›

Đề tài Bước đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất văcxin sởi tại Việt Nam quy mô phòng thí nghiệm

pdf 68 trang yendo 5790
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đề tài Bước đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất văcxin sởi tại Việt Nam quy mô phòng thí nghiệm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfde_tai_buoc_dau_nghien_cuu_cong_nghe_san_xuat_vacxin_soi_tai.pdf

Nội dung text: Đề tài Bước đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất văcxin sởi tại Việt Nam quy mô phòng thí nghiệm

  1. Bộ khoa học và công nghệ - Bộ Y tế Trung tâm khoa học sản xuất văcxin sabin === Đề tài độc lập cấp nhà n−ớc B−ớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất văcxin sởi tại việt nam qui mô phòng thí nghiệm 5836 20/7/2006 Hà nội – 2002
  2. Đề tài độc lập cấp Nhà N−ớc B−ớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất văcxin sởi tại việt nam qui mô phòng thí nghiệm Chủ nhiệm đề tài: GS.TSKH. Nguyễn Văn Mẫn Phó chủ nhiệm đề tài: GS.TS. Huỳnh Ph−ơng Liên Cố vấn khoa học: GS.TSKH. Hoàng Thuỷ Nguyên GS.TS KH. Đặng Đức Trạch Cán bộ tham gia: TS. Nguyễn Đăng Hiền TS. Nguyễn Thị Quỳ ThS. Cao Xuân Thịnh BS. Nguyễn Anh Thu ThS. Hoàng Thanh H−ơng CN. Trần văn Dụ CN. Đặng Mai Dung CN. Nguyễn Thanh Thuỷ BS. Đoàn Văn L−u BS. Nguyễn Thị Th−ờng BS. Nguyễn Thị Thắng Các cơ quan tham gia: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung −ơng 2
  3. Chữ viết tắt ADN Deoxyribonucleic Acid (Axit deoxyribonucleic) ARN Ribonucleic Acid (Axit ribonucleic) Bộ KHCN&MT Bộ Khoa học Công nghệ và Môi tr−ờng BTP Bán thành phẩm CCID50 Cell Culture Infective Dose 50% (Liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy) CEC Chicken Embryonate Cell (Tế bào phôi gà) CGI Cell Growth Index (Chỉ số phát triển tế bào) CMF Hanks Ca and Mg Free Hanks (Hanks không có ion Ca và Mg) CPE Cytopathic Effects (Tác dụng huỷ hoại tế bào) FBS Fetal Bovine Serum HA Hemagglutinin HAM Human Amniotic Membrane (Tế bào màng ối ng−ời) HK Human Kidney Cell (Tế bào thận ng−ời) KB Human rhinopharyngeal cancer epithelial cells (Tế bào ung th− biểu mô mũi hầu ng−ời) KHT Kháng huyết thanh KN Kháng nguyên MMR Văcxin phối hợp Sởi, Quai bị, Rubella MT Môi tr−ờng 3
  4. PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymeraza) SCD Soybean Casein Digest SPF Specific Pathogen Free (Không có tác nhân gây bệnh đặc hiệu) SSPE Hội chứng viêm não sơ cứng bán cấp TB Tế bào TCMR Tiêm chủng mở rộng TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) 4
  5. mục lục Trang Ch−ơng 1: Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 2 1.3. Nội dung nghiên cứu 2 1.3.1. Sản xuất vắcxin sởi qui mô phòng thí nghiệm 2 1.3.2. Đánh giá chất l−ợng vắcxin 2 Ch−ơng 2: Tổng quan tài liệu 2.1. Virút học 3 2.2. Lâm sàng bệnh sởi 5 2.2.1. Đặc điểm của ban sởi 5 2.2.2. Tiến triển điển hình của bệnh sởi 5 2.2.3. Triệu chứng xuất tiết của bệnh sởi 6 2.3. Quá trình nhân lên của virút sởi 6 2.4. Đáp ứng miễn dịch 7 2.5. Sinh bệnh học 8 2.6. Dịch tễ học bệnh sởi 9 2.6.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh sởi 9 2.6.2. Tình hình mắc bệnh sởi ở Việt Nam 11 2.7. Vắcxin sởi 12 2.7.1. Lịch sử của vắcxin sởi 12 2.7.2. Tình hình sản xuất vắc xin sởi trên thế giới 12 2.8. Sử dụng vắcxin sởi 14 Ch−ơng 3: Vật liệu và ph−ơng pháp 3.1. Qui trình sản xuất vắcxin sởi 16 5
  6. 3.2. Vật liệu và ph−ơng pháp sản xuất 16 3.2.1. Chủng virút Hu-191 16 3.2.2. Trứng gà SPF 17 3.2.3. Trang thiết bị và dụng cụ cần thiết 18 3.2.4. Các loại môi tr−ờng cần thiết 18 3.2.5. Ph−ơng pháp thực nghiệm 20 3.3. Ph−ơng pháp kiểm tra chất l−ợng vắcxin sởi 24 3.3.1. Kiểm tra vô trùng 25 3.3.2. Thử nghiệm nhận dạng virút sởi 25 3.3.3. Thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá 26 3.3.4. Thử nghiệm an toàn chung cho vắcxin thành phẩm trên súc vật 27 3.3.5. Thử nghiệm an toàn trên súc vật cho mẻ gặt đơn sau lọc 28 3.3.6. Thử nghiệm quan sát tế bào chứng 28 3.3.7. Thử nghiệm hấp phụ hồng cầu 29 3.3.8. Thử nghiệm tìm virút ngoại lai của mẻ gặt trên nuôi cấy tế bào 29 3.3.9. Thử nghiệm tìm virút ngoại lai của n−ớc nổi trên nuôi cấy tế bào.30 3.3.10. Thử nghiệm xác định hàm l−ợng Albumin bò tồn d− 31 3.3.11. Thử nghiệm phát hiện Mycoplasma 31 Ch−ơng 4: Kết quả và bàn luận 4.1. Kết quả sản xuất 33 4.1.1. Kết quả quá trình ấp trứng gà 33 4.1.2. Kết quả của quá trình tách và nuôi cấy tế bào 34 4.1.3. Kết quả quan sát tế bào 35 4.1.4. Kết quả đếm tế bào 36 4.1.5. Kết quả sử dụng tế bào 37 4.1.6. Kết quả tìm hiểu yếu tố ảnh h−ởng tới gây nhiễm virút 37 4.1.7. Vắcxin bán thành phẩm 39 4.1.8. Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm 41 4.2. Kết quả kiểm tra chất l−ợng 42 4.2.1. Kết quả kiểm tra nuôi cấy tế bào 42 4.2.2. Kết quả kiểm tra mẻ gặt đơn tr−ớc lọc 44 6
  7. 4.2.3. Kiểm tra vắcxin bán thành phẩm 46 4.2.4. Kiểm tra vắcxin thành phẩm 49 Ch−ơng 5: Kết luận 7
  8. Ch−ơng 1: Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Bệnh sởi là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây qua đ−ờng hô hấp, tốc độ lan truyền nhanh và dễ gây dịch, th−ờng 100% ng−ời bị nhiễm virút sẽ phát bệnh nếu nh− ch−a có miễn dịch với sởi. Thể nhẹ là sốt, phát ban sau khoảng 1 tuần ban hết, trẻ có thể hồi phục hoàn toàn. Bệnh có thể trở thành ác tính. Bệnh tiến triển nhanh và gây tử vong do suy hô hấp, viêm cơ tim cấp, giảm tiểu cầu gây xuất huyết nội tạng Do điều kiện kinh tế xã hội của n−ớc ta còn khó khăn, các ph−ơng tiện và thuốc men điều trị còn hạn chế đặc biệt là các vùng sâu vùng xa do đó tỷ lệ tử vong do sởi còn cao và tỷ lệ biến chứng do sởi lớn. Những biến chứng do sởi nh− ỉa chảy, viêm phổi, viêm tai giữa, cam tẩu mã, nặng hơn có thể viêm não cấp, viêm não xơ cứng lan toả gây tử vong và để lại các di chứng về thần kinh. Theo số liệu của ch−ơng trình Tiêm chủng mở rộng năm 1999 tỷ lệ mắc bệnh sởi trong cả n−ớc ở mức 18,84/100.000 dân. ở vùng núi phía bắc, miền Trung, Tây Nguyên tỷ lệ này còn cao hơn, có nơi từ 50-409/100.000 dân. Bệnh sởi là một trong 10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ tử vong cao ở n−ớc ta. Bệnh sởi phòng ngừa đ−ợc bằng văcxin. Hiệu lực bảo vệ của văcxin sởi đạt trên 90%. Nhiều n−ớc trên thế giới đã khống chế đ−ợc bệnh sởi nhờ sử dụng văcxin. ở Việt Nam nhờ thực hiện tiêm phòng sởi cho trẻ d−ới một tuổi mà tỷ lệ mắc đã giảm đi rõ rệt từ 30,9 tr−ờng hợp/100.000 dân năm 1987 xuống còn 18,84/100.000 dân năm 1999. Văcxin sởi bất hoạt, kể từ khi ra đời những năm đầu thập kỷ 60 đã nhanh chóng bị loại bỏ vì khả năng bảo vệ kém. Hiện nay tất cả các nhà sản xuất trên thế giới đều sản xuất văcxin sởi sống giảm độc lực. Có nhiều chủng virut nổi tiếng đ−ợc sử dụng hiện nay nh− AIK-C, CAM, Schwarz, TD97 đ−ợc sử dụng ở Mỹ, Nhật, Pháp, Bỉ; chủng L-16 đ−ợc sử dụng ở Nga, Đức; chủng Hu191 đ−ợc sử dụng ở Trung Quốc Tất cả các chủng này đều có độ an toàn cao và khả năng bảo vệ tốt. 8
  9. Việt Nam đã sản xuất đ−ợc nhiều loại văcxin phục vụ cho công tác phòng bệnh. Trong 10 loại vắcxin thiết yếu đ−ợc dùng trong ch−ơng trình TCMR hiện nay chúng ta đã tự sản xuất đ−ợc 9 trừ vắcxin sởi. Nhu cầu về văcxin sởi ở n−ớc ta rất cao, đặc biệt khi thực hiện ch−ơng trình khống chế bệnh sởi. Theo khuyến cáo của TCYTTG, mỗi trẻ cần đ−ợc tiêm 2 mũi văcxin sởi thay cho 1 mũi tr−ớc đây. Nh− vậy nhu cầu về vắcxin sởi sẽ lên tới 6 - 7 triệu liều một năm. Để đáp ứng đ−ợc nhu cầu này chúng ta sẽ phải hoàn toàn nhập ngoại. Nh− vậy là sẽ tốn kém và thụ động. Chính vì vậy mà Bộ KH CN&MT và Bộ Y tế đã giao cho chúng tôi thực hiện đề tài này với nội dung "B−ớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất vắcxin sởi tại Việt Nam qui mô phòng thí nghiệm" để dần từng b−ớc chúng ta sẽ sản xuất đ−ợc vắcxin và cung cấp đủ cho nhu cầu trong n−ớc. 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Xây dựng qui trình và sản xuất ra vắcxin sởi qui mô phòng thí nghiệm 1.2.2. Thử nghiệm, đánh giá chất l−ợng vắcxin sởi ở mức độ phòng thí nghiệm. 1.3. Nội dung nghiên cứu 1.3.1. Sản xuất vắcxin sởi qui mô phòng thí nghiệm - Nuôi cấy tế bào phôi gà một lớp - Tiến hành gây nhiễm virút : Xác định nồng độ gây nhiễm, qui trình gây nhiễm, thời điểm thích hợp để thu hoạch vắcxin cho có hiệu quả cao - Đông khô vắcxin 1.3.2. Đánh giá chất l−ợng vắcxin - Kiểm tra tác nhân ngoại lai có trong tế bào - Kiểm định mẻ gặt đơn - Kiểm định vắcxin bán thành phẩm tr−ớc lọc - Kiểm định vắcxin bán thành phẩm cuối cùng - Kiểm định vắcxin thành phẩm. 9
  10. Ch−ơng 2: Tổng quan tài liệu 2.1. Virút học Virút sởi thuộc giống Morbillivirus họ Paramyxoviridae phân họ Pneumovirinae. Vật liệu di truyền là ARN một sợi âm. Virút có hình cầu không đồng nhất với kích th−ớc từ 150-200nm. Vỏ virút bao gồm 2 lớp Lipit. Trên bề mặt có 2 glycoprotein H và F chúng tạo nên những gai nhô lên trên bề mặt virút. Protein H (hemagglutinin) có chức năng hấp phụ hồng cầu và bám dính lên bề mặt tế bào trong khi đó protein F (fusion) tạo ra các cầu nối liên kết các tế bào với nhau. Protein M (matrix) tạo nên một lớp nền ở bên trong vỏ. Protein NP tạo nên các nucleocapsit bao quanh ARN hình xoắn ốc. Protein P (photphorynate) và L (large) cũng đ−ợc chứa trong nucleocapsit và liên quan đến quá trình sao chép của ARN. NP H &F M ARN L P Lớp Lipit kép Hình 2-1: Sơ đồ cấu tạo của hạt virút sởi H: Hemagglutinin protein ; F: Fusion protein; M: Matrix protein; L: Large protein: NP: Nucleoprotein, P: Photphorynate protein 10
  11. 3' N P M F H L 5' 1688 1657 1473 2377 1949 6639 2 4 6 8 10 12 14 Kilobazơ Hình 2-2: Sơ đồ gen của virút sởi (theo D.W.Kingsbury, "Field Virology", 2nd Ed.,p.948. Raven, New York, 1990) Bảng 2-1: Sản phẩm và chức năng của gen Gen Số l−ợng Đặc tính của protein (tính nucleotit Trọng l−ợng pt từ của Axit Không Vị trí trong Các tính chất đầu ARNtt trừ amin hoạt SDS- hạt virút Chức năng khác 3') poly A động PAGE N 1688 523 58111 60000 Nucleo- Protein cấu photpho cápsit trúc của protein, nằm nucleo-capsit sâu trong ARN, chiếm 25% tổng số Pr của hạt virút P 1657 507 53900 68000 Nucleo- Thành phần Photpho cápsit cấu trúc của protein, có tính phức hợp men axit, chiếm polymeraza 10% tổng số Pr của hạt virút M 1473 335 37714 39000 Trong vỏ Liên kết giữa có tính bazơ, vỏ và không −a n−ớc, nucleocapsit chiếm 25% tổng số protein 11
  12. của hạt virút F 2377 550 59510 62000 trên bề mặt liên kết giữa chiếm 15% của vỏ vỏ virút với tổng protein màng tế bào của virút H 1949 617 69250 78000 trên bề mặt vùi trong thụ chiếm 25% của vỏ thể của tế bào protein virút virút chủ L 6639 2183 247611 >200000 nucleocaps men 2% tổng it polymeraza protein virút 2.2. Lâm sàng bệnh sởi 2.2.1. Đặc điểm của ban sởi - Ban xuất hiện tuần tự từ sau tai lan ra đầu mặt cổ sau đó lan xuống thân mình và tứ chi. - Ban màu đỏ, một số có thể kết hợp lại xen kẽ với những nốt ban là các khoảng da khoẻ mạnh. - Ban mất đi cũng tuần tự theo nh− lúc xuất hiện. - Sau khi ban lặn xuất hiện các nốt thâm thẫm mầu trên da tạo nên hình vằn da hổ. 2.2.2. Tiến triển điển hình của bệnh sởi Ngày của bệnh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 40 39 38 C) o 37 ( 36 Giai đoạn tiền Giai đoạn ngoại ban Giai đoạn lui bệnh Nhiệt độ cơ thể triệu (xuất tiết) Hạt Koplik Phát ban Để lại vết thâm Viêm kết mạc Chảy n−ớc mũi Ho Hình 2-3: Tiến triển của bệnh sởi 12
  13. 2.2.3. Triệu chứng xuất tiết của bệnh sởi Mắt Viêm kết mạc Chảy n−ớc mắt Mũi Chảy n−ớc mũi Nghẹt mũi Khoang miệng Hạt Koplik Viêm hầu họng Hầu họng Viêm thanh quản Ho Đ−ờng hô hấp Viêm phế quản Ho Đ−ờng tiêu hoá Xuất tiết đ−ờng ruột ỉa chảy 2.3 Quá trình nhân lên của virút sởi Nhìn chung, quá trình nhân lên của virút sởi đ−ợc tóm tắt nh− sau : Virút hấp phụ lên Receptor của tế bào vật chủ, xâm nhập vào bên trong tế bào, cởi vỏ → Tổng hợp các thành phần của virút (gen và protein) → Lắp giáp các thành phần đã tổng hợp đ−ợc → Giải phóng hạt virút ra khỏi tế bào. Sự lan truyền virút từ tế bào này sang tế bào khác theo 2 cách: 1) virút đ−ợc giải phóng ra từ tế bào bị nhiễm đ−ợc truyền trực tiếp đến tế bào lành và 2) virút đ−ợc truyền từ tế bào này sang tế bào khác nhờ vào sự liên kết của tế bào. Khi virút giải phóng ra khỏi tế bào theo cách 1) thì protein màng (M) sẽ có ái lực với vỏ và nucleocapsit để hình thành nên hạt virút. Còn theo cách thứ 2) khi các tế bào đã liên kết với nhau thì virút không cần phải giải phóng ra ngoài. Các loại tế bào nhạy cảm với virút sởi nh− tế bào thận khỉ, thận ng−ời, thận chuột lang, thận cừu, tế bào phôi gà tiên phát, các loại tế bào th−ờng trực nh− : Vero, KB (tế bào ung th− biểu mô hầu họng) và Hela. Tế bào B95a đ−ợc chuyển thể bởi virút Epstein-Barr từ nguyên bào lympho của khỉ đuôi sóc gần đây đ−ợc xem là nhạy cảm nhất với virút sởi. Tỷ lệ nhân lên của virút sởi là thấp. Chúng bắt đầu nhân lên trong tế bào cả Vero và KB 20 giờ sau khi thâm nhiễm và chúng đạt đỉnh cao vào ngày thứ 4-6. Sau đó tế bào giữ đ−ợc tốc độ sản sinh virút. Số l−ợng virút tạo ra trên tế bào KB vẫn giữ ở tỷ lệ cao cho đến ngày thứ 12. Trong thời gian đó tế bào chủ dần dần thoái hoá. Số l−ợng virút giải phóng ra 13
  14. ngoài chỉ bằng 1/10 đến 1/100 số l−ợng virút tổng hợp đ−ợc và chúng đ−ợc xem là hầu hết virút tổng hợp đ−ợc đều dính chặt vào tế bào chủ. Hiệu giá HA bắt đầu tăng 4 ngày sau khi thâm nhiễm. Điều đó chứng tỏ rằng số l−ợng hạt virút làm tăng hiệu giá HA. Đối với tế bào Vero hiệu giá HA và sự thâm nhiễm giảm kể từ ngày thứ 12. Tế bào khổng lồ đ−ợc hình thành đối với tế bào Vero lớn hơn rất nhiều so với tế bào KB. Cuối cùng tế bào khổng lồ bị dung giải liên quan đến các b−ớc của quá trình nhân lên của virút. Một lý do mà virút sởi nhân lên trong tế bào KB lâu hơn có thể là do chúng ít tạo thành tế bào khổng lồ. Mặt khác virút rất dễ bị bất hoạt bởi nhiệt và tia cực tím. Hiệu giá thâm nhiễm giảm 1/2 khi hỗn dịch virút đ−ợc giữ ở 4oC trong 12 giờ. Chúng chỉ còn 1/10 khi giữ ở 33oC trong 15 giờ và 37oC trong 5 giờ, và chỉ còn 1/100 khi ở 37oC trong 15 giờ. Những kết quả trên cho thấy virút sởi không đ−ợc tạo ra với số l−ợng lớn trong cùng một lúc và những hạt virút mới tạo ra rất dễ bị bất hoạt. Do đó số l−ợng virút đ−ợc bài tiết ra ở đ−ờng hô hấp trên và trong n−ớc bọt là những virút đã thắng đ−ợc những yếu tố bất lợi trên chúng có khả năng thâm nhiễm rất mạnh. Điều này giúp cho chúng ta phải xác định đ−ợc thời gian thu hoạch văcxin tối −u và tìm ra ph−ơng pháp bảo quản tốt trong quá trình sản xuất. 2.4. Đáp ứng miễn dịch Kháng thể xuất hiện ngay khi ban xuất hiện. Xuất hiện sớm nhất là IgM, tiếp theo là IgG và IgA trong huyết thanh và trong dịch tiết. Cả IgM và IgG đ−ợc sản sinh ra tr−ớc tiên nh−ng IgM đạt đỉnh cao vào ngày thứ 7 đến ngày thứ 10 sau khi xuất hiện ban, sau đó giảm nhanh và không tồn tại sau 4 tuần. Sự có mặt của IgM chứng tỏ bệnh nhân bị nhiễm sởi tiên phát hoặc tiêm vắcxin. Còn IgG đ−ợc tồn tại lâu. Cấu trúc vỏ bao ngoài của hạt virut có các hemaglutinin. Có vai trò giúp virút bám vào receptor của tế bào cảm thụ. Sau đó protein hoà màng xâm nhập phức hợp tái tổ hợp, thực hiện sự nhân lên của virút trong tế bào cảm thụ. Sau khi virút đ−ợc nhân lên, giai đoạn giải phóng của virút thực hiện theo ph−ơng thức nẩy chồi. Virút sởi là 14
  15. virút đồng nhất, không có sự biến dị mọi cấu trúc của virút, do vậy sau khi nhiễm virút sởi, kháng thể sởi sẽ duy trì suốt đời. Virút sởi chỉ gây bệnh cho ng−ời. Tuy nhiên việc trung hoà virut sởi trong phòng thí nghiệm có thể bị ảnh h−ởng bởi kháng thể kháng HA. Do đó để ngăn ngừa sự lan truyền virut trong cộng đồng cần có cả kháng thể kháng kháng nguyên F. Kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên F là đặc hiệu cho từng chủng. Vai trò quan trọng của kháng thể này đ−ợc phỏng đoán từ khi ng−ời ta nhận ra rằng văcxin sởi bất hoạt không mang lại miễn dịch đầy đủ. Văcxin này không tạo ra đ−ợc kháng thể kháng kháng nguyên F. Thành phần M của virut sởi cũng đã đ−ợc nghiên cứu, đặc biệt trong những bệnh nhân bị bệnh viêm não sơ cứng bán cấp (SSPE). Ng−ời ta nhận thấy rằng những bệnh nhân SSPE có kháng thể kháng thành phần M rất thấp. So sánh 9 chủng virut khác nhau bằng kháng thể đơn dòng đã phát hiện ra rằng protein M thay đổi trong các quyết định kháng nguyên. Đánh giá hiệu quả sau khi tiêm chủng bằng xác định kháng thể trong máu và so sánh tr−ớc khi tiêm vắc xin với sau khi tiêm vắcxin ít nhất 4 tuần. Th−ờng sử dụng phản ứng ức chế ngăn ng−ng kết hồng cầu (HI) để xác định hiệu giá kháng thể. Hiệu giá kháng thể cao ở giai đoạn đầu, nó vẫn tồn tại kéo dài từ 1 → 1,5 năm sau tiêm. Sau đó giảm dần từ 1/2 → 1/3 trong vòng 5 năm. 2.5.Sinh bệnh học Con ng−ời bị nhiễm bệnh qua đ−ờng hô hấp. Virút xâm nhập vào hệ thống bạch huyết, có thể ở thể tự do hoặc liên kết với các đại thực bào, và đi tới các hạch bạch huyết. Tại đây virút nhân lên mạnh mẽ nh−ng không gây huỷ hoại nhiều tế bào, và có một số lan truyền sang các hạch bạch huyết khác, tới lách. Những tế bào đơn nhân bị nhiễm sẽ tạo thành tế bào đa nhân khổng lồ, tế bào lympho T nhạy cảm với virút sởi khi chúng đang hoạt động. Khoảng 6 ngày sau khi bị nhiễm xuất hiện virút trong máu và các hạt virút lan truyền khắp cơ thể. Vì biểu mô liên kết chỉ có 1 hoặc 2 lớp tế bào nên chúng bị huỷ hoại tr−ớc tiên, chỉ 9-10 ngày sau khi bị nhiễm. Sau đó các triệu chứng bệnh cấp tính xảy ra nh− ho, chảy n−ớc mũi, phù nề mô liên kết, sốt cao, xuất 15
  16. hiện hạt Koplik. Các triệu chứng này giảm đi khi ban xuất hiện. Cũng trong giai đoạn này, trong máu ngoại vi xuất hiện kháng thể kháng virút sởi. 2.6. Dịch tễ học bệnh sởi 2.6.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh sởi Virút sởi có khả năng lây nhiễm rất mạnh so với các tác nhân gây bệnh đ−ợc biết cho đến nay. Bệnh có triệu chứng lâm sàng điển hình. Khi ng−ời không có kháng thể kháng lại virút sởi bị nhiễm virút sởi thì sẽ bị bệnh, chỉ một số rất ít không có triệu chứng. Tuy nhiên, có một số tr−ờng hợp mà trẻ bị phơi nhiễm với virút trong khi kháng thể do mẹ truyền sang đã giảm nh−ng vẫn không có biểu hiện lâm sàng. Sởi đ−ợc biết đến nh− là một bệnh của trẻ nhỏ, tất cả mọi ng−ời nhạy cảm với virút đều có thể bị nhiễm bất kể lứa tuổi nào. Bởi vì chúng có khả năng lây nhiễm mạnh, những đứa trẻ trở nên nhạy cảm với virút sởi vào lúc 6 tháng tuổi có thể bị nhiễm bệnh ngay sau khi chúng bị tiếp xúc với virút. Do đó tuổi mắc bệnh chủ yếu là trẻ nhỏ. Sau khi khỏi bệnh ng−ời ta có đ−ợc miễn dịch cao chúng có thể tồn tại suốt cuộc đời. Do đó sởi còn đ−ợc gọi là bệnh không ai mắc lần thứ 2. Vì các đặc tính đó nên dịch sởi th−ờng có tính chu kỳ. Những ng−ời nhạy cảm luôn luôn đ−ợc bổ sung bằng những đứa trẻ mới sinh và những đứa trẻ di c− đến và cơ hội của chúng khi tiếp xúc với ng−ời bệnh. Khi các yếu tố này v−ợt quá một ng−ỡng nhất định thì một vụ dịch sẽ xảy ra. Sau khi khỏi bệnh những ng−ời này đ−ợc loại khỏi nhóm có nguy cơ. Do đó chỉ còn những ng−ời có nguy cơ mới là vấn đề cần quan tâm. Chu kỳ của dịch sởi trong cộng đồng rộng lớn th−ờng là 2 năm. Bartlett (1960) đã phát hiện ra mối liên hệ giữa dịch sởi và độ lớn của cộng đồng tại Mỹ và Anh. Ông cho rằng từ 4000 - 5000 ca xảy ra trong một năm trong một cộng đồng có từ 250 - 300 ngàn dân mới có thể làm cho dịch xảy ra th−ờng xuyên, bởi vì virút không thể tồn tại lâu trong một cộng đồng nhỏ và nó không thể tồn tại nếu không có những ng−ời mang mầm bệnh từ những nơi dịch xảy ra. Black (1966) đã phân tích các báo cáo hàng tháng của bệnh sởi ở một số thành phố và ở 19 hòn đảo trong 15 năm. Kết quả cho thấy 1) dịch sởi đôi khi không tồn tại 16
  17. ở một hòn đảo với dân số d−ới 500 ngàn ng−ời và 2) độ dài của dịch tỷ lệ nghịch với mật độ dân số. Do đó ông đã khẳng định rằng với một cộng đồng khoảng 350 ngàn dân với mật độ dân số cao nh− các thành phố lớn là cần thiết cho bệnh sởi l−u hành trong cộng đồng dân c−. Cliff và Haggett (1984) đã phân tích các yếu tố địa lý dựa vào kết quả của Blak về dịch tễ học bệnh sởi và đã chia cộng đồng ng−ời thành 3 nhóm. Mỗi nhóm có một đặc điểm về dịch sởi liên quan đến độ lớn của cộng đồng. Những cộng đồng dân c− lớn có đặc điểm dịch sởi theo kiểu I, trong đó dịch xảy ra liên tục và giữa các vụ dịch luôn có các bệnh nhân bị bệnh. Những cộng đồng vừa có kiểu thứ II. Kiểu này cho thấy dịch xảy ra theo chu kỳ nh−ng không liên tục bởi vì dân số quá ít để có thể l−u giữ đ−ợc virút sởi sau mỗi vụ dịch. Virút biến mất trong giai đoạn giữa 2 vụ dịch và nguồn lây chủ yếu là do những bệnh nhân từ cộng đồng lớn mang tới trong thời gian ở đó xảy ra dịch. Trong cộng đồng dân c− nhỏ dịch xảy ra theo kiểu thứ III. Dịch xảy ra không liên tục và không theo một qui tắc nào cả. Kiểu I Kiểu II Kiểu III 17
  18. 2.6.2. Tình hình mắc bệnh sởi ở Việt Nam Bệnh sởi đã giảm đáng kể kể từ khi ch−ơng trình TCMR đ−ợc thực hiện ở n−ớc ta. Tuy nhiên, trong những năm gần đây các vụ dịch sởi vẫn xảy ra rải rác tại nhiều địa ph−ơng trong cả n−ớc. Bệnh sởi xảy ra quanh năm, xuất hiện nhiều trong mùa xuân, thấp nhất vào mùa hè - thu. Trong năm 1999, cả n−ớc có 13.475 tr−ờng hợp mắc sởi, số ca d−ới 5 tuổi chiếm 18,93%. Số chết do bệnh sởi trong những năm gần đây dao dộng thấp trong khoảng 8 - 9 tr−ờng hợp/năm. Theo số liệu của ch−ơng trình TCMR phía Bắc cho thấy 30,4% trẻ mắc sởi d−ới 5 tuổi là do không đ−ợc tiêm chủng hoặc tiêm không đúng lịch. Đó cũng chính là một trong những nguyên nhân làm cho bệnh sởi gia tăng trong những năm qua. Do tăng c−ờng công tác tiêm chủng, tỷ lệ tiêm phòng sởi đ−ợc tăng lên từ 42% năm 1987 lên 89% năm 1992 và duy trì ở mức trên 90% cho đến năm 1999. Đồng thời với sự tăng tỷ lệ tiêm chủng, tỷ lệ mắc giảm đi rõ rệt từ 30,9 tr−ờng hợp trên 100.000 dân năm 1987 giảm xuống 18,84% năm 1999. Đối với một số vùng núi phía Bắc, miền Trung và Tây nguyên tỷ lệ mắc vẫn cao (từ 50 tới 409/100.000 dân). Trong 5 tháng đầu năm 2000, trên 14 tỉnh, 34 huyện ở miền Bắc đã có 7172 tr−ờng hợp nghi mắc sởi, tỷ lệ trẻ d−ới 5 tuổi chiếm 18%, từ 5 - 9 tuổi là 36%, 10-15 tuổi chiếm 39% và trên 15 tuổi chiếm 39%. Qua theo dõi thấy rằng tuổi mắc bệnh đã chuyển dịch lên lứa tuổi cao hơn, chủ yếu những trẻ ch−a tiêm chủng và những trẻ mới tiêm một mũi vắcxin sởi. 2.7. Vắcxin Sởi 2.7.1. Lịch sử của vắcxin sởi. Vắc xin sởi chết đã đ−ợc sử dụng ở Mỹ từ năm 1963 → 1967, nh−ng do hiệu quả bảo vệ ngắn đã khuyến cáo tiêm vắcxin sống giảm độc lực. Vắcxin sống giảm độc lực lần đầu tiên đ−ợc giới thiệu cũng vào năm 1963, 1967, 1969. Đến năm 1971 18
  19. vắcxin sởi sống giảm độc lực kết hợp với quai bị, Rubella đ−ợc chính thức đ−a vào sử dụng. 2.7.2. Tình hình sản xuất vắc xin sởi trên thế giới 2.7.2.1. ở Nhật Bản Tr−ớc kia sử dụng vắcxin sởi chết, nh−ng sau đó huỷ bỏ vì có phản ứng phụ và xuất hiện thể sởi không điển hình. Hiện nay đang sản xuất và sử dụng vắcxin sởi sống giảm độc lực, có 4 chủng virút sởi : Schwarz, CAM, AIK - C, TD - 97 đang đ−ợc sử dụng để sản xuất vắc xin này. Mỗi chủng đều thích nghi ở nhiệt độ thấp, nh−ng độ nhậy cảm nhiệt độ của vắcxin phụ thuộc vào chủng virút dùng để sản xuất. 1970 1975 1980 1985 1990 Schwarz Schwarz FF8 CAM - 70 AIK - C TD 97 Chủng AIK - C và Schwarz FF8 có nguồn gốc từ chủng Edmonston. Chủng CAM - 70 và TD - 97 có nguồn gốc từ chủng Tanabe là chủng đ−ợc phân lập ở Nhật. Lịch sử các chủng gốc đang đ−ợc sử dụng để sản xuất vắcxin sởi sống giảm độc lực ở Nhật. 19
  20. edmonston Tanabe strain HK/24 HA/28 HA/12 CE/6 MK/1 MK(320C)/1 SK (330C)/17 CEF(370C)/14 HK/3 GPK(320C)/37 CEF (330C)/12 MK/1 GPK(320C)/5 Edmonston A HK/5 CEF(320C)/7 MK/1 MK(320C)/1 CEF(320C)/85 CE/90 CEF(320C)/2 HK/2 MK(320C)/2 AIK-C Schwarz CE/4 Kitasato institute CAM/35 CEF(310C)/31 CEF (260C)/12 CEF(310C)/4 CAM-70 TD97 Schwarz FF8 osaka University Chiba Serum Institue Takeda Chemical Industry Co., Ltd CAM : Embryonated egg chorioallantoic cavity, CE : Embryonated egg amniotic cavity, CEC : Chick embryo cells, GPK : guiea-pig kidney cells, HA : Human amniotic cells, HK : Human kidney cells, MK : Monkey kidney cells, SK : Sheep kidney cells. Từ tháng 4 năm 1998 bên cạnh việc tiêm chủng vắcxin đơn giá, sử dụng vắcxin phối hợp MMR : sởi, quai bị, Rubella. 2.7.2.2. ở Trung quốc ở Trung quốc sử dụng chủng Hu191 (Th−ợng Hải 191) để sản xuất vắcxin Sởi sống giảm độc lực, phục vụ cho nhu cầu tiêm chủng trong n−ớc. Chủng Hu191 đ−ợc phân lập từ một bé trai 2 tuổi mắc thể sởi điển hình năm 1960 ở Th−ợng Hải. Virút sởi này đ−ợc nhân lên trên tế bào thận ng−ời tiên phát 33 lần, tiếp tục đ−ợc nhân lên trên tế bào màng ối ng−ời 39 lần, sau đó chuyển sang tế bào phôi gà 16 lần và đ−ợc chính phủ Trung quốc cấp giấy phép sử dụng làm chủng 20
  21. gốc năm 1965. Văcxin dùng cho ng−ời đ−ợc sản xuất từ đời cấy truyền thứ 22 đến đời thứ 32. Chủng này hiện nay đ−ợc dùng ở viện văcxin và huyết thanh Bắc Kinh và viện văcxin và sinh phẩm Vũ Hán Trung Quốc. Trong một nghiên cứu về huyết thanh học và dịch tễ học sau khi tiêm văcxin sởi đ−ợc sản xuất từ chủng Hu191 trên 503 trẻ từ 6 đến 15 tháng tuổi, từ năm 1991 đến 1998 thấy rằng: tỷ lệ đáp ứng miễn dịch đạt 91,65%, hiệu giá kháng thể trung bình nhân đạt 1:266,74. Tuổi gây miễn dịch là một yếu tố rất quan trọng quyết định tỷ lệ đáp ứng miễn dịch. Qua nghiên cứu cho thấy trẻ d−ới 6 tháng tuổi có tỷ lệ đáp ứng thấp hơn rõ rệt so với trẻ trên 8 tháng tuổi. 2.8. Sử dụng vắcxin sởi Trình bày vắcxin d−ới dạng đông khô, có chất bảo quản và kháng sinh. Nó có mầu đỏ trong suốt khi hoàn nguyên. Vắcxin đông khô đ−ợc bảo quản d−ới 50C trong điều kiện không có ánh sáng. Hiệu giá của vắcxin không d−ới 1.000 CCID50/ 1 liều. Vắc xin đ−ợc tiêm d−ới da, tiêm cho trẻ từ 9 tháng tuổi . Trong vùng dịch sởi khuyến cáo phải tiêm cho trẻ từ 18 tháng đến 36 tháng tuổi. Vắcxin này có thể tiêm quanh năm, nh−ng tốt nhất nên tránh vào thời điểm giữa mùa hè hoặc đang giai đoạn có dịch sởi l−u hành. Chống chỉ định : Những ng−ời nhiễm HIV nên tránh không tiêm chủng vắcxin Sởi. Hiện tại có hai loại vắcxin sởi : vắcxin sởi sống giảm độc và vắcxin sởi chết. Vắcxin sống giảm độc rất có hiệu quả phòng bệnh sởi, do vậy nó đ−ợc tiêm cho trẻ em 9 tháng tuổi để phòng bệnh sởi ở mọi hình thái lâm sàng. Vắcxin chết, trong quá trình sản xuất đã phá huỷ protein kháng nguyên hoà màng, do vậy kháng thể hình thành sau khi tiêm vắcxin không đủ để kháng lại mọi kháng nguyên của virút sởi. Vì vậy nếu nhiễm virút sởi hoang dại, ng−ời đã tiêm có thể bị sởi không điển hình, đó là nguồn lây không biết rõ nên khó phòng. 21
  22. Ch−ơng 3 Vật liệu và ph−ơng pháp 3.1. Qui trình sản xuất vắcxin sởi Trứng gà SPF ấp tại 38oC/9 ngày Trypsin hoá phôi gà Nuôi cấy tế bào một lớp Sau 2 ngày tế bào phát triển kín một lớp Gây nhiễm virút/33oC Sau 3 ngày Rửa tế bào đã nhiễm virút Thay bằng môi tr−ờng duy trì/33oC Sau 3-4 ngày Khi CPE đạt 3+. Giữ 5oC/ qua đêm Gặt, Lọc, Cho chất bảo quản Đóng lọ, Đông khô 3.2. Vật liệu và ph−ơng pháp sản xuất 3.2.1. Chủng virút Hu-191 Chủng do Viện vắcxin và huyết thanh Bắc Kinh, Trung Quốc cung cấp 22
  23. Lịch sử của chủng Hu-191 Virút Sởi (Phân lập từ một bệnh nhân nam 2 tuổi ở Th−ợng Hải năm 1960) HK/33 lần cấy truyền HAM/39 lần cấy truyền CEC/16 lần cấy truyền Đ−ợc cấp phép năm 1965 CEC/P22 Từ đây cho đến P32 dùng cho ng−ời CEC/P30 Việt Nam Sơ đồ 3-1: Lịch sử chủng virút sởi Hu-191. 3.2.2. Trứng gà SPF Trứng gà không có tác nhân gây bệnh đ−ợc nhập từ công ty MERIAL Trung Quốc (Giấy chứng nhận - Phụ Lục 1) a) ) a) b) ảnh 3-1: Trứng gà SPF a) và hình ảnh trứng gà 9 ngày tuổi phát triển bình th−ờng. 23
  24. 3.2.3.Trang thiết bị và dụng cụ cần thiết - Máy đo pH - Tủ ấp trứng 39oC - Máy kiểm tra trứng - Pank, kéo - Chai nuôi tế bào - Các dụng cụ thuỷ tinh - L−ới lọc tế bào - Tủ ấm 33oC, 37oC Harman - Đức - Tủ lạnh, tủ đá - Kính hiển vi lộn ng−ợc - Nhật - Hốt vô trùng - Lọc millipore - Mỹ - Máy đông khô Virtis - Mỹ 3.2.4. Các loại môi tr−ờng cần thiết. 3.2.4.1 Dung dịch trypsin STT Thành phần hóa học H∙ng sản xuất số g/l 1 NaCl Sigma 80 2 KCl Merck 2 3 KH2PO4 Merck 2 4 Na2HPO4.12 H2O Merck 11,5 5 Red Phenol BDH 0,02 6 Trysine Gibco 1,25 Kháng sinh: Kanamycin Chống nấm: Fugizon N−ớc cất 2 lần vừa đủ 1 lít 24
  25. 3.2.4.2. Môi tr−ờng Earle. STT Thành phần hoá học H∙ng sản xuất số g/l 1 NaCl Sigma 136 2 KCl Merck 8 3 CaCl2.2H2O Labosi 5,28 4 MgCl2.6H2O Merck 3,4 5 NaH2PO4.2H2O Merck 3,16 6 Gluco Labosi 20 7 Red Phenol BDH 0,02 Kháng sinh : Kanamycin Chống nấm : Fugizon N−ớc cất 2 lần vừa đủ 1 lít 3.2.4.3. Môi tr−ờng phát triển LH (0,2% Lactabumin Hydrolyzat - 3% huyết thanh bê) - Lactabumin Hydrolyzat : 2 g/l - Huyết thanh bê : 30 ml/l - Môi tr−ờng Earle : vừa đủ 1 lít 3.2.4.4. Môi tr−ờng duy trì: 199 (Sigma) 3.2.4.5. Môi tr−ờng bảo quản. STT Thành phần hoá học H∙ng sản xuất Số g/l 1 Sodium Glutamat Labosi 16 2 UREA Labosi 8,3 3 Arginin Merck 2,7 4 Succoze Labosi 50 5 Gelatin BDH 10 6 Albumin, Human Sigma 2 Đ−ợc pha trong môi tr−ờng 199 25
  26. 3.2.5. Ph−ơng pháp thực nghiệm 3.2.5.1. Ph−ơng pháp ấp trứng gà Trứng nhập từ Trung Quốc đ−ợc bảo quản ở nhiệt độ phòng từ 2 - 4 ngày, ấp trong tủ ấm nhiệt độ 37oC - 38oC, độ ẩm 60% - 70%. Đảo trứng 2 lần trong 1 ngày. Sau 9 ngày kiểm tra sự phát triển của phôi quan sát thấy các mạch máu rõ, phôi phát triển bình th−ờng, đ−ợc đem sử dụng (nh− ảnh 1-b), loại bỏ phôi không đạt tiêu chuẩn. 3.2.5.2.Ph−ơng pháp tách và nuôi cấy tế bào. Sát trùng trứng bằng cồn i-ốt Cắt bỏ vỏ trứng ở đầu có túi khí Lấy phôi Cắt bỏ đầu, chân, cánh Cân trọng l−ợng phôi Rửa 3 lần bằng Hanks Nghiền nhỏ phôi bằng bơm tiêm 10 ml Cho những mảnh phôi vào bình trypsin hoá Rửa 2 lần bằng Hanks, 1 lần bằng dung dịch trypsin Đổ dung dịch trypsin vào bình với 5-7 ml/1 phôi Khuấy từ /10 phút x 4 lần Hỗn dịch tễ bào đ−ợc thu vào chai có chứa sẵn môi tr−ờng phát triển Ly tâm Loại bỏ n−ớc nổi Cặn tế bào đ−ợc đánh kỹ bằng pipét trong môi tr−ờng phát triển Hỗn dịch tế bào 26
  27. Lấy 1ml hỗn dịch tế bào trên pha loãng 8 lần, nhuộm tế bào bằng thuốc nhuộm xanh Trypan 0,4% và tiến hành đếm tế bào. Nồng độ tế bào đ−ợc nuôi cấy trong chai Roux có thể tích 150 ml là 4.105 tế bào/ml. Giữ những chai tế bào trong tủ ấm 36,5oC - 37oC. Sau 2 ngày quan sát sự phát triển của tế bào bằng kính hiển vi lộn ng−ợc. Đếm tế bào có trong 1 chai sau khi tế bào phát triển kín 1 lớp, đánh giá sự phát triển của tế bào bằng chỉ số phát triển tế bào (CGI). 3.2.5.3.Gây nhiễm vi rút, gặt lọc vắcxin 1) Tiến hành gây nhiễm vi rút Những chai tế bào kín một lớp sẽ đ−ợc sử dụng. Loại bỏ hết phần n−ớc nổi, rửa thật nhẹ nhàng tế bào bằng môi tr−ờng Hanks Nhiễm 20 ml hỗn dịch virút vào một chai 2) Giai đoạn hấp phụ virút: Hấp phụ virút tại 34oC trong 1 giờ (30 phút láng lại 1 lần). Sau 1 giờ bổ sung môi tr−ờng duy trì 199 chứa 1% huyết thanh bê tới thể tích 150 ml. 3) Nuôi cấy Giữ trong tủ ấm 34oC. Sau 3 ngày tế bào đ−ợc rửa 3 lần bằng hanks. Bổ sung mỗi chai 150 ml môi tr−ờng 199 không chứa huyết thanh bê Nuôi cấy tiếp 3-4 ngày. Quan sát sự huỷ hoại của tế bào. Mức độ huỷ hoại của tế bào dao động từ 3(+) đến 3,5(+) thì gặt đ−ợc. 4) Gặt vắcxin Những chai tế bào gặt đ−ợc đ−ợc giữ ở 4oC qua đêm. Ngày hôm sau mang ra lắc mạnh chai tế bào để những đám tế bào huỷ hoại bám trên thành chai bong hết, và làm cho virút thoát ra khỏi tế bào. Hộn tất cả hỗn dịch virút thu đ−ợc lại. Bổ sung chất bảo quản. Lọc qua màng lọc millipore đ−ờng kính 0,45 àm, bảo quản ở - 80oC. 27
  28. 3.2.5.4. Đông khô văc xin sởi 1) Phân liều: - Lọ dùng cho đông khô loại thể tích 8 ml. - Phân liều 1,5 ml bán thành phẩm/ 1 lọ. - Đậy nút cao su sao cho 1/2 nút ngập trong miệng lọ 2) Làm đông: - Các khay văcxin đ−ợc đặt vào buồng đông khô - Nhiệt độ đông băng -50oC - Thời gian duy trì đông băng 4 giờ 3) Làm khô giai đoạn 1 - Khi nhiệt độ mẫu đạt -50oC khoảng 3,5 giờ thì tiến hành làm lạnh buồng ng−ng tụ. Sau khoảng 25-30 phút nhiệt độ buồng ng−ng tụ đạt -70oC thì tiến hành làm khô giai đoạn 1 - Chạy máy hút chân không - Khi chân không đạt d−ới 300 mTorr tiến hành tăng nhiệt buồng đông khô - Nhiệt độ làm khô giai đoạn 1 là -30 đến -25oC - Thời gian của giai đoạn này là 40 giờ 4) Làm khô giai đoạn 2 - Khi quan sát thấy toàn bộ l−ợng văcxin trong lọ chuyển sang mầu vàng nhạt bắt đầu tăng nhiệt độ - Nhiệt độ cuối cùng là +28oC - Thời gian duy trì ở nhiệt độ này là 6 giờ hoặc thời gian duy trì chân không đạt thấp nhất (15-17mTorr) khoảng 3 giờ 5) Đậy nút cao su bằng hệ thống thuỷ lực 28
  29. 6) Cho phông khí vào buồng đông khô. Kết thúc quá trình đông khô oC 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40 -45 -50 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 Thời gian (Giờ) Sơ đồ 3-2: Qui trình đông khô ảnh 3-2: Máy đông khô Virtis 35 XL (Mỹ) 29
  30. 3.3. Ph−ơng pháp kiểm tra chất l−ợng vắcxin sởi Chủng sản Trứng gà có - Vô trùng, thử nghiệm nhận dạng. xuất phôi - Kiểm tra hồ sơ trứng gà sạch. - Quan sát tế bào chứng Nuôi cấy tế - Hấp phụ hồng cầu bào - Kiểm tra virút ngoại lai của n−ớc nổi nuôi tế bào. (trên các loại tế bào : FL, Vero, CEC). Mẻ gặt đơn - Vô trùng tr−ớc lọc - Mycoplasma - Chuẩn độ hiệu giá - Trung hoà mẻ gặt tìm virút ngoại lai (trên các loại tế bào : FL, Vero, CEC). - Vô trùng - Chuẩn độ hiệu giá Mẻ gặt đơn - sau lọc Nhận dạng - Tiêm súc vật : chuột nhắt tr−ởng thành, chuột ổ, chuột lang. - Vô trùng - Mycoplasma Vắcxin bán thành phẩm - Nhận dạng - Vô trùng Vắcxin - Mycoplasma, thành phẩm - Chuẩn độ hiệu giá - ổn định nhiệt - Albumin bò tồn d−. - Độ ẩm tồn d− - An toàn chung 30
  31. 3.3.1. Kiểm tra vô trùng. 3.3.1.1 Vật liệu. - Môi tr−ờng thioglycolate : 15 ml/ ống (Hãng DIFCO) - Môi tr−ờng soybean caseine : 15 ml/ống (Hãng DIFCO) 3.3.1.2. Ph−ơng pháp Nuôi cấy, quan sát sự phát triển của vi khuẩn và nấm trong môi tr−ờng và điều kiện thích hợp 3.2.1.3. Tiến hành - Mỗi mẫu thử vô trùng dùng : 8 ống thioglycolate : Nhiễm 1 ml mẫu/ống 8 ống soybean casein : Nhiễm 1 ml mẫu/ống 4 ống mẫu thử : 9 ml/ống - Mỗi lần thử để chứng: 2 ống thioglycolate, 2 ống soybean casein - Môi tr−ờng thioglycolate : ủ ở nhiệt độ 30-32oC - 2 ống mẫu thử : ủ ở nhiệt độ 30-32oC - Môi tr−ờng soybean casein : ủ ở nhiệt độ 20-25oC - 2 ống mẫu thử : ủ ở nhiệt độ 20-25oC - Theo dõi trong 14 ngày. 3.3.2. Thử nghiệm nhận dạng virút sởi 3.3.2.1 Vật liệu - Kháng huyết thanh sởi đặc hiệu - Viện NIBSC- 20000 UI/ml - Tế bào VERO - Viện quốc gia Vắcxin và Serum Trung quốc cung cấp - MEM - Hãng Sigma - Huyết thanh bê - Sigma 3.3.2.2. Ph−ơng pháp Dùng ph−ơng pháp trung hoà vi l−ợng trên tế bào vero. 3.3.2.3. Tiến hành 3.3.2.4. Chuẩn bị 31
  32. - Chuẩn bị tế bào vero một lớp trên phiến 24 giếng : 150.000 TB/ml/ giếng nuôi trong MEM 5% huyết thanh bê Nuôi 37oC/ 2 - 3 ngày - Pha loãng mẫu bậc 10 theo sơ đồ 100 10-1 10-2 10-3 Mẫu 3 ml 0,3ml 0,3ml 0,3ml MEM 2% FBS 2,7ml 2,7ml 2,7ml 1,5ml 1,5ml 1,5ml 1,5ml KHT sởi 160UI/ 1ml 1,5ml 1,5ml 1,5ml 1,5ml - Trung hoà theo tỷ lệ 1:1 và ủ 37oC/30 phút - Để 4oC qua đêm. - Tế bào vero một lớp trên phiến 24 đổ hết môi tr−ờng cũ, nhiễm 0,2 ml hỗn dịch virút đã trung hòa/giếng. Để hấp phụ 1h, thêm 1ml MEM 2% huyết thanh bê /giếng. Mỗi mẫu làm 10 giếng - Mẫu chứng d−ơng thay 0,2 ml hỗn dịch trung hoà/giếng bằng 0,1 ml mẫu. o - ủ ở nhiệt độ 36-37 C/ 5%CO2 - Sau 1 tuần thêm 0,5 ml MEM2% FBS/giếng - Đọc kết quả sau 2 tuần 3.3.2.5. Đọc kết quả : - Mẫu chứng d−ơng cho kết quả CPE (+) - Đối với mẫu thử CPE(-) chứng tỏ là virút sởi. 3.3.3. Thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá 3.3.3.1. Vật liệu - Phiến 96 giếng - Chai nhựa nuôi tế bào loại 25 hoặc 75 cm2 - Tế bào VERO (Viện quốc gia Vắcxin và Serum Trung quốc cung cấp) - MEM 2% serum, 5% serum (Hãng SIGMA) - Trypsine (0,25%) + EDTA (0,1%) (Phòng MT - POLIOVAC cung cấp) 32
  33. - PBS (-) pH 7,2 (Phòng MT - POLIOVAC cung cấp) 3.3.3.2. Ph−ơng pháp Chuẩn độ hiệu giá bằng ph−ơng pháp vi l−ợng trên tế bào vero. 3.3.3.3. Tiến hành - Tách tế bào vero, đếm, pha loãng tới nồng độ 150.000 TB/ml: - Pha KN từ 10-1 đến 10-5 bằng MEM 2% serum. - Nhỏ từ 10-1,5 đến 10-5 mỗi nồng độ 10 giếng. Mỗi giếng nhỏ 0,1ml KN và 0,1 o ml tế bào Vero (150000 TB/ml), ủ 36 C với 5% CO2 hoặc dán kín phiến bằng băng dính. - Đọc kết quả sau 9 ngày. 3.3.3.4. Đọc kết quả - Tính kết quả theo công thức Karber CCID50= L - d(S - 0,5) Trong đó L : Log của nồng độ pha thấp nhất d : Log của sự khác nhau giữa các bậc pha S : Tổng số d−ơng tính thu đ−ợc (Mỗi nồng độ d−ơng tính hết đ−ợc tính là 1) 3.3.4. Thử nghiệm an toàn chung cho vắcxin thành phẩm trên súc vật - Trên chuột lang : Chuột lang dùng để kiểm tra cân nặng khoảng 300 - 350g, không có các biểu hiện bệnh lý, khoẻ mạnh và tăng trọng bình th−ờng trong thời gian cách ly ít nhất là 5 ngày. Mỗi thử nghiệm dùng 2 chuột lang để kiểm tra. Tiêm 5ml vắcxin đ−ờng phúc mạc cho mỗi chuột và theo dõi trong thời gian ít nhất là 7 ngày. Thử nghiệm đạt yêu cầu nếu chuột khoẻ mạnh, tăng trọng bình th−ờng. - Trên chuột nhắt : Chuột nhắt dùng để kiểm tra cân nặng khoảng 18-20g, không có các biểu hiện bệnh lý, khoẻ mạnh và tăng trọng bình th−ờng trong thời gian cách ly it nhất là 5 ngày. Mỗi thử nghiệm dùng 5 chuột để kiểm tra. Tiêm 0,5ml vắcxin đ−ờng phúc mạc cho mỗi chuột và theo dõi trong thời gian ít nhất là 7 ngày. 33
  34. Tiêu chuẩn chấp thuận : Thử nghiệm đạt yêu cầu nếu chuột khoẻ mạnh, tăng trọng bình th−ờng. 3.3.5. Thử nghiệm an toàn trên súc vật cho mẻ gặt đơn sau lọc - Trên chuột lang : Chuột lang dùng để kiểm tra cân nặng khoảng 350-450g, không có các biểu hiện bệnh lý, khoẻ mạnh và tăng trọng bình th−ờng trong thời gian cách ly ít nhất là 5 ngày. Mỗi thử nghiệm dùng 5 chuột lang để kiểm tra. Tiêm 0,1 ml vắcxin vào não cho mỗi chuột và theo dõi trong thời gian ít nhất là 14 ngày. Thử nghiệm đạt yêu cầu không d−ới 80% chuột khoẻ mạnh, tăng trọng bình th−ờng không có dấu hiệu bị nhiễm virút ngoại lai. - Trên chuột nhắt tr−ởng thành : Chuột nhắt dùng để kiểm tra cân nặng khoảng 15-20g, không có các biểu hiện bệnh lý, khoẻ mạnh và tăng trọng bình th−ờng trong thời gian cách ly it nhất là 5 ngày. Mỗi thử nghiệm dùng 10 chuột để kiểm tra. Tiêm 0,5ml vắcxin đ−ờng phúc mạc và 0,03ml đ−ờng não cho mỗi chuột và theo dõi trong thời gian ít nhất là 21 ngày. Thử nghiệm đạt yêu cầu nếu ít nhất 80% chuột khoẻ mạnh, tăng trọng bình th−ờng không có dấu hiệu bị nhiễm virút ngoại lai. - Trên chuột ổ : Chuột ổ dùng để kiểm tra không đ−ợc quá 24 giờ tuổi không có các biểu hiện bệnh lý, khoẻ mạnh và tăng trọng bình th−ờng. Mỗi thử nghiệm dùng 20 chuột để kiểm tra. Tiêm 0,1ml vắcxin đ−ờng phúc mạc và 0,01ml đ−ờng não cho mỗi chuột và theo dõi trong thời gian ít nhất là 14 ngày. Thử nghiệm đạt yêu cầu nếu ít nhất 80% chuột khoẻ mạnh, tăng trọng bình th−ờng không có dấu hiệu bị nhiễm bệnh. 3.3.6. Thử nghiệm quan sát tế bào chứng - Tế bào chứng : không gây nhiễm virut và đ−ợc nuôi trong cùng một diều kiện với lô tế bào sản xuất - Thời gian quan sát tế bào chứng vào những thời điểm sau: (1) Ngày nhiễm virút (2) Ngày thay môi tr−ờng (3) Ngày gặt 34
  35. - Đánh giá kết quả theo chỉ số phát triển của tế bào. - Lô tế bào đạt yêu cầu khi kông quá 20% số chai tế bào bị thoái hoá do những nguyên nhân không đặc hiệu 3.3.7. Thử nghiệm hấp phụ hồng cầu 3.3.7.1. Vật liệu - Hồng cầu chuột lang 10% đ−ợc bảo quản 4oC không quá 1 tuần. - Hank không có ion Ca++ và Mg++ - PBS (-) pH=7,2 (Phòng môi tr−ờng - POLIO cung cấp) 3.3.7.2 Ph−ơng pháp Phát hiện virút dựa vào khả năng gây hấp phụ hồng cầu của virút 3.3.7.3 Tiến hành - Pha hồng cầu chuột lang tới 0,2% bằng PBS (-) - Chai tế bào chứng lấy vào ngày gặt virút đ−ợc rửa 3 lần bằng Hank sau khi đã đổ hết môi tr−ờng nuôi. - Cho 15 ml dung dịch hồng cầu chuột lang 0,2% vào 1 chai Roux. - Để 30 phút ở nhiệt độ phòng. - Rửa 3 lần bằng Hank. - Đọc kết quả bằng kính hiển vi lộn ng−ợc Tiêu chuẩn chấp thuận : Loạt tế bào chứng đạt tiêu chuẩn dùng cho sản xuất khi không có virút gây hấp phụ hồng cầu. 3.3.8. Thử nghiệm tìm virút ngoại lai của mẻ gặt trên nuôi cấy tế bào 3.3.8.1. Vật liệu - Kháng huyết thanh sởi đặc hiệu -Viện NIBSC- 20000 UI/ml - Tế bào : CEC,VERO, FL. (VERO : Viện quốc gia vắc xin và serum Trung quốc cung cấp) ( FL : Viện KITASATO- Nhật Bản cung cấp) (CEC : tế bào phôi gà của loạt kế tiếp ) - MEM 2%FCS, MEM 0,5%FCS, MEM 10%FCS (Hãng SIGMA) 35
  36. 3.3.8.2. Ph−ơng pháp Trung hoà virút sởi bằng kháng huyết thanh sởi đặc hiệu để phát hiện virút ngoại lai trên nuôi cấy tế bào. 3.3.8.3 Tiến hành - Trung hoà mẻ gặt (X2,5) + KHT(160UI/ml) theo tỷ lệ 1:1 - Mỗi mẫu nhiễm 8 chai và để chứng 1 chai - Nhiễm 2,5ml/chai hấp phụ 37oC/1h Cộng thêm 7,5 ml MEM 2% FCS (Đối với CEC) Cộng thêm 7,5 ml MEM 10% FCS (Đối với FL) Cộng thêm 7,5 ml MEM 2% FCS (Đối với VERO) - Quan sát trong 14 ngày - Cấy truyền và quan sát tiếp 14 ngày đối với tế bào phôi gà. Tiêu chuẩn chấp thuận : Không quá 20% số tế bào bị thới hoá bởi những nguyên nhân không đặc hiệu. 3.3.9. Thử nghiệm tìm virút ngoại lai trong n−ớc nổi nuôi cấy tế bào 3.3.9.1 Vật liệu - Tế bào : CEC, VERO, FL. (VERO : Viện quốc gia vắc xin và serum Trung quốc cung cấp) ( FL : Viện KITASATO- Nhật Bản cung cấp) (CEC : tế bào phôi gà của loạt kế tiếp) - MEM 2%FCS (Hãng SIGMA) 3.3.9.2. Ph−ơng pháp Phát hiện virút ngoại lai bằng ph−ơng pháp nuôi cấy tế bào. 3.3.9.3. Tiến hành Nhiễm 2,5 ml/25 cm2 hấp phụ 37oC/1h. Cộng 7,5 ml MEM2% FBS Quan sát 14 ngày Tiêu chuẩn chấp thuận : Lô tế bào đ−ợc đánh giá đạt tiêu chuẩn khi không quá 20% số tế bào bị huye hoại do những nguyên nhân không đặc hiệu. 36
  37. 3.3.10. Thử nghiệm xác định hàm l−ợng Albumin bò tồn d− 3.3.10.1 Vật liệu - Huyết thanh bò chuẩn- Viện VX&HT Bắc Kinh,Trung Quốc cấp - Hồng cầu cừu gắn kháng thể kháng albumin bò hiệu giá 1:800-Viện VX&HT Bắc Kinh,Trung Quốc cấp - Hồng cầu cừu- Viện VX&HT Bắc Kinh,Trung Quốc cấp - Chứng d−ơng- Viện VX&HT Bắc Kinh,Trung Quốc cấp 3.3.10.2. Ph−ơng pháp : Lấy 0,25 ml mẫu rồi pha loãng hệ số 2 (2X, 4X, 8X) và kiểm tra cùng mẫu đối chứng. Lắc đều ở 37oC trong 60 phút cho đến khi ng−ng tụ. Hàm l−ợng Albumin bò tồn d− phải ≤ 50 Ng/ml. Độ pha loãng huyết thanh 25 50 100 200 400 800 1600 3200 Hàm l−ợng Albumin 200 100 50 25 12,5 6,3 3,2 1,6 Độ ng−ng kết hồng cầu Chứng huyết thanh đặc 2X 4X 8X 16X 32X 64X 128X Chứng hồng cầu Mẫu đặc 2X4X 8XChứng Kết Kết âm quả luận Độ ng−ng kết hồng cầu 3.3.11. Thử nghiệm phát hiện Mycoplasma 3.3.11.1 Vật liệu - PPLO BROTH (DIFCO) - PPLO AGAR (DIFCO) - L- argine- HCL (DIFCO) - 0,4% phenol red (DIFCO) - 25% Glucose (DIFCO) - 25% Yeast extracts (DIFCO) 37
  38. - Heated horse serum (DIFCO) - Penicillin G (1000000 Unit/5ml) (HELM- GERMANY) - N−ớc cất dùng để pha môi tr−ờng 3.3.11.2 Ph−ơng pháp Phát hiện Mycoplasma dựa vào sự chuyển mầu của môi tr−ờng nuôi cấy. 3.3.11.3 Tiến hành Chuẩn bị 2 loại môi tr−ờng : - MT (1): PPLO Broth, Glucose, Yeast extract, đỏ phenol, n−ớc cất, horse serum, penicillin. pH 7,6-7,8 - MT (2): PPLO Broth, arginine, Yeast extract, đỏ phenol, n−ớc cất, horse serum, penicilline. pH 6,8-7 Nhiễm 0,2ml/ống (mỗi ống đóng 10 ml môi tr−ờng nuôi cấy). Mỗi mẫu nhiễm 5 ống (từ số 1 đến số 5) và ống số 6 cho cả 2 loại môi tr−ờng để làm chứng. ủ 35oC - o 37 C, 5% CO2, độ ẩm 100%. Sau 7 ngày cấy truyền 0,5 ml/ống cho cả 2 loại môi o o tr−ờng tiếp tục ủ 35 C - 37 C, 5% CO2 . Sau 2 tuần đọc kết quả. 3.3.11.4 Nhận định kết quả - Thử nghiệm là d−ơng tính (+) khi môi tr−ờng chuyển màu: môi tr−ờng 1 từ đỏ chuyển thành da cam; môi tr−ờng 2 từ da cam chuyển thành đỏ 38
  39. ch−ơng 4 : Kết quả và bàn luận 4.1. Kết quả sản xuất 4.1.1. Kết quả quá trình ấp trứng gà Trứng nhập về đ−ợc bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi ấp.Trứng đ−ợc ấp trong tủ ấm có khay n−ớc để tạo độ ẩm. Đảo trứng hàng ngày 2 lần. Thời gian ấp 9 ngày. Bảng 4-1: Kết quả ấp trứng gà SPF Kết quả Số Nhiệt Độ ngày Số Trọng Lô Ngày ấp độ ẩm Có Không bảo l−ợng Chết l−ợng (o C) (%) phôi phôi quản phôi (g) 1 11/11/00 3 20 37,7 61,4 15 2 3 0,75 (75%) (10%) (15%) 2 13/3/01 0 41 38,5 60,9 17 7 17 0,72 (41,5%) (17%) (41,5%) 3 25/3/01 3 45 37,9 64,6 21 7 17 0,718 (46,7%) (15,5%) (37,8%) 4 15/4/01 3 64 38,2 64,4 38 5 21 0,75 (59,4%) (7,8%) (32,8%) 5 29/4/01 3 60 38,3 65,25 43 8 9 0,775 (71,7%) (13,3%) (14%) Trứng nhập về nên ấp ngay trong vòng 2-4 ngày. Để càng lâu tỉ lệ phôi chết và không tạo phôi càng cao. Nhiệt độ thích hợp khoảng 38 ± 0,5 o C; độ ẩm khoảng từ 60 -70%. Trọng l−ợng phôi đạt 0,718 đến 0,775 gam. Tuy nhiên theo kết quả trên, tỷ lệ phôi bị chết vẫn còn cao, có lô (lô số 2) lên tới 41,5%. Cần liên hệ với nhà cung cấp và nhà vận chuyển để có biện pháp khắc phục, đặc biệt là tránh l−u hàng tại sân bay lâu kể cả kho đi và kho đến. 39
  40. 4.1.2 Kết quả của quá trình tách và nuôi cấy tế bào Sau khi lấy phôi, dùng panh cắt bỏ đầu, chân và cánh của phôi. Những phôi này đ−ợc rửa 3 lần bằng hanks CMF. Sau đó phôi đ−ợc nghiền nhỏ thành các mảnh có kích th−ớc khoảng 2-3 mm. Cho toàn bộ phôi nghiền vào trong bình trypsin hoá. Rửa tiếp 2 lần bằng Hanks CMF, 1 lần bằng trypsin 0,25%. Sau đó tiến hành trypsin hoá. Hỗn dịch tế bào thu đ−ợc đ−ợc lọc qua 8 lớp vải gạc vô trùng vào trong một chai 1 lít có chứa sẵn 100 ml huyết thanh bê và đ−ợc bảo quản tại 8o C. Sau khi trypsin hoá xong hỗn dịch thu đ−ợc ly tâm loại bỏ trypsin. Cặn tế bào thu đ−ợc đ−ợc đánh tan và trộn đều trong môi tr−ờng phát triển ta thu đ−ợc hỗn dịch tế bào. Từ l−ợng hỗn dịch này ta tiến hành lấy mẫu và đếm tế bào thu đ−ợc bằng buồng đếm hồng cầu sau khi nhuộm bằng thuốc nhuộm xanh trypan. Bảng 4-2 : L−ợng hỗn dịch thu đ−ợc. Loạt Ngày tách Số l−ợng phôi L−ợng hỗn dịch L−ợng tế bào tế bào gốc (ml) sống (x105) CEC-1 21/11/00 14 1000 21.200 CEC-2 23/3/01 17 1000 16.800 CEC-3 04/4/01 20 1000 20.400 CEC-4 25/4/01 37 2000 23.800 CEC-5 09/5/01 41 2000 37.400 Từ hỗn dịch ban đầu, tế bào đ−ợc pha loãng với nồng độ 4x105 TB/1ml dùng để nuôi cấy. Mỗi chai Roux cấy 170 ml hỗn dịch. Chai 2-oz (25 cm2) cấy 15ml. Ta thu đ−ợc số chai tế bào nh− sau: 40
  41. Bảng 4-3 : Tế bào thu đ−ợc từ phôi gà SPF 9 ngày tuổi. Loạt Số phôi Trọng l−ợng phôi L−ợng hỗn dịch Số chai tế bào (gam) (lít) CEC-1 14 10,56 5,3 31 CEC-2 17 12,31 4,2 24 CEC-3 20 14,36 5,1 30 CEC-4 37 27,94 5,95 35 CEC-5 41 31,79 9,35 55 Tổng 129 96,96 29,9 175 Trung 1 0,75 0,23 1,4 bình Từ bảng trên ta thấy, trung bình 1 phôi gà 9 ngày tuổi có trọng l−ợng khoảng 0,75 gam thu đ−ợc 0,23 lít hỗn dịch tế bào và khi ta nuôi cấy 400.000 tế bào/1 ml thi thu đ−ợc 1,4 chai Roux. Kết quả này cũng t−ơng đ−ơng với kết quả thu đ−ợc của Gs. Makino, Viện Kitasato-Nhật bản là từ 1 phôi gà 9 ngày tuổi thu đ−ợc 1,08-1,2 chai Roux tế bào. 4.1.3 Kết quả quan sát tế bào Quan sát tế bào bằng kính hiển vi lộn ng−ợc. Đánh giá sự phát triển của tế bào bằng chỉ số phát triển (CGI). Bảng 4-4: Sự phát triển của tế bào Loạt Thời gian quan sát Chỉ số phát triển Số chai tế bào (CGI) Số chai Tỷ lệ % 3,5 - 4 29 93,5 Sau 2 ngày nuôi CEC-1 < 3,5 2 6,5 cấy Khác 0 0 3,5 - 4 24 100 Sau 2 ngày nuôi CEC-2 < 3,5 0 0 cấy Khác 0 0 3,5 - 4 30 100 Sau 2 ngày nuôi CEC-3 < 3,5 0 0 cấy Khác 0 0 Sau 2 ngày nuôi 3,5 - 4 35 100 CEC-4 cấy < 3,5 0 0 41
  42. Khác 0 0 3,5 - 4 55 100 Sau 2 ngày nuôi CEC-5 < 3,5 0 0 cấy Khác 0 0 Qua bảng 4-4 ta thấy, sau 2 ngày nuôi cấy 93,5-100% số tế bào đã mọc kín một lớp. Đây là thời điểm thích hợp cho việc gây nhiễm virút dùng để sản xuất vắcxin. ảnh 4-1: Hình ảnh tế bào phôi gà 2 ngày tuổi tr−ớc khi gây nhiễm 4.1.4 Kết quả đếm tế bào Số tế bào có trong một chai khi tế bào đã kín một lớp. Bảng 4-5: Số tế bào có trong một chai Ngày tiến hành Chai nhựa 3/11/00 45 ± 2 triệu Biết đ−ợc số tế bào có trong một chai là rất quan trọng. Từ số tế bào này chúng ta mới có thể tính toán l−ợng virút gây nhiễm cho mỗi chai cho phù hợp. Trong các loạt tế bào trên, chúng tôi chỉ tiến hành đếm cho một loạt số 1 ngày 23/11. Từ đó lấy số liệu chung cho tất cả các loạt về sau này. Sau khi tiến hành đếm trên 3 chai chúng tôi thu đ−ợc con số là 45± 2 triệu tế bào có trong một chai đã kín. 42
  43. 4.1.5. Kết quả sử dụng tế bào Tế bào sau khi kín một lớp đ−ợc tiến hành gây nhiễm virút. Một phần đ−ợc để lại làm chứng trong điều kiện nuôi cấy nh− nhau. Ngoài ra một số chai đ−ợc tiến hành tách và đếm số tế bào có trong đó nh− mục 4.1.4. Bảng 4-6: Tình hình sử dụng tế bào Ngày sử Loạt Mục đích sử dụng Số chai dụng Sản xuất vắc xin 3 CEC-1 23/11/00 Đối chiếu 6 Khác 22 Sản xuất vắc xin 20 CEC-2 25/3/01 Đối chiếu 4 Khác 0 Sản xuất vắc xin 20 CEC-3 6/4/01 Đối chiếu 6 Khác 4 Sản xuất vắc xin 28 CEC-4 27/4/01 Đối chiếu 6 Khác 1 Sản xuất vắc xin 47 CEC-5 11/5/01 Đối chiếu 6 Khác 2 4.1.6. Kết quả tìm hiểu yếu tố ảnh h−ởng tới gây nhiễm virút Tr−ớc hết để việc gây nhiễm virút có hiệu quả chúng ta phải tìm hiểu liều gây nhiễm thích hợp. Chúng tôi đã tiến hành gây nhiễm theo 2 nồng độ 0,012 và 0,056 CCID50 cho một tế bào. Kết quả thu đ−ợc nh− sau: 43
  44. Bảng 4-7: Mức độ huỷ hoại tế bào theo nồng độ gây nhiễm ≥3+ ≤2,5+ Mức độ huỷ hoại Số chai % Số chai % Nồng độ cao 30 78,9 9 21,1 Nồng độ thấp 28 77,8 8 22,2 Qua bảng 4-7 ta thấy mức độ huỷ hoại giữa 2 nồng độ cao và thấp là t−ơng đ−ơng (78,9% và 77,8%). Mức độ huỷ hoại tập trung chủ yếu 3+, tức là CPE xuất hiện đều khắp trên bề mặt tế bào của chai mà tế bào vẫn còn bám chặt trên bề mặt chai ch−a bong khỏi thành chai. Theo th−ờng qui sản xuất của Viện Vắcxin và Huyết thanh Bắc Kinh thì nồng độ gây nhiễm vào khoảng từ 0,01 đến 0,02 CCID50 cho 1 tế bào, và của Viện Kitasato là 0,016 đến 0,02. Qua đó ta thấy nồng độ gây nhiễm 0,012 CCID50/ tế bào là thích hợp. Bảng 4-8: Hiệu giá vắcxin thu đ−ợc theo nồng độ gây nhiễm Nồng độ gây nhiễm Cao Thấp n 4,48 4,4 Hiệu giá (10 ccid50/ml) Qua bảng 7 ta thấy hiệu giá thu đ−ợc giữa 2 nồng độ gây nhiễm là t−ơng đ−ơng. Qua đó càng khẳng định tỷ lệ gây nhiễm 0,012 ccid50/tế bào là thích hợp. Theo th−ờng qui của Viện Vắcxin và Huyết thanh Bắc kinh sẽ gặt vào ngày thứ 6 sau khi gây nhiễm. Trong thời theo dõi tiến hành thay môi tr−ờng vào ngày thứ 3 bằng môi tr−ờng 199 không chứa huyết thành bê. Còn theo th−ờng qui của Kitasato với chủng AIK-C, họ gặt vào ngày thứ 9 và tiến hành 2 lần thay môi tr−ờng lần 1 vào ngày thứ 3 bằng môi tr−ờng chứa 2% huyết thanh bê và lần 2 vào ngày thứ 6 bằng môi tr−ờng không có huyết thanh bê. Trong nghiên cứu này chúng tôi làm theo 44
  45. ph−ơng pháp của Trung Quốc. Bởi vì mỗi chủng có một đặc điểm riêng và th−ờng qui này đã đ−ợc áp dụng ở Trung Quốc trong nhiều năm. a) b) ảnh 4-2: Hình ảnh tế bào phôi gà loạt MV-2S bị huỷ hoại bởi virút sởi. Chụp d−ới kính hiển vi lộn ng−ợc độ phóng đại a) 200 lần, b) 100 lần. 4.1.7. Kết quả sản xuất vắcxin bán thành phẩm. Hu191 MV-1S MV-2S MV-3S MV-4S MV-5S Sơ đồ 4-1: Sơ đồ quá trình thực hiện việc cấy truyền virút sởi từ chủng Hu191. 45
  46. Bảng 4-9: L−ợng hỗn dịch virút thu hoạch đ−ợc sau mỗi lần cấy truyền Loạt Số chai thu hoạch Thể tích hộn (ml) MV-1S 3 450 MV-2S 20 2500 MV-3S 20 2700 MV-4S 27 3730 MV-5S 47 8000 Bảng 4-9 cho ta thấy số l−ợng hỗn dịch virút thu hoạch đ−ợc sau mỗi lần cấy truyền. L−ợng hỗn dịch này đ−ợc bổ sung chất bảo quản và đ−ợc lọc qua lọc 0,45 àm. a) b) ảnh 4-3:Hình ảnh virút sởi nhân lên trên tế bào phôi gà sau 7 ngày nuôi cấy Loạt MV-3S (b) và tế bào chứng (a), Chụp d−ới kính hiển vi huỳnh quang độ phóng đại 400 lần Hình ảnh huỳnh quang cho thấy sau 7 ngày nuôi cấy virút nhân lên mạnh, hầu hết các tế bào đã bị nhiễm. Đây là thời điểm gặt tốt nhất. 46
  47. 4.1.8. Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm Bảng 4-10: L−ợng vắcxin thành phẩm thu đ−ợc Loạt L−ợng vắcxin sau Số liều thu đ−ợc lọc (ml) (0,5ml/liều) MV-2S 2200 4400 MV-3S 2500 5000 Theo tiêu chuẩn mỗi liều vắcxin sởi có thể tích 0,5 ml chứa hàm l−ợng virút không d−ới 1000 CCID50. Nh−ng theo kinh nghiệm quá trình đông khô hiệu giá vắcxin giảm từ 0,5-0,7 log. Hơn nữa, Tổ chức Y tế thế giới yêu cầu vắcxin sau khi ủ 37oC trong 1 tuần hiệu giá còn lại phải đạt tối thiểu 1 liều gây nhiễm. Chính vì vậy mà hiệu giá vắcxin tr−ớc đông khô phải cao hơn yêu cầu phải từ 1,5-2 log. Do đó để sản xuất đạt hiệu quả cao thì ta phải thu đ−ợc vắcxin bán thành phẩm có hiệu giá cao. Vấn đề này sẽ đ−ợc bàn luận tiếp ở phần kết quả kiểm định. Nh−ng với chủng vắcxin nhận đ−ợc chỉ có hiệu giá 5,13 log/ml nên chúng tôi cũng không hy vọng sẽ có đ−ợc vắcxin bán thành phẩm có hiệu giá cao. Vì vậy mà trong bảng 4-10 chúng tôi không pha loãng vắcxin tr−ớc khi đông khô. Bảng 4-11: Kết quả quá trình đông khô vắcxin Loạt Loạt BTP Số l−ợng (ml) Số lọ Số liều L12 MV-2S 320 210 1050 L13 MV-2S 500 330 1650 Tổng cộng 2700 L−ợng vắcxin thành phẩm thu đ−ợc có nguồn gốc từ loạt vắcxin bán thành phẩm MV-2S. Đây là loạt vắcxin thuộc đời cấy truyền thứ 32. Nằm trong phạm vi an toàn cho phép dùng cho ng−ời của chủng Hu191. Tổng số vắcxin thu đ−ợc là 540 lọ, t−ơng đ−ơng 2700 liều. 47
  48. 4.2. Kết quả kiểm tra chất l−ợng 4.2.1 Kết quả kiểm tra nuôi cấy tế bào. 4.2.1.1 Kết quả quan sát tế bào chứng Quan sát tế bào bằng kính hiển vi lộn ng−ợc. Đánh giá sự phát triển của tế bào bằng chỉ số phát triển (CGI). Bảng 4-12: Kết quả quan sát tế bào chứng Loạt Số chai Thời gian theo CGI Kết luận chứng dõi (ngày) CEC-1 6 7 4 Đạt CEC-2 4 7 4 Đạt CEC-3 6 7 4 Đạt CEC-4 6 7 4 Đạt CEC-5 6 7 4 Đạt Theo qui định đến cuối thời gian theo dõi tế bào chứng phát triển bình th−ờng, không có dấu hiệu của sự huỷ hoại tế bào. Qua bảng trên ta thấy cả 5 loạt tế bào đều đạt yêu cầu, tế bào đủ tiêu chuẩn dùng để sản xuất vắcxin. 4.2.1.2 Hấp phụ hồng cầu Tiến hành hấp phụ hồng cầu tại 2 thời điểm : Lần 1 vào ngày gây nhiễm virút, lần 2 vào ngày gặt vắcxin Tế bào đ−ợc rửa 2-3 lần bằng Hank không có ion Ca++ và Mg++. Cho dung dịch hồng cầu chuột lang 0,2% vào phủ kín mặt chai tế bào. Hấp phụ trong khoảng 30 phút tại nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch hồng cầu. Rửa 3 lần bằng Hanks. Láng nhẹ nhàng. Đọc kết quả trên kính hiển vi lộn ng−ợc. 48
  49. Bảng 4-13: Kết quả hấp phụ hồng cầu Loạt Lần I Lần II Số chai Kết quả Số chai Kết quả CEC-1 3 - 3 - CEC-2 2 - 2 - CEC-3 3 - 3 - CEC-4 2 - 2 - CEC-5 3 - 3 - Kết quả cho thấy cả 5 loạt tế bào đều không bị nhiễm các virút gây hấp phụ hồng cầu chuột lang. 4.2.1.3 Kết quả kiểm tra virút ngoại lai trong n−ớc nổi Mẫu n−ớc nổi đ−ợc lấy 2 mẫu : M1 và M2. M1 đ−ợc lấy khi gây nhiễm virút. M2 đ−ợc lấy vào ngày gặt từ các chai tế bào chứng. N−ớc nổi này đ−ợc pha loãng với môi tr−ờng dinh d−ỡng với tỷ lệ 1/4 . Sau đó chúng đ−ợc nhiễm trên các chai tế bào đã kín một lớp với tỷ lệ 1 ml mẫu cho 3 cm2 bề mặt tế bào. Tế bào dùng cho thử nghiệm này là FL, CEC và Vero. Tế bào đ−ợc nuôi một lớp trong các chai có diện tích bề mặt 25 cm2. Mỗi lô đ−ợc gây nhiễm trên 8 chai và có 1 chai không gây nhiễm đ−ợc dùng làm chứng. Tế bào đ−ợc theo dõi trong vòng 14 ngày. Thử nghiệm này đạt yêu cầu khi đến cuối thời gian theo dõi tế bào phát triển bình th−ờng, ít nhất 80% số chai tế bào không có biểu hiện của sự huỷ hoại do các tác nhân không đặc hiệu. 49
  50. Bảng 4-14: Kết quả kiểm tra n−ớc nổi Trên tế bào Vero Trên tế bào FL Trên tế bào phôi gà Loạt Mẫu Số chai Kết quả Số chai Kết quả Số chai Kết quả M1 8 - 8 - 8 - CEC-1 M2 8 - 8 - 8 - M1 8 - 8 - 8 - CEC-2 M2 8 - 8 - 8 - M1 8 - 8 - 8 - CEC-3 M2 8 - 8 - 8 - M1 8 - 8 - 8 - CEC-4 M2 8 - 8 - 8 - M1 8 - 8 - 8 - CEC-5 M2 8 - 8 - 8 - Qua bảng 12 ta thấy các mẫu n−ớc nổi của nuôi cấy tế bào đều không bị nhiễm các tác nhân ngoại lai gây huỷ hoại tế bào Vero, FL và tế bào phôi gà. 4.2.2 Kết quả kiểm tra mẻ gặt đơn tr−ớc lọc. 4.2.2.1 Thử vô trùng Bảng 4-15: Kết quả thử vô trùng Loạt Kết quả Trực tiếp Thio SCD MV-1S - - - MV-2S - - - MV-3S - - - MV-4S - - - MV-5S - - - Sau khi gặt, hỗn dịch virút đ−ợc hộn lại, lắc đều thành một hỗn dịch đồng nhất gọi là một mẻ gặt đơn. Chúng đ−ợc lấy mẫu và tiến hành thử vô trùng. Môi tr−ờng 50
  51. Thioglycolat dùng để phát hiện vi khuẩn, môi tr−ờng SCD dùng để phát hiện nấm. Qua bảng 4-15 thấy rằng cả 5 mẻ gặt đơn đều không bị nhiễm khuẩn và nấm. Kể cả mẫu thử trực tiếp cũng cho kết quả âm tính. 4.2.2.2 Kết quả kiểm tra virút ngoại lai Hỗn dịch virút sởi đ−ợc trung hoà bằng kháng huyết thanh sởi đặc hiệu, sau đó gây nhiễm trên 3 loại tế bào : Vero, FL, CEC để phát hiện virút ngoại lai. Ph−ơng pháp tiến hành giống nh− làm với mẫu n−ớc nổi. Riêng đối với tế bào phôi gà thì đến cuối thời gian theo dõi đ−ợc cấy truyền và theo dõi tiếp 14 ngày nữa. Vì virút sởi đã đ−ợc trung hoà hết nên trong thời gian theo dõi nếu thấy tế bào bị huỷ hoại chứng tỏ chúng đã bị nhiễm một loại virút khác. Bảng 4-16: Kết quả kiểm tra virút ngoại lai có trong mẻ gặt đơn. Trên tế bào Trên CEC Trên tế bào FL Loạt Vero Nhiễm lần 1 Cấy truyền Số Kết Số chai Kết Số chai Kết Số chai Kết chai quả quả quả quả MV-1S 8 - 8 - 8 - 8 - MV-2S 8 - 8 - 8 - 8 - MV-3S 8 - 8 - 8 - 8 - MV-4S 8 - 8 - 8 - 8 - MV-5S 8 - 8 - 8 - 8 - Kết quả trên cho thấy cả 5 loạt vắcxin đều không có biểu hiện gây thoái hoá tế bào. Chứng tỏ trong hỗn dịch ban đầu chỉ có virút sởi nh−ng đã bị trung hoà hết và ngoài ra không có mặt của bất cứ virút nào khác. 51
  52. 4.2.2.3 Kết quả kiểm tra Mycoplasma Bảng 4-17: Kết quả kiểm tra Mycoplasma MT (1) MT (2) Loạt Nhiễm lần 1 Cấy truyền Nhiễm lần 1 Cấy truyền Thời Kết Thời Kết Thời Kết Thời Kết gian quả gian quả gian quả gian quả theo dõi theo dõi theo dõi theo dõi MV-1S 14 - 14 - 14 - 14 - MV-2S 14 - 14 - 14 - 14 - MV-3S 14 - 14 - 14 - 14 - MV-4S 14 - 14 - 14 - 14 - MV-5S 14 - 14 - 14 - 14 - Kết quả kiểm tra cho thấy các mẫu vắcxin trên không bị nhiễm Mycoplasma. Đây là một yếu tố rất hay nhiễm trên các nuôi cấy tế bào, tốc độ lan truyền nhanh và khó phát hiện bằng kính hiển vi quang học thông th−ờng. Theo khuyến cáo của TCYTTG, các vắcxin đ−ợc sản xuất từ nuôi cấy tế bào phải bắt buộc thực hiện thử nghiệm này. Hiện nay có nhiều ph−ơng pháp mới để phát hiện mycoplasma nh− nhuộm ADN, ph−ơng pháp PCR. Nh−ng chúng tôi vẫn áp dụng ph−ơng pháp nuôi cấy. Đây là một ph−ơng pháp đơn giản, tiện lợi, rẻ tiền, độ chính xác cao. 4.2.3. Kiểm tra vắcxin bán thành phẩm Vắcxin bán thành phẩm sau khi lọc đ−ợc tiến hành những thử nghiệm nh−: vô trùng, hiệu giá, nhận dạng, an toàn trên súc vật, albumin bò tồn d−. 4.2.3.1 Kết quả thử vô trùng 52
  53. Bảng 4-18: Kết quả thử vô trùng mẻ gặt sau khi lọc Kết quả Loạt Trực Thio SCD tiếp MV-1S - - - MV-2S - - - MV-3S - - - MV-4S - - - MV-5S - - - Mục đích của quá trình lọc là để loại bỏ xác tế bào để thu đ−ợc một hỗn dịch virút thuần nhất. Qua bảng trên ta thấy sau khi lọc tất cả các mẫu vắcxin đều không bị nhiễm khuẩn và nấm. 4.2.3.2 Kết quả chuẩn độ hiệu giá Bảng 4-19: Kết quả chuẩn độ hiệu giá Loạt MV-1S MV-2S MV-3S MV-4S MV-5S Hiệu giá 5,53 5,03 4,8 4,08 4,55 n (10 ccid50/ml) Hiệu giá chủng tr−ớc khi cấy truyền là 5,13 log10 ccid50/ml. Sau lần cấy truyền thứ nhất hiệu giá thu đ−ợc là 5,53. Từ loạt MV-1S này chúng tôi đem cấy truyền để sản xuất vắcxin. Loạt MV-2S có hiệu giá là 5,03 và loạt MV-3S có hiệu giá là 4,8 log10 ccid50/ml. Theo yêu cầu của TCYTTG một liều tối thiểu dùng cho ng−ời có hàm l−ợng virút đạt không d−ới 1000 ccid50. Do vậy các loạt vắcxin MV- 2S và MV-3S đủ điều kiện để pha và đông khô thành vắcxin thành phẩm. Theo th−ờng qui của Trung Quốc đối với chủng Hu191 thì từ lần cấy truyền thứ 22 đến 32 mới đ−ợc dùng cho ng−ời. Do qua nhiều lần cấy truyền đặc điểm di truyền 53
  54. của virút sẽ bị thay đổi. Có thể chúng sẽ quay trở lại độc lực gây các phản ứng có hại cho con ng−ời. Nh−ng trong quá trình nghiên cứu, sản xuất giai đoạn đông khô thử nghiệm để tìm ra đ−ợc qui trình đông khô thích hợp đòi hỏi phải làm nhiều lần, tốn nhiều mẫu. L−ợng vắcxin thu đ−ợc từ loạt MV-2S và MV-3S không đủ để làm việc này. Do đó chúng tôi đã cấy truyền thêm thành loạt MV-4S và MV-5S để lấy mẫu đông khô thử. Tuy nhiên các thử nghiệm về vô trùng và hiệu giá thấy rằng 2 loạt vắcxin này đều đạt tiêu chuẩn. 4.2.3.3 Kết quả nhận dạng virút sởi Bảng 4-20: Kết quả kiểm tra nhận dạng Số giếng tế bào huỷ hoại Loạt Kết luận Mẫu Mẫu + KHT sởi Chứng tế bào MV-1S 5/5 0/5 0/2 + MV-2S 5/5 0/5 0/2 + MV-3S 5/5 0/5 0/2 + MV-4S 5/5 0/5 0/2 + MV-5S 5/5 0/5 0/2 + Qua bảng trên ta thấy virút trong mẫu thử đã bị trung hoà hết bởi kháng huyết thanh kháng virut sởi. Điều đó chứng tỏ virút đó là virút sởi. Đây là một tiêu chuẩn bắt buộc phải làm đối với vắcxin dùng cho ng−ời. Ng−ời ta khuyến cáo nên tiến hành thử nghiệm này đối với cả vắcxin bán thành phẩm và vắcxin thành phẩm. 4.2.3.4 Kết quả kiểm tra an toàn trên động vật Chúng tôi chỉ tiến hành thử nghiệm này cho các loạt vắcxin MV-1S, MV-2S và MV-3S. Súc vật dùng trong thử nghiệm này gồm chuột lang, chuột ổ và chuột nhắt trứng. 54
  55. Bảng 4-21: Kết quả kiểm tra trên an toàn động vật Loạt Động vật Số l−ợng Số ngày Tỷ lệ % chuột sống Tỷ lệ % tăng ĐV tiêm theo dõi khoẻ mạnh trọng Chuột ổ 20 14 100 MV - 1S Chuột nhắt 11 21 100 172 Chuột lang 5 42 100 118,5 Chuột ổ 36 14 100 MV - 2S Chuột nhắt 11 21 100 172 Chuột lang 5 42 80 120 Chuột ổ 20 14 100 MV - 3S Chuột nhắt 11 21 100 179,5 Chuột lang 5 42 100 110,2 Chuột ổ 10 14 100 Chứng Chuột nhắt 5 21 100 166 Chuột lang 5 42 100 114,4 Cả 3 loạt vắcxin trên đây đều đạt tiêu chuẩn về an toàn trên động vật. Trên tất cả các loại động vật đến cuối thời gian theo dõi chuột đều sống khoẻ mạnh, tăng cân. Riêng loạt MV-2S có 1 chuột lang bị chết trong vòng 24 giờ sau tiêm do đó không tính vào kết quả thử nghiệm. Theo tiêu chuẩn của TCYTTG đến cuối thời gian theo dõi ít nhất 80% số động vật thử nghiệm sống khoẻ mạnh thì thử nghiệm đ−ợc coi là đạt yêu cầu. Nh− vậy cả 3 loạt văcxin trên đều đạt yêu cầu về thử an toàn trên động vật. 4.2.4 Kiểm tra vắcxin thành phẩm Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành đông khô 13 loạt. Từ loạt số 1 đến loạt 11 chúng tôi sử dụng vắcxin bán thành phẩm loạt MV-4S và MV-5S để tìm ra qui trình đông khô thích hợp. Đối với mỗi loạt này sau khi đông khô chúng tôi tiến hành đánh giá về đặc điểm vật lý của sản phẩm, định l−ợng độ ẩm tồn d−. Sau khi qui trình đông khô đã ổn định chúng tôi mới tiến hành đông khô vắcxin từ loạt bán thành phẩm MV-2S và MV-3S. Các loạt vắcxin thành phẩm đ−ợc đánh số là L12 và L13 4.2.4.1 Kết quả thử vô trùng 55
  56. Bảng 4-22: Kết quả vô trùng vắcxin thành phẩm Mẫu vắcxin Mẫu n−ớc cất Loạt Trực Thio SCD Trực Thio SCD tiếp tiếp L12 - - - - - - L13 - - - - - - Mẫu n−ớc cất ở đây cùng loạt với n−ớc cất dùng để hồi chỉnh văcxin thành phẩm. Qua đó ta thấy cả hai loạt vắcxin thành phẩm đạt tiêu chuẩn về vô trùng. 4.2.4.2. Kết quả kiểm tra hiệu giá Bảng 4-23: Kết quả chuẩn độ hiệu giá Loạt Hiệu giá n (10 CCID50/0,5 ml/liều) L12 3,67 L13 3,92 Theo tiêu chuẩn mỗi liều vắcxin dùng cho ng−ời là 0,5 ml và có hiệu giá không d−ới 1000 CCID50. ở đây ta thấy loạt L12 có hiệu giá đạt 4677 và loạt L13 là 8 317 CCID50 trong 1 liều. Nh− vậy hai loạt vắcxin thành phẩm sản xuất đ−ợc có hiệu giá đạt tiêu chuẩn. 4.2.4.3.Kết quả kiểm tra tính ổn định nhiệt Bảng 4-24: Kết quả kiểm tra tính ổn định nhiệt Hiệu giá 10nCCID / 0,5ml/liều Loạt 50 Mẫu vắcxin Mẫu 37oC/ 7 ngày Chênh lệch L12 3,67 3,02 0,65 L13 3,92 3,07 0,85 56
  57. Kết quả kiểm tra tính ổn định nhiệt cho thấy loạt L12 sau khi ủ ấm ở 37oC trong 1 tuần hiệu giá virút giảm 0,65 log và loạt L13 giảm 0,85 log. Hiệu giá còn lại của loạt L12 là 1047 và loạt L13 là 1174 ccid50. Theo tiêu chuẩn của TCYTTG đối với vắcxin sởi sau khi ủ ấm ở 37oC trong 1 tuần hiệu giá vắcxin giảm không quá 1 log và hiệu giá còn lại phải còn ít nhất bằng 1 liều gây nhiễm cho ng−ời tức là 1000 ccid50. Qua đây ta thấy cả 2 loạt vắcxin thành phẩm L12, L13 đều đạt tiêu chuẩn về tính ổn định nhiệt. 4.2.4.4 Kết quả nhận dạng virút sởi Bảng 4-25: Kết quả nhận dạng Số giếng tế bào huỷ hoại Loạt Kết luận Mẫu Mẫu + KHT sởi Chứng tế bào L12 5/5 0/5 0/2 + L13 5/5 0/5 0/2 + Bảng 4-25 cho ta thấy mẫu vắcxin sau đông khô loạt L12 và L13 là virút sởi. 4.2.4.5 Kết quả kiểm tra Mycoplasma Bảng 4-26: Kết quả kiểm tra Mycoplasma MT (1) MT (2) Loạt Nhiễm lần 1 Cấy truyền Nhiễm lần 1 Cấy truyền Thời Kết Thời Kết Thời Kết Thời Kết gian quả gian quả gian quả gian quả theo dõi theo dõi theo dõi theo dõi L12 14 - 14 - 14 - 14 - L13 14 - 14 - 14 - 14 - Bảng 4-26 cho thấy các mẫu vắcxin không bị nhiễm mycoplasma. 57
  58. 4.2.4.6 Kết quả kiểm tra Albumin bò tồn d− Chúng tôi sử dụng ph−ơng pháp ng−ng kết hồng cầu. Mẫu vắcxin đạt yêu cầu khi hàm l−ợng albumin bò tồn d− ≤ 50 ng/ml Bảng 4-27: Kết quả kiểm tra albumin bò tồn d− Loạt Kết quả (ng/ml) Kết luận L12 25,04 Đạt yêu cầu L13 25,04 Đạt yêu cầu Albumin bò là một trong những yếu tố gây phản ứng phụ trong vắcxin sởi. Tiêu chuẩn tối đa cho phép là không quá 50 ng/ml. Chính vì vậy trong quá trình sản xuất tr−ớc khi thay bằng môi tr−ờng duy trì (ngày thứ 3 sau gây nhiễm) tế bào phải đ−ợc rửa 3 lần bằng Hank mà phải rửa cả 2 mặt của chai. Mục đích là để loại bỏ hết albumin bò còn sót lại trên bề mặt chai. Kết quả ở bảng 4-27 cho thấy hai loạt vắcxin này đạt yêu cầu về l−ợng albumin bò tồn d−. 4.2.4.7 Kết quả kiểm tra độ ẩm tồn d− Chúng tôi sử dụng ph−ơng pháp sấy đến trọng l−ợng không đổi trong điều kiện 0 có P2O5, áp suất 5mmHg tại 60 C/ 3 giờ. Đo trọng l−ợng của mẫu vào thời điểm tr−ớc và sau sấy. Phần chênh lệch về trọng l−ợng của mẫu là phần n−ớc tồn d− trong mẫu đã bị bốc hơi trong quá trình thí nghiệm. Từ đó mà tính ra tỷ lệ % l−ợng n−ớc tồn d−. Theo yêu cầu của WHO đối với vắcxin sởi đông khô độ ẩm tồn d− phải ≤3% Bảng 4-28: Kết quả độ ẩm tồn d− Loạt Độ ẩm tồn d− (%) Kết luận L12 1,37% Đạt yêu cầu L13 2,03% Đạt yêu cầu Kết quả ở bảng 4-29 cho thấy hai mẫu vắcxin đông khô L12 và L13 đạt tiêu chuẩn về độ ẩm tồn d−. 58
  59. 4.2.4.8 Kết quả kiểm tra an toàn chung Bảng 4-29: Kết quả kiểm tra an toàn chung Kết quả Thời gian Loạt Súc vật Số l−ợng theo dõi Số chuột Tỷ lệ % sống khoẻ tăng trọng Chuột lang 2 7 2 106,9 L12 Chuột nhắt 5 7 5 125 Chuột lang 2 7 2 105,2 L13 Chuột nhắt 5 7 5 120 Chuột lang 2 7 2 107,1 Chứng Chuột nhắt 5 7 5 120 Kết quả kiểm tra an toàn chung cho thấy 100% số chuột sống khoẻ mạnh và tăng cân trong thời gian theo dõi. Hai loạt vắcxin thành phẩm L12 và L13 đạt yêu cầu về an toàn. 59
  60. Ch−ơng 5: Kết luận 5.1. B−ớc đầu đã xây dựng đ−ợc qui trình và sản xuất đ−ợc văcxin sởi thực nghiệm trong phòng thí nghiệm. 5.1.1. Trứng gà SPF dùng cho nghiên cứu này đ−ợc nhập từ công ty MIRIAL của Trung Quốc. Nhiệt độ ấp trứng 37,5-38oC, độ ẩm 70%. Tỷ lệ tạo phôi đạt sấp sỉ 70%. 5.1.2. Một phôi gà 9 ngày tuổi có trọng l−ợng trung bình 0,75 gam, nuôi cấy đ−ợc khoảng 1,2-1,4 chai Roux. Mật độ nuôi cấy tế bào là 400.000 tế bào trong 1 ml. Mỗi chai cấy 170 ml. Thời gian tế bào phát triển kín một lớp là 2 ngày. Số tế bào có trong một chai đã phát triển kín một lớp là 45 triệu. 5.1.3. Tỷ lệ gây nhiễm virút của chủng Hu191 là 0,012 CCID50 cho 1 tế bào. Thời gian gặt tốt nhất là sau 6 ngày nuôi cấy, CPE đạt từ 3+ đến 3,5+. 5.1.4. Đã sản xuất đ−ợc 2 loạt văcxin thành phẩm với tổng số 2.700 liều. 5.2. Kết quả kiểm định văcxin sởi thực nghiệm trong phòng thí nghiệm 5.2.1. Tế bào tách từ trứng gà SPF nhập khẩu từ Trung Quốc không bị nhiễm các virút gây hấp phụ hồng cầu, các virút gây huỷ hoại tế bào FL, VERO và tế bào phôi gà. Chúng đủ tiêu chuẩn dùng để sản xuất văcxin sởi 5.2.2. Các loạt văcxin bán thành phẩm sản xuất đ−ợc không bị nhiễm các yếu tố ngoại lai, đạt mức độ an toàn thử nghiệm trên sức vật và có hiệu giá đủ cao để đông khô thành văcxin thành phẩm. 5.2.3. Hai loạt vắcxin thành phẩm L12 và L13 có hiệu giá 3,67 và 3,92 log 10 CCID50, đạt tiêu chuẩn về tính ổn định nhiệt, độ ẩm tồn d− <3%, l−ợng albumin bò tồn d− 25,04 ng/ml, đảm bảo tính an toàn khi thử nghiệm trên động vật. 60
  61. Tài liệu tham khảo I. Tiếng Việt 1. Nguyễn Văn Hiếu và cs. Kết quả triển khai chiến dịch tiêm phòng sởi mũi 2 cho trẻ 9 tháng đến 10 tuổi tại Hải phòng năm 1999. Tạp chí Y tế dự phòng, tập X, số 3(46) - Phụ bản. 2000 2. Phạm Kim Liên, Nguyễn Đồng Lịch, Bùi Thế Hiền, Hoàng Văn Miêng, Phạm Quang Hoà, Bùi Huy Thức. Tình hình bệnh sởi tại Thái Bình qua 14 năm triển khai ch−ơng trình TCMR, 19985 - 1999. . Tạp chí Y tế dự phòng, tập X, số 3(46) - Phụ bản. 2000 3. Huỳnh Ph−ơng Liên, Nguyễn Thị Thắng, Nguyễn Thị Th−ờng, Nguyễn Thị út, Nguyễn Thị Quý, Phạm Kim Thanh, Vũ Tuyết Minh, Nguyễn Văn Hiếu, Đỗ Sĩ Hiển. Nghiên cứu đáp ứng kháng thể và tồn l−u kháng thể sởi tr−ớc và sau khi tiêm đồng loạt vắc xin sơỉ mũi 2 tại Tiên Lãng, Hải Phòng. Tạp chí VSPD, tập XII, số 3 (54) - Phụ bản/2002. 4. Nguyễn Hạnh Phúc, Huỳnh Ph−ơng Liên, Nguyễn Kim Hà, Nguyễn Thị út, Nguyễn Thị Quý, Nguyễn Thị Thắng, Trần Văn Tiến, Hoàng Văn Tân. Kết quả xét nghiệm huyết thanh học xác định vụ dịch sởi tại Hà Nội, Hà Bắc, Hà Giang, Lào Cai từ tháng 1 đến tháng 3 năm 1992. Tạp chí VSPD, Tập II, số 3/1992. 5. Nguyễn Hạnh Phúc, Huỳnh Ph−ơng Liên, Hoàng Thuỷ Nguyên. Tinh chế kháng nguyên virut sởi ứng dụng trong các kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh miễn dịch học. Tạp chí VSPD, tập IV, số 3(16), phụ bản. 1994. 6. Doãn Thị Tâm, Hoàng Thị Liên, Nguyễn Kim Tâm, Khuất Thị Dần. Theo dõi chất l−ợng Vắc xin sởi dùng trong ch−ơng trình TCMR ở Việt Nam. Tạp chí VSPD, Tập II, số 3/1992. 61
  62. 7. Hoàng Văn Tân, Trần Văn Tiến, Huỳnh Ph−ơng Liên và cs. Kết quả đánh giá hiệu lực vắc xin sởi tại 12 xã có dịch thuộc tỉnh Hải H−ng, Hà Bắc và Hà Nội, 1991 - 1992. Tạp chí VSPD, tập IV, số 3(16), phụ bản. 1994. 8. Hoàng Văn Tân, Trần Văn Tiến, Huỳnh Ph−ơng Liên, Nguyễn Kim Thảo, Nguyễn Thị út, Nguyễn Thị Quý, L−ơng Đức Đán, Nguyễn Văn Đệ. Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vắc xin sởi ở trẻ em đã tiêm vắc xin từ năm 1984 đến 1989 tại xã Nghĩa Trụ, Mỹ Văn, Hải H−ng. Tạp chí VSPD, tập I, số 2/1991. 9. Phạm Anh Tuấn, Trần Gia H−ng, Nguyễn Thu Yến, Trần Văn Tiến, Nguyễn Thị Thắng và cs. Một số nhận xét về tình hình bệnh sởi khu vực miền Bắc 1999. Tạp chí Y tế dự phòng, tập X, số 3(46) - Phụ bản. 2000 10. Phạm Anh Tuấn, Trần Gia H−ng, Nguyễn Thu Yến, Trần Văn Tiến. Một số nhận xét về bệnh sởi khu vực miền Bắc, 1996 - 1997. Tạp chí VSPD, tập VIII, số 2 (36) - Phụ bản/1998. 11. Nguyễn Thu Yến, Phạn Anh Tuấn, Phạm Quang Thái, Trần Gia H−ng, Nguyễn Thị Thắng và cs. Nhận xét về các vụ dịch sởi khu vực Miền Bắc, 2001. Tạp chí VSPD, tập XII, số 3 (54) - Phụ bản/2002. 12. Nguyễn Thu Yến, Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Thắng, Nguyễn Đăng Ngoạn. Điều tra dịch tễ huyết thanh học bệnh sởi ở trẻ em tại Thanh Hoá. Tạp chí VSPD, tập XII, số 3 (54) - Phụ bản/2002. 62
  63. Tiếng Anh 13 Aaby, P., Clements, CJ Measles immunization research: a review. Bull. WORLD Health Oragn., 67: 443 - 448, 1989. 14 Adré FE, Peetermans J: Effect of simultaneous administration of live measles vaccine on the "take rate" of live mumps vaccine. In Van Wezel AL, Hennessen W (eds): Developments in Biological Standardization. Basel, Karger, 1986, vol 65, pp 101 - 107. 15 Baczko K, Billeter M, Meules V: Purification and molecular weight determination of measles virus genomic RNA. J Gen Virol 1983; 64:1409- 1413 16 Bart KJ, Orenstein WH, Hinman AR: The virtual elimination of rubella and mumps from the United States and the use of combined measles, mumps, and rubella vaccine (M + M + R) to eliminate measles. In Van Wezel AL, Hennessen W (eds): Developments in Biological Standardization. Basel, Karger, 1986, vol 65, pp 45- 52. 17 Bartlett, M.S.: The critical community size for measles in the United States, J.R. Stat, Soc. Ser. A, 123: 37 - 44,1960. 18 Beck M, Smerdel S, Dedié J, Delimar N, Rajninger M, Juzbasié M, Manhalter T, Vlatkovié R, Boroêié B, Mikajié Z: Immune response to Edmonston - Zagreb measles virus strain in monovalent and combined MMR vaccine. In Van Wezel AL, Hennessen W (eds) : Developments in Biological Standardization. Basel, Karger, 1986, vol 65, pp 95 - 100. 19 Bin D, Hanhua F, Shoujun H, et al. Study on the hemolysis inhibition antibody produced after immunization of live attenuated measles vaccine (Hu 191). Chin J Microbiol Immunol 1982: 2 (2): 80 -5 in Chinese. 20 Buckland R. Expression of measles virus nucleoprotein in Escherichia coli: use of deletion mutant to locate the antigenic sites. J Gen Virol 1989: 70 (20): 435. 21 CDC: Measles prevention: Recommendations of the immunization Practices Advisory Committee (ACIP). MMWR, 38:1 - 18, 1989. 22 Centers for Disease Control: Recommendations of the Immunization Practices Advisory Committee (ACIP): Measles prevention. MMWR 1982; 31: 217 - 224, 229 - 231. 63
  64. 23 Centers for Disease Control: Recommendations of the Immunization Practices Advisory Committee: Measles prevention: Supplementary statement. MMWR 1987; 38/1:11-14. 24 Chongyong L, Zhenying Z, Jiuxing F, et al. Surveillance on seroconversion rate of immunization with measles vaccine in 1996. Henan province. Chin J Vaccines Immunization 1997: 3 (5 -B): 65 - 7 in Chinese. 25 Cliff, A., Haggett, P.: Island Epidemics, Scientific American, 250 (5): 110 - 117, 1984. 26 Cutts, F, T., Henderson, R. H., Clements, CJ., Chen, R.T., Patriarca, P.A. : Principles of measles control. Bull. WORLD Health Organ., 69: 1- 7, 1991. 27 Dinxing Y. Clinical practice of live attenuated measles vaccine (Hu 191). Natl Med J China 1965 : 51 (4): 203 - 11 in Chinese. 28 Enders JF, Kato SL, Holloway A: Development of attenuated measles - virus vaccine. A summary of recent investigation. Am J Dis Child 1962; 103 : 335 - 340. 29 Fukuda, A. Sugiura. A.: Temperature - dependent growth restriction in measles vaccine strains. Jpn. Med.Sci. Biol., 36: 331 - 335, 1983. 30 Gedelman HE, Wolinsky JS, Johnson RT, Pressman NJ, Prezeshkpour GH, Boisset GF: Measles encephalomyelitis: Lack of evidence of viral invasion of the central nature system and quantitative study of the nature of demyelination. Ann Neurol 1984; 15: 353 - 360. 31 Graves M, Silver SM, Choppin PW: Measles virus polypeptide synthesis in infected cells. Virology 1978; 86:254-263 32 Hinman, A, R: World eradication of measles. Rev. Infect, Dis. 4: 933 - 937, 1982. 33 Hyypiọ T, Korkiamọki P, Vainionpọọ R: Replication of measles virus in human lymphocytes. J Exp Med 1985; 161: 1261 - 1271. 34 Japan Measles Vaccine Research Commission: A field trial of further attenuated live measles virus vaccine in Japan. 1968. Jpn. J. Med.Sci. Biol., 22: 191 - 200, 1969. 64
  65. 35 Just M, Berger R, Glĩck R, Wegmann A: Evaluation of a combined vaccine against measles - mumps - rubella produced in human diploid cells. Dev Biol Stand 1986 ; 65: 25 - 28. 36 Kambarami RA, Nathoo KJ, Nkrumah FK, et al. Measles epidemic in Harare, Zimbabwe, despite high measles immunization coverage rates. Bull WHO 1991: 69 (2): 213 - 9. 37 Kejian G, Yquing L, Libi Z. The advantages of ELISA for measles antibody detection. Chin J Microbiol Immunol 1986: 4 (6) : 218 - 21 in Chinese. 38 Kiepiela P, Coovadia HM, Loening WEK, et al. Lack of efficacy of the standard potency Edmonston- Zagreb live, attenuated measles vaccine in African infants. Bull WHO 1991: 69 (2): 221 - 7. 39 Kobune, F., Sakata, H., Sugiura, A.: Marmoset lymphoblastoid cells as a sentitive host for isolation of measles virus. J. Virol., 64: 700 - 705, 1990. 40 Kohama, T., Sugiura, A. : Characteristic of measles virus (Text in Japanese). Japanese J. Pediatr. Med., 21: 27 - 33, 1989. 41 Krugman S, Giles JP, Jacobs AM, Friedman H: Studies with a further attenuated live measles virus vaccine. Pediatrics 1963; 31: 919- 928. 42 Lingyun T. Progress of measles virus and vaccine. Chin J Biologicals 1997: 10 (4): 250 - 3 in Chinese. 43 Markowitz LE. Immunization of six - month - old infants with different doses of Edmonston - Zagreb and Scharz measles vaccine. N Eng J Med 1990: 332 (3): 580-7. 44 Merz DC, Sheid A, Choppin PW: Importance of antibodies to the fusion glycoprotein of paramyxoviruses in the prevention of spread of infection. J Exp Med 1983; 151 - 275 - 279. 45 Norrby E, Applel MJ: Humoral immunity to canine distemper after immunization of dogs with inactivated and live measles virus. Arch Virol 1980; 66: 169 - 177. 46 Norrby E, Gollmar Y: Identification of measles virus specific hemolysis - inhibiting anti-bodies separate from hemagglutinating -inhibiting antibodies. Infect Immun 1975; 11: 231 - 239. 65
  66. 47 Orenstein WA, Markowitz L, Preblud SR: Appropriate age for measles vaccination in the United State. In Van Wezel Al, Hennessen W (eds): Developments in Biological Standardization. Basel, Karger, 1986, vol 65, pp 13 - 21. 48 Preblud SR, Katz SL : Measles vaccine. In Plotkin SA, Mortimer EA (eds): Vaccines. Philadelphia, WB Saunders, 1988, pp 182 - 222. 49 Rauh, L. W., Schmidt, R.: Measles immunization with killed virus vaccine. Am, J. Dis. Child., 109: 232 - 237, 1965. 50 Richardson CD, Berkovich A, Rozenblatt S, Bellini WJ: Use of antibodies directed against synthetic peptides for identifying cDNA clones, estabishing reading frame, and deducing the gene order of measles virus. J Virol 1985; 59:186-193 51 Rota JS. Genetic variability of the glycoprotein gene of the current wild - type measles isolates. Virology 1992: 188: 135. 52 Rota JS. Molecular epidemiology of measles virus: identification of pathways of transmission and implications for measles elimination. J Infect Dis 1996: 173 : 32. 53 Shasby DM, Shope TC, Down H, Herrmann KL, Polkowski J: Epidemic measles in a highly vaccinated population. N Engl J Med 1977; 296 : 585 - 589. 54 Sheshberadran H, Chen SN, Norby E: Monoclonal antibodies against five structural components of measles virus: I. Characterization of antigenic determinants on nine strains of meales virus. Virology 1983; 128:341-353 55 Shuichan X. Study on expression of fusion protein and hemag-glutinin of measles virus in vaccine virus and vircation of structure and immunity of F protein in two measles virus strains. Institute of Virology CAMP. Beijing, 1992 in Chinese. 56 Sugiura, A., Fukuda, A., Sakata, H., Kubune, F., Kohama, T.: Identification of measles virus isolated from recipients of measles vaccine (Text in Japanese). Clinical Virology, 19: 148 - 151, 1989. 57 Suzuki, K., Morita, M., Katoh, M., Kidokoro, M., Saika,S., Yoshizawa, S., Hashizume, S., Horiuchi, K., Okabe, N., Shinozaki, T., Hirayama, M. : Development and evaluation of the TD 97 measles virus vaccine. J. Med. Virol., 32: 194 - 201, 1990. 66
  67. 58 Udem SA, Cook KA: Isolation and characterization of measles virus intracellular nucleocapsid RNA. J Gen Virol 1984; 49:57-65 59 Varsanyi TM, Utter G, Norrby E: Purification morphology and antigenic characterization of measles virus envelope components. J Gen Virol 1984; 65:355-366 60 Ward BJ, Boulianne N, Rotnam S, et al. Celullar immunity in measles vaccine failure: demonstration of measles antigen - specific lymphoproliferative responses despite limited serum anti-body production after revaccination. J Infect Dis 1995: 172: 1591- 5. 61 Wegmann A, Glĩck R, Just M, Mischeler R, Paroz P, Germanier R: Comparative study: and evaluation of further attenuated, live measles vaccines alone and in combination with mumps and rubella vaccines. In Van Wezel AL, Hennessen W (eds): Developments in Biological Standardization. Basel, Karger, 1986, vol 65, pp 69 -74. 62 Wenbo X, Libi ZX, Tinghai X, et al. Measles virus isolation and its serological analysis. Chin J Vaccines Immunization 1996 : 2 (1): 4 - 7 in Chinese. 63 Wenyan Z. EPI, 1st ed, Shanghai: Shanghai Science and Technology Publishing House, 1997. 64 Whittle HC, Rowland MG, Mann GR, Lamb WH, Lewis RA: Immunization of 4 - to 6 - month - old Gambian infants with Edmonston - Zagreb measles vaccine. Lancet 1984; 2: 834 - 837. 65 Xiaozhen L. Measles vaccine meeting in Geneva. Foreign Med Sci - Biological Prod Fascicle 1990: 13 (5): 220. 66 Yan YW, She SQ, Xiao Y, et al. A seroepidemiological study of an out break of measles. Chn J Epidemiol 1988: 9(3): 165 in Chinese. 67 Yan YW, Yan P, Jianming D, et al. Features of a measles outbreak in a rural area Hubei and its control. Shanghai J Prev Med 1993 ; 3 (5): 31 - 3 in Chinese. 68 Yan YW. Investigation on the measles antibody level of health population in Jingzhou, 1995. EPI of Hubei 1996: 4: 11 in Chinese. 69 Yihao Z, Some problems in etiology of measles virus. Shanghai J Prev Med 1994: 6 (9): 6 - 7 in Chinese. 67
  68. 70 Yowang Y, Yong X, Yong H, et al . Observation on protective titre of ELISA IgG antibody to measles virus. China Pub Health 1990: 6 (2): 49- 50 in Chinese. 71 Yuping D, Huaiwen L, Junquing L, et at. Study on serological and clinical reaction of immunization with S 191 measles vaccine to 4 - 7 months old infants. Chin J Vaccines Immunization 1997: 3 (1): 12 - 15 in Chinese. 72 Zhengxiang H, Binyi J, Fuchang Z, et al. Study on the live attenuated measles vaccine. Natl Med J China 1961: 6: 341 - 5 in Chinese. 73 Zhenkui G, He H, Lin L, et al. Early diagnosis of Rubella virus infection with monoclonal antibody against human IgM (à chain). Virol Sinica 1997: 12 (3): 281 - 3 in Chinese. 74 Zhihui C, Bin D, Qicha L, et al. Study on the immunization endurance of measles vaccine - results of basic inoculation for 14 - 15 years. Natl Med J China 1989; 69 (7): 389 - 92 in Chinese. 75 Zhihui C, Xigen R, Hueying Y, et al. Study on the seroepidemilogical efficacy of Shanghai 191 measles live vaccine after 16 years since primary immunization. Chin J Biologicals 1989; 2 (2): 5 - 7 in Chinese. 68