 2 bề mặt nuôi cấy được ủ ở 37oC trong tủ ấm CO2 5% trong 48 tiếng. Những tế bào trong cả 2 bề mặt nuôi cấy được thu nhận riêng biệt và rửa sạch với PBS vô trùng, sau đó RNA tổng cộng được tách chiết từ tế bào, sử dụng thuốc thử Trizol. DNA trong mỗi bề mặt nuôi cấy được loại bỏ bằng enzyme DNase. DNA được tổng hợp từ RNA tổng số thông qua bộ kit tổng hợp cDNA (Invitrogen). Những cDNA này sẽ được sử dụng làm khuôn trong PCR cho việc khuếch đại ompLI thông qua 2 primer forward và reverse như trên. Nhưng vì đây chỉ là loại vaccine đang được nghiên cứu, chưa thật sự đem vào thực tế sự dụng. Kết quả thử nghiệm trên chuột lông vàng Syrian: Hai mươi bốn con chuột cái lông vàng Syrian, 4 tuần tuổi, được đem ra thử nghiệm. Lấy mẫu máu để thu mẫu huyết thanh trước khi tiêm ngừa vaccine (ngày 0). Những con chuột được chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm 6 con. Mỗi con chuột của nhóm 1 được chủng ngừa vaccine vào cơ với liều lượng 100 ug ompLI-pcDNA3.1(+) trong 100 ul PBS trong khi mỗi con chuột trong nhóm 2 thì được tiêm pcDNA(+) với liều lượng giống nhóm 1, tức là miễn dịch giả. Nhóm 3 và 4 thì được tiêm với 100 ul PBS. Quá trình tiêm được nhắc lại lần 2 vào 2 tuần sau đó với cách tiêm và liều lượng như lần 1. Lấy mẫu máu để thu mẫu huyết thanh ở từng con chuột vào ngày 7, 14, 28, 42 sau lần tiêm đầu tiên. Những con chuột từ nhóm 1-3 được tiêm vào màng bụng với 10 LD50 (1000 tế bào) của L.interrogans, serogroup Pomona, serovar Pomona vào ngày thứ 49. Vì vậy, những con chuột nhóm 3 chắc chắn nhiễm leptospirosis trong khi những con chuột nhóm 4 hoàn toàn không nhiễm. Tất cả những con chuột được cho nuôi lại trong chuồng với thức ăn viên và nước ad libitum. Chúng được theo dõi tình trạng bệnh mỗi ngày (nhiệt độ trực tràng, trọng lượng cơ thể, lượng nước và thức ăn đã tiêu thụ), và sự tử vong kéo dài đến khi thử nghiệm kết thúc vào ngày thứ 21 sau khi tiêm Leptospira (ngày 70 từ lần tiêm thứ 1). Tim, phổi, gan, lá lách và thận được thu nhận từ những con chuột đã chết trong ngày thứ 21 sau khi tiêm Leptospira và từ những con chuột sống sót sau cuộc thí nghiệm. Tất cả các mô được nuôi cấy trong môi trường dung dịch EMJH có bổ sung 5- fluorouracil và ủ ở 30oC cho việc phục hồi sự sống cho Leptospira. Kết quả đạt được từ thử nghiệm: 1. Việc chuẩn bị vaccine ompLI DNA bộ gen mã hóa ompLI được thu nhận thành công từ L.interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae, serovar Copenhageni, như 16S rDNA được khuếch đại từ bộ gen DNA (dãy 1, fig 1A). DNA được sử dụng như 1 khuôn cho việc khuếch đại ompLI bằng gradient PCR và nhiệt đọ tối ưu là ở 54,6oC. Vị trí ompLI amplicon là ở 917 bp (dãy 2, fig 1A). Đoạn ompLI được tạo dòng phụ thành công vào 15
16. pcDNA3.1(+), được đưa vào E.coli Top10. Mẫu dãy DNA của XhoI và XhaI cắt plasmid ompLI-pcDNA3.1(+) từ E.coli Top10 có mang vector tái tổ hợp sau khi điện di trên gel agarose 1% và nhuộm ethidium bromide. Dòng E.coli Top10 mang vector tái tổ hợp đã lựa chọn mang ompLI- pcDNA3.1(+) và dòng E.coli chỉ mang pcDNA3.1(+) phát triển riêng biệt trong môi trường canh thịt có LB-ampicillin; những plasmid được thu nhận và tinh sạch bằng phương pháp phenol-chloroform (fig 1B). 2. Quá trình phiên mã DNA ompLI-plasmid trong tế bào COS-7 RT-PCR amplicon sử dụng cDNA được chuẩn bị từ RNA tổng cộng của những tế bào COS-7 được gây nhiễm với pcDNA3.1(+) như 1 khuôn (dãy 2, fig 2) chứng tỏ có quá trình phiên mã diễn ra trong tế bào động vật. Không có sản phẩm RT-PCR nào được phat hiện khi cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số của những tế bào COS-7 chỉ nhiễm pcDNA3.1(+). 3. Hiệu quả bảo vệ của vaccine trong chuột 16
17. Những con chuột trong tất cả các nhóm không biểu hiện dấu hiệu giảm sức sống nào sau khi được miễn dịch. Vaccine [100 ug của plasmid ompLI-pcDNA3.1(+)] và giả vaccine [pcDNA3.1(+)] được tiêm cho những con chuột của nhóm 1 và 2. Sau khi tiêm Leptospira cho các con chuột từ nhóm 1-3, tất cả con chuột đều có biểu hiện giảm sức sống, tức là lượng tiêu thụ thức ăn và nước uống giảm và trọng lượng giảm. Tuy nhiên, những con chuột nhóm 1 không phát sốt trong khi những con chuột nhóm 2 và 3 thì nhiệt độ trực tràng tăng, 37,74 +_ 0,35oC (nhóm 1) và 37,81 +_ 0,41oC (nhóm 2) [biên độ nhiệt trực tràng thông thường của chuột là 36,2 đến 37,5oC]. Những con chuột nhóm 4 sức khỏe bình thường trong suốt quá trình thử nghiệm. Tất cả những con chuột nhóm 4 (không tiêm Leptospira) sống sót đến cuối đợt thử nghiệm (ngày thứ 70). Tỷ lệ sống của chuột được thể hiện qua Fig.3. Những con chuột nhóm 2 (giả vaccine) và nhóm 3 (tiêm Leptospira sống) tất cả đều chết từ ngày thứ 5 và 6 sau khi tiêm Leptospira. Đối với nhóm 1 (vaccine), 2 con chuột trong nhóm thì chết vào ngày thứ 9, 2 con lần lượt chết vào ngày thứ 11 và 18. Hai con sống sót được đến ngày thứ 21. 17
18. Từ những kết quả đạt được, các nhà khoa học đang dần cải thiện và nghiên cứu thêm về vaccine DNA. III. Tổng Kết Nhìn chung, Leptospira là một nhóm vi khuẩn nguy hiểm, vì chúng không những gây hại trên động vật mà còn lây nhiễm trên người; đồng thời chúng là nhóm lây nhiễm, có thể từ động vật (thường là chuột) sang người, hoặc có thể từ môi trường (do chúng có thể tồn tại lâu trong môi trường) như đất, nước ao hồ Bên cạnh đó, việc điều trị bệnh cũng rất khó khăn và dễ dẫn đến tử vong. Do đó, việc nghiên cứu và sản xuất vaccine là vấn đề cấp thiết. Đã có nhiều loại vaccine được đưa ra và dần dần đang được cải thiện, chẳng hạn như vaccine DNA, nó là một hướng nghiên cứu mới và đầy tiềm năng với những ưu thế (kháng nguyên được tạo ra ngay trên cơ thể nên cơ thể luôn tạo ra kháng thể sẵn, đơn giản không cần tiêm vaccine nhắc lại ). Tóm lại, vaccine phòng bệnh do Leptopira nói riêng cũng như các loại vaccine khác nói chung đã, đang và sẽ được nghiên cứu xa hơn để tạo một bức tường bảo vệ con người cũng như động vật khỏi những tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, virus ) IV. Tài Liệu Tham Khảo www.impe-qn.org.vn , Viện sốt rét ký sinh trùng côn trùng Quy Nhơn, 1-8. www.microbialcellfactories.com, 8-10. European Pharmacopoeia, Inactivated, 10. 18
19. Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology, DNA Vaccine for Leptospirosis, 2007, 11 – 18. 19