Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài khổ sâm mềm (Brucea Mollis Wall. ex Kurz) và cơm rượu trái hẹp (Glycosmis Stenocarpa (drake) Guillaum) ở Việt Nam

169 trang yendo 4910

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài khổ sâm mềm (Brucea Mollis Wall. ex Kurz) và cơm rượu trái hẹp (Glycosmis Stenocarpa (drake) Guillaum) ở Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_an_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_va_hoat_tinh_sinh_hoc.pdf

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài khổ sâm mềm (Brucea Mollis Wall. ex Kurz) và cơm rượu trái hẹp (Glycosmis Stenocarpa (drake) Guillaum) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC MAI HÙNG THANH TÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI KHỔ SÂM MỀM (BRUCEA MOLLIS WALL. EX KURZ) VÀ CƠM RƯỢU TRÁI HẸP (GLYCOSMIS STENOCARPA (DRAKE) GUILLAUM) Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC MAI HÙNG THANH TÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI KHỔ SÂM MỀM (BRUCEA MOLLIS WALL. EX KURZ) VÀ CƠM RƯỢU TRÁI HẸP (GLYCOSMIS STENOCARPA (DRAKE) GUILLAUM) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số : 62.44.27.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. NGUYỄN MẠNH CƯỜNG 2. GS.TS. YOUNG HO KIM HÀ NỘI - 2012
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả thu được trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Mai Hùng Thanh Tùng
LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường và GS.TS. Young Ho Kim là những người thầy đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện Hóa học và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, đặc biệt PGS.TS. Phạm Quốc Long, Viện trưởng Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, người đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo trường Cao đẳng công nghiệp Tuy Hòa đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Thảo và các anh chị Tổ Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể cán bộ Phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành tốt luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Tác giả luận án Mai Hùng Thanh Tùng
MỤC LỤC Trang Danh mục các hình trong luận án DM1 Danh mục các bảng trong luận án DM2 Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt DM3 MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu về chi Brucea (Sầu đâu) 3 1.1.1. Sơ lược về chi Brucea 3 1.1.2. Thành phần hóa học của chi Brucea 3 1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 3 1.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3 1.1.2.2.1. Lớp chất quassinoit 4 1.1.2.2.2. Lớp chất ancaloit 4 1.1.2.2.3. Lớp chất tritecpenoit và steroit 5 1.1.2.2.4. Lớp chất flavonoit 5 1.1.2.2.5. Lớp chất axít béo và loại khác 5 1.1.3. Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Brucea 12 1.1.3.1. Hoạt tính chống sốt rét 12 1.1.3.2. Hoạt tính kháng u và ung thư 13 1.1.3.3. Hoạt tính kháng virus TMV (Tobacco Mosaic Virus) 13 1.1.3.4. Hoạt tính chống tiểu đường 13 1.1.3.5. Hoạt tính kháng ký sinh trùng mũi khoan 14 1.1.3.6. Hoạt tính kháng amíp 14 1.1.3.7. Các hoạt tính khác 14 1.1.4. Sơ lược lớp chất quassinoit 14 1.1.4.1. Giới thiệu 14 1.1.4.2. Phân lập và xác định cấu trúc 15 1.1.4.3. Sinh tổng hợp các quassinoit 16
1.1.4.4. Bán tổng hợp các quassinoit 17 1.1.4.5. Tổng hợp toàn phần các quassinoit 18 1.1.4.6. Hoạt tính sinh học của lớp chất quassinoit 19 1.1.5. Loài Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) 20 1.2. Chi Glycosmis 21 1.2.1. Đặc điểm hình thái và phân bố 21 1.2.2. Sử dụng trong dân gian 22 1.2.3. Thành phần hóa học chi Glycosmis 23 1.2.3.1. Tecpenoit 23 1.2.3.2. Flavonoit 24 1.2.3.3. Cumarin 25 1.2.3.4. Ancaloit 25 1.2.3.5. Các ancaloit dạng amít chứa lưu huỳnh 25 1.2.3.6. Glycosid 26 1.2.4. Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Glycosmis 27 1.2.5. Loài Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) 27 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 30 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu 30 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 30 2.1.3. Các phương phương xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 30 2.1.3.1. Xác định điểm chảy và góc quay cực 31 2.1.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) 31 2.1.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 31 2.1.4. Phương pháp thử hoạt tính gây độc (ức chế) tế bào ung thư in vitro 31 2.1.4.1. Vật liệu 31 2.1.4.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 31 2.1.4.3. Phép thử sinh học xác định hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic assay) 31 2.2. Xử lí mẫu thực vật và chiết tách 32
2.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được 40 2.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất được phân lập 46 2.4.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư KB 47 2.4.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư LU-1 47 2.4.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư LNCaP 48 2.4.4. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư HL-60 48 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm 50 3.2. Cấu trúc của các hợp chất được phân lập 50 3.2.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm 50 3.2.2. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ thân và rễ cây Khổ sâm mềm 74 3.2.3. Xác định tên khoa học cây Brucea mollis 108 3.2.4. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ rễ cây Cơm rượu trái hẹp 109 KẾT LUẬN 137 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TRONG KHUÔN KHỔ LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
DM-1 DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN ÁN Trang Hình 1.1 Các bộ khung cơ bản của lớp chất quassinoit 15 Hình 1.2 Quassin 117 và neoquassin 118 là hai quassinoit đầu tiên được phân lập từ cây Quassia amara 16 Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp các quassinoit 17 Hình 1.4 Bán tổng hợp bruceantin từ bruceoside A 18 Hình 1.5 Tổng hợp toàn phần bruceantin 19 Hình 1.6 Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) 21 Hình 1.7 Cây Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) 27 Hình 2.1 Sơ đồ phân đoạn các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm 33 Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các chất từ lá cây Khổ sâm mềm 36 Hình 2.3 Sơ đồ phân lập các chất từ thân và rễ cây Khổ sâm mềm 38 Hình 2.4 Sơ đồ phân lập các chất từ rễ cây Cơm rượu trái hẹp 39 Hình 2.5 Tác dụng ức chế tế bào ung thư KB của hợp chất BM.19 ở các nồng độ 20; 4; 0,8 mg/ml 47 Hình 2.6 Tác dụng ức chế tế bào ung thư LNCaP của hợp chất BM.17 ở các nồng độ 20; 4; 0,8 mg/ml 48 Hình 2.7 Tác dụng ức chế tế bào ung thư HL-60 của hợp chất BM.19 ở các nồng độ 20; 4; 0,8 mg/ml . 49 Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.01 51 Hình 3.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.02 52 Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.03 52 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.04 52 1 Hình 3.5 Phổ H-NMR của hợp chất BM.04 54 Hình 3.6 Phổ DEPT của hợp chất BM.04 54 Hình 3.7 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.05 56
DM-1 Hình 3.8 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.05 56 Hình 3.9 Phổ DEPT của hợp chất BM.05 57 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.06 57 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.07 58 Hình 3.12 Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất BM.08 60 Hình 3.13 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.08 60 Hình 3.14 Phổ DEPT của hợp chất BM.08 61 Hình 3.15 Phổ HSQC của hợp chất BM.08 61 Hình 3.16 Phổ HMBC của hợp chất BM.08 61 Hình 3.17 Phổ COSY của hợp chất BM.08 62 Hình 3.18 Phổ NOESY của hợp chất BM.08 62 Hình 3.19 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.09 63 1 Hình 3.20 Phổ H-NMR của hợp chất BM.09 63 Hình 3.21 Phổ DEPT của hợp chất BM.09 63 Hình 3.22 Các tương tác trong phổ HMBC, COSY và NOESY của hợp chất BM.10 66 1 Hình 3.23 Phổ H-NMR của hợp chất BM.10 66 Hình 3.24 Phổ DEPT của hợp chất BM.10 67 Hình 3.25 Phổ HSQC của hợp chất BM.10 67 Hình 3.26 Phổ HMBC của hợp chất BM.10 67 Hình 3.27 Phổ COSY của hợp chất BM.10 68 Hình 3.28 Phổ NOESY của hợp chất BM.10 68 Hình 3.29 Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất BM.10 68 Hình 3.30 Các tương tác HMBC của hợp chất BM.11 69 1 Hình 3.31 Phổ H-NMR của hợp chất BM.11 69 Hình 3.32 Phổ DEPT của hợp chất BM.11 70 Hình 3.33 Các tương tác HMBC của hợp chất BM.12 70 1 Hình 3.34 Phổ H-NMR của hợp chất BM.12 71 Hình 3.35 Phổ 13C-NMR của hợp chất BM.12 71
DM-1 Hình 3.36 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.13 75 Hình 3.37 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.14 75 Hình 3.38 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.14 76 Hình 3.39 Phổ 13C-NMR của hợp chất BM.14 76 Hình 3.40 Các tương tác trong phổ HMBC, COSY và NOESY của hợp chất BM.15 77 1 Hình 3.41 Phổ H-NMR của hợp chất BM.15 80 Hình 3.42 Phổ DEPT của hợp chất BM.15 80 Hình 3.43 Phổ HSQC của hợp chất BM.15 80 Hình 3.44 Phổ HMBC của hợp chất BM.15 81 Hình 3.45 Phổ COSY của hợp chất BM.15 81 Hình 3.46 Phổ NOESY của hợp chất BM.15 81 Hình 3.47 Các tương tác NOESY của hợp chất BM.16 82 Hình 3.48 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.16 83 Hình 3.49 Phổ DEPT của hợp chất BM.16 84 Hình 3.50 Phổ HSQC của hợp chất BM.16 84 Hình 3.51 Phổ HMBC của hợp chất BM.16 84 Hình 3.52 Phổ COSY của hợp chất BM.16 85 Hình 3.53 Phổ NOESY của hợp chất BM.16 85 Hình 3.54 Các tương tác HMBC và COSY của hợp chất BM.17 86 Hình 3.55 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.17 87 Hình 3.56 Phổ DEPT của hợp chất BM.17 88 Hình 3.57 Phổ HSQC của hợp chất BM.17 88 Hình 3.58 Phổ HMBC của hợp chất BM.17 88 Hình 3.59 Phổ COSY của hợp chất BM.17 89 Hình 3.60 Phổ NOESY của hợp chất BM.17 89 Hình 3.61 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.18 90 1 Hình 3.62 Phổ H-NMR của hợp chất BM.18 91 Hình 3.63 Phổ DEPT của hợp chất BM.18 91
DM-1 Hình 3.64 Các tương tác HMBC chính của hợp chất BM.19 92 1 Hình 3.65 Phổ H-NMR của hợp chất BM.19 94 Hình 3.66 Phổ DEPT của hợp chất BM.19 94 Hình 3.67 Phổ HMBC của hợp chất BM.19 94 Hình 3.68 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC của hợp chất BM.20 95 Hình 3.69 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.20 96 13 Hình 3.70 Phổ C-NMR của hợp chất BM.20 96 Hình 3.71 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.21 97 Hình 3.72 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.21 98 Hình 3.73 Phổ DEPT của hợp chất BM.21 98 Hình 3.74 Các tương tác HMBC, COSY, NOESY của hợp chất BM.22 99 1 Hình 3.75 Phổ H-NMR của hợp chất BM.22 101 Hình 3.76 Phổ DEPT của hợp chất BM.22 101 Hình 3.77 Phổ HSQC của hợp chất BM.22 102 Hình 3.78 Phổ HMBC của hợp chất BM.22 102 Hình 3.79 Phổ COSY của hợp chất BM.22 102 Hình 3.80 Phổ NOESY của hợp chất BM.22 103 Hình 3.81 Phổ ESI-MS của hợp chất BM.22 103 Hình 3.82 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.23 104 1 Hình 3.83 Phổ H-NMR của hợp chất BM.23 104 Hình 3.84 Phổ DEPT của hợp chất BM.23 105 Hình 3.85 Phổ HSQC của hợp chất BM.23 105 Hình 3.86 Phổ HMBC của hợp chất BM.23 105 Hình 3.87 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC của hợp chất GP.24 112 Hình 3.88 Phổ IR của hợp chất GP.24 112 Hình 3.89 Phổ 1H-NMR của hợp chất GP.24 112 Hình 3.90 Phổ DEPT của hợp chất GP.24 113 Hình 3.91 Cấu trúc hóa học của hợp chất GP.25 114 Hình 3.92 Phổ 1H-NMR của hợp chất GP.25 115
DM-1 Hình 3.93 Phổ DEPT của hợp chất GP.25 115 Hình 3.94 Phổ HSQC của hợp chất GP.25 115 Hình 3.95 Phổ HMBC của hợp chất GP.25 116 Hình 3.96 Phổ COSY của hợp chất GP.25 116 Hình 3.97 Cấu trúc hóa học của hợp chất GP.26 117 Hình 3.98 Phổ 1H-NMR của hợp chất GP.26 118 Hình 3.99 Phổ DEPT của hợp chất GP.26 119 Hình 3.100 Phổ HSQC của hợp chất GP.26 119 Hình 3.101 Phổ HMBC của hợp chất GP.26 120 Hình 3.102 Phổ COSY của hợp chất GP.26 120 Hình 3.103 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GP.26 121 Hình 3.104 Sơ đồ phân mảnh của hợp chất GP.27 trong phổ ESI-MS 123 Hình 3.105 Các tương tác HMBC, COSY và NOESY của hợp chất GP.27 123 Hình 3.106 Phổ 1H-NMR của hợp chất GP.27 124 Hình 3.107 Phổ DEPT của hợp chất GP.27 124 Hình 3.108 Phổ HSQC của hợp chất GP.27 124 Hình 3.109 Phổ HMBC của hợp chất GP.27 125 Hình 3.110 Phổ COSY của hợp chất GP.27 125 Hình 3.111 Phổ NOESY của hợp chất GP.27 126 Hình 3.112 Phổ ESI-MS của hợp chất GP.27 126
DM-2 DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN Trang Bảng 2.1 Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất được phân lập từ cây Khổ sâm mềm trên bốn dòng ung thư 46 Bảng 2.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB của các hợp chất BM.06, BM.07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.22 47 Bảng 2.3 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư LU-1 của các hợp chất BM.06, BM.07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.22 47 Bảng 2.4 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư LNCaP của các hợp chất BM.06, BM.07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.22 48 Bảng 2.5 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư HL-60 của các hợp chất BM.06, BM.07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.22 48 Bảng 3.1 Kết quả thử độc tính tế bào các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall.ex Kurz) 50 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.04 53 Bảng 3.3 Số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất BM.05 và chất tham khảo 55 Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.06, BM.07 và chất tham khảo 58 Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.10 64 Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.10 và chất tham khảo 65 Bảng 3.7 Tổng hợp các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm 72 Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất BM.13 và chất tham khảo 74 Bảng 3.9 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.15 78 Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.15 và chất tham khảo 79 Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.16 và chất tham khảo 83 Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.17 và chất tham khảo 86 Bảng 3.13 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.18 và chất tham khảo 90
DM-2 Bảng 3.14 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.19 và chất tham khảo 93 Bảng 3.15 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.20 95 Bảng 3.16 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.21 và chất tham khảo 97 Bảng 3.17 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.22 100 Bảng 3.18 Tổng hợp các hợp chất phân lập từ thân và rễ cây Khổ sâm mềm 106 Bảng 3.19 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.24 111 Bảng 3.20 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.25 113 Bảng 3.21 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.25 và chất tham khảo 114 Bảng 3.22 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.26 và chất tham khảo 118 Bảng 3.23 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.26 118 Bảng 3.24 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.27 122 Bảng 3.25 Cấu trúc các hợp chất phân lập từ rễ cây Cơm rượu trái hẹp 127 Bảng 3.26 Bảng tổng kết các hợp chất được phân lập từ cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) và cây Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) 129
DM-3 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy proton 13C- NMR Carbon -13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy cacbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ HMBC Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ HSQC Coherence NOESY Nuclear Overhauser Effect Phổ NOESY Spectroscopy 1H-1H-COSY 1H -1H - Correlation Phổ tương tác proton Spectroscopy ESI-MS Electron Spray Ionization-Mass Phổ khối ion hóa bằng phun mù Spectroscopy điện tử HR-ESI-MS High Resolution Electron Phổ khối phân giải cao ion hóa Spray Ionization Mass bằng phun mù điện tử Spectroscopy IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại s Singlet d Doublet t Triplet q Quartet dd doublet doublet dt doublet triplet
DM-3 b Broad m Multiplet J (Hz) Hằng số tương tác tính bằng Hz δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính bằng ppm (phần triệu) CC Column Chromatography Sắc ký cột thường TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng HS (%) Hiệu suất so với mẫu khô CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô Hep-G2 Human hepatocellular Ung thư gan người carcinoma MCF-7 Adenocarcinoma Ung thư vú LU-1 Human lung carcinoma Ung thư phổi người LNCaP Human prostate Ung thư tiền liệt tuyến adenocarcinoma HL-60 Human promyelocytic Ung thư máu cấp tính leukemia IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50% Mp Melting point Điểm chảy MeOH Metanol DMSO Dimethylsulfoxide Py Pyridin EtOAc Etyl axetat TMS Tetrametyl Silan BuOH Butanol
1 MỞ ĐẦU Cho đến ngày nay dân số thế giới đã đạt được bảy tỷ người, một con số rất lớn và nhu cầu về khám chữa bệnh vì thế cũng tăng theo. Trong khi đó thì tình trạng sử dụng thuốc bừa bãi không theo hướng dẫn của bác sĩ dẫn đến kháng thuốc, đặc biệt là ở những nước đang phát triển đã vô tình tạo một áp lực lớn đối với ngành y tế thế giới phải cố gắng tìm ra những loại thuốc mới. Thiên nhiên là một kho thuốc khổng lồ, mà cho đến nay thế giới vẫn chưa khám phá hết. Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, có một hệ động thực vật đa dạng phong phú. Đây chính là tiềm năng to lớn mà chúng ta cần phải tận dụng. Hiện nay, tình trạng đốt phá rừng ngày càng gia tăng và không thể kiểm soát, đồng thời khí hậu thay đổi theo chiều hướng khắc nghiệt hơn, đã và đang làm cho một số lượng lớn các loài suy thóai dần. Nếu chúng ta không nhanh chóng nghiên cứu và bảo vệ nguồn gien này thì đó sẽ là một mất mát to lớn của loài người. Ngày nay, hầu hết các bài thuốc gia truyền đều sử dụng theo kinh nghiệm, phần lớn chưa được chứng minh theo y học hiện đại. Thông thường người ta sử dụng ở dạng sắc lấy nước uống hoặc ở dạng cao, viên. Đó là một hỗn hợp bao gồm nhiều thành phần khác nhau, có những thành phần có khả năng làm tăng hoặc giảm hoạt tính hoặc độc tính của thuốc. Vì vậy, chúng ta cần phải nghiên cứu xác định chính xác tác dụng của từng thành phần hoặc các hợp phần, từ đó tạo cơ sở cho sử dụng tốt hơn cây thuốc và bài thuốc dân tộc. Trong y học dân gian cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) được sử dụng để trị sốt rét, đau bụng, u nhọt, amíp, ghẻ lở [1]. Trong chương trình hợp tác giữa Việt Nam và Hàn Quốc, nhằm phát hiện các loài thực vật có kháng ung thư, các tác giả đã phát hiện ra dịch chiết MeOH từ lá cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis) có hoạt tính rất mạnh, ức chế tới 96% tế bào ung thư phổi người A549 [2]. Cây Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) thu hái tại Việt Nam đã được nghiên cứu từ năm 2004. Từ cây Cơm rượu trái hẹp đã phân lập được một số ancaloit như murrayanin, murrayafoline A. Trong đó, murrayafoline A
2 có hoạt tính ức chế mạnh sự phát triển tế bào ung thư đại tràng thông qua con đường Wnt/b-catenin [3]. Nhằm mục đích đi sâu nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của hai cây này, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: " Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) và Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) ở Việt Nam'' với nội dung nghiên cứu như sau: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài trên 2. Đánh giá hoạt tính kháng ung thư của một số hợp chất phân lập được
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về chi Brucea (Sầu đâu) 1.1.1. Sơ lược về chi Brucea Chi Brucea (Sầu đâu) là một chi thuộc họ Simaroubaceae (Thanh Thất) với sáu loài chính (Brucea javanica, Brucea mollis var. tonkinensis, Brucea guineensis, Brucea sumatrana, Brucea antidysenterica và Brucea amarissima) được phân bố ở các vùng nhiệt đới phía đông bán cầu [4], [5]. Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ, chi Brucea có ba loài gồm Brucea javanica, Brucea mollis và Brucea mollis var. tonkinensis [5].Trong đó, có hai loài được sử dụng trong dân gian để làm thuốc là Sầu đâu cứt chuột (Brucea javanica) và Khổ sâm mềm (Brucea mollis) trị sốt rét, đau bụng, u nhọt Hai loài trên thường gặp ở vùng Lào Cai, Kom Tum, Lâm Đồng [1]. Ở Trung Quốc, hai loài Brucea mollis và Brucea javanica cũng được sử dụng như là thuốc thảo dược truyền thống bởi vì hoạt tính chống ung thư và chống sốt rét của chúng [6]. Gần đây, các cây thuộc chi Brucea đã thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu về thành phần hóa học, bởi vì phổ hoạt tính sinh học đa dạng của chúng. Các nghiên cứu hóa học về chi Brucea đã phát hiện ra nhiều hợp chất thuộc các lớp chất chính là quassinoit, ancaloit, tritecpenoit và flavonoit. 1.1.2. Thành phần hóa học của chi Brucea 1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở trong nước, cho đến nay chỉ có ba công bố các nghiên cứu về hai loài trong chi Brucea là B. javanica và B. sumatrana. Năm 1979, tác giả Ngô Văn Thu nghiên cứu về hoạt tính chống sốt rét của các dịch chiết từ cây B. sumatrana [7]. Năm 1995, GS. Trần Văn Sung và cộng sự đã phân lập được một glycoside mới từ lá cây B. javanica [8]. Gần đây, 2009, GS. Douglas Kinghorn, Đại học Ohio, Mỹ, đã phân lập được năm tritecpenoit, hai quassinoit và một flavonolignan từ lá cây B. javanica thu hái tại Việt Nam và đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của chúng [9]. 1.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
4 Cho đến nay, đã có năm loài trong sáu loài chính của chi Brucea được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới gồm: B. javanica, B. mollis var. tonkinensis, B. sumatrana, B. antidysenterica và B. amarissima. Kể từ năm 1900, đã có hơn 100 hợp chất hóa học được tách ra từ chi Brucea, bao gồm các lớp chất: quassinoit, ancaloit, tritecpenoit, flavonoit và các axít béo [6- 74]. Trong đó thì lớp chất quassinoit là lớp chất chính, chiếm hơn 50% các hợp chất được tách ra từ chi này. Cấu trúc các hợp chất được chỉ ra ở phần sau; tên của hợp chất và nguồn gốc cây tương ứng được liệt kê ở Bảng 1.1 (trang 9). 1.1.2.2.1. Lớp chất quassinoit Các quassinoit là lớp chất chính của chi Brucea và chỉ được phát hiện ở các loài thuộc họ Simaroubaceae. Cho đến nay, có khoảng 75 quassinoit (1-75), được phân lập từ chi Brucea [10-45] và tập trung nhiều nhất ở loài B. javanica. Các quassinoit chủ yếu được tách từ quả và hạt của cây, một số quassinoit có hoạt tính sinh học lý thú. Từ loài B. javanica phân lập được các quassinoit: bruceantinol A 12, bruceene 16, bruceine H-J (24-26), bruceoside A-G (27-33), dehydrobruceine A 37 và B 38, javanicolide A-D (41-44), javanicoside A-H (45-52), yadanzigan 57, yadanziolide B 58, C 59, và S 60, và yadanzioside A-O (61-75). Trong số chúng thì các hợp chất yadanzigan 57 và yadanzioside B 62, C 63, E 65, I 69 và K 71, cũng được phát hiện ở loài B. amarissima, và hợp chất yadanzioside M 73 cũng được tìm thấy ở loài B. antidysenterica. Các quassinoit bruceine A-G (17-23) và javanicoside I-L (53-56) được phân lập từ loài B. amarissima. Trong số chúng thì các hợp chất bruceine A-G (17-23) cũng được tìm thấy ở loài B. javanica. Đặc biêt hợp chất brusatol 34 chỉ được phát hiện ở hai loài là B. sumatrana và B. javanica. Một số quassinoit khung C-20 như: bruceantarin 9, bruceantin 10, bruceantinol 11, bruceantinoside A 13 và B 14 được tách từ loài B. javanica. Các quassinoit còn lại được phân lập từ loài B. antidysenterica 1.1.2.2.2. Lớp chất ancaloit Cho đến nay có 25 ancaloit (76-100) được phân lập từ chi Brucea [6], [46-53],
5 [58]. Các hợp chất này phân bố chủ yếu ở hai cây B.mollis var. tonkinensis và B. javanica. 1.1.2.2.3. Lớp chất tritecpenoit và steroit Có tám tritecpenoit, bruceajavanin A, B 101, 102, dihydrobruceajavanin A 103, bruceajavanone A, B, C, bruceajavanone A 7-axetat và bruceajavaninone A; một steroit, daucosterol 104, được phân lập từ cây B. javanica [6], [8], [9], [58]. 1.1.2.2.4. Lớp chất flavonoit Có hai flavonoit, luteolin-7-O-b-D-glucoside 105 và quercetin-3-O-b-D- galactoside 106 được phân lập từ cây B. mollis var. tonkinensis và B. javanica [58]. 1.1.2.2.5. Lớp chất axít béo và loại khác Có chín axít béo 107-115 và axít vanllic 116 được phân lập từ B. sumatrana và B. javanica [46], [58].
6 OH OH O OH O HO HO HO OMe OH O O O O OMe OH O O GlcO O R H H H OH O H H GlcO O O O O O O O H H H H H H 14 16 15 R = AcOC(Me)2C(Me)=CH 46 R = i-Bu 53 R = Me2C=CH 74 R = i-PrC(Me)=CH OH OH OH OH HO HO R HO HO HO OH H O R O O OH O OH HO O OH OH O OH O OH H OH H OH H H H H O O O O O O O O H H H H H H H H 20 R = H 21 R = Me OH 23 42 R = OH 22 R = CH2OH 24 OH O OH O HO HO OH O O OEt O OH HO OMe O O O O O O R H H H H O H H HO O O HO O O O H H H H GlcO O O 25 26 H H 28 R = Me2C=CH 54 R = i-Ph 69 R = Me 71 R = AcOC(Me)2C(Me)=CH 72 R = HOC(Me)2C(Me)=CH OH O OH O HO HO O OMe OH O OMe O O HO O OH H H H H O O GlcO O O O O H H H H 44 45
7 OH OH O OH O HO OH HO HO OH OH O OMe OH O OMe O OH O O GlcO O R H OH H H H H O O O O H H GlcO O O O O H H H H 60 62 64 R = Me 65 R = Me2C=CH 68 R = i-Bu R1 76 77 80 85 87 95 96 97 98 99 4 N R 1 2 R MeO MeO MeO H OH MeO H H H H R R2 H H OH H H H H H H H R3 H H H MeO H H H H MeO H N 4 R3 R MeO OH MeO MeO MeO H OH H H MeO O
8 H H H O H O H O H O O O AcO MeO AcO H H H H H H H H H O OAc H O OAc O H H OAc 103 101 102
9 Bảng 1.1. Thành phần hóa học các cây thuộc chi Brucea STT Phân loại và tên chất Tách ra từ cây TLTK Quassinoit 1 Bruceanol A B. antidysenterica [12] 2 Bruceanol B B. antidysenterica [12] 3 Bruceanol C B. antidysenterica [13] 4 Bruceanol D B. antidysenterica [14] 5 Bruceanol E B. antidysenterica [14] 6 Bruceanol F B. antidysenterica [14] 7 Bruceanol G B. antidysenterica [15] 8 Bruceanol H B. antidysenterica [15] 9 Bruceantarin B. antidysenterica [17] B. javanica [16] 10 Bruceantin B. javanica [16] B. antidysenterica [17] 11 Bruceantinol B. antidysenterica [18] B. javanica [19] 12 Bruceantinol A B. javanica [20] 13 Bruceantinoside A B. antidysenterica [21] B. javanica [22] 14 BruceantinosideB, yadanzioside P B. antidysenterica [21] B. javanica [23] 15 Bruceantinoside C B. antidysenterica [24] 16 Bruceene B. javanica 17 Bruceine A B. amarissima [25] B. javanica [19] 18 Bruceine B B. amarissima [25] B. javanica [19] 19 Bruceine C B. amarissima [25] B. javanica [19] 20 Bruceine D B. amarissima [26] 21 Bruceine E B. amarissima [26] 22 Bruceine F B. amarissima [27] 23 Bruceine G B. amarissima [28]
10 24 Bruceine H, yadanziolide A B. javanica [58] 25 Bruceine I B. javanica [58] 26 Bruceine J B. javanica [20] 27 Bruceoside A B. javanica [29] 28 Bruceoside B B. javanica [26] 29 Bruceoside C B. javanica [30] 30 Bruceoside D B. javanica [31] 31 Bruceoside E B. javanica [31] 32 Bruceoside F B. javanica [31] 33 Bruceoside G B. javanica [32] 34 Brusatol B. javanica [19] B. sumatrana [33] 35 Dehydrobruceantarin B. antidysenterica [10] 36 Dehydrobruceantin B. antidysenterica [10] 37 Dehydrobruceine A B. javanica [19][34] 38 Dehydrobruceine B B. javanica [34] 39 Isobruceine A B. antidysenterica [34] 40 Isobruceine B B. antidysenterica [10] 41 Javanicolide A B. javanica [36] 42 Javanicolide B B. javanica [36] 43 Javanicolide C B. javanica [37] 44 Javanicolide D B. javanica [37] 45 Javanicoside A B. javanica [36] 46 Javanicoside B B. javanica [37] 47 Javanicoside C B. javanica [37] 48 Javanicoside D B. javanica [37] 49 Javanicoside E B. javanica [37] 50 Javanicoside F B. javanica [37] 51 Javanicoside G B. javanica [38] 52 Javanicoside H B. javanica [38] 53 Javanicoside I B. amarissima [39] 54 Javanicoside J B. amarissima [39] 55 Javanicoside K B. amarissima [39] 56 Javanicoside L B. amarissima [39] 57 Yadanzigan B. amarissima [39] B. javanica [40] 58 Yadanziolide B B. javanica [43] 59 Yadanziolide C B. javanica [43] 60 Yadanziolide S B. javanica [41] 61 Yadanzioside A B. javanica [42–44] 62 Yadanzioside B B. javanica [42–44] B. antidysenterica [45]
11 63 Yadanzioside C B. amarissima [39] B. javanica [42–44] 64 Yadanzioside D B. javanica [42] 65 Yadanzioside E B. javanica [42] B. amarissima [39] 66 Yadanzioside F B. javanica [42][43] 67 Yadanzioside G B. javanica [42–44] 68 Yadanzioside H B. javanica [42][43] 69 Yadanzioside I B. amarissima [39] B. javanica [42][43] 70 Yadanzioside J B. javanica [43][44] 71 Yadanzioside K B. amarissima [39] B. javanica [44] 72 Yadanzioside L B. javanica [43][44] 73 Yadanzioside M B. javanica [44] B. antidysenterica [45] 74 Yadanzioside N B. javanica [44] 75 Yadanzioside O B. javanica [44] Ancaloit 76 1,11-dimethoxycanthin-6-one B. antidysenterica [46] 77 11-hydroxy-1-methoxycanthin-6-one B. antidysenterica [47] B. mollis var. tonkinenis [48] 78 Bruceolline A B. mollis var. tonkinenis [49] 79 Bruceolline B B. javanica [6] B. mollis var. tonkinenis [49] 80 Bruceolline C B. mollis var. tonkinenis [48] 81 Bruceolline D B. mollis var. tonkinenis [50] 82 Bruceolline E B. mollis var. tonkinenis [50] 83 Bruceolline F B. mollis var. tonkinenis [50] 84 Bruceolline G B. mollis var. tonkinenis [48] 85 5,11-dimethoxycanthin-6-one B. mollis var. tonkinenis [48] 86 11-hydroxycanthin-6-one N-oxide B. mollis var. tonkinenis [49] 87 1-hydroxy-11-methoxycanthin-6-one B. mollis var. tonkinenis [48] B. antidysenterica [47] 88 4-(ethoxycarbonyl)quinolin-2-(1H)-one B. javanica [58] B. antidysenterica [51] 89 Picrasidine Q B. javanica [52] 90 Flazine B. javanica [53] 91 1-(hydroxymethyl)-b-carboline B. mollis var. tonkinenis [48] 92 1-ethyl-b-carboline B. mollis var. tonkinenis [48] 93 9H-pyrido[3,4-b]indole-1-ethanol B. mollis var. tonkinenis [48] 94 b-carboline-1-propionic acid B. mollis var. tonkinenis [48]
12 95 1-methoxycanthin-6-one B. antidysenterica [47] 96 11-hydroxycanthin-6-one B. mollis var. tonkinenis [48] 97 Canthin-6-one B. javanica [52] 98 5-methoxycanthin-6-one B. javanica [52] 99 11-methoxycanthin-6-one B. javanica [52] 100 Canthin-6-one N-oxide B. mollis var. tonkinenis [49] B. javanica [52] Tritecpenoit và steroit 101 Bruceajavanin A B. javanica [6] 102 Bruceajavanin B B. javanica [6] 103 Dihydrobruceajavanin A B. javanica [6] 104 Daucosterol B. javanica [58] Flavonoit 105 Luteolin-7-O-b-D-glucoside B. mollis var. tonkinenis [59] B.javanica [58] 106 Quercetin-3-O-b-D-galactoside B. javanica [58] Axít béo và các hợp chất khác 107 Axít cerotic B. sumatrana [58] 108 Axít crotonic B. javanica [58] 109 Axít cis-oleic B. javanica [58] 110 Axít palmitic B. sumatrana [58] 111 Axít stearic B. sumatrana [58] 112 Axít linoleic B. sumatrana [58] 113 Axít behenic B. sumatrana [7] 114 Axít 8-hydroxyhexadecanoic B. javanica [41] 115 Axít azelaic B. javanica [41] 116 Axít vanillic B. javanica [58] 1.1.3. Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Brucea Tác dụng sinh học đầu tiên được phát hiện của các cây thuộc họ Simaroubaceae là hoạt tính chống sốt rét [19]. Các nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loài thuộc chi Brucea đã phân lập được nhiều hợp chất có phổ hoạt tính rộng và mạnh như: kháng u, ung thư, virus, amíp 1.1.3.1. Hoạt tính chống sốt rét Vào năm 1987, một nhóm nghiên cứu về các cây thuốc có tác dụng chống sốt rét đã tiến hành thử nghiệm in vitro về hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét của các quassinoit bruceantin 10, bruceantinol 11, bruceine A-D 17-20, yadanziolide A 24,
13 brusatol 34, và dehydrobruceine A 37 được tách ra từ quả cây B. javanica, có giá trị IC50 in vitro trong khoảng 0,046¸0,0008 µg/ml. Như vậy, các quassinoit này kháng rất mạnh chủng ký sinh trùng Plasmodium falciparum gây bệnh sốt rét - chủng đã kháng thuốc chloroquine. Ở thử nghiệm in vivo, khi cho chuột uống một liều tác dụng các quassinoit bruceine A 17, B 18, bruceine D 20, và brusatol 34, đã có tác dụng chống lại sự nhiễm ký sinh trùng P. berghei ở những con chuột này [19]. Năm 1994, Kitagawa và cộng sự đã thông báo rằng các quassinoit bruceajavanin A 101, dihydrobruceajavanin A 103 và bruceolline B 79 ức chế sự phát triển của chủng ký sinh trùng sốt rét kháng chloroquine Plasmodium falciparum K1 [6]. 1.1.3.2. Hoạt tính kháng u và ung thư Cho đến nay, đã có một số công bố về hoạt tính của các hợp chất như: bruceoside C 29 cho thấy hoạt tính gây độc tế bào mạnh kháng lại các tế bào ung thư KB (ung thư biểu mô), A549 (ung thư phổi), RPMI (u ác tính), và TE-671 (u nguyên tủy bào) [30]; bruceoside D 30, E 31, và F 32 cho thấy hoạt tính gây độc tế bào chọn lọc kháng lại các dòng tế bào ung thư bạch cầu, ung thư phổi, ung thư đại tràng, u ác tính, và ung thư buồng trứng với giá trị log|GI50| nằm trong khoảng -4,14 đến -5,72 [31]. Vì vậy, các bằng chứng thực nghiệm thuốc đã cung cấp một giải thích khoa học về việc dân gian đã sử dụng cây B. javanica để điều trị một số bệnh liên quan đến ung thư. Ngoài ra, hai quassinoit bruceatin 10 và bruceantinol 11 cũng có hoạt tính kháng ung thư bạch cầu [10], [17]. 1.1.3.3. Hoạt tính kháng virus TMV (Tobacco Mosaic Virus) TMV là chủng virus gây thiệt hại rất lớn trong ngành trồng trọt. Năm 2010, một báo cáo của các tác giả người Trung Quốc cho thấy các quassinoit 18, 20, 34, 66, 67, 69, 72 tách ra từ cây B. javanica ức chế rất mạnh TMV với phần trăm ức chế lần lượt là 94,6; 84,7; 94,0; 31,1; 33,7; 81,5; 73,8% [60]. 1.1.3.4. Tác dụng chống tiểu đường Mới đây, 2009, người ta đã tiến hành thử nghiệm tác dụng làm giảm hàm lượng đường trong máu của hai quassinoit bruceine D 20 và E 21 lên chuột với liều 1mg/kg cho thấy hai hợp chất này làm giảm đến 48,82 (± 13,34%) và 40,07 (±
14 11,45%) nồng độ đường trong máu của chuột [61]. Tiếp tục thử nghiệm hai hợp chất này trên các con chuột bị đái đường bởi STZ. Kết quả cho thấy bruceine D và bruceine E lần lượt làm giảm đến 87,99 ( ± 2,91%) và 73,57 (± 13,64%) hàm lượng đường trong máu của chuột [61]. 1.1.3.5. Hoạt tính kháng ký sinh trùng mũi khoan Năm 2008, Ken Katakura và cộng sự tách được 11 quassinoit khung C-20 từ quả của cây B. javanica. Tác giả đã tiến hành thử hoạt tính kháng ký sinh trùng mũi khoan Trypanosoma evansi cho các quassinoit này. Trong số đó thì các hợp chất bruceantinol A 12, bruceine B 18, bruceine C 19, bruceine D 20 và brusatol 34 cho hoạt tính kháng ký sinh trùng mũi khoan rất mạnh, với các giá trị IC50 dao động từ 2,9-17,8 mM [62]. 1.1.3.6. Hoạt tính kháng amíp Dịch chiết MeOH và CHCl3 của cây B. javanica có hoạt tính kháng amíp đáng kể [54]. Năm 1988, Colin W. Wright đã tiến hành thử hoạt tính kháng amíp của năm quassinoit tách ra từ các dịch chiết của cây B. javanica gồm bruceantin 10, bruceine A-D (17-20). Các hợp chất này cho hoạt tính kháng amíp rất mạnh với giá trị IC50 (μg/ml) lần lượt là 0,019; 0,097; 0,306; 0,279; 0,386 [64]. 1.1.3.7. Các hoạt tính khác Các nhà nghiên cứu đã phát hiện thấy hợp chất dehydrobruceantin 36 kháng lao trên in vitro [55]. Ngoài ra, các hợp chất bruceoside A 27, bruceine D 20, yadanzigan 57, javanicolide B 42, yadanziolide S 60, flazine 90, axít 8- hydroxyhexadecanoic 115, và axít azelaic 116 được tách ra từ B. javanica cho thấy gây ra sự khác biệt tế bào ung thư bạch cầu ở người (HL-60) và ức chế COX-1, COX-2 và 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) là các tác nhân gây ra sự tổn thương ở vú chuột [41]. Hoạt tính kháng virus và kháng viêm ở B. javaniva cũng được nghiên cứu [56], [57]. 1.1.4. Sơ lược lớp chất quassinoit 1.1.4.1. Giới thiệu Quassinoit được biết đến như là các hợp chất có vị đắng đặc trưng [65]. Lớp
15 chất này xét về mặt hóa học là các tritecpen thóai biến và được phân loại thành năm bộ khung cơ bản gồm có: C-18, C-19, C-20, C-22, C-25 (Hình 1.1) [66]. Trong đó các quassinoit có khung C-20 được chú ý nghiên cứu nhiều hơn vì chúng có hoạt tính kháng ung thư bạch cầu được phát hiện ra vào đầu những năm 1970 bởi Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ. Lớp chất quassinoit khung C-20 được phân thành hai loại: loại bốn vòng (tetracyclic) và loại năm vòng (pentacyclic). Dạng bốn vòng phổ biến không có nguyên tử ôxy ở vị trí C-20, còn dạng năm vòng thì có thêm một ôxy nguyên tử ở vị trí cacbon C-20 và cho phép tạo thêm một vòng nữa. Tuy nhiên, các quassinoit có bộ khung khác, đặc biệt là các quassinoit có bộ khung C-19 gần đây cũng được chú ý nhiều hơn [67], [68]. Các hợp chất quassinoit thể hiện phổ hoạt tính sinh học rộng in vivo và in vitro bao gồm như: kháng u, kháng virus, kháng HIV, kháng ung thư, chống sốt rét, kháng viêm, chống côn trùng, trị lở loét và diệt cỏ. O O C O C O O O C18 C19 C20 O O O O O O O O C22 C25 Hình 1.1. Các bộ khung cơ bản của lớp chất quassinoit 1.1.4.2. Phân lập và xác định cấu trúc Cho đến nay, lớp chất quassinoit chỉ được tìm thấy ở trong các loài thuộc họ Simaroubaceae như Brucea antidysenterica Mill, Brucea javanica Merr, Brucea mollis var. tonkinensis, Simaba amara, Picrasma ailanthoides, Pierreodendron kerstingii và Ailanthus grandis. Tất cả các loài này thuộc phân họ Simarouboidaea của họ Simaroubaceae. Hai hợp chất quassinoit đầu tiên được phân lập từ gỗ cây Quassia amara là quassin 117 và neoquassin 118 (hình 1.2), cả hai đều thuộc nhóm quassinoit có bộ khung C-20 [69]. Hai chất này được Clark phân lập vào đầu những năm 1930 [69], và cấu trúc hóa học của chúng do Valenta xác định vào đầu những
16 năm 1960 với sự trợ giúp của các kĩ thuật vật lý hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR [70]. Một số loài thuộc họ Simaroubaceae đã được nghiên cứu về thành phần hóa học. Các hợp chất chính được tách ra có cấu trúc hóa học tương tự quassin - là quassinoit đầu tiên được tách ra. Vì vậy, tất cả các hợp chất này được gọi chung là lớp chất quassinoit [71]. Việc nghiên cứu lớp chất quassinoit đã thu hút các nhà khoa học kể từ khi cấu trúc của quassin được xác định và hoạt tính kháng bệnh ung thư bạch cầu của các quassinoit được công bố. OMe OMe O 12 O O 11 O 18 19 13 MeO 1 10 9 14 MeO 15 2 8 5 H 7 H 16 H H 3 O O O 4 6 OH H H H H 17 117 118 Hình 1.2. Quassin 117 và neoquassin 118 là hai quassinoit đầu tiên được phân lập từ cây Quassia amara Các nghiên cứu và ứng dụng của lớp chất quassinoit tiếp tục mở rộng suốt những năm 1990, với việc phân lập và xác định cấu trúc của nhiều hợp chất mới. Cho đến nay đã có hơn 150 quassinoit được phân lập và mô tả đầy đủ. Có một điều đặc biệt là các quassinoit chỉ được tìm thấy trong họ Simaroubaceae và đây là một đặc điểm về thành phần hóa học để phân biệt các loài trong họ Simaroubaceae với các loài trong các họ khác. 1.1.4.3. Sinh tổng hợp các quassinoit Tất cả các quassinoit đều được sinh tổng hợp thông qua con đường tương tự như ở tritecpenoit [65]. Quá trình sinh tổng hợp bắt đầu với sự thóai biến của các tritecpen gồm: sự mất đi một nhóm methyl ở vị trí C-4 và bốn nguyên tử cacbon ở cuối mạch nhánh. Một phản ứng ôxy hóa tương tự phản ứng Bayer-Villiger dẫn đến sự chia cắt liên kết giữa C-16 và C-17, tạo điều kiện cho nó hình thành một vòng δ-lacton thông qua phản ứng của nhóm cacbonyl C-16 và nhóm 7α-OH. Các quassinoit C-20 là được hình thành như vậy. Ngoài ra, sự thêm vào một nguyên tử ôxy ở liên kết C- 13/C-17 sẽ làm cho liên kết này bị đứt gẫy, kết quả là sự tạo thành hầu hết các
17 quassinoit C-19 và C-20. Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp các quassinoit 1.1.4.4. Bán tổng hợp các quassinoit Bán tổng hợp các hợp chất thiên nhiên thường dùng để thay thế cho các hợp chất có hoạt tính sinh học nhưng lại có hàm lượng thấp trong tự nhiên. Có thể lấy một ví dụ thành công nhất cho việc bán tổng hợp các quassinoit là sự chuyển hóa bruceoside A 27, một hợp chất dễ dàng thu được từ Brucea javanica Biomass [72], thành bruceantin 10 (hình 1.4)(trang 18), hợp chất này rất khó để có lượng lớn dùng trong việc thử nghiệm lâm sàng nhằm chứng tỏ hoạt tính kháng ung thư bạch cầu mạnh của nó [73]. Bruceoside A 27 một khi bị thủy phân sẽ cho hợp chất 119, hợp chất này sau đó có thể bị este hóa và tạo thành một hỗn hợp gồm các hợp chất 120 và 121. Hợp chất 121 tiếp tục bị este hóa một lần nữa để đến 120, phản ứng thủy phân chọn lọc tiếp theo của nhóm este ở vị trí C-3 sẽ cho bruceantin 10 với hiệu suất 40%. Quy trình bán tổng hợp này đảm bảo nguồn thay thế bruceantin cung cấp cho các cuộc thử nghiệm lâm sàng.
18 Hình 1.4. Bán tổng hợp bruceantin từ bruceoside A 1.1.4.5. Tổng hợp toàn phần các quassinoit Tổng hợp bruceantin 10 được thực hiện bởi nhóm Grieco là ví dụ đầu tiên về tổng hợp toàn phần các quassinoit [74]. Qui trình tổng hợp bắt đầu với sự bảo vệ nhóm hydroxymethyl của một hợp chất xeton có ba vòng 122 tại vị trí C-8, tiếp theo là cacbomethoxy hóa để nhận được hợp chất 123. Các liên kết đôi α, β chưa bão hòa được no hóa bằng phản ứng với selenyl và tách loại của axít benzeneselenic để nhận được một hợp chất enone ba vòng 124, enone này được chuyển thành hợp chất 125 bằng cách thêm vào hai đơn vị cacbon và phân cắt nhóm bảo vệ. Brôm hóa hợp chất 125, sau đó đun nóng với collidine sẽ nhận được hợp chất 127, hợp chất này có thể được chuyển hóa lượng lớn thành hợp chất xeton bốn vòng 128. Việc cộng hai nhóm OH (axial) ở vị trí trans vào vòng C qua qui trình tám bước sẽ nhận được hợp chất 132 và chuẩn bị để tạo thành vòng D. Sau khi bảo vệ có chọn lọc, sự ôxy hóa, sự khử và gỡ bỏ nhóm bảo vệ ta thu được hợp chất triol 134, hợp chất này tiếp tục qua bốn giai đoạn nữa để nhận được hợp chất lacton năm vòng 135. Từ 135 ta sẽ có 138 thông qua quá trình tách, ôxy hóa và thủy phân. Sự acyl hóa 138, sau đó là sự ôxy hóa sẽ cho 140, hợp chất này sau khi gỡ bỏ bảo vệ hai nhóm OH ở vòng C sẽ cho hỗn hợp tinh thể racemic bruceantin (10) (Hình 1.5, trang 19).
19 Hình 1.5. Tổng hợp toàn phần bruceantin Tuy nhiên, qui trình này trải qua rất nhiều bước, vì vậy không cho hiệu suất cao, nên nó chỉ có thể mang tính chất nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. 1.1.4.6. Hoạt tính sinh học của lớp chất quassinoit
20 Kể từ khi khám phá ra hoạt tính kháng ung thư bạch cầu mạnh của bruceantin năm 1973 [17], các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các quassinoit tăng mạnh. Bên cạnh bruceantin thì các quassinoit khác cũng thể hiện hoạt tính sinh học khác in vitro và/hoặc in vivo gồm: kháng u, chống sốt rét, kháng virus, gây độc tế bào, chống viêm, kháng côn trùng, kháng HIV, kháng amíp và diệt cỏ (xem mục 1.1.3, trang 12). 1.1.5. Loài Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. Ex Kurz) Ở Việt Nam, họ Thanh Thất (Simaroubaceae) có tám chi, trong đó chi Brucea có ba loài gồm Brucea javanica, Brucea mollis và Brucea mollis var. tonkinensis [5]. Cây Brucea mollis còn có tên là Sầu đâu rừng hay Khổ sâm mềm, thường mọc ở vùng Lào Cai, Kom Tum, Lâm Đồng [1]. Hình thái thực vật của cây Brucea mollis khá giống với cây Meliosma pinnata thuộc họ Sabiaceae. Để tránh nhầm lẫn khi thu hái hai loài này, chúng tôi đưa ra một số mô tả về đặc điểm thực vật của cây Brucea mollis (Khổ sâm mềm) như sau: Brucea mollis Wall. ex Kurz - Khổ sâm mềm Wall. ex Kurz, Bengal 42: 64. Tên đồng nghĩa: Brucea acuminata H. L. 1873. J. Asiat. Soc. Li. Tên Việt Nam khác: Cứt chuột, Sầu đâu rừng. Cây bụi hoặc gỗ nhỏ, cao l-5 m. Cành nhỏ màu vàng-xanh, có lông; cành to màu đỏ-nâu với nhiều bì khổng màu trắng. Lá kép lông chim lẻ, cỡ 20-45(-60) cm; trục và cuống lá có nhiều lông vàng; lá chét 5-15; cuống lá chét dài 3-7 mm; phiến lá hình bầu dục-mác, trứng-mác hoặc mác rộng, cỡ 5-12(-15) × 2,5-5 cm, phủ lông nâu khi non, sau nhẵn; gốc hình nêm rộng hay hơi tròn, lệch, mép nguyên; đỉnh có đuôi dài hay nhọn; gân bên 8-10 cặp. Cụm hoa hình chùy, dài 10-25 cm, mảnh; trục phủ lông rậm màu vàng, sau thưa hoặc nhẵn. Đường kính hoa 2-3 mm. Cánh hoa hình cái thìa, có lông ngắn, dài hơn nhị. Đĩa hình cầu ở hoa đực, hình cái bát nông ở hoa cái. Bầu có lông. Quả hạch, hình trứng, cỡ 8-12 × 6-8 mm, nhẵn, màu nâu đỏ khi khô, có hình mạng lưới nông [5], [63].
21 Hình 1.6. Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) Sinh học và sinh thái: Mùa quả tháng 6-12. Mọc rải rác trong rừng, ở độ cao 1200-1700 m. Phân bố: Lào Cai (Sa Pa), Hòa Bình (Mai Châu, Pà Cò), Kon Tum (Đác Glây, Ngọc Linh), Lâm Đồng (Đà Lạt, Lang Bian). Còn có ở Trung Quốc, Mianma, Lào, Campuchia, Ấn độ, Malaysia, Thái Lan, Philippin, Nepal. Mẫu nghiên cứu: Hòa Bình (Mai Châu, Pà Cò), 15/12/1999, Phương 2228 (HN); 24/6/2008, VK 2211 (HN). 1.2. Chi Glycosmis 1.2.1. Đặc điểm hình thái và phân bố Theo hệ thống phân loại thực vật của Engler, chi Glycosmis thuộc họ cam quýt (Rutaceae), phân họ Aurantioideae, phân nhóm Clauseneae [75]. Phân nhóm Clauseneae có ba chi: Glycosmis, Clausena và Murraya [76]. Cả ba chi này đều có ở nước ta. Trên thế giới, đến nay người ta đã ghi nhận chi Glycosmis có 66 loài với 124 thứ (variety), phân bố ở trung và đông nam châu Á [77], [78]. Chúng là các loại cây bụi hay cây thân gỗ nhỏ có lá lông chim hay lá đơn với các tuyến trong mờ. Chồi được che phủ bởi lớp lông tơ ngắn và có màu gỉ sét. Hoa trắng, nhỏ, khó thấy, mọc thành chùm, sau khi được thụ phấn sẽ phát triển thành loại quả mọng có vỏ màu vàng, hồng, đỏ hay da cam [79]. Ở Việt Nam, Võ Văn Chi và các cộng sự đã mô tả năm loài Glycosmis [80]. Phạm Hoàng Hộ cho biết 21 loài và đã mô tả khá chi tiết 20 loài Glycosmis, chiếm
22 một phần ba tổng số loài trên thế giới [5]. Các loài Glycosmis phân bố trong cả nước, từ Bắc đến Nam bộ, thường thấy mọc hoang ở vùng đất cao trung bình và vùng rừng núi. Chi Glycosmis có tên chung là Cơm rượu, lấy tên từ loài G. pentaphylla Correa, vì lá của cây này được dùng để làm thơm rượu [5]. Ngoài ra lá loài G. cymosa và G. citrifolia cũng được dùng trong công thức men rượu [80]. Trong tổng số 21 loài tìm thấy ở Việt Nam, hiện mới chỉ có hai loài là G. stenocarpa và G. petelotii (Guill) đã bước đầu được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ở nước ta [5], [81]. Tám loài khác đã được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính tính sinh học ở các nước khác. 1.2.2. Sử dụng trong dân gian Chi Glycosmis có nhiều loài đã được sử dụng rộng rãi từ lâu trong dân gian ở nhiều nước. Loài được biết đến nhiều nhất là G. pentaphylla. Người Ấn Độ hay dùng loài này làm thuốc trị ho, thấp khớp, thiếu máu, tiêu chảy, vàng da. Nước ép từ lá cây này dùng để chữa sốt, bệnh về gan và trị giun, nước sắc từ rễ dùng để chữa sưng mặt, cành nhỏ có sợi còn có tác dụng làm săn và dùng để chải răng [82], [83]. Ở Trung Quốc, nước sắc từ rễ và lá của G. pentaphylla được dùng để chữa ho, chữa thâm tím mình mẩy. Ở Malaysia người ta uống nước sắc từ rễ để chữa sưng mặt. Hoa cây này trộn với hạt tiêu chữa ngứa ngáy; vỏ thân được dùng với Datura làm độc cá. Ở Inđônexia, nước sắc rễ dùng để điều trị các bệnh về mật [84]. Loài G. arborrea (Roxb.) DC cũng là một cây thuốc phổ biến ở Ấn Độ với các tên như Ashshoura, Bon-nimbu, dùng để chữa sốt, đau gan và một số bệnh khác [85]. Ở Đài Loan, loài G. citrifolia (Willd.) Lindl. được sử dụng chữa ngứa ghẻ, mụn nhọt và sưng u [86]. Nước sắc từ lá của loài G. ovoidea Pierre dùng để điều trị đau nhức; nước sắc từ rễ và lá cây G. puberula Lindl. dùng chống nhiễm trùng sau khi đẻ; hỗn hợp gồm vỏ, thân, rễ và lá với hạt tiêu đen, gạo dính dùng để chống nôn [84]. Ở Việt Nam, một số loài trong chi Glycosmis đã được sử dụng từ lâu trong dân gian. Loài G. pentaphylla được sử dụng nhiều nhất với rễ dùng để chữa phong thấp, chân tay nhức mỏi, bán thân bất toại, tích huyết ở phụ nữ sau khi sinh, mụn nhọt, chốc lở, rắn cắn. Lá của loài này đem sao vàng, sắc đặc cho phụ nữ uống sau khi
23 sinh để kích thích tiêu hóa, làm ăn ngon miệng [81]. Rễ và lá của loài Cơm rượu hoa nhỏ (G. parviflora) được dùng làm thuốc trị ho, cảm mạo, ăn không tiêu, đầy bụng, đau sán khi đòn ngã sưng ứ và nứt nẻ da [79]. Lá của loài G. citrifolia phối hợp với lá của cây Cơm rượu (G. pentaphylla) làm men tăng hiệu suất rượu. Rễ và lá của loài G. citrifolia này thường được dùng để trị ho, cảm lạnh, khó tiêu hóa, đau dạ dày, đau thóat vị. Ngoài ra đem giã tươi lá trộn với rượu còn được dùng để đắp trị đòn ngã tổn thương. Khi bị phát cước, tê cứng vì sương giá đồng bào dân tộc thường dùng lá của loài này nấu nước để rửa phần đau [87]. Nguyễn Nghĩa Thìn còn cho biết, đồng bào Dao vùng Ba Vì - Hà Nội còn sử dụng loài Glycosmis lanceolata chữa bệnh về răng, tai và loài G. cyanocarpa chữa chó cắn, rắn cắn [88]. 1.2.3. Thành phần hóa học chi Glycosmis Kể từ nghiên cứu đầu tiên về hóa học chi Glycosmis năm 1935 của Sikhibhushan cho tới nay đã có gần 200 chất được phân lập từ các loài Glycosmis. Trong đó, có 94 chất lần đầu được phát hiện trong tự nhiên. Ancaloit chiếm phần lớn trong tổng số chất được tìm thấy (hơn 140 chất), thuộc nhiều kiểu khung phong phú như arcridon, quinazolin, quinolin, indol, cacbazol, và đặc biệt là các hợp chất amít chứa lưu huỳnh. Hầu hết các chất được phân lập từ lá, một số từ vỏ, rễ, thân, hạt và hoa. Các hợp chất tách ra từ chi Glycosmis cũng bao gồm những lớp chất phổ biến trong họ cam quýt như cumarin, tritecpenoit, flavonoit và ancaloit. Cùng với các lớp chất phong phú, đa dạng như vậy, chúng cũng có nhiều hoạt tính lý thú như kháng nấm, trừ sâu, chống sốt rét, giảm stress, chống ung thư, là tác nhân bảo vệ gan Dưới đây sẽ trình bày các loại hợp chất đã được phân lập từ các loài Glycosmis. 1.2.3.1. Tecpenoit Năm 1996, Charkravarty đã phân lập được một monotecpen là 3,6-dihydroxy- 10-nor-7-megastigmen 141 từ loài G. arborea [89].
24 Cũng từ loài G. arborea này, đã phân lập và xác định cấu trúc của hai đồng phân lập thể là hai tritecpenoit kiểu khung lupeol, chỉ khác nhau về cấu hình tại vị trí 3, đó là arborinol A (dạng 3a) 142 và arborinol B (dạng 3b) 143 [90]. 1.2.3.2. Flavonoit Từ loài G. citrifolia thu hái ở Đài Loan, đã phân lập được bốn flavonoit . Đó là glychalcon-A 144, glychalcol-B 145, glyflavanon-A 146 và glyflavanon-B 147 [86]. Năm 2005, Wang cùng các cộng sự thông báo đã tách được bốn flavonoit từ loài G. montana bao gồm glymontanin A 148, glymontanin B 149 và hai flavol dạng dime là montahomobisflavan A 150 và montahomobisflavan B 151 [91].
25 1.2.3.3. Cumarin Tài liệu [92] cũng cho biết đã có ba cumarin là angelical 152, limettin 153 và xanthyletin 154 được Talapatra cùng các cộng sự phân lập từ cây G. cyanocarpa mọc ở Ấn Độ và xác định cấu trúc vào năm 1975 [93]. 1.2.3.4. Ancaloit Ancaloit là nhóm hợp chất tự nhiên chính được phân lập từ chi Glycosmis. Năm 1952, lần đầu tiên một số nhà nghiên cứu Ấn Độ công bố kết quả phân lập các ancaloit từ loài G. pentaphylla [94], [95]. Cho tới nay đã có gần 100 ancaloit được tìm thấy, chúng thường có dạng quinolon, quinazolin, quinazolon, furoquinolin, cacbazol và acridon. OC2H5 5 4 CH2CH=CHCH3 6 3 2 7 N O 8 1 OH CH3 156 Glycolon B O 5 4 1 H 4 6 8 N 3 HO N 9 3 5 2 7 7 2 2 N 3 8 1 6 6 H C N 1 3 4 5 7 H CH3 OCH 157 Glycorin 158 Cacbaletxin 3 159 3,7-diprenylindol 1.2.3.5. Các ancaloit dạng amít chứa lưu huỳnh Chi Glycosmis là nguồn giàu các amít chứa lưu huỳnh, với các kiểu khung khá phức tạp và phong phú. Amít chứa lưu huỳnh trong chi Glycosmis được bắt đầu nghiên cứu từ năm 1967 bởi nhóm nghiên cứu của Alilbrecht. Cho đến nay đã phân lập và nhận dạng được 40 ancaloit loại này.
26 Bên cạnh đó còn có các hợp chất amít cũng được tách ra từ chi này. Từ dịch chiết metanol của lá loài G. ovoidea mọc ở Thái Lan và cây G. parva đã tách được hai amít doisuthin 163 và khaochamit 164 [96], [97]. 1.2.3.6. Glycosid
27 Hợp chất đầu tiên được phân lập từ chi Glycosmis là một glycosid tinh thể có tên glycosmin từ dịch chiết benzen của lá loài G. pentaphylla ở Ấn Độ [98]. Cho đến nay, đã có hơn 10 dạng glucosid được phân lập từ chi này. Ví dụ như: 3',7-dihydroxy-4',5,6-trimethoxyisoflavone 7-O-(5-O-trans-p- coumaroyl)-b-D-apiofuranosyl-(1®6)-b-D-glucopyranoside 165, glycopentoside B 166; glycopentoside C 167 [99], [100]. 1.2.4. Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Glycosmis Mặc dù chưa được nghiên cứu nhiều nhưng các chất tách từ chi Glycosmis thể hiện phổ hoạt tính khá rộng bao gồm ức chế khối u, kháng ung thư, kháng vi khuẩn, kháng ký sinh trùng sốt rét, kháng nấm, trừ sâu bọ Các dạng chất có hoạt tính bao gồm các ancaloit khung cacbazol, acridon, và các amít chứa lưu huỳnh [101-106]. 1.2.5. Loài Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) Cây cơm rượu trái hẹp có tên khoa học là Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum. Ngoài ra cây này còn có tên là Atalantia stenocarpa Drake, hoặc Murraya stenocarpa (Drake) Guill [5]. Đây là loài có thân gỗ nhỏ, cao 1 m, có mùi thơm gắt, không có gai, không lông; lá thon, to (5-11 x 2-4 cm), bìa lá có răng cưa mịn, cuống lá dài 1-2,3 cm; lá mỏng, mặt trên màu nâu, láng; gân lá có 12-24 cặp; hoa phát ở nách lá, cánh hoa dài 4 mm, tiểu nhụy có chỉ rời nhau, đĩa mật, noãn sào không có lông; trái mập, màu đỏ nhạt, xoan tròn, to khoảng 13-15 mm; hột dài 11- 12 mm, rộng 4 mm [5]. Loài Glycosmis này đã được phát hiện thấy trong vườn quốc gia Cúc Phương [107]. Hình 1.7. Cây Cơm rượu trái hẹp Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum
28 Năm 2005, nhóm tác giả N.M. Cuong, T.Q. Hung, T.V. Sung và Walter C. Taylor đã tách được ba cacbazol, trong đó có một dime cacbazol mới, từ phần dịch chiết n-hexan và cloroform từ rễ của loài G. stenocarpa, Các hợp chất đều được đem thử nghiệm hoạt tính sinh học và cho thấy chúng có các hoạt tính sinh học phong phú [108]. Hợp chất bisisomahanin Đây là hợp chất mới, lần đầu tiên được phát hiện trong tự nhiên. Hợp chất murrayafolin A Hợp chất murrayanin Qua thử nghiệm hoạt tính sinh học các tác giả cho biết đã xác định được hai hợp chất 173 và 174 đều có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tốt. Hợp chất murrayafolin A có nồng độ ức chế tối thiểu MIC đối với các vi khuẩn E. coli, B. subtilis, S. aureus, P. aeruginosa trong khoảng 6,25-50 mg/ml và đối với các nấm C. albicans, S. cerevisar, A. niger, F. oxysporum trong khoảng 6,25-50 mg/ml. Hợp chất murrayanin có nồng độ ức chế tối thiểu MIC đối với các vi khuẩn E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa trong khoảng 25-50 mg/ml và đối với các nấm S. cerevisar,
29 A.niger là 50 mg/ml. Thử nghiệm gây độc tế bào cho thấy cả hai hợp chất murrayafolin A và murrayanin đều có hoạt tính gây độc tế bào đối với ba dòng tế bào ung thư: dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), dòng tế bào ung thư gan (Hep-2) và dòng tế bào ung thư màng tim (RD), nhưng riêng murrayafolin A thể hiện hoạt tính mạnh, IC50 của nó đối với KB, Hep-2 và RD lần lượt là 1,3; 0,24 và 2,41 mg/ml. Mới đây, 2010, một công bố của nhóm tác giả Hàn Quốc và Việt Nam đã cho thấy hợp chất murrayafolin A có tác dụng ức chế con đường tạo Wnt/b-catenin, một hệ protein được tạo ra trong các tế bào ung thư ở giai đoạn phát triển. Con đường Wnt/b-catenin này dẫn đến sự tích tụ b-catenin trong một số tế bào bệnh lý, đặc biệt có nhiều loại tế bào ung thư đại tràng di căn ở người. Các thử nghiệm đã chứng minh murrayafolin A là chất đối kháng với con đường Wnt/b-catenin. Murrayafolin A gây ra sự giảm b-catenin thông qua một cơ chế không phụ thuộc vào sự photphoryl hóa N-terminal của b-catenin và Siah-1. Murrayafolin A có tác dụng ức chế sự tăng sinh của dòng ung thư đại tràng HCT-116 và SW480 [3].
30 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) được thu hái vào tháng 3/2009, ở Mai Châu, tỉnh Hoà Bình. Tên khoa học của cây do TS. Trần Thế Bách (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật) xác định. Mẫu tiêu bản của cây được lưu trữ tại phòng tiêu bản thực vật HN thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, kí hiệu mẫu là VK 2211 (HN). Cây cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa - (Drake) Guillaum) được thu hái tại xã Hoàng Hoa Thám, huyện Chí Linh, tỉnh Hải Dương, Việt Nam vào tháng 2/2009 , tên khoa học của cây được xác định bởi nhà thực vật học Ngô Văn Trại - Viện Dược liệu. Mẫu thực vật sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, phơi khô và sấy ở nhiệt độ 50-60oC cho đến khô. Sau đó mẫu được xay nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng MeOH ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần như: n-hexan, cloroform hoặc điclometan, etyl axetat, BuOH và MeOH. Các dung môi dùng để chiết tách và chạy sắc ký là dung môi công nghiệp được làm khan, lọc và cất lại trước khi sử dụng. 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết Các phương pháp sắc ký được sử dụng để nhận biết và phân lập các hợp chất từ cặn chiết thô bao gồm: sắc ký bản mỏng TLC, sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (Merck loại 40-63 mm) hoặc pha đảo (ODS, YMC (30-50 μm)), sắc ký cột Diaion HP-20, Sephadex LH-20. Bên cạnh đó còn dùng phương pháp kết tinh để thu chất sạch. 2.1.3. Các phương phương xác định cấu trúc hóa học các hợp chất Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ra được xác định bằng cách kết
31 hợp các phương pháp vật lý và hóa học, sử dụng các phương pháp phổ như: phổ khối lượng (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D, 2D-NMR). 2.1.3.1. Xác định điểm chảy và góc quay cực Điểm nóng chảy được đo trên máy Boetius, góc quay cực đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet là 1 cm. 2.1.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) Phổ khối ion hóa bụi điện tử ESI-MS được ghi trên máy ghi Agilent 6310 Ion Trap, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS. 2.1.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz với TMS là chất chuẩn nội. 2.1.4. Phương pháp thử hoạt tính gây độc (ức chế) tế bào ung thư in vitro 2.1.4.1. Vật liệu + Hóa chất: do Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên cung cấp và các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen v.v. + Các dòng tế bào ung thư: KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi người), Hep-G2 (ung thư gan người), MCF-7 (ung thư vú người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thư máu cấp tính) do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp. 2.1.4.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L sodium bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum-FBS (GIBCO). Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở o điều kiện 37 C, 5% CO2. 2.1.4.3. Phép thử sinh học xác định hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic assay) Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất được đánh giá bằng phương pháp
32 sulforhodamine B (SRB). Các tế bào ung thư được nuôi trong phiến vi lượng 96 giếng với nồng độ 3×104 tế bào/mL. Các mẫu đánh giá được hoà tan trong DMSO 10% đến nồng độ 100μg/mL. Các mẫu này được chia làm 3 lần. Nồng độ DMSO cuối cùng được điều chỉnh nhỏ hơn 0,1%. Phép thử kéo dài trong 3 ngày. Một phiến vi lượng để trống xem như là mẫu so sánh 0 ngày. Các phiến còn lại được ủ trong môi trường ẩm chứa 5% CO2 trong 72h. Trong khi đó phiến 0 ngày được ủ trong 1h. Sau khi ủ xong, quay cất dịch, thu được các tế bào ung thư. Các tế bào ung thư còn lại ở phiến 0 ngày được trộn với tricloroaxetic 10% (TCA) khoảng 1h ở 4oC. Còn các tế bào ung thư ở các phiến còn lại được trộn với tricloroaxetic 70% (TCA) khoảng 2h ở 4oC. Các tế bào ung thư sau khi xử lí với TCA được rửa nhiều lần với nước và làm khô bằng không khí. Sau đó, thêm vào mỗi phiến 50μl dung dịch SRB (0,4% trong CH3COOH) ở nhiệt độ phòng. Sau khi để yên khoảng 1h, các phiến được rửa 3-4 lần với CH3COOH 1% và làm khô bằng không khí. Quá trình nhuộm chỉ thực hiện duy nhất 1 lần bằng cách thêm vào 10 mmol Tris base không đệm. Hàm lượng protein tổng số được đo ở bước sóng 515 nm bằng máy Microplate Reader (BioRad). Hoạt chất được chuẩn bị cho thí nghiệm ở các nồng độ 100 mg/ml; 20 mg/ml; 4 mg/ml; 0,8 mg/ml. Phần trăm tế bào ung thư sống sót theo từng nồng độ mẫu thử được tính theo công thức: % growth = [absorbance (test substance) – absorbance (0-day control)]*100/[absorbance (negative control) – absorbance (0-day control)]. Dữ liệu sau đó được phân tích bằng bảng Excel và giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ phần mềm TableCurve phiên bản số 4. DMSO 10% là dung môi pha chất được sử dụng như đối chứng âm. Ellipticine được sử dụng làm đối chứng dương ở các nồng độ 100 mg/ml; 20 mg/ml; 4 mg/ml; 0,8 mg/ml. 2.2. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách Lá cây Khổ sâm mềm sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi khô, nghiền thành bột (2,6 kg), ngâm chiết trong metanol (12 lít × 3 lần). Dịch chiết metanol sau đó được quay
33 cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 191g dịch cô. Dịch cô này được hoà vào 1,5 lít hỗn hợp MeOH:nước (1/1) rồi chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi n-hexan, điclorometan, etyl axetat. Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexan (80 g), điclometan (21 g), etyl axetat (8 g) và dịch nước còn lại. Hai cặn chiết n-hexan và điclometan cho các vết giống nhau trên sắc ký bảng mỏng TLC, vì vậy gộp hai cặn chiết này lại và tiến hành tách phân đoạn trên Hình 2.1. Sơ đồ phân đoạn các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm cột với chất hấp thụ là silica gel pha thường và hệ dung môi rửa giải lần lượt là n- hexan:axeton 100 - 40/1 - 20/1 - 10/1 - 5/1 - 2,5/1 - 1/1 - 0/100, thu được tám phân đoạn 1E (10 g), 1F (5 g), 1G (27 g), 1H (8 g), 1I (14 g), 1K (9 g), 1L (15 g), 1M (15 g). Phân đoạn 1G (27 g) tiếp tục tách phân đoạn trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải điclometan:metanol (gradient, 1-100%), thu được 11 phân đoạn 12A (3 g), 12B (1,3 g), 12C (2,4 g), 12D (2,8 g), 12E (1 g), 12F (1,4 g), 12G (4,1g), 12H (700 mg), 12I (1 g), 12L (1,9 g), 12S (0,76 g). Phân đoạn 12F (1,4 g) xuất hiện tinh thể, lọc rửa bằng axeton thu được chất sạch BM.01 (22 mg). Phân đoạn 12G (4,1 g) chạy tách chất lần lượt qua hai cột sắc ký trên silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải lần lượt là điclometan (100%) và n-hexan:axeton 20/1, thu được chất sạch BM.02 (24 mg). Hai phân đoạn
34 12I và 12L xuất hiện chất kết tinh, tiến hành lọc rửa bằng metanol thu được chất sạch BM.03 (570 mg). Phân đoạn 12B được tiến hành sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexan:điclometan 2/1 thu được ba phân đoạn 14A (500 mg), 14B (180 mg), 14C (140 mg). Gộp hai phân đoạn (14B+14C) tiến hành sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexan:etyl axetat 40/1, thu được hai chất sạch BM.04 (70 mg) và BM.05 (75 mg). Từ 8 g cặn chiết etyl axetat tiến hành sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải axeton:cloroform:metanol 3/1/0,1, thu được tám phân đoạn 2A (2 g), 2B (1g), 2C (50 mg), 2D (1,5 g), 2F, 2G (700 mg), 2H (500 mg) và 2I (400 mg). Phân đoạn 2D (1,5 g) xuất hiện chất rắn kết tinh màu vàng, lọc rửa bằng metanol thu được chất sạch BM.06 (280 mg). Tương tự với hai phân đoạn 2F và 2G cũng xuất hiện chất kết tinh màu vàng nhạt, lọc rửa bằng metanol thu được chất sạch BM.07 (170 mg). Phân đoạn 2A (2 g) được chạy tách chất trên cột YMC với hệ dung môi rửa giải metanol:nước 2/3 thu được năm phân đoạn 5A (360 mg), 5B (210 mg), 5C (140 mg), 5D (150 mg), 5E (200 mg). Phân đoạn 5C (140 mg) tiến hành sắc ký cột trên silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải điclometan:n- hexan:axeton 4/1/1, thu được chất sạch BM.08 (20 mg). Từ phân đoạn 2D (1,5 g) chạy tách chất trên cột YMC với hệ dung môi rửa giải metanol:nước 1/2 thu được bốn phân đoạn 8A (200 mg), 8B (32 mg), 8C (30 mg), 8D (30 mg). Phân đoạn 8A (200 mg) được tiến hành sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải điclometan:metanol 10/1, thu được chất sạch BM.09 (30 mg). Phân đoạn 8B (32 mg) được tách bằng sắc ký bản mỏng điều chế TLC với hệ dung môi CH3Cl:MeOH 20/1 thu được chất sạch BM.10 (15 mg). Từ phân đoạn 2B (1 g) chạy tách chất trên cột YMC với hệ dung môi rửa giải metanol:nước 1/4 thu được hai phân đoạn 18A (30 mg), 18B (32 mg), và một chất sạch BM.10 (66 mg) (đã thu được ở trên). Hai phân đoạn 18A và 18B xuất hiện chất rắn kết tinh, lọc rửa bằng metanol thu được hai chất sạch tương ứng là BM.11 (10 mg) và BM.12 (10 mg). Thân và rễ cây Khổ sâm mềm sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi khô, nghiền
35 thành bột (8,6 kg), ngâm chiết trong MeOH (30 lít × 3 lần). Dịch chiết metanol sau đó được quay cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 300 g dịch cô. Dịch cô này được hòa vào 2,5 lít hỗn hợp MeOH:nước (1/1) rồi chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi n-hexan, điclometan và etyl axetat. Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexan (60 g), điclometan (85 g), etyl axetat (15 g) và dịch nước còn lại. Dịch nước còn lại được tách phân đoạn bằng cột Diaion HP-20 với hệ dung môi giải hấp lần lượt là metanol:nước 1/3 - 1/1 - 3/1 - 1/0, thu được bốn phân đoạn 3M (9 g), 3N (18 g), 3P (20 g), 3Q (8 g). Cặn chiết n-hexan được tách phân đoạn trên cột sắc ký với chất hấp thụ là silica gel pha thường và hệ dung môi rửa giải lần lượt là n-hexan:axeton 100/0 - 40/1 - 20/1 - 10/1 - 5/1 - 1/1 - 0/100, thu được sáu phân đoạn 3D (7 g), 3E (12 g), 3F (13 g), 3G (6 g), 3I (9 g), 3K (3,5 g). Phân đoạn 3K xuất hiện tinh thể, lọc rửa bằng metanol thu được chất sạch BM.13 (50 mg). Phân đoạn 3D và 3F cũng xuất hiện tinh thể, lọc rửa bằng metanol thu được hai chất sạch BM.14 (80 mg), BM.03 (500 mg). Từ 85 g cặn chiết điclometan được tách phân đoạn trên sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường và giải hấp lần lượt bằng hệ dung môi điclometan:metanol 100/0 - 40/1 -20/1 - 10/1 - 5/1 - 2,5/1 - 1/1 - 0/100, thu được tám phân đoạn 4A (28 g), 3B (3,5 g), 4C (12 g), 4D (14 g), 4E (5 g), 4F (2 g), 4G (3 g), 4H (1g). Gộp hai phân đoạn (4A+4B) tiến hành sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải lần lượt n-hexan:axeton 3/1 - 2/1 - 1/1, thu được chín phân đoạn 13A (900 mg), 13B (1,1 g), 13C (3,6 g), 13D (6 g), 13E (4,2 g), 13F (2 g), 13G (4 g), 13H (1,3 g), 13I (2 g). Phân đoạn 13I chạy tách chất trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải lần lượt điclometan:etyl axetat 6/1 - 4/1 - 1/1, thu được bốn phân đoạn 13L (1,1 g), 13M (600 mg), 13O (300 mg) và 13P (270 mg). Phân đoạn 13L (1,1 g) tiếp tục được chạy tách chất trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải điclometan:etyl axetat 5/1 thu được chất sạch BM.15 (70 mg). Phân đoạn 13P xuất hiện tinh thể, lọc rửa bằng metanol thu được chất sạch BM.16 (11 mg).
36 Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các chất từ lá cây Khổ sâm mềm
37 Phân đoạn 13C được tách phân đoạn trên cột sắc ký với chất hấp phụ silica gel pha thường và hệ dung môi giải hấp n-hexan:etyl axetat 6/1, thu được tám phân đoạn 16A (70 mg), 16B (100 mg), 16C (130 mg), 16D (130 mg), 16E (120 mg), 16F (300 mg), 16G (150 mg), 16L (1,1g). Phân đoạn 16E (120 mg) tiếp tục tiến hành sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung môi rửa n-hexan:etyl axetat 6/1, thu được chất sạch BM.17 (50 mg). Phân đoạn 16F chạy tách chất trên cột sắc ký silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải điclometan:etyl axetat 30/1 thu được chất sạch BM.18 (22 mg). Phân đoạn 13G được tách chất trên cột YMC với hệ dung môi rửa giải lần lượt metanol:nước 1/1,5 - 2/1 - 4/1, thu được chất sạch BM.19 (100 mg). Phân đoạn 3M của dịch nước, tiến hành sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải điclometan:metanol:nước 4/1/0,1 thu được 12 phân đoạn 6A (90 mg), 6B (60 mg), 6C (140 mg), 6D (380 mg), 6E (840 mg), 6F (170 mg), 6G (50 mg), 6H (200 mg), 6I (140 mg), 6K (120 mg), 6L (500 mg), 6M (150 mg). Phân đoạn 6L (500 mg) được chạy tách chất trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải axeton:điclometan:nước 3,5/1/0,1 thu được hai chất sạch BM.20 (105 mg) và BM.21 (26 mg). Phân đoạn 3N được tách phân đoạn trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi giải hấp điclometan:metanol:nước 4/1/0,1 thu được chín phân đoạn 7A (150 mg), 7B (580 mg), 7C (1,6 g), 7D (2,6 g), 7E (2,5 g), 7F (1,5 g), 7G (2,3 g), 7H (670 mg), 7I (5 g). Phân đoạn 7D xuất hiện tinh thể, lọc rửa bằng metanol thu được chất sạch BM.22 (200 mg). Phân đoạn 7E được tách phân đoạn trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi giải hấp axeton:điclometan:nước 4/1/0,1 thu được năm phân đoạn 9A, 9B (430 mg), 9C (160 mg), 9D (400 mg), 9E(450 mg). Phân đoạn 9A xuất hiện tinh thể, lọc rửa bằng metanol thu được chất sạch BM.22 (52mg). Gộp hai phân đoạn 6H+6I, chạy tách chất trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải axeton:điclometan:nước 6/1/0,1 thu được chất sạch BM.23 (10 mg).
38 Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các chất từ thân và rễ cây Khổ sâm mềm
39 Bột rễ G. stenocarpa khô (2,3 kg) được ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (15 lít x 3 lần ), siêu âm 30 phút, lọc và cô cất trong chân không. Phần cặn metanol được hoà trong 300 ml MeOH:nước (tỉ lệ 1/1). Và chiết lần lượt bằng các dung môi n-hexan, cloroform, etyl axetat và butanol cho các cặn chiết tương ứng là các cặn n-hexan (40 g), cloroform (25 g), etyl axetat (5 g) và butanol (15 g). Cặn chiết butanol (15 g) được chạy sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải gradient với hệ dung môi CHCl3:MeOH (100:0 - 0:100) thu được 20 phân đoạn (GP-RB-1 đến 20). Phân đoạn GP-RB-11 được sắc ký cột silicagel pha thường với Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các chất từ rễ cây Cơm rượu trái hẹp hệ dung môi rửa giải CHCl3:MeOH:nước 3/1/0,1 thu được 14 phân đoạn (ký hiệu từ GP-RB-11A đến L). Cô cạn dung môi dưới áp suất giảm của phân đoạn GP-RB-
40 11K thu được hợp chất GP.24 (100 mg). Phân đoạn GP-RB-9 được tách tiếp trên sắc ký cột Sephadex LH-20 với dung môi rửa giải là MeOH (100%) thu được năm phân đoạn. Phân đoạn thứ hai đem kết tinh chậm, lọc lấy chất rắn, rửa qua bằng metanol thu được chất sạch GP.25 (2 g). Cặn chiết etyl axetat (5 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải gradient với hệ dung môi CHCl3:MeOH (100:0 - 0:100), thu được 29 phân đoạn (GP-RE-21 đến 49). Phân đoạn GP-RE-39 (1,32 g) sau đó được tiếp tục chạy sắc ký cột trên chất hấp phụ silica gel pha thường với dung môi rửa giải CHCl3:MeOH:nước 3/1/0,1 thu được năm phân đoạn (GP- RE-39-A đến E). Tinh chế phân đoạn GP-RE-39-D bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải CHCl3:MeOH:nước 3/1/0,1, thu được chất sạch GP.26 (247 mg). Phân đoạn GP-RE-40 được chạy trên cột Saphadex LH-20 với dung môi MeOH 100% thu được bốn phân đoạn 40A đến 40D. Phân đoạn 40B (0,8 g) được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải CHCl3: MeOH:nước 3/1/0,1 thu được chất sạch GP.27 (45 mg). 2.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được 2.3.1. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.01 Chất bột màu trắng. + ESI-MS (+) m/z: 550,6 [M+H] , C38H78O. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3), δ (ppm): 3,49 (2H, -CH2-O), 1,45 (2H, m, CH2), 1,16 (70H, 35CH2), 0,78 (3H, m, CH3). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3), δ (ppm): 62,3 (-CH2-O-), 22,4-32,3 (36CH2), 13,7 (CH3) . 2.3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.02 Chất bột màu trắng. - ESI-MS (-) m/z: 477,0 [M-H] , C33H68O. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 3,64 (2H, -CH2-O-), 1,57(4H, m, 2CH2), 1,26 (58H, 29CH2), 0,88 (3H, m, CH3). 2.3.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.03 Tinh thể hình kim, không màu, không mùi.
41 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,34 (1H, d, J = 5 Hz, H-6), 5,12 (1H, dd), 5,03 (1H, dd), 3,51 (1H, m, H-3), 1,01 (3H, s, H-19). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3), δ (ppm): 140,8 (s, C-5), 138,4 (d, C-22), 129,3 (d, C- 23), 121,7 (d, C-6), 71,8 (d, C-3), 56,8 (d, C-14), 55,9 (d, C-17), 51,2 (d, C-9), 50,1 (d, C-24), 42,3 (t, C-4), 42,2 (t, C-12), 40,4 (d, C-20), 37,2 (t, C-7), 36,1 (t, C-1), 36,1 (s, C-13), 33,9 (t, C-25), 31,8 (d, C-8), 31,6 (t, C-13), 31,6 (t, C-16), 29,1 (t, C- 2), 28,2 (q, C-28), 26,0 (t, C-15), 24,2 (t, C-11), 21,1 (q, C-26), 21,0 (q, C-21), 19,3 (d, C-27), 18,7 (q, C-19), 12,2 (q, C-29), 12,0 (q, C-18). 2.3.4. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.04 Chất bột màu vàng, tan trong CHCl3, Rf = 0,25 (n-hexan: EtOAc 20/1). + ESI-MS (+) m/z: 603,0 [M+H] , C43H70O. 1 13 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem bảng 3.2. 2.3.5. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.05 Chất bột màu đỏ, Rf = 0,17 (n-hexan:EtOAc 20/1), hiện UV254. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 2,60 (t), 2,16 (s), 2,11 (s), 1,72-1,84 (m), 1,47-1,57 (m), 1,21-1,39 (m), 1,05-1,16 (m), 0,84 (d, J = 4,5 Hz), 0,86 (d, J = 5,0 Hz), 0,87, 1,22 (3H, s). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem bảng 3.3. 2.3.6. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.06 Chất bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 238-239oC. 1 13 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem bảng 3.4. 2.3.7. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.07 Chất bột màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 266-268oC. 1 13 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem bảng 3.4. 2.3.8. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.08 Chất bột màu trắng, tan trong MeOH, nhiệt độ nóng chảy 113-114oC. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), d (ppm): 5,90 (1H, br s, H-4), 5,81 (1H, dd, J = 15,5; 6,0 Hz, H-8), 5,79 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-7), 4,34 (1H, dq, J = 6,5; 6,0 Hz, H-9), 2,53 (1H, d, J = 17 Hz, H-2α), 2,18 (1H, d, J = 17 Hz, H-2b), 1,94 (3H, d, J = 1,5
42 Hz, H-13), 1,26 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-10), 1,06 (3H, s, H-12), 1,03 (3H, s, H-11). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD), d (ppm): 201,2 (s, C-3), 167,4 (d, C-5), 137,0 (d, C- 8), 130,1 (d, C-7), 127,1 (d, C-4), 79,9 (s, C-6), 68,7 (d, C-9), 50,7 (t, C-2), 42,4 (s, C-1), 24,5 (q, C-11), 23,8 (q, C-10), 23,5 (q, C-12), 19,6 (q, C-13). 2.3.9. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.09 Chất bột màu trắng, tan trong MeOH, nhiệt độ nóng chảy 153-155oC. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), d (ppm): 5,99 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-7), 5,90 (1H, br s, H-4), 5,75 (1H, dd, J = 15,5 Hz, H-8), 4,55 (1H, qn, J = 6,5 Hz, H-9), 4,29 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1'), 3,87 (1H, dd, J = 12,0; 2,5 Hz, H-6'b), 3,65 (1H, dd, J = 11,5; 6,0 Hz, H-6'a), 3,28 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5'), 3,22 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-2'), 3,18 (1H, m, H-3'), 3,19 (1H, m, H-4'), 2,63 (1H, d, J = 17 Hz, H-2α), 2,19 (1H, d, J = 17 Hz, H-2b), 1,96 (3H, d, J = 1,5 Hz, H-13), 1,31 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-10), 1,06 (3H, s, H-12), 1,03 (3H, s, H-11). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD), d (ppm): 201,2 (s, C-3), 167,1 (d, C-5), 133,7 (d, C- 8), 130,7 (d, C-7), 127,1 (d, C-4), 101,2 (d, C-1'), 80,0 (s, C-6), 78,4 (d, C-5'), 78,2 (d, C-3'), 75,0 (d, C-2'), 74,6 (d, C-9), 71,7 (d, C-4'), 62,8 (t, C-6'), 50,7 (t, C-2), 42,4 (s, C-1), 24,7 (q, C-11), 23,4 (q, C-12), 22,3 (q, C-10), 19,5 (q, C-13). 2.3.10. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.10 Chất bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 263-265oC, α 22 +101 (c = 1,01 trong [ ]D MeOH:CHCl3 2/1). + HR-ESI-MS (+) m/z: 397,18626 [M+H] , ứng với CTPT C20H29O8, tính toán lý thuyết là 397,18624. 1 13 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz): xem bảng 3.5. 2.3.11. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.11 Chất bột màu vàng, tan trong hỗn hợp MeOH + nước, nhiệt độ nóng chảy 320- o 325 C, Rf = 0,5 ( axeton:CHCl3:nước 3/1/0,1). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD+D2O), d (ppm): 7,44 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-2), 5,67 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-3).
43 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD+D2O), d(ppm): 167,5 (s, C-1), 153,6 (s, C-4), 143,7 (d, C-2), 101,8 (d, C-3). 2.3.12. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.12 Chất bột màu trắng, tan trong hỗn hợp MeOH+nước, nhiệt độ nóng chảy 326- o 327 C, Rf =0,33 (axeton:CHCl3:nước 3/1/0,1). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD+D2O), d (ppm): 7,24 (1H, q, J = 1,0 Hz, H-2), 1,87 (3H, d, J = 1,0 Hz, H-5). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD+D2O), d (ppm): 167,5 (s, C-1), 153,5 (s, C-4), 139,1 (d, C-2), 110,5 (s, C-3), 12,1 (q, C-5). 2.3.13. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.13 o Chất bột màu trắng, tan tốt trong hỗn hợp CHCl3+MeOH, nhiệt độ nóng chảy 284-286 C. 1 Phổ H-NMR (125 MHz, CDCl3+CD3OD): xem bảng 3.8. 2.3.14. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.14 Chất bột màu trắng, tan trong hỗn hợp điclometan+MeOH, Rf = 0,33 (n- hexan:EtOAc 30/1), không hiện UV 254, hiện bằng thuốc thử H2SO4 10% có màu hồng, nhiệt độ nóng chảy 79oC. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 + CD3OD), d (ppm): 2,08 (2H, t, J = 7,8 Hz, H-19), 1,41 (2H, t, J = 6,4 Hz, H-18), 1,08 (38H, m, H-2, H-3, H-(4¸17), 19CH2), 0,67 (3H, t, J = 5,4 Hz, H-1). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3 + CD3OD), d (ppm): 176,5 (s, C=O), 33,7 (t, C-19), 31,5 (t, C-3), 28,7-29,2 (t, C(4¸17)), 24,5 (t, C-18), 22,2 (t, C-2), 13,4 (q, C-1). 2.3.15. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.15 o α 25 Chất bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 243-246 C, [ ]D -36,2 (c = 0,24 trong pyriđin). + ESI - MS (+) m/z: 463,0 [M - H2O + H] , C23H28O11. 1 13 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem bảng 3.9. 2.3.16. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.16 Chất bột màu trắng, tan trong hỗn hợp (CHCl3 + MeOH), nhiệt độ nóng chảy 250- o α 20 252 C, [ ]D +2,5 (c = 0,07 trong MeOH).
44 1 13 H-NMR (500 MHz, CD3OD+CDCl3) và C-NMR (125 MHz, CD3OD+CDCl3) : xem bảng 3.11. 2.3.17. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.17 Tinh thể màu vàng, tan trong cloroform, nhiệt độ nóng chảy 178-180oC. + HR-ESI-MS (+) m/z: 252,08207 [M+H] , ứng với CTPT C15H11N2O2, tính toán lý thuyết là 252,08205. 1 13 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem bảng 3.12. 2.3.18. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.18 Tinh thể hình kim, màu vàng, tan trong CHCl3, Rf = 0,25 (n-hexan:EtOAc 2/1). 1 13 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem bảng 3.13. 2.3.19. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.19 Chất bột màu vàng, tan trong CHCl3, Rf = 0,22 (MeOH:nước 5/1), nhiệt độ nóng chảy 147-149oC, α 18 - 62,4 (c = 0,08 trong CHCl ). [ ]D 3 + HR-ESI-MS (+) m/z: 457,36821 ([M+H] ), ứng với CTPT C30H49O3, tính toán lý thuyết là 457,36817. 1 13 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem bảng 3.14 2.3.20. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.20 Chất bột trắng, tan trong MeOH, nhiệt độ nóng chảy 175-177oC. 1 13 H-NMR (400 MHz, CD3OD) và C-NMR (100 MHz, CD3OD): xem bảng 3.15. 2.3.21. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.21 o α 18 Chất bột màu trắng, tan tốt trong nước, nhiệt độ nóng chảy 215 C, [ ]D - 49,2 (c = 0,9 trong H2O). + ESI - MS (+) m/z: 269,5 [M+H] , C10H12N4O5. 1 13 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem bảng 3.16. 2.3.22. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.22 o α 20 Chất bột màu vàng nhạt, tan tốt trong nước, nhiệt độ nóng chảy 209-211 C, [ ]D - 55,8 (c = 0,9 trong pyriđin). + ESI -MS (+) m/z: 418,0 [M+2H2O+H] , C19H27NO7.
45 1 13 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem bảng 3.17. 2.3.23. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.23 Chất bột trắng, khó tan trong dung môi hữu cơ, nhiệt độ nóng chảy 232-234oC, α 25 [ ]D - 44,6 (c = 0,2 trong axeton/MeOH). 1 Phổ H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), d (ppm): 6,05 (s, H-4, H-6), 4,63 (d, J = 7,5 Hz, H-1'), 3,67 (s, 1-OMe, 3-OMe), 3,58 (1H, dd, J = 10; 2,5 Hz, Ha-6'), 3,41 (1H, Hb-6'), 3,16 (m, H-2'), 3,16 (m, H-3'), 3,12 (m, H-4'), 3,00 (m, H-5'). 13 Phổ C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), d (ppm): 153,9 (s, C-5), 153,2 (d, C-1, C-3), 127,5 (s, C-2), 103,5 (d, C-1'), 93,8 (s, C-4, C-6), 77,0 (d, C-5'), 76,5 (d, C-3'), 74,2 (d, C-2'), 70,0 (d, C-4'), 61,0 (t, C-6'), 56,1 (q, 1-OMe, 3-OMe). 2.3.24. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất GP.24 Chất rắn màu trắng xám, tan tốt trong các dung môi phân cực như H2O, MeOH, o 20 nhiệt độ nóng chảy 141 C, [α]D = - 0,82 (c = 0,75 trong MeOH). + ESI-MS (+) (m/z): 129,0 [M+H] , C6H12N2O. 1 13 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem bảng 3.19. 2.3.25. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất GP.25 Chất bột màu trắng, tan tốt trong nước. Nhiệt độ nóng chảy 176-178oC. + ESI-MS (+) m/z: 365,1 [M+Na] , C12H22O11. 1 13 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem bảng 3.20. 2.3.26. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất GP.26 Chất rắn màu vàng nâu, tan tốt trong metanol, nhiệt độ nóng chảy: 187oC 1 13 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem bảng 3.23. 2.3.27. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất GP.27 Chất rắn màu vàng nâu, tan tốt trong metanol. + ESI-MS (+) m/z: 506,2 [M+2Na-H] , C20H31NO11. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), d (ppm): 7,27 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3;H-5), 6,82 (2H, dd, J = 8,0 Hz, H-2;H-6), 4,89 (1H, m, H-7), 3,14 (2H, m, H-8), 2,75(3H, s, H- 9), 4,50 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1'), 3,16 (m, H-2'), 3,37 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-3'),
46 3,70 (1H, t, J = 9,5 Hz, H-4'), 3,80 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-5'), 3,67 (1H, m, H-6'), 3,82 (1H, m, H-6'), 5,12 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-1"), 3,38 (1H, m, H-2"), 3,31 (1H, m, H-3"), 3,71 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-4"), 3,87 (1H, m, H-5"), 3,73 (1H, m, H-5"). 13 C-NMR ( 125 MHz, CD3OD), d (ppm): 158,7 (s, C-1), 116,4 (d, C-2; C-6), 128,3 (d, C-3; C-5), 132,8 (s, C-4), 69,8 (d, C-7), 56,8 (t, C-8), 33,8 (q, C-9), 98,2 (d, C-1'), 76,3 (d, C-2'), 78,0 (d, C-3'), 74,9 (d, C-4'), 72,4 (d, C-5'), 64,8 (t, C-6'), 94,0 (d, C-1"), 73,8 (d, C-2"), 72,0 (d, C-3"), 73,0 (d, C-4"), 62,8 (t, C-5"). 2.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất được phân lập Các hợp chất BM.02 ¸ 07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.21, BM.22 được thử hoạt tính gây độc tế bào đối với bốn dòng ung thư KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thư máu cấp tính) (phương pháp thử xem mục 2.1.4, trang 31). Thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và của dữ liệu. Sau quá trình xử lí số liệu bằng phần mềm Table Curve, các giá trị IC50 đã được tính toán và cho thấy độ tin cậy cao (r2 ≥ 0,99 tương ứng sai số 20 > 20 > 20 > 20 BM.03 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.04 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.05 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.06 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.07 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.10 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.15 0,23 0,40 0,39 0,34 BM.17 0,91 1,61 3,73 1,01 BM.19 0,99 1,22 2,22 1,10 BM.21 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.22 > 20 > 20 > 20 > 20 Ellipticine 0,66 0,72 0,89 0,69
47 2.4.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư KB Bảng 2.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB của các hợp chất BM.06, BM.07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.22 BM.22 BM.06 BM.07 BM.10 BM.15 BM.17 BM.19 Ellipticine Nồng độ % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế 100µg/ml 7,94 9,82 21,55 83,80 100,14 100,94 102,63 102,07 20µg/ml 5,63 3,94 10,39 22,44 69,13 100,42 100,04 58,14 4µg/ml 2,00 -1,34 10,06 15,00 30,90 56,34 65,48 37,66 0,8µg/ml -4,40 2,43 1,25 17,07 14,78 5,96 23,81 13,07 IC50 > 20 > 20 > 20 > 20 0,39 3,73 2,22 0,89 (µg/ml) (A) (B) (C) Hình 2.5. Tác dụng ức chế tế bào ung thư KB của hợp chất BM.19 ở các nồng độ 20; 4; 0,8 mg/ml (A) Tế bào KB thử chất BM.19 ở nồng độ 20 mg/ml sau 72h; (B) Tế bào KB thử chất BM.19 ở nồng độ 4 mg/ml sau 72h; (C) Tế bào KB thử chất BM.19 ở nồng độ 0,8 mg/ml sau 72h. 2.4.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư LU-1 Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư LU-1 của các hợp chất BM.06, BM.07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.22 BM.22 BM.06 BM.07 BM.10 BM.15 BM.17 BM.19 Ellipticine Nồng độ % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế 100µg/ml 45,21 40,74 57,25 54,95 91,08 101,00 100,87 100,02 20µg/ml 7,05 4,34 1,10 -0,66 65,10 82,88 96,49 61,05 4µg/ml -2,69 -11,62 -8,51 -15,28 24,51 56,62 60,23 39,48 0,8µg/ml -2,69 -11,62 -10,00 -20,15 10,70 43,99 44,40 17,22 IC50 (µg/ml) > 20 > 20 > 20 > 20 0,40 1,61 1,22 0,72
48 2.4.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư LNCaP Bảng 2.4. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư LNCaP của các hợp chất BM.06, BM.07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.22 BM.22 BM.06 BM.07 BM.10 BM.15 BM.17 BM.19 Ellipticine Nồng độ % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế 100µg/ml 41,26 42,70 48,59 66,50 81,17 99,16 100,95 98,24 20µg/ml 12,52 27,07 20,82 7,23 75,64 82,49 84,66 65,06 4µg/ml 2,78 10,96 10,60 -5,27 24,05 62,30 64,22 36,49 0,8µg/ml -3,47 -2,87 1,94 2,78 5,71 48,23 46,19 11,17 IC50 (µg/ml) > 20 > 20 > 20 > 20 0,34 1,01 1,10 0,69 (A) (B) (C) Hình 2.6. Tác dụng ức chế tế bào ung thư LNCaP của hợp chất BM.17 ở các nồng độ 20; 4; 0,8 mg/ml (A) Tế bào LNCaP thử chất BM.17 ở nồng độ 20 mg/ml sau 72h; (B) Tế bào LNCaP thử chất BM.17 ở nồng độ 4 mg/ml sau 72h; (C) Tế bào LNCaP thử chất BM.17 ở nồng độ 0,8 mg/ml sau 72h. 2.4.4. Kết quả thử hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư HL-60 Bảng 2.5. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư HL-60 của các hợp chất BM.06, BM.07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.22 BM.22 BM.06 BM.07 BM.10 BM.15 BM.17 BM.19 Ellipticine Nồng độ % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế 100µg/ml 37,30 29,97 43,45 87,08 97,28 103,53 101,83 105,25 20µg/ml 15,62 9,60 17,21 29,10 84,10 100,02 100,72 63,22 4µg/ml 3,79 2,91 8,90 18,22 34,54 72,34 71,78 33,73 0,8µg/ml -5,20 1,28 -1,13 8,56 13,57 49,12 46,81 6,47 IC50 > 20 > 20 > 20 > 20 0,23 0,91 0,99 0,66 (µg/ml)
49 (A) (B) (C) Hình 2.7. Tác dụng ức chế tế bào ung thư HL-60 của hợp chất BM.19 ở các nồng độ 20; 4; 0,8 mg/ml (A) Tế bào HL-60 thử chất BM.19 ở nồng độ 20 mg/ml sau 72h; (B) Tế bào HL-60 thử chất BM.19 ở nồng độ 4 mg/ml sau 72h; (C) Tế bào HL-60 thử chất BM.19 ở nồng độ 0,8 mg/ml sau 72h.
50 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện theo phương pháp mô tả ở mục 2.1.4 (trang 31). Cặn chiết MeOH thu được từ lá cây Khổ sâm mềm được phân đoạn như trong Hình 2.1 (Sơ đồ phân đoạn các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm, trang 33). Cặn chiết MeOH và các phân đoạn được thử hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng ung thư LU-1 (ung thư phổi người), Hep-G2 (ung thư gan người), MCF-7 (ung thư vú người). Bảng 3.1. Kết quả thử độc tính tế bào các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall.ex Kurz) Các cặn chiết từ IC50 (µg/ml) STT lá cây Khổ sâm mềm LU-1 Hep-G2 MCF-7 1 MeOH (cặn chiết) 28,4 14,49 61,6 2 n-hexan (cặn chiết) 3,5 1,03 5,8 3 Điclometan (cặn chiết) 58,43 61,21 60,87 4 Nước (cặn chiết) >128 >128 >128 Ta thấy cặn chiết MeOH cho hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư gan người (Hep-G2) với giá trị IC50 (μg/ml) là 14,49. Trong các phân đoạn, đặc biệt có phân đoạn n-hexan cho hoạt tính gây độc tế bào rất mạnh với cả ba dòng tế bào ung thư LU-1, Hep-G2, MCF-7 với các giá trị IC50 (μg/ml) lần lượt là 3,5; 1,03 và 5,8. Kết quả này đã giúp chúng tôi định hướng phân lập các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư. 3.2. Cấu trúc của các hợp chất được phân lập 3.2.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm Từ lá cây Khổ sâm mềm phân lập theo Hình 2.1 (trang 33) và 2.2 (trang 36) thu được 12 hợp chất bao gồm: 4 chất béo (octatriacontan-1-ol BM.01, tritriacontan-1-ol BM.02, bombiprenone BM.04, α-tocopherol BM.05), 2 flavonoit (apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside BM.06, luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside BM.07), 1 steroit (stigmast-5,22-dien-3-β-ol BM.03), 2 tecpenoit (blumenol A
51 BM.08, vomifoliol 9- O-β-D-glucopyranoside BM.09), 1 quassinoit (soulameanone BM.10) và 2 nucleotit (cytosine BM.11, thymine BM.12). 3.2.1.1. Hợp chất BM.01: octatriacontan-1-ol Hợp chất BM.01 thu được dưới dạng bột trắng. Phổ 1H và 13C-NMR cho thấy có một nhóm metyl tại δ 13,7 ứng với proton tại δ 0,78, một nhóm metylen có liên kết với ôxy tại δ 62,3 ứng với proton tại δ 3,49 và 35 nhóm metylen nằm trong vùng δ 22,4 - 32,3 ứng với proton tại δ 1,16. Điều này cho phép ta dự đoán hợp chất BM.01 là một ancol no, đơn chức và mạch thẳng. Trong phổ ESI-MS của BM.01 xuất hiện peak ion giả phân tử m/z 550,6 [M+H]+ Giả sử CTPT của ancol no, đơn chức là CnH2n+1OH Ta có: M = 14n + 18 = 550 => n = 38 Vậy CTPT của BM.01 là C38H77OH và được xác định là octatricontan-1-ol. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ chi Brucea. Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.01 3.2.1.2. Hợp chất BM.02: tritriacontan-1-ol Hợp chất BM.02 thu được dưới dạng bột trắng. Phổ 1H-NMR của BM.02 có các đặc điểm giống với phổ BM.01, có một nhóm metyl tại δ 0,88, hai nhóm metylen tại δ 1,57, 29 nhóm metylen tại δ 1,26 và một nhóm metylenhydroxy tại δ 3,64. Vì vậy dựa vào phổ 1H-NMR ta có thể dự đoán BM.02 cũng là một ancol no, đơn chức và mạch thẳng. Trong phổ ESI-MS của BM.02 xuất hiện peak ion giả phân tử m/z 477,0 [M - - H] . Cho phép xác định khối lượng phân tử của BM.02 là 478 Giả sử CTPT của ancol no, đơn chức BM.02 là CnH2n+1OH Ta có: M = 14n + 18 = 478 => n = 33 Vậy CTPT của BM.02 là C33H67OH, được xác định là tritriacontan-1-ol và lần đầu tiên được phân lập từ chi Brucea. CTCT của BM.02 là
52 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.02 3.2.1.3. Hợp chất BM.03: stigmast-5,22-dien-3-b-ol Hợp chất BM.03 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, không o α 25 o 1 mùi, nhiệt độ nóng chảy 155-157 C, [ ]D -45 (c = 0,05 trong CHCl3). Trên phổ H, 13C-NMR cho thấy có ba proton olefinic ở δ 5,34 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6), 5,12 (1H, dd, H-22), 5,03 (1H, dd, H-23) ứng với ba cacbon ở δ 121,7 (d, C-6), 138,4 (d, C-22), 129,3 (d, C-23). Dựa vào dữ kiện lý hóa và so sánh phổ với chất chuẩn, hợp chất BM.03 được xác định là stigmast-5,22-dien-3-b-ol, có CTPT là C29H58O. Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.03 3.2.1.4. Hợp chất BM.04: bombiprenone Hợp chất BM.04 thu được dưới dạng bột màu vàng, tan trong CHCl3, Rf = 0,25 (n-hexan: EtOAc 20/1). Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.04
53 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.04 a b Vị trí δC (ppm) δH (ppm) 1 29,9 (q) 2,13 (3H, s) 2 208,8 (s) 3 43,8 (t) 2,45 (2H, t, J = 7,5 Hz) 4 22,5 (t) 2,27 (2H, t, J = 7,5 Hz) 5 122,5 (d) 5,08-5,13 (1H, m) 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30 (I) 134,9-136,5 (s) 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31(II) 39,7 (t) 1,97-2,00 (14H, t, J = 7,5 Hz) 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32 (III) 26,6-26,8 (t) 2,05-2,09 (14H, t, J = 7,5 Hz) 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33 (IV) 124,1-124,4 (d) 5,08-5,13 (7H, m) 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 (V) 16,0 (q) 1,57-1,60 (21H, s) 41 131,2 (s) 42 25,7 (q) 1,68 (3H, s) 43 17,7 (q) 1,62 (3H, s) a b đo trong CDCl3, 125 MHz; đo trong CDCl3, 500 MHz; TMS là chất chuẩn nội. Nguyên cứu kỹ phổ 1H, 13C-NMR và HSQC của BM.04 cho thấy trong phân tử tồn tại các mảnh phân tử có độ chuyển dịch hóa học trùng hoặc sát nhau bao gồm: 7 nhóm metyl (nhóm V), 14 nhóm metylen (nhóm II + III), 7 nhóm metin (nhóm IV, cacbon lai hóa sp2) và 7 cacbon không có liên kết hydro (nhóm I). Trên phổ HMBC của BM.04 có các tương tác của H7/C5, H4/C6, H34/C5, C7, điều đó cho thấy trong phân tử tồn tại các hợp phần dạng isopren được nối với nhau theo kiểu đầu đuôi. Phân tích phổ HMBC sâu hơn cho ta biết trong phân tử hợp chất BM.04 có 7 nhóm isopren gần tương đương về hóa học. Ngoài ra, trên phổ HMBC còn có các tương tác giữa các nhóm metyl ở δ 1,68 (H-42) và 1,62 (H-43) với các cacbon δ 25,7 (C-42) và 17,7 (C-43) được xác định là của nhóm isopren cuối mạch. Như vậy, trong phân tử BM.04 có tất cả 8 nhóm isopren nối lại với nhau tạo thành mạch dài phân tử.
54 Phổ ESI-MS của BM.04 cho peak ion giả phân tử tại m/z 603,0 [M+H]+. Từ dữ liệu phổ và các phân tích trên, hợp chất BM.04 được xác định là bombiprenone, có CTPT là C43H70O. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ chi Brucea. Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.04 Hình 3.6. Phổ DEPT của hợp chất BM.04 3.2.1.5. Hợp chất BM.05: α-tocopherol Hợp chất BM.05 thu được dưới dạng bột màu đỏ, Rf = 0,17 (n-hexan:EtOAc 20/1), hiện UV254. Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy có 29 cacbon trong đó có tám nhóm metyl, 11 nhóm metylen, ba nhóm metin và bảy cacbon không liên kết hydro.
55 Bảng 3.3. Số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất BM.05 và chất tham khảo Vị trí Hợp chất BM.05 α-tocopherol [110] δC (ppm) δC (ppm) (CDCl3, 125 MHz) (CDCl3, 25,2 MHz) 1 2 74,5 74,3 2a 23,8 23,8 3 31,6 31,6 4 20,8 20,8 4a 117,4 117,0 5 118,5 118,5 5a 11,3 11,2 6 144,5 144,4 7 121,0 121,0 7a 12,2 12,1 8 122,6 122,3 8a 145,6 145,4 8b 11,8 11,8 1' 39,8 39,8 2' 21,1 21,0 3', 5', 7', 9' 37,3 - 37,5 37,5 4', 8' 32,8 32,7 4'a, 8'a 19,8 19,7 6' 24,5 24,5 10' 24,8 24,8 11' 39,4 39,4 12' 28,0 28,0 12'a 22,6 22,6 13' 22,7 22,6
56 Dữ liệu phổ của BM.05 cho thấy sự xuất hiện một vòng thơm bị thế hoàn toàn tại δ 117,4 (C-4a); 118,5 (C-5); 144,5 (C-6); 121,0 (C-7); 122,6 (C-8) và 145,6 (C- 8a). Sở dĩ các cacbon C6 và C8a chuyển dịch về trường thấp vì nó gắn với dị tố có độ âm điện lớn, các cacbon khác có các nhóm thế metyl tại δ 11,3 (C-5a); 12,2 (C- 7a); 11,8 (C-8b) và một nhóm metylen tại δ 20,8 (C4). Từ những phân tích trên đã chứng tỏ trong phân tử của hợp chất BM.05 có nhân croman. Khi so sánh dữ liệu phổ của BM.05 với dữ liệu phổ của α-tocopherol trong tài liệu tham khảo [110], ta thấy chúng hoàn toàn phù hợp. Vì vậy, BM.05 được xác định là α-tocopherol, có CTPT là C29H50O2 và lần đầu tiên được phân lậptừ chi Brucea. Hợp chất này có khả năng chống ôxy hóa mạnh và tiêu diệt các gốc tự do [111, 112]. Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.05 Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.05
57 Hình 3.9. Phổ DEPT của hợp chất BM.05 3.2.1.6. Hợp chất BM.06: apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside Hợp chất BM.06 thu được dưới dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 238- 239oC. Phổ 1H-NMR của BM.06 cho cặp tín hiệu doublet của bốn proton đặc trưng cho vòng thơm có hai nhóm thế ở vị trí para tại δ 7,95 (2H, d, J = 9,0 Hz), 6,93 (2H, d, J = 8,5 Hz). Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR còn có một tín hiệu singlet ở δ 6,87 (1H, s) và hai tín hiệu doublet của proton metin có tương tác meta ở δ 6,83 (1H, d, J = 2,4 Hz) và 6,44 (1H, d, J = 2,4 Hz). Trên phổ này các tín hiệu proton của đường glucopyranosyl nằm ở trong khoảng δ 3,16 - 5,06, trong đó proton anome tại δ 5,06 (1H, d, J = 7,5 Hz), chứng tỏ nhóm đường có cấu hình b. Tín hiệu singlet của nhóm hydroxyl ở vị trí số 5 tại δ 12,97 (1H, s). Phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện tín hiệu của 16 cacbon, trong đó có một nhóm cacbonyl tại δ 182,0 và sáu tín hiệu cacbon của đường glucopyranosyl tại δ 99,9, 77,2, 76,4, 73,1, 69,5 và 60,6. Sau khi so sánh dữ kiện phổ với tài liệu, cho phép ta xác định hợp chất BM.06 là apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside, có CTPT là C21H20O10. Một flavonglucoside phổ biến trong thiên nhiên [113]. Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.06
58 3.2.1.7. Hợp chất BM.07: luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside Hợp chất BM.07 thu được dưới dạng bột màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 266-268oC. Phổ 1H-NMR cho tín hiệu của sáu proton thơm tại δ 6,75 (1H, s, H-3), 6,79 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 6,44 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), trong đó vòng C chỉ có ba proton tại δ 7,45 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6′), 6,90 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5'), 7,42 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2'), điều đó cho thấy vòng C có hai nhóm thế. Phổ 1H-NMR còn có các tín hiệu proton của một nhóm thế đường glucopyranosyl trong vùng δ 3,18 - 5,07, trong đó proton anome tại δ 5,07 (1H, d, J = 7,5 Hz), chứng tỏ nhóm thế đường có cấu hình b. Phổ 13C-NMR xuất hiện các tín hiệu phù hợp với một flavonglucoside. So sánh dữ kiện phổ với tài liệu tham khảo [114], hợp chất BM.07 được xác định là luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside, CTPT C21H20O11 (Cynanoside). Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.07 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.06, BM.07 và chất tham khảo Apigenin 7-O-β-D- Hợp chất BM.06 Hợp chất BM.07 glucopyranoside [113] Vị δC δC δC δH (ppm) δH (ppm) δH (ppm) trí (ppm) (ppm) (ppm) 1 2 161,1 161,1 161,1 3 6,87 (1H,s) 103,1 6,75 (1H, s) 103,1 6,86 102,9 4 182,0 182,0 181,9 5 12,97 (1H, s, OH) 163,0 12,99 (1H, s, OH) 163,0 12,95 (1H, s, OH) 162,9 6 6,83 (1H, d, J = 2,0 Hz) 99,5 6,79 (1H, d, J = 2,4 Hz) 99,5 6,82 (1H, d, J = 2,2 Hz) 99,5 7 164,3 164,5 164,3 8 6,44 (1H, d, J = 2,0 Hz) 94,8 6,44 (1H, d, J = 2,4 Hz) 94,7 6,44 (1H, d, J = 2,2 Hz) 94,48 9 161,1 157,0 161,1 10 105,3 105,3 105,3 1' 121,0 121,4 120,7 2' 128,6 7,42 (1H, d, J = 2,0 Hz) 113,5 128,5 3' 116,0 145,8 116,0 4' 10,37 (1H, s, OH) 156,9 150,0 10,37 (1H, s, OH) 156,9
59 5' 6,93 (1H, d, J = 8,5 Hz) 128,6 6,9 (1H, d, J = 8,5 Hz) 116,0 6,93 (1H, d, J = 8,8 Hz) 128,5 6' 7,95 (1H, d, J = 9,0 Hz) 116,0 7,45 (1H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 119,2 7,95 (1H, d, J = 8,8 Hz) 116,0 1" 99,9 99,9 99,9 2" 73,1 73,1 73,1 3" 76,4 76,4 76,4 4" 69,5 69,5 69,5 5" 77,2 77,2 77,2 6" 60,6 60,6 60,6 1 13 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6); C-NMR (125 MHz, DMSO-d6). 3.2.1.8. Hợp chất BM.08: blumenol A Hợp chất BM.08 được tách ra từ phân đoạn etylaxetat của lá cây Khổ sâm mềm, có dạng bột trắng, tan trong MeOH, nhiệt độ nóng chảy 113-114oC. Phổ 1H-NMR của BM.08 chỉ ra tín hiệu đặc trưng của bốn nhóm metyl tại δ 1,26 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-10), 1,03 (3H, s, H-11), 1,06 (3H, s, H-12), 1,94 (3H, d, J = 1,5 Hz, H-13), một nhóm metylen tại δ 2,53 (1H, d, J = 17 Hz, H-2α), 2,18 (1H, d, J = 17 Hz, H-2b) và bốn nhóm metin tại δ 5,90 (1H, br s, H-4), 5,79 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-7), 5,81 (1H, dd, J = 15,5; 6,0 Hz, H-8), 4,34 (1H, dq, J = 6,5; 6,0 Hz, H-9). Trong đó, H-7 và H-8 có tương tác rất mạnh (J = 17 Hz), chứng tỏ hai proton của nối đôi C7=C8 có cấu hình trans. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất BM.08 cho thấy sự có mặt của 13 cacbon, trong đó có một nhóm cacbonyl được xác định bằng tín hiệu cộng hưởng tại δ 201,2 (C-3), 1 cacbon bậc IV tại d 42,4 (C-1), 2 cacbon không liên kết hydro tại δ 167,4 (C- 5), 79,9 (C-6), bốn nhóm metyl tại δ 23,8 (C-10), 24,5 (C-11), 23,5 (C-12), 19,6 (C- 13), một nhóm metylen tại d 50,7 (C-2) và bốn nhóm metin tại δ 127,1 (C-4), 130,1 (C-7), 137,0 (C-8), 68,7 (C-9). Cấu hình của các nguyên tử cacbon bất đối C-6, C-9 được xác định dựa vào các tương tác proton trong phổ NOESY. Trên phổ NOESY, ta thấy proton H-2α có tương tác với các proton H-7, H-12 và H-13 trong khi đó proton H-2b tương tác với hai proton H-11, H-12. Điều đó chứng tỏ hai proton H-2α, H-11 và nhóm 3- hidroxybut-1-enyl ở vị trí axial còn hai proton H-12, H-2b ở vị trí equatorial. Các dữ kiện trên khẳng định cấu hình của C-6 là (S). Các tương tác của proton H-12,
60 H-13 với các proton H-7, H-8 trên phổ NOESY khẳng định thêm cho lập luận trên. Trong phổ NOESY ta còn thấy proton H-9 tương tác mạnh với các proton H- 7, H-8, H-10, và có tương tác yếu với proton H-2α và H-12. Điều đó chứng tỏ H-9 về mặt không gian là gần với H-2α và H-12 và tạo thành trạng thái ổn định nhất của phân tử. Đồng thời, sự xuất hiện tương tác mạnh giữa proton H-8 và H-10 cho phép khẳng định cấu hình của C-9 là (R). Qua phân tích phổ và so sánh với dữ kiện phổ trong tài liệu [115], [116], [117], [118] cho thấy hợp chất BM.08 là blumenol A, có CTPT là C13H20O3. Hình 3.12. Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất BM.08 Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.08
61 Hình 3.14. Phổ DEPT của hợp chất BM.08 Hình 3.15. Phổ HSQC của hợp chất BM.08 Hình 3.16. Phổ HMBC của hợp chất BM.08
62 Hình 3.17. Phổ COSY của hợp chất BM.08 Hình 3.18. Phổ NOESY của hợp chất BM.08 3.2.1.9. Hợp chất BM.09: vomifoliol 9-O-β-D-glucopyranoside Hợp chất BM.09 thu được dưới dạng bột màu trắng, tan trong MeOH, nhiệt độ nóng chảy 153-155oC. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất BM.09 có các tín hiệu giống với BM.08, điểm khác là có thêm các tín hiệu của nhóm đường -O-b-D- glucopyranosyl. Trong phổ 1H-NMR các proton của nhóm đường có các tín hiệu tại δ 3,10 - 3,36, trong phổ 13C-NMR các cacbon của nhóm đường có các tín hiệu tại δ 101,2 (C-1'), 75,0 (C-2'), 78,2 (C-3'), 71,7 (C-4'), 78,4 (C-5'), 62,8 (C-6'). Proton anome ở δ 4,29 với hằng số tách J = 7,5 Hz chứng tỏ nhóm đường có cấu hình β. Ngoài ra, trong phổ HMBC của BM.09 có tương tác giữa proton H-9 và cacbon
63 anome C-1' của phần đường, điều đó xác định vị trí nhóm đường -O-b-D- glucopyranosyl gắn vào cacbon C-9 của phần aglycon. Từ các dữ kiện phổ và so sánh với tài liệu tham khảo [118] khẳng định hợp chất BM.09 là vomifoliol 9-O-β- D-glucopyranoside, có CTPT là C19H30O8. Hợp chất này lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea và cũng đã được phát hiện ở loài Euphorbia heteradena (thuộc họ Thầu dầu Euphobiaceae) [118]. Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.09 Hình 3.20. Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.09 Hình 3.21. Phổ DEPT của hợp chất BM.09