Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống ung thư của cây giác đế đài to (Goniothalamus macrocalyx Ban) và giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban) họ na (Annonaceae)

174 trang yendo 7642

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống ung thư của cây giác đế đài to (Goniothalamus macrocalyx Ban) và giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban) họ na (Annonaceae)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_an_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_va_hoat_tinh_chong_ung.pdf

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống ung thư của cây giác đế đài to (Goniothalamus macrocalyx Ban) và giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban) họ na (Annonaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC Triệu Quý Hùng NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ CỦA CÂY GIÁC ĐẾ ĐÀI TO (GONIOTHALAMUS MACROCALYX BAN) VÀ GIÁC ĐẾ CUỐNG DÀI (GONIOTHALAMUS GRACILIPES BAN) HỌ NA (ANNONACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC Triệu Quý Hùng NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ CỦA CÂY GIÁC ĐẾ ĐÀI TO (GONIOTHALAMUS MACROCALYX BAN) VÀ GIÁC ĐẾ CUỐNG DÀI (GONIOTHALAMUS GRACILIPES BAN) HỌ NA (ANNONACEAE) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62.44.27.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Nguyễn Văn Hùng 2. TS. Đoàn Thị Mai Hương Hà Nội – 2013
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa từng có ai công bố trong các công trình nghiên cứu trước đây. Toàn bộ các thông tin trích dẫn trong Luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc xuất xứ. Nghiên cứu sinh Triệu Quý Hùng
LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn Thầy hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Văn Hùng và TS. Đoàn Thị Mai Hương-Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ ra hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, các Cô, các nhà khoa học Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong Chương trình đào tạo. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ sự cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Hội đồng khoa học, Bộ phận đào tạo và các phòng chức năng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (CNRS- Cộng hòa Pháp), TS. Marc Litaudon-chủ nhiệm dự án “Nghiên cứu hóa thực vật của thảm thực vật Việt Nam” đã hỗ trợ tôi trong việc đo X-ray, phổ MS/MS, thử hoạt tính sinh học; cùng với Quỹ Nafosted (Đề tài nghiên cứu khoa học cơ bản mã số 104.01.76.09) đã cấp kinh phí cho việc thực hiện Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn TS.HDR. Phạm Văn Cường và các cán bộ nghiên cứu Phòng Tổng hợp hữu cơ, Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc-Viện Hóa sinh biển đã giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và hỗ trợ tôi thực hiện Luận án. Tôi tôi xin bày tỏ sự cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo Trường Đại học Hùng Vương, Khoa Khoa học Tự nhiên-Trường Đại học Hùng Vương đã tạo mọi điều kiện về thời gian, kinh phí hỗ trợ cho tôi trong quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, NGND.GS.TSKH. Đặng Như Tại, NGƯT. Đào Văn Ích đã định hướng, xây dựng cho tôi nền móng kiến thức hóa học từ bậc Trung học phổ thông, Đại học và Cao học. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã hỗ trợ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện Luận án. Hà Nội, ngày 08 tháng 12 năm 2013 Tác giả Luận án Triệu Quý Hùng
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ix ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 4 1. 1 Giới thiệu sơ lược về thực vật họ Na (Annonaceae) 4 1.2 Giới thiệu về thực vật chi Goniothalamus 4 1.2.1 Sơ lược về chi Goniothalamus 4 1.2.2 Đặc điểm thực vật cây Giác đế đài to 7 1.2.3 Đặc điểm thực vật cây Giác đế cuống dài 8 1.3 Các nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học chi Goniothalamus 9 1.3.1 Styryl-lactone từ chi Goniothalamus 9 1.3.2 Acetogenin từ chi Goniothalamus 20 1.3.3 Flavonoid từ chi Goniothalamus 28 1.3.4 Alkaloid từ chi Goniothalamus 30 1.3.5 Một số hợp chất khác từ chi Goniothalamus 32 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Thu hái mẫu cây và xác định tên khoa học 34 2.2 Phương pháp xử lý và chiết mẫu 34 2.3 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật 34 2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ các mẫu thực vật nghiên cứu 35 2.5 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 36 2.5.1 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 36 2.5.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 37 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM 38 3.1 Tách chiết, phân lập các chất từ cây Giác đế đài to 38 i
3.1.1 Vỏ cây Giác đế đài to 38 3.1.1.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết tách 38 3.1.1.2 Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất được phân lập từ vỏ cây Giác đế đài to 41 3.1.2 Quả cây Giác đế đài to 47 3.1.2.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết tách 47 3.1.2.2 Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất được phân lập từ quả cây Giác đế đài to 49 3.2 Tách chiết, phân lập các chất từ cây Giác đế cuống dài 55 3.2.1 Quả cây Giác đế cuống dài 55 3.2.1.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết tách 55 3.2.1.2 Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất được phân lập từ quả cây Giác đế cuống dài 58 3.2.2 Lá cây Giác đế cuống dài 64 3.2.2.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết tách 64 3.2.2.2 Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất được phân lập từ lá cây Giác đế cuống dài 67 3.3 Hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất được phân lập 70 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 71 4.1 Các hợp chất phân lập được từ cây Giác đế đài to 71 4.1.1 Từ vỏ cây Giác đế đài to 71 4.1.1.1 Altholactone (GM1) 72 4.1.1.2 Goniopypyrone (GM2) 73 4.1.1.3 Goniofufurone (GM3) 74 4.1.1.4 Cardiobutanolide (GM4) 75 4.1.1.5 Goniothalamin (GM5) 76 4.1.1.6 (+)-T-cadinol (GM6) 77 4.1.1.7 α-Cadinol (GM7) 79 4.1.1.8 Aristolactam BII (GM8) 79 4.1.1.9 3-Methyl-1H-benz[f]indole-4,9-dione (GM9) 81 4.1.1.10 Acid nonacosanoic (GM10) 82 4.1.2 Từ quả cây Giác đế đài to 83 4.1.2.1 8-Hydroxygoniofupyrone A (GM11) 84 4.1.2.2 4-Deoxycardiobutanolide (GM12) 90 ii
4.1.2.3 7-Acetylaltholactone (GM13) 92 4.1.2.4 Annonacin (GM14) 93 4.1.2.5 cis+trans-Solamin (GM15) 97 4.1.2.6 Isoannonacin (GM16) 99 4.1.2.7 trans-Murisolinone (GM17) 101 4.1.2.8 β-Caryophyllene oxide (GM18) 103 4.1.2.9 2-(2’-Hydroxytetracosanoylamino)octadecane-1,3,4-triol (GM19) 105 4.1.2.10 Acid palmitic (GM20) 106 4.2 Các hợp chất phân lập được từ cây Giác đế cuống dài 106 4.2.1 Từ quả cây Giác đế cuống dài 106 4.2.1.1 Saccopetrin A (GG1) 107 4.2.1.2 Gracilipin A (GG2) 109 4.2.1.3 Methylsaccopetrin A (GG3) 115 4.2.1.4 7,3’,4’-Trimethylquercetin (GG4) 117 4.2.1.5 Rhamnazin (GG5) 117 4.2.1.6 Casticin (GG6) 118 4.2.1.7 Isokanugin (GG7) 119 4.2.1.8 Melisimplexin (GG8) 120 4.2.1.9 5-Hydroxy-3,7-dimethoxy-3’,4’-methylenedioxyflavone (GG9) 120 4.2.1.10 1-Phenylpropan-1,2-diol (GG10) 121 4.2.1.11 Acid vanillic (GG11) 122 4.2.1.12 Phenylmethanol (GG12) 122 4.2.2 Các hợp chất phân lập được từ lá cây Giác đế cuống dài 123 4.2.2.1 Gracilipin B (GG13) 124 4.2.2.2 Gracilipin C (GG14) 130 4.2.2.3 Gracilipin D (GG15) 133 4.2.2.4 Squalene (GG16) 136 4.2.2.5 Benzyl benzoate (GG17) 136 4.2.2.6 Acid benzoic (GG18) 137 4.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất được phân lập 138 4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập 138 4.3.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất được phân lập 142 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 144 CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 147 TÀI LIỆU THAM KHẢO 149 iii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT  Các phương pháp sắc ký TLC Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography: Sắc ký cột  Các phương pháp phổ ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectroscopy: Phổ khối phun mù điện tử IR Infrared Spectroscopy: Phổ hồng ngoại 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer: Phổ DEPT COSY Correlation Spectroscopy: Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt nhân 1H-1H HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation: Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation: Phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị hạt nhân NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy: Phổ NOESY s: singlet d: doublet t: triplet q: quartet quint: quintet m: multiplet dd: double doublet br: broad  Các chữ viết tắt khác IC50 Nồng độ ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào thử nghiệm ED50 Liều có hiệu quả trên 50% tế bào thử nghiệm MIC Nồng độ ức chế tối thiểu đnc. Điểm nóng chảy DMSO Dimethyl sulfoxide TMS Tetramethyl silan CTPT Công thức phân tử MTT 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide OD Optical density: Mật độ quang grad. gradient  Tên của các hợp chất được viết theo nguyên bản Tiếng Anh iv
DANH MỤC CÁC BẢNG 13 1 Bảng 4.1. Dữ kiện phổ C-, H-NMR (125/500 MHz, Acetone-d6) của GM11 85 13 1 Bảng 4.2. Dữ kiện phổ C-, H-NMR (125/500 MHz, CD3OD) của GM12 90 13 1 Bảng 4.3. Dữ kiện phổ C-, H-NMR (125/500 MHz, CDCl3) của GG2 110 13 1 Bảng 4.4. Dữ kiện phổ C-, H-NMR (125/500 MHz, CDCl3) của GG1, GG3 116 13 1 Bảng 4.5. Dữ kiện phổ C-, H-NMR (125/500 MHz, CDCl3) của GG13 125 13 1 Bảng 4.6. Dữ kiện phổ C-, H-NMR (125/500 MHz, CDCl3) của GG14 132 13 1 Bảng 4.7. Dữ kiện phổ C-, H-NMR (125/500 MHz, CDCl3) của GG15 134 Bảng 4.8. Hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết CH2Cl2 vỏ cây Giác đế đài to . 138 Bảng 4.9. Hoạt tính gây độc tế bào KB của dịch chiết MeOH phần vỏ và dịch chiết CH2Cl2 phần quả cây Giác đế đài to 139 Bảng 4.10. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất từ cây Giác đế đài to và Giác đế cuống dài 140 Bảng 4.11. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất từ cây Giác đế đài to và Giác đế cuống dài 143 v
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cành mang hoa (1) và ảnh chụp tiêu bản lá, cành mang quả (2) của cây Giác đế đài to 7 Hình 1.2. Cành mang hoa, quả (1) và ảnh chụp tiêu bản lá, cành mang quả (2) của cây Giác đế cuống dài 8 Hình 1.3. Các khung cơ bản của styryl-lactone 9 Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp các khung styryl-lactone cơ bản 20 Hình 1.5. Một số dạng cấu trúc THF, THP của acetogenin 21 Hình 1.6. Một số dạng cấu trúc vòng epoxy của acetogenin 21 Hình 1.7. Một số dạng cấu trúc vòng -lactone của acetogenin 22 Hình 1.8. Quá trình hình thành mono-THF acetogenin 27 Hình 3.1. Sơ đồ ngâm chiết vỏ cây Giác đế đài to 38 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập dịch chiết CH2Cl2 vỏ cây Giác đế đài to 39 Hình 3.3. Sơ đồ phân lập dịch chiết MeOH vỏ cây Giác đế đài to 40 Hình 3.4. Sơ đồ ngâm chiết quả cây Giác đế đài to 47 Hình 3.5. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết CH2Cl2 quả cây Giác đế đài to 48 Hình 3.6. Sơ đồ ngâm chiết quả cây Giác đế cuống dài 56 Hình 3.7. Sơ đồ phân lập dịch chiết CH2Cl2 quả cây Giác đế cuống dài 57 Hình 3.8. Sơ đồ ngâm, chiết phân bố lá cây Giác đế cuống dài 65 Hình 3.9. Sơ đồ phân lập các chất từ lá cây Giác đế cuống dài 66 Hình 4.1. Cấu trúc các hợp chất được phân lập từ vỏ cây Giác đế đài to 71 Hình 4.2. Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của chất GM1 73 Hình 4.3. Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của chất GM2 74 Hình 4.4. Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của chất GM5 77 Hình 4.5. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC và NOESY của GM6 78 Hình 4.6. Các tương tác chính trong phổ HMBC của chất GM8 80 Hình 4.7. Một số tương tác chính trong phổ HMBC, COSY, NOESY của GM9 82 Hình 4.8. Cấu trúc các hợp chất được phân lập từ quả cây Giác đế đài to 83 vi
Hình 4.9. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của GM11 84 Hình 4.10. Phổ 1H-NMR giãn rộng của GM11 86 Hình 4.11. Phổ 13C-NMR và DEPT của GM11 86 Hình 4.12. Phổ COSY giãn rộng của GM11 87 Hình 4.13. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC và NOESY của GM11 87 Hình 4.14. Phổ HMBC của GM11 88 Hình 4.15. Phổ NOESY giãn rộng của GM11 89 Hình 4.16. Cấu trúc không gian qua nhiễu xạ tia X của hợp chất GM11 89 Hình 4.17. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC và NOESY của GM12 91 Hình 4.18. Một số tương tác chính trên phổ HMBC, COSY và NOESY của GM13 92 Hình 4.19. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC và phân mảnh MS/MS của GM14 94 Hình 4.20. Độ chuyển dịch hóa học đặc trưng của mono-THF-acetogenin 94 Hình 4.21. Phổ Li-(+)ESI-LQT/Obitrap MS/MS của GM14 95 Hình 4.22. Cơ chế phân mảnh tạo ion X4, B1 96 Hình 4.23. Một số ion mảnh trên phổ Li-(+)ESI-QTOF MS/MS của GM14 96 Hình 4.24. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC và phân mảnh MS/MS của GM15 98 Hình 4.25. Độ chuyển dịch hóa học của proton trong vòng ketolactone 100 Hình 4.26. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC và phân mảnh MS/MS của GM16 100 Hình 4.27. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC và phân mảnh MS/MS của GM17 102 Hình 4.28. Một số tương tác chính trên phổ HMBC, COSY và NOESY của GM18 104 Hình 4.29. Cấu trúc các hợp chất được phân lập từ quả cây Giác đế cuống dài 107 Hình 4.30. Một số tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của chất GG1 108 vii
Hình 4.31. Phổ khối phân giải cao của GG2 109 Hình 4.32. Phổ 1H-NMR của GG2 111 Hình 4.33. Phổ 13C-NMR và DEPT của GG2 112 Hình 4.34. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC, NOESY của GG2 113 Hình 4.35. Phổ COSY của GG2 113 Hình 4.36. Phổ HMBC của GG2 114 Hình 4.37. Phổ NOESY của GG2 114 Hình 4.38. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC, NOESY của GG3 115 Hình 4.39. Các hợp chất được phân lập từ lá cây Giác đế cuống dài 123 Hình 4.40. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của GG13 124 Hình 4.41.Phổ 1H-NMR của GG13 126 Hình 4.42. Phổ 13C-NMR và DEPT của GG13 127 Hình 4.43. Phổ COSY của GG13 127 Hình 4.44. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC, NOESY của GG13 128 Hình 4.45. Phổ HMBC của GG13 129 Hình 4.46. Phổ NOESY giãn rộng của GG13 129 Hình 4.47. Cấu trúc nhiễu xạ tia X của hợp chất GG13 130 Hình 4.48. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC, NOESY của GG14 131 Hình 4.49. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC, NOESY của GG15 135 viii
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các phổ của hợp chất GM1 PL1 Phụ lục 2. Các phổ của hợp chất GM2 PL5 Phụ lục 3. Các phổ của hợp chất GM3 PL10 Phụ lục 4. Các phổ của hợp chất GM4 PL14 Phụ lục 5. Các phổ của hợp chất GM5 PL17 Phụ lục 6. Các phổ của hợp chất GM6 PL22 Phụ lục 7. Các phổ của hợp chất GM7 PL26 Phụ lục 8. Các phổ của hợp chất GM8 PL30 Phụ lục 9. Các phổ của hợp chất GM9 PL34 Phụ lục 10. Các phổ của hợp chất GM10 PL40 Phụ lục 11. Các phổ của hợp chất GM11 PL40 Phụ lục 12. Các phổ của hợp chất GM12 PL43 Phụ lục 13. Các phổ của hợp chất GM13 PL49 Phụ lục 14. Các phổ của hợp chất GM14 PL54 Phụ lục 15. Các phổ của hợp chất GM15 PL59 Phụ lục 16. Các phổ của hợp chất GM16 PL66 Phụ lục 17. Các phổ của hợp chất GM17 PL73 Phụ lục 18. Các phổ của hợp chất GM18 PL79 Phụ lục 19. Các phổ của hợp chất GM19 PL84 Phụ lục 20. Các phổ của hợp chất GM20 PL88 Phụ lục 21. Các phổ của hợp chất GG1 PL88 Phụ lục 22. Các phổ của hợp chất GG2 PL94 Phụ lục 23. Các phổ của hợp chất GG3 PL96 Phụ lục 24. Các phổ của hợp chất GG4 PL101 Phụ lục 25. Các phổ của hợp chất GG5 PL104 Phụ lục 26. Các phổ của hợp chất GG6 PL107 Phụ lục 27. Các phổ của hợp chất GG7 PL109 ix
Phụ lục 28. Các phổ của hợp chất GG8 PL112 Phụ lục 29. Các phổ của hợp chất GG9 PL114 Phụ lục 30. Các phổ của hợp chất GG10 . PL117 Phụ lục 31. Các phổ của hợp chất GG11 . PL119 Phụ lục 32. Các phổ của hợp chất GG12 . PL121 Phụ lục 33. Các phổ của hợp chất GG13 . PL123 Phụ lục 34. Các phổ của hợp chất GG14 . PL125 Phụ lục 35. Các phổ của hợp chất GG15 . PL131 Phụ lục 36. Các phổ của hợp chất GG16 . PL136 Phụ lục 37. Các phổ của hợp chất GG17 . PL139 Phụ lục 38. Các phổ của hợp chất GG18 . PL142 Phụ lục 39. Dữ kiện phổ nhiễu xạ tia X của GM11 và GG13 . PL145 x
ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư là căn bệnh đã có từ lâu mà nhiều người trên thế giới mắc phải và có tỉ lệ tử vong cao. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) hằng năm có khoảng 7,6 triệu người chết vì bệnh ung thư, chiếm hơn 13% số người chết mỗi năm. Điển hình là các nhóm bệnh ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư đại trực tràng, ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư tiền liệt tuyến. Gần 2/3 số ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình. Tình hình mắc bệnh và tử vong do ung thư có xu hướng ngày càng tăng. Theo ước tính của WHO, số ca tử vong do ung thư trên toàn thế giới sẽ lên đến con số 11,8 triệu mỗi năm vào năm 2030 [1]. Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê qua ghi nhận ung thư tại Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh; ước tính mỗi năm ở nước ta có khoảng 150 nghìn bệnh nhân mới mắc ung thư và 75 nghìn người chết vì ung thư; con số này có xu hướng ngày càng gia tăng [2]. Hóa học liệu pháp trong điều trị ung thư đã xuất hiện ở thế kỷ 19 với việc sử dụng potassium arsenite để điều trị bệnh bạch cầu tủy và được sử dụng đến tận những năm 1930 [3]. Đến nay, nhiều hợp chất thiên nhiên hoặc các sản phẩm được tổng hợp, bán tổng hợp từ các hợp chất tự nhiên đã được sử dụng một cách hiệu quả trong việc điều trị, phòng ngừa bệnh ung thư và các bệnh tật khác giúp con người chống lại bệnh tật, nâng cao sức khỏe cộng đồng. Nhiều loại thuốc chữa trị ung thư sử dụng các hoạt chất được phân lập từ tự nhiên như nhóm các hợp chất vinca alkaloid vinblastine, vincristine được phân lập từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus, họ Trúc đào-Apocynaceae), paclitaxel (Taxol) là một diterpenoid được phân lập từ loài Thông đỏ Taxus brevifolia (Taxaceae) hay một số hợp chất khác podophyllotoxin, camptothecin, berbamine, beta-lapachone, acid betulinic, colchicine, curcumin, daphnoretin, ellipticine, và dẫn xuất bán tổng hợp của chúng vinflunine, docetaxel (Taxotere), [4],[5]. Cùng với sự phát triển của công nghệ tổng hợp hóa dược tạo ra các biệt dược, các nhà khoa học vẫn đang cố gắng -1-
tìm hiểu, khám phá tác dụng chống ung thư và các hoạt tính sinh học khác của các hợp chất có nguồn gốc từ nhiều loài thực vật khác nhau. Việt Nam nằm ở trung tâm Đông Nam Á với 3/4 diện tích là đồi núi, thuộc khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa có hai mùa rõ rệt thay đổi theo địa hình. Lượng mưa hằng năm vào khoảng 1200-2800 mm cùng với độ ẩm tương đối cao. Với những đặc thù về khí hậu thiên nhiên như vậy, Việt Nam có một hệ thực vật phong phú và đa dạng với trên 12.000 loài, trong đó có trên 3.200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian; mở ra tiềm năng nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên từ các loài thực vật của Việt Nam [6]. Chi Goniothalamus (tên Tiếng Việt là Giác đế) thuộc họ Na (Annonaceae) có 160 loài phân bố ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, đặc biệt ở Châu Á, tập trung nhiều ở Đông Nam Á [7]. Nhiều loài trong số đó đã được sử dụng trong các bài thuốc y học cổ truyền. Theo tác giả Nguyễn Tiến Bân, chi Goniothalamus ở Việt Nam có 19 loài. Một số loài trong chi này được sử dụng chữa vết thương, làm thuốc trị đòn ngã tổn thương, gãy xương, làm thuốc bổ, kích thích tiêu hóa [8],[9]. Cho đến nay mới có khoảng 30 loài trong số 160 loài thuộc chi Goniothalamus được nghiên cứu về hoá thực vật. Các nghiên cứu này cho thấy styryl-lactone, alkaloid và acetogenin là các lớp chất chính có trong các loài Goniothalamus; trong đó nhiều styryl-lactone và acetogenin thể hiện hoạt tính sinh học phong phú như hoạt tính gây độc tế bào, chống khối u, trừ sâu, chống nấm, kháng trùng sốt rét, kháng lao và hoạt tính chống oxi hóa [10],[11]. Với đặc trưng cấu trúc và hoạt tính sinh học của các lớp chất thiên nhiên thứ cấp có trong cây, các loài thuộc chi Goniothalamus tiếp tục được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong khuôn khổ của Đề tài nghiên cứu khoa học cơ bản mã số 104.01.76.09 và dự án Hợp tác Quốc tế Pháp - Việt “Nghiên cứu hóa thực vật của thảm thực vật Việt Nam”; một số loài Goniothalamus của Việt Nam đã được thu hái và thử hoạt tính sơ bộ. Kết quả cho thấy dịch chiết EtOAc của vỏ và quả cây Goniothalamus macrocalyx Ban có khả năng ức chế lần lượt 50,2%; 43,1% dòng tế bào ung thư biểu mô KB ở nồng độ 1 μg/mL. Dịch chiết EtOAc của lá và quả cây Goniothalamus gracilipes Ban có khả năng ức chế lần lượt 29,7%; 17,0% dòng tế -2-
bào KB ở nồng độ 1,0 μg/mL. Cho đến nay mới chỉ có 2 loài Goniothalamus của Việt Nam (G. tamirensis, G. vietnamensis) được nghiên cứu về thành phần hóa học và chưa có công trình trong nước hay quốc tế nào nghiên cứu về hóa học của hai loài G. macrocalyx Ban và G. gracilipes Ban. Do vậy chúng tôi lựa chọn hai loài Goniothalamus này làm đối tượng nghiên cứu của Luận án với mục tiêu: (1) Nghiên cứu thành phần hóa học cây Giác đế đài to (G. macrocalyx Ban) và cây Giác đế cuống dài (G. gracilipes Ban) nhằm phát hiện các hợp chất có hoạt tính chống ung thư. (2) Khảo sát hoạt tính chống ung thư và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng các hợp chất này. -3-
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1. 1 Giới thiệu sơ lược về thực vật họ Na (Annonaceae) Họ Na (danh pháp khoa học Annonaceae) là một họ thực vật có hoa bao gồm các loại cây thân gỗ, cây bụi hay dây leo. Đây là họ lớn nhất của bộ Mộc lan (Magnoliales) với 130 chi và 2.300 loài, được phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới [8],[11]. Hầu hết các dạng sống chủ yếu được thấy ở các loài trong họ Na, chỉ trừ các cây thân cỏ và các dạng sống phụ sinh hay ký sinh. Đối với các loài cây mọc đứng thường gặp ở dạng cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ. Trong khi đó nhiều loài khác thuộc chi Polyathia và hàng loạt các chi khác lại gặp những cây gỗ to lớn [8]. Hình thái chung của các cây họ Na có những đặc điểm sau [8]: Lá của tất cả các loài họ Na đều không có lá kèm, mọc cách, đơn, nguyên, mép lá nguyên với gân lông chim. Hoa của các loài họ Na thường là hoa lưỡng tính. Hoa mọc đơn độc hoặc họp thành các dạng cụm hoa khác nhau, ở nách lá hoặc ngoài nách lá, ở đỉnh cành hoặc hoa mọc trên thân già không lá. Đặc điểm này thường được dùng để phân biệt các chi trong họ Na. Nhị trong họ Na có hai kiểu chính: “kiểu Uvarioid” với trung đới khá dầy và dài vượt quá bao phấn để tạo thành mào trung đới,“kiểu Miliusoid” có trung đới mỏng và hẹp, làm cho bao phấn lồi lên so với trung đới. Phần lớn các loài họ Na có bộ nhụy gồm các lá noãn rời. Mỗi lá noãn được chia thành bầu, vòi nhụy và núm nhụy. 1.2 Giới thiệu về thực vật chi Goniothalamus 1.2.1 Sơ lược về chi Goniothalamus 1.2.1.1 Đặc điểm hình thái của chi Goniothalamus Các loài Goniothalamus ở dạng cây bụi hoặc gỗ nhỏ, ở các bộ phận non không có lông hình sao. Hoa lưỡng tính, thường mọc ở nách lá xanh hoặc nách lá đã rụng, -4-
hiếm khi hoa mọc trên thân già hoặc vừa ở đỉnh hoặc vừa ở nách; ở gốc cuống hoa thường có một số lá bắc nhỏ. Lá đài (3), cánh hoa (6) đều xếp van; 3 cánh hoa vòng ngoài thường phẳng; các cánh hoa vòng trong rất nhỏ và dày hơn cánh hoa ngoài, ở gốc thót lại thành móng hẹp, còn đỉnh thì dính nhau tạo thành mũ, chụp lên trên nhị và nhụy. nhị nhiều, dạng uvarioid; mào trung đới có khi rất nhọn đầu hoặc thường thì cụt, bao phấn hướng ngoài, thường có vách ngăn ngang. Lá noãn nhiều, vòi thường rõ, với núm nhụy nguyên hoặc hơi xẻ thành hai thùy. Noãn 1-2 hoặc 3-10. Phân quả ngồi hoặc có cuống ngắn [8]. Chi Goniothalamus có 160 loài, phân bố ở châu Á đến Niu Ghinê, tập trung nhiều ở Đông Nam Á (Thái Lan, Đông Dương, Malaixia, Inđônêxia, Philipin). Ở Việt Nam chi này có 19 loài [7],[8]. 1.2.1.2 Một số loài Goniothalamus ở Việt Nam Theo tác giả Nguyễn Tiến Bân, chi Goniothalamus ở Việt Nam có 19 loài [8]: Goniothalamus albiflorus Ban (Giác đế hoa trắng): Cho đến nay mới gặp loài này ở Trung Bộ Việt Nam: Thừa Thiên-Huế, Kon Tum. Goniothalamus chinensis Merr. & Chun. (Giác đế trung hoa): Cây này có ở Lào Cai (Sapa), Hà Giang, Quảng Ninh và còn có cả ở Trung Quốc (Quảng Tây, Quảng Đông, Hải Nam). Goniothalamus chartaceus P. T. Li (Chân kiềng hay giác đế giấy): Hiện mới thấy loài này ở miền Bắc Việt Nam: Quảng Ninh, Lạng Sơn. Goniothalamus donnaiensis Fin. & Gagnep. (Giác đế nhung, còn gọi là giác đế đồng nai): Mới chỉ thấy loài này ở Trung và Nam Bộ Việt Nam: Khánh Hoà, Kon Tum, Đắc Lắc, Đắc Nông, Lâm Đồng, Ninh Thuận, Đồng Nai. Goniothalamus elegans Ast. (Giác đế thanh lịch): Loài này mới gặp ở Trung Bộ Việt Nam: Quảng Bình. Goniothalamus expansus Craib (Giác đế xoè): Loài này được tìm thấy ở Gia Lai và còn gặp ở Thái Lan. Goniothalamus gabriacianus (Baill.) Ast. (Giác đế sài gòn): Loài này có ở Quảng Trị, Đà Nẵng, Quảng Nam, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Kon Tum, Gia Lai, -5-
Đắc Lắc, Tây Ninh, Bình Dương, Bà Rịa-Vũng Tàu, Kiên Giang, ngoài ra còn có ở Trung Quốc, Lào, Campuchia. Goniothalamus gracilipes Ban (Giác đế cuống dài): Loài này gặp ở Trung Bộ Việt Nam (Đắc Lắc), gần đây còn tìm thấy ở Thái Nguyên. Goniothalamus macrocalyx Ban (Màu cau trắng, còn gọi là giác đế đài to, tai nghé, bồ câu đất): Loài này có ở Bắc Cạn, Hà Nội, Hòa Bình, Thanh Hóa, gần đây còn tìm thấy ở Hà Giang. Goniothalamus multiovulatus Ast. (Giác đế nhiều noãn): Cho đến nay chỉ mới gặp loài này ở Trung Bộ Việt Nam: Thừa Thiên-Huế, Đà Nẵng. Goniothalamus ninhianus Ban (Giác đế lâm đồng): Có ở Lâm Đồng. Goniothalamus takhtajanii Ban (Giác đế tam đảo): Loài này chỉ mới gặp ở miền Bắc Việt Nam: Vĩnh Phúc (Tam Đảo). Goniothalamus tamirensis Pierre ex Fin. & Gagnep. (Giác đế miên, còn gọi là giác đế Tamir): Loài này có ở Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Đắc Lắc, Đắc Nông và còn có ở Lào, Campuchia. Goniothalamus tenuifolius King (Giác đế lá mỏng): Loài này có ở Kon Tum, ngoài ra còn gặp ở Malaixia. Goniothalamus touranensis Ast. (Giác đế đà nẵng): Cho đến nay chỉ thấy loài này ở vùng Trung Bộ Việt Nam: Đà Nẵng, Quảng Nam, Khánh Hòa, Đắc Lắc, Lâm Đồng. Goniothalamus undulatus Ridl. (Giác đế lượn sóng): Có ở Đắc Lắc, ngoài ra còn có ở Mianma, Thái Lan. Goniothalamus vietnamensis Ban (Bổ béo đen): Loài này mới gặp ở miền Bắc Việt Nam: Cao Bằng, Quảng Ninh, Phú Thọ, Hà Nội (Ba Vì, Minh Quang). Goniothalamus wightii Hook.f. & Thoms. (Giác đế ấn độ): Loài này có ở Đà Nẵng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Gia Lai, Đồng Nai, ngoài ra còn có ở Ấn Độ, Lào, Campuchia. Goniothalamus yunnanensis W. T. Wang (Giác đế vân nam): Loài này có ở Lào Cai, Sơn La, Lạng Sơn, Hòa Bình và còn có ở Trung Quốc (Vân Nam). -6-
Theo tác giả Võ Văn Chi, một loài thuộc chi Goniothalamus của Việt Nam được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian như lá của cây Giác đế giấy (G. chartaceus P. T. Li) được dùng nấu nước rửa vết thương; thân cây Giác đế nhung (G. donnaiensis Fin. & Gagnep.) được dùng làm thuốc trị đòn ngã tổn thương và gãy xương; rễ cây Giác đế sài gòn (G. gabriacianus (Baill.) Ast.) dùng làm thuốc giải độc, trừ ban trái, đậu sởi; rễ cây Bổ béo đen (G. vietnamensis Ban) được dùng sắc nước uống làm thuốc bổ, kích thích tiêu hóa [9]. 1.2.2 Đặc điểm thực vật cây Giác đế đài to Cây Giác đế đài to (G. macrocalyx Ban) ở dạng cây gỗ nhỏ, cao 10-15 m, cành non, cuống lá và cuống hoa đều có lông màu gỉ sắt. Lá dai, thường láng ở mặt trên, thuôn hoặc thuôn hình trứng ngược, cả 2 mặt (trừ ở gân chính mặt dưới) đều nhẵn; chóp lá thành mũi ngắn, gốc lá tù; gân bên mờ nhưng hơi nổi ở 2 mặt. Hoa mọc ở nách lá đã rụng (có khi ở trên cành già); cuống hoa mập, ở gốc mang 4-6 lá bắc không đều nhau có lông ở cả 2 mặt (Hình 1.1.). (1) [8] (2) Hình 1.1. Cành mang hoa (1) và ảnh chụp tiêu bản lá, cành mang quả (2) của cây Giác đế đài to Loài Giác đế đài to có cánh hoa ngoài khi tươi màu vàng nhạt, dày, hình mác, có 1 gân ở giữa, cả hai mặt đều có lông tơ màu gỉ sắt; cánh hoa trong hình trứng hơi nhọn đầu, dính nhau ở đỉnh tạo thành mũ, mặt ngoài có lông. Nhị nhiều, chỉ nhị rõ, -7-
bao phấn có vách ngang; mào trung đới hình đĩa hơi lồi, có lông. Lá noãn nhiều, bầu có lông dài; vòi ngắn; núm nhụy hình phễu, dài bằng bầu, ở đỉnh hơi xẻ 2 môi. Noãn 2. Đế hoa gần phẳng. Phân quả có lông màu nâu đen, thuôn hoặc hình trụ cong, có mỏ nhọn ở đỉnh, vỏ quả mỏng. Hạt màu nâu, nhẵn và hơi láng [8]. 1.2.3 Đặc điểm thực vật cây Giác đế cuống dài Cây Giác đế cuống dài (G. gracilipes Ban) ở dạng cây bụi nhỏ, cao 3-4 m, cành và cuống lá khi rất non có lông màu nâu, về sau nhẵn. Lá mỏng, hình trái xoan hoặc hình thuôn. Cả hai mặt (trừ gân chính ở mặt dưới) đều không có lông, chóp lá hơi có mũi ngắn, gốc là hình nêm hoặc tù, gân cấp II rất mờ ở cả hai mặt. Hoa mọc đơn độc ở nách lá ; cuống hoa mảnh, ở gốc mang 3-5 lá bắc. Lá bắc có khi dạng lá lớn cỡ 12-20 x 6-10 mm. Lá đài rời từ gốc, hình trứng rộng, hơi tù đầu. Cả hai mặt đều gần như nhẵn, bền theo quả và nằm sát đế quả (Hình 1.2.). (1) [8] (2) Hình 1.2. Cành mang hoa, quả (1) và ảnh chụp tiêu bản lá, cành mang quả (2) của cây Giác đế cuống dài Loài Giác đế cuống dài có cánh hoa ngoài dày, hình trứng thuôn nhọn đầu, cả hai mặt đều có lông (mặt ngoài rậm hơn) màu vàng nâu, dính nhau bởi mép và có đỉnh hình 3 cạnh rõ ; cánh hoa trong hình thoi, dính nhau ở đỉnh tạo thành mũ nhọn đầu, mặt ngoài có lông màu vàng nâu. Nhị nhiều hình cái đinh, có chỉ nhị ngắn ; bao -8-
phấn có vách ngang, mào trung đới hình đĩa lồi, có lông ngắn, rất rộng hơn bao phấn. Lá noãn không nhiều, hơi dài hơn nhị, bầu hoàn toàn nhẵn, vòi nhỏ và ngắn, núm nhụy hình trụ, ở đỉnh nguyên và hơi loe rộng. Noãn một. Phân quả hình trứng, có mũi nhọn, nhẵn, khi chín màu đỏ, ở trên cuống rất dài 3-4 cm, vỏ quả mỏng. Hạt màu xám vàng nhẵn [8]. 1.3 Các nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học chi Goniothalamus Cho đến nay mới có khoảng 30 loài trong số 160 loài thuộc chi Goniothalamus được nghiên cứu về hoá thực vật. Các nghiên cứu này cho thấy styryl-lactone, acetogenin và alkaloid là ba lớp chất chính có trong các loài Goniothalamus, ngoài ra còn gặp một số nhóm chất khác như flavonoid, terpenoid, [7]. 1.3.1 Styryl-lactone từ chi Goniothalamus Các styryl-lactone được phân lập từ chi Goniothalamus thường có bộ khung cơ bản C13 gồm mạch styryl gắn với vòng lactone được chia thành 6 nhóm cấu trúc cơ bản đặc trưng bao gồm: styryl-pyrone (I), furano-pyrone (II), furano-furone (III), pyrano-pyrone (IV), butenolide (V) và heptolide (VI) (Hình 1.3.). Nhiều styryl-lactone thể hiện hoạt tính sinh học phong phú như hoạt tính gây độc tế bào, chống khối u, trừ sâu, kháng vi sinh vật kiểm định, kháng trùng sốt rét, kháng lao và hoạt tính chống oxi hóa; trong đó hoạt tính gây độc tế bào đã được nghiên cứu một cách tỉ mỉ và đưa ra cơ chế hoạt động của styryl-lactone [7],[10]. Hình 1.3. Các khung cơ bản của styryl-lactone -9-
1.3.1.1 Styryl-pyrone từ chi Goniothalamus Năm 1972, nhóm tác giả K. Jewers và cộng sự thuộc Viện các hợp chất nhiệt đới của Anh đã phân lập được (R)-goniothalamin (1) từ vỏ cây Goniothalamus andersonii. Đây là hợp chất styryl-lactone đầu tiên được phân lập từ chi Goniothalamus (Annonaceae) [12]. Hợp chất này cũng được phân lập từ nhiều loài thuộc chi Goniothalamus, như G. andersonii, G. fulvus, G. giganteus, G.macrophyllus, G. malayanus, G. scortechinii, G. sesquipedalis, G. tamirensis, G. tapis và G. uvaroides, trong đó có loài G. tamirensis của Việt Nam [13]. Năm 1998, kết quả thử hoạt tính sinh học ban đầu cho thấy (R)-goniothalamin (1) có hoạt tính in vitro đối với nhiều dòng tế bào ung thư như dòng tế bào ung thư máu P388, u bướu WEHI1640 và ung thư dạ dày ở người HGC-27 với giá trị ED50 lần lượt 0,75; 1,70; 0,70 g/mL [14]. Thử nghiệm tiếp theo cho thấy (R)- Goniothalamin (1) có hoạt tính đối với các dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela, ung thư vú MCF7, ung thư buồng trứng Caov-3. Đặc biệt là (R)-goniothlamin lại không độc đối với tế bào lành tính, kết quả thử hoạt tính chống ung thư in vivo cho thấy hợp chất này có hoạt tính chống ung thư vú trên chuột thực nghiệm Sparague- Dawley [15]. Năm 2003, nhóm tác giả Malaysia S.H. Inayat-Hussain và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu HL-60 của (R)-goniothalamin (1). Từ mô hình về chương trình cái chết định sẵn của tế bào ung thư máu HL-60 cho thấy styryl-lactone (R)-goniothalamin (1) từ chi Goniothalamus hoạt hóa hệ thống enzym caspases qua sự mất màng ty thể dẫn đến phóng thích sắc tố tế bào ty thể c, làm cho nhiễm sắc thể bị co rút không thể phân chia và làm tế bào ngừng phát triển [16]. Năm 2011, nhóm tác giả M. Al-Qubaisi đã đánh giá một cách chi tiết hoạt tính gây độc tế bào của (R)-goniothalamin đối với dòng tế bào ung thư ở người gồm tế -10-
bào ung thư gan HepG2, tế bào gan bình thường Chang. Kết quả cho thấy (R)- goniothalamin (1) có khả năng giảm sự phát triển của tế bào HepG2 một cách chọn lọc sau 72 giờ với giá trị IC50 = 4,63 M, trong khi đó giá trị IC50 đối với dòng tế bào Chang là 35,01 M. Nghiên cứu đã chỉ ra hoạt tính gây độc tế bào của (R)- goniothalamin (1) có sự liên quan đến ức chế quá trình tổng hợp ADN [17], [18]. Ngoài hoạt tính gây độc tế bào, (R)-goniothalamin (1) còn thể hiện hoạt tính chống nấm. Năm 2008, nhóm các nhà nghiên cứu của Brazil đã thử nghiệm và cho thấy (R)-goniothalamin (1) thể hiện mức độ hoạt tính khác nhau đối với nhiều chủng nấm, trong đó hoạt tính mạnh hơn cả là đối với hai chủng nấm Paracoccidioides braziliensis và Paracoccidioides braziliensis với giá trị MIC lần lượt 9,0; 6,8 g/mL [19]. Gần đây, năm 2013 nhóm các nhà khoa học Malaysia R.P.T Kim và cộng sự đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của (R)-goniothalamin (1) cho thấy chất này có hoạt tính chống oxi hóa (IC50 = 2,04 M), tuy nhiên kém hoạt động hơn chất đối chứng (acid ascobic IC50 = 0,075 M) [20]. Đã có nhiều dẫn xuất của (R)-goniothalamin (1) được phân lập từ các loài khác nhau thuộc chi Goniothalamus, do đó hợp chất này được coi là tiền chất trong quá trình sinh tổng hợp hợp chất styryl-lactone khác (2-5). Các styryl-pyrone thường gặp ở các dạng khác nhau với mức độ oxi hóa mạch liên kết với vòng phenyl và mức độ bão hòa của vòng pyrone như 7,8-olefin styryl-pyrone ((R)- goniothalamin (1)); 7,8-epoxy styryl-pyrone (goniothalamin oxide (2)); 7,8- dihydroxy styryl-pyrone (goniotriol (3), goniodiol (4)); styryl-pyrone bão hòa (garvensintriol (5)). Goniothalamin oxide (2) được phân lập từ loài G. macrophyllus của Malaysia vào năm 1987. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy hợp chất này có khả năng gây sảy thai ở chuột [21]. Từ loài G. giganteus các nhà khoa học Ấn Độ lần lượt phân lập được goniotriol (3) (1989), goniodiol (4) (1991). Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào cho thấy goniotriol (3), goniodiol (4) đều có hoạt tính đối với các dòng tế bào ung thư phổi A-549, ung thư vú MCF-7, ung thư đại tràng HT-29; trong đó hợp chất 4 có hoạt tính mạnh hơn (3) ở cả 3 dòng tế và hoạt tính đối với dòng tế bào A-549 là mạnh hơn cả (ED50 = 0,12 g/mL) [14],[22],[23]. -11-
Styryl-pyrone bão hòa đầu tiên được phân lập là garvensintriol (5) từ vỏ cây G. arvensis vào năm 1998 [24]. Năm 2003, từ vỏ và lá của cây G. amuyon của Trung Quốc, nhóm tác giả Y.H. Lan và cộng sự đã phân lập được 8-chlorogoniodiol (6) [25]. Đây là dẫn xuất halogeno styryl-lactone hiếm gặp trong chi Goniothalamus. Hợp chất này cũng được phân lập từ cây G. scortechinii của Thái Lan vào năm 2012 cùng với một số styryl-pyrone khác như goniothalamin (1), goniothalamin oxide (2), goniodiol (4). Các styryl-pyrone này đã được thử hoạt tính kháng lao, chống sốt rét và hoạt tính gây độc tế bào. Kết quả cho thấy goniothalamin (1) và goniothalamin oxide (2) có hoạt tính chống sốt rét và hoạt tính gây độc tế bào mạnh, trong đó (1) có hoạt tính mạnh hơn (2). Dẫn xuất chloro của chất 4 là 8-chlorogoniodiol (6) có hoạt tính mạnh hơn chất 4 đối với cả 3 các dòng tế bào ung thư biểu mô KB, ung thư vú BC, ung thư phổi NCI-H187 [25],[26],[27]. Từ các loài G. amuyon, G.giganteus, G. grifithii, G. sesquipedalis, G. uvaroides một số dẫn xuất acetyl hóa, alkyl hóa của các styryl-pyrone trên được phân lập: 5-acetoxygoniothalamin (7), 5-acetoxyisogoniothalamin oxide (8), 8- acetylgoniotriol (9), etharvendiol (10), 7-acetylgoniodiol (11), 8-acetylgoniodiol (12), goniodiol diacetate (13), 8-methoxygoniodiol (14) [10],[24],[25]. -12-
Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào cho thấy các dẫn xuất acetyl của goniodiol và goniotriol đều có hoạt tính đối với dòng tế bào ung thư phổi A-549, ung thư đại tràng HT-29, ung thư máu P-388 với giá trị ED50 < 10 g/mL. Cả ba dẫn xuất acetyl của goniodiol (11, 12, 13) thể hiện hoạt tính mạnh hơn goniodiol (4) đối với dòng tế bào P-388, nhưng kém hoạt động hơn đối với hai dòng tế bào A- 549, HT-29; trong khi đó 8-acetylgoniotriol (9) lại có hoạt tính mạnh hơn goniotriol (3) đối với các dòng tế bào A-549, HT-29. Đối với các dòng tế bào thử nghiệm, dẫn xuất monoacetyl của goniodiol có hoạt tính mạnh hơn dẫn xuất monoacetyl của goniotriol [14]. Một kết quả thử hoạt tính khác đối với dòng tế bào ung thư dạ dày NUGC, ung thư mũi hầu HONE-1 các dẫn xuất của goniodiol cho thấy dẫn xuất chloro 8-chlorogoniodiol (6) có hoạt tính chọn lọc đối với dòng tế bào HONE-1 (IC50 = 4,87 g/mL), dẫn xuất monoacetyl goniodiol là (11) và (12) có hoạt tính mạnh đối với hai dòng tế bào thử nghiệm, mạnh hơn cả chất đối chứng actinomycin D đối với dòng tế bào NUGC. Tuy nhiên dẫn xuất methoxy 8-methoxygoniodiol (14) lại có hoạt tính rất yếu đối với các dòng tế bào NUGC và HONE-1 [25]. Một dẫn xuất styryl-pyrone khác là howiinol A (15) được các nhà khoa học Trung Quốc R. Chen và cộng sự chiết tách ra lần đầu tiên vào năm 1998 từ vỏ cây G. howii Merr (Annonaceae) [28]. Về mặt cấu trúc, howiinol A (15) chính là dẫn xuất cinnamoyl của goniotriol (3). Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy howiinol A (15) có hoạt tính chống ung thư in vitro đối với nhiều dòng tế bào ung thư ở người như ung thư máu L1210, HL-60, ung thư biểu mô KB, ung thư buồng trứng A2780, ung thư gan Bel 7402, ung thư ruột kết HCT-18 và dòng tế bào phổi lành tính. Đặc biệt howiinol A (15) lại không có độc tính cao đối với dòng tế bào phổi lành tính. Hợp chất này còn được thử nghiệm in vivo cho thấy có khả năng làm giảm sự phát triển của khối u ung thư gan H22, ung thư phổi Lewis và ung thư mô liên kết S-180 ở chuột nhắt trắng. Nghiên cứu cũng đã chỉ ra howiinol A (15) ức chế -13-
ADN trên dòng tế bào ung thư máu L1210 và đồng thời ức chế enzym topoisomerase II, làm ngăn cản quá trình chuyển pha G1 sang pha S trong một chu kỳ tế bào [29],[30]. 1.3.1.2 Furano-pyrone từ chi Goniothalamus Altholactone (16) là furano-pyrone đầu tiên được nhóm tác giả A.E. El-Zayat phân lập từ vỏ cây G.giganteus vào năm 1985. Tiếp theo đó từ một số loài Goniothalamus đã phân lập được altholactone (16) và diasteromer isoaltholactone (17) [10]. Altholactone (16) đã được các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ nghiên cứu (1989) cho thấy hợp chất này được coi là một trong số các styryl-lactone có hoạt tính cao nhất với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 0,1 đến 10 M đối với nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau ở người như ung thư máu, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư ruột kết, u sắc tố [31]. Isoaltholactone (17) cũng thể hiện hoạt tính mạnh, chọn lọc đối với dòng tế bào u bạch cầu 9PS, tế bào ung thư đại tràng HT-29 với giá trị IC50 < 1 M [14]. Năm 2009, altholactone (16) được tách ra từ loài G. laoticus và kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy hợp chất này còn có hoạt tính chống sốt rét, chống lao [27]. Gần đây, năm 2011, nhóm nghiên cứu của F.A. Momani và cộng sự đã cho thấy altholactone (16) còn có hoạt tính mạnh đối với các vi khuẩn Gram (-) (E. Coli, S. typhi) và vi khuẩn Gram (+) (S. aureus, E. faecalis) mở ra con đường sử dụng chất này trong y học và trong nông nghiệp để khử trùng, diệt khuẩn [32]. -14-
Năm 2000, nhóm các nhà khoa học Tây Ban Nha E. Peris và cộng sự đã phân lập được dẫn xuất acetyl của altholactone 7-acetylaltholactone (18) từ vỏ cây G. arvensis [33]. Hợp chất này tiếp tục được phân lập từ loài G. laoticus (2009), G. undulatus (2011). Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy 7-acetylaltholactone (18) cũng có hoạt tính đối với nhiều dòng tế bào ung thư và hoạt tính chống sốt rét nhưng không thể hiện hoạt tính chống lao. Đặc biệt 7-acetylaltholactone (18) còn có hoạt tính mạnh hơn altholactone (16) đối với dòng tế bào ung thư phổi COR-L23, tế bào phổi nguyên bào sợi ở người MRC-5 [27],[34]. Từ các loài G. giganteus, G. arvensis, các furano-pyrone goniofupyrone (19), goniotharvensin (20), etharvensin (21), arvensin (22) được phân lập và xác định cấu trúc [10]. Hợp chất (19) được thử hoạt tính gây độc tế bào nhưng thể hiện hoạt tính yếu đối với các dòng tế bào ung thư phổi A-549, ung thư vú MCF-7, ung thư đại tràng HT-28 [14]. Năm 2005 nhóm tác giả Y.H. Lan và cộng sự đã phân lập được một furano- pyrone goniofupyrone A (23) mới với vòng pyrone và furan tiếp giáp với nhau ở vị trí C-4,6 trong khi đó ở các furano-pyrone đều có dạng vòng pyrone và furan tiếp giáp ở vị trí C-5,6 [35]. Tuy nhiên kết quả thử hoạt tính đối với các dòng tế bào ung thư gan (HepG2, Hep3B), ung thư vú (MCF-7, MDA-MB-231) cho thấy hợp chất này không thể hiện hoạt tính đối với các dòng tế bào trên [35]. -15-
1.3.1.3 Furano-furone từ chi Goniothalamus Từ vỏ cây G. giganteus nhóm tác giả X.P. Fang và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất furano-furone goniofufurone (24) (1990) và 8-epi-goniofufurone (25) (1991) [37],[38]. Đây là một cặp đồng phân epimer ở C-8. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư phổi A-549, ung thư vú MCF-7, ung thư đại tràng HT-29 cho thấy goniofufurone (24) có hoạt tính đối với dòng tế bào A-549 (ED50 = 4,76 g/mL), còn 8-epi-goniofufurone (25) không có hoạt tính đối với 3 dòng tế bào trên [37],[38]. Năm 2011, nhóm tác giả M.M. Jiang và cộng sự đã phân lập từ loài G. cheliensis hai epimer của 8-epi-goniofufurone (25) là (+)-cheliensis A (26) (epimer C-4) và (+)-cheliensis B (27) (epimer C-5) [39]. 1.3.1.4 Pyrano-pyrone từ chi Goniothalamus Hợp chất pyrano-pyrone đầu tiên là goniopypyrone (28) được X.P. Fang và cộng sự phân lập vào năm 1990 từ vỏ cây G. giganteus của Thái Lan. Cũng từ loài G. giganteus nhóm tác giả này phân lập được 5-deoxygoniopypyrone (29) vào năm 1991 [36],[37],[38]. Từ loài G. leiocarpus, nhóm tác giả Q. Mu và cộng sự phân lập được epimer của 5-deoxygoniopypyrone (29) ở C-8 là leiocarpin A (30) [10]. H H H 4 10 4 10 O O 10 O 4 8 2 8 2 8 2 12 HO 5 O 12 O 12 O O O O 14 7 6 14 7 6 14 7 6 HO H HO H HO H (28) (29) (30) -16-
Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy goniopypyrone (28) có hoạt tính mạnh đối với cả 3 dòng tế bào ung thư phổi A-549, ung thư vú MCF-7, ung thư đại tràng HT-29 với giá trị ED50 < 0,7 g/mL, trong khi đó 5-deoxygoniopypyrone (29) lại thể hiện hoạt tính yếu đối với 3 dòng tế bào trên [37]. Năm 2010 TS. Nguyễn Mạnh Cường và cộng sự đã phân lập được một pyrano-pyrone mới (+)-7-epi-5-deoxygoniopypyrone (31) từ lá cây G. tamirensis của Việt Nam [40]. Kết quả thử hoạt tính chống loãng xương cho thấy (+)-7-epi-5- deoxygoniopypyrone (31) có khả năng kích thích sự phát triển của tế bào xương ở nồng độ 2,67 M [40]. Từ một số loài của chi Goniothalamus, các dẫn xuất acetyl của pyrano-pyrone cũng được phân lập và xác định cấu trúc. Năm 2003, nhóm tác giả S. Wang và cộng sự đã phân lập từ cây G. cheliensis của Trung Quốc hợp chất 7-acetyl-5- deoxygoniopypyrone (32) [41]. Năm 2013, nhóm nghiên cứu của GS. Nguyễn Văn Hùng đã phân lập từ lá cây G. tamirensis hợp chất 7-epi-5-deoxygoniopypyrone acetate (33) cùng với 2 pyrano-pyrone khác 5-deoxygoniopypyrone (29) và (+)-7-epi- 5-deoxygoniopypyrone (31) [13]. 1.3.1.5 Butenolide từ chi Goniothalamus Hai hợp chất butenolide goniobutenolide A (34) và goniobutenolide B (35) được nhóm các tác giả X.P. Fang và cộng sự phân lập từ loài G. giganteus vào năm 1991. Hai butenolide trên cũng được nhóm nghiên cứu của S.G. Cao và cộng sự phân lập từ loài G. borneensis vào năm 1998 [10]. -17-
Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy goniobutenolide A (34) và goniobutenolide B (35) đều có hoạt tính trung bình đối với các dòng tế bào ung thư phổi A-549, ung thư vú MCF-7, ung thư đại tràng HT-29; trong đó goniobutenolide B (35) có tính chọn lọc đối với dòng tế bào A-549 (ED50 = 0,91 g/mL) [14]. Năm 2003, nhóm tác giả A. Hisham và cộng sự đã phân lập từ vỏ cây G. cardiopetalus của Ấn Độ hợp chất cardiobutanolide (36) [42]. Tuy nhiên đến nay chưa có tài liệu công bố về hoạt tính sinh học của hợp chất này. 1.3.1.6 Heptolide từ chi Goniothalamus Các hợp chất gonioheptolide-A (37) và gonioheptolide-B (38) được nhóm tác giả X.P. Fang và cộng sự phân lập từ vỏ cây G. giganteus vào năm 1993. Năm 1997, nhóm tác giả A. Bermejo và cộng sự phân lập được almuheptolide-A (39) và almuheptolide-B (40) từ vỏ cây G. arvensis [10]. Đến nay vẫn chưa có tài liệu công bố về hoạt tính sinh học của nhóm chất styryl-lactone này. 1.3.1.7 Một số styryl-lactone khác từ chi Goniothalamus Bên cạnh nhóm các nhóm chất styryl-lactone trên, trong một số loài Goniothalamus còn phân lập được các styryl-lactone dưới dạng dimer hóa. Năm 2002, từ rễ cây G. cheliensis nhóm các nhà khoa học Trung Quốc S. Wang và cộng sự đã phân lập được dimer styryl-lactone goniolactone A (41) [43]. -18-
Goniolactone A (41) được tạo thành do sự kết hợp của hai phân tử goniodiol (4) và altholactone (16) qua liên kết ether giữa C-8 và C-7’. Năm 2005, nhóm các nhà khoa học của Đài Loan Y.H. Lan và cộng sự đã phân lập được dimer styryl- lactone digoniodiol (42) từ lá và vỏ cây G. amuyon [25]. Về cấu trúc, digoniodiol (42) chính là dimer tạo thành từ hai phân tử goniodiol (4) liên kết với nhau qua vị trí C-8 và C-8’ bằng cầu nối ether. Cấu trúc của (42) được khẳng định bằng dữ liệu đo nhiễu xạ tia X. Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy digoniodiol (42) có hoạt tính trung bình đối với các dòng tế bào ung thư gan HepG2, Hep3B, ung thư vú MDA- MB-231 và thể hiện hoạt tính mạnh hơn goniodiol (4) đối với các dòng tế bào HepG2 và MDA-MB-231 [25]. Gần đây, năm 2012 tác giả J.X. Zhu và cộng sự đã phân lập được 1 dimer sryryl-lactone goniodilactone (43) từ lá của loài G. cheliensis của Trung Quốc [44]. Goniodilactone (43) và goniolactone A (41) là một cặp đồng phân diasteromer, khác nhau ở cấu hình C-7, C-8, C-7’ và C-8’. Goniodilactone (43) được tạo thành từ phân tử isoaltholactone (17) và một diasteromer của goniodiol (4). Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối với các dòng tế bào ung thư ở người như ung thư tiền liệt tuyến DU 145, PC-3, ung thư vú MCF-7, ung thư phổi A-549, ung thư biểu mô KB cho thấy goniodilactone (43) có hoạt tính đáng kể với giá trị IC50 nằm trong khoảng 1,29-4,56 g/mL, hợp chất này có hoạt tính mạnh hơn isoaltholactone (17) là thành phần cấu tạo nên phân tử (43) đối với tất cả các dòng tế bào trên [44]. 1.3.1.8 Sinh tổng hợp styryl-lactone Theo các tác giả X.P. Fang (1993) và T.K.M. Shing (1995), con đường sinh tổng hợp các styryl-lactone được đề nghị là bắt nguồn từ quá trình sinh tổng hợp acid shikimic, qua phenylalanine rồi tạo thành acid cinnamic (đơn vị cấu trúc C6- C3). (Hình 1.4.). Hai phân tử acetyl-Coenzyme A kết hợp với nhau tạo thành phân tử C4. Phản ứng cặp đôi giữa hai đơn vị cấu trúc C6-C3 và C4, sau đó là quá trình lactone hóa để tạo thành styryl-pyrone (R)-goniothalamin (1) với bộ khung cơ bản C4-C3-C6 được coi là chất chìa khóa trung gian. Từ chất chìa khóa trung gian này, qua phản ứng -19-
hydroxyl hóa, vòng hóa khác nhau tạo thành các styryl-lactone với cấu trúc và lập thể phong phú, đa dạng [10], [45]. Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp các khung styryl-lactone cơ bản 1.3.2 Acetogenin từ chi Goniothalamus Acetogenin là nhóm các hợp chất tự nhiên với cấu trúc hóa học độc đáo, chỉ được tìm thấy trong một số loài thuộc họ Na, trong đó có chi Goniothalamus. Về mặt hóa học, các acetogenin được coi là các dẫn xuất của acid béo với bộ khung cacbon C35 hoặc C37 được tạo thành do sự kết hợp của mạch acid béo C32 hoặc C34 với đơn vị propan-2-ol hình thành vòng -lactone ở đầu mạch. Bên cạnh đó trong phân tử acetogenin còn có thể có thêm một số nhóm chức có oxi như hydroxyl, ketone, epoxide, tetrahydrofuran (THF), tetrahydropyran (THP) cùng với liên kết đôi, liên kết ba ở trong mạch [46]. Các acetogenin có nhiều hoạt tính sinh học đa dạng như hoạt tính chống ung thư, ức chế miễn dịch, trừ sâu, diệt sinh vật đơn bào, ức chế sự phát triển của côn trùng, diệt giun sán, diệt vi khuẩn, vi nấm, vi-rút, chống sốt rét. Gần đây các nghiên -20-
cứu chỉ ra cho thấy các acetogenin còn có khả năng ức chế chọn lọc sự phát triển của tế bào ung thư. Cơ chế hoạt động chính của các acetogenin là sự ức chế một cách có hiệu quả NADH là enzym thiết yếu của phức hợp I trong hệ thống chuyển electron điều khiển quá trình phosphoryl hóa-oxi hóa của ty thể [11],[46],[50]. Các dạng cấu trúc đặc trưng của acetogenin như sau [46]: - Các nhóm THF, THP với nhóm thế α-hydroxyl; trong đó có các dạng mono- THF (I, II), bis-THF liền kề (III, IV), bis-THF không liền kề (V, VI), tri-THF (VII), THP (VIII), mono-THF-THP liền kề (IX) (Hình 1.5.). Hình 1.5. Một số dạng cấu trúc THF, THP của acetogenin Về mặt lập thể, các vòng THF có thể ở dạng cis hoặc trans và các nhóm OH bên cạnh vòng THF có thể ở dạng erythro hoặc threo. - Dạng vòng epoxy có thể đơn vòng hoặc đa vòng (XI, XII, XIII) (Hình 1.6.): Hình 1.6. Một số dạng cấu trúc vòng epoxy của acetogenin - Các dạng cấu trúc -lactone với hai nhóm chính là -lactone-α,β-không no (XIV-XVIII) và ketolactone (XIX, XX) (Hình 1.7.): -21-
HO HO CH2OH R R O 1 O 1 O 1 O 4 1 4 R=H, OH R=H, OH O O O O (XIV) (XV) (XVI) (XVII) H3CO O O R 1 O 4 4 1 4 1 O O O O O (XVIII) (XIX) (XX) Hình 1.7. Một số dạng cấu trúc vòng -lactone của acetogenin Các acetogenin được phân lập chủ yếu từ các loài thuộc chi Annona của họ Na (Annonaceae). Đến nay mới chỉ có 6 loài thuộc chi Goniothalamus (G. amuyon, G. donnaiensis, G. gardneri, G. gigianteus, G. sesquipedalis, G. vietnamensis Ban) phân lập được acetogenin thuộc 4 nhóm cấu trúc cơ bản: mono-THF(THP), bis- THF, tri-THF và linear-acetogenin [46]. 1.3.2.1 Mono-THF và mono-THP acetogenin Mono-THF acetogenin đầu tiên được phân lập từ chi Goniothalamus là annonacin (44) và goniothalamicin (45). Hai acetogenin này được nhóm các nhà khoa học Mỹ là A. Alkofahi và cộng sự phân lập từ vỏ cây G. giganteus vào năm 1987 [47]. Annonacin (44) cũng được phân lập từ nhiều loài thuộc chi khác của họ Na. Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy annonacin (44) có hoạt tính in vitro đối với dòng tế bào ung thư bạch cầu 9PS, ung thư biểu mô mũi hầu 9KB, ung thư phổi A- 5 3 3 549 và ung thư đại tràng HT-29 với các giá trị ED50 lần lượt là 10 ; 10 ; 10 ; 3,0 -22-
g/mL. Goniothalamicin (45) cũng có hoạt tính đối với dòng tế bào 9PS và 9KB nhưng kém hoạt động hơn annonacin (44) [47],[48]. Năm 1997, nhóm tác giả F. Alali và cộng sự đã phân lập từ vỏ loài G. giganteus của Thái Lan annomontacin (46) và annomontacinone (47) [49]. Hai hợp chất này chỉ khác nhau về cấu trúc vòng -lactone đầu mạch, (46) ở dạng -lactone-α,β-không no và (47) ở dạng ketolactone tương ứng. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào cho thấy cả hai hợp chất này đều có hoạt tính đối với các dòng tế bào ung thư phổi A-549, ung thư vú MCF-7, ung thư đại tràng HT-29 (giá 8 trị ED50 từ 2,3.10 3,21 g/mL); trong đó hoạt tính của annomontacin (46) mạnh hơn annomontacinone (47) [49]. Điều này phù hợp với nhiều acetogenin khác, dạng -lactone-α,β-không no thường có hoạt tính mạnh hơn dạng ketolactone tương ứng đối với nhiều dòng tế bào ung thư ở người. Đặc biệt annomontacin (46) có hoạt tính rất mạnh đối với các dòng tế bào MCF-7, A-549; mạnh hơn cả đối chứng adriamycin 2,4.106 lần đối với dòng tế bào ung thư vú MCF-7 [49]. Cũng từ loài G. giganteus trên, năm 1998, nhóm tác giả F. Alali và cộng sự đã phân lập được 2 hợp chất THP-acetogenin pyranicin (48) và pyragonicin (49) [50]. -23-
Cả hai hợp chất THP-acetogenin (48) và (49) đều có hoạt tính đối với các dòng tế bào ung thư phổi A-549, ung thư vú MCF-7, ung thư đại tràng HT-29, ung thư thận A-498, ung thư tiền liệt tuyến PC-3 và ung thư tuyến tụy PACA-2 với giá 3 trị ED50 1,3.10 2,8 g/mL; trong đó hoạt tính của pyragonicin (49) kém hơn pyranicin (48) [50]. Ở Việt Nam đến nay mới chỉ có 2 loài thuộc chi Goniothalamus họ Na được nghiên cứu về thành phần hóa học; trong đó từ rễ của loài G. vietnamesis (Bổ béo đen) nhóm tác giả Nguyễn Mạnh Cường và cộng sự đã phân lập được 6 acetogenin mới (2003, 2006) [51],[52]. Các acetogenin mới này ở dạng 3 cặp đồng phân govietnin A, B (50), govietnin C và 34-epi-govietnin C (51), cis-govietnin C và 34- epi-cis-govietnin C (52) đều có khung cacbon C35 với cấu trúc mono-THF, trong đó cặp đồng phân 51 và 52 có cấu trúc dạng -hydroxy--lactone-α,β-không no. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào cho thấy hỗn hợp 50 và (51, 52) có hoạt tính in vitro đối với dòng tế bào ung thư phổi A-549 của người với giá trị ED50 lần lượt là 0,91 và 1,01 g/mL [51],[52]. trans threo OH 24 15 32 23 19 4 35 O 2 OH OH OH O threo 1 (50) O trans threo threo 35 OH OH 20 15 7 1 O 32 O 4 2 OH OH OH O (51) cis threo threo 35 OH OH 20 15 7 1 O 32 O 4 2 OH OH OH O (52) -24-
1.3.2.2 Bis-THF acetogenin Từ vỏ cây G. giganteus của Thái Lan, nhóm các tác giả J.L. McLaughlin và cộng sự (1997) đã phân lập được (2,4-cis và 2,4-trans)-gigantecinone (53) và gigantecin (54) là các bis-THF-aetogenin với hai vòng THF không kề nhau đều có hoạt tính đối với các dòng tế bào ung thư phổi A-549, ung thư vú MCF-7, ung thư đại tràng HT-29, ung thư thận A-498, ung thư tiền liệt tuyến PC-3 và ung thư tuyến 3 tụy PACA-2 với giá trị ED50 nằm trong khoảng 1,08.10 1,0 g/mL, trong đó chất 54 có hoạt tính mạnh hơn 53 [53]. 1.3.2.3 Tri-THF acetogenin Đây là loại acetogenin ít gặp trong tự nhiên. Đến nay mới chỉ có một tri-THF- acetogenin được phân lập từ họ Na là goniocin (55). Hợp chất này được nhóm tác giả Z.-M. Gu và cộng sự phân lập từ loài G. giganteus vào năm 1994 [54]. Tri- THF-acetogenin này có cấu hình tương đối của vòng THF và nhóm OH kề bên là trans-threo-trans-threo-trans-threo. -25-
1.3.2.4 Linear-acetogenin Năm 1997, từ rễ của cây G. gardneri của Trung Quốc, nhóm tác giả Z. Jiang và cộng sự đã phân lập được hai linear-acetogenin gardnerilin A (56) và gardnerilin B (57) [55]. Hai chất này đều thuộc nhóm C35 linear-acetogenin có các cặp vicinal- OH. threo threo 35 OH OH OH OH 32 1 O 4 2 20 19 16 15 8 OH OH O (56) threo 35 OH OH OH 32 1 O 4 2 18 17 10 OH O (57) Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào cho thấy gardnerilin A (56) có hoạt tính đối với các dòng tế bào ung thư ở người như ung thư biểu mô KB, ung thư đại tràng HTC-8, ung thư gan Bel-7402 với giá trị IC50 tương ứng >10, >10 và 3,6g/mL; trong khi đó gardnerilin B (57) có giá trị IC50 đối với các dòng tế bào KB, HTC-8, Bel-7402 lần lượt là 5,5; 4,2; 8,5g/mL [55]. Điều này cho thấy việc tăng thêm nhóm OH trong hợp chất (56) đã làm giảm đáng kể hoạt tính gây độc tế bào của chất này. Như vậy, mức độ phân cực của mạch dài trong phân tử acetogenin có vai trò quan trọng đối với hoạt tính sinh học của nhóm chất này. Năm 1999, từ cây G. gardneri của Sri Lanka, nhóm tác giả P.G. Waterman và cộng sự đã phân lập được một linear-acetogenin mới là goniothalamusin (58) có khung cacbon C25 với nhóm cấu trúc -hydroxymethyl--lactone bão hòa có cấu hình trans, một liên kết ba trong mạch dài và nhóm vinyl cuối mạch [56]. Đây là acetogenin với khung cacbon bất thường so với các acetogenin hầu hết đều có khung cacbon C35 hoặc C37. -26-
1.3.2.5 Sinh tổng hợp acetogenin Các acetogenin được coi là các dẫn xuất của acid béo với bộ khung cacbon C35 hoặc C37 được tạo thành do sự kết hợp của mạch acid béo C32 hoặc C34 với đơn vị propan-2-ol hình thành vòng -lactone ở đầu mạch. Cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu thực nghiệm về con đường sinh tổng hợp acetogenin song với đặc điểm cấu trúc của phân tử, các acetogenin được coi tạo thành từ con đường sinh tổng hợp poliketide. Các vòng THF, THP, epoxide được hình thành từ quá trình epoxi hóa các liên kết đôi, tiếp theo đó là quá trình mở vòng epoxide rồi vòng hóa lại. Giả thuyết về con đường sinh tổng hợp acetogenin được khẳng định nhờ mối liên hệ về cấu trúc của các acetogenin không vòng THF, dạng epoxide, vị trí liên kết đôi tương ứng với các THF-acetogenin [11]. Chẳng hạn, các acetogenin có cấu trúc mono-THF với hai nhóm OH liên kết ở vị trí α so với vòng THF được hình thành từ cis-cis diene hoặc trans-cis diene tương ứng qua phản ứng epoxi hóa rồi vòng hóa; các mono-THF-acetogenin có một nhóm OH bên cạnh vòng THF được hình thành từ keto cis-alkene hoặc keto trans-alkene qua các bước khử hóa nhóm keto rồi vòng hóa (Hình 1.8.) [50]. Hình 1.8. Quá trình hình thành mono-THF acetogenin -27-
Các bis-, tri-THF acetogenin được hình thành từ các triene tương ứng tương tự như con đường hình thành mono-THF-acetogenin. 1.3.3 Flavonoid từ chi Goniothalamus Năm 2000, nhóm các nhà khoa học của Pháp đã phân lập từ cây G. gardneri và G. thwaitesii của Sri Lanka 10 hợp chất flavonoid trong đó có 5 dẫn xuất của chalcone 2'-hydroxy-4,4',6'-trimethoxychalcone (flavokawain A) (59); 2',4'- dihydroxy-4,6'-dimethoxychalcone (60); 2'-hydroxy-4,4',6'- trimethoxydihydrochalcone (61), 2',4'-dihydroxy-4,6'-dimethoxydihydrochalcone (62); 2',4,4'-trihydroxy-6'-methoxydihydrochalcone (63); 2 dẫn xuất của flavanone naringenin trimethyl ether (64), tsugafolin (65); 2 dẫn xuất của flavonol mearnsitrin(myricetin 4’-O-methyl ether-3-O-α-L-rhamnopyranoside) (66); annulatin(myricetin 3-O-methyl ether) (67) và một hợp chất dimerflavonoid (rel)- 1β,2α-di-(2,4-dihydroxy-6-methoxybenzoyl)-3β,4α-di-(4-methoxyphenyl)- cyclobutane (68) [57]. MeO OMe OH 4 R1 B B' 4' 1' 4 HO 7 9 O OH OMe 3 MeO 6 1 2 OR HO 4 A A' OH 5 4 O OH O 2 O OH HO (66) R = rhamnose; R1 = OMe 1 (67) R = Me, R = OH (68) Năm 2006, tác giả K. Likhitwitayawuid và cộng sự của Thái Lan đã phân lập từ lá của loài G. tenuifolius 7 dẫn xuất methoxy-hydroxy của flavone 3’-hydroxy- -28-
3,5,7,4’-tetramethoxyflavone (69); 5-hydroxy-3,7,3’,4’-tetramethoxyflavone (70); 5,4’-dihydroxy-3,7,3’-trimethoxyflavone (71); 5,7,3’,4’-tetrahydroxy-3- methoxyflavone (72); kumatakenin(5,3’,4’-trihydroxy-3,7-dimethoxyflavone) (73); 3,5,7,3’,4’-pentamethoxyflavone (74); 4’-hydroxy-3,5,7,3’-tetramethoxyflavone (75) [58]. Các dẫn xuất của flavone trên đã được khảo sát hoạt tính loại gốc tự do với quercetin (76) làm chất đối chứng dương. Kết quả cho thấy chỉ có hai hợp chất 5,7,3’,4’-tetrahydroxy-3-methoxyflavone (72); kumatakenin(5,3’,4’-trihydroxy-3,7- dimethoxyflavone) (73) có hoạt tính loại gốc tự do tương tự chất đối chứng với giá trị IC50 lần lượt là 6,4; 5,8 M (giá trị IC50 của quercetin (76) là 6,6 M). Từ kết quả trên các tác giả đã đưa ra nhận định cấu trúc 3’,4’-diphenolic là thiết yếu cho hoạt tính loại gốc tự do [58]. Năm 2009, nhóm tác giả A. Abdullah và cộng sự đã phân lập từ quả G. scortechinii 1 hợp chất flavanone pinocembrin (77) [59]. Hợp chất này cũng được phân lập từ hoa loài G. laoticus của Thái Lan vào năm 2009 và từ vỏ loài G. velutinus của Malaysia vào năm 2009 cùng với 1 flavanone khác là naringenin (78) [27],[60]. -29-
Ở Việt Nam, năm 2011 nhóm nghiên cứu của GS. Nguyễn Văn Hùng và cộng sự đã phân lập từ lá cây G. tamirensis 1 hợp chất biflavonoid amentoflavone (79) [6]. 1.3.4 Alkaloid từ chi Goniothalamus Năm 1998, tác giả S.G. Cao và cộng sự đã phân lập từ vỏ cây G. borneensis của Malaysia hai hợp chất aristolactam alkaloid là goniothalactam (80) và aristolactam-AIII (81). Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào cho thấy aristolactam- AIII (81) có hoạt tính mạnh đối với dòng tế bào ung thư máu của chuột P388, dòng tế bào gây sinh quá nhiều lympho bào của người MOLT4 với giá trị ED50 lần lượt là 5,2; 4,3 g/mL; trong khi đó dẫn xuất 3-methyl của hợp chất này là goniothalactam (80) lại có hoạt tính rất yếu đối với các dòng tế bào trên [61]. Năm 1999, nhóm tác giả N. Soonthornchareonnon và cộng sự đã phân lập từ vỏ cây G. marcanii 6 hợp chất 1-azaanthraquinone là marcanine A (82), dielsiquinone (83), marcanine B (84), marcanine C (85), marcanine D (86), marcanine E (87) và 1 hợp chất aminonaphthoquinone là 5-hydroxy-3-amino-2- aceto-1,4-naphthoquinone (88) [62]. -30-
Các hợp chất 8286 và 88 đã được thử hoạt tính gây độc tế bào cho thấy marcanine A (82), dielsiquinone (83), marcanine B (84), marcanine C (85), marcanine D (86) thể hiện hoạt tính mạnh đối với cả 5 dòng tế bào ung thư ở người gồm tế bào ung thư phổi A-549, ung thư đại tràng HT-29, ung thư vú MCF7, u sắc tố RPMI, ung thư não U251 với giá trị ED50 0,04-2,12 M. Hợp chất 3- aminonaphthoquinone (88) có hoạt tính yếu hơn các hợp chất 1-azaanthraquinone trên với giá trị ED50 từ 2,60-3,30 M [62]. Năm 2009, nhóm tác giả R. Lekphrom đã phân lập từ hoa loài G. laoticus của Thái Lan 1 hợp chất aporphine alkaloid ( )-nordicentrine (89) có hoạt tính chống sốt rét đối với chủng Plasmodium falciparum (IC50 = 0,3 g/mL), chống lao đối với chủng Mycobacterium tuberculosis (MIC = 12,5 g/mL). Bên cạnh đó ( )- nordicentrine (89) còn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với các dòng tế bào ung thư biểu mô KB, ung thư phổi NCI-H187, ung thư vú MCF-7 với giá trị IC50 tương ứng 0,4; 0,4; 2,9 g/mL [27]. Gần đây nhất, năm 2013 nhóm tác giả C. Levrier và cộng sự đã phân lập được 2 hợp chất pyridocoumarin alkaloid mới là goiniothaline A (89) và goniothaline B (90) từ cây G. australis của Australia [63]. -31-
Tuy nhiên hai hợp chất pyridocoumarin trên không thể hiện hoạt tính đối với chủng sốt rét Plasmodium falciparum thử nghiệm (IC50 > 50 M) [63]. Ở Việt Nam, năm 2013 nhóm nghiên cứu của GS. Nguyễn Văn Hùng và cộng sự đã phân lập được 1 hợp chất aporphine alkaloid mới goniotamirine (91) và một số alkaloid khác glaunine (92), liriodenine (93) từ lá cây G. tamirensis [13]. 1.3.5 Một số hợp chất khác từ chi Goniothalamus Bên cạnh các nhóm chất trên, một số hợp chất terpenoid, phenolic, aliphatic cũng được phân lập từ một số loài Goniothalamus. Năm 2000, nhóm các nhà khoa học của Pháp đã phân lập từ cây G. thwaitesii của Sri Lanka 3 hợp chất triterpenoid là friedelin (94), friedelinol (95) và acid betulinic (96) [57]. Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy friedelin (94) có hoạt tính kháng lao đối với chủng Bacillus Calmette Guerin với giá trị MIC = 4,9 g/mL [64]. Acid -32-
betulinic (96) thể hiện hoạt tính sinh học phong phú như chống ung thư, HIV, chống sốt rét, diệt khuẩn, nấm, diệt giun sán [65]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu của GS. Nguyễn Văn Hùng và cộng sự đã phân lập từ lá cây G. tamirensis một số hợp chất phenolic và aliphatic như acid cinnamic (97), acid p-methoxycinnamic (98), acid 3,4-dimethoxycinnamic (99), syringaldehyde (100), vanillin (101), acid protocatechuic (102) và hexatriacontan-1- ol (103) [6]. -33-
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu hái mẫu cây và xác định tên khoa học Mẫu vỏ và quả loài Giác đế đài to (Goniothalamus macrocalyx Ban, Annonaceae) được thu hái tại Phú Linh, Hà Giang vào tháng 8 năm 2000. Mẫu quả và lá cây Giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban, Annonaceae) được thu hái tại Văn Lang, Đồng Hỷ, Thái Nguyên vào tháng 11 năm 2000. Hai mẫu cây trên được nhà thực vật học Nguyễn Hữu Hiến định tên. Các mẫu tiêu bản của hai loài Giác đế này (VN 0701, VN 0759) được lưu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2 Phương pháp xử lý và chiết mẫu Các mẫu thực vật sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45 oC, sau đó đem nghiền nhỏ. Các mẫu vỏ, quả cây Giác đế đài to và mẫu quả cây Giác đế cuống dài được ngâm chiết theo một quy trình chung: Ngâm chiết với dung môi CH2Cl2 trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng 3 lần. Gộp các dịch chiết đã lọc, cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn chiết CH2Cl2. Mẫu cây còn lại được ngâm chiết tiếp với MeOH 3 lần (mỗi lần 24 giờ). Sau khi cất loại dung môi MeOH dưới áp suất thấp thu được cặn chiết MeOH tương ứng. Mẫu lá cây Giác đế cuống dài được ngâm chiết với dung môi MeOH ở nhiệt độ phòng 5 lần (mỗi lần 24 giờ). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi ở áp suất thấp thu được dịch chiết thô. Thêm hỗn hợp MeOH và nước theo tỉ lệ thể tích 1/1 vào dịch chiết thô rồi lần lượt chiết bằng các dung môi n-hexane, EtOAc; mỗi dung môi chiết 5 lần. Sau khi cất loại dung môi ở áp suất thấp thu được 2 cặn dịch chiết n-hexane, EtOAc của lá cây Giác đế cuống dài. 2.3 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật -34-
Việc phân tích, phân tách các dịch chiết của cây được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) và sắc ký rây phân tử (sephadex). Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần và sắc ký lớp mỏng điều chế đều được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung môi triển khai là 1 hoặc hỗn hợp một số dung môi thông dụng như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, acetone, MeOH, EtOH. Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230- 400 mesh) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-hexane/acetone, CH2Cl2/MeOH, với tỉ lệ thích hợp. Sắc ký sephadex LH-20 được rửa giải bằng dung môi MeOH hoặc hỗn hợp MeOH/CH2Cl2 (9/1, 8/2, ). 2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ các mẫu thực vật nghiên cứu Các phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại-khả kiến (UV- vis), phổ khối phun bụi điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HRMS), phổ khối nhiều lần MS/MS và các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR và DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được sử dụng để nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất được phân lập. Phổ hồng ngoại được đo bằng máy FTIR-Impact-410 bằng phương pháp viên nén KBr hoặc bao film. Phổ tử ngoại-khả kiến được đo bằng máy Cintra 40. Phổ khối được đo bằng máy UPLC/MS/MS XEvo-TQMS, Waters-USA. Phổ khối phân giải cao biến đổi Fourrier FT-ICR-MS được đo bằng máy Variance 320-MS. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều được đo bằng máy Bruker Avance 500 với TMS làm chất nội chuẩn. Các thiết bị trên thuộc Viện Hóa học –Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ khối phân giải cao sàng lọc ion gắn thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao và sử dụng muối lithium ion hóa phân tử HPLC-Li-(+)ESI-LTQ/Orbitrap, HPLC-Li- -35-
(+)ESI-QTOF cho tín hiệu về số khối của các ion mảnh đặc trưng theo B.C Das [66] cho phép xác định vị trí các nhóm hydroxyl, vòng THF trong phân tử acetogenin. Phương pháp phổ khối lượng này và phương pháp đo nhiễu xạ tia X được đo tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Cộng hòa Pháp. Độ quay cực được đo bằng máy Jasco P-2000 của hãng Jasco-Mỹ và điểm nóng chảy được đo trên máy MEL TEMP3.0 của hãng Thermo Scientific-Mỹ tại Viện Hóa Sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). 2.5 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 2.5.1 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào Dịch chiết EtOAc của vỏ, quả cây Giác đế đài to và dịch chiết EtOAc của quả, lá cây Giác đế cuống dài được thử sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào KB. Dịch chiết CH2Cl2, MeOH và một số phân đoạn của vỏ, quả cây Giác đế đài to và một số chất sạch được thử hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào KB và dòng tế bào phổi nguyên bào sợi của người MRC-5. Các phép thử này được tiến hành tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Cộng hòa Pháp. Các chất còn lại được phân lập từ vỏ, quả cây Giác đế đài to và từ quả, lá cây Giác đế cuống dài được thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Bốn dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATTC gồm: KB - ung thư biểu mô (CCL – 17TM); Hep G2 - ung thư gan (HB – 8065TM); MCF-7 - ung thư vú (HTB – 22TM) và LU-1 - ung thư phổi (HTB-57TM). Sử dụng phương pháp MTT assay: Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh ở điều kiện 37 oC, 4 5% CO2, độ ẩm 95%. Nồng độ tế bào dùng cho thử độc tính là 3x10 /mL. Chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ thích hợp và được ủ cùng tế bào nuôi ở 37 o C, 5% CO2/3 ngày. Sau 72 giờ nuôi cấy ủ với MTT 0,2 mg/mL trong 4 giờ. Dừng phản ứng bằng DMSO. Đọc OD trên máy quang phổ bước sóng 540 nm. Giá trị -36-
IC50 (nồng độ ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào thử nghiệm) được tính toán dựa trên số liệu phần trăm kìm hãm phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve [67]. 2.5.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử theo phương pháp pha loãng đa nồng độ F. Hadacek và H. Greger [68]. Vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người được sử dụng trong phép thử gồm: - Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh. - Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng. - Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật. - Escherichia coli: vi khuẩn gram ( ), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn. - Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram ( ), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột. - Salmonella enterica: vi khuẩn gram ( ), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật. - Candida albicans: là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa. Môi trường nuôi cấy: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud-2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm men. Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256 g/mL và với chất sạch là 128 g/mL. Lấy 10 L dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200l dung dịch vi sinh vật kiểm định có nồng độ 5.105 CFU/mL, ủ ở 37oC/24h. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data. -37-
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM 3.1 Tách chiết, phân lập các chất từ cây Giác đế đài to 3.1.1 Vỏ cây Giác đế đài to 3.1.1.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết tách Mẫu vỏ cây Giác đế đài to sau khi phơi khô, xay nhỏ (1,98 kg) được ngâm chiết với CH2Cl2 trong 24h ở nhiệt độ phòng (5 lít × 3 lần). Gộp các dịch chiết đã lọc, cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được 63,8 g cặn chiết CH2Cl2. Mẫu vỏ thân cây còn lại được ngâm chiết tiếp với MeOH (5 lít × 24 h/lần × 3 lần). Sau khi cô cạn dung môi MeOH trên máy quay cất chân không thu được 40,3 g cặn chiết MeOH (Hình 3.1.). Hình 3.1. Sơ đồ ngâm chiết vỏ cây Giác đế đài to Quá trình phân lập các chất từ cặn CH2Cl2 được trình bày trong Hình 3.2: Tiến hành sắc kí cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH gradient phần cặn CH2Cl2 thu được 9 phân đoạn kí hiệu F1-F9. Từ phân đoạn F2, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-CH2Cl2 gradient thu được 7 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F2.1-F2.7. Tinh chế phân đoạn F2.4 bằng cột sephadex với dung môi MeOH thu được 76 mg chất GM6. -38-
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập dịch chiết CH2Cl2 vỏ cây Giác đế đài to Từ phân đoạn F3, sau khi được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-EtOAc gradient (5 - 80%) thu được 10 phân đoạn nhỏ, kí hiệu từ F3.1-F3.10. Kết tinh phân đoạn F3.2 với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH thu được 20 mg chất GM10. Từ phân đoạn F5, sau khi được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-EtOAc gradient (10 - 80%) thu được 9 phân đoạn nhỏ, kí hiệu từ F5.1-F5.9. Phân đoạn F5.5 được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2-acetone gradient (0 - 10%) thu được 1,1 g chất GM1. Sau khi kết tinh phân đoạn F5.7 trong hệ dung môi n-hexane-EtOAc thu được 145 -39-
mg chất GM2. Từ phân đoạn F5.8, sau khi chạy cột sephadex với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 1/9 thu được 547 mg chất GM3. Quá trình phân lập các chất từ cặn MeOH được trình bày trong Hình 3.3: Hình 3.3. Sơ đồ phân lập dịch chiết MeOH vỏ cây Giác đế đài to Phần cặn MeOH được tinh chế bằng sắc kí cột với hệ dung môi CH2Cl2- MeOH gradient thu được 10 phân đoạn F1-F10. Từ phân đoạn F3, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-CH2Cl2 1/1 thu được 8 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F3.1-F3.8. Tiếp tục tinh chế phân đoạn F3.5 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-CH2Cl2 1/1 thu được 43 mg chất GM7. Tinh -40-
chế phân đoạn F3.7 bằng cột sephadex với dung môi MeOH thu được 2 phân đoạn. Tiến hành sắc ký bản mỏng điều chế phân đoạn thứ hai với hệ dung môi n-hexane- CH2Cl2 1/1 thu được 14 mg chất GM5. Từ phân đoạn F3.8, sau khi chạy cột sephadex với dung môi MeOH thu được 17,5 mg chất GM9. Từ phân đoạn F4, sau khi tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-acetone gradient (8-50%) thu được 15 phân đoạn nhỏ kí hiệu từ F4.1-F4.15. Phân đoạn F4.13 được kết tinh bằng hệ dung môi CH2Cl2-MeOH thu được 6,4 mg chất GM8. Tinh chế phân đoạn F6 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2-acetone gradient thu được 4 phân đoạn nhỏ, kí hiệu F6.1-F6.4. Tiếp tục tinh chế phân đoạn nhỏ F6.4 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-acetone gradient thu được 30 mg chất GM3. Phân đoạn F8 được kết tinh trong hệ dung môi CH2Cl2-MeOH thu được 7,5 mg chất GM4. 3.1.1.2 Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất được phân lập từ vỏ cây Giác đế đài to Altholactone (GM1): 25 Chất dầu màu vàng nhạt; Rf = 0,67 (n-hexane-EtOAc 30/70, v/v); [ ]D + 233,5o (c 0,65; EtOH). 1 FT-IR (film) νmax (cm ): 3432, 3070, 2928, 1726, 1637, 1454, 1368, 1252, 1093, 1022, 823, 704, 640, 448. MeOH + UV max nm (log ): 207 (4,34). (+)-ESI-MS: m/z 255 [M+Na] . 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,29 (5H, m, C6H5); 6,98 (1H, dd, J=5,0 10,0 Hz, H-4); 6,20 (1H, d, J=10,0 Hz, H-3); 4,90 (1H, dd, J=2,5; 5,5 Hz, H-6); 4,73 (1H, d, J=5,5 Hz, H-8); 4,61 (1H, t, J=5,0 Hz; H-5); 4,42 (1H, m, H-7); 3,62 (1H, d, J=3,5 Hz, OH). -41-
13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 161,6 (C-2); 140,5 (C-4); 138,1 (C-9); 128,6 (C-11, C-13); 128,3 (C-12); 126,1 (C-10, C-14); 123,6 (C-3); 86,6 (C-6); 86,0 (C-8); 83,5 (C-7); 68,1 (C-5). Goniopypyrone (GM2): o Tinh thể hình kim màu trắng; đnc. 179-181 C; Rf = 0,42 (n-hexane-EtOAc 25 o 30/70, v/v); [ ]D + 61,7 (c 0,3; EtOH). 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3400, 3272, 2986, 2872, 1741, 1447, 1346, 1223, 1169, 1058, 830, 740, 708, 513, 450. MeOH UV max nm (log ): 206 (3,93); 252 (2,44). (+)-ESI-MS: m/z 273 [M+Na]+. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,42 (4H, m); 7,37 (1H, m); 5,01 (1H, br s, H-8); 4,80 (1H, m, H-5); 4,46 (1H, m, H-4); 4,14 (2H, m, H-7, OH); 4,02 (1H, m, H-6); 3,08 (1H, dd, J=1,5; 19,5 Hz, H-3a); 3,00 (1H, dd, J=5,0; 19,5 Hz, H-3b); 2,37 (1H, d, J=3,5 Hz, OH). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 167,8 (C-2); 135,9 (C-9); 129,0 (C-11, C-13); 128,6 (C-12); 126,2 (C-10, C-14); 72,7 (C-6); 70,9 (C-4); 70,4 (C-8); 70,1 (C-7); 64,5 (C-5); 35,2 (C-3). Goniofufurone (GM3): o Tinh thể hình kim màu trắng; đnc. 152-153 C; Rf = 0,39 (n-hexane-EtOAc 25 o 30/70, v/v); [ ]D + 11,5 (c 0,4, EtOH). 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3420, 3350, 2996, 2862, 1746, 1450, 1342, 1191, MeOH 1046, 905, 702, 635, 493. UV max nm (log ): 206 (3,95); 258 (2,31). (+)-ESI-MS: m/z 273 [M+Na]+. -42-
1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,43 (2H, d, J=7,5 Hz, H-10, H-14); 7,35 (2H, t, J=7,5 Hz, H-11, H-13); 7,28 (1H, t, J=7,5 Hz, H-12); 4,94 (2H, m, H-4, H-5); 4,89 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-8); 4,47 (1H, m, H-6); 3,98 (1H, dd, J=2,0; 8,0 Hz, H-7); 2,81 (1H, dd, J=6,0; 18,5 Hz, H-3a); 2,42 (1H, d, J=18,5 Hz, H-3b). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 178,1 (C-2); 143,6 (C-9); 129,2 (C- 11, C-13); 128,7 (C-12); 128,0 (C-10, C-14); 89,5 (C-5); 85,2 (C-7); 78,4 (C-4); 74,7 (C-6); 72,3 (C-8); 36,3 (C-3). Cardiobutanolide (GM4): o Chất bột rắn màu trắng; đnc. 188-190 C; Rf = 0,41 (CH2Cl2-MeOH 90/10, 24 o v/v); [ ]D +1,3 (c 0,15; MeOH). 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3476, 2937, 2852, 1743, 1629, 1581, 1400, 1206, 1113, 985, 645, 608, 500, 452. MeOH UV max nm (log ): 208 (3,43); 260 (2,06). (+)-ESI-MS: m/z 291 [M+Na]+. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,46 (1H, d, J=7,5 Hz, H-10, H-14); 7,35 (2H, t, J=7,5 Hz, H-11, H-13); 7,27 (1H, td, J=1,5; 7,5 Hz, H-12); 4,78 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 4,59 (1H, dd, J=3,5; 8,0 Hz, H-5); 4,53 (1H, td, J=0,5; 4,5 Hz, H- 4); 4,41 (1H, dd, J=1,5; 8,0 Hz, H-6); 3,90 (1H, dd, J=1,5; 8,0 Hz, H-7); 2,92 (1H, dd, J=5,0; 17,5 Hz, H-3a), 2,45 (1H, dd, J=0,5; 17,5 Hz, H-3b). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 178,6 (C=O); 144,2 (C-9); 129,1 (C- 11, C-13); 128,5 (C-12); 128,4 (C-10, C-14); 88,2 (C-5); 75,4 (C-8); 74,4 (C-7); 70,3 (C-6); 68,8 (C-4); 40,9 (C-3). Goniothalamin (GM5): -43-
o Chất rắn màu vàng nhạt; đnc. 82-84 C; Rf = 0,44 (n-hexane-CH2Cl2 20/80, 27 o v/v); [ ]D +81,0 (c 0,2; EtOH). 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 2925, 1707, 1664, 1627, 1454, 1382, 1244, 1066, 966, 822, 759, 699, 584, 512, 440. MeOH UV max nm (log ): 210 (4,43); 251 (4,32); 282 (3,25); 290 (3,03). (+)-ESI-MS: m/z 223 [M+Na]+. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,40 (2H, m, H-10, H-14); 7,34 (2H, m, H-11, H-13); 7,27 (1H, m, H-12); 6,92 (1H, ddd, J=4,0; 5,0; 9,5 Hz, H-4); 6,73 (1H, d, J=16,0 Hz, H-8); 6,27 (1H, dd, J=6,5; 16,0 Hz, H-7); 6,09 (1H, dt, J=2,0; 10,0 Hz, H-3); 5,10 (1H, ddd, J=1,0; 6,5; 15,5 Hz; H-6); 2,54 (2H, m, H-5). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 163,8 (C-2); 144,5 (C-4); 135,8 (C-9); 133,1 (C-8); 128,7 (C-11, C-13); 128,3 (C-12); 126,7 (C-10, C-14'); 125,7(C-7); 121,7(C-3); 77,9 (C-6); 29,9 (C-5). (+)-T-Cadinol (GM6): 24 o Chất dầu không màu; Rf = 0,50 (n-hexane-CH2Cl2 20/80, v/v); [ ]D +8,3 (c 0,69; EtOH). + (+)-ESI-MS: m/z 205 [M-H2O+H] (CTPT: C15H26O). 1 FT-IR (film) νmax (cm ): 3457; 2928; 2872; 1637; 1458; 1370; 1100; 1010; 885; 724; 642; 566. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 5,55 (1H, br s, H-5); 2,18 (1H, dquint, J=3,1; 7,0 Hz; H-11); 1,98 (2H, m, H-3); 1,96 (1H, m, H-6); 1,92 (1H, m, H-2ax); 1,74 (1H, dt, J=2,8; 2,8; 13,0 Hz; H-9ax); 1,66 (3H, s, CH3-15); 1,47 (1H, dq, J=3,0; 12,5 Hz; H-8ax); 1,41 (1H, m, H-9eq); 1,37 (1H, m, H-2eq); 1,34 (1H, m, H-8eq); 1,22 (3H, s, CH3-14); 1,07 (1H, ddd, J=2,0; 10,3; 12,3 Hz; H-1); 1,01 (1H, m, H-7); 0,91 (3H, d, J=7,0 Hz; CH3-13); 0,79 (3H, d, J=7,0 Hz; CH3-12). -44-
13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 134,4 (C-4); 122,7 (C-5); 70,7 (C-10); 48,0 (C-1); 46,7 (C-7); 40,3 (C-9); 37,8 (C-6); 30,9 (C-3); 28,5 (C-14); 26,2 (C-11); 23,8 (C-15); 22,6 (C-2); 21,4 (C-13); 19,8 (C-8); 15,2 (C-12). α-Cadinol (GM7): 27 o Chất dầu không màu; Rf = 0,34 (n-hexane-CH2Cl2 20/80, v/v); [ ]D 10,0 (c 0,3; EtOH). 1 FT-IR (film) νmax (cm ): 3392; 2933; 2876; 1654; 1457; 1378; 1122; 1037; 922; 819; 715; 614; 523. + (+)-ESI-MS: m/z 205 [M-H2O+H] (CTPT: C15H26O). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 5,50 (1H, br s, H-5); 2,16 (1H, td, J=3,0; 7,0 Hz; H-11); 1,99 (3H, m, H-3, H-2a); 1,81 (1H, dt, J=3,5; 12,5 Hz; H-9a); 1,72 (1H, m, H-6); 1,67 (3H, s, CH3-15); 1,62 (1H, m, H-8a); 1,41 (1H, dt, J=4,0; 12,5 Hz; H-9b); 1,24 (3H, m, H-1, H-2b); 1,09 (3H, s, CH3-14); 1,06 (1H, dt, J=3,0; 11,0 Hz; H-7); 0,92 (3H, d, J=7,0 Hz; CH3-13); 0,77 (3H, d, J=7,0 Hz; CH3-12). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 135,0 (C-4); 122,3 (C-5); 72,4 (C-10); 50,0 (C-1); 46,7 (C-7); 42,2 (C-9); 39,9 (C-6); 31,0 (C-3); 26,0 (C-11); 23,8 (C-15); 22,7 (C-2); 22,0 (C-8); 21,5 (C-13); 20,8 (C-14); 15,1 (C-12). Aristolactam BII (GM8): o Tinh thể hình kim màu vàng; đnc. 248-250 C; Rf = 0,38 (n-hexane-acetone 67/33, v/v). -45-
1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3449, 3194, 2926, 2855, 1717, 1644, 1607, 1462, 1379, 1031, 838, 720, 624, 530, 466. MeOH UV max nm (log ): 205 (3,59); 232 (3,56); 263 (3,49); 276 (3,54); 286 (3,53); 317 (2,97); 385 (2,94). (+)-ESI-MS: m/z 302 [M+Na]+; 581 [2M+Na]+. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3+ CD3OD): δ (ppm) 9,12 (1H, m, H-5); 7,72 (1H, s, H-2); 7,72 (1H, m , H-8); 7,47 (2H, m, H-6, H-7); 7,00 (1H, s, H-9); 4,02 (3H, s, 4-OCH3); 3,98 (3H, s, 3-OCH3). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3+ CD3OD): δ (ppm) 170,2 (C=O); 154,4 (C-3); 151,5 (C-4), 134,8 (C-8a), 134,2 (C-10), 128,9 (C-8), 127,4 (C-5), 127,4 (C-7), 126,9 (C-5a), 125,8 (C-6), 124,2 (C-10a), 121,2 (C-1), 120,8 (C-4a), 109,5 (C-2), 106,2 (C-9), 60,2 (4-OCH3), 56,8 (3-OCH3). 3-Methyl-1H-benz[f]indole-4,9-dione (GM9): o Chất rắn màu vàng; đnc. 248-249 C; Rf = 0,44 (n-hexane-CH2Cl2 25/75, v/v). ( )-ESI-MS: m/z 210 [M H] , (+)-ESI-MS: m/z 212 [M+H]+; (+)-HR-ESI-MS + m/z 212,0710 [M+H] tương ứng với CTPT là C13H9NO2 (theo tính toán lý thuyết [M+H]+ có m/z là 212,0706). 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3429, 3322, 2938, 1647, 1588, 1507, 1403, 1238, 1031, 932, 714. UV (MeOH) max nm (log ): 258 (4,07); 330 (3,32). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3+ CD3OD): δ (ppm) 8,08 (1H, m, H-5); 8,01 (1H, 1 m, H-8); 7,59 (2H, m, H-6, H-7); 6,83 (1H, m, H-2); 2,34 (3H, s, CH3-10). H-NMR (500 MHz, DMSO): δ (ppm) 12,65 (1H, br s, H-1); 8,18 (2H, m, H-5, H-8); 7,76 (2H, m, H-6, H-7); 7,13 (1H, m, H-2); 2,31 (3H, s, CH3-10). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3+ CD3OD): δ (ppm) 182,3 (C-9); 175,7 (C-4); 134,5 (C-8a); 133,4 (C-4a); 133,2 (C-6, C-7); 132,7 (C-9a); 126,5 (C-5); 126,0 (C- 8); 125,5 (C-2); 125,1 (C-3a); 122,8 (C-3); 11,0 (CH3-10). -46-
Acid nonacosanoic (GM10): 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 2,34 (2H, t, J=7,5 Hz, CH2-2); 1,62 (2H, quint, J=7,5 Hz, CH2-3); 1,26 (50H, m, 25 x CH2); 0,88 (3H, t, J=7,5 Hz, CH3). 3.1.2 Quả cây Giác đế đài to 3.1.2.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết tách Hình 3.4. Sơ đồ ngâm chiết quả cây Giác đế đài to Mẫu quả cây Giác đế đài to sau khi phơi khô, xay nhỏ (275 g) được ngâm chiết với CH2Cl2 trong 24h ở nhiệt độ phòng (5 lít × 3 lần). Gộp các dịch chiết đã lọc, cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được 37 g cặn chiết CH2Cl2. Mẫu quả cây còn lại được ngâm chiết tiếp với MeOH (5 lít × 24 h/lần × 3 lần). Sau khi cô cạn dung môi MeOH dưới áp suất thấp thu được 13 g cặn chiết MeOH (Hình 3.4.). Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết CH2Cl2 của quả cây Giác đế đài to được trình bày trong Hình 3.5. Tiến hành sắc kí cột silica gel phần cặn CH2Cl2 với hệ dung môi n-hexane- CH2Cl2 gradient thu được 9 phân đoạn F1-F9. -47-
Hình 3.5. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết CH2Cl2 quả cây Giác đế đài to Phân đoạn F1 được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n- hexane-CH2Cl2 gradient (0-40%) thu được 25 mg hợp chất GM18. Tiếp tục tinh chế phân đoạn F4 bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi rửa giải n-hexane-EtOAc gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ F4.1-F4.5. Tiến hành chạy cột sephadex phân đoạn F4.5 với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 1/9 thu được 11 mg hợp chất GM13. -48-
Phân đoạn F5 được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n- hexane-acetone gradient (0-60%) thu được 6 phân đoạn nhỏ, kí hiệu từ F5.1-F5.6. Tinh chế phân đoạn F5.1 bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane- EtOAc gradient thu được 15 mg hợp chất GM15 và 10 mg hợp chất GM20. Phân đoạn F6 sau khi được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane- CH2Cl2 gradient rồi tiếp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH gradient (0-5%) thu được 3 phân đoạn nhỏ F6.1-F6.3. Tiếp tục tinh chế phân đoạn F6.1 bằng sắc kí cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane-acetone gradient thu được 34 mg hợp chất GM17. Tinh chế phân đoạn F7 bằng sắc kí cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane-acetone gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ F7.1-F7.5. Sau khi kết tinh phân đoạn F7.3 trong hệ dung môi n-hexane-acetone thu được 45 mg hợp chất GM16. Phân đoạn F8 được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n- hexane-acetone gradient (0-60%) thu được 7 phân đoạn nhỏ kí hiệu F8.1-F8.7. Kết tinh phân đoạn F8.1 bằng hệ dung môi n-hexane-acetone thu được 8,7 mg hợp chất GM19. Phân đoạn F8.3 được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel, rửa giải bằng dung môi EtOAc 100% thu được 6 phân đoạn nhỏ F8.3.1-F8.3.6. Tinh chế phân đoạn F8.3.3 bằng sắc kí cột silica gel, rửa giải bằng dung môi EtOAc 100% thu được 22 mg hợp chất GM14. Tiếp tục tinh chế phân đoạn F8.5 bằng sắc kí cột silica gel với dung môi rửa giải EtOAc 100% thu được 2 phân đoạn F8.5.1-F8.5.2. Sau khi tinh chế phân đoạn F8.5.2 bằng sắc kí cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n- hexane-EtOAc 1/1 thu được 63 mg hợp chất GM11. Tiến hành chạy cột sephadex phân đoạn F8.6 với dung môi MeOH thu được 24 mg hợp chất GM12. 3.1.2.2 Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất được phân lập từ quả cây Giác đế đài to 8-Hydroxygoniofupyrone A (GM11): -49-
o Tinh thể không màu (MeOH); đnc. 210,3-211,0 C; Rf = 0,50 (n-hexane/EtOAc 20 o 20/80, v/v); [ ]D 38,5 (c 0,32; EtOH) 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3445, 2945, 1728, 1661, 1441, 1371, 1210, 1029, MeOH 862, 704, 619, 488. UV max nm (log ): 206 (4,01); 257 (2,30). ( )-ESI-MS: m/z 249 [M-H] , HR-ESI-MS: m/z 273,0724 [M+Na]+ tương ứng + với CTPT C13H14O5 (theo tính toán lý thuyết [M+Na] có m/z là 273,0733). 1 13 H-NMR (500 MHz, acetone d6) và C-NMR (125 MHz, acetone d6) (Bảng 4.1). 4-Deoxycardiobutanolide (GM12): 20 o Chất dầu không màu; Rf = 0,53 (n-hexane-acetone 45/55, v/v); [ ]D 3,4 (c 0,44; CHCl3). 1 FT-IR (film) νmax (cm ): 3378, 2926, 1754, 1634, 1414, 1194, 1046, 925, 702, 603, 491. MeOH UV max nm (log ): 207 (4,25); 257 (2,66). ( )-ESI-MS: m/z 251 [M-H] , HR-ESI-MS: m/z 275,0895 [M+Na]+ tương ứng + với CTPT C13H16O5 (theo tính toán lý thuyết [M+Na] có m/z là 275,0890). 1 13 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và C-NMR (125 MHz, CD3OD) (Bảng 4.2). 7-Acetylaltholactone (GM13): o Tinh thể hình kim không màu; đnc. 141-143 C; Rf = 0,31 (n-hexane-acetone 20 o 75/25, v/v); [ ]D +195,7 (c 0,3; EtOH). 1 IR (KBr): max (cm ): 2937, 1743, 1724, 1636, 1500, 1367, 1225, 1050, 920, 822, 707, 603, 479. MeOH UV max nm (log ): 204 (4,32). -50-
(+)-ESI-MS: m/z 297 [M+Na]+. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,30-7,36 (5H, m, C6H5), 7,03 (1H, dd, J=5,5; 10,0 Hz; H-4); 6,28 (1H, d, J=10,0 Hz, H-3); 5,40 (1H, br d, J=3,5 Hz, H-7); 4,98 (1H, d, J=3,5 Hz, H-8); 4,95 (1H, dd, J=1,0; 4,0 Hz, H-6); 4,63 (1H, dd, J=4,5; 5,0 Hz, H-5); 2,16 (3H, s, CH3). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 169,4 (OCOCH3); 160,4 (C-2); 139,1 (C-4); 137,5 (C-9); 128,7 (C-11, C-13); 128,5 (C-12); 126,2 (C-10, C-14); 124,7 (C-3); 86,1 (C-8); 83,6 (C-6, C-7); 69,1 (C-5); 20,8 (OCOCH3). Annonacin (GM14): o 25 Chất rắn dạng sáp màu trắng; đnc. 63-64 C; Rf = 0,44 (EtOAc 100%); [ ]D +16o (c 0,40; MeOH). 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3440, 2930, 2852, 1744, 1635, 1523, 1344, 1229, 1040, 828, 725, 650, 594, 514. EtOH UV max nm (log ): 211 (3,82), 272 (2,74). + HR-ESI-MS: m/z 619,4544 [M+Na] tương ứng với CTPT C35H64O7 (theo tính + toán lý thuyết [M+Na] có m/z là 619,4544). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,18 (1H, br s, H-33); 5,05 (1H, q, J=6,8 Hz; H-34); 3,84 (1H, m, H-4); 3,79 (2H, dd, J=7,0; 13,5 Hz; H-16, H-19); 3,59 (1H, m, H-10); 3,41 (2H, m, H-15, H-20); 2,51 (1H, m, H-3a); 2,42 (1H, m, H- 3b); 1,97 (2H, m, H-17a, H-18a); 1,65 (2H, m, H-17b, H-18b); 1,43 (3H, d, J=7,0 Hz; CH3-35); 1,25-1,53 (m, CH2-59, 1114, 2131); 0,87 (3H, t, J=6,5 Hz; CH3-32). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 174,6 (C-1); 151,8 (C-33); 131,2 (C-2); 82,7 (C-16); 82,6 (C-19); 78,0 (C-34); 74,1 (C-15); 74,0 (C-20); 71,8 (C-10); 69,9 (C-4); 37,4 (C-9); 37,3 (C-5, C-11); 33,5 (C-14, C-21); 33,4 (C-3); 31,9 (C-30); 28,8 (C-17, C-18); 25,5-29,7 (C-68, C-12, C-13, C-2229); 22,7 (C-31); 19,1 (C- 35); 14,1 (C-32). -51-
cis+trans-Solamin (GM15): o Chất bột rắn màu trắng; đnc. 68-70 C; Rf = 0,31 (n-hexane-EtOAc 70/30, 25 o v/v); [ ]D +20 (c 0,30; MeOH). 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3433, 2923, 2860, 1741, 1635, 1467, 1324, 1084, 859, 733, 662, 613, 528. EtOH UV max nm (log ): 208 (4,79). + HR-ESI-MS: m/z 587,4640 [M+Na] tương ứng với CTPT C35H64O5 (theo tính + toán lý thuyết [M+Na] có m/z là 587,4646). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 6,98 (1H, d, J=1,5 Hz; H-33); 4,99 (1H, dq, J=1,8; 6,8 Hz; H-34); 3,80 (2H, m, H-16, H-19); 3,41 (2H, m, H-15, H-20); 2,26 (2H, t, J=7,8 Hz; H-3); 1,98 (2H, m, H-17a, H-18a) (solamin); 1,95 (2H, m, H-17a, H-18a) (cis-solamin); 1,74 (2H, m, H-17b, H-18b) (cis-solamin); 1,68 (2H, m, H- 17b, H-18b) (solamin); 1,40 (3H, d, J=7,0 Hz; CH3-35); 1,25-1,57 (m, CH2-414, 2131); 0,88 (3H, t, J=6,8 Hz; CH3-32). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 173,9 (C-1); 148,9 (C-33); 134,3 (C-2); 82,7 (C-16); 82,6 (C-19); 77,4 (C-34); 74,4 (C-15); 74,1 (C-20); 34,1 (C-14); 33,5 (C-21); 31,9 (C-30); 28,8 (C-17, C-18) (solamin); 28,1 (C-17, C-18) (cis-solamin); 25,6-29,7 (C-413, C-2229); 25,2 (C-3); 22,7 (C-31); 19,2 (C-35); 14,1 (C-32). Isoannonacin (GM16): o Chất bột rắn màu trắng, đnc. 104-105 C; Rf = 0,53 (n-hexane-acetone 60/40, 25 o v/v); [ ]D +20 (c 0,28; MeOH). 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3338, 2925, 2861, 1766, 1704, 1464, 1377, 1189, 1069, 642. -52-
+ HR-ESI-MS: m/z 619,4544 [M+Na] tương ứng với CTPT C35H64O7 (theo tính + toán lý thuyết [M+Na] có m/z là 619,4544). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 4,54 (1H, m, H-4); 3,79 (2H, dd, J=6,5; 13,0 Hz; H-16, H-19); 3,58 (1H, m, H-10); 3,40 (2H, m, H-15, H-20); 3,02 (2H, m, H-2, H-33a); 2,66 (1H, dd, J=9,8; 19,3 Hz; H-33b); 2,22 (1H, ddd, J=3,3; 9,8; 13,0 Hz; H-3a); 2,19 (3H, s, CH3-35); 1,98 (3H, m, H-3b, H-17a, H-18a); 1,70 (1H, m, H-5a); 1,68 (2H, m, H-17b, H-18b); 1,54 (1H, m, H-5b); 1,25-1,73 (m, CH2-69, 1114, 2131); 0,87 (3H, t, J=6,8 Hz; CH3-32). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 205,5 (C-34); 178,8 (C-1); 82,7 (C-16); 82,6 (C-19); 78,9 (C-4); 74,1 (C-15); 74,0 (C-20); 71,7 (C-10); 44,2 (C-33); 35,4 (C-5); 34,5 (C-2); 33,3 (C-3); 31,9 (C-30); 29,9 (C-35); 28,7 (C-17, C-18); 25,3- 37,4 (C-69, C-1114, C-2129); 22,7 (C-31); 14,1 (C-32). trans-Murisolinone (GM17): o Chất bột rắn không màu; đnc. 102-103 C; Rf = 0,41 (n-hexane-acetone 80/20, 25 o v/v); [ ]D +25 (c 0,42; MeOH). 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3512, 2918, 2855, 1743, 1711, 1633, 1467, 1380, EtOH 1188, 1075, 955, 723, 583, 487. UV max nm (log ): 202 (2,50), 279 (1,79). + HR-ESI-MS: m/z 603,4585 [M+Na] tương ứng với CTPT C35H64O6 (theo tính toán lý thuyết [M+Na]+ có m/z là 603,4595). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 4,54 (1H, m, H-4); 3,80 (2H, dd, J=6,5; 13,5 Hz; H-16, H-19); 3,40 (2H, br d, J=6,5 Hz; H-15, H-20); 3,02 (2H, m, H-2, H- 33a); 2,66 (1H, dd, J=9,5; 19,0 Hz; H-33b); 2,23 (1H, ddd, J=3,3; 9,5; 13,0 Hz; H- 3a); 2,19 (3H, s, CH3-35); 1,98 (3H, m, H-3b, H-17a, H-18a); 1,72 (1H, m, H-5a); 1,68 (2H, m, H-17b, H-18b); 1,56 (1H, m, H-5b); 1,25-1,75 (m, CH2-614, 2131); 0,87 (3H, t, J=6,8 Hz; CH3-32). -53-
13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 205,5 (C-34); 178,8 (C-1); 82,7 (C-16, C-19); 78,9 (C-4); 74,0 (C-15, C-20); 44,3 (C-33); 35,5 (C-5); 34,5 (C-2); 33,3 (C- 3); 31,9 (C-30); 29,9 (C-35); 28,7 (C-17, C-18); 25,3-35,5 (C-614, C-2129); 22,7 (C-31); 14,1 (C-32). β-Caryophyllene oxide (GM18): 24 o Chất dầu không màu; Rf = 0,47 (n-hexane-CH2Cl2 50/50, v/v); [ ]D 57,6 (c 0,63; CHCl3). 1 IR (KBr): max (cm ): 2933, 2862, 1668, 1627, 1458, 1370, 1266, 1078, 911, 777, 692, 597, 497. (+)-ESI-MS: m/z 221 [M+H]+. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 4,97 (1H, d, J=1,0 Hz, H-12a); 4,85 (1H, d, J=1,5 Hz, H-12b); 2,87 (1H, dd, J=4,3; 10,8 Hz; H-9); 2,61 (1H, dt, J=9,0; 9,5 Hz, H-2); 2,34 (1H, ddd, J=4,0; 8,0; 12,5 Hz, H-11a); 2,24 (1H, m, H-10a); 2,12 (1H, m, H-11b); 2,08 (1H, m, H-7a); 1,76 (1H, t, J=10,0 Hz, H-5); 1,68 (1H, m, H- 3a); 1,66 (1H, m, H-6a); 1,63 (1H, m, H-3b); 1,42 (1H, m, H-6b); 1,32 (1H, m, H- 10b); 1,20 (3H, s, CH3-15); 1,00 (3H, s, CH3-13); 0,98 (3H, s, CH3-14); 0,96 (1H, m, H-7b). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 151,8 (C-1); 112,7 (C-12); 63,7 (C-9); 59,8 (C-8); 50,8 (C-5); 48,7 (C-2); 39,8 (C-3); 39,2 (C-7); 34,0 (C-4); 30,2 (C-10); 29,9 (C-14); 29,8 (C-11); 27,2 (C-6); 21,6 (C-13); 17,0 (C-15). 2-(2’-Hydroxytetracosanoylamino)octadecane-1,3,4-triol (GM19): -54-
o Chất bột rắn màu trắng; đnc. 141-143 C; Rf = 0,53 (n-hexane-acetone 67/33, 24 o v/v); [ ]D +9,3 (c 0,23; pyridine). 1 IR (KBr): max (cm ): 3432, 2920, 2850, 1629, 1470, 1353, 1083, 971, 785, 711, 656, 594, 542. (+)-ESI-MS: m/z 684 [M+H]+; ( )-ESI-MS: m/z 682 [M-H] . CTPT C42H85NO5. 1 H-NMR (500 MHz, pyridine-d5): δ (ppm) 8,59 (1H, d, J=9,0 Hz, NH); 5,12 (1H, dddd, J=4,5; 4,5; 4,5; 9,0 Hz; H-2); 4,63 (1H, dd, J=3,5; 7,5 Hz; H-2’); 4,52 (1H, dd, J=4,5; 11,0 Hz; H-1a); 4,43 (1H, dd, J=4,8; 10,8 Hz; H-1b); 4,37 (1H, dd, J=5,0; 6,0 Hz; H-3); 4,29 (1H, m, H-4); 2,26 (1H, m, H-5a); 2,23 (1H, m, H-3’a); 2,05 (1H, m, H-3’b); 1,93 (2H, m, H-5b, H-6a); 1,78 (1H, m, H-4’a); 1,70 (2H, m, H-6b, H-4’b); 1,25-1,44 (60H, m, H-717, H-5’23’); 0,86 (3H, t, J=7,0 Hz; CH3- 24’); 0,85 (3H, t, J=7,0 Hz, CH3-18). 13 C-NMR (125 MHz, pyridine-d5): δ (ppm) 175,2 (C-1’); 76,8 (C-3); 73,0 (C- 4); 72,5 (C-2’); 62,1 (C-1); 53,0 (C-2); 35,7 (C-3’); 34,1 (C-5); 32,1 (C-17); 29,6- 30,3 (C-716, C-5’22’); 26,7 (C-6); 25,8 (C-4’); 22,9 (C-23’); 14,3 (C-18, C-24’). Acid palmitic (GM20): 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 2,35 (2H, t, J=7,5 Hz, CH2-2); 1,64 (2H, quint, J=7,3 Hz, CH2-3); 1,26 (24H, m, 12 x CH2); 0,89 (3H, t, J=7,0 Hz, CH3- 16). 3.2 Tách chiết, phân lập các chất từ cây Giác đế cuống dài 3.2.1 Quả cây Giác đế cuống dài 3.2.1.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết tách Quá trình ngâm chiết quả cây Giác đế cuống dài được trình bày trong Hình 3.6. Mẫu quả cây Giác đế cuống dài sau khi phơi khô, xay nhỏ (1,84 kg) được ngâm chiết với CH2Cl2 trong 24h ở nhiệt độ phòng (7 lít × 4 lần). Gộp các dịch chiết đã -55-
lọc, cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được 71 g cặn chiết CH2Cl2. Mẫu quả cây còn lại được ngâm chiết tiếp với MeOH (5 lít × 24 h/lần × 3 lần). Sau khi cô cạn dung môi MeOH dưới áp suất thấp thu được 138 g cặn chiết MeOH. Hình 3.6. Sơ đồ ngâm chiết quả cây Giác đế cuống dài Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết CH2Cl2 của quả cây Giác đế cuống dài được trình bày trong Hình 3.7. Tiến hành sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-acetone gradient phần cặn CH2Cl2 thu được 9 phân đoạn kí hiệu F1-F9. Từ phân đoạn F3 sau khi được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-EtOAc gradient (0-60%) thu được 1,8 gam hợp chất GG1 (phân đoạn F3.7) và 9 phân đoạn nhỏ khác, ký hiệu từ F3.1-F3.10. Tinh chế tiếp phân đoạn F3.2 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-EtOAc gradient (0-75%) thu được 6 phân đoạn nhỏ ký hiệu từ F3.2.1-F3.2.6. Kết tinh phân đoạn F3.2.1 trong hỗn hợp dung môi n-hexane-EtOAc 4/1 thu được 8,6 mg chất GG9. Kết tinh phân đoạn F3.2.2 trong MeOH rồi tinh chế phần dung dịch bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-EtOAc gradient thu được 4 mg chất GG3. Tiến hành chạy cột sephadex phân đoạn F3.2.3 rửa giải với dung môi MeOH thu được 2 phân đoạn nhỏ. Tinh chế tiếp phân đoạn thứ nhất bằng cột sephadex với dung môi MeOH thu được 45 mg chất GG12. Từ phân đoạn F5, sau khi được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2-EtOAc gradient (0 – 20%) thu được 11 phân -56-
đoạn nhỏ, kí hiệu từ F5.1-F5.11. Kết tinh phân đoạn F5.4 với hệ dung môi MeOH- acetone thu được 8 mg chất GG5. Hình 3.7. Sơ đồ phân lập dịch chiết CH2Cl2 quả cây Giác đế cuống dài -57-
Từ phân đoạn F5.5, sau khi được kết tinh bằng hệ dung môi n-hexane-acetone thu được 815 mg chất GG4. Phân đoạn F5.8 được tinh chế bằng sắc kí cột sephadex với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 1/9 thu được 21 mg hợp chất GG2. Phân đoạn F5.9 được tinh chế bằng sắc ký cột sephadex với dung môi MeOH thu được 5 phân đoạn nhỏ, ký hiệu F5.9.1-F5.9.5. Tiến hành tinh chế phân đoạn F5.9.4 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-EtOAc 3/1 thu được 13,6 mg chất GG6. Sau khi chạy cột sephadex với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 1/9 phân đoạn F5.10 thu được 5 phân đoạn nhỏ, kí hiệu F5.10.1-F5.10.5. Phân đoạn F5.10.4 được tinh chế bằng sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi n-hexane-EtOAc 2/1 thu được 4 mg chất GG10. Tiến hành sắc ký cột silica gel phân đoạn F5.10.5 với hệ dung môi n-hexane-EtOAc thu được 15,8 mg chất GG8. Tiếp tục tinh chế phân đoạn F5.11 trên sắc ký cột sephadex với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 1/9 thu được 4 phân đoạn nhỏ ký hiệu F5.11.1-F5.11.4. Tinh chế phân đoạn F5.11.4 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-EtOAc 5/2 thu được 3 mg chất GG11. Kết tinh phân đoạn F7 bằng hệ dung môi n-hexane-CH2Cl2 thu được 122 mg hợp chất GG7. 3.2.1.2 Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất được phân lập từ quả cây Giác đế cuống dài Saccopetrin A (GG1): 25 o Chất rắn dạng sáp; Rf = 0,42 (n-hexane-EtOAc 67/33, v/v); [ ]D 9,0 (c 0,21; CHCl3). 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3456, 3077, 2927, 2862, 1760, 1641, 1468, 1367, 1179, 1048, 911, 727, 625. MeOH UV max nm (log ): 202 (3,66), 214 (3,52), 227 (3,22), 252 (2,93), 267 (3,02), 283 (2,88). (+)-ESI-MS: m/z 391 [M+H]+; HR-ESI-MS: m/z 391,3206 [M+H]+ tương ứng + với CTPT C25H42O3 (theo tính toán lý thuyết [M+H] có m/z là 391,3207). -58-
1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 5,80 (1H, ddt, J=6,5; 10,0; 17,0 Hz, H- 21); 4,99 (1H, ddt, J=1,5; 2,0; 17,0 Hz, H-22a); 4,92 (1H, dd, J=2,0; 10,5 Hz, H- 22b); 4,58 (1H, m, H-24); 3,85 (1H, dd, J=3,0; 12,5 Hz, H-25a); 3,63 (1H, dd, J=4,5; 12,5 Hz, H-25b); 2,69 (1H, m, H-2); 2,29 (1H, m, H-23a); 2,12 (4H, t, J=6,5 Hz, H-12, H-15); 2,01 (2H, m, H-20); 2,00 (1H, m, H-23b); 1,83 (1H, m, H-3a); 1,42-1,49 (5H, m, H-3b, H-11, H-16); 1,26-1,41 (20H, m, H-4H-10; H-17H-19). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 179,8 (C-1); 139,1 (C-21); 114,1 (C- 22); 80,3 (C-13); 80,2 (C-14); 78,5 (C-24); 64,6 (C-25); 39,6 (C-2); 33,7 (C-20); 31,3 (C-3); 27,2-29,6 (C-23, C-4  C-11, C-16  C-19); 18,7 (C-12, C-15). Gracilipin A (GG2): 25 Chất dầu màu vàng nhạt; Rf = 0,35 (CH2Cl2-EtOAc 90/10, v/v); [ ]D 12.2 (c 0,245; CHCl3). 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3420, 2933, 2855, 1760, 1631, 1580, 1469, 1343, 1163, 1009, 809, 715, 575, 475. UV (MeOH) max (log ) 207 (4,51), 214 (4,58), 228 (3,42), 240 (3,71), 253 (4,00), 267 (4,18), 284 (4,08) nm. (+)-ESI-MS: m/z 385 [M+H]+, HR-ESI-MS: m/z 385,2728 [M+H]+ tương ứng + với CTPT C25H36O3 (theo tính toán lý thuyết [M+H] có m/z là 385,2737). 1 13 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và C-NMR (125 MHz, CDCl3) (Bảng 4.3.). Methylsaccopetrin A (GG3): 24 o Chất dầu không màu; Rf = 0,32 (n-hexane-EtOAc 88/12, v/v); [ ]D 13,3 (c 1 0,21; CHCl3). FT-IR (film) νmax (cm ): 2923, 2866, 1720, 1685, 1629, 1411, 1301, 1108, 1039, 827, 672, 622, 554, 500, 461. -59-
MeOH UV max nm (log ): 202 (2,62), 225 (2,19), 253 (1,64), 266 (1,59), 282 + (1,55). HR-ESI-MS: m/z 405,3369 [M+H] tương ứng với CTPT C26H44O3 (theo tính toán lý thuyết [M+H]+ có m/z là 405,3363). 1 13 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và C-NMR (125 MHz, CDCl3) (Bảng 4.4.) 7,3’,4’-Trimethylquercetin (GG4): o Tinh thể hình kim màu vàng; đnc. 174-176 C; Rf = 0,32 (n-hexane-acetone 1 70/30, v/v). FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3440, 2936, 2838, 2872, 1665, 1601, 1494, 1428, 1351, 1210, 1162, 1039, 792, 607, 494. MeOH UV max nm (log ): 206 (4,72), 255 (4,42), 269 (4,34), 356 (4,42). (+)-ESI-MS: m/z 345 [M+H]+. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 12,64 (1H, s, OH); 7,70 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2’); 7,67 (1H, dd, J=2,0; 8,0 Hz, H-6’); 7,04 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5’); 6,42 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8); 6,35 (1H, d, J=2,0 Hz, H-6); 6,04 (1H, s, OH); 3,98 (3H, s, OMe); 3,87 (3H, s, OMe); 3,86 (3H, s, OMe). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 178,7 (C-4); 165,4 (C-7); 162,0 (C-5); 156,7 (C-9); 155,9 (C-2); 148,3 (C-4’); 146,4 (C-3’); 138,8 (C-3); 122,7 (C-1’); 122,5 (C-6’); 114,6 (C-5’); 110,9 (C-2’); 106,0 (C-10); 97,8 (C-6); 92,2 (C-8); 60,2 (OMe); 56,1 (OMe); 55,8 (OMe). Rhamnazin (GG5): o Chất rắn màu vàng nhạt; đnc. 221-223 C; Rf = 0,34 (n-hexane-EtOAc 67/33, v/v). 1 FT-IR (KBr) νmax (cm ): 3476, 3290, 2924, 1656, 1609, 1503, 1435, 1312, 1211, 1153, 1038, 836, 749, 610, 416. -60-