Luận văn Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum

Nội dung text: Luận văn Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum

1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN ĐỘNG HỌC LÊN MEN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Sinh viên thực hiện : Hoàng Thị Lệ Hoa Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Tp.HCM, tháng 12 năm 2019
2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG ab LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN ĐỘNG HỌC LÊN MEN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Sinh viên thực hiện : Hoàng Thị Lệ Hoa Mã số sinh viên : 1511539376 Lớp : 15DTP1A Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Giáo viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Quốc Duy Tp.HCM, tháng 12 năm 2019
3. TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM & MÔI TRƯỜNG Độc lập - Tự do - Hạnh phúc Tp. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 11 năm 2019 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Hoàng Thị Lệ Hoa Mã số sinh viên: 1511539376 Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Lớp: 15DTP1A 1. Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN ĐỘNG HỌC LÊN MEN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM 2. Nhiệm vụ luận văn ˗ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi pH và độ acid tổng của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. ˗ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi số lượng vi khuẩn của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. ˗ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi hàm lượng glucose và cellulose của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. 3. Ngày giao nhiệm vụ luận văn: 15/6/2019 4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ luận văn: 15/11/2019 5. Người hướng dẫn: Họ và tên Học hàm, học vị Đơn vị Phần hướng dẫn Nguyễn Quốc Duy Thạc sĩ BM CNTP 100% Nội dung và yêu cầu của luận văn đã được thông qua bộ môn. Trưởng Bộ môn Người hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) ThS. Nguyễn Thị Vân Linh ThS. Nguyễn Quốc Duy
4. LỜI CẢM ƠN Để có được thành công như ngày hôm nay, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, gia đình và bạn bè. Trước hết, em xin cảm ơn giáo viên hướng dẫn của em, thầy Nguyễn Quốc Duy về những hướng dẫn và lời khuyên có giá trị. Em cảm thấy có động lực hơn trong suốt ba tháng làm thí nghiệm. Thầy đã truyền cảm hứng cho em rất nhiều để hoàn thành dự án này. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Kỹ thuật Thực phẩm và Môi trường đã cung cấp cho em những thông tin, hướng đi và nền tảng kiến thức cần thiết cho em đạt được những mục đích học tập của mình. Em muốn cảm ơn các anh chị trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ em trong khoảng thời gian qua. Nếu không có sự hiểu biết của anh chị về các thiết bị thì việc hoàn thành dự án của em sẽ rất khó khăn. Cuối cùng, em dành một sự cảm ơn đến gia đình, bạn bè cho một tình yêu thương và giúp đỡ ấy. Em xin kính chúc Quý thầy cô Khoa Kỹ thuật Thực phẩm và Môi trường và thầy Nguyễn Quốc Duy dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục sứ mệnh trồng người cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. iv
5. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả của đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi đã thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Quốc Duy. Các số liệu và kết quả được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, không sao chép của bất cứ ai, và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học của nhóm nghiên cứu nào khác cho đến thời điểm hiện tại. Nếu không đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình và chấp nhận những hình thức xử lý theo đúng quy định. Tp.HCM, ngày 25 tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn (Ký và ghi rõ họ tên) Hoàng Thị Lệ Hoa v
6. TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum được khảo sát. Nồng độ cơ chất được thay đổi ở các giá trị 50, 100, 200 g/L. Quá trình lên men celulose được mô tả dựa trên sự thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật trong canh trường lên men và hiệu suất sinh tổng hợp cellulose. Với lượng đường ban đầu 100 g/L theo thời gian, hàm lượng acid tăng do vi khuẩn A. xylinum sử dụng đường tham gia vào quá trình chuyển hóa các ethanol thành acid acetic khiến pH giảm và acid tăng, pH không thay đổi đáng kể trong 2 ngày đầu từ (4.203–4.093); sau đó giảm đáng kể đến ngày 10 (3.346) và không thay đổi ở các ngày cuối quá trình lên men. Hàm lượng đường giảm mạnh từ ngày 0–5 từ (95.189–43.643 g/L) là do vi sinh vật đang ở pha phát triển bắt đầu sử dụng đường. Với lượng đường ban đầu 200 g/L hàm lượng đường giảm dần từ ngày 0–8 từ (206.784–118.993 g/L) do vi sinh vật đang ở pha tăng trưởng nên nguồn cung cấp carbon ban đầu giảm, vi khuẩn bắt đầu sử dụng acid gluconic trong quá trình trao đổi chất và trong thời gian này độ kết tinh của màng BC tăng dần. Khi hàm lượng đường giảm dẫn đến tổng hàm lượng vi sinh vật tăng và thời gian lên men tăng thì tổng hàm lượng vi sinh vật tăng. Theo khảo sát cho thấy hàm lượng glucose và màng BC tỷ lệ nghịch với nhau, glucose là nguyên liệu chính để tổng hợp màng BC. vi
7. MỤC LỤC NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP iii LỜI CẢM ƠN iv LỜI CAM ĐOAN v TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP vi MỤC LỤC vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi Chương 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 TÍNH CẤP THIẾT VÀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2 Chương 2. TỔNG QUAN 3 2.1 VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM 3 2.1.1 Đặc điểm hình thái 3 2.1.2 Đặc điểm sinh lý 4 2.2 QUÁ TRÌNH LÊN MEN CELLULOSE 4 2.2.1 Thành phần môi trường lên men 4 2.2.2 Phương pháp lên men 4 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng 5 2.3 CELLULOSE VI KHUẨN 6 Chương 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7 3.1 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT 7 3.1.1 Dụng cụ - thiết bị 7 3.1.2 Hóa chất 7 vii
8. 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 8 3.2.1 Thời gian nghiên cứu 8 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 8 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8 3.3.1 Quá trình nhân giống vi sinh vật 8 3.3.2 Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose 9 3.3.3 Bố trí thí nghiệm 9 3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 9 3.4.1 Xác định hàm lượng cellulose sinh tổng hợp 9 3.4.2 Xác định hàm lượng vi sinh vật 9 3.4.3 Xác định hàm lượng đường khử 9 3.4.4 Xác định độ acid tổng 10 3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 10 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 11 4.1 SỰ THAY ĐỔI pH VÀ ĐỘ ACID TỔNG 11 4.2 SỰ THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT 13 4.3 SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG GLUCOSE VÀ CELLULOSE 15 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 19 5.1 KẾT LUẬN 19 5.2 KHUYẾN NGHỊ 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 viii
9. DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi 4 Hình 3.1 Máy quang phổ UV-1800 (Shimadzu Schweiz GmbH) 7 Hình 3.2 Máy ly tâm 80-2 (Wincom Company Ltd.) 7 Hình 3.3 Cân phân tích PA (OHAUS Instruments Co.,Ltd.) 8 Hình 3.4 Tủ sấy UN55 (Memmert GmbH + Co.KG) 8 Hình 4.1 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L 11 Hình 4.2 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L 12 Hình 4.3 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L 13 Hình 4.4 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L 14 Hình 4.5 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L 14 Hình 4.6 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L 15 Hình 4.7 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L 16 Hình 4.8 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) và cellulose (g DW/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L 16 ix
10. Hình 4.9 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) và cellulose (g DW/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L 17 x
11. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt BC Bacterial cellulose Cellulose vi khuẩn BC_W Width of bacterial cellulose layer Chiều dày lớp cellulose HS Hestrin-Schramm medium Môi trường Hestrin-Schramm TA Total acidity Độ acid tổng DW On a dry weight Theo chất khô xi
12. Chương 1. MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT VÀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Cellulose là đại phân tử phong phú nhất trên trái đất và hầu hết cellulose được sản xuất bởi thực vật. Cellulose bao gồm các homopolymer của -1,4-glucose. Mức độ trùng hợp của cellulose thay đổi từ 100–15000 đơn vị glucose với sự kết tinh của các chuỗi tuyến tính dài để tạo thành các vi sợi của một thực thể tinh thể duy nhất [1]. Khi cellulose được xử lý bằng acid đậm đặc ở nhiệt độ cao thì cấu trúc của nó sẽ bị phân hủy thành các đơn vị glucose [2]. Cellulose là thành phần cấu trúc chính tạo nên thành tế bào của hầu hết các loại thực vật và nó chủ yếu được lấy từ các nguồn thực vật từ sợi lông, gỗ có chứa khoảng 40-90% là cellulose. Cellulose có giá trị thương mại trong sản xuất giấy, sợi nano cellulose [3], [4]. Ngoài thực vật, cellulose cũng được tìm thấy trong nhiều vi sinh vật như nấm, vi khuẩn và tảo. Báo cáo đầu tiên về cellulose được sản xuất từ vi khuẩn (bacterial cellulose – BC), đặc biệt từ A. xylinum, được công bố vào năm 1996 [5]. Các nghiên cứu gần đây đã tiết lộ rằng BC có thể được sản xuất bởi các vi khuẩn, bao gồm cả các loại vi khuẩn Gram âm như Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas, Salmonella, Alcaligenes, cũng như vi khuẩn Gram dương như Sarcina ventriculi. Mặc dù quá trình hình thành cellulose của A. xylinum đã được nghiên cứu khá nhiều trong các nghiên cứu trước đó, hầu hết các nghiên cứu đã giải quyết việc làm sáng tỏ quá trình sinh tổng hợp cellulose, và hầu hết các chủng được nghiên cứu cho đến nay chỉ tạo ra một lượng cellulose nhỏ [6]–[8]. Hơn nữa, một môi trường tiêu chuẩn được sử dụng để canh tác các sinh vật sản xuất vi khuẩn như môi trường Hestrin-Schramm rất tốn kém và đòi hỏi nhiều nguồn bổ sung dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy [9]. Nghiên cứu này được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên việc sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu nguồn sinh tổng hợp cellulose từ vi sinh vật với nhiều ưu điểm so với cellulose từ thực vật ứng dụng trong công nghiệp vật liệu và y học. 1
13. 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi pH và độ acid tổng của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi số lượng vi khuẩn của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi hàm lượng glucose và cellulose của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. 2
14. Chương 2. TỔNG QUAN 2.1 VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Giới : Bacteria Ngành : Proteobacteria Lớp : Alpharoteobacteria Bộ : Rhodospirillales Họ : Acetobacteraceae Chi : Acetobacter Loài : Acetobacter xylinum 2.1.1 Đặc điểm hình thái Acetobacter xylinum là một loại vi sinh vât Gram âm, hiếu khí được biết đến như Gluconacetobacter xylinum, có đặc tính sinh tổng hợp cellulose. Độ dài của A. xylinum nằm trong khoảng 2–10 µm, với chiều rộng nằm trong phạm vi 0.5–1 µm [6]. A. xylinum thường phát triển ở độ pH từ 5.4-6.3 và nhiệt độ khoảng 28–31C và có thể tích lũy 4.5% acid acetic. Một tế bào A. xylinum có khả năng polymer hóa 200000 phân tử glucose/giây tạo thành β-1,4-glucan và sau ñó được bài tiết vào môi trường xung quanh tạo thành dạng sợi. A. xylinum được tìm thấy trên trái cây, ngũ cốc, trà thảo dược, rau hư, đất, nước, hoa, trái cây và mật ong, nơi xảy ra quá trình lên men đường [10]. Sự tăng trưởng của chúng có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố vật lý và sinh hóa. Các yếu tố vật lý bao gồm pH, nhiệt độ, oxy nồng độ, độ ẩm, áp suất (thủy tĩnh và thẩm thấu) và bức xạ. Mặt khác, các yếu tố sinh hóa bao gồm sự sẵn có của carbon, nitrogen, lưu huỳnh, phosphor, và vitamin [11]. Những vi khuẩn này còn được gọi là vi khuẩn acid acetic có khả năng tạo thành acid từ glucose, rượu ethyl, rượu propyl chứ không phải oxy hóa acid thành carbon dioxide và nước với sự có mặt của oxy. Đặc điểm nổi bật của vi khuẩn này là khả năng trùng hợp glucose thành cellulose chỉ qua quá trình tổng hợp, những vi khuẩn này được hình thành khi có sự kết hợp của 6 đến 8 tế bào và không tạo thành sắc tố nội bào. A. xylinum có khả năng chống lại những thay đổi đột ngột như khi giảm lượng nước hoặc khi có sự hiện diện của các chất độc hại và những sinh vật gây bệnh. Mặc dù thời tiết không thuận lợi nhưng A. xylinum có thế phát triển và sản xuất cellulose trong màng bao. Có 23% tế bào vi khuẩn được bao bọc cellulose tồn tại sau khi được 3
15. xử lý bằng bức xạ UV, loại bỏ các polysaccharide để có thể bảo vệ cellulose khỏi tế bào vi khuẩn dẫn đến việc giảm mạnh tỷ lệ sống của vi khuẩn là 3% [12]. Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi 2.1.2 Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ từ 28–32C. Ở nhiệt độ 37C, hầu hết các tế bào đều bị suy thoái hoàn toàn ngay cả ở môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn nhiều khảo sát khác nhau về các yếu tố như nhiệt độ và pH tối ưu cho vi khuẩn A. xylinum sinh trưởng và tạo màng. Vi khuẩn A. xylinum có thể chịu được pH thấp, do đó có thể bổ sung acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế được sự nhiễm khuẩn lạ. 2.2 QUÁ TRÌNH LÊN MEN CELLULOSE 2.2.1 Thành phần môi trường lên men Nước dừa được sử dụng tốt nhất trong sản xuất biocellulose, vì chứa nhiều amino acid giúp tăng trưởng, phát triển hoạt động của A. xylinum. Để tăng trưởng và hoạt động, A. xylinum đòi hỏi các yếu tố đa lượng và vi lượng. Các yếu tố đa lượng được làm từ carbon và nitrogen. Ngoài carbohydrate và protein, trong nước dừa còn chứa nhiều khoáng chất cần thiết cho A. xylinum như: K, Na, Mg, Ca, P. Loại nước dừa tốt nhất có thể được lấy từ trái dừa già. Mặt khác trong nước dừa non hầu như không chứa khoáng chất cần thiết [13]. 2.2.2 Phương pháp lên men Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A. xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn, rìa mép khuẩn lạc thường gợn sóng có màu trắng, khuẩn lạc lồi lên thuận tiện cho việc dễ tách ra khỏi môi trường. Do vi khuẩn được nuôi cấy ở môi trường lỏng ở điều kiện 4
16. tĩnh nên chúng hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose. Trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành những hạt nhỏ có kích thước không bằng nhau và phân tán trong môi trường tạo thành những đặc tính hình thái khác với cellulose được nuôi cấy ở điều kiện tĩnh [14]. 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng 2.2.3.1 Nguồn carbon Trong số các nguồn carbon, sucrose, glucose và mannitol là những nguồn carbon tối ưu cho sự hình thành cellulose. Sucrose 60 g/L là hàm lượng cơ chất tối ưu cho sinh tổng hợp cellulose trong khi 70 g/L là giá trị tối ưu cho glucose và mannitol với hiệu suất sinh tổng hợp cellulose là 5.0 g/L. Ngoài ra, lactose, galactose, acid citric , tinh bột và maltose cũng cho hiệu suất sinh tổng hợp celllulose là 2.0 g/L [15]. 2.2.3.2 Nguồn nitrogen Nguồn nitrogen có thể được sử dụng trong hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ. Chiết xuất men và casein là những sản phẩm tốt được sử dụng cho sự tăng trưởng và hình thành biocellulose. Những nguồn nitrogen có thể được sử dụng bao gồm casein hydrolysate, peptone, glutamate và ammonium sulfate [15]. Tuy nhiên, ammonium sulfate và ammonium phosphate là những vật liệu phù hợp hơn được sử dụng về mặt kinh tế và năng suất chất lượng của biocellulose [16]. Trong môi trường lên men chứa sucrose, việc bổ sung bột đậu nành hoặc ammonium sulfate thu được ít cellulose hơn khi sử dụng peptone hay casein hydrolysate. Điều này cho thấy rằng nguồn nitrogen cũng đóng góp vào việc cải thiện sự sinh tổng hợp cellulose [15]. 2.2.3.3 pH A. xylinum là một loại vi khuẩn ưa acid có thể phát triển trong môi trường pH thấp. Nó có thể sống ở pH thấp tới 3.5 [17]. Độ pH tối ưu nằm trong khoảng từ 5.4–6.3 [18]. Các giá trị pH thuận lợi nhất cho sự hình thành cellulose của vi khuẩn ở pH 4.0 và 5.0 [10]. Những giá trị pH thúc đẩy tăng trưởng tối ưu và ảnh hưởng đến oxy hấp thu trong quá trình lên men. Hầu hết các nhà nghiên cứu đã sử dụng pH 5.0 [17], [19]. 2.2.3.4 Nhiệt độ Nhiệt độ để A. xylinum phát triển tối ưu từ 28–31C. Ở nhiệt độ dưới 28C vi khuẩn phát triển chậm trong khi ở nhiệt độ trên 31C bắt đầu gây ra thiệt hại cho A. xylinum và có thể dẫn đến tử vong [16]. 5
17. 2.2.3.5 Oxy Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí do đó chúng rất cần oxy trong quá trình sinh trưởng, phát triển. Khi thiếu oxy vi khuẩn này sẽ bị gián đoạn tăng trưởng có thế dẫn đến tử vong. Do đó những thùng chứa được sử dụng cho quá trình lên men cần phải được mở thoáng [16]. 2.3 CELLULOSE VI KHUẨN Cellulose tương đối tinh khiết được sản xuất bởi vi khuẩn A. xylinum. Vi sinh vật này đã được nghiên cứu trong hơn 100 năm. Không giống như cellulose từ bột gỗ, cellulose vi khuẩn không có các polysaccharide tạp khác như lignin và hemicellulose. Ngoài ra, sự phân lập và tinh chế của nó tương đối đơn giản, không cần các quá trình sử dụng nhiều năng lượng hoặc hóa học [20]. Vi khuẩn này đã được sử dụng làm hệ thống mô hình trong việc khám phá các quá trình sinh học [21], [22]. Các vi sinh vật sản xuất polysacchride rất đơn giản và có khả năng tạo nên một polymer từ các nguyên liệu đơn giản có sẵn và các nguồn nguyên liệu thứ cấp. Các sản phẩm từ củ cải đường (mật đường, syrup đường và sucrose), ngô (tinh bột, tinh bột thủy phân, syrup glucose và glucose), và khoai tây (tinh bột thủy phân và tinh bột) có thể được sử dụng để sản xuất các polymer như vậy. Các chất không ăn được như gỗ, chất thải sản xuất dextran, chất thải hóa dầu và các sản phẩm, ethanol, methanol, glycerin và ethylene glycol thường phù hợp [23]. BC có hình thái, cấu trúc, tính chất và ứng dụng khác nhau tùy thuộc vào loại vi sinh vật sinh tổng hợp ra chúng. Trong số các vi khuẩn đã nói ở trên, các vi sinh vật hiệu quả nhất để sản xuất BC là A. xylinum, A. hansenii và A. pasteurianus. Trong số này, A. xylinum đã được sử dụng để sản xuất BC thương mại do năng suất cao. Mặc dù cả cellulose thực vật và BC đều được sản xuất trong tự nhiên, nhưng sự thay đổi đáng kể đã được tìm thấy giữa chúng về độ tinh khiết, tính chất phân tử và đặc tính. So với cellulose thực vật, BC có giá trị module Young cao [24]–[26], khả năng hấp thụ nước cao [27] làm cho nó trở thành vật liệu hữu ích trong nhiều ngành công nghiệp, như thực phẩm, sản xuất giấy và ứng dụng dược phẩm. 6
18. Chương 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT 3.1.1 Dụng cụ - thiết bị Cốc thuỷ tinh Giá ống nghiệm pH kế Pipet Erlen Bình định mức Nhiệt kế Ống nghiệm Bình định mức Ống ly tâm Cốc thuỷ tinh Phễu Micropipet Đũa thuỷ tinh 3.1.2 Hóa chất Chế phẩm enzyme cellulase (Viscozyme®L, Novozymes, Đan Mạch) dạng lỏng có hoạt tính 100 FBG/g. Glucose, peptone, chất chiết men, Na2HPO4, citric acid monohydrate, ammonium sulfate, acid acetic, sodium acetate, nước cất đều đạt chuẩn phân tích. Hình 3.1 Máy quang phổ UV-1800 Hình 3.2 Máy ly tâm 80-2 (Wincom (Shimadzu Schweiz GmbH) Company Ltd.) 7
19. Hình 3.3 Cân phân tích PA (OHAUS Hình 3.4 Tủ sấy UN55 (Memmert GmbH + Instruments Co.,Ltd.) Co.KG) 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.2.1 Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 15 tháng 6 năm 2019 đến ngày 15 tháng 10 năm 2019. 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa phân tích, trường ĐH Nguyễn Tất Thành, 331 Quốc lộ 1A, Phường An Phú Đông, Quận 12, Tp.HCM. 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Quá trình nhân giống vi sinh vật Trong nghiên cứu này, môi trường Hestrin-Schramm (HS) được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum. Thành phần của môi trường HS bao gồm (g/L): glucose (20.0), peptone (5.0), chất chiết men (5.0), Na2HPO4 (2.7), và citric acid monohydrate (1.15) và pH được hiệu chỉnh về giá trị 5.0 [28]. Môi trường được bổ sung thêm ammonium sulfate (4 g/L) để kích thích quá trình tăng sinh khối. Giống vi khuẩn được nhân giống cấp 1 tại cơ sở sản xuất thạch dừa (Sơn Phú, Giồng Trôm, Bến Tre) trên môi trường nước dừa già có bổ sung ammonium sulfate (4 g/L) và diammonium phosphate (1 g/L) để kích thích tăng trưởng trong khoảng thời gian 3 ngày ở nhiệt độ 30C. Giống vi khuẩn hoạt hóa được nhân giống cấp 2 trên môi trường HS sử dụng tỷ lệ giống cấy 10% ở nhiệt độ 30C trong 5 ngày. Sau 5 ngày nhân giống, giống vi khuẩn được cấy vào môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp cellulose ở tỷ lệ giống cấy 10% và 8
20. tiến hành lên men tĩnh ở nhiệt độ 30C trong 15 ngày. Sau mỗi ngày lên men, màng cellulose (nếu hình thành) được tách trực tiếp ra khỏi môi trường và được xử lý trước khi xác định khối lượng. Phần dịch lên men còn lại được sử dụng để phân tích các chỉ tiêu khác bao gồm: pH, độ acid tổng, hàm lượng đường khử, hàm lượng vi khuẩn. 3.3.2 Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum được thực hiện trên môi trường HS như mô tả trong phần trên với nồng độ cơ chất ban đầu là 50, 100 và 200 g/L với tỷ lệ giống cấy 10%. Quá trình lên men tĩnh được thực hiện trong 15 ngày ở nhiệt độ 30C. Sau khi quá trình lên men kết thúc, dịch lên men và lớp màng cellulose tạo thành được phân tích xác định các chỉ tiêu hóa lý. 3.3.3 Bố trí thí nghiệm HS, Giống o 10%, 30 C, 5 ngày Cấy 10% HS HS HS (Glucose50g/L) (Glucose100g/L) (Glucose200g/L) Lên men tĩnh o 30 C, 15 ngày Màng cellulose Dịch lên men Xử lý Vi sinh Đường pH Acid tổng vật khử Xác định khối lượng 9
21. 3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.4.1 Xác định hàm lượng cellulose sinh tổng hợp Đầu tiên, màng cellulose được ngâm trong dung dịch NaOH 2% trong 30 phút ở nhiệt độ 80C để loại bỏ các tạp chất và tế bào bám trên màng. Sau đó, màng được tiếp tục ngâm trong dung dịch acid acetic 2% trong 30 phút ở nhiệt độ 80C để trung hòa lượng base và được rửa bằng nước cất để đưa về pH trung tính. Màng cellulose sau khi rửa sạch được sấy tới khối lượng không đổi ở 105C để xác định khối lượng khô. Hàm lượng cellulose sinh tổng hợp được biểu diễn theo đơn vị g chất khô cellulose trong 1 L dịch lên men [29]. 3.4.2 Xác định hàm lượng vi sinh vật Canh trường (2 mL) được định mức lên 10 mL sử dụng dung dịch đệm acetate 0.1 M (pH 5.0) có chứa cellulase 1% (v/v) và tiến hành quá trình thủy phân trong 2 giờ ở 50C. Sau quá trình thủy phân, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc Whatman No.2 và hàm lượng vi sinh vật được xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm [30]. 3.4.3 Xác định hàm lượng đường khử Hàm lượng đường khử được xác định bằng phương pháp dinitro salicylic acid (DNS) [31]. Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo phức có màu vàng giữa đường khử và thuốc thử DNS có bước sóng hấp thu cực đại ở 540 nm. 2mL dịch lên men sau khi pha loãng được bổ sung 1 mL thuốc thử DNS và đun sôi trong 10 phút. Sau khi làm nguội về nhiệt độ phòng, mẫu được đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm. Hàm lượng đường khử được tính toán dựa vào đường chuẩn glucose và được biểu diễn bằng đơn vị g/L 3.4.4 Xác định độ acid tổng Độ acid tổng của dịch lên men được xác định bằng phương pháp chuẩn độ acid- base sử dụng dung dịch NaOH 0.05 N làm dung dịch chuẩn độ với chỉ thị màu phenolphthalein. Độ acid tổng được biểu diễn theo đơn vị gam acid acetic trong 1 L dịch lên men. 3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Dữ liệu thực nghiệm được phân tích bằng phần mềm SPSS 15 (SPSS Inc. Chicago, U.S.A) sử dụng những kỹ thuật thống kê cơ bản. Phân tích phương sai một nhân tố (one- way ANOVA) được áp dụng để xác định sự khác nhau giữa các chế độ xử lý mẫu và Tukey’s Multiple Range test được áp dụng để xác định sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình ở mức ý nghĩa 5%. Tất cả thí nghiệm và những chỉ tiêu phân tích được lặp lại 3 lần. 10
22. Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 SỰ THAY ĐỔI pH VÀ ĐỘ ACID TỔNG Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn A. xylinum được khảo sát. Nồng độ cơ chất được thay đổi ở các giá trị 50, 100, 200 g/L. Quá trình lên men cellulose được mô tả dựa trên sự thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật trong canh trường lên men và hiệu suất sinh tổng hợp BC. 5 9 4.5 8 4 7 3.5 6 3 5 2.5 pH 4 2 3 1.5 TA (g acetic acid/L) 1 2 0.5 1 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Day pH TA Hình 4.1 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. Sự thay đổi pH và độ acid tổng của dịch lên men trong môi trường HS được biểu thị qua Hình 4.1. Kết quả cho thấy rằng sự thay đổi pH của dịch lên men trong môi trường HS cũng có chiều hướng giảm và giảm mạnh từ ngày 0 đến ngày 7. Do pH giảm nên lượng acid tổng của môi trường tăng. Sự thay đổi của pH và hàm lượng acid tổng trong dịch lên men cellulose với nồng độ cơ chất 100 g/L được thể hiện qua Hình 4.2. Kết quả này cho thấy khi pH giảm thì hàm lượng acid tổng trong canh trường lên men tăng [32]. Theo thời gian, hàm lượng acid tăng do vi khuẩn A. xylinum sử dụng đường tham gia vào quá trình chuyển hóa các ethanol thành acid acetic khiến pH giảm và acid tăng [33]. pH không thay đổi đáng 11
23. kể trong 2 ngày đầu, sau đó giảm đáng kể đến ngày 10 và không thay đổi ở các ngày cuối quá trình lên men. 5 14 4.5 12 4 3.5 10 3 8 2.5 pH 6 2 1.5 4 TA (g acetic acid/L) 1 2 0.5 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Day pH TA Hình 4.2 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L. Kết quả nghiên cứu này cũng được tìm thấy ở báo cáo của Kamide et al. (1990) về ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum trên sinh tổng hợp cellulose. Báo cáo cho thấy rằng pH không thay đổi cho đến khi 64 giờ lên men và giảm tương đối nhanh trong thời gian 1giờ tiếp theo. Sau đó, pH giảm chậm và gần như không đổi cho đến 120 giờ và sau đó cho thấy một sự giảm nhanh chóng và không thay đổi cho tới 150 giờ lên men [34]. Vi khuẩn A. xylinum ưa thích môi trường acid nhẹ để tổng hợp cellulose [35]. Do đó, việc tăng giá trị pH môi trường lên men làm giảm đáng kể quá trình tổng hợp cellulose do sự sinh trưởng của vi khuẩn kém trong điều kiện này cũng như việc ức chế các enzyme tham gia vào quá trình hình thành cellulose [28]. Với môi trường có nồng độ cơ chất 200 g/L, khi thời gian lên men tăng lên, có sự gia tăng tổng lượng acid qua từng ngày, tổng lượng acid tăng dần đều trong 14 đầu lên men và tăng mạnh trong ngày 15. Điều này là do A. xylinum có thể chuyển hóa carbohydrate thành acid acetic bằng cách tổng hợp các sợi cellulose. Quá trình chuyển hóa là hô hấp tế bào, bao gồm quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic và chuyển đổi glucose thành acid gluconic. Acid acetic là sản phẩm phụ của cellulose và có ảnh hưởng đến sự giảm pH trong môi trường nuôi cấy [36]. Sự 12
24. giảm pH có ảnh hưởng lên cả sự sinh tổng hợp cellulose và sự sinh trưởng của vi sinh vật [37]. Hình 4.3 cho thấy pH có xu hướng thay đổi không đáng kể từ ngày 0–4 do vi khuẩn mới thích nghi với môi trường và có xu hướng giảm từ ngày 4–6 do nồng độ acid gluconic tăng. Kết quả là, nồng độ acid gluconic cao có thể thay đổi hoạt động của các quá trình trao đổi chất [38]. Trong khoảng thời gian lên men 10–15 ngày, sự oxi hóa glucose tạo thành gluconate đã dẫn đến giảm năng suất cellulose và giảm pH ức chế sự tăng trưởng tế bào và sản xuất cellulose. Những nghiên cứu khác cũng cho rằng khi pH giảm xuống dưới 4.0, quá trình lên men tĩnh tạo ra cellulose bắt đầu xảy ra [10]. 5 18 4.5 16 4 14 3.5 12 3 10 2.5 pH 8 2 6 1.5 TA (g acetic acid/L) 1 4 0.5 2 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Day pH TA Hình 4.3 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L. Việc điều chỉnh pH môi trường rất quan trọng để thu được hiệu suất thu hồi cellulose cao [39], [40]. Sự oxy hóa glucose bởi enzyme glucose dehydrogenase liên kết màng tế bào tạo nên acid gluconic và làm giảm pH môi trường. Nếu pH môi trường giảm xuống dưới 3.0, quá trình tổng hợp cellulose bị ức chế [14]. 4.2 SỰ THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT Sự thay đổi số lượng vi sinh vật của dịch lên men trong môi trường HS với 50 g/L cơ chất được biểu thị qua Hình 4.4. Kết quả cho thấy rằng số lượng vi sinh vật phát triển liên tục từ ngày 0 đến ngày 7 nhưng từ ngày 8 thì giảm nhẹ và ngày 9 và ngày 10 thì vi sinh vật không tăng nhiều nhưng từ ngày 11 đến ngày 13 thì vi sinh vật bắt đầu giảm. 13
25. 0.12 0.1 0.08 0.06 OD600 0.04 0.02 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Day Hình 4.4 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 0.12 0.1 0.08 0.06 OD600 0.04 0.02 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Day Hình 4.5 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L. 14
26. Sự thay đổi số lượng vi sinh vật của canh trường lên men với nồng độ cơ chất ban đầu 100 g/L theo thời gian được thể hiện qua Hình 4.5. Sự phát triển của vi sinh vật tăng đáng kể trong 9 ngày lên men đầu và bắt đầu có xu hướng suy thoái sau ngày thứ 9. 0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 OD600 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Day Hình 4.6 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L. Ảnh hưởng của thời gian lên men lên số lượng vi sinh vật của canh trường lên men với nồng độ cơ chất ban đầu 200 g/L được biểu thị trong Hình 4.6. So với môi trường có nồng độ cơ chất thấp hơn 200 g/L, số lượng vi sinh vật của môi trường 200 g/L glucose cao hơn đáng kể. 4.3 SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG GLUCOSE VÀ CELLULOSE Ở môi trường HS có nồng độ cơ chất 50 g/L, hàm lượng đường giảm đáng kể bắt đầu từ ngày lên men thứ 3 và duy trì không đổi sau khoảng 8 ngày kên men. Hàm lượng đường sót lại trong dịch lên men rất thấp. Điều đáng lưu ý là đối với môi trường 50 g/L, không có sự phát hiện cellulose trong canh trường lên men. Điều này có thể giải thích là do vi sinh vật chỉ sử dụng glucose để tăng sinh khối. 15
27. 60 50 40 30 Glucose (g/L) 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Day Hình 4.7 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 120 25 100 20 80 15 60 10 BC (gBC DW/L) Glucose (g/L) 40 5 20 0 0 -5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Day Glucose BC Hình 4.8 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) và cellulose (g DW/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L. 16
28. Sự thay đổi hàm lượng đường khử và cellulose của canh trường lên men với nồng độ chất khô ban đầu 100 g/L được thể hiện qua Hình 4.8. Khi hàm lượng đường giảm, tổng hàm lượng vi sinh vật tăng. Hàm lượng đường giảm mạnh từ ngày 0–5 là do vi sinh vật đang ở pha phát triển bắt đầu sử dụng đường. Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự báo cáo của Tsouko et al. (2015) sử dụng vi sinh vật Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973 lên men sinh tổng hợp cellulose từ bã dầu hướng dương [41]. Báo cáo cho thấy khi lượng đường giảm thì hàm lượng vi sinh vật tăng và thời gian lên men tăng thì hàm lượng vi sinh vật tăng. 250 45 40 200 35 30 150 25 20 100 15 BC (gBC DW/L) Glucose (g/L) 10 50 5 0 0 -5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Day Glucose BC Hình 4.9 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) và cellulose (g DW/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L. Trong nghiên cứu này, việc sử dụng môi trường có hàm lượng cơ chất ban đầu trên 10% mới có khả năng thúc đẩy việc cải thiện sinh tổng hợp cellulose. Kết quả này phù hợp với kết quả của tác giả Jagannath et al. (2008) [42]. Tuy nhiên, tác giả Embuscado et al. (1994) lại kết luận rằng nồng độ chất khô trên 5% không có ảnh hưởng lên sự sinh tổng hợp cellulose [20]. Tiền chất của cellulose trong quá trình lên men của A. xylinum là uridine diphosphoglucose nên sự tổng hợp BC có liên quan tới việc sử dụng cơ chất glucose hoặc fructose là nguồn carbon [12]. Cellulose hình thành có hàm lượng chất khô 1% với khả năng ưa nước và giữ nước tốt [43]. 17
29. Lượng vi sinh vật, hàm lượng đường và thời gian lên men là ba yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men cellulose vi khuẩn. Hình 4.9 cho thấy hàm lượng đường và thời gian lên men hàm lượng vi sinh vật. Khi hàm lượng đường giảm dẫn đến tổng hàm lượng vi sinh vật tăng và thời gian lên men tăng thì tổng hàm lượng vi sinh vật tăng. Hàm lượng đường giảm dần từ ngày 0–8 do vi sinh vật đang ở pha tăng trưởng nên nguồn cung cấp carbon ban đầu giảm, vi khuẩn bắt đầu sử dụng acid gluconic trong quá trình trao đổi chất và trong thời gian này độ kết tinh của màng BC tăng dần. Hàm lượng đường từ ngày 0–9 giảm mạnh và từ ngày 9–15 dần ổn định. Theo tác giả Jagannath et al. (2008), không có sự hình thành cellulose trong giai đoạn đầu của quá trình lên men của vi khuẩn A. xylinum. Cellulose chỉ được hình thành sau ngày thứ 3. Trong suốt thời gian đầu, canh trường lên men trở nên đục hơn [42]. So với nuôi cấy tĩnh, quá trình lên men có khuấy đảo cải thiện sự sinh trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, phương pháp lên men này lại hạn chế sự hình thành cellulose và cellulose hình thành dưới dạng hạt chứ không phải dạng lớp như nuôi cấy tĩnh [44]. 18
30. Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn A. xylinum được khảo sát. Nồng độ cơ chất được thay đổi ở các giá trị 50, 100, 200 g/L. Quá trình lên men cellulose được mô tả dựa trên sự thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật trong canh trường lên men và hiệu suất sinh tổng hợp BC. Môi trường HS với nồng độ cơ chất 50 g/L không có sự hình thành cellulose là do lượng đường vi sinh vật sử dụng chỉ tăng sinh khối chứ không sản xuất ra cellulose. Sự giảm pH và tăng hàm lượng acid tổng của môi trường 200 g/L cơ chất cao hơn đáng kể so với môi trường 100 g/L. Điều này thúc đẩy việc sinh khối tổng hợp cellulose. 5.2 KHUYẾN NGHỊ Trong quá trình nghiên cứu, do thời gian thí nghiệm và điều kiện trang thiết bị còn hạn chế nên nghiên cứu vẫn còn nhiều khía cạnh và những khảo sát chưa thực hiện được. Những vấn đề cần được nghiên cứu kỹ hơn trong những nghiên cứu tiếp theo bao gồm: ˗ So sánh các loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose khác; ˗ Tính toán các thông số động học của quá trình lên men; ˗ Khảo sát các chỉ tiêu hiển vi liên quan tới cấu trúc của cellulose thu nhận. 19
31. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] D. N.-S. Hon, “Cellulose: a random walk along its historical path,” Cellulose, vol. 1, no. 1, pp. 1–25, 1994. [2] P. Béguin and J.-P. Aubert, “The biological degradation of cellulose,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 13, no. 1, pp. 25–58, 1994. [3] J. Bi et al., “Morphology and structure characterization of bacterial celluloses produced by different strains in agitated culture,” J. Appl. Microbiol., vol. 117, no. 5, pp. 1305–1311, 2014. [4] D. Klemm, B. Heublein, H. Fink, and A. Bohn, “Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material,” Angew. chemie Int. Ed., vol. 44, no. 22, pp. 3358–3393, 2005. [5] R. M. Brown Jr, “Cellulose structure and biosynthesis: what is in store for the 21st century?,” J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem., vol. 42, no. 3, pp. 487–495, 2004. [6] P. Ross, R. Mayer, and M. Benziman, “Cellulose biosynthesis and function in bacteria.,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 55, no. 1, pp. 35–58, 1991. [7] L. R. Lynd, P. J. Weimer, W. H. Van Zyl, and I. S. Pretorius, “Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 66, no. 3, pp. 506–577, 2002. [8] A. Hirai, M. Tsuji, H. Yamamoto, and F. Horii, “In situ crystallization of bacterial cellulose III. Influences of different polymeric additives on the formation of microfibrils as revealed by transmission electron microscopy,” Cellulose, vol. 5, no. 3, pp. 201–213, 1998. [9] M. Schramm and S. Hestrin, “Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum,” Microbiology, vol. 11, no. 1, pp. 123–129, 1954. [10] P. G. Verschuren, T. D. Cardona, M. J. R. Nout, K. D. De Gooijer, and J. C. Van den Heuvel, “Location and limitation of cellulose production by Acetobacter xylinum established from oxygen profiles,” J. Biosci. Bioeng., vol. 89, no. 5, pp. 414–419, 2000. [11] M. Schramm, Z. Gromet, and S. Hestrin, “Synthesis of cellulose by Acetobacter Xylinum. 3. Substrates and inhibitors,” Biochem. J., vol. 67, no. 4, p. 669, 1957. [12] E. J. Vandamme, S. De Baets, A. Vanbaelen, K. Joris, and P. De Wulf, “Improved production of bacterial cellulose and its application potential,” Polym. Degrad. Stab., vol. 59, no. 1–3, pp. 93–99, 1998. [13] M. Iguchi, S. Yamanaka, and A. Budhiono, “Bacterial cellulose—a masterpiece of nature’s arts,” J. Mater. Sci., vol. 35, no. 2, pp. 261–270, 2000. [14] A. Krystynowicz et al., “Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum,” ACTA Biochim. Pol. Ed., vol. 52,
32. no. 3, p. 691, 2005. [15] K. V Ramana, A. Tomar, and L. Singh, “Effect of various carbon and nitrogen sources on cellulose synthesis by Acetobacter xylinum,” World J. Microbiol. Biotechnol., vol. 16, no. 3, pp. 245–248, 2000. [16] P. R. Chawla, I. B. Bajaj, S. A. Survase, and R. S. Singhal, “Fermentative production of microbial cellulose,” Food Technol. Biotechnol, vol. 47, no. 2, pp. 107–124, 2009. [17] E. P. Çoban and H. Biyik, “Evaluation of different pH and temperatures for bacterial cellulose production in HS (Hestrin-Scharmm) medium and beet molasses medium,” Afr. J. Microbiol. Res, vol. 5, no. 9, pp. 1037–1045, 2011. [18] S. Tantratian, P. Tammarate, W. Krusong, P. Bhattarakosol, and A. Phunsri, “Effect of dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter sp,” J. Sci. Res. Chula Univ, vol. 30, pp. 179–186, 2005. [19] A. Ishikawa, M. Matsuoka, T. Tsuchida, and F. Yoshinaga, “Increase in cellulose production by sulfaguanidine-resistant mutants derived from Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans,” Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 59, no. 12, pp. 2259– 2262, 1995. [20] M. E. Embuscado, J. S. Marks, and J. N. BeMiller, “Bacterial cellulose. I. Factors affecting the production of cellulose by Acetobacter xylinum,” Topics in Catalysis, vol. 8, no. 5. pp. 407–418, 1994. [21] D. P. Delmer and Y. Amor, “Cellulose biosynthesis.,” Plant Cell, vol. 7, no. 7, p. 987, 1995. [22] D. P. Delmer, “Cellulose biosynthesis: exciting times for a difficult field of study,” Annu. Rev. Plant Biol., vol. 50, no. 1, pp. 245–276, 1999. [23] I. I. Shamolina, “Prospects for use of microbial raw material for fabrication of fibre and film materials. Review,” Fibre Chem., vol. 29, no. 1, pp. 1–8, 1997. [24] R. M. Brown, J. H. Willison, and C. L. Richardson, “Cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum: visualization of the site of synthesis and direct measurement of the in vivo process,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 73, no. 12, pp. 4565–4569, 1976. [25] Y.-C. Hsieh, H. Yano, M. Nogi, and S. J. Eichhorn, “An estimation of the Young’s modulus of bacterial cellulose filaments,” Cellulose, vol. 15, no. 4, pp. 507–513, 2008. [26] A. N. Nakagaito, S. Iwamoto, and H. Yano, “Bacterial cellulose: the ultimate nano-scalar cellulose morphology for the production of high-strength composites,” Appl. Phys. A, vol. 80, no. 1, pp. 93–97, 2005. [27] E. Trovatti et al., “Novel bacterial cellulose–acrylic resin nanocomposites,” Compos. Sci. Technol., vol. 70, no. 7, pp. 1148–1153, 2010. [28] J. Ye et al., “Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum ATCC 23767 using tobacco waste extract as culture medium,” Bioresour. Technol., vol. 274, pp. 518–524, 2019.
33. [29] Z. Lu, Y. Zhang, Y. Chi, N. Xu, W. Yao, and B. Sun, “Effects of alcohols on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum 186,” World J. Microbiol. Biotechnol., vol. 27, no. 10, pp. 2281–2285, 2011. [30] L. L. Zhou, D. P. Sun, L. Y. Hu, Y. W. Li, and J. Z. Yang, “Effect of addition of sodium alginate on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum,” J. Ind. Microbiol. Biotechnol., vol. 34, no. 7, p. 483, 2007. [31] G. L. Miller, “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar,” Anal. Chem., vol. 31, no. 3, pp. 426–428, 1959. [32] S. Masaoka, T. Ohe, and N. Sakota, “Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum,” J. Ferment. Bioeng., vol. 75, no. 1, pp. 18–22, 1993. [33] M. Gullo, C. Caggia, L. De Vero, and P. Giudici, “Characterization of acetic acid bacteria in ‘traditional balsamic vinegar,’” Int. J. Food Microbiol., vol. 106, no. 2, pp. 209–212, 2006. [34] K. Kamide, Y. Matsuda, H. Iijima, and K. Okajima, “Effect of culture conditions of acetic acid bacteria on cellulose biosynthesis,” Br. Polym. J., vol. 22, no. 2, pp. 167–171, 1990. [35] J. H. Ha, N. Shah, M. Ul-Islam, T. Khan, and J. K. Park, “Bacterial cellulose production from a single sugar α-linked glucuronic acid-based oligosaccharide,” Process Biochem., vol. 46, no. 9, pp. 1717–1723, 2011. [36] S. Kongruang, “Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum strains from agricultural waste products,” in Biotechnology for Fuels and Chemicals, Springer, 2007, pp. 763–774. [37] A. Seto, Y. Kojima, N. Tonouchi, T. Tsuchida, and F. Yoshinaga, “Screening of bacterial cellulose-producing Acetobacter strains suitable for sucrose as a carbon source,” Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 61, no. 4, pp. 735–736, 1997. [38] J. K. Park, S. H. Hyun, and J. Y. Jung, “Conversion ofG. hansenii PJK into non- cellulose-producing mutants according to the culture condition,” Biotechnol. Bioprocess Eng., vol. 9, no. 5, p. 383, 2004. [39] G. Joseph, G. E. Rowe, A. Margaritis, and W. Wan, “Effects of polyacrylamide- co-acrylic acid on cellulose production by Acetobacter xylinum,” J. Chem. Technol. Biotechnol. Int. Res. Process. Environ. Clean Technol., vol. 78, no. 9, pp. 964–970, 2003. [40] S. T. Park, E. Kim, and Y. M. Kim, “Overproduction of cellulose in Acetobacter xylinum KCCM 10100 defective in GDP-mannosyltransferase,” J. Microbiol. Biotechnol., vol. 16, no. 6, pp. 961–964, 2006. [41] E. Tsouko et al., “Bacterial cellulose production from industrial waste and by- product streams,” Int. J. Mol. Sci., vol. 16, no. 7, pp. 14832–14849, 2015. [42] A. Jagannath, A. Kalaiselvan, S. S. Manjunatha, P. S. Raju, and A. S. Bawa, “The effect of pH, sucrose and ammonium sulphate concentrations on the production of bacterial cellulose (Nata-de-coco) by Acetobacter xylinum,” World J. Microbiol. Biotechnol., vol. 24, no. 11, p. 2593, 2008.
34. [43] S. Yamanaka et al., “The structure and mechanical properties of sheets prepared from bacterial cellulose,” J. Mater. Sci., vol. 24, no. 9, pp. 3141–3145, 1989. [44] R. E. Cannon and S. M. Anderson, “Biogenesis of bacterial cellulose,” Crit. Rev. Microbiol., vol. 17, no. 6, pp. 435–447, 1991 [45]