Đồ án Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens SH1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường

125 trang thiennha21 12/04/2022 2410

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens SH1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_cai_thien_dieu_kien_nuoi_cay_serratia_marcescens_sh1_v.pdf

Nội dung text: Đồ án Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens SH1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUƠI CẤY SERRATIA MARCESCENS SH1 VÀ PHƯƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƯỜNG”. Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hồi Hương Sinh viên thực hiện : Hồ Thị Bích Phương MSSV: 1151100246 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi đƣợc thực hiện tại phịng thí nghiệm khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trƣờng, trƣờng đại học Cơng nghệ TP.Hồ Chí Minh. Các số liệu và kết quả là trung thực, chƣa ai cơng bố. Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm về lời cam đoan của mình trƣớc quý thầy cơ và nhà trƣờng. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8, năm 2015 Sinh viên thực hiện Hồ Thị Bích Phƣơng
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Tận đáy lịng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ đã gian lao nuơi dạy con thành ngƣời và là ngƣời thầy đầu đời của con. Cha mẹ luơn là chỗ dựa vững chắc nhất của con, là ngƣời giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã, là nguồn động viên, động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống. Với lịng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn tồn thể quý Thầy Cơ Khoa Cơng nghệ sinh học – Mơi trƣờng – Thực phẩm, cùng tồn thể Thầy Cơ Trƣờng Đại học Cơng nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu về cơ sở ngành cũng nhƣ chuyên ngành từ ngày em bƣớc chân vào giảng đƣờng đại học. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cơ Nguyễn Hồi Hƣơng ngƣời đã luơn tận tình chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hồn thành phần thực nghiệm của đồ án. Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Mơi trƣờng – Thực phẩm, Trƣờng Đại học Cơng nghệ TP. Hồ Chí Minh. Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH04 và các bạn làm đồ án tại phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Mơi trƣờng – Thực phẩm đã luơn khích lệ, động viên và giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trƣờng và trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015 SVTH: Hồ Thị Bích Phƣơng
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỤC LỤC BẢNG viii LỜI MỞ ĐẦU 9 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 12 1.1.1. Hợp chất thứ cấp 12 1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 12 1.2 Tổng quan prodigiosin 15 1.2.1. Khái niệm về prodigiosin 15 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin 16 1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin 18 1.3. Tổng quan về Serratia marcescens 24 1.3.1. Phân loại Serratia marcescens 24 1.3.2. Đặc điểm của Serratia marcescens 25 1.3.4 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens 29 1.3.5 Tổng quan về quorum sensing trong S. marcescens 31 1.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin 32 1.4.1. Cơ chế tổng hợp prodigiosin 32 1.4.2. Yếu tố ảnh hƣởng đến tổng hợp prodigiosin 34 i
Đồ án tốt nghiệp 1.4.3. Điều kiện tổng hợp prodigiosin 38 1.4.4. Thu nhận, tinh sạch và định lƣợng prodigiosin 39 1.5 Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens 42 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU45 2.1. Thời gian và địa điểm 45 2.1.1. Thời gian 45 2.1.2. Địa điểm 45 2.2. Vật liệu 45 2.2.1. Nguồn vi sinh vật 45 2.2.2. Mơi trƣờng nuơi cấy và hĩa chất sử dụng 45 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 46 2.4 Bố trí thí nghiệm 47 2.5.1 Khảo sát chủng nuơi cấy 49 2.5.1 Kiểm tra độ thuần khiết 49 2.5.2 Kháng sinh đồ 49 2.6 Xác định điều kiện lên men 49 2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc trong nuơi cấy 52 2.7.2 Xác định pH tối ƣu cho mơi trƣờng lên men 53 2.7.3 Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl 53 2.7.4 Khảo sát sự ảnh hƣởng của phƣơng pháp đồng nuơi cấy 54 2.7.5 Khảo sát sự ảnh hƣởng của sản phẩm Quorum sensing 55 2.8 Thu hồi sản phẩm thơ 56 ii
Đồ án tốt nghiệp 2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung mơi đồng thời khảo sát thể tích lên men 56 2.8.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ 56 2.9 Các phƣơng pháp phân tích 56 2.9.1 Xác định protein cĩ trong mẫu 57 2.9.2 Xác định lipid cĩ trong mẫu 57 2.10 Sắc ký bản mỏng TLC 57 2.11 Phƣơng pháp phân tích 59 2.11.1. Phƣơng pháp định lƣợng hợp chất prodigiosin 59 2.11.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê 59 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60 3.1 Kết quả kiểm tra độ thuần khiết 60 3.2 Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin 65 3.2.1 Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp 65 3.2.2 Xác định vận tốc lắc 67 3.2.3 Kết quả xác định pH tối ƣu cho mơi trƣờng MT3 69 3.2.4 Ảnh hƣởng của nồng độ muối lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp 71 3.2.5 Kết quả thí nghiệm đồng nuơi cấy 73 3.2.6 Sử dụng dịch trong nuơi cấy 76 3.3 Thu hồi sản phẩm lên men từ canh trƣờng 77 3.3.1 Ảnh hƣởng của tỷ lệ canh trƣờng: dung mơi trích ly lên hàm lƣợng prodigiosin thu hồi 77 3.3.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia nhiệt canh trƣờng 78 iii
Đồ án tốt nghiệp 3.4 Xác định thành phần hĩa học trong mẫu 84 3.4.1. Phản ứng Biuret’s test 84 3.4.2 Xác định lipid cĩ trong mẫu 86 3.5 Sắc ký bản mỏng TLC 88 Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91 4.1 Kết luận 91 4.2 Kiến nghị 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 PHỤ LỤC 1 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EPN: Entomopathogenic nematodes OD: mật độ quang (Optical Density) λmax : bƣớc sĩng hấp thụ cực đại TLC: Thin Layer Chromatogarphy v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 19 Hình 1.2 Cấu trúc hĩa học prodigiosin (Krishna,2008) 20 Hình 1.3. Cơ chế kháng tế bào ung thƣ của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,2011) 23 Hình 1.4. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) 29 Hình 1.5. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên mơi trƣờng nutrient agar ở 250C sau 48 giờ (David, 2012) 28 Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC 39.600, Sma 274 và các cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001) 35 Hình 1.7. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009) 37 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 51 Hình 2.2 Sơ đồ trích ly 54 Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký 61 Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuơi cấy trên mơi trƣờng NA 63 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng và soi nghiêng dƣới kính hiển vi vật kính 10X .64 Hình 3.3 Kết quả nhuộm Gram chủng SH1 65 Hình 3.4 Kết quả kháng kháng sinh của chủng SH1 65 vi
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp 69 Hình 3.6 Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc 71 Hình 3.7 Ảnh hƣởng của pH lên sự tổng hợp prodigiosin của S. marcescens SH1. 73 Hình 3.8 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung NaCl. 75 Hình 3.9 Đồng nuơi cấy Serratia marcescens SH1 và Bacillus sp. 77 Hình 3.10 Kết quả đồng nuơi cấy E. coli 78 Hình 3.11. Hàm lƣợng prodigiosin thu hồi sau trích ly nhờ tỷ lệ canh trƣờng: dung mơi khác nhau 81 Hình 3.12 Canh trƣờng sau khi ly tâm 82 Hình 3.13. Sắc tố đỏ sau khi trích ly với dung mơi Etanol:HCl (95:5) 83 Hình 3.14. Vi khuẩn S. marcescens đƣợc cấy trên mơi trƣờng NA. 84 Hình 3.15. Hàm lƣợng prodigiosin so với đối chứng. 85 Hình 3.16. Kết quả quét quang phổ của sắc tố canh trƣờng khơng đun và đun 1000C 86 Hình 3.17 Biuret’s test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thơ 87 Hình 3.18 Ninhydrin test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thơ ở thí nghiệm đun và khơng đun canh trƣờng. 88 Hình 3.19. Kết quả mẫu phản ứng Coomassie brilliant blue trƣớc và sau khi phun thuốc thử. 90 Hình 3.20. Kết quả sắc ký bản mỏng sử dụng hệ dung mơi Petrolium ether: Ether : Acetic acid (70 : 40 : 2, v : v :v) 92 Hình 3.21 Sơ đồ quy trình S. marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin 93 vii
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật 15 Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) 19 Bảng 1.3. Các sản phẩm prodigiosin thƣơng mại hĩa (Santa Cruz Biotechnology, Merck Millipore, Biovision incorporated) 25 Bảng 1.4. Một số đặc điểm sinh hĩa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010) 29 Bảng 1.5. So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các mơi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009). 40 Bảng 2.1. Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của máy lắc và chế độ lắc. 55 Bảng 3.1 Kết quả kháng kháng sinh 66 Bảng 3.2 % Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp so với đối chứng (thí nghiệm A) 69 Bảng 3.3. Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc. 70 Bảng 3.4 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu 73 Bảng 3.5 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung muối NaCl 75 Bảng 3.6. % prodigiosin tổng hợp so với đối chứng 77 Bảng 3.7. Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp khi bổ sung dịch nuơi cấy. 79 Bảng 3.8. % Ảnh hƣởng của tỷ lệ canh trƣờng : dung mơi trích ly 80 Bảng 3.9. Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong thí nghiệm 84 Bảng 3.10. Kết quả xác định protein và lipid 91 viii
Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn nhƣ thực vật, vi sinh vật, động vật cĩ xƣơng sống và khơng xƣơng sống là những nguồn cĩ giá trị của các hợp chất hoạt tính sinh học. Một số lƣợng lớn các loại thuốc đã đƣợc phát triển trong ngành y từ các sản phẩm tự nhiên. Kể từ khi phát hiện và thành cơng trong việc điều trị của peniciline, các vi sinh vật đã đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn đặc biệt của các tác nhân hoạt tính sinh học cĩ cấu trúc đa dạng. Các ứng dụng điều trị của các chất chuyển hĩa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát hiện ra kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin ), ức chế miễn dịch trong cấy ghép, các tác nhân giảm cholesterol (ví dụ lovastain và mevastatin) và tác nhân chống ung thƣ (ví dụ doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin). Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đƣợc chiết xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ, đã đƣợc sử dụng trong việc làm thuốc đơng y, mỹ phẩm, thực phẩm, Nhƣng sau đĩ, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đã đƣợc nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hĩa học cũng nhƣ cách tổng hợp bằng phƣơng pháp hĩa học, bởi ngƣời ta cho rằng chúng bền hơn, cĩ thể sản xuất trên quy mơ lớn và chi phí sản xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ơ nhiễm mơi trƣờng và ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hĩa học đã bắt đầu đƣợc chú ý đến. Chính vì thế so với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh vật ngày càng đƣợc quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự nhiên và an tồn dễ sử dụng, sản xuất đƣợc quanh năm trong các điều kiện địa lý khác nhau và do sự tăng trƣởng nhanh chĩng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời gian sản xuất xuống cịn chỉ một vài ngày. So với các nguồn khác từ thực vật hoặc động vật thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật cĩ thể dễ dàng đƣợc kiểm sốt và dự đốn sản 9
Đồ án tốt nghiệp lƣợng (Francis, 1987; Taylor, 1984). Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì hợp chất prodigiosin đƣợc biết đến với ý nghĩa quan trọng. Một số lồi Serratia, đặc biệt lồi Serratia marcenscens cĩ khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N30 = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005). Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và cĩ hoạt tính kháng vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lãnh vực bảo vệ thực vật cũng nhƣ hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Sớm nhận thấy đƣợc lợi rất quan trọng của hợp chất prodigiosin đƣợc tách từ việc nuơi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, Nguyễn Hồng Anh Kha đã thu nhận sắc tố đỏ prodigiosin từ việc nuơi cấy trong mơi trƣờng peptone glycerol đạt 10,575 mg/ml sắc tố ( ĐATN Nguyễn Hồng Anh Kha, 2014). Sau đĩ ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) đã khảo sát trong quá trình lên men thu prodigiosin, mơi trƣờng huyền phù đậu phộng MT1 (10%) cho hàm lƣợng prodigiosin là 248,4% so với mơi trƣờng peptone glycerol là 100%. Cũng trong ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) kết luận mơi trƣờng MT3 chứa 10% huyền phù đậu phộng 5% pepton và 1% dầu hƣớng dƣơng, tỉ lệ cấy giống 3%, lắc 180 vịng phút trong 24 giờ đầu sau đĩ giảm cịn 150 vịng/phút là mơi trƣờng và điều kiện tối ƣu nhất để tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin. Nhƣng quá trình lên men cịn ở quy mơ sản xuất nhỏ 20 ml/bình và cịn nhiều yếu tố cần cải thiện. Dựa trên cơ sở này đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUƠI CẤY Serratia mercescens SH1 VÀ PHƢƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƢỜNG” đƣợc tiến hành nhằm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp. 10
Đồ án tốt nghiệp 2. Mục tiêu đề tài Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin, cũng nhƣ phƣơng pháp thu hồi sắc tố thơ. 3. Nội dung đề tài Khảo sát chủng Serratia marcescens xem xét độ thuần khiết, khảo sát kháng sinh đồ. Cải tiến điều kiện nuơi cấy Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin: tăng thể tích lên men, ảnh hƣởng của vận tốc lắc, pH nuơi cấy, nồng độ muối % NaCl, thử áp dụng phƣơng pháp đồng nuơi cấy tăng hợp chất thứ cấp, thử áp dụng bổ sung dịch nuơi cấy vi khuẩn Gram âm chứa phân tử tín hiệu Quorum sensing. Thiết lập quy trình trích ly sắc tố thơ từ canh trƣờng nuơi cấy. 4. Ý nghĩa khoa học Áp dụng các kiến thức về cơng nghệ lên men sản xuất hợp chất thứ cấp vào tổng hợp prodigiosin. Xem xét khá năng sử dụng chủng Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến trùng EPN vào sản xuất prodigiosin qua kháng sinh đồ khác biệt với chủng phân lập từ bệnh phẩm. Gĩp phần vào việc tăng quy mơ và nồng độ sản phẩm prodigiosin tổng hợp bằng phƣơng pháp lên men. 5. Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp sản phẩm prodigiosin thơ cho nghiên cứu tinh sạch và khảo sát hoạt tính sinh học. 11
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1. Hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất cĩ hoạt tính sinh học đĩng vai trị điều hịa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của mơi trƣờng xung quanh. Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hĩa hợp chất sơ cấp. 1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Cĩ sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành cơng nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp, đƣợc xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành cơng nghiệp chế biến cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuơi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên cĩ tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống oxy hĩa. Ngành cơng nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh 12
Đồ án tốt nghiệp vật cung cấp một số lƣợng hợp chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này cĩ tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng nhƣ cĩ thể dễ dàng tối ƣu hĩa quy trình cơng nghệ (Juailova và cộng sự, 1997). Bên cạnh đĩ, một số vi sinh vật cĩ khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula, Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng cĩ khả năng sản xuất số lƣợng lớn hợp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đĩ kháng sinh, nhĩm hoạt chất cĩ khả năng gây chết hoặc kìm hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi sinh vật nhƣ nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh cĩ phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tĩm tắt về một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật. Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật Vi sinh vật Hợp chất thứ cấp Ứng dụng Kiểu tác động ức chế Penicillium Penicillin Ức chế tụ cầu khuẩn, Ức chế tạo polymer notatum, nhiễm trùng kỵ khí, vách tế bào vi khuẩn, giang mai, hen suyễn. ức chế hấp thu amino Penicillium acid và protein, ức chế chrysogenum tạo enzyme 13
Đồ án tốt nghiệp Streptomyces Streptomycin Ức chế vi khuẩn Ức chế ghép nối một griceus Gram âm và ram số amino acid vào dƣơng. Trị bệnh lao, protein, tác động lên bệnh viêm màng não, hệ enzyme của vi ho gà khuẩn tham gia chuyển pyruvate vào chu trình Creb Steptomyces Chloramphenicol Ức chế đối với bệnh Ức chế đặc hiệu sinh venezuelae lỵ, sốt cao, sốt phát tổng hợp protein vi ban khuẩn liên quan đến peptidyl transferase trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn khơng cho tạo liên kết peptide Streptomyces Tetracilin Ức chế phổ rộng vi Ức chế tổng hợp aureomycin khuẩn Gram âm, protein Gram dƣơng Streptomyces Erythromycin Chữa bệnh do tụ cầu ức chế vi khuẩn Gram erythraeus khuẩn streptococcal âm và Gram dƣơng gây ra 14
Đồ án tốt nghiệp Streptomyces Neomycin Tác dụng vi khuẩn Hơi độc fradiae Gram âm và Gram dƣơng Streptomyces Kanamycin Điều trị lao, ức chế vi Tác động giống nhƣ kanamycetius khuẩn Gram âm và streptomycin và neomycin Gram dƣơng Streptomyces Cycloserine Điều trị bệnh lao Cản trở tổng hợp vách lavendulae tế bào 1.2 Tổng quan prodigiosin 1.2.1. Khái niệm về prodigiosin Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” cĩ nguồn gốc từ “prodigious” cĩ nghĩa là một điều gì đĩ kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng túi bên ngồi tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). Prodigiosin là một chất chuyển hĩa thứ cấp, đƣợc sản xuất bởi các vi khuẩn nhƣ Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous, Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và các xạ khuẩn Gram dƣơng, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli và Streptomyces longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006). Hình 1.1 trình bày cấu trúc hĩa học của các hợp chất đại diện của prodigiosin. 15
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin Mãi đến năm 1960, cơng thức hĩa học chính xác của prodigiosin đƣợc tổng hợp bởi Serrattia marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chĩng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo, mà cấu trúc của prodigiosin dần đƣợc nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000). Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2- ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) cĩ cơng thức phân tử C20H25N30 và trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Williamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid cĩ cấu trúc hĩa học đặc biệt, với ba vịng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đĩ hai vịng đầu liên kết trực tiếp với nhau, cịn vịng thứ ba đƣợc gắn vào thơng qua cầu nối methene (Qadri và Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin cĩ bảy liên kết đơi và đƣợc miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). 16
Đồ án tốt nghiệp Hình 1 .2. Cấ u trúc hĩa học prodigiosin (Krishna , 2008). (Krishna Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và khơng tan đƣợc trong nƣớc. Prodigiosin cĩ thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đĩ, nĩ dễ tan trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafari và cộng sự, 2006). Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Lồi Tên sắc tố Danh pháp prodigiosin Trọng lƣợng phân tử và cơng thức Serratia marcescens Prodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da methoxy prodigiosene C20H25N30 Serratia marcescens Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da hydroxy-prodigiosene C10H23N30 Nocardia Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- 363,5 Da (Actinomadura) methoxyprodigiosene C23H31N30 madurae 17
Đồ án tốt nghiệp Nocardia Cyclononylprodig 2,10-Nonano-6- 265,5 Da (Actinomadura) iosin melhoxy-prodigiosene C23H33N30 madurae Nocardia(Actinomadura) Methylcyclodc 2,10-Nonano-6- 391,5 Da cyl-prodigiosin pellctieri Methoxy-prodigiosene C25H33N30 Streptomyces Undccylprodigios 2-Undecyl-6- 393,6 Da longisporusruber và in Rnethoxyprodigiosene C25H35N30 Nocardia(Actinomadura) pelletieri Streplonlyces Metacycloprodig 2,4-(9-Ethylnonano)-6- 391,6 Da longisporusruber iosin methoxyprodigiosene C25H33N30 1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin 1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn Prodigiosin cĩ khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số lồi vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng tế bào và khả năng ức chế các enzyme nhƣ DNA gyrase, topoisomerase IV, dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009). Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin cĩ thể kháng một số vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus 18
Đồ án tốt nghiệp mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus, Tuy nhiên, hoạt động kháng khuẩn của prodigiosin đối với các vi khuẩn Gram dƣơng lại cao hơn so với các vi khuẩn Gram âm (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012). 1.2.3.2. Hoạt tính chống tế bào ung thư Prodigiosin cĩ khả năng gây độc tế bào và cĩ thể chống lại một loạt các dịng tế bào ung thƣ ở ngƣời, nhƣng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng sự,2009; Pérez-Tomás và Viđas, 2010). Vì khả năng gây độc chọn lọc này, prodigiosin hứa hẹn cĩ nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung thƣ. Các hoạt động chống ung thƣ trong cơ thể của prodigiosin đƣợc chứng minh lần đầu tiên bằng những ác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7 hepatocarcinoma xenografted (Yamamoto và cộng sự, 1999). Một mơ hình khối u ác tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin cĩ khả năng ức chế sự di căn, bằng cách nĩ đã giảm sự di căn trên tế bào ung thƣ phổi (Zhang và cộng sự, 2005), điều này đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thƣ thơng qua nhiều cơ chế. Các khả năng gây độc dẫn đến sự tự hủy của tế bào ác tính bởi prodigiosin chủ yếu là do ảnh hƣởng từ proapoptotic của chúng chống lại các tế bào ác tính. Nhiều nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ con đƣờng prodigiosin gây sự tự hủy của các tế bào (Chia-Che và cộng sự, 2011). Cơ chế kháng tế bào ung thƣ của prodigiosin đƣợc mơ tả cụ thể nhƣ sau: 19
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Cơ chế kháng tế bào ung thƣ của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,2011) Quá trình acid hĩa pH trong tế bào (pHi) rõ ràng là một kích hoạt quan trọng của quá trình tự hủy trong tế bào (Lagadic-Gossmann và cộng sự, 2004). Acid hĩa nội bào là cần thiết cho cycloprodigiosin kích thích quá trình tự hủy trong tế bào HL-60 (Yamamoto và cộng sự, 2000), cũng tƣơng tự nhƣ prodigiosin gây ra sự tự hủy ở tế bào ung thƣ ruột (Castillo-Avila và cộng sự, 2005). Các kết cấu của BCL-2 rất quan trọng trong việc tiến hành con đƣờng tự hủy của ty thể bằng cách điều hịa tính thấm của màng ty thể bên ngồi. Tăng tính thấm của màng ty thể bên ngồi sẽ dẫn đến việc hình thành cytosolic của cytochrome c, nhằm kích hoạt caspase-9 bắt đầu caspase để tạo ra quá trình tự hủy. Prodigiosin đƣợc biết là tác nhân gây ra sự kích thích quá trình tự hủy của protein BCL-2 BAX trong tế bào MCF-7 (Soto-Cerrato và cộng sự, 2004). Tƣơng tự nhƣ vậy, các nghiên cứu cũng đã chứng minh trƣớc đĩ undecylprodigiosin giảm sự ngăn chặn tự hủy BCL-XL nhƣng nâng kích thích tự hủy BIK, BIM, MCL-1S và NOXA (Ho và cộng sự, 2007). Survivin và XIAP là chất ức chế nội sinh của caspase. Survivin hoặc XIAP cao sẽ tạo ra sự đề kháng, điều này rất phổ biến trong các tế bào ung thƣ (Schimmer 20
Đồ án tốt nghiệp và cộng sự, 2006; Altieri, 2008). Một nghiên cứu trƣớc đĩ của các tác giả thấy rằng cả survivin và XIAP đều đƣợc giảm đi bởi sự cĩ mặt của undecylprodigiosin trong tế bào MCF-7 (Ho và cộng sự, 2007). Ngừng chu kỳ tế bào: bên cạnh việc gây sự tự hủy của các tế bào ung thƣ, prodigiosin cũng ngăn chặn sự phát triển ung thƣ bằng cách gây ra quá trình ngừng chu kỳ tế bào ở nồng độ khơng gây độc cho tế bào. Để làm điều này, undecylprodigiosin làm giảm sự phát triển của tế bào lympho T bằng cách ức chế CDK4 và CDK2 (Songia và cộng sự, 1997). Tƣơng tự nhƣ vậy, prodigiosin gây ra ngừng tăng trƣởng của các tế bào Jurkat tại quá trình chuyển đổi G1-S, bằng cách giảm phosphoryl hĩa Rb thơng qua sự ức chế hoạt động của kinase cyclin E-CDK2 và cyclin A-CDK2, cũng nhƣ bằng cách điều chỉnh p21CIP1/WAF1 và p27KIP1 (Pérez-Tomás, và Montaner, 2003). Một nghiên cứu gần đây của SotoCerrato và cộng sự (Soto-Cerrato và cộng sự, 2007) đã cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào cách prodigiosin điều chỉnh p21CIP1/WAF1. Chống sự xâm nhập và chống sự di căn: di căn là một nguyên nhân hàng đầu dẫn đế sự tử vong do bệnh ung thƣ và làm tăng nhu cầu về thuốc chống di căn. Những lợi ích chữa bệnh của prodigiosin đã đƣợc chứng minh trong một mơ hình khối u ác tính ở chuột, bằng cách giảm sự di căn phổi (Zhang và cộng sự, 2005). Cơ chế hoạt động chống di căn của prodigiosin cĩ thể là do tác dụng ức chế của nĩ trên các tế bào di căn và xâm nhập, cĩ thể thơng qua quá trình down- regulation của RhoA và matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Zhang và cộng sự, 2005). Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dịng tế bào tiêu chuẩn của các khối u ở ngƣời, cĩ nguồn gốc từ phổi, ruột, thận, buồng trứng, ung thƣ não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu. Ức chế tăng sinh tế 21
Đồ án tốt nghiệp bào cũng nhƣ cảm ứng cho tế bào tự hủy đã đƣợc quan sát trong các dịng tế bào (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Ngồi ra, prodigiosin cũng đƣợc tìm thấy gây độc tế bào ung thƣ phổi và các tế bào biểu mơ kháng doxorubicin và biểu hiện tốt lên các protein đa kháng thuốc (Llagostera và cộng sự, 2005). 1.2.3.3. Hoạt tính ức chế miễn dịch Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên đƣợc mơ tả bởi Nakamura và cộng sự, họ đã cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và metacycloprodigiosin trong canh trƣờng nuơi cấy vi khuẩn Serratia và quan sát sự ức chế chọn lọc quá trình phát triên của các tế bào lympho T đa giá so với các tế bào lympho B (Han và cộng sự, 2001). Sau đĩ, hoạt động ức chế miễn dịch đã đƣợc chứng minh cho các chất tƣơng tự prodigiosin khác nhƣ: undecylprodigiosin, cPrG, MAMPDM, nonylprodigiosin, 22
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3. Các sản phẩm prodigiosin thƣơng mại hĩa (Santa Cruz Biotechnology, Merck Millipore, Biovision incorporated) STT GIÁ THÀNH ĐỘ THƠNG SỐ KỸ THUẬT ỨNG DỤNG SẢN PHẨM TINH SẠCH 1 95 $/ 250 g 95% Độ hịa tan : DMSO hoặc Hoạt động nhƣ Ethanol. một mTORC1 và = 2000000 HPLC mRTOC2 ức chế Nhiệt độ lƣu trữ: -20 0C VNĐ/250 g chất phát triển Điều kiện vận chuyển : gĩi gel, 355 $/ 1 mg = phức tạp. Chỉ sử tránh khơng khí ánh sáng. dụng cho nghiên 7100000 VNĐ/ Dạng thành phẩm: rắn màu đỏ cứu, khơng sử 1mg đậm. dụng cho ngƣời. 2 349 $/500 µg = >95% Trạng thái vật lý: rắn Hoạt động nhƣ 6980000 một kháng sinh. Cĩ nguồn gốc từ: Serratia VNĐ/500 µg Chỉ sử dụng cho marcescens nghiên cứu, khơng Độ hịa tan: Hịa tan trong sử dụng cho điều ethanol, methanol, DMF hoặc trị ở ngƣời. DMSO.Tan trong nƣớc hạn chế Bảo quản: ở nhiệt độ -20°C Điểm nĩng chảy: 151-152ºC 23
Đồ án tốt nghiệp 3 159 GBP/200 >95% Nguồn: Serratia marcescens Một ứng dụng µg = 3975000 hợp chất tế bào HPLC Xuất hiện: rắn, màu đỏ đậm VNĐ/200 µg thẩm thấu cĩ hiển Lƣu trữ dài hạn: -20°C thị ức chế miễn Độ hịa tan: Hịa tan trong dịch và chống ethanol, methanol, DMF hoặc khối u đặc tính DMSO. Tan trong nƣớc hạn khơng phân biệt chế. tình trạng p53 và kháng đa thuốc. Đĩng gĩi khí trơ. Một trong những vi sinh vật tổng hợp prodigiosin và analog đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là Serratia marcescens. 1.3. Tổng quan về Serratia marcescens 1.3.1. Phân loại Serratia marcescens Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhĩm vi khuẩn cĩ liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đĩ, lồi điển hình của chi Serratia là Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae 24
Đồ án tốt nghiệp Chi: Serratia Lồi: Serratia marcescens 1.3.2. Đặc điểm của Serratia marcescens 1.2.2.1 Đặc điểm sinh lý Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia marcescens cĩ hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC và cĩ thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). Hình 1.4. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên mơi trƣờng nutrient agar đƣợc mơ tả là khuẩn lạc trịn, lồi và các khuẩn lạc này cĩ màu trắng, hồng hay đỏ, đĩ cũng chính là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thƣờng bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012). 25
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên mơi trƣờng nutrient agar ở 250C sau 48 giờ (David, 2012). Serratia marcescens cĩ thể bám dính với nhau trên mơi trƣờng thạch, tạo thành nhĩm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8%), các cụm tế bào này cĩ chiều dài từ 530 μl. Serratia marcescens cũng cĩ thể tạo thành một màng sinh học. 1.3.2.2 Đặc điểm sinh hĩa Serratia marcescens cĩ thể phát triển trong mơi trƣờng cĩ oxy hoặc trong trƣờng hợp khơng cĩ oxy. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lƣợng và nhờ cĩ các enzyme nhƣ superoxide dismutase, calatase, peroxidase, bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hĩa, cho phép sống trong mơi trƣờng oxy hĩa. Serratia marcescens cĩ thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). Ngồi ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Một số đặc điểm sinh hĩa của Serratia marcescens đƣợc thể hiện qua bảng 1.4. 26
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.4. Một số đặc điểm sinh hĩa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010). STT Đặc điểm sinh hĩa Kết quả 1 Di động + 2 Indole - 3 Methyl Red - 4 Voges Proskauer + 5 Citrate + 6 Dnase + 7 Catalase + 8 Oxidase - 9 Urease - 10 Gelatinase + 11 Chitinase + 12 Triple sugar iron Mơi trƣờng chuyển sang acid, khơng sinh khí và khơng sinh H2 S 27
Đồ án tốt nghiệp 13 Hydrogen sulphide - peoduction 14 Lysine decarboxylase + 15 Ornithine decarboxylase + 16 Lên men glucose + 17 Lên men sucrose + 18 Lên men sorbitol + 19 Lên men fructose + 20 Lên men xylose - 22 Lên men lactose - 23 Lên men arabinose - 1.3.2.3. Đặc điểm phân bố Cĩ thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nƣớc, trong đất, trong thực vật, cơn trùng, cũng nhƣ trong ống tiêu hĩa của ngƣời và động vật cĩ xƣơng sống. Trong nƣớc và đất: đã cĩ 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sơng và Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đĩ, Serratia marcescens cĩ thể đĩng một vai trị quan trọng trong chu trình sinh địa hĩa của kim loại, thơng qua việc khống hĩa hữu cơ sắt, cũng nhƣ hịa tan vàng và đồng (Parès, 1964). 28
Đồ án tốt nghiệp Trong cơn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các lồi cơn trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế. Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng đối với cơn trùng, chúng làm cơn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006). Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là mơi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001). Gần đây, ngƣời ta cịn phát hiện sự cĩ mặt của Serratia marcescens trong các lồi Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữ Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae. 1.3.4 Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens 1.3.4.1. Sắc tố Một nhĩm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998), đƣợc biết đến nhƣ là một yếu tố đặc biệt, nhƣng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhĩm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đĩ, khả năng ức chế miễn dịch cĩ trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI) (Krishna, 2008). Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin đƣợc sản xuất bởi biogroup A1 và A2/6, nĩ khơng đƣợc sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8, hoặc TCT (Grimont, 1977). Bên cạnh đĩ, chủng khơng sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 thƣờng gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont, 29
Đồ án tốt nghiệp 1977; Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hĩa sinh tổng hợp prodigiosin đã đƣợc biểu hiện trong Escherichia coli (Dauenhauer và cộng sự, 1984). Các dịng đƣợc tạo thành này cĩ khả năng tổng hợp ở cả hai giai đoạn MAP và MBC, hoặc tổng hợp giai đoạn MAP ở bên ngồi (Francine và Patrick, 2006). Prodigiosin đƣợc biết đến là cĩ khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể ngƣời, cĩ thể chúng sẽ khơng tổng hợp prodigiosin và do đĩ thốt khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkiner, 1997). Bên cạnh đĩ, một sắc tố vàng cĩ tên gọi là 2-hydroxy-5-carboxymethylmuconic semialdehyde acid, đƣợc sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid (3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự, 1988). Enzyme này đƣợc cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens. Tuy nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a, đã bị mất khả năng phát triển trên các hợp chất thơm, để cĩ thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006). 1.3.4.2. Biosurfactants Các chủng sinh sắc tố và một số chủng khơng sinh sắc tố của Serratia marcescens đều sản xuất biosurfactants cĩ thể hoạt động nhƣ một chất thấm. Chất thấm này đƣợc sản xuất với số lƣợng lớn ở 30°C nhƣng khơng đƣợc sản xuất ở 37°C trong phase cân bằng của quá trình tăng trƣởng. Ba aminolipid, từ W1 đến W3, cĩ các hoạt động thấm ƣớt và đã đƣợc tách bằng sắc ký lớp mỏng (Matsuyama và cộng sự, 1986). Trong đĩ, W1 đƣợc xác định là serratamolide, một cyclodepsipeptide mà trƣớc đĩ đã từng đƣợc phát hiện bởi Wasserman và cộng sự (1961). 30
Đồ án tốt nghiệp 1.3.4.3. Acid béo Các acid béo chủ yếu trong tồn bộ tế bào của các chủng Serratia marcescens là 3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic, và octadecanoic acid. Các acid béo này chiếm khoảng 50 – 80% thành phần tế bào, trong đĩ, ntetradecanoic acid chiếm Tỷ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983). 1.3.4.4. Enzyme Serratia marcescens cĩ thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease, chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase, Trong đĩ, enzyme chitinase cĩ nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải cĩ chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đĩng gĩi, cũng nhƣ kiểm sốt sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc, (Joshi và cộng sự, 1989). Serratia marcescens cĩ khả năng tiết ra các loại enzyme: Protease thủy phân casein. Đây là đặc điểm phân biệt Serratia marcescens từ 438 chủng vi khuẩn đƣờng ruột và tập hợp Pseudomonadaceae. Tƣơng tự nhƣ vậy, một protease khác là gelatinase phân hủy gelatin, một loại protein khơng đầy đủ mà thiếu tryptopan. 1.3.5 Tổng quan về quorum sensing trong S. marcescens Cảm biến định mức (quorum sensing) là một quá trình truyền tín hiệu gian bào qua đĩ vi khuẩn nhận diện mật độ tế bào và điều chỉnh sự biểu hiện gen một cách tƣơng ứng. Tế bào vi khuẩn sản sinh ra những phân tử tín hiệu để tập hợp lại xung quanh chúng nhƣ việc gia tăng quần thể. Khi sự tập trung của tín hiệu vƣợt quá ngƣỡng của nĩ, thì việc đánh dấu hành trình đƣợc bắt đầu và phản ứng sinh lý đƣợc sắp đặt sẽ đƣợc thực hiện thơng qua quần thể này. Quorum sensing sẽ điều chỉnh nhiều quá trình xử lý quan trọng, trong các lồi vi khuẩn khác nhau, ví dụ nhƣ tính độc hại, sự sản sinh 31
Đồ án tốt nghiệp trao đổi thứ cấp, cộng sinh, sự hình thành bào tử và màng sinh học ( Whitehead et al., 2001). Những hệ thống quorum sensing đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất trong khuẩn gram âm là những hệ thống sử dụng phân tử tín hiệu aHSL, trong đĩ đồng đẳng LuxI tổng hợp nhiều tín hiệu aHSL và những protein điều hịa phiên mã loại LuxR tập hợp tín hiệu cùng loại của chúng ở mật độ tế bào dày đặc và thay đổi sự biểu hiện gen (Labbate et al., 2004; Riedel et al., 2001). 1.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin 1.4.1. Cơ chế tổng hợp prodigiosin Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens, ATCC 274 (Sma 274) đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Prodigiosin đƣợc hình thành qua hai giai đoạn: 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene. Cĩ rất ít thơng tin về con đƣờng sinh tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC, ngoại trừ việc mơ tả về phân tử proline kết hợp nguyên vẹn thành một trong những nhĩm pyrrole của MBC. Quá trình tổng hợp sắc tố này cần cĩ khơng khí và phân tử oxy (Williams và Qadri, 1980). 32
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC 39.600, Sma 274 và các cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001). Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để thực hiện thử nghiệm trong các chất chuyển hĩa của Serratia marcescens và cĩ thể hữu ích đối với việc nghiên cứu một hệ thống mơ hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hĩa thứ cấp trong vi khuẩn. Tách các phân tử tái tổ hợp mã hĩa cho quá trình tổng hợp prodigiosin sẽ là một cách tiếp cận để xác định sản phẩm gene và sự hiểu biết về enzymology và di truyền học của quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. Việc tách trình tự của DNA mã hĩa một phần trong quá trình tổng hợp prodigiosin bằng cách sử dụng hệ thống nhân bản vector ở Escherichia coli cosmid đã đƣợc báo cáo (Dauenhauer và cộng sự, 1984). Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora (25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm), mặc dù nĩ đã khơng đƣợc biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn khác thuộc Enterobacteriaceae, bao gồm cả Escherichia coli (Thomson và cộng sự, 2000). Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi nhiều yếu tố, 33
Đồ án tốt nghiệp bao gồm hệ thống quorum-sensing, thơng qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000). Nhĩm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí trong pigA đến pigN, trong đĩ cĩ năm gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mơ tả ở hình 1.4. Bốn gene cịn lại khơng cĩ vai trị tổng hợp, tuy nhiên, cĩ một protein cịn lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ tự gene của hai lồi Serratia khác nhau là khác nhau và14 protein thể hiện kích thƣớc và trình tự amino acid khác nhau giữa các lồi (Cerdeno và cộng sự, 2001). 1.4.2. Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin Prodigiosin là một chất chuyển hĩa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn (Harris và cộng sự, 2004). Bản chất màu đỏ tƣơi của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ dàng hơn (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Nhiều yếu tố, chẳng hạn nhƣ: nhiệt độ, pH, độ oxy hịa tan, ánh sáng, phosphate vơ cơ và thành phần mơi trƣờng ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất prodigiosin (Heinemann và cộng sự, 1970; Sole và cộng sự, 1994; Rjazantseva và cộng sự, 1995; Williamson và cộng sự, 2005). Quá trình sản xuất prodigiosin trong Serratia marcescens rất nhạy cảm với nhiệt độ và bị ức chế đáng kể ở nhiệt độ cao hơn 37°C (Giri và cộng sự, 2004). Hơn nữa, mơi trƣờng thơng thƣờng đƣợc sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi các chủng Serratia marcescens là mơi trƣờng phức tạp và rất giàu dinh dƣỡng 34
Đồ án tốt nghiệp (Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004). Một số chất dinh dƣỡng nhƣ thiamine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan trọng đối với sản xuất prodigiosin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự, 1977), adenosine triphosphate và ribose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại cĩ tác dụng ức chế sản lƣợng prodigiosin. Hình 1.7. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009) Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của Serratia marcescens trên các mơi trƣờng khác nhau nhƣ: mơi trƣờng hạt mè, nutrient broth và peptone glycerol broth, Các mơi trƣờng cũng đƣợc so sánh tốc độ tăng trƣởng và khả năng xuất prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau. Các thí nghiệm này cũng giúp quan sát vai trị của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần trong hạt cĩ thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều prodigiosin hơn. Trên mơi trƣờng peanut broth thì prodigiosin cĩ thể tổng hợp ở nhiệt độ 37oC trong khi trên các mơi trƣờng nhƣ nutrient broth, peptone glycerol broth cĩ hoặc khơng cĩ bổ sung đƣờng cũng khơng thể làm đƣợc điều này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). 35
Đồ án tốt nghiệp Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bởi glucose và các loại đƣờng khác do sự giảm pH trong canh trƣờng nuơi cấy Khanafari và cộng sự, 2006). Bên cạnh đĩ, cĩ thể xét đến vai trị của nguồn carbon trong quá trình sản xuất sắc tố. Điểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ bản là mơi trƣờng này khơng cĩ nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose làm tăng cƣờng việc sản xuất sắc tố, trong trƣờng hợp sử dụng mơi trƣờng sesame broth thì nguồn carbon ở dạng các acid béo. Maltose và glucose đƣợc thêm vào nutrient broth làm tăng gấp đơi năng suất so với chỉ sử dụng mơi trƣờng nutrient broth hoặc peptone glycerol broth. Điểm thứ hai là sự sản xuất sắc tố đƣợc tăng cƣờng trong mơi trƣờng peptone glycerol broth ở 30oC và trong nutrient broth ở 28oC, điều này cĩ thể là do sự hiện diện của glycerol nhƣ là một nguồn carbon. Rõ ràng trong thực tế nguồn carbon giúp hỗ trợ tăng trƣởng tế bào và sản xuất prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Ngồi ra, một báo cáo đã chứng minh việc bổ sung silica gel vào mơi trƣờng lỏng của Serratia marcescens cũng dẫn đến sự tăng trƣởng tế bào, sản xuất prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng sự, 2001). Hơn nữa, prodigiosin thƣờng nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn nhƣ SDS và mơi trƣờng nuơi cấy cũng cĩ thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin (Feng và cộng sự, 1982; Wei và Chen, 2005). 36
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.5. So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các mơi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009). 37
Đồ án tốt nghiệp 1.4.3. Điều kiện tổng hợp prodigiosin Helvia và cộng sự (2010), đã tối ƣu hĩa quá trình sản xuất proodigiosin bởi Serratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nƣớc thải từ cơng nghiệp chế biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho thấy Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l. Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hĩa sản xuất prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigiosin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ƣu cho việc sản xuất prodigiosin trong mơi trƣờng Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và quá trình chiết xuất prodigiosin đƣợc thực hiện bằng ethanol: hydrochloric acid (9,5: 0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngồi ra, prodigiosin thu nhận đƣợc cĩ tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm. Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin cĩ khả năng kháng khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh nhƣ Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp.,hơn nữa, prodigiosin cĩ khả năng chống oxy hĩa ở nồng độ 22,05 μg/ml và cĩ tiềm năng nhuộm, cùng với việc khơng bị ảnh hƣởng bởi acid, kiềm , chất tẩy rửa, mà cĩ thể ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành cơng nghiệp trị liệu. Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất prodigiosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các mơi trƣờng dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và cĩ thể sử dụng để nhuộm bơng tạo ra màu đẹp. San và cộng sự (2012), đã sử dụng chất thải chế biến thủy sản nhƣ một nguồn carbon và nitơ để sản xuất prodigiosin từ Serratia marcescens TKU011. Hơn nữa, nghiên cứu của các tác giả này cũng cho thấy prodigiosin cĩ khả năng diệt cơn trùng. 38
Đồ án tốt nghiệp Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ Alteromonas sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml. Bên cạnh đĩ, Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 μg/ml. 1.4.4. Thu nhận, tinh sạch và định lượng prodigiosin 1.4.4.1. Thu nhận và tinh sạch Các sắc tố khơng tan trong nƣớc mà tan trong dầu thƣờng đƣợc chiết xuất bằng dung mơi hữu cơ pha nƣớc nhƣ: acetone, methanol, ethanol, hoặc các hỗn hợp của các dung mơi, để giúp các dung mơi này hoạt động tốt hơn. Chiết xuất thƣờng cĩ chứa một lƣợng nƣớc đáng kể, do đĩ, cĩ thể đƣợc loại bỏ bằng cách phân lớp nhờ hexane, petroleum ether, diethyl ether, dichloromethane hoặc hỗn hợp các dung mơi. Sắc ký, quang phổ hấp thụ ở vùng khả kiến là cơ sở đầu tiên dùng để xác định các chất màu. Quang phổ sẽ đƣợc thực hiện, lƣu giữ và sau đĩ tiến hành so sánh với các phổ chuẩn (Amaya. 2001). Các tiêu chuẩn tối thiểu sau đây đƣợc đề xuất là nên thực hiện để xác định một hợp chất chƣa biết (Liaaen-Jensen, 1971; Pfander và cộng sự, 1994). Phổ khả kiến (휇max ). Sắc ký lớp mỏng (Rf). Sắc ký lỏng cao áp (thời gian lƣu mẫu). Phƣơng pháp phổ khối (khối lƣợng phân tử). NMR (chuyển hĩa về mặt hĩa học). 39
Đồ án tốt nghiệp Các nhà khoa học đã thực hiện nhiều nghiên cứu về quá trình thu nhận và tinh sạch prodigiosin nhƣ sau: Prodigiosin (2-metyl-3-pentyl-6 methoxyprodigiosene) đƣợc chiết xuất từ mơi trƣờng nutrient broth nuơi cấy Serratia marcescens sau 72 giờ, với ethanol và petroleum ether, tiếp theo loại bỏ dung mơi trong một cốc nƣớc sơi (hay trong một bể cách thủy) và hịa tan phần cịn lại vào 50% ethanol (Rosenzweig và Stotzky, 1980). Các sắc tố từ tế bào của Serratia marcescens phân lập từ đất đƣợc chiết xuất bằng acetone, hịa với một ít ethyl acetate, và đƣợc sấy khơ bằng natri sulfat. Các chất chiết xuất đƣợc hịa tan và đƣợc thực hiện quét từ bƣớc sĩng 200 – 700 nm. Hỗn hợp dung mơi dichloromethane, chloroform và acetone với tỷ lệ 2,5: 2,5: 0,5 đã đƣợc sử dụng để tách một cách hiệu quả các tạp chất từ chiết xuất cùng với các sắc tố bằng sắc ký lớp mỏng. Cột silica cĩ kích thƣớc từ 80 – 100 mesh đã đƣợc sử dụng để phân tách các tạp chất khơng màu từ các sắc tố. Mẫu tinh khiết cho thấy cĩ độ hấp thụ cao duy nhất tại 535 nm trong quang phổ UV. Nĩ đƣợc tiếp tục phân tích để xác định trọng lƣợng phân tử bằng việc sử dụng máy quang phổ khối. Các sắc tố prodigiosin tinh khiết đƣợc đem phân tích quang phổ khối cho thấy chúng cĩ trọng lƣợng phân tử là 324 Da (Giri và cộng sự, 2004). Prodigiosin đƣợc chiết xuất bằng cách lắc mơi trƣờng nuơi cấy tế bào Serratia marcescens 2170 với methanol cĩ tính acid (1ml dung dịch HCl 1N: 24 ml methanol) và dịch trong suốt đƣợc làm cho bay hơi trong chân khơng. Sắc ký lỏng cao áp của các chiết xuất đƣợc thực hiện trên silica gel với dung mơi chloroform và methanol. Các sắc tố thu đƣợc sẽ đƣợc rửa giải trong methanol và phân tích bởi phƣơng pháp phổ khối (ESI-MS). Sau đĩ, các sắc tố chƣa tinh khiết đã thu đƣợc sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện phƣơng pháp HPLC. Một cột đảo pha Nucleosil C18 (250x4 mm, 10 m) đã đƣợc sử dụng với một gradient tuyến tính 0% đến 100% trong 30 phút (A: 10mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% acetonitrile). Việc rửa giải đƣợc theo dõi bằng cách sử dụng 40
Đồ án tốt nghiệp cả hai máy dị UV diode-array và ESI-MS (Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003). Sau khi lên men Serratia marcescens phân lập từ đất, canh trƣờng đƣợc lấy từ những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đĩ, 1 lít ethanol 95% (v/v) đã acid hĩa (pH 3,0) đƣợc thêm vào IAB. Các sắc tố đƣợc chiết xuất bằng cách sử dụng một vịng trịn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vịng trong 5 giờ, rồi đem cơ đặc và ly tâm. Sau đĩ, nĩ đƣợc thu bằng cách sử dụng nƣớc và chloroform để tách pha. Prodigiosin màu đỏ đi vào chiếm hết chỗ ở phía dƣới của pha chloroform và đƣợc cơ đặc bằng cách cho bốc hơi. Prodigiosin đƣợc phân tách bằng sắc ký cột silica gel (2,5 × 30 cm). Nĩ đƣợc rửa với một hỗn hợp hexane: ethyl acetate (2: 1, v/v). Các sắc tố cơ đặc đã đƣợc tách ra bởi việc sử dụng hỗn hợp chloroform: methanol 95:5 (v/v) trong TLC. Sau đĩ, màu đỏ duy nhất của prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã đƣợc thu nhận và hịa tan trong acetone. Các sắc tố chƣa tinh khiết sẽ tiếp tục đƣợc thực hiên phƣơng pháp TLC (với tỷ lệ dung mơi chloroform: methanol: diethyl ether là 6: 2: 2), và cuối cùng là tinh chế bằng HPLC (với cột C18 (2,5×10 cm)). Sau đĩ, nĩ đƣợc tách rửa với hỗn hợp methanol: nƣớc (7:3, v/v) đã đƣợc điều chỉnh pH= 3,0 bằng 0,1N HCl với tốc độ dịng chảy là 20 ml/ phút. Một lƣới thép khơng gỉ lớn với kích thƣớc lỗ 0,5 cm đã đƣợc sử dụng nhƣ sự hỗ trợ cho chất hấp phụ bên trong. Nồng độ của các prodigiosin đỏ sản xuất ra đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ ở 535 nm sử dụng chùm quang phổ tia UV khả kiến trong methanol đã đƣợc acid hĩa (0,01N HCI 4ml + 96ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khối lƣợng phân tử của chất màu tinh khiết đƣợc xác định bằng việc sử dụng quang phổ khối. Các 1 13 H- và C-NMR của các mẫu màu đƣợc ghi nhận sau khi hịa tan trong CDCl3. Các dịch chuyển hĩa đã đƣợc đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu. Phổ FT-IR của các sắc tố đƣợc ghi nhận (Song và cộng sự, 2006). 41
Đồ án tốt nghiệp 1.4.4.2. Định lượng Mẫu tinh khiết của prodigiosin cho thấy nĩ cĩ độ hấp thụ cao và duy nhất tại bƣớc sĩng 535nm trong quang phổ UV (Giri và cộng sự, 2004). Chính vì vậy, nồng độ của các prodigiosin đỏ sản xuất ra đƣợc thu nhận trong methanol đã acid hĩa (với 0,01N HCI 4ml và 96ml methanol) sẽ đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ ở bƣớc sĩng 535 nm và sử dụng quang phổ UV khả kiến (Goldschmidt và Williams, 1968). Tổng số các sắc tố đƣợc ƣớc tính theo cơng thức sau (Chen và cộng sự, 2006; Williams và cộng sự, 1960): TP(µg/L)= Trong đĩ: TP: Biểu thị tổng số sắc tố thu đƣợc (μg/L). A: Độ hấp thụ của sắc tố đƣợc chiết xuất trong methanol ở 535 nm. D: Hệ số pha lỗng. V1: Thể tích methanol bổ sung vào. V2: Thể tích canh trƣờng ban đầu. 7.07×104 : Hệ số hấp thụ của prodigiosin. 1.5 Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens Trong nhiều thập kỷ qua, prodigiosin đƣợc biết đến là một hợp chất tự nhiên cĩ thể gây độc tế bào (Furstner, 2003) và đƣợc sản xuất bởi các vi sinh vật nhƣ Vibrio psychroerythrus (D’Aoust và Gerber,1974), Serratia marcescens, Pseudomonas magnesiorubra và một số vi khuẩn khác (Lewis và Corpe, 1964). Đặc trƣng của Serratia marcescens là sản xuất sắc tố đỏ khơng cĩ khả năng khuếch tán prodigiosin nên cĩ khuẩn lạc với màu đỏ rất đẹp (Kalesperis và cộng sự, 42
Đồ án tốt nghiệp 1975; Gargallo và cộng sự, 1987; Gargallo-Viola, 1989). S. marcescens cũng là một tác nhân gây bệnh cơ hội ở ngƣời với những chủng khơng sản xuất sắc tố gây đe dọa sức khỏe cộng đồng (Gargallo-Viola, 1989). Những chủng sản xuất sắc tố phân lập từ tự nhiên ít liên quan đến nhiễm trùng và thật thú vị là những sắc tố đỏ khơng tan trong nƣớc này lại đƣợc báo cáo là cĩ hoạt tính kháng sinh (Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji và cộng sự, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Các prodigiosin tốt nhất đƣợc biết đến là một chất màu đỏ nondiffusible gắn với lớp màng bên trong tế bào (Iranshahi và cộng sự, 2004). S. marcescens cũng sản xuất một chất hịa tan trong nƣớc, cĩ màu đỏ hồng-tím superoxidase dismutase (Hardjito và cộng sự, 2002). Ở S. marcescens khuẩn lạc rất nhỏ và ban đầu khơng cĩ màu, màu đầu tiên xuất hiện gần đƣờng kính khuẩn lạc khoảng 1mm (Haddix và Werner, 2000). S. marcescens chỉ tổng hợp sắc tố trong một điều kiện nhất định. Bizio và Sette đã phân lập đƣợc sắc tố đỏ sản xuất bởi các chủng Serratia và cố gắng sử dụng nĩ nhƣ là một loại thuốc nhuộm cho mục đích thƣơng mại. Tuy nhiên, ở dạng tinh khiết nĩ quá nhạy cảm với ánh sáng khi đƣợc sử dụng thực tế (Furstner, 2003). Serratia, giống các vi sinh vật họ Enterobacteriaceae khác, cĩ thể phát triển tốt trong điều kiện mơi trƣờng kỵ khí và hiếu khí. Nĩ phát triển tốt trên các mơi trƣờng tổng hợp, sử dụng các hợp chất khác nhau nhƣ một nguồn carbon duy nhất. Giri và cộng sự (2004) đã thực hiện thử nghiệm trên một loạt các mơi trƣờng và phát hiện ra trên mơi trƣờng từ hạt đậu phộng làm tăng một lƣợng đáng kể prodigiosin. Hơn nữa, một báo cáo chứng minh việc bổ sung silica gel vào mơi trƣờng lỏng của S. marcescens cũng dẫn đến sự tăng trƣởng tế bào, sản xuất prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng sự,2001). Ngồi ra, prodigiosin thƣờng nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn nhƣ sodium dodecyl sulface (SDS) cũng cĩ thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin (Wei và Chen, 43
Đồ án tốt nghiệp 2005). Hardjito và cộng sự (2002) báo cáo rằng việc sản xuất sắc tố bởi chủng phi lâm sàng (non-clinical) cĩ ý nghĩa khoa học và quan trọng, cĩ một mối quan hệ giữa quá trình sản xuất sắc tố với sự vắng mặt của plasmid. Do đĩ, sản xuất sắc tố do chủng phi lâm sàng của S. marcescens đã đƣợc quan tâm nghiên cứu sâu hơn để xác định mối quan hệ của quá trình sản xuất sắc tố và khả năng gây bệnh. Đặc điểm sắc tố của S. marcescens cũng khác nhau (Hardjito và cộng sự, 2002), chịu ảnh hƣởng của cả hai yếu tố di truyền và mơi trƣờng. Sản xuất các sắc tố tan trong nƣớc đƣợc tăng cƣờng bằng cách bổ sung polymyxin B (Suzuki và cộng sự, 2001), gramicidin và valinomycin vào mơi trƣờng tăng trƣởng (Hardjito và cộng sự, 2002). Khơng nghi ngờ gì nữa, sản xuất sắc tố bởi S. marcescens sẽ tiếp tục hấp dẫn các nhà vi sinh vật học, bác sĩ và kỹ sƣ cơng nghệ sinh học. Gần đây, prodigiosin đã đƣợc xem là hiệu quả nhƣ một tác nhân kiểm sốt sinh học với tảo cĩ hại trong mơi trƣờng biển tự nhiên, do đĩ, prodigiosin phải sản xuất với số lƣợng lớn để cĩ thể đáp ứng nhu cầu trong tƣơng lai (Someya và cộng sự, 2001). 44
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm 2.1.1. Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 25/05/2015 đến ngày 15/08/2015. 2.1.2. Địa điểm Phịng Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học, Khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực phẩm - Mơi trƣờng, Trƣờng Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn vi sinh vật Nguồn vi khuẩn thử nghiệm là chủng Serratia marcescens_SH1 do Nguyễn Hồng Anh Kha phân lập từ tuyến trùng diệt sâu (EPN) Heterorhabditis indica CP 16 (H.CP 16) tại phịng Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học, khoa Cơng nghệ Sinh học-Thực phẩm-Mơi trƣờng, Đại học Cơng nghệ TP. HCM, đƣợc định danh bằng phƣơng pháp sinh học phân tử cĩ số đăng kí trên genbank là KF534508.1. Vi khuẩn sử dụng đồng nuơi cấy gồm Bacillus sb, E. coli do phịng thí nghiệm khoa Cơng nghệ Sinh học - Thực phẩm - Mơi trƣờng cung cấp. 2.2.2. Mơi trường nuơi cấy và hĩa chất sử dụng 2.2.2.1. Mơi trường nuơi cấy ( thành phần mơi trƣờng xem phụ lục) - Mơi trƣờng Nutrient agar (NA); 45
Đồ án tốt nghiệp - Mơi trƣờng Nutrient broth (NB); - Mơi trƣờng Peptone glycerol broth (PG); - Mơi trƣờng huyền phù đậu phộng, pepton, dầu hƣớng dƣơng (MT3); - Mơi trƣờng huyền phù đậu phộng, pepton, dầu hƣớng dƣơng, muối NaCl (MT4). 2.2.2.2. Hĩa chất sử dụng - NaCl; HCl; NaOH; H2SO4 - Pepton, meat extract, agar - Nƣớc muối sinh lý 0,85%; nƣớc muối bão hịa - Ethanol 96%; Petrolium ether; Bismuth nitrate; KI; Ether; Acetic acid; Aceton; - Coomassie brilliant blue; Methanol; N-hexan; Etyl Acetate 2.2.2.3. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị Nồi tiệt trùng Autoclave, cân kỹ thuật, cân phân tích, máy lắc, máy ly tâm, máy đo độ hấp thụ quang học, tủ lạnh thƣờng, tủ cấy vơ trùng, tủ ấm, kính hiển vi Dụng cụ Cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức, pipet, micropipet, ống nghiệm, đĩa petri, Eppendorf, vi quản, bản mỏng TLC, đũa thủy tinh, que cấy,cuvet thủy tinh, đèn cồn 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phƣơng pháp luận 46
Đồ án tốt nghiệp Dựa trên mục tiêu đề tài “Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin, cũng nhƣ phƣơng pháp thu hồi sắc tố thơ”, các nội dung nghiên cứu đã đƣợc đề ra với các phƣơng pháp luận nhƣ sau: Khảo sát chủng Serratia marcescens SH1 xem xét độ thuần khiết, khảo sát kháng sinh đồ so sánh chủng sử dụng với cơng bố về các chủng cĩ khả năng gây bệnh. Cải tiến điều kiện nuơi cấy Serratia marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin: tăng thể tích lên men, ảnh hƣởng của vận tốc lắc, pH nuơi cấy, nồng độ muối NaCl, thử áp dụng phƣơng pháp đồng nuơi cấy tăng hợp chất thứ cấp, thử áp dụng bổ sung dịch nuơi cấy vi khuẩn Gram âm chứa phân tử tín hiệu Quorum sensing. Prodigiosin là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp thƣờng trễ hơn pha tăng trƣởng tế bào. Điều kiện nuơi cấy quyết định nồng độ prodigiosin tổng hợp. Nghiên cứu này dựa trên các báo cáo trƣớc đĩ của các tác giả cùng nhĩm (sinh viên năm trƣớc) và ngồi nƣớc để cải thiện điều kiện nuơi cấy cho chủng phân lập của phịng thí nghiệm. Thiết lập quy trình trích ly sắc tố thơ từ canh trƣờng nuơi cấy đáp ứng yêu cầu tăng hiệu suất trích ly, tiết kiệm dung mơi và an tồn sinh học. 2.4 Bố trí thí nghiệm Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ trên hình 2.1 47
Đồ án tốt nghiệp Chủng VK SH1 Khảo sát thể tích lên men và vận tốc lắc trong nuơi cấy. Kiểm tra độ thuần khiết và khuẩn Xác định pH nuơi 1. Khảo sát chủng nuơi định S. marcescens cấy. cấy. Kháng sinh đồ Ảnh hƣờ ng của nồng độ muối 2. Cải tiến điều kiện lên NaCl men thu prodigiosin Xác định tỷ lệ dung Kh ảo sát sự ảnh 3. Thu hồi prodigiosin từ mơi trích ly hƣở ng của phƣơng pháp canh trƣờng đồng nuơi cấy. Cải thiện quá trình trích ly nhờ Kh ảo sát sự ảnh tiền xử lý gia hƣởng của sản nhiệt. phẩm Quorum Prodigiosin thơ (sắc tố sensing. thơ – STT) Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 48
Đồ án tốt nghiệp 2.5.1 Khảo sát chủng nuơi cấy 2.5.1 Kiểm tra độ thuần khiết Khảo sát hình thái khuẩn lạc Cấy ria chủng vi khuẩn SH1 đã đƣợc phân lập trên mơi trƣờng NA. Dùng dao sắc, nhỏ, cắt một miếng thạch mỏng, mép cắt sát với mép khuẩn lạc. Quan sát dƣới kính hiển vi ở hai gĩc độ là từ trên xuống và soi nghiêng ở vật kính 4X và 10X. 2.5.2 Kháng sinh đồ Sau khi kiểm tra độ thuần khiết, ngƣời thực hiện đề tài gửi chủng vi khuẩn đến cơng ty Nam Khoa, 793/58 Trần Xuân Soạn - Phƣờng Tân Hƣng Quận 7 - Thành phố HCM - Việt Nam để khảo sát kháng sinh đồ. Sử dụng các kháng sinh amoxicillin- clavulanic acid, ampicillin, tetracycline, cefuroxime và cefotaxime,ciprofloxacin, amikacin, ertapenem, ceftazidime, chloramphenicol, imipenem, trimethoprim/sulfamethoxazole, cefepime, piperacillin/tazobactam, gentamicin khuếch tán vào thạch Mueler-hinton. Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ theo Enterobacteriaceae đƣợc trình bày ở bảng 1 phần phụ lục. 2.6 Xác định điều kiện lên men 2.6.1 Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên nồng độ prodigiosin tổng hợp Lên men đƣợc thực hiện trong bình tam giác với các nghiệm thức: đối chứng: 20 ml/bình, thí nghiệm 200 ml/bình và 400 ml/bình. Thí nghiệm lặp lại ba lần. Cách tiến hành Bƣớc 1 (nhân giống): từ ống thạch nghiêng đã kiểm tra đổ tinh khiết cũng nhƣ khẳng định là S. marcescens SH1, tiến hành nhân giống trong mơi trƣờng Nutrient broth trong 24, lắc 150 vịng/phút, ủ tối, nhiệt độ phịng. 49
Đồ án tốt nghiệp Bƣớc 2. Chuẩn bị mơi trƣờng lên men MT3 thành phần trong phụ lục 1 với thể tích nhƣ nêu trên. Đem hấp khử trùng trong 15’ ở áp suất 1 atm, nhiệt độ 1210C. Bƣớc 3: Cấy giống vi khuẩn thu từ canh trƣờng ở bƣớc 1, pha lỗng sao cho OD 600 nm ≈ 0,7 vào mơi trƣờng MT3 với tỷ lệ giống 3%. Lắc 200 vịng/phút ở 24h đầu, 150 vịng/phút ở 24h sau với nghiệm thức 20 ml/bình và lắc thêm 150 vịng/ phút với nghiệm thức 200 ml/bình và 400 ml/bình. Bƣớc 4: thu canh trƣờng, tiến hành trích ly theo sơ đồ trích ly hình 2.2 với tỷ lệ canh trƣờng : dung mơi (Ethanol : HCl 1N (95:5; v:v)) 1:2 (A:B 1:2). 50
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2 Sơ đồ trích ly 51
Đồ án tốt nghiệp Sau khi trích ly, loại bỏ dịch trong, gom dịch 1, dịch 2 và dịch 3 vừa trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng λ=535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. 2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc trong nuơi cấy Ngƣời thực hiện đề tài khảo sát vận tốc lắc cho bình lên men với thể tích 400 ml/bình ở các chế độ lắc đƣợc trình bày trên bảng 2.1 Bảng 2.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của máy lắc và chế độ lắc. Thí nghiệm Ngày Loại máy lắc Tốc độ (vịng/phút) 1 Máy lắc ngang 180 Nghiệm thức 1 2 Máy lắc ngang 150 3 Máy lắc vịng 150 1 Máy lắc ngang 180 2 Máy lắc ngang 150 Nghiệm thức 2 3 Máy lắc ngang 150 4 Máy lắc vịng 150 1 Máy lắc ngang 180 Nghiệm thức 3 2 Máy lắc ngang 150 52
Đồ án tốt nghiệp 3 Máy lắc ngang 150 4 Khơng sử dụng 0 1 Máy lắc vịng 200 Nghiệm thức 4 2 Máy lắc vịng 150 3 Máy lắc vịng 150 1 Máy lắc vịng 200 Nghiệm thức 5 2 Máy lắc vịng 200 3 Máy lắc vịng 200 Cách tiến hành, trích ly sắc tố và xác định hàm lƣợng prodigiosin nhƣ trong thí nghiệm 2.6.1. 2.7.2 Xác định pH tối ưu cho mơi trường lên men Chuẩn bị mơi trƣờng lên men MT3 với thể tích 20 ml/bình, điều chỉnh pH ≈ 7.2 lặp lại cho 3 bình thí nghiệm và 3 bình khơng điều chỉnh pH làm đối chứng. Đem hấp khử trùng trong 15’ ở áp suất 1 atm, 1210C. Các bƣớc nhân giống, lên men và xác định hàm lƣợng prodigiosin tiến hành giống thí nghiệm 2.6.1 lắc 200 vịng/phút ở 24h đầu và 150 vịng/phút ở 24h sau. 2.7.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl Các bƣớc nhân giống và lên men tiến hành giống thí nghiệm 2.6.1 lắc 200 vịng/phút ở 24h đầu và 150 vịng/phút ở 24h sau, điều chỉnh pH phù hợp với kết quả 53
Đồ án tốt nghiệp của thí nghiệm 2.7.2. Bổ sung nồng độ muối NaCl tỷ lệ với thể tích canh trƣờng lên men lần lƣợt là 0% (đối chứng), 1%, 2%, 3%, lặp lại 3 lần với mỗi nghiệm thức. Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. Đo pH canh trƣờng sau nuơi cấy, xác định nồng độ NaCl cho nồng độ prodigiosin tổng hợp cao nhất trong tƣơng quan với pH sau nuơi cấy. 2.7.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của phương pháp đồng nuơi cấy 2.7.4.1 Thí nghiệm đồng nuơi cấy với vi khuẩn Bacillus subtilis Cách tiến hành Bƣớc 1 ( nhân giống Serratia marcescens SH1) từ ống thạch nghiêng đã kiểm tra độ tinh khiết cũng nhƣ khẳng định là S. marcescens SH1, tiến hành nhân giống trong mơi trƣờng NB trong 24h, lắc 150 vịng/phút, ủ tối, nhiệt độ phịng. Nhân giống cho vi khuẩn Bacillus subtilis: từ ống thạch nghiêng đã đƣợc cấy thuần, tiến hành nhân giống trong mơi trƣờng NB trong 24h, lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ phịng. Bƣớc 2: Thu canh trƣờng, pha lỗng sao cho OD 600 nm ≈ 0,7. Cấy giống vào MT4 (MT3 + %NaCl ở thí nghiệm 2.6.3 đƣợc điều chỉnh pH tối ƣu khảo sát ở thí nghiệm 2.6.2) với các nghiệm thức nhƣ sau: Đối chứng: Cấy giống vi khuẩn S. marcescens vào mơi trƣờng MT4, tỷ lệ giống 3% . Nghiệm thức S/B = 2/1: Cấy giống đồng thời hai giống vi khuẩn S. marcescens tỷ lệ 3 % và vi khuẩn Bacillus subtilis tỷ lệ 1,5%. 54
Đồ án tốt nghiệp Nghiệm thức S/B = 1/1: Cấy giống đồng thời hai giống vi khuẩn S. marcescens tỷ lệ 3 % và vi khuẩn Bacillus subtilis tỷ lệ 3%. Nghiệm thức S/B = 1/2: Cấy giống đồng thời hai giống vi khuẩn S. marcescens tỷ lệ 3 % và vi khuẩn Bacillus subtilis tỷ lệ 6%. Bƣớc 3: lắc 200 vịng/phút ở 24h đầu và 150 vịng/phút ở 24h sau, ủ tối, nhiệt độ phịng. Sau 48h thu canh trƣờng, tiến hành trích ly theo sơ đồ hình 2.2 nhƣ trong thí nghiệm 2.6.1. Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. 2.7.4.2 Thí nghiệm đồng nuơi cấy với vi khuẩn Echerichia coli Các bƣớc tiến hành thực hiện giống thí nghiệm 2.7.4.1 và thay chủng vi khuẩn Bacillus subtilis là vi khuẩn gram + bằng vi khuẩn gram – E. coli. 2.7.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của sản phẩm Quorum sensing. Bƣớc 1 ( nhân giống cấp 2): từ ống thạch nghiêng đã kiểm tra độ tinh khiết cũng nhƣ khẳng định là S. marcescens SH1, tiến hành nhân giống cấp 2 trong mơi trƣờng NB trong 24h, lắc 150 vịng/phút, ủ tối, nhiệt độ phịng. Bƣớc 2: lên men S. marcescens mơi trƣờng MT5 (đậu phộng 10%+ peptone 5% + dầu hƣớng dƣơng 1% + 10ml H2O cất + % NaCl tối ƣu khảo sát ở thí nghiệm 2.7.3 và điều chỉnh pH thích hợp theo thí nghiệm 2.7.2), tỷ lệ cấy giống 3%. Đối chứng: MT5 + 10ml nƣớc cất. Nghiệm thức 1: MT5 + 10ml dịch nuơi cấy S. marcescens đã loại bỏ tế bào. Nghiệm Thức 2: MT5 + 10 ml dịch nuơi cấy E. coli đã loại bỏ tế bào. 55
Đồ án tốt nghiệp Bƣớc 3: lắc 200 vịng/phút ở 24h đầu và 150 vịng/phút ở 24h sau, ủ tối, nhiệt độ phịng. Sau 48h thu canh trƣờng, tiến hành trích ly theo sơ đồ hình 2.2. Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. 2.8 Thu hồi sản phẩm thơ 2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung mơi đồng thời khảo sát thể tích lên men Trích ly sắc tố bằng dung mơi Ethanol : HCl (95:5) với tỷ lệ canh trƣờng : dung mơi (A:B) nhƣ các nghiệm thức sau 2:3, 1:2, 2:5. Trích ly theo sơ đồ hình 2.1 ở thí nghiệm 2.6.1. Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. 2.8.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ Các bƣớc tiến hành lên men thực hiện tƣơng tự thí nghiệm 2.6.1 Sau đĩ gia nhiệt canh trƣờng ở 1000C, 15 phút. Tiến hành trích ly theo sơ đồ hình 2.2. Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. 2.9 Các phƣơng pháp phân tích Phân tích prodigiosin Quang phổ hấp thụ UV/VIS, thiết bị đo mật độ quang. Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp chất và giá trị đo OD tại bƣớc sĩng λ =535 nm. 56
Đồ án tốt nghiệp 2.9.1 Xác định protein cĩ trong mẫu 2.9.1.1 Phản ứng Biuret’s test Hút 1 ml mẫu thêm 5-8 giọt NaOH 10% sau đĩ thêm 1-2 giọt CuSO4 3%. Đem đun cách thủy từ 1-2 phút. Nếu dƣơng tính (+) sẽ tạo phức màu tím và ngƣợc lại. 2.9.1.2 Phản ứng Nynhydrin Hút 1ml mẫu vào ống nghiệm sau đĩ thêm 1ml nynhydrin 1%, đun nĩng 1-2 phút. Mẫu sau khi đun nĩng cĩ màu tím thì đƣợc xem là dƣơng tính (+). 2.9.2 Xác định lipid cĩ trong mẫu Chấm mẫu trên bản mỏng sắc ký. Dùng CBB (Coomassie brilliant blue) 0.03% trong methanol 20% xịt và sấy 100oC. Mẫu cĩ màu xanh trên nền sáng đƣợc coi là cĩ lipid trong mẫu. 2.10 Sắc ký bản mỏng TLC Sử dụng dung mơi Petrolium ether: Ether : Acetic acid (70:40:2, v:v:v) và bản mỏng silica gel. Chuẩn bị bản sắc ký Dùng bút chì và thƣớc kẻ vạch đƣờng xuất phát để chấm mẫu cách mép dƣới 2cm và vạch kết thúc cách mép trên bản sắc ký 0,5 cm (Hình ). Lƣu ý: khơng chạm tay lên bản silicagel. Dùng bút chì vạch và chấm nhẹ lên bản silicagel tránh trầy xƣớc lớp silicagel. 57
Đồ án tốt nghiệp Vạch kết 0,5 cm thúc Vạch xuất phát 2 cm Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký Mẫu sắc tố đƣợc chấm lên bản sắc ký theo vị trí đã đƣợc xác định trên vạch xuất phát. Dùng vi quản để chấm mẫu. Mẫu chấm phải gọn, khơng lan rộng, cĩ thể dùng máy sấy để làm khơ ngay. Chấm lặp lại nhiều lần để số lƣợng mẫu nạp đủ mức cần thiết. Tiến hành chạy sắc ký Tiến hành cho mẫu chạy sắc ký với hệ dung mơi trên. Cho bản sắc ký vào buồng sắc ký chứa sẵn dung mơi. Đảm bảo dung mơi tiếp xúc gần sát vạch xuất phát. Đậy nắp bình để tránh thất thốt dung mơi và tránh ảnh hƣởng đến sức khỏe. Dung mơi sẽ thấy lên bản sắc ký theo lực mao dẫn và phân tách các thành phần của mẫu. Chấm dứt chạy sắc ký khi dung mơi thấm đến vạch kết thúc. 58
Đồ án tốt nghiệp 2.11 Phƣơng pháp phân tích 2.11.1. Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin Mục đích Xác định đƣợc lƣợng hợp chất prodigiosin cĩ trong mẫu từ đĩ đƣa ra kết luận cho thí nghiệm. Nội dung Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp chất và giá trị đo OD tại bƣớc sĩng λ =535 nm. 2.11.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê Các số liệu thơ đƣợc xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion XV. Các số liệu sau đĩ đƣợc phân tích ANOVA và đƣợc trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05. Các số liệu đƣợc tính tốn và xử lý trên phần mềm Microsoft Office Excel 2010. Các biểu đồ cũng đƣợc thể hiện bằng phần mềm này. 59
Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả kiểm tra độ thuần khiết Hình thái khuẩn lạc Chủng S. marcescens SH1 sau khi nuơi cấy trên mơi trƣờng NA (hình 3.1) tạo khuẩn lạc đặc trƣng trịn, lồi, màu đỏ, cĩ quầng sáng bao quanh. Đây cũng chính là đặc điểm hình thái S. marcescens theo mơ tả của David (2002). Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuơi cấy trên mơi trƣờng NA Chủng SH1 tổng hợp sắc tố đỏ trên mơi trƣờng NA làm cho khuẩn lạc cĩ màu đỏ (Hình 3.1) nhƣ theo mơ tả của các tài liệu về khả năng tổng hợp sắc tố của Serratia marcescens (Grimont và Grimont, 2006; Anita và cộng sự, 2006; Chidambaram và cộng sự, 2009; Antony và cộng sự, 2011). 60
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng và soi nghiêng dƣới kính hiển vi vật kính 10X. Kết quả nhuộm gram Nhuộm Gram là hình thức quan sát vi thể hình thái tế bào vi sinh vật và là cách đơn giản nhất, nhanh nhất để phân biệt vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dƣơng. Kết quả hình 3.3 cho thấy chủng phân lập cĩ lớp peptidoglycan mỏng nên khơng giữ đƣợc phức hợp crystal violet – iodine sau khi tẩy cồn và tiếp tục bắt màu hồng với thuốc nhuộm fuchsin. Điều này cho thấy hai chủng phân lập đƣợc là Gram âm, phù hợp với những mơ tả về Serratia marcescens (Williams và Qadri, 1980; Grimont và Grimont, 2006; David R.C.,2012). 61
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3 Kết quả nhuộm Gram chủng SH1 Sau khi khẳng định là S. marcescens SH1, gửi mẫu cho cơng ty Nam Khoa thực hiện kháng sinh đồ đƣợc kết quả nhƣ hình 3.4. Hình 3.4 Kết quả kháng kháng sinh của chủng SH1 62
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1 Kết quả kháng kháng sinh S(Sensitivity) - Nhạy cảm: nghĩa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn cĩ thể điều trị đƣợc với liều thơng thƣờng đã đƣợc khuyến cáo. I(Intermediate) - Trung gian: là kiểu kháng trong đĩ với những nồng độ ức chế tối thiểu của một kháng sinh thƣờng đạt đƣợc trong máu và tổ chức cho đáp ứng thấp hơn so với kiểu nhậy cảm (S). Kháng trung gian phản ánh hiệu quả lâm sàng tại các cơ quan, bộ phận mà thuốc phân bố. R(Resistan) - Đề kháng: chủng vi khuẩn khơng bị ức chế bởi bất cứ nồng độ nào của thuốc mà cơ thể cĩ thể chấp nhận đƣợc. Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Mueler-hinton cĩ chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh đƣợc biểu hiện bằng đƣờng kính các vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh. Cũng giống nhƣ các chủng khác của Enterobacteriaceae, S. marcescens và các lồi Serratia khác đều kháng penicillin G, các macrolides, clindamycin, linezolid, các glycopeptide, quinupristin-dalfopristin và rifampin (Department of Pathology and Area Laboratory Services, Madigan Healthcare System, Tacoma, Washington, 2011). Hầu hết các chủng vi khuẩn thuộc chi Serratia, trong đĩ cĩ S. marcescens thƣờng kháng ampicillin, amoxicillin, amoxicillin-clavulanate, ampicillin-sulbactam, 63
Đồ án tốt nghiệp cephalosporin phổ hẹp, cephamycins, cefuroxime, nitrofurantoin và colistin (CLSI, 2011; Stock và cộng sự, 2003). Cũng theo nghiên cứu của Stock và cộng sự thì một số chủng Serratia nhƣ S. marcescens, S.odorifera, và S. rubidaea kháng nội với tetracycline. Thực tế là S. marcescens là một loại vi sinh vật đề kháng với rất nhiều loại kháng sinh đã đƣợc cơng nhận ở nhiều trƣờng hợp. Ví dụ Wheat và cộng sự, trong báo cáo chuyên đề của họ về 11 trƣờng hợp nhiễm trùng tiểu từ San Francisco vào năm 1951, sau này xác định là S. marcescens, làm viêm màng trong tim gây tử vong do kháng polymyxin B, Terramycin (oxytetracycline), chloramphenicol, streptomycin và penicillin, nhạy cảm trung bình với sulfonamid. Kết quả kháng sinh đồ ở bảng 3.1 và hình 3.4 cho thấy chủng S. marcescens SH1 kháng 3 loại kháng sinh thơng dụng là amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin, tetracycline, đúng nhƣ mơ tả ở các báo cáo trên. Sở dĩ S. marcescens SH1 kháng kháng sinh amoxicillin-clavulanic acid bởi vì amoxicilin rất dễ bị phá hủy bởi beta - lactamase, do đĩ khơng cĩ tác dụng đối với những chủng vi khuẩn sản sinh ra các enzyme này (S. marcescens SH1 thuộc chủng Enterobacteriaceae cĩ khả năng sản sinh ra enzyme này). Đối với 2 kháng sinh cịn lại là ampicillin, tetracycline là 2 kháng sinh phổ rộng thế hệ cũ chủng S. marcescens SH1 cũng gây ra tính kháng. Ngồi ra theo bảng 3.1 thì chủng S. marcescens SH1 cũng kháng yếu với kháng sinh cefuroxime và cefotaxime. Một số loại kháng sinh nhạy cảm với Serratia rất phổ biến nhƣ quinolone và trimethoprim-sulfamethoxazole. Qua khảo sát tất cả 110 chủng S. marcescens thu hồi từ các mẫu bệnh 2008-2010 đều nhạy cảm với trimethoprim-sulfamethoxazole. Nĩi chung, hầu hết các lồi Serratia rất nhạy cảm với các kháng sinh nhĩm aminoglycosides. (Stock và cộng sự, 2003). 64
Đồ án tốt nghiệp Qua bảng 3.1 và hình 3.4 thì chủng S. marcescens SH1 cĩ tính nhạy cảm với các kháng sinh ciprofloxacin, amikacin, ertapenem, ceftazidime, chloramphenicol, imipenem, trimethoprim/sulfamethoxazole, cefepime, piperacillin/tazobactam, gentamicin. Serratia marcescens SH1 là chủng đƣợc phân lập từ tuyến trùng gây bệnh cơn trùng. Việc ứng dụng chủng phân lập từ mơi trƣờng tự nhiên ứng dụng trong cơng nghệ sinh học sản xuất các sản phẩm thuốc đã đƣợc nghiên cứu và thực hành trong nhiều năm qua. Do Serratia marcescens là chủng tự thân kháng nhiều kháng sinh và nằm trong danh sách đối tƣợng vi sinh vật gây bệnh cơ hội nên các biện pháp an tồn sinh học cần đƣợc áp dụng khi nghiên cứu và sản xuất. 3.2 Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin Quá trình này đƣợc thực hiện vì các nghiên cứu trƣớc đĩ của các bài báo nƣớc ngồi cho nhiều kết quả khác nhau vì nhiều lý do, mà chủ yếu là các điều kiện mơi trƣờng. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này với mục đích tìm ra đƣợc điều kiện nuơi cấy phù hợp với mơi trƣờng phịng thí nghiệm tại Việt Nam. 3.2.1 Ảnh hưởng của thể tích lên men lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp Các thí nghiệm lên men tổng hợp prodigiosin từ S. marcescens SH1 trƣớc kia đƣợc tiến hành với quy mơ nhỏ phịng thí nghiệm, thể tích lên men là 20 ml/bình. Để cĩ thể cung cấp thơng số kỹ thuật cho quá trình lên men việc tăng thể tích thí nghiệm là tất yếu. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài thử thực hiện lên men với cùng thơng số cung cấp từ DATN Trần Lâm Tú Quyên 10DSH với quy mơ 200 ml/bình và 400 ml/bình. 65
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2 % Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp so với đối chứng (thí nghiệm A) Tỉ lệ Thí nghiệm A Thí nghiệm B Thí nghiệm C (20 ml/bình) (%) (200 ml/bình) (%) (400 ml/bình) (%) Trung bình 100 ± 0 82,9 ± 3,2 47,8 ± 3,8 Kết quả cho thấy (hình 3.5) quy mơ lên men tăng làm giảm hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp. Khi thể tích tăng từ 20 ml lên 200 ml thì hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp chỉ bằng (82,9 ± 3,2) % so với đối chứng, khi thể tích là 400 ml thì tỷ lệ này chỉ cịn (47,8 ± 3,8) % so với đối chứng. Một điểm nữa cần nhận xét là màu hồng xuất từ 24-48 giờ khi lên men 20 ml thì chỉ xuất hiện sau 48 giờ ở quy mơ lên men lớn hơn. Vì vậy thời gian lên men ở mẫu thí nghiệm là 72 giờ, tăng thêm 24 giờ so với đối chứng. Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp 66
Đồ án tốt nghiệp Phân tích nguyên nhân gây giảm hàm lƣợng prodigiosin khi tăng thể tích lên men cĩ thể dễ dàng nhận thấy yếu tố ảnh hƣởng mạnh nhất là oxy. Do mơi trƣờng đậu phộng cĩ độ nhớt cao nên nhu cầu khuấy đảo (hoặc lắc) mạnh hơn để đạt đến cùng một nhu cầu oxy cho vi sinh vật. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài khảo sát ảnh hƣởng của chế độ lắc lên khả năng tổng hợp prodigiosin trong thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2 Xác định vận tốc lắc Quá trình lên men tạo sinh khối tế bào đề thu hợp chất thứ cấp rất cần oxi để cung cấp cho vi khuẩn S. marcescens sinh tổng hợp. Khi chọn đƣợc số vịng lắc thích hợp sẽ kích thích quá trình tăng trƣởng tế bào và đồng thời sinh tổng hợp prodigiosin. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc. Thí nghiệm Prodigiosin trung bình trích ly đƣợc từ 1ml canh trƣờng lên men mg/ml 1(180N/150N/150V) 8,9 2(180N/150N/150N/150V) 1,7 3(180N/150N/150N/0) 0,0 4(200V/150V/150V) 9,1 5(200V/200V/200V) 10,6 67
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6 Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc Từ kết quả ở hình 3.6 và bảng 3.3 nhận thấy việc sử dụng máy lắc ngang và máy lắc vịng cũng nhƣ thay đổi vịng lắc cĩ ảnh hƣởng đến hàm lƣợng prodigiosin. Trong 5 nghiệm thức ta thấy sử dụng máy lắc vịng ở chế độ lắc 200/200/200 vịng/phút thu đƣợc kết quả tốt nhất. Do điều kiện cơ sở vật chất khơng cho phép nên việc lặp thí nghiệm chƣa tốt, nhƣng qua thí nghiệm kết luận đƣợc rằng việc sử dụng máy lắc vịng tốt hơn máy lắc ngang và tốt nhất ở chế độ lắc 200/200/200 vịng/phút. Mơi trƣờng đậu phộng cĩ độ nhớt cao làm tăng nhu cầu oxy cung cấp. Quy mơ lên men càng lớn thì địi hỏi lực khuấy đảo càng cao. Cũng do mơi trƣờng nhƣ vậy và màu hồng canh trƣờng xác định oxy hịa tan khơng thực hiện đƣợc bằng phƣơng pháp hĩa học nhƣ phƣơng pháp chuẩn độ iot – thiosunfat do L.W.Winkler đề xuất từ năm 1914, đã cĩ nhiều cải 68
Đồ án tốt nghiệp tiến để phù hợp với mẫu. Do đĩ nhu cầu oxy thực sự khơng xác định đƣợc, mà chỉ xác định đƣợc số vịng lắc thích hợp trong điều kiện thí nghiệm. 3.2.3 Kết quả xác định pH tối ưu cho mơi trường MT3 Quá trình tăng trƣởng của vi sinh vật rất nhạy cảm với pH, mỗi vi sinh vật thích ứng với khoảng pH khác nhau. Vì vậy, tìm ra đƣợc pH phù hợp sẽ giúp cho quá trình tăng trƣởng tế bào của vi sinh vật phát triển tốt hơn và tổng hợp hợp chất mong muốn. S. marcescens cĩ thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). Samrot và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hĩa sản xuất prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigiosin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ƣu cho việc sản xuất prodigiosin trong mơi trƣờng Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Đối với điều kiện nuơi cấy ở Việt Nam theo báo cáo đồ án tốt nghiệp của Trần Lâm Tú Quyên (2014) thì khoảng pH của S. marcescens khá rộng nên khơng bị ảnh hƣởng trong khoảng 6,2 – 8,2, nhƣng cho mật độ tế bào cao nhất ở pH=7,2 nuơi trong mơi trƣờng NB. Chính vì vậy, ngƣời thực hiện đề tài quyết định khảo sát việc chỉnh pH =7,2, trong mơi trƣờng MT3 cĩ chứa đậu phộng là mơi trƣờng tối ƣu nhất đã đƣợc kết luận trong đồ án tốt nghiệp của Trần Lâm Tú Quyên (2014), để nuơi cấy chủng vi khuẩn S. marcescens. Prodigiosin là sắc tố gắn liền với sinh khối. Vì vậy điều kiện đầu tiên cần thiết cho sinh tổng hợp prodigiosin là phát triển sinh khối. Kết quả cho thấy nếu nâng pH mơi trƣờng lên men ban đầu lên giá trị 7,2 là giá trị tối ƣu thu sinh khối S. marcescens, thì nồng độ prodigiosin tổng hợp tăng thêm 63,3 %. Điều này tƣơng tự pH tối ƣu trong mơi trƣờng peptone glycerol để tổng hợp prodigiosin là 7,5 (DATN Nguyễn Hồng Anh Kha 09DSH). 69
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu pH đầu Prodigiosin trong 1ml canh pH cuối trƣờng lên men (mg/ml) 5,63 ± 0,13 2,0 ± 0,2 (a) 7,60 ± 0,13 7,2 ± 0.00 3,3± 0,2 (b) 8,19 ± 0,03 (Các giá trị cĩ các chữ cái giống nhau ở cùng một cột thì khơng cĩ sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05) Hình 3.7 Ảnh hƣởng của pH lên sự tổng hợp prodigiosin của S. marcescens SH1. Chính vì vậy ngƣời thực hiện đề tài quyết định chỉnh pH =7,2 cho mơi trƣờng MT3 trƣớc khi nuơi cấy S. marcescens cho các thí nghiệm tiếp theo. 70
Đồ án tốt nghiệp 3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp Trong tài liệu cĩ nhiều ý kiến khác nhau về ảnh hƣởng của nồng độ muối lên sinh tổng hợp prodigiosin ở S. marcescens. Theo Sil Verman và Munoz (1973), 3% NaCl trong mơi trƣờng phức hợp chứa 10 ug/ml Fe ức chế tổng hợp prodigiosin ở S. marcescens, nhƣng ở nồng độ thấp hơn là 0,1 % NaCl lại khơng xảy ra hiện tƣợng ức chế. Theo Rjazantseva IN và cộng sự (1994) lại kết luận rằng nồng độ NaCl 4-5 % làm tăng hàm lƣợng prodigiosin do S. marcescens tổng hợp, trong khi theo Wei và cộng sự. (2005) thì khơng cĩ NaCl trong mơi trƣờng là điều kiện tổng hợp prodigiosin cao nhất. Samrot và cộng sự (2011) cho biết đối với S. marcescens SU 10 nồng độ muối tối ƣu để tổng hợp prodigiosin là 0,75%. Vì vậy thí nghiệm này nhằm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ muối lên khả năng tổng hợp prodigiosin của S. marcescens SH1 phân lập từ tuyến trùng EPN. Kết quả thí nghiệm cho thấy ở nồng độ NaCl 1% trong mơi trƣờng đậu phộng bổ sung peptone và dầu hƣớng dƣơng, hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp là cao nhất, cao hơn 52,5 % so với đối chứng khơng bổ sung muối trong mơi trƣờng. Tăng nồng độ muối lên 2 % thì hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp thấp hơn so với bổ sung 1 % NaCl nhƣng sai khác khơng cĩ ý nghĩa thống kê với (p<0,05). Nồng độ NaCl 3% làm giảm hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp, tuy nhiên khơng sai khác so với đối chứng với mức so sánh p < 0,05. Để giải thích cho ảnh hƣởng của nồng độ NaCl lên khả năng tổng hợp prodigiosin của chủng nghiên cứu, chúng tơi so sánh pH giữa các nghiệm thức cuối kỳ lên men. Mặc dù pH lúc đầu lên men đã đƣợc điều chỉnh về giá trị tối ƣu là 7,2 cho mọi nghiệm thức, nhƣng pH sau lên men giảm khi tăng nồng độ NaCl trong mơi trƣờng. Nhƣ trên bảng 3.5 và hình 3.8. 71
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung muối NaCl Nghiệm thức Prodigiosin tổng hợp (mg/ml) pH sau lên men Đối chứng 12,1 ± 0,8 (a) 8,02 ± 0,10(a) 1% 18,5 ± 2,5 (b) 7,19 ± 0,16(b) 2% 13,00 ± 4,7 (ab) 6,89 ± 0,10(c) 3% 7,7 ± 3,8 (a) 6,52 ± 0,11(d) Hình 3.8 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung NaCl. 72
Đồ án tốt nghiệp Từ bảng 3.5 quả nhận thấy ở nồng độ muối NaCl làm thay đổi pH sau khi lên men dẫn đến sự thay đổi hàm lƣợng prodigiosin trong quá trình lên men. Rõ ràng là khi bổ sung muối NaCl 1% vào mơi trƣờng lên men cho hàm lƣợng prodigiosin cao hơn mẫu đối chứng 52,5%. Khi bổ sung hàm lƣợng muối NaCl ở nồng độ càng cao thì pH càng giảm, làm mơi trƣờng cĩ tính acid điều này khơng thuận lợi cho sự phát triển của S. marcescens. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài quyết định chọn nồng độ muối 1% để bổ sung vào mơi trƣờng nuơi cấy cho các thí nghiệm sau. 3.2.5 Kết quả thí nghiệm đồng nuơi cấy Đồng nuơi cấy là phƣơng pháp gần đây thƣờng đƣợc sử dụng để kích thích sự tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở vi sinh vật (Bartrand et al., 2014). Đồng nuơi cấy tạo ra điều kiện stress sinh học lên chủng tổng hợp hợp chất thứ cấp, bắt chƣớc điều kiện trong tự nhiên. Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin cĩ thể kháng một số lồi vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012). Ngồi ra theo Nguyễn Hiếu Dân, DATN 09DSH S. marcescens SH1 đối kháng yếu Bacillus sp. và E. coli, từ đấy cĩ thể thấy hai vi khuẩn chị thị này cĩ thể gây stress đối với S. marcescens SH1. Từ đĩ chúng tơi quyết định đồng nuơi cấy S. marcescens SH1 và Bacillus sp. hoặc E. coli. 3.2.5.1 Đồng nuơi cấy với Bacillus subtilis Bacillus sp. cĩ đặc điểm phát triển là kị khí tùy nghi, khơng cạnh tranh nhiều oxy với S.marcecens. pH tăng trƣởng và sinh protease trong điều kiện pH 7-7,4. Điều kiện thí nghiệm là giữ nguyên mật độ S. marcescens SH1, chỉ thay đổi mật độ Bacillus sp. theo tỷ lệ 2:1; 1:1; và 1:2 so với S. marcescens. 73
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6 % prodigiosin tổng hợp so với đối chứng Đối chứng (%) S/B 1:2 (%) S/B 1:1 (%) S/B 2:1 (%) Prodigiosin tổng 100 ± 50,6 (a) 66,8 ± 34,5 (a) 64,6 ± 28,4 (a) 96,7 ± 22 (a) hợp (% ĐC) Hình 3.9 Đồng nuơi cấy Serratia marcescens SH1 và Bacillus sp. Hình 3.9 cho thấy đồng nuơi cấy S. marcescens SH1 với Bacillus sp giữ ngƣợc lại với kỳ vọng khơng làm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp, mà cịn cĩ xu hƣớng làm giảm mặc dù sai khác khơng cĩ ý nghĩa thống kê. Hai vi khuẩn này đều cĩ khả năng thủy phân protein, cĩ cùng điều kiện nuơi cấy. Tuy nhiên giá trị trung bình trong nghiệm thức tỷ lệ S/B = 2:1 là lớn nhất đạt 96,7 % và sai số tƣơng đối nhỏ nhất so 74
Đồ án tốt nghiệp với đối chứng và các nghiệm thức cịn lại. Điều này cũng hợp lý do tỷ lệ S. marcescens càng lớn thì khả năng cạnh tranh càng cao. Trong thiết kế thí nghiệm này chƣa thấy đƣợc hiệu quả của đồng nuơi cấy lên sự tổng hợp hợp chất thứ cấp. Cĩ thể hiệu quả này sẽ đƣợc phát huy khi giảm mật độ Bacillus sp. đến một giá trị thích hợp. 3.2.5.2 Kết quả đồng nuơi cấy vi khuẩn E. coli Sau khi tiến hành thử nghiệm ở vi khuẩn Gram dƣơng, ngƣời thực hiện đề tài tiến hành thử nghiệm ở vi khuẩn Gram âm, để tìm ra giải pháp tăng hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp. E. coli là vi khuẩn cĩ khả năng sử dụng mơi trƣờng protein và cĩ điều kiện nuơi cấy tƣơng tự S. marcescens. Tuy nhiên khi đồng nuơi cấy E. coli với S. marcescens SH1 với tỷ lệ E/S=2:1 thì hàm lƣợng sắc tố tổng hợp giảm hẳn, cĩ thể nhận thấy bằng mắt thƣờng Hình 3.10 Kết quả đồng nuơi cấy E. coli, A) Đối chứng, B) Nghiệm thức E/S = 1:2 (E. coli + S. marcescens (tỷ lệ E. coli : S. marcescens 1:2)). Sau khi tiến hành lên men thu đƣợc kết quả nhƣ hình 3.10. Đồng nuơi cấy với vi khuẩn E. coli đã cạnh tranh hết nguồn chất dinh dƣỡng với S. marcescens nên việc tạo ra hàm lƣợng prodigiosin trong việc nuơi cấy là rất ít. Kết quả này ngƣợc lại với kết 75
Đồ án tốt nghiệp quả đối kháng trong DATN Nguyễn Thị Hiếu Dân là S. marcescens SH1 cĩ khả năng lấn át E. coli trong phƣơng pháp cấy chéo trên đĩa thạch. So sánh đồng nuơi cấy S. marcescens SH1 với Bacillus sp. và với E. coli thì đồng nuơi cấy với Bacillus sp. khả quan hơn. Trong tài liệu cĩ nĩi đến cơ chế truyền tín hiệu của vi khuẩn Gram âm (hiện tƣợng quorum sensing) qua trung gian phân tử tín hiệu AHL. Tuy nhiên E. coli là vi khuẩn cĩ kết quả thử nghiệm Indol +, tƣơng đƣơng cĩ sự tạo thành Indol trong mơi trƣờng khi nuơi cấy. Indol theo tài liệu mới gần đây là chất làm giảm độc lực của S. marcescens qua ức chế quorum sensing (Hidalgo-Romano et al., 2014). 3.2.6 Sử dụng dịch trong nuơi cấy Sau quá trình lên men thu sinh khối và thay vì loại bỏ dịch trong, ngƣời thực hiện đề tài sử dụng lại nguồn dịch trong để tiến hành thí nghiệm. Tƣơng tự, dịch trong vi khuẩn E. coli tăng sinh trong mơi trƣờng NB trong 24h, sau khi ly tâm loại bỏ tế bào cũng đƣợc sử dụng. Cơ sở của thí nghiệm này là các vi khuẩn Gram âm nhƣ Serratia marcescens và E. coli đều đƣợc hoạt động theo cơ chế quorum sensing. Các phân tử tín hiệu AHL đƣợc tổng hợp trong quá trình nuơi cấy cĩ thể giúp tăng sinh khối nhanh và cải thiện độc lực trong quá trình nuơi cấy. Các phân tử tín hiệu này nằm trong dịch trong của canh trƣờng lên men vi khuẩn Gram âm. Từ đĩ chúng tơi thử sử dụng dịch trong canh trƣờng nuơi cấy S. marcescens SH1 và E. coli bổ sung vào mơi trƣờng mới chuẩn bị. Bảng 3.7 Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp khi bổ sung dịch nuơi cấy. Đối chứng Dịch trong S. Dịch trong E. coli (mg/ml) marcescens(mg/ml) (mg/ml) Hàm lƣợng prodigiosin 26,0 ± 13,2 (a) 27,4 ± 10,4 (a) 26,7 ± 2,7 (a) 76
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7 cho thấy hàm lƣợng prodigiosin khơng cĩ sự sai khác giữa các nghiệm thức. Nhƣ vậy trong khuơn khổ DATN, hàm lƣợng prodigiosin do S. marcescens tổng hợp tăng nhờ áp dụng chế độ khuấy đảo lớn nhất cĩ thể trong phịng thí nghiệm là máy lắc vịng 200 vịng/phút trong 3 ngày. Nhờ điều chỉnh pH mơi trƣờng nuơi cấy ban đầu từ pH = 5,6 lên pH = 7,2, hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp tăng 63,3 %, bổ sung NaCl 1 % làm tăng hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp lên thêm 52,5%. Các cố gắng tiếp theo nhằm tăng hàm lƣợng prodigiosin bằng phƣơng pháp đồng nuơi cấy hoặc bổ sung dịch trong canh trƣờng vi khuẩn Gram âm đều khơng đạt kết quả mong đợi, cần đƣợc nghiên cứu thêm. 3.3 Thu hồi sản phẩm lên men từ canh trƣờng 3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ canh trường: dung mơi trích ly lên hàm lượng prodigiosin thu hồi Vi sinh vật tổng hợp sắc tố ở hai dạng: ngoại bào và liên kết trong tế bào (Allen và cộng sự, 1983). Vì thế ta phải trích ly sắc tố từ trong tế bào ra ngồi mơi trƣờng. Sau khi tổng hợp sắc tố trên mơi trƣờng MT3 quy trình lên men nhƣ thí nghiệm 2.6.1 sắc tố đƣợc trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5) với tỷ lệ canh trƣờng : dung mơi là 2:3, 1:2, 2:5. Bảng 3.8 % Ảnh hƣởng của tỷ lệ canh trƣờng : dung mơi trích ly Tỉ lệ 2:3 (đối chứng) (%) Tỉ lệ 1:2 (%) Tỉ lệ 2:5 (%) Prodigiosin tổng hợp 100 ± 0 150,8 ± 17,7 139 ± 7,2 (% so với đối chứng) 77
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11. Hàm lƣợng prodigiosin thu hồi sau trích ly nhờ tỷ lệ canh trƣờng: dung mơi khác nhau. Hình 3.11 cho thấy tỷ lệ canh trƣờng : dung mơi (Ethanol:HCl (95:5) (v:v)) tỷ lệ 1:2 và tỷ lệ 2:5 cho hàm lƣợng prodigiosin cao hơn đối chứng tỷ lệ 2:3 là (50,8 ± 17,7) % và (39,0 ± 7,2) %. Sai khác giữa hai tỷ lệ thì nghiệm khơng cĩ ý nghĩa thống kê (p>0,05). Nhƣng vì tính kinh tế ngƣời thực hiện đề tài quyết định chọn tỷ lệ trích ly canh trƣờng : dung mơi (Ethanol:HCl = 95:5) là 1:2 cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.3.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia nhiệt canh trường Theo nghiên cứu trƣớc đĩ (DATN Nguyễn Hồng Anh Kha), prodigiosin bền nhiệt ngay cả ở 1000C. Nhận thấy trong quá trình trích ly việc loại bỏ dịch trong thƣờng gây thất thốt hàm lƣợng prodigiosin trong thao tác tiến hành. Đồng thời việc trích ly trực tiếp dễ bị nhiễm vi sinh vật đối với ngƣời thực hiện thao tác, nhất là khi đƣa ra sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp. 78
Đồ án tốt nghiệp Chính vì vậy ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đun cách thủy canh trƣờng trong vịng 15 phút, ở 1000C trƣớc khi đem trích ly. Điều này giúp canh trƣờng trƣớc khi trích ly loại bỏ dịch trong mà khơng cần qua ly tâm, đồng thời cũng giết đƣợc vi khuẩn tránh bị nhiễm mơi trƣờng xung quanh và đặc biệt là ngƣời thao tác. Tiến hành đun canh trƣờng sau lên men làm nƣớc trong canh trƣờng (dịch trong) bốc hơi hầu nhƣ hồn tồn. Quá trình này nhằm tránh thất thốt canh trƣờng khi ly tâm loại bỏ dịch trong nhƣ quy trình bình thƣờng (hình 3.12). Hình 3.12 Canh trƣờng sau khi ly tâm A. Canh trƣờng khơng đun B. Canh trƣờng đun 1000C trong vịng 15 phút. 79
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.13. Sắc tố đỏ sau khi trích ly với dung mơi Etanol:HCl (95:5). A. Sắc tố của canh trƣờng khơng đun. B. Sắc tố của canh trƣờng đun 1000C trong vịng 15 phút. Đồng thời trong quá trình đun sẽ giết chết đƣợc vi khuẩn, làm hạn chế nhiễm khuẩn trực tiếp cho ngƣời thực hiện thao tác trích ly. Đƣợc tiến hành thử nghiệm bằng cách cấy canh trƣờng sau khi đun lên mơi trƣờng NA (hình 3.14). 80
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.14. Vi khuẩn S. marcescens đƣợc cấy trên mơi trƣờng NA. A. Đối chứng ( canh trƣờng chƣa đun). B. Canh trƣờng đƣợc đun 1000C trong vịng 15 phút. Bảng 3.9. Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong thí nghiệm Nghiệm thức Prodigiosin trong 1ml canh trƣờng lên men Đối chứng 10,2 ± 4,3 (a) Đun 1000C trong vịng 15 phút 26,2 ± 5,9 (b) Điều quan trọng là trong quá trình đun hàm lƣợng prodigiosin đƣợc trích ly cao hơn nhiều so với việc khơng đun. Cao hơn mẫu đối chứng là 157,12% (hình 3.15). 81
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.15. Hàm lƣợng prodigiosin so với đối chứng. Mẫu tinh khiết của prodigiosin trong dung mơi Ethanol : HCl (95:5) cho thấy nĩ cĩ độ hấp thụ cao và duy nhất tại bƣớc sĩng 535 nm trong quang phổ UV (Giri và cộng sự, 2004). Dựa vào đặc điểm này ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đo phổ hấp thụ của sắc tố trƣớc và sau khi đun để kiểm chứng. 3.3.3 Ảnh hƣởng của việc gia nhiệt canh trƣờng đến chất lƣợng prodigiosin trong sản phẩm Để khảo sát liệu gia nhiệt cĩ làm ảnh hƣởng lên chất lƣợng sản phẩm khơng và thành phần các chất trong sản phẩm sắc tố thơ, các khảo sát sau đƣợc tiến hành. 82
Đồ án tốt nghiệp Quang phổ hấp thụ UV/VIS: Đối chứng (canh trƣờng khơng đun) Canh trƣờng đun Hình 3.16. Kết quả quét quang phổ của sắc tố canh trƣờng khơng đun và đun 1000C. 0 Qua kết quả quét quang phổ nhận thấy mẫu đun ở 100 C cĩ bƣớc sĩng λmax= 535 nm tƣơng đồng với phổ nhận đƣợc ở mẫu đối chứng khơng đun, trùng khớp với báo cáo của Giri và cộng sự, 2004. Nguyễn Hồng Anh Kha cũng đã khảo sát prodigiosin tổng hợp từ mơi trƣờng peptone glycerol cho biết xử lý nhiệt 1000C, 15 phút khơng làm ảnh hƣởng lên prodigiosin. Điều này tạo cơ sở tin tƣởng rằng đây là hợp chất prodgiosin. Nhƣ vậy trong quá trình đun khơng làm biến đổi hợp chất thứ cấp là prodigiosin. 83
Đồ án tốt nghiệp 3.4 Xác định thành phần hĩa học trong mẫu 3.4.1. Phản ứng Biuret’s test Phản ứng Biuret’s test này nhằm nhận diện liên kết peptide cĩ trong mẫu phản ứng. Ion Cu2+ sẽ tạo phức màu tím với liên kết peptide cĩ trong mẫu. Ngƣời thực hiện đề tài chọn BSA (Bovine sodium albumin) làm mẫu đối chứng. Và dùng thí nghiệm này để xác định protein cĩ trong mẫu dịch trong sau nuơi cấy và trong mẫu sau khi trích ly bằng Ethanol: HCl (95:5). Hình 3.17 Biuret’s test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thơ. 1. Hợp chất thứ cấp prodigiosin sau khi trích ly Ethanol:HCl 2. Dịch nuơi cấy sau ly tâm 3. BSA 4. Peptone 84
Đồ án tốt nghiệp Từ hình 3.17 nhận thấy ở 2 mẫu đối chứng là BSA và peptone cho màu tím đặc trƣng. Sau khi thực hiện thí nghiệm ở mẫu 1 hợp chất thứ cấp prodigiosin cĩ màu tím khá giống mẫu đối chứng, chứng tỏ cĩ liên kết peptide trong mẫu. Ở mẫu 2 là mẫu dịch nuơi cấy sau ly tâm cĩ màu đỏ đậm khơng giống mẫu đối chứng, kết luận rằng mẫu 2 khơng cĩ liên kết peptide, tức là khơng cịn chứa protein. 3.4.1.2 Phản ứng Nynhydrin Phản ứng Nynhydrin giúp ta nhận diện đƣợc sự cĩ mặt của các acid amin tự do trong mẫu cần xác định. Ngƣời thực hiện đề tài sử dụng BSA, peptone, tyrosin làm đối chứng. Cả ba mẫu sau phản ứng đều cĩ màu tím đậm đƣợc thể hiện ở hình 3.18. Đối chứng Mẫu thí nghiệm Hình 3.18 Ninhydrin test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thơ ở thí nghiệm đun và khơng đun canh trƣờng. 1. Đối chứng BSA 2. Đối chứng Peptone 85
Đồ án tốt nghiệp 3. Đối chứng Tyrosine 4. Dịch nuơi cấy sau ly tâm 5. Hợp chất thứ cấp prodigiosin sau khi trích ly Ethanol:HCl (canh trƣờng khơng đun) 6. Hợp chất thứ cấp prodigiosin sau khi trích ly Ethanol : HCl (ở thí nghiệm đun canh trƣờng). Từ hình 3.18 nhận thấy rõ ràng là cả 3 mẫu thí nghiệm đều chuyển màu tím đậm, giống với màu 3 mẫu đối chứng dƣơng. Vậy ta kết luận rằng ở cả ba mẫu dịch trong, hợp chất thứ cấp prodigiosin đun và khơng đun đều cĩ chứa các acid amin tự do, cĩ thể trong mẫu cĩ protein hoặc amino acid. 3.4.2 Xác định lipid cĩ trong mẫu Phản ứng Coomassie brilliant blue giúp nhận diện lipid cĩ trong mẫu. Ngƣời thực hiện đề tài sử dụng dầu hƣớng dƣơng để làm mẫu đối chứng vì trong dầu cĩ hàm lƣợng chất béo rất cao. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.19. 86
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.19. Kết quả mẫu phản ứng Coomassie brilliant blue trƣớc và sau khi phun thuốc thử. 1. Hợp chất thứ cấp prodigiosin sau khi trích ly Ethanol:HCl (canh trƣờng khơng đun) 2. Hợp chất thứ cấp prodigiosin sau khi trích ly Ethanol:HCl (canh trƣờng đun nĩng) 3. Dịch trong sau khi lên men 4. Dầu hƣớng dƣơng Từ kết quả hình 3.19 nhận thấy ở 3 mẫu thí nghiệm đều cĩ vầng sáng trên nên xanh dƣơng giống với mẫu đối chứng là dầu hƣớng dƣơng, chứng tỏ mẫu cĩ chứa lipid. Kết quả khảo sát nhanh protein, lipid đƣợc ghi nhận ở bảng 3.10. 87
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10. Kết quả xác định protein và lipid Mẫu Biuret Nynhydrin Coomasie blue (lipid) Peptone + + BSA + + Tyrosine + Dầu hƣớng dƣơng + Dịch nuơi cấy sau ly - + + tâm Dịch trích ly sắc tố + + + thơ Dịch trích ly sắc tố + + thơ (đã xử lý nhiệt) 3.5 Sắc ký bản mỏng TLC Kết quả sắc ký bản mỏng sử dụng dung mơi Petrolium ether: Ether : Acetic acid (70:40:2, v:v:v) đƣợc trình bày trên hình 3.20. 88
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.20. Kết quả sắc ký bản mỏng sử dụng hệ dung mơi Petrolium ether: Ether : Acetic acid (70:40:2, v:v:v). 1. Prodigiosin thơ trích ly bằng Ethanol :HCl (canh trƣờng khơng đun) 2. Prodigiosin thơ trích ly bằng Ethanol :HCl (canh trƣờng đun) 3. Prodigiosin trích ly lỏng-lỏng (canh trƣờng khơng đun) 4. Prodigiosin trích ly lỏng-lỏng (canh trƣờng đun) 5. Mẫu prodigiosin trích ly từ mơi trƣờng PG Kết quả hình 3.20 cho thấy khơng cĩ sự khác biệt giữa vệt màu ở canh trƣờng thu hồi bằng phƣơng pháp đun so với khơng đun thu hồi từ canh trƣờng đậu phộng, cũng khơng khác biệt với mẫu prodigiosin đƣợc thu hồi từ canh trƣờng peptone glycerol đã qua trích ly lỏng lỏng. 89