Luận văn Ảnh hưởng của các hydrocolloid lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum

Nội dung text: Luận văn Ảnh hưởng của các hydrocolloid lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum

1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC HYDROCOLLOID LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Sinh viên thực hiện : Nguyễn Lê Hoàng Bảo Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Tp.HCM, tháng 12 năm 2019
2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC HYDROCOLLOID LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Sinh viên thực hiện : Nguyễn Lê Hoàng Bảo Mã số sinh viên : 1511539234 Lớp : 15DTP1A Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Giáo viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Quốc Duy Tp.HCM, tháng 10 năm 2019
3. TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM & MÔI TRƯỜNG Độc lập - Tự do - Hạnh phúc Tp. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 11 năm 2019 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Nguyễn Lê Hoàng Bảo Mã số sinh viên: 1511539234 Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Lớp: 15DTP1A 1. Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC HYDROCOLLOID LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM 2. Nhiệm vụ luận văn ˗ Khảo sát ảnh hưởng của xanthan gum ở những nồng độ khác nhau lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. ˗ Khảo sát ảnh hưởng của microcrystalline cellulose ở những nồng độ khác nhau lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. ˗ Khảo sát ảnh hưởng của konjac ở những nồng độ khác nhau lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. 3. Ngày giao nhiệm vụ luận văn: 15/6/2019 4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ luận văn: 15/11/2019 5. Người hướng dẫn: Họ và tên Học hàm, học vị Đơn vị Phần hướng dẫn Nguyễn Quốc Duy Thạc sĩ BM CNTP 100% Nội dung và yêu cầu của luận văn đã được thông qua bộ môn. Trưởng Bộ môn Người hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) ThS. Nguyễn Thị Vân Linh ThS. Nguyễn Quốc Duy
4. LỜI CẢM ƠN Để có được thành công như ngày hôm nay, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, gia đình và bạn bè. Trước hết, tôi xin cảm ơn giáo viên hướng dẫn của tôi, thầy Nguyễn Quốc Duy về những hướng dẫn và lời khuyên có giá trị. Tôi cảm thấy có động lực hơn trong suốt ba tháng làm thí nghiệm. Cô đã truyền cảm hứng cho tôi rất nhiều để hoàn thành dự án này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Kỹ thuật Thực phẩm và Môi trường đã cung cấp cho tôi những thông tin, hướng đi và nền tảng kiến thức cần thiết cho tôi đạt được những mục đích học tập của mình. Tôi muốn cảm ơn các anh chị trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ tôi trong khoảng thời gian qua. Nếu không có sự hiểu biết của anh chị về các thiết bị thì việc hoàn thành dự án của tôi sẽ rất khó khăn. Cuối cùng, tôi dành một sự cảm ơn đến gia đình, bạn bè cho một tình yêu thương và giúp đỡ ấy. Tôi xin kính chúc Quý thầy cô Khoa Kỹ thuật Thực phẩm và Môi trường và thầy Nguyễn Quốc Duy dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục sứ mệnh trồng người cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. iv
5. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả của đề tài “Ảnh hưởng của các hydrocolloid lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi đã thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Quốc Duy. Các số liệu và kết quả được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, không sao chép của bất cứ ai, và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học của nhóm nghiên cứu nào khác cho đến thời điểm hiện tại. Nếu không đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình và chấp nhận những hình thức xử lý theo đúng quy định. Tp.HCM, ngày 25 tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn (Ký và ghi rõ họ tên) Nguyễn Lê Hoàng Bảo v
6. TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của các hydrocolloid lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum được khảo sát. Hiệu quả của quá trình lên men cellulose được mô tả dựa trên sự thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật trong canh trường lên men, hiệu suất sinh tổng hợp cellulose và bề dày của lớp cellulose hình thành. Lượng đường ban đầu 50g/l của môi trường HS giảm mạnh từ ngày 0 (44.862) đến ngày 7 (8.078) và những ngày sau bắt đầu giảm từ từ cho đến khi môi trường cạn kiệt cơ chất. Việc không hình thành được cellulose là do vi sinh vật chỉ sử dụng đường để tăng sinh khối. KJ 0.2% đạt hiệu quả tốt nhất về khối lượng BC (6.97 gDW/L) và độ dày BC (3.54mm). XG ở các nồng độ 0.1%,0.2% và 0.3% thu được sự ổn định về khối lượng cellulose (4.96 gDW/L - 6.52gDW/L) và độ dày cellulose (2.54mm-2.67mm) khá tương đồng nhau MCC ở các nồng độ luôn ở mức hiệu quả thấp nhất. vi
7. MỤC LỤC NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP iii LỜI CẢM ƠN iv LỜI CAM ĐOAN v TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP vi MỤC LỤC vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi Chương 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 TÍNH CẤP THIẾT VÀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2 Chương 2. TỔNG QUAN 3 2.1 VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM 3 2.1.1 Đặc điểm hình thái 3 2.1.2 Đặc điểm sinh lý 4 2.2 QUÁ TRÌNH LÊN MEN CELLULOSE 4 2.2.1 Thành phần môi trường lên men 4 2.2.2 Phương pháp lên men 4 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng 5 2.3 CELLULOSE VI KHUẨN 6 Chương 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7 3.1 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT 7 3.1.1 Dụng cụ - thiết bị 7 3.1.2 Hóa chất 7 vii
8. 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 9 3.2.1 Thời gian nghiên cứu 9 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 9 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9 3.3.1 Quá trình nhân giống vi sinh vật 9 3.3.2 Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose 9 3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 10 3.4.1 Xác định hàm lượng cellulose sinh tổng hợp 10 3.4.2 Xác định hàm lượng vi sinh vật 10 3.4.3 Xác định hàm lượng đường khử 10 3.4.4 Xác định độ acid tổng 10 3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 11 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 12 4.1 QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỔNG HỢP CELLULOSE 12 4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA HYDROCOLLOID LÊN pH VÀ ĐỘ ACID TỔNG 14 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA HYDROCOLLOID LÊN HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG Error! Bookmark not defined. 4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA HYDROCOLLOID LÊN SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT 17 4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA HYDROCOLLOID LÊN TỔNG HỢP CELLULOSE Error! Bookmark not defined. Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 20 5.1 KẾT LUẬN 20 5.2 KHUYẾN NGHỊ 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 viii
9. DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi 4 Hình 3.1 Máy quang phổ UV-1800 (Shimadzu Schweiz GmbH) 7 Hình 3.2 Máy ly tâm 80-2 (Wincom Company Ltd.) 7 Hình 3.3 Cân phân tích PA (OHAUS Instruments Co.,Ltd.) 8 Hình 3.4 Tủ sấy UN55 (Memmert GmbH + Co.KG) 8 Hình 4.1 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 12 Hình 4.2 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 13 Hình 4.3 Sự thay đổi hàm lượng glucose của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 14 Hình 4.4 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên pH của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 15 Hình 4.5 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên độ acid tổng của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 15 Hình 4.6 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên hàm lượng đường của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 16 Hình 4.7 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên hàm lượng đường của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 17 Hình 4.8 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên khối lượng cellulose sinh tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 18 ix
10. Hình 4.9 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên khối lượng cellulose sinh tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 18 x
11. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt BC Bacterial cellulose Cellulose vi khuẩn BC_W Width of bacterial cellulose layer Chiều dày lớp cellulose HS Hestrin-Schramm medium Môi trường Hestrin-Schramm TA Total acidity Độ acid tổng DW On a dry weight Theo chất khô XG Xanthan gum Xanthan gum MCC Microcrystalline cellulose Cellulose vi tinh thể KJ Konjac Konjac xi
12. Chương 1. MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT VÀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Cellulose là đại phân tử phong phú nhất trên trái đất và hầu hết cellulose được sản xuất bởi thực vật. Cellulose bao gồm các homopolymer của -1,4-glucose. Mức độ trùng hợp của cellulose thay đổi từ 100–15000 đơn vị glucose với sự kết tinh của các chuỗi tuyến tính dài để tạo thành các vi sợi của một thực thể tinh thể duy nhất [1]. Khi cellulose được xử lý bằng acid đậm đặc ở nhiệt độ cao thì cấu trúc của nó sẽ bị phân hủy thành các đơn vị glucose [2]. Cellulose là thành phần cấu trúc chính tạo nên thành tế bào của hầu hết các loại thực vật và nó chủ yếu được lấy từ các nguồn thực vật từ sợi lông, gỗ có chứa khoảng 40-90% là cellulose. Cellulose có giá trị thương mại trong sản xuất giấy, sợi nano cellulose [3], [4]. Ngoài thực vật, cellulose cũng được tìm thấy trong nhiều vi sinh vật như nấm, vi khuẩn và tảo. Báo cáo đầu tiên về cellulose được sản xuất từ vi khuẩn (bacterial cellulose – BC), đặc biệt từ A. xylinum, được công bố vào năm 1996 [5]. Các nghiên cứu gần đây đã tiết lộ rằng BC có thể được sản xuất bởi các vi khuẩn, bao gồm cả các loại vi khuẩn Gram âm như Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas, Salmonella, Alcaligenes, cũng như vi khuẩn Gram dương như Sarcina ventriculi. Mặc dù quá trình hình thành cellulose của A. xylinum đã được nghiên cứu khá nhiều trong các nghiên cứu trước đó, hầu hết các nghiên cứu đã giải quyết việc làm sáng tỏ quá trình sinh tổng hợp cellulose, và hầu hết các chủng được nghiên cứu cho đến nay chỉ tạo ra một lượng cellulose nhỏ [6]–[8]. Hơn nữa, một môi trường tiêu chuẩn được sử dụng để canh tác các sinh vật sản xuất vi khuẩn như môi trường Hestrin-Schramm rất tốn kém và đòi hỏi nhiều nguồn bổ sung dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy [9]. Để tăng hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A. xylinum, nhiều nghiên cứu được thực hiện bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy các phụ gia tạo cấu trúc như xanthan, alginate, carboxymethyl cellulose. Nghiên cứu này được thực hiện để đánh giá hiệu quả của một số hydrocolloid lên việc hỗ trợ sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu nguồn sinh tổng hợp cellulose từ vi sinh vật với nhiều ưu điểm so với cellulose từ thực vật ứng dụng trong công nghiệp vật liệu và y học. 1
13. 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Khảo sát ảnh hưởng của các loại hydrocolloid khác nhau lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát ảnh hưởng của xanthan gum ở những nồng độ khác nhau lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Khảo sát ảnh hưởng của microcrystalline cellulose ở những nồng độ khác nhau lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Khảo sát ảnh hưởng của konjac ở những nồng độ khác nhau lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. 2
14. Chương 2. TỔNG QUAN 2.1 VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Giới : Bacteria Ngành : Proteobacteria Lớp : Alpharoteobacteria Bộ : Rhodospirillales Họ : Acetobacteraceae Chi : Acetobacter Loài : Acetobacter xylinum 2.1.1 Đặc điểm hình thái Acetobacter xylinum là một loại vi sinh vât Gram âm, hiếu khí được biết đến như Gluconacetobacter xylinum, có đặc tính sinh tổng hợp cellulose. Độ dài của A. xylinum nằm trong khoảng 2–10 µm, với chiều rộng nằm trong phạm vi 0.5–1 µm [6]. A. xylinum thường phát triển ở độ pH từ 5.4-6.3 và nhiệt độ khoảng 28–31C và có thể tích lũy 4.5% acid acetic. Một tế bào A. xylinum có khả năng polymer hóa 200000 phân tử glucose/giây tạo thành β-1,4-glucan và sau ñó được bài tiết vào môi trường xung quanh tạo thành dạng sợi. A. xylinum được tìm thấy trên trái cây, ngũ cốc, trà thảo dược, rau hư, đất, nước, hoa, trái cây và mật ong, nơi xảy ra quá trình lên men đường [10]. Sự tăng trưởng của chúng có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố vật lý và sinh hóa. Các yếu tố vật lý bao gồm pH, nhiệt độ, oxy nồng độ, độ ẩm, áp suất (thủy tĩnh và thẩm thấu) và bức xạ. Mặt khác, các yếu tố sinh hóa bao gồm sự sẵn có của carbon, nitrogen, lưu huỳnh, phosphor, và vitamin [11]. Những vi khuẩn này còn được gọi là vi khuẩn acid acetic có khả năng tạo thành acid từ glucose, rượu ethyl, rượu propyl chứ không phải oxy hóa acid thành carbon dioxide và nước với sự có mặt của oxy. Đặc điểm nổi bật của vi khuẩn này là khả năng trùng hợp glucose thành cellulose chỉ qua quá trình tổng hợp, những vi khuẩn này được hình thành khi có sự kết hợp của 6 đến 8 tế bào và không tạo thành sắc tố nội bào. A. xylinum có khả năng chống lại những thay đổi đột ngột như khi giảm lượng nước hoặc khi có sự hiện diện của các chất độc hại và những sinh vật gây bệnh. Mặc dù thời tiết không thuận lợi nhưng A. xylinum có thế phát triển và sản xuất cellulose trong màng bao. Có 23% tế bào vi khuẩn được bao bọc cellulose tồn tại sau khi được 3
15. xử lý bằng bức xạ UV, loại bỏ các polysaccharide để có thể bảo vệ cellulose khỏi tế bào vi khuẩn dẫn đến việc giảm mạnh tỷ lệ sống của vi khuẩn là 3% [12]. Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi 2.1.2 Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ từ 28–32C. Ở nhiệt độ 37C, hầu hết các tế bào đều bị suy thoái hoàn toàn ngay cả ở môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn nhiều khảo sát khác nhau về các yếu tố như nhiệt độ và pH tối ưu cho vi khuẩn A. xylinum sinh trưởng và tạo màng. Vi khuẩn A. xylinum có thể chịu được pH thấp, do đó có thể bổ sung acid acetic vào môi trường để nuôi cấy sẽ hạn chế được sự nhiễm khuẩn lạ. 2.2 QUÁ TRÌNH LÊN MEN CELLULOSE 2.2.1 Thành phần môi trường lên men Nước dừa được sử dụng tốt nhất trong sản xuất biocellulose, vì chứa nhiều amino acid giúp tăng trưởng, phát triển hoạt động của A. xylinum. Để tăng trưởng và hoạt động, A. xylinum đòi hỏi các yếu tố đa lượng và vi lượng. Các yếu tố đa lượng được làm từ carbon và nitrogen. Ngoài carbohydrate và protein, trong nước dừa còn chứa nhiều khoáng chất cần thiết cho A. xylinum như: K, Na, Mg, Ca, P. Loại nước dừa tốt nhất có thể được lấy từ trái dừa già. Mặt khác trong nước dừa non hầu như không chứa khoáng chất cần thiết [13]. 2.2.2 Phương pháp lên men Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A. xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn, rìa mép khuẩn lạc thường gợn sóng có màu trắng, khuẩn lạc lồi lên thuận tiện cho việc dễ tách ra khỏi môi trường. Do vi khuẩn được nuôi cấy ở môi trường lỏng ở điều kiện 4
16. tĩnh nên chúng hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose. Trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành những hạt nhỏ có kích thước không bằng nhau và phân tán trong môi trường tạo thành những đặc tính hình thái khác với cellulose được nuôi cấy ở điều kiện tĩnh [14]. 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng 2.2.3.1 Nguồn carbon Trong số các nguồn carbon, sucrose, glucose và mannitol là những nguồn carbon tối ưu cho sự hình thành cellulose. Sucrose 60 g/L là hàm lượng cơ chất tối ưu cho sinh tổng hợp cellulose trong khi 70 g/L là giá trị tối ưu cho glucose và mannitol với hiệu suất sinh tổng hợp cellulose là 5.0 g/L. Ngoài ra, lactose, galactose, acid citric , tinh bột và maltose cũng cho hiệu suất sinh tổng hợp celllulose là 2.0 g/L [15]. 2.2.3.2 Nguồn nitrogen Nguồn nitrogen có thể được sử dụng trong hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ. Chiết xuất men và casein là những sản phẩm tốt được sử dụng cho sự tăng trưởng và hình thành biocellulose. Những nguồn nitrogen có thể được sử dụng bao gồm casein hydrolysate, peptone, glutamate và ammonium sulfate [15]. Tuy nhiên, ammonium sulfate và ammonium phosphate là những vật liệu phù hợp hơn được sử dụng về mặt kinh tế và năng suất chất lượng của biocellulose [16]. Trong môi trường lên men chứa sucrose, việc bổ sung bột đậu nành hoặc ammonium sulfate thu được ít cellulose hơn khi sử dụng peptone hay casein hydrolysate. Điều này cho thấy rằng nguồn nitrogen cũng đóng góp vào việc cải thiện sự sinh tổng hợp cellulose [15]. 2.2.3.3 pH A. xylinum là một loại vi khuẩn ưa acid có thể phát triển trong môi trường pH thấp. Nó có thể sống ở pH thấp tới 3.5 [17]. Độ pH tối ưu nằm trong khoảng từ 5.4–6.3 [18]. Các giá trị pH thuận lợi nhất cho sự hình thành cellulose của vi khuẩn ở pH 4.0 và 5.0 [10]. Những giá trị pH thúc đẩy tăng trưởng tối ưu và ảnh hưởng đến oxy hấp thu trong quá trình lên men. Hầu hết các nhà nghiên cứu đã sử dụng pH 5.0 [17], [19]. 2.2.3.4 Nhiệt độ Nhiệt độ để A. xylinum phát triển tối ưu từ 28–31C. Ở nhiệt độ dưới 28C vi khuẩn phát triển chậm trong khi ở nhiệt độ trên 31C bắt đầu gây ra thiệt hại cho A. xylinum và có thể dẫn đến tử vong [16]. 5
17. 2.2.3.5 Oxy Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí do đó chúng rất cần oxy trong quá trình sinh trưởng, phát triển. Khi thiếu oxy vi khuẩn này sẽ bị gián đoạn tăng trưởng có thế dẫn đến tử vong. Do đó những thùng chứa được sử dụng cho quá trình lên men cần phải được mở thoáng [16]. 2.3 CELLULOSE VI KHUẨN Cellulose tương đối tinh khiết được sản xuất bởi vi khuẩn A. xylinum. Vi sinh vật này đã được nghiên cứu trong hơn 100 năm. Không giống như cellulose từ bột gỗ, cellulose vi khuẩn không có các polysaccharide tạp khác như lignin và hemicellulose. Ngoài ra, sự phân lập và tinh chế của nó tương đối đơn giản, không cần các quá trình sử dụng nhiều năng lượng hoặc hóa học [20]. Vi khuẩn này đã được sử dụng làm hệ thống mô hình trong việc khám phá các quá trình sinh học [21], [22]. Các vi sinh vật sản xuất polysacchride rất đơn giản và có khả năng tạo nên một polymer từ các nguyên liệu đơn giản có sẵn và các nguồn nguyên liệu thứ cấp. Các sản phẩm từ củ cải đường (mật đường, syrup đường và sucrose), ngô (tinh bột, tinh bột thủy phân, syrup glucose và glucose), và khoai tây (tinh bột thủy phân và tinh bột) có thể được sử dụng để sản xuất các polymer như vậy. Các chất không ăn được như gỗ, chất thải sản xuất dextran, chất thải hóa dầu và các sản phẩm, ethanol, methanol, glycerin và ethylene glycol thường phù hợp [23]. BC có hình thái, cấu trúc, tính chất và ứng dụng khác nhau tùy thuộc vào loại vi sinh vật sinh tổng hợp ra chúng. Trong số các vi khuẩn đã nói ở trên, các nguồn hiệu quả nhất để sản xuất BC là A. xylinum, A. hansenii và A. pasteurianus. Trong số này, A. xylinum đã được sử dụng để sản xuất BC thương mại do năng suất cao. Mặc dù cả cellulose thực vật và BC đều được sản xuất trong tự nhiên, nhưng sự thay đổi đáng kể đã được tìm thấy giữa chúng về độ tinh khiết, tính chất phân tử và đặc tính. So với cellulose thực vật, BC có giá trị module Young cao [24]–[26], khả năng hấp thụ nước cao [27] làm cho nó trở thành vật liệu hữu ích trong nhiều ngành công nghiệp, như thực phẩm, sản xuất giấy và ứng dụng dược phẩm. 6
18. Chương 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT 3.1.1 Dụng cụ - thiết bị Cốc thuỷ tinh Giá ống nghiệm pH kế Pipet Erlen Bình định mức Nhiệt kế Ống nghiệm Bình định mức Ống ly tâm Cốc thuỷ tinh Phễu Micropipet Đũa thuỷ tinh 3.1.2 Hóa chất Chế phẩm enzyme cellulase (Viscozyme®L, Novozymes, Đan Mạch) dạng lỏng có hoạt tính 100 FBG/g. Glucose, peptone, chất chiết men, Na2HPO4, citric acid monohydrate, ammonium sulfate, acid acetic, sodium acetate, nước cất đều đạt chuẩn phân tích. Hình 3.1 Máy quang phổ UV-1800 Hình 3.2 Máy ly tâm 80-2 (Wincom (Shimadzu Schweiz GmbH) Company Ltd.) 7
19. Hình 3.3 Cân phân tích PA (OHAUS Instruments Co.,Ltd.) Hình 3.4 Tủ sấy UN55 (Memmert GmbH + Co.KG) 8
20. 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.2.1 Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 15 tháng 6 năm 2019 đến ngày 15 tháng 10 năm 2019. 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa phân tích, trường ĐH Nguyễn Tất Thành, 331 Quốc lộ 1A, Phường An Phú Đông, Quận 12, Tp.HCM. 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Quá trình nhân giống vi sinh vật Trong nghiên cứu này, môi trường Hestrin-Schramm (HS) được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum. Thành phần của môi trường HS bao gồm (g/L): glucose (20.0), peptone (5.0), chất chiết men (5.0), Na2HPO4 (2.7), and citric acid monohydrate (1.15) và pH được hiệu chỉnh về giá trị 5.0 [28]. Môi trường được bổ sung thêm ammonium sulfate (4 g/L) để kích thích quá trình tăng sinh khối. Giống vi khuẩn được nhân giống cấp 1 tại cơ sở sản xuất thạch dừa (Sơn Phú, Giồng Trôm, Bến Tre) trên môi trường nước dừa già có bổ sung ammonium sulfate (4 g/L) và diammonium phosphate (1 g/L) để kích thích tăng trưởng trong khoảng thời gian 3 ngày ở nhiệt độ 30C. Giống vi khuẩn hoạt hóa được nhân giống cấp 2 trên môi trường HS sử dụng tỷ lệ giống cấy 10% ở nhiệt độ 30C trong 5 ngày. Sau 5 ngày nhân giống, giống vi khuẩn được cấy vào môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp cellulose ở tỷ lệ giống cấy 10% và tiến hành lên men tĩnh ở nhiệt độ 30C trong 15 ngày. Sau mỗi ngày lên men, màng cellulose (nếu hình thành) được tách trực tiếp ra khỏi môi trường và được xử lý trước khi xác định khối lượng. Phần dịch lên men còn lại được sử dụng để phân tích các chỉ tiêu khác bao gồm: pH, độ acid tổng, hàm lượng đường khử, hàm lượng vi khuẩn. 3.3.2 Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum được thực hiện trên môi trường HS như mô tả trong phần trên với nồng độ cơ chất ban đầu là 50 g/L với tỷ lệ giống cấy 10%. Ngoài ra, 3 loại hydrocolloid khác nhau được bổ sung vào môi trường bao gồm xanthan gum (XG), microcrytalline cellulose (MCC) và konjac (KJ) với hàm lượng 0.1, 0.2 và 0.3%. Quá trình lên men tĩnh được thực hiện trong 13 9
21. ngày ở nhiệt độ 30C. Sau khi quá trình lên men kết thúc, dịch lên men và lớp màng cellulose tạo thành được phân tích xác định các chỉ tiêu hóa lý. 3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.4.1 Xác định hàm lượng cellulose sinh tổng hợp Đầu tiên, màng cellulose được ngâm trong dung dịch NaOH 2% trong 30 phút ở nhiệt độ 80C để loại bỏ các tạp chất và tế bào bám trên màng. Sau đó, màng được tiếp tục ngâm trong dung dịch acid acetic 2% trong 30 phút ở nhiệt độ 80C để trung hòa lượng base và được rửa bằng nước cất để đưa về pH trung tính. Màng cellulose sau khi rửa sạch được sấy tới khối lượng không đổi ở 105C để xác định khối lượng khô. Hàm lượng cellulose sinh tổng hợp được biểu diễn theo đơn vị g chất khô cellulose trong 1 L dịch lên men [29]. 3.4.2 Xác định hàm lượng vi sinh vật Canh trường (2 mL) được định mức lên 10 mL sử dụng dung dịch đệm acetate 0.1 M (pH 5.0) có chứa cellulase 1% (v/v) và tiến hành quá trình thủy phân trong 2 h ở 50C. Sau quá trình thủy phân, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc Whatman No.2 và hàm lượng vi sinh vật được xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm [30]. 3.4.3 Xác định hàm lượng đường khử Hàm lượng đường khử được xác định bằng phương pháp dinitro salicylic acid (DNS) [31]. Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo phức có màu vàng giữa đường khử và thuốc thử DNS có bước sóng hấp thu cực đại ở 540 nm. 2 mL dịch lên men sau khi pha loãng được bổ sung 1 mL thuốc thử DNS và đun sôi trong 10 phút. Sau khi làm nguội về nhiệt độ phòng, mẫu được đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm. Hàm lượng đường khử được tính toán dựa vào đường chuẩn glucose và được biểu diễn bằng đơn vị g/L . 3.4.4 Xác định độ acid tổng Độ acid tổng của dịch lên men được xác định bằng phương pháp chuẩn độ acid- base sử dụng dung dịch NaOH 0.05 N làm dung dịch chuẩn độ với chỉ thị màu phenolphthalein. Độ acid tổng được biểu diễn theo đơn vị gam acid acetic trong 1 L dịch lên men. 10
22. 3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Dữ liệu thực nghiệm được phân tích bằng phần mềm SPSS 15 (SPSS Inc. Chicago, U.S.A) sử dụng những kỹ thuật thống kê cơ bản. Phân tích phương sai một nhân tố (one-way ANOVA) được áp dụng để xác định sự khác nhau giữa các chế độ xử lý mẫu và Tukey’s Multiple Range test được áp dụng để xác định sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình ở mức ý nghĩa 5%. Tất cả thí nghiệm và những chỉ tiêu phân tích được lặp lại 3 lần. 11
23. Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỔNG HỢP CELLULOSE Trong môi trường không bổ sung các hydrocolloid, quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum được mô tả như sau. Các tiêu chí sử dụng trong quá trình khảo sát là pH, độ acid tổng, hàm lượng đường khử, số lượng vi sinh vật. 5 9 4.5 8 4 7 3.5 6 3 5 2.5 pH 4 2 3 1.5 TA acetic(g acid/L) 1 2 0.5 1 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Day pH TA Hình 4.1 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. Sự thay đổi PH và độ acid tổng của dịch lên men trong môi trường HS được biểu thị qua Hình 4.1. Kết quả cho thấy rằng sự thay đổi PH và độ acid tổng của dịch lên men trong môi trường HS cũng có chiều hướng giảm và giảm mạnh từ ngày 0 đến ngày 7 và do PH giảm nên dẫn tới lượng axit tổng của môi trường tăng. Những nghiên cứu khác cũng cho rằng khi pH giảm xuống dưới 4.0, quá trình lên men tĩnh tạo ra cellulose bắt đầu xảy ra [10]. Theo tác giả Jagannath et al. (2008), không có sự hình thành cellulose trong giai đoạn đầu của quá trình lên men của vi khuẩn A. xylinum. Cellulose chỉ được hình thành sau ngày thứ 3. Trong suốt thời gian đầu, canh trường lên men trở nên đục hơn [34]. Vi khuẩn A. xylinum ưa thích môi trường acid nhẹ để tổng hợp cellulose [37]. Do đó, việc tăng giá trị pH môi trường lên men làm giảm đáng kể quá trình tổng hợp 12
24. cellulose do sự sinh trưởng của vi khuẩn kém trong điều kiện này cũng như việc ức chế các enzyme tham gia vào quá trình hình thành cellulose [28]. Việc điều chỉnh pH môi trường rất quan trọng để thu được hiệu suất thu hồi cellulose cao [38], [39]. Sự oxy hóa glucose bởi enzyme glucose dehydrogenase liên kết màng tế bào tạo nên acid gluconic và làm giảm pH môi trường. Nếu pH môi trường giảm xuống dưới 3.0, quá trình tổng hợp cellulose bị ức chế [14]. 0.12 0.1 0.08 0.06 OD600 0.04 0.02 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Day Hình 4.2 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. Sự thay đổi số lượng vi sinh vật của dịch lên men trong môi trường HS được biểu thị qua Hình 4.2. Kết quả cho thấy rằng số lượng vi sinh vật phát triển liên tục từ ngày 0 đến ngày 7 nhưng từ ngày 8 thì giảm nhẹ và ngày 9 và ngày 10 thì vi sinh vật không tăng nhiều nhưng từ ngày 11 đến ngày 13 thì vi sinh vật bắt đầu giảm. Sự thay đổi hàm lượng đường của dịch lên men trong môi trường HS được biểu thị qua hình 4.3. Kết quả cho thấy rằng lượng đường giảm mạnh từ ngày 0 đến ngày 7 và bắt đầu giảm từ từ cho đến hết. Việc không hình thành được cellulose là do vi sinh vật chỉ sử dụng đường để tăng sinh khối. Trong nghiên cứu này, việc sử dụng môi trường có hàm lượng cơ chất ban đầu trên 10% mới có khả năng thúc đẩy việc cải thiện sinh tổng hợp cellulose. Kết quả này phù hợp với kết quả của tác giả Jagannath et al. (2008) [34]. Tuy nhiên, tác giả 13
25. Embuscado et al. (1994) lại kết luận rằng nồng độ chất khô trên 5% không có ảnh hưởng lên sự sinh tổng hợp cellulose [20]. Tiền chất của cellulose trong quá trình lên men của A. xylinum là uridine diphosphoglucose nên sự tổng hợp BC có liên quan tới việc sử dụng cơ chất glucose hoặc fructose là nguồn carbon [12]. Cellulose hình thành có hàm lượng chất khô 1% với khả năng ưa nước và giữ nước tốt [36]. 60 50 40 30 Glucose Glucose (g/L) 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Day Hình 4.3 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA HYDROCOLLOID LÊN QUÁ TRÌNH LÊN MEN Khi bổ sung hydrocolloid vào môi trường lên men, ảnh hưởng của loại hydrocolloid và nồng độ của chúng lên quá trình lên men cellulose được mô tả sau đây. Các hydrocolloid sử dụng bao gồm xanthan gum (XG), microcrystalline cellulose (MCC) và konjac (KJ) với hàm lượng 0.1, 0.2 và 0.3%. 4.2.1 pH và độ acid tổng 14
26. 4.0 3.5 a e 3.0 bd de bd b c b bc bc 2.5 2.0 pH 1.5 1.0 0.5 0.0 Hình 4.4 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên pH của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 12 10 e c 8 b b ab b ab ab a d 6 TA acetic(g acid/L) 4 2 0 Hình 4.5 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 15
27. PH khi bổ sung các chất phụ được biểu thị qua hình 4.4. Kết quả cho thấy rằng ở các nồng độ chất phụ gia cho vào không làm thay đổi pH quá nhiều gần như là tương đương nhau. Độ acid tổng của dịch lên men trong môi trường HS có bổ sung phụ gia được biểu thị qua Hình 4.5. Kết quả cho thấy độ acid tổng của dịch lên men trong môi trường HS ở nồng độ KJ 0.3% XG 0.3% thì độ acid đạt mức cao nhất khi so với các nồng độ và phụ gia khác. Các nồng độ còn lại thì độ acid không có sự thay đổi nhiều và khá gần nhau. 4.2.2 Hàm lượng đường 6 c c 5 b b b b b e 4 d 3 Glucose Glucose (g/L) 2 a 1 0 Hình 4.6 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên hàm lượng đường (g/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. Hàm lượng đường của dịch lên men trong môi trường HS được biểu thị qua Hình 4.6. Kết quả cho thấy rằng hàm lượng đường của dịch lên men trong môi trường HS đạt mức cao nhất ở nồng độ XG 0.3% và thấp hơn XG 0.3% là KJ 0.2% với lượng đường cũng gần tương đương, thấp nhất ở nồng độ MCC 0.1%. 16
28. 4.2.3 Số lượng vi sinh vật 0 a 0 c 0 f bf b 0 b OD600 0 dg g d 0 e 0 0 Hình 4.7 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. Hàm lượng vi sinh vật khi bổ sung các chất phụ gia được thể hiện qua Hình 4.7. Kết quả cho thấy hàm lượng vi sinh vật khi được bổ sung XG 0.2% là tốt nhất và có số lượng cao hơn so với XG 0.1% và XG 0.3%. KJ 0.1% và KJ 0.3% thì có hàm lượng vi sinh vật tương đương với XG 0.1% và XG 0.3%. Còn về MCC thì lượng vi sinh vật có nhưng khá thấp. Nên kết luận XG 0.2% là tốt nhất để vi sinh vật phát triển. 4.2.4 Chiều dày lớp cellulose Độ dày của BC khi bổ sung các chất phụ gia được thể hiện qua Hình 4.8. Kết quả này cho thấy độ dày của BC khi bổ sung KJ nồng độ (0.1%, 0.2%, 0.3%) cao hơn hẳn so với việc bổ sung XG và MCC có cùng nồng độ. Và với nồng độ 0.2% của KJ thì đồ dày của BC đạt lớn nhất, còn với nồng độ KJ 0.1% thì độ dày tương đương với XG (0.1%, 0.2%, 0.3%). MCC đạt hiệu quả thấp nhất trong 3 chất phụ gia nhưng cũng góp phần tạo nên độ dày của BC tốt hơn so với việc chỉ sử dụng glucose. So với nuôi cấy tĩnh, quá trình lên enm có khuấy đảo cải thiện sự sinh trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, phương pháp lên men này lại hạn chế sự hình thành cellulose và cellulose hình thành dưới dạng hạt chứ không phải dạng lớp như nuôi cấy tĩnh [35]. 17
29. 4.0 g 3.5 h 3.0 c b b b 2.5 2.0 BC_W(mm) 1.5 f e 1.0 0.5 d a 0.0 Hình 4.8 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên chiều dày lớp cellulose (mm) sinh tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 4.2.5 Khối lượng cellulose 8 h 7 c 6 d i b 5 4 g BC DW/L) (g 3 f f 2 e 1 a 0 Hình 4.9 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên khối lượng cellulose (g DW/L) sinh tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. 18
30. Khối lượng BC khi bổ sung các chất phụ gia được thể hiện qua Hình 4.9. Kết quả cho thấy rằng KJ 0.2% có khối lượng BC cao nhất giống như ở Hình 4.8 cũng cho thấy KJ 0.2% có độ dày BC tốt nhất. Điều này cho thấy rằng khi bổ sung KJ 0.2% thì thạch sẽ dày và nặng hơn so với việc bổ sung các phụ gia khác. Tuy nhiên khối lượng BC chỉ tốt nhất khi bổ sung KJ 0.2% còn ở nồng độ 0.1% và 0.3% thì khối lượng thấp hơn so với XG ở các nồng độ 0.1%, 0.2% và 0.3%. Còn MCC thì hiệu quả khá thấp, khối lượng BC thu được chỉ gần một nửa so với XG và KJ ở cùng nồng độ. Từ những số liệu thu thập được ở trên, có thể kết luận được rằng việc bổ sung XG ở các nồng độ 0.1%,0.2% và 0.3% thu được sự ổn định về khối lượng, vi sinh vật và độ dày khá tương đồng nhau. KJ 0.2% đạt hiệu quả tốt nhất về khối lượng BC và độ dày BC. So với môi trường HS có nồng độ cơ chất 50 g/L, việc chỉ sử dụng glucose khiến các liên kết cellulose không được hình thành việc bổ sung thêm các chất phụ gia như KJ [32], XG và MCC [33] giúp cải thiện hơn về liên kết bề mặt BC giúp tạo ra BC. Sự cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp cellulose khi bổ sung các hydrocolloid được giải thích là do sự tăng độ hòa tan của BC khi có mặt các hydrocolloid này. Các hydrocolloid trong quá trình cellulose hình thành sẽ bám vào bề mặt của các sợi cellulose để cải thiện độ hòa tan cũng như cấu trúc của lớp cellulose. Ngoài ra, quá trình kết tinh của cellulose cũng làm giảm hiệu suất hình thành cellulose nên sự giảm độ kết tinh cũng cải thiện lượng cellulose được hình thành [33]. Việc bổ sung các polymer tan trong nước như agar [40], sodium alginate [30], xanthan [41], polyacrylamide-co-acylic acid [38] và acetan [42] được báo cáo làm giảm lực trượt, tăng lực ma sát của môi trường lên men; từ đó làm tăng tốc độ truyền khối và tăng hiệu suất tổng hợp cellulose. 19
31. Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của các hydrocolloid lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum được khảo sát. Hiệu quả của quá trình lên men cellulose được mô tả dựa trên sự thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật trong canh trường lên men, hiệu suất sinh tổng hợp BC và bề dày của lớp cellulose hình thành. Lượng đường ban đầu 50g/l của môi trường HS giảm mạnh từ ngày 0 (44.862) đến ngày 7 (8.078) và những ngày sau bắt đầu giảm từ từ cho đến khi môi trường cạn kiệt cơ chất. Việc không hình thành được cellulose là do vi sinh vật chỉ sử dụng đường để tăng sinh khối. KJ 0.2% đạt hiệu quả tốt nhất về khối lượng BC (6.97 gDW/L) và độ dày BC (3.54mm). XG ở các nồng độ 0.1%,0.2% và 0.3% thu được sự ổn định về khối lượng cellulose (4.96 gDW/L - 6.52gDW/L) và độ dày cellulose (2.54mm-2.67mm) khá tương đồng nhau MCC ở các nồng độ luôn ở mức hiệu quả thấp nhất. 5.2 KHUYẾN NGHỊ Trong quá trình nghiên cứu, do thời gian thí nghiệm và điều kiện trang thiết bị còn hạn chế nên nghiên cứu vẫn còn nhiều khía cạnh và những khảo sát chưa thực hiện được. Những vấn đề cần được nghiên cứu kỹ hơn trong những nghiên cứu tiếp theo bao gồm: ˗ So sánh các loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose khác; ˗ Ảnh hưởng của các hydrocolloid khác lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose; ˗ Khảo sát các chỉ tiêu hiển vi liên quan tới cấu trúc của cellulose thu nhận. 20
32. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] D. N.-S. Hon, “Cellulose: a random walk along its historical path,” Cellulose, vol. 1, no. 1, pp. 1–25, 1994. [2] P. Béguin and J.-P. Aubert, “The biological degradation of cellulose,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 13, no. 1, pp. 25–58, 1994. [3] J. Bi et al., “Morphology and structure characterization of bacterial celluloses produced by different strains in agitated culture,” J. Appl. Microbiol., vol. 117, no. 5, pp. 1305–1311, 2014. [4] D. Klemm, B. Heublein, H. Fink, and A. Bohn, “Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material,” Angew. chemie Int. Ed., vol. 44, no. 22, pp. 3358–3393, 2005. [5] R. M. Brown Jr, “Cellulose structure and biosynthesis: what is in store for the 21st century?,” J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem., vol. 42, no. 3, pp. 487–495, 2004. [6] P. Ross, R. Mayer, and M. Benziman, “Cellulose biosynthesis and function in bacteria.,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 55, no. 1, pp. 35–58, 1991. [7] L. R. Lynd, P. J. Weimer, W. H. Van Zyl, and I. S. Pretorius, “Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 66, no. 3, pp. 506–577, 2002. [8] A. Hirai, M. Tsuji, H. Yamamoto, and F. Horii, “In situ crystallization of bacterial cellulose III. Influences of different polymeric additives on the formation of microfibrils as revealed by transmission electron microscopy,” Cellulose, vol. 5, no. 3, pp. 201–213, 1998. [9] M. Schramm and S. Hestrin, “Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum,” Microbiology, vol. 11, no. 1, pp. 123–129, 1954. [10] P. G. Verschuren, T. D. Cardona, M. J. R. Nout, K. D. De Gooijer, and J. C. Van den Heuvel, “Location and limitation of cellulose production by Acetobacter xylinum established from oxygen profiles,” J. Biosci. Bioeng., vol. 89, no. 5, pp. 414–419, 2000. [11] M. Schramm, Z. Gromet, and S. Hestrin, “Synthesis of cellulose by Acetobacter Xylinum. 3. Substrates and inhibitors,” Biochem. J., vol. 67, no. 4, p. 669, 1957. [12] E. J. Vandamme, S. De Baets, A. Vanbaelen, K. Joris, and P. De Wulf, “Improved production of bacterial cellulose and its application potential,” Polym. Degrad. Stab., vol. 59, no. 1–3, pp. 93–99, 1998. [13] M. Iguchi, S. Yamanaka, and A. Budhiono, “Bacterial cellulose—a masterpiece of nature’s arts,” J. Mater. Sci., vol. 35, no. 2, pp. 261–270, 2000. [14] A. Krystynowicz et al., “Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum,” ACTA Biochim. Pol. Ed., vol. 52, 21
33. no. 3, p. 691, 2005. [15] K. V Ramana, A. Tomar, and L. Singh, “Effect of various carbon and nitrogen sources on cellulose synthesis by Acetobacter xylinum,” World J. Microbiol. Biotechnol., vol. 16, no. 3, pp. 245–248, 2000. [16] P. R. Chawla, I. B. Bajaj, S. A. Survase, and R. S. Singhal, “Fermentative production of microbial cellulose,” Food Technol. Biotechnol, vol. 47, no. 2, pp. 107–124, 2009. [17] E. P. Çoban and H. Biyik, “Evaluation of different pH and temperatures for bacterial cellulose production in HS (Hestrin-Scharmm) medium and beet molasses medium,” Afr. J. Microbiol. Res, vol. 5, no. 9, pp. 1037–1045, 2011. [18] S. Tantratian, P. Tammarate, W. Krusong, P. Bhattarakosol, and A. Phunsri, “Effect of dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter sp,” J. Sci. Res. Chula Univ, vol. 30, pp. 179–186, 2005. [19] A. Ishikawa, M. Matsuoka, T. Tsuchida, and F. Yoshinaga, “Increase in cellulose production by sulfaguanidine-resistant mutants derived from Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans,” Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 59, no. 12, pp. 2259–2262, 1995. [20] M. E. Embuscado, J. S. Marks, and J. N. BeMiller, “Bacterial cellulose. I. Factors affecting the production of cellulose by Acetobacter xylinum,” Topics in Catalysis, vol. 8, no. 5. pp. 407–418, 1994. [21] D. P. Delmer and Y. Amor, “Cellulose biosynthesis.,” Plant Cell, vol. 7, no. 7, p. 987, 1995. [22] D. P. Delmer, “Cellulose biosynthesis: exciting times for a difficult field of study,” Annu. Rev. Plant Biol., vol. 50, no. 1, pp. 245–276, 1999. [23] I. I. Shamolina, “Prospects for use of microbial raw material for fabrication of fibre and film materials. Review,” Fibre Chem., vol. 29, no. 1, pp. 1–8, 1997. [24] R. M. Brown, J. H. Willison, and C. L. Richardson, “Cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum: visualization of the site of synthesis and direct measurement of the in vivo process,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 73, no. 12, pp. 4565–4569, 1976. [25] Y.-C. Hsieh, H. Yano, M. Nogi, and S. J. Eichhorn, “An estimation of the Young’s modulus of bacterial cellulose filaments,” Cellulose, vol. 15, no. 4, pp. 507–513, 2008. [26] A. N. Nakagaito, S. Iwamoto, and H. Yano, “Bacterial cellulose: the ultimate nano-scalar cellulose morphology for the production of high-strength composites,” Appl. Phys. A, vol. 80, no. 1, pp. 93–97, 2005. [27] E. Trovatti et al., “Novel bacterial cellulose–acrylic resin nanocomposites,” Compos. Sci. Technol., vol. 70, no. 7, pp. 1148–1153, 2010. [28] J. Ye et al., “Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum ATCC 23767 using tobacco waste extract as culture medium,” Bioresour. Technol., vol. 274, pp. 518–524, 2019. 22
34. [29] Z. Lu, Y. Zhang, Y. Chi, N. Xu, W. Yao, and B. Sun, “Effects of alcohols on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum 186,” World J. Microbiol. Biotechnol., vol. 27, no. 10, pp. 2281–2285, 2011. [30] L. L. Zhou, D. P. Sun, L. Y. Hu, Y. W. Li, and J. Z. Yang, “Effect of addition of sodium alginate on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum,” J. Ind. Microbiol. Biotechnol., vol. 34, no. 7, p. 483, 2007. [31] G. L. Miller, “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar,” Anal. Chem., vol. 31, no. 3, pp. 426–428, 1959. [32] F. Hong and K. Qiu, “An alternative carbon source from konjac powder for enhancing production of bacterial cellulose in static cultures by a model strain Acetobacter aceti subsp. xylinus ATCC 23770,” Carbohydr. Polym., vol. 72, no. 3, pp. 545–549, 2008. [33] K.-C. Cheng, J. M. Catchmark, and A. Demirci, “Effect of different additives on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum and analysis of material property,” Cellulose, vol. 16, no. 6, pp. 1033–1045, 2009. [34] A. Jagannath, A. Kalaiselvan, S. S. Manjunatha, P. S. Raju, and A. S. Bawa, “The effect of pH, sucrose and ammonium sulphate concentrations on the production of bacterial cellulose (Nata-de-coco) by Acetobacter xylinum,” World J. Microbiol. Biotechnol., vol. 24, no. 11, p. 2593, 2008. [35] R. E. Cannon and S. M. Anderson, “Biogenesis of bacterial cellulose,” Crit. Rev. Microbiol., vol. 17, no. 6, pp. 435–447, 1991. [36] S. Yamanaka et al., “The structure and mechanical properties of sheets prepared from bacterial cellulose,” J. Mater. Sci., vol. 24, no. 9, pp. 3141–3145, 1989. [37] J. H. Ha, N. Shah, M. Ul-Islam, T. Khan, and J. K. Park, “Bacterial cellulose production from a single sugar α-linked glucuronic acid-based oligosaccharide,” Process Biochem., vol. 46, no. 9, pp. 1717–1723, 2011. [38] G. Joseph, G. E. Rowe, A. Margaritis, and W. Wan, “Effects of polyacrylamide‐ co‐acrylic acid on cellulose production by Acetobacter xylinum,” J. Chem. Technol. Biotechnol. Int. Res. Process. Environ. Clean Technol., vol. 78, no. 9, pp. 964–970, 2003. [39] S. T. Park, E. Kim, and Y. M. Kim, “Overproduction of cellulose in Acetobacter xylinum KCCM 10100 defective in GDP-mannosyltransferase,” J. Microbiol. Biotechnol., vol. 16, no. 6, pp. 961–964, 2006. [40] S. Bae, Y. Sugano, and M. Shoda, “Improvement of bacterial cellulose production by addition of agar in a jar fermentor,” J. Biosci. Bioeng., vol. 97, no. 1, pp. 33–38, 2004. [41] Y. Chao, M. Mitarai, Y. Sugano, and M. Shoda, “Effect of addition of water‐ soluble polysaccharides on bacterial cellulose production in a 50‐L airlift reactor,” Biotechnol. Prog., vol. 17, no. 4, pp. 781–785, 2001. [42] T. Ishida, Y. Sugano, T. Nakai, and M. SHODA, “Effects of acetan on production of bacterial cellulose by Acetobacter xylinum,” Biosci. Biotechnol. 23
35. Biochem., vol. 66, no. 8, pp. 1677–1681, 2002. 24
36. PHỤ LỤC – KẾT QUẢ XỬ LÝ ANOVA 1. pH ANOVA pH Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 1.499 9 .167 109.594 .000 Within Groups .122 80 .002 Total 1.621 89 pH Tukey HSDa Additive N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4 5 0.3%XG 9 2.7533 0.3%KJ 9 2.7867 2.7867 0.2%KJ 9 2.8100 2.8100 0.1%MCC 9 2.8133 0.2%XG 9 2.8200 0.1%KJ 9 2.8333 2.8333 0.1%XG 9 2.8333 2.8333 0.2%MCC 9 2.8833 2.8833 0.3%MCC 9 2.9133 Control 9 3.2333 Sig. .078 .264 .183 .828 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 9.000. 2. Độ acid tổng ANOVA TA Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 49.893 9 5.544 77.074 .000 Within Groups 4.172 58 .072 Total 54.065 67 25
37. TA Tukey HSDa,b Additive N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4 5 0.3%MCC 9 6.1667 0.2%MCC 6 6.7750 Control 5 6.8700 6.8700 0.1%XG 9 6.9500 6.9500 0.1%KJ 6 7.0750 7.0750 0.2%KJ 6 7.2750 0.1%MCC 6 7.3250 0.2%XG 6 7.3500 0.3%XG 9 8.0167 0.3%KJ 6 9.5250 Sig. 1.000 .589 .058 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 6.522. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed. 3. Hàm lượng đường khử ANOVA Glucose Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 76.035 9 8.448 277.509 .000 Within Groups 1.309 43 .030 Total 77.344 52 Glucose Tukey HSDa,b Additive N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4 5 Control 6 1.0116 0.1%MCC 4 3.0574 0.3%MCC 7 3.9602 0.1%KJ 5 4.4040 0.1%XG 5 4.4542 0.2%XG 4 4.4767 0.3%KJ 5 4.5207 26
38. 0.2%MCC 7 4.5970 0.2%KJ 6 5.0025 0.3%XG 4 5.2578 Sig. 1.000 1.000 1.000 .754 .391 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.079. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed. 4. Số lượng vi sinh vật ANOVA OD600 Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups .024 9 .003 275.714 .000 Within Groups .000 21 .000 Total .024 30 OD600 Tukey HSDa,b Additive N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4 5 6 7 0.2%MCC 4 .0324 0.3%MCC 3 .0462 0.1%MCC 3 .0535 .0535 0.2%KJ 2 .0559 0.3%KJ 2 .0770 0.1%XG 3 .0799 0.3%XG 4 .0860 .0860 0.1%KJ 5 .0915 0.2%XG 2 .1016 Control 3 .1285 Sig. 1.000 .197 .994 .058 .528 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.830. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed. 5. Khối lượng cellulose 27
39. ANOVA BC Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 427.400 9 47.489 6032.253 .000 Within Groups .630 80 .008 Total 428.030 89 BC Tukey HSDa Additive N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Control 9 .0000 0.1%MCC 9 1.7750 0.2%MCC 9 2.3983 0.3%MCC 9 2.5033 0.1%KJ 9 3.5950 0.1%XG 9 4.9550 0.3%KJ 9 5.5033 0.3%XG 9 5.7983 0.2%XG 9 6.5183 0.2%KJ 9 6.9700 Sig. 1.000 1.000 .279 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 9.000. 6. Chiều dày lớp cellulose ANOVA BC_W Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 126.546 9 14.061 8046.149 .000 Within Groups .140 80 .002 Total 126.686 89 28
40. BC_W Tukey HSDa Additive N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4 5 6 7 8 Control 9 .0000 0.1%MCC 9 .3867 0.2%MCC 9 .9233 0.3%MCC 9 1.1267 0.1%KJ 9 2.5400 0.3%XG 9 2.5433 0.1%XG 9 2.5833 0.2%XG 9 2.6733 0.3%KJ 9 3.3400 0.2%KJ 9 3.5400 Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 .466 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 9.000. 29