›

Luận án Đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch của vắc xin Rotavin-M1 do Việt Nam sản xuất

pdf 156 trang yendo 3730
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch của vắc xin Rotavin-M1 do Việt Nam sản xuất", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfluan_an_danh_gia_tinh_an_toan_va_tinh_sinh_mien_dich_cua_vac.pdf

Nội dung text: Luận án Đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch của vắc xin Rotavin-M1 do Việt Nam sản xuất

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG * BÙI ĐỨC NGUYÊN ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN ROTAVIN-M1 DO VIỆT NAM SẢN XUẤT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2014
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG * BÙI ĐỨC NGUYÊN ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN ROTAVIN-M1 DO VIỆT NAM SẢN XUẤT Chuyên ngành: Dịch tễ học Mã số: 62.72.01.17 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học 1. PGS.TS. Nguyễn Đăng Hiền 2. GS.TS. Đặng Đức Anh HÀ NỘI – 2014
  3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận án tiến sỹ này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân tôi. Các kết quả nghiên cứu và phân tích là trung thực và chưa từng được công bố dưới bất cứ hình thức nào bởi bất cứ ai khác. Tác giả Bùi Đức Nguyên
  4. LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới các thầy hướng dẫn của tôi: - PGS.TS. Nguyễn Đăng Hiền – Giám đốc Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế - GS.TS. Đặng Đức Anh – Phó viện trưởng Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương. Các thầy đã luôn tận tâm giúp đỡ, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. - Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Thị Luân, TS. Nguyễn Vân Trang, TS Vũ Đình Thiểm đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn: - Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương và cơ sở đào tạo sau đại học của Viện đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận án này. - Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi nghiên cứu và hoàn thành luận án. - Đảng ủy ban giám đốc bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện để tôi nghiên cứu và hoàn thành luận án. - Ban lãnh đạo khoa truyền nhiễm, các anh chị em đồng nghiệp và toàn thể nhân viên khoa truyền nhiễm bệnh viện Bạch Mai. - Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong hội đồng, các nhà khoa học đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình tôi và bạn bè thân thiết luôn ủng hộ và hỗ trợ về mọi mặt trong cuộc sống để tôi có thể hoàn thành luận án này. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, tháng 7 năm 2014 Bùi Đức Nguyên
  5. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Virut Rota 3 1.1.1. Hình thái 5 1.1.2. Cấu trúc 5 1.1.3. Protein 7 1.1.4. Khả năng gây bệnh 10 1.1.5. Dự phòng 10 1.1.6. Điều trị 11 1.2. Dịch tễ học 11 1.2.1. Đường lây truyền 11 1.2.2. Mùa bệnh 12 1.2.3. Lứa tuổi mắc bệnh 12 1.2.4. Chủng lưu hành 12 1.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin Rota trên thế giới 17 1.3.1. Vắc xin đơn giá 17 1.3.2. Vắc xin đa giá 19 1.3.3. Hướng phát triển vắc xin khác 20 1.4. Nghiên cứu sản xuất vắc xin Rota ở Việt Nam 21 1.5. Các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng 26 1.5.1. Giai đoạn tiền lâm sàng 27 1.5.2. Giai đoạn I 30 1.5.3. Giai đoạn II 31 1.5.4. Giai đoạn III 31 1.5.5. Giai đoạn IV 32
  6. 1.6. Các vấn đề cần lưu ý trong thử nghiệm vắc xin trên người 32 1.6.1. Đề cương nghiên cứu 34 1.6.2. Lựa chọn đối tượng tình nguyện tham gia nghiên cứu 35 1.6.3. Phân nhóm 37 1.6.4. Giai đoạn giám sát 38 1.6.5. Các nghiên cứu sau khi vắc xin được cấp giấy phép 40 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1. Đối tượng, phương pháp nghiên cứu 44 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 44 2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn 44 2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ 45 2.2. Vật liệu nghiên cứu 46 2.2.1. Các nguyên vật liệu, dụng cụ dùng cho uống vắc xin, lấy mẫu và xét nghiệm trong phòng thí nghiệm 46 2.2.2. Vắc xin thử nghiệm 47 2.2.3. Vật liệu thu thập thông tin nghiên cứu 49 2.3. Phương pháp nghiên cứu 50 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu giai đoạn 1 50 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu giai đoạn 2. 53 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu giai đoạn 3 60 2.4. Vấn đề y đức trong nghiên cứu 63 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 64 3.1. Kết quả nghiên cứu tính an toàn 64 3.1.1. Tính an toàn trên người trưởng thành 64 3.1.2. Kết quả nghiên cứu tính an toàn trên trẻ em 71 3.2. Kết quả nghiên cứu liều và lịch sử dụng 96 3.2.1. Hiệu giá kháng thể IgA ở các nhóm nghiên cứu 96
  7. 3.2.2. Sự biến đổi hiệu giá IgG trong huyết thanh trẻ trước và sau khi uống các liều vắc xin ở các nhóm nghiên cứu 99 3.2.3. Đáp ứng kháng thể 1 năm sau khi uống vắc xin – So sánh giữa Rotavin-M1 và Rotarix 100 3.3. Kết quả nghiên cứu tính sinh miễn dịch 103 3.3.1. Hiệu giá kháng thể trước khi uống vắc xin 103 3.3.2. Kết quả chuyển đổi huyết thanh sau 1 tháng uống liều 2 105 3.3.3. Hiệu giá kháng thể trung bình nhân sau khi uống vắc xin/giả dược (M2) 107 3.3.4. Phân bố hiệu giá kháng thể IgA trong các đối tượng nghiên cứu 111 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 114 4.1. Tính an toàn của vắc xin Rotavin-M1 114 4.1.1. Tính an toàn trên người lớn 114 4.1.2. Tính an toàn trên trẻ em ở giai đoạn 2 115 4.1.3. Tính an toàn trên trẻ em ở giai đoạn 3 118 4.2. Đánh giá liều và lịch uống vắc xin trên trẻ nhỏ 118 4.3. Đánh giá tính sinh miễn dịch của vắc xin Rotavin ở trẻ em tại Thái Bình và Thanh Sơn, Phú Thọ 123 KẾT LUẬN 125 KIẾN NGHỊ 126 DANH MụC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CứU ĐÃ CÔNG Bố CÓ LIÊN QUAN ĐếN LUậN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  8. CÁC CHỮ VIẾT TẮT CDC Centers for Disease Control and Trung tâm Kiểm soát và phòng Prevention ngừa bệnh tật Hoa Kỳ FFU Fluorescent focus-forming unit Đơn vị huỳnh quang GMT Geometric mean titer Hiệu giá kháng thể trung bình nhân IgA Imuno Globulin A Kháng thể IgA IgG Imuno globulin G Kháng thể IgG NIHE National Institue of Hygiene and Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ương Epidemiology OD Optical Density Mật độ quang POLYVAC Center for Research and Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất Production of Vaccines and Vắc xin và Sinh phẩm y tế Biologicals RT-PCR Reverse Transcription Phản ứng khuếch đại chuỗi gen sao polymerase chain reaction chép ngược RV Rotavirus Virut Rota SGOT Serum Glutamat Oxalacetat Men gan SGOT Transaminase SGPT Serum Glutanric Pyruvic Men gan SGPT Transaminase TCID50 Tissue culture infectous dose Liều gây nhiễm 50% tổ chức 50% TCMR Tiêm chủng mở rộng TĐLS Thực địa lâm sàng VP Virus protein
  9. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các gen và protein của RV 9 Bảng 3.1. Tóm tắt các đặc điểm nhân khẩu học ở những người tình nguyện 64 Bảng 3.2. Kết quả xét nghiệm máu ở người tình nguyện trước khi uống, so sánh với chỉ số bình thường 65 Bảng 3.3. Tỷ lệ người tình nguyện có biểu hiện sốt (trên 38oC) trong vòng 30 ngày sau mỗi liều 67 Bảng 3.4. Tỷ lệ có những triệu chứng đáng chú ý trong vòng 30 ngày sau mỗi liều vắc xin 68 Bảng 3.5. So sánh các kết quả xét nghiệm huyết học và sinh hóa lần 1 và lần 2 69 Bảng 3.6. So sánh các kết quả xét nghiệm huyết học và sinh hóa lần 1 và lần 3 70 Bảng 3.7. Tuổi của trẻ tham gia nghiên cứu sau các liều vắc xin ở các nhóm uống vắc xin khác nhau 71 Bảng 3.8. Kết quả xét nghiệm máu ở trẻ ở các nhóm trước khi uống 72 Bảng 3.9. Trường hợp tiêu chảy có RV trong phân sau khi uống vắc xin liều 1 ở các nhóm nghiên cứu 84 Bảng 3.10. Trường hợp tiêu chảy có RV trong phân sau khi uống vắc xin liều 2 ở các nhóm theo liều uống 84 Bảng 3.11. Trường hợp tiêu chảy có RV trong phân sau khi uống vắc xin liều 3 ở các nhóm theo liều uống 85 Bảng 3.12. Tổng hợp trẻ tham gia nghiên cứu trong giai đoạn III 86 Bảng 3.13. Tuổi (ngày) của trẻ tham gia nghiên cứu tại các thời điểm tham gia nghiên cứu 87 Bảng 3.14. Cân nặng (kg) của trẻ tại các thời điểm tham gia nghiên cứu 88 Bảng 3.15. Chiều cao (cm) của trẻ tham gia nghiên cứu tại các thời điểm tham gia nghiên cứu 88
  10. Bảng 3.16. Các triệu chứng không mong muốn ở trẻ uống vắc xin/giả dược 7 ngày sau mỗi liều tại cả 2 địa điểm nghiên cứu. 89 Bảng 3.17. Các triệu chứng không mong muốn ở trẻ tham gia nghiên cứu tại cả 2 địa điểm nghiên cứu 8-30 ngày sau khi uống liều 1 và 2 91 Bảng 3.18. Mẫu phân tiêu chảy thu thập được trong thời gian nghiên cứu và khả năng phân lập RV trong phân 94 Bảng 3.19. Một số đặc điểm lâm sàng trẻ tiêu chảy trong phân có virut Rota . 95 Bảng 3.20. Hiệu giá kháng thể IgA kháng virut Rota trong huyết thanh của các đối tượng uống vắc xin nghiên cứu và vắc xin Rotarix 96 Bảng 3.21. Hiệu giá kháng thể RV-IgA ở nhóm R (Rotavin) và nhóm E (Rotarix) tại các thời điểm (trước khi tham gia nghiên cứu Mo, 3 và 12 tháng sau liều 1 vắc xin (M2 và M3) 101 Bảng 3.22. Tỷ lệ đối tượng có kháng thể IgA kháng virut Rota dương tính thời điểm 1 năm sau liều 1 102 Bảng 3.23. Tỷ lệ trẻ có kháng thể RV-IgA trước khi uống vắc xin/giả dược 103 Bảng 3.24. So sánh các mức hiệu giá kháng thể IgG ở trẻ trước khi uống vắc xin/giả dược tại 2 địa điểm nghiên cứu 104 Bảng 3.25. Tỷ lệ chuyển đổi kháng thể IgA tại thời điểm 1 tháng sau uống liều 2 106 Bảng 3.26. Hiệu giá trung bình nhân của kháng thể IgA trước và sau khi uống vắc xin/giả dược tại các địa điểm nghiên cứu 107 Bảng 3.27. Hiệu giá trung bình nhân của kháng thể IgG tại các thời điểm thăm khám 108
  11. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sự phân bố các chủng RV trên toàn cầu 5 Hình 1.2. Ảnh chụp RV dưới kính hiển vi điện tử 5 Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc hạt virut Rota và các vùng mã hóa protein 6 Hình 1.4. Hình ảnh hạt virut Rota G1P dưới kính hiển vi điện tử tại lần cấy truyền thứ 30 trên tế bào thận khỉ tiên phát chụp dưới kính hiển vi điện tử - Viện VSDTTƯ 22 Hình 1.5. Tóm tắt qui trình phát triển một loại thuốc mới 26 Hình 1.6. Tóm tắt các giai đoạn thử nghiệm vắc xin 33 Hình 2.1. Sơ đồ tuyển chon và phân nhóm đối tượng giai đoạn 1 50 Hình 2.2. Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu theo dõi an toàn giai đoạn 1 51 Hình 2.3. Sơ đồ tuyển chọn và phân nhóm đối tượng giai đoạn 2 54 Hình 2.4. Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu xét nghiệm giai đoạn 2 nhóm C, E và N 55 Hình 2.5. Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu xét nghiệm giai đoạn 2 nhóm B và R . 55 Hình 2.6. Tóm tắt tuyển chọn và thực hiện cho uống vắc xin tại Thành phố Thái Bình 60 Hình 2.7. Tóm tắt tuyển chọn và thực hiện cho uống vắc xin tại Thanh Sơn - Phú Thọ 61 Hình 2.8. Tóm tắt tuyển chọn và thực hiện cho uống vắc xin cả hai địa điểm 62 Hình 2.9. Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu xét nghiệm giai đoạn 3 63
  12. DANH MỤC BIỂU ĐỒ Đồ thị 1. Chủng lưu hành gây bệnh theo týp G từ 1998 – 2009 16 Đồ thị 2. Chủng lưu hành gây bệnh theo týp P từ 2000 - 2011 17 Biểu đồ 3.1. So sánh chỉ số men gan trung bình trước khi uống và sau mỗi liều vắc xin. Đường kẻ ngang thể hiện chỉ số bình thường 70 Biểu đồ 3.2. Chỉ số hồng cầu ở trẻ trước và sau khi uống vắc xin ở các nhóm khác nhau 73 Biểu đồ 3.3. Chỉ số bạch cầu ở trẻ trước và sau khi uống vắc xin 73 Biểu đồ 3.4. Chỉ số tiểu cầu ở trẻ trước và sau khi uống vắc xin 73 Biểu đồ 3.5. Nồng độ SGOT trước và sau khi uống vắc xin 74 Biểu đồ 3.6. Nồng độ SGPT ở trẻ trước và sau khi uống vắc xin 74 Biểu đồ 3.7. Nồng độ urê trong huyết thanh trẻ trước và sau khi uống vắc xin 74 Biểu đồ 3.8. Tỷ lệ trẻ có các biểu hiện không mong muốn trong vòng 7 ngày sau liều 1 ở các nhóm nghiên cứu 76 Biểu đồ 3.9. So sánh tỷ lệ trẻ ở các nhóm có phản ứng không mong muốn từ ngày thứ 8 đến ngày 30 sau liều 1 77 Biểu đồ 3.10. Tỷ lệ trẻ có triệu chứng không mong muốn trong vòng 1 - 7 ngày sau khi uống liều 2 79 Biểu đồ 3.11. Tỷ lệ trẻ có triệu chứng không mong muốn từ ngày 8-30 sau khi uống liều 2 80 Biểu đồ 3.12. Tỷ lệ trẻ có các triệu chứng không mong muốn trong vòng 7 ngày sau liều 3 81 Biểu đồ 3.13. Tỷ lệ trẻ có triệu chứng không mong muốn trong vòng 8-30 ngày sau liều 3 82 Biểu đồ 3.14. Các triệu chứng không mong muốn trong 7 ngày uống liều 1 và 2 ở trẻ tham gia nghiên cứu tại Thành phố Thái Bình và huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ 90 Biểu đồ 3.15. Các dấu hiệu/ triệu chứng từ ngày 8 – 30 sau uống liều 1 và 2 tại Thành phố Thái Bình và huyện Thanh sơn, Phú Thọ 92
  13. Biểu đồ 3.16. Các triệu chứng không mong muốn ở cả 2 địa điểm nghiên cứu trong vòng 30 ngày sau mỗi liều vắc xin/giả dược 93 Biểu đồ 3.17. Tỷ lệ trẻ có động lực IgA 1 tháng sau liều vắc xin cuối cùng ở các nhóm nghiên cứu 97 Biểu đồ 3.18. Đáp ứng kháng thể RV- IgA sau 2 liều và 3 liều vắc xin ở nhóm C và N 98 Biểu đồ 3.19. Tỷ lệ trẻ có chuyển đổi kháng thể RV-IgG trong huyết thanh ở các nhóm nghiên cứu 99 Biểu đồ 3.20. Hiệu giá kháng thể RV-IgG trước và sau khi uống vắc xin ở các nhóm nghiên cứu 99 Biểu đồ 3.21. Hiệu giá RV-IgA ở 2 nhóm nghiên cứu tại các thời điểm 101 Biểu đồ 3.22. Sự phân bố các mức hiệu giá kháng thể IgG ở trẻ trước khi uống vắc xin tại 2 địa điểm nghiên cứu. 105 Biểu đồ 3.23. Tỷ lệ chuyển đổi kháng thể IgA tại thời điểm 1 tháng sau uống liều 2 106 Biểu đồ 3.24. Hiệu giá trung bình nhân của kháng thể IgA trước và sau khi uống vắc xin/giả dược tại các địa điểm nghiên cứu 107 Biểu đồ 3.25. Tỷ lệ giữa hiệu giá kháng thể IgG trong mẫu M2 và mẫu Mo ở trẻ tham gia nghiên cứu. 109 Biểu đồ 3.26. Hiệu giá trung bình nhân của kháng thể IgG tại các thời điểm thăm khám 110 Biểu đồ 3.27. Tổng hợp phân bố hiệu giá IgA sau liều 2 tại Thành phố Thái Bình 111 Biểu đồ 3.28. Tổng hợp phân bố hiệu giá IgA sau liều 2 tại Thanh Sơn – Phú Thọ 112 Biểu đồ 3.29. Tổng hợp phân bố hiệu giá IgA sau liều 2 tại 2 địa điểm nghiên cứu 112
  14. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tiêu chảy do virut Rota là căn bệnh viêm dạ dày ruột cấp tính phổ biến ở trẻ em trên toàn thế giới. Ở các nước phát triển có 35 - 52% trẻ em bị tiêu chảy cấp là do virut Rota. Ở các nước đang phát triển, tỷ lệ tử vong ở trẻ em do tiêu chảy chiếm 1/3 tổng số tử vong vì mọi nguyên nhân, trong đó tỷ lệ tử vong do tiêu chảy liên quan đến virut Rota chiếm khoảng 20 – 40%. Hàng năm, trên thế giới có khoảng trên 600 nghìn trẻ chết vì tiêu chảy do virut Rota, chiếm 5% số ca chết vì mọi nguyên nhân ở trẻ em dưới 5 tuổi [6],[13],[49],[116]. Tại Việt Nam, hàng năm tỷ lệ mắc tiêu chảy do virut Rota chiếm trên 50% trong tổng số trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy vào điều trị tại một số Bệnh viện Nhi lớn của Việt Nam [6], [99], [114]. Như vậy, tiêu chảy do virut Rota ở trẻ em là một gánh nặng đối với tất cả các nước trên thế giới. Việc cải thiện điều kiện vệ sinh cũng không làm giảm tỷ lệ mắc tiêu chảy do virut Rota, do vậy biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất hiện nay là sử dụng vắc xin. Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã và đang đặc biệt quan tâm đến vấn đề sản xuất vắc xin phòng bệnh do virut Rota [11], [14], [46]. Tại Việt Nam, từ năm 2008, vắc xin Rotarix của Hãng Glaxo Smith Kline đã được đưa vào sử dụng trên thị trường. Tuy nhiên, giá thành của vắc xin này rất cao >700.000 đồng/liều. Do vậy không nhiều người dân có đủ điều kiện để sử dụng vắc xin này cho con em họ. Từ thực tế đó, POLYVAC được Bộ Y tế giao nhiệm vụ nghiên cứu sản xuất vắc xin Rota nhằm chủ động nguồn vắc xin cho nhu cầu trong nước thông qua đề tài nghiên cứu qui trình công nghệ sản xuất vắc xin Rota tại Việt Nam. Đề tài đã được nghiệm thu đạt kết quả xuất sắc. Để triển khai bước tiếp
  15. 2 theo nhằm tiến tới xin cấp đăng ký sử dụng vắc xin Rota tại Việt Nam, chúng tôi đã sử dụng sản phẩm của đề tài cấp nhà nước nói trên là các loạt vắc xin Rotavin-M1 đã được đánh giá trong phòng thí nghiệm và tiền lâm sàng và được Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế cấp giấy chứng nhận chất lượng để tiến hành đề tài: “Đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch của vắc xin Rotavin-M1 do Việt Nam sản xuất”. Mục tiêu của luận án: 1. Đánh giá tính an toàn của vắc xin Rotavin-M1 do Việt Nam sản xuất. 2. Đánh giá tính sinh miễn dịch của vắc xin Rotavin-M1 do Việt Nam sản xuất. 3. Xác định liều dùng và lịch sử dụng thích hợp.
  16. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Virut Rota Virut Rota (RV) là virut không màng, có vật liệu di truyền ARN kép, thuộc họ Reoviridae [17],[18],[78]. Họ này gồm có các nhóm: Reovirut, Coltivirut, Cypovirut, Fijivirut, Orbivirut, Phytoreovirut, Oryzavirut, Reovirut. RV gây bệnh ở động vật có vú, chim, bò sát. Virut có hình khối tròn, đường kính trung bình từ 65-70 nm, giống như một cái bánh xe có các gai ngắn và một cái vành rất nhẵn do vậy có tên là RV [48]. RV được chia thành 7 nhóm; A, B, C, D, E, F và G, trong đó chỉ có nhóm A, B, C gây bệnh cho cả người và động vật [83]. Nhóm D, E, F, G chỉ thấy ở động vật. Nhóm A hay gặp nhất, gây ra hầu hết các vụ dịch tiêu chảy nặng ở trẻ em. Nhóm B thường gây ra những vụ dịch tiêu chảy nặng trên người lớn ở Trung Quốc, còn nhóm C gây ra các trường hợp lẻ tẻ trong các vụ dịch tiêu chảy ở trẻ. VP6 là kháng nguyên quyết định nhóm và phân nhóm, I hoặc II [28],[29],[30]. Các týp huyết thanh và genotype. Týp huyết thanh của RV được đặc trưng bởi hai protein capsid lớp ngoài là VP4 và VP7, xác định bởi kỹ thuật trung hoà, sử dụng kháng huyết thanh tạo ra ở động vật [124]. Giống như virut cúm, phân loại RV dựa trên cùng một lúc VP4 (týp huyết thanh P) và VP7 (týp huyết thanh G). Ví dụ chủng Wa (G1P1A) phân lập từ người thuộc nhóm A, phân nhóm II, týp huyết thanh G1 và P1A, còn chủng DS-1 (G2P1B) thuộc nhóm A, phân nhóm I, týp huyết thanh G2 và P1B. Gần đây RV còn được phân loại dựa theo genotype. Đối VP7, týp huyết thanh G (phân loại bằng kỹ thuật trung hoà) và genotype G (xác định bằng RT-PCR) có mối liên quan chặt chẽ với
  17. 4 nhau, do vậy có thể sử dụng 2 thuật ngữ này tương đương [123],[138]. Có 14 týp huyết thanh G đã phân lập được. Tuy nhiên, đối với VP4, tồn tại song song 2 hệ phân loại theo týp huyết thanh (13 týp) và genotype (21 genotypes). Do 2 hệ phân loại này không trùng lặp, cả 2 thuật ngữ đều được sử dụng để miêu tả chủng RV; ví dụ chủng Wa được ký hiệu là P1A [8] trong đó P1A là týp huyết thanh 1A và [8] là genotype (số trong ngoặc đơn vuông). Tuy nhiên, việc tạo kháng thể chỉ kháng VP4 rất khó khăn (do tỷ lệ VP4 trong hạt virut nhỏ, 1.5% so với tỷ lệ VP7 30%), xu hướng phân loại RV hiện nay dựa trên genotype (xác định bằng RT-PCR) [1],[30]. 14 genotype G đã được nhận dạng ở RV nhóm A. Các týp 1, 2, 3 và 4 là các genotype chiếm đa số còn lại các týp 5,6, 7, 8, 9, 10, 12 chiếm thiểu số trong các týp gây bệnh ở người. Có ít nhất 21 genotype P đã được phát hiện tại thời điểm của bài viết này (tương đương với 12 týp huyết thanh), 8 trong số đó phát hiện ở người là P1A [8], P1B [4], P2A [6], P3 [9], P4 [10], P5A [3], P8 [11], P11 [14]. Các chủng có sự kết hợp giữa G và P genotype bắt đầu xuất hiện với chiều hướng tăng. Về mặt lý thuyết sẽ có rất nhiều chủng RV của người khác nhau bởi khả năng kết hợp của các genotype G (14 chủng) và P (21 chủng). Các kết hợp G và P thường gặp là G1P[8], G3P[8], G4P[8], G2P[4]. Đây là một thuận lợi cho mục đích phát triển vắc xin. Tuy nhiên, sự lưu hành của các chủng RV có khác nhau đáng kể ở các vùng khí hậu khác nhau, một số chủng không thông thường lại phân bố ở một vài quốc gia đang phát triển, týp huyết thanh G9[6] chiếm 9,5% tổng số các chủng RV ở Ấn Độ [15]. Ở Việt Nam theo nghiên cứu dịch tễ học phân tử RV trên trẻ em dưới 5 tuổi nhập viện do tiêu chảy từ năm 2000 - 2003 cho thấy chủng G1P [8] chiếm đa số. Ngoài ra có một tỷ lệ nhỏ các chủng G1P [4], G2P [4], G4P [8], G4P [6], Tuy nhiên, từ năm 2006 đến nay, tỷ lệ lưu hành của chủng G1P[8] đã giảm dần, thay vào đó là sự lưu hành rộng rãi của chủng G3P [6] hoặc G3P[8] [6, 7, 8, 9, 10, 114].
  18. 5 G1P8 G2P4 14% G3P8 G4P8 Hỗn hợp 14,3% Các loại khác 53% 5,4% 10,7% Hình 1.1. Sự phân bố các chủng RV trên toàn cầu 1.1.1. Hình thái Virut có hình khối tròn, đường kính trung bình từ 65-70 nm [1,2]. Giống hệt như một cái bánh xe có các gai ngắn và một cái vành rất nhẵn. Tên Rota virut từ tiếng La Tinh, “Rota” có nghĩa là bánh xe bắt đầu từ hình thái của nó [5,16]. Hình 1.2. Ảnh chụp RV dưới kính hiển vi điện tử [42] 1.1.2. Cấu trúc Dưới kính hiển vi điện tử, virut Rota có dạng khối cầu 20 mặt, đường kính khoảng 75nm [14,101,120]. Chuỗi nucleocapsid của virut được tạo thành bởi ba vòng xoắn đồng tâm gồm 11 đoạn RNA kép. Hạt Rota virut có hai lớp
  19. 6 áo protein bao ngoài. Mỗi đoạn dsRNA mã hóa cho một protein cần thiết cho sự tồn tại và nhân lên của virut [121]. Capsid của RV có dạng đối xứng 20 mặt, 132 capsomer sắp xếp đối xứng xoắn [77,120]. - Lớp ngoài chứa protein cấu trúc VP4 và VP7 - Lớp trong chứa protein cấu trúc VP6 - Lớp lõi chứa protein cấu trúc VP1, VP2 và VP3. Trong đó VP2 là protein bao quanh RNA. Các nghiên cứu bằng kĩ thuật điện di miễn dịch và kính hiển vi điện tử đã khẳng định: Capsid trong mang kháng nguyên đặc hiệu nhóm. Capsid ngoài mang kháng nguyên đặc hiệu týp [6, 14, 88, 100]. Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc hạt virut Rota và các vùng mã hóa protein
  20. 7 Genome của Rota virut là RNA sợi đôi có 11 đoạn kí hiệu từ 1->11. Có độ lớn khoảng 18.555 cặp base. Mỗi gen có trọng lượng phân tử từ 2x105 -> 2,2x106 (Dalton), mã hóa cho một protein cấu trúc hoặc không cấu trúc. Trừ gen 9 và gen 11, mỗi chuỗi mã hóa hóa cho hai phân tử protein. Trọng lượng 11 đoạn ước tính khoảng 10x106 đến 14x106 (Dalton) [41, 42]. Điện di trên gel acrylamit thấy 11 đoạn gen của Rota virut được chia ra làm 4 khu vực. Những gen này được đánh số theo thứ tự phân bố của chúng trên bản gel, chẳng hạn gen nào di chuyển chậm nhất được đánh số 1 [52]. Đối với Rota virut nhóm A: - 4 gen có kích thước lớn: 1,2,3,4 - 2 gen trung bình: 5,6 - 3 gen nhỏ: 7,8,9 - 2 gen nhỏ nhất: 10, 11 1.1.3. Protein 1.1.3.1. Protein cấu trúc Hạt virut chứa ít nhất 6 protein cấu trúc: - Các đoạn 1, 2, 3 và 6 mã hóa cho các protein VP1, VP2, VP3 và VP6. - VP1 là enzym ARN polymerase nằm trong lõi hạt virut, tham gia vào quá trình phiên mã tạo ra các phân tử mARN và tạo ra các bản sao genom ARN cho các hạt virion mới. - VP2 là lớp lõi của hạt virion và liên kết với genom ARN. - VP3 là một phần của màng lõi trong của hạt virion và là enzyme Guanylyl transferase, có vai trò gắn mũ vào đầu 5’ trong quá trình cải biến sau phiên mã phân tử mARN, bảo vệ mARN khỏi sự phân huỷ của các nuclease [110,118]. - Ba protein mang tính đặc hiệu kháng nguyên của virut là VP4,VP6 và VP7.
  21. 8 - Đoạn gen 4 mã hóa cho protein capsit lớp ngoài VP4, là protein bề mặt hạt virut nhô ra như những cái gai, liên kết với các phân tử receptor bề mặt tế bào chủ để đưa toàn bộ genom virut vào tế bào. VP4 là một protein nhạy cảm với protease và định ra týp P của virut, là kháng nguyên trung hòa có tính ngưng kết hồng cầu. VP4 bị enzyme protease trong ruột phân hủy tách ra một cách đặc hiệu tạo thành VP5* và VP8* làm tăng hoạt tính gây nhiễm của virut vào tế bào chủ [42,88]. - Đoạn gen 9 mã hóa cho protein VP7. VP7 có bản chất là glycoprotein là kháng nguyên trung hòa đặc hiệu cho týp huyết thanh và VP7 đinh ra týp G của virut [42, 47]. - VP6 là kháng nguyên chung cho dưới nhóm của RV. - Các gai VP4 nhô ra từ lớp vỏ VP6. Phần VP4 trải dài hướng vào trong và tương tác với VP7 và protein capsit trong VP6. Sự tương tác VP4-VP7, VP4- VP6 bao hàm rằng VP4 có thể tham gia duy trì chính xác hình dạng giữa hai lớp trong và ngoài vỏ capsit cũng như phạm vi ảnh hưởng chức năng. VP7 là glycoprotein tạo ra lớp vỏ ngoài của virut bao gồm 780 phân tử, VP7 tương tác với phần chóp của VP6 [14]. 1.1.3.2. Protein không cấu trúc - Các đoạn gen còn lại (5, 7, 8 hoặc 9 tùy chủng, 10 và 11) mã hóa cho các protein không cấu trúc lần lượt là: NSP1 (NS53), NP2 (NS35), NSP3 (NS34), NSP4 (NS28), NSP5 (NS26). - NSP1 tạo ra từ gen 5 là một protein không cấu trúc liên kết ARN. - NSP2 là một protein liên kết ARN tích lũy trong thể vùi tế bào chất (viroplasms) cần thiết cho quá trình sao chép genom của virut [110,115,131].
  22. 9 Bảng 1.1. Các gen và protein của RV [14] Trọng Đoạn lượng Vị trí trên hạt Protein Chức năng gen phân tử virut (Daltol) 1 VP1 Lõi trong ARN polymerase phụ thuộc 125.005 ARN 2 VP2 Lõi trong Kích thích tái tạo ARN của 102.431 virut 3 VP3 Lõi trong Enzyme Guanylyl 98.120 transferase gắn mũ ARN 4 VP4 86.782 Vỏ capsit ngoài Biệt hóa tế bào, tính độc 5 NSP1 Protein không Không có vai trò cho sinh 58.654 (NS53) cấu trúc trưởng virut 6 VP6 Vỏ trong capsit Cấu trúc và là kháng nguyên 44.816 (NS34) đặc trưng loài 7 NSP3 Protein không Làm tăng hoạt tính mARN (NS34) 34.600 cấu trúc virut và ngừng tổng hợp protein tế bào 8 NSP2 Protein không NTPase liên quan trong việc (NS35) 36.700 cấu trúc protein nhân lên của ARN cấu trúc 9 VP7 Vỏ capsit ngoài Cấu trúc và kháng nguyên 37.368 trung hòa 10 NSP4 Protein không 20.290 Độc tố ruột (NS28) cấu trúc 11 NSP5 Protein không 21.725 Độc tố ruột (NS26) cấu trúc
  23. 10 1.1.4. Khả năng gây bệnh RV là nguyên nhân hàng đầu gây viêm dạ dày ruột cấp dẫn đến tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi, đặc biệt là trẻ từ 6 đến 24 tháng tuổi [4,8,9]. Trẻ sơ sinh hiếm khi bị bệnh, chủ yếu là nhiễm trùng không triệu chứng hoặc biểu hiện rất nhẹ. Một nghiên cứu cho thấy chỉ 10 – 20% trẻ sơ sinh bị nhiễm RV có biểu hiện lâm sàng. Nhiễm trùng không triệu chứng ở trẻ sơ sinh có thể liên quan đến kháng thể từ mẹ truyền qua nhau thai cho con hoặc kháng thể và các yếu tố ức chế trysin trong sữa mẹ, enzym pancreatic, cytokine Như vậy sữa mẹ không những chỉ phòng được nhiễm RV mà còn có thể phòng được bệnh tiêu chảy nặng [23,27]. Ngoài gây viêm dạ dày ruột cấp, RV còn có thể gây viêm ruột hoại tử, lồng ruột, tắc mật, xuất huyết đường niệu, nhiễm trùng huyết Tuy nhiên, hiện nay chưa có bằng chứng điển hình có tính thuyết phục về vấn đề này [137]. Nhiễm trùng do RV cũng khá phổ biến ở người lớn. Theo một nghiên cứu khoảng 55% người lớn khi tiếp xúc với trẻ em bị viêm dạ dày ruột do RV có hiệu giá kháng thể tăng trong thời gian con cái họ mắc bệnh [73]. Một nghiên cứu khác cho thấy 11-70% người lớn bị nhiễm trùng đã biểu hiện thành bệnh tiêu chảy. Bệnh thường do virut nhóm B, người mắc bệnh có thể không có triệu chứng hoặc bị tiêu chảy mãn tính [91, 92, 93]. 1.1.5. Dự phòng Gần như hầu hết trẻ bị nhiễm RV trong vòng 2-3 năm đầu do nhiễm từ nhà, nhiễm tại nhà trẻ, bệnh viện. Do vậy cần cảnh báo cho các bậc phụ huynh cần rửa tay kỹ bằng xà phòng để phá vỡ chuỗi lây nhiễm [64,103]. Các dung dịch diệt khuẩn khác như 0.1% o-phenylphenol và 79% ethanol như Lysol có thể được sử dụng. Hơn nữa cần có kiến thức về các triệu chứng mất nước, cũng như điều trị trẻ khi tiêu chảy. Phương pháp dự phòng hữu hiệu nhất vẫn là sử dụng vắc xin phòng bệnh.
  24. 11 1.1.6. Điều trị Hiện nay, biện pháp hữu hiệu để phòng bệnh này là sử dụng vắc xin. Việc cung cấp nước sạch và cải thiện điều kiện vệ sinh cũng không làm giảm tiêu chảy do virut Rota ở nhiều quốc gia. Những nghiên cứu đã đưa ra rằng nhiễm virut Rota lần đầu có khả năng bảo vệ cho những lần nhiễm sau (giảm triệu chứng lâm sàng, lượng virut thải trong phân). Do vậy, mặc dù có rất nhiều genotype và týp huyết thanh của RV lưu hành, vắc xin phòng virut Rota có thể được phát triển chỉ từ một chủng. Hiện nay, 2 chiều hướng song song tồn tại trong phát triển vắc xin phòng RV: vắc xin đơn giá (nguồn gốc từ người hoặc động vật) và vắc xin đa giá. Cả hai hướng phát triển này đều cho hiệu lực cao, như sẽ trình bày dưới đây. Điều cần quan tâm nhất là tính giảm động lực và gây đáp ứng miễn dịch chéo của vắc xin. Việc bù nước và điện giải là quan trọng nhất trong điều trị tiêu chảy do Rota virut và được thực hiện càng sớm càng tốt. Có thể bù nước bằng đường uống hoặc đường tĩnh mạch. Kháng sinh không có tác dụng trong điều trị. Nếu lạm dụng có thể dẫn tới loạn khuẩn đường ruột. Chính vì vậy việc chuẩn đoán nhanh nguyên nhân gây bệnh sẽ giúp cho có hướng điều trị đúng và hiệu quả. 1.2. Dịch tễ học 1.2.1. Đường lây truyền RV chủ yếu lây truyền theo đường phân miệng ngoài ra còn có thể lây theo đường hô hấp. Bệnh hiếm khi truyền từ động vật sang người. Trẻ em có thể nhiễm cả trước và sau khi ốm kèm tiêu chảy. Đôi khi chúng có thể đưa virut tới những thành viên khác trong gia đình và những người có tiếp xúc gần gũi. RV có thể gây tiêu chảy ở cả người lớn chăm sóc trẻ bị bệnh [14,68,73].
  25. 12 1.2.2. Mùa bệnh Ở các nước khí hậu ôn đới, tiêu chảy do RV thường xuất hiện vào mùa đông. Ở các nước nhiệt đới và các nước đang phát triển, yếu tố mùa ít rõ rệt hơn, bệnh có thể gặp quanh năm [56,104]. Ở Mỹ, RV gây bệnh theo mùa, đạt cao điểm từ tháng 11 đến tháng 5, với mức độ lưu hành bắt đầu từ phía Tây Nam lan sang vùng Đông Bắc [57]. Ở Việt Nam theo Đoàn Thị Ngọc Anh (1987) các tháng 11. 12 và một tỷ lệ phát hiện virut là 25-39,5% so với các tháng 4, 5, 6 là 5% - 10% [1]. 1.2.3. Lứa tuổi mắc bệnh Trên thế giới có khoảng 95% trẻ em ở lứa tuổi từ 3 đến 5 tuổi đã bị nhiễm RV. Tuy nhiên tỷ lệ nhiễm ở trẻ sơ sinh chưa được điều tra một cách có hệ thống, nhiễm RV ở trẻ sơ sinh thường không có triệu chứng, tuổi hay gặp nhất của bệnh là trẻ từ 6 đến 24 tháng tuổi. Nhiễm RV ở người lớn cũng thường không có triệu chứng, đôi khi biểu hiện thành bệnh, đặc biệt ở cha mẹ của trẻ bị tiêu chảy do RV [108]. Theo chương trình giám sát đã công bố năm 2001, sự phân bố bệnh tiêu chảy theo lứa tuổi ở tất cả các lứa tuổi đều không giống nhau. Tại Việt Nam trẻ dưới 3 tháng tuổi ít mắc bệnh do sữa mẹ có tỷ lệ IgA khá cao. Kháng thể này có thể kéo dài tới khi trẻ 2 tuổi, do vậy trẻ bú sữa mẹ được miễn dịch tự nhiên nên ít mắc bệnh hơn. 1.2.4. Chủng lưu hành 1.2.4.1. Trên thế giới * Sự phân bố khác nhau của chủng RV ở các vùng khí hậu khác nhau [126] - Sự phân bố của các kiểu gen G + Theo thống kê tại Nam Mỹ trong 2095 chủng RV được phân tích có 57,5% là G1; 18,3% là G2; 4,4% là G3; 8,8% là G4; 2,3% là G5; và 8,6% là G9.
  26. 13 + Tại châu Phi trong 2133 chủng RV được phân tích có G1, G2, G3, G4, G8 và G9 tương ứng là 35,75%; 20,3%; 13,3%; 14,2%; 12,8 % và 3,7%. + Tại các nước châu Á trong số 13126 chủng phân tích có tỷ lệ G1, G2, G3, G4, G10 và G12 tương ứng là 60,3%; 16,7%; 6,5%; 14,3%; 1,7%; 0,3%; và 0,2%. + Tại Bắc Mỹ trong 2892 chủng RV được phân tích có tỷ lệ chủng G1, G2, G3, G4 và G9 tương ứng là 73,7%; 11%; 10,6%; 2,7%; 8,6% [57]. + Tại Châu Âu trong 14475 chủng RV tỷ lệ G1, G2, G3, G4, G6 và G9 tương ứng là 69.4%; 10,2%; 3,5%; 15,5%; 0,1% và 1,3%. + Tại châu Úc trong 6995 chủng RV được phân tích tỷ lệ chủng G1, G2, G3, G4 và G9 tương ứng là: 74%; 10,8%; 1%; 4,6% và 9,6%. - Sự phân bố của các kiểu gen P Kiểu gen P8 và P4 chiếm hơn 90% tiêu chảy do RV. Ngoại trừ ở châu Phi thì kiểu gen P6 có tỷ lệ cao (22,4%) đứng thứ 2 sau P8 (51%). - Sự phân bố của các chủng hỗn hợp P-G Bốn chủng Rota phổ biến trên toàn cầu G1P8 (64,7%); G2P4 (12%); G3P8 (3,3%); G4P8 (8,5%) là nguyên nhân tiêu chảy ở trẻ em do RV trên thế giới [84]. Sự phân bố chủng P-G biến đổi nhanh chóng từ châu lục này tới châu lục khác. Bốn chủng nói trên chiếm tới 90% các trường hợp ở Bắc Mỹ, châu Âu, châu Úc, ở Nam Mỹ và châu Á có mặt khoảng 68% ca nhiễm, ở châu Phi là 50%. Chủng P8G1 gây ra hơn 70% ca nhiễm ở Bắc Mỹ và châu Âu trong khi đó chỉ xuất hiện trong 30% ca nhiễm ở Nam Mỹ và châu Á, chỉ khoảng 23% ở châu Phi. Trong đó cần phải kể đến là sự phát hiện một số chủng P-G bất thường như P4G1, P8G2, P4G3, P4G4 với tần suất tương đối cao (trong các khu vực khác nhau trên thế giới có thể gợi ý tính di truyền bền vững và khả năng tiềm tàng lây lan của chúng trong cộng đồng).
  27. 14 Sự xuất hiện các chủng bất thường có thể được giải thích bằng các nguyên nhân sau đây [13,126]: Genome RV khi sao chép đã xảy ra đột biến điểm. Khi 2 týp huyết thanh cùng gây nhiễm vào một tế bào sẽ xảy ra hoán vị kháng nguyên. RV gây bệnh mãn tính ở người suy giảm miễn dịch có thể sắp xếp lại genome và tạo ra các đoạn ARN bất thường. Các yếu tố kể trên có thể cùng một lúc xảy ra. Ví dụ vừa sắp xếp lại genome, vừa xảy ra đột biến. Tần số các mẫu không thể định týp khi sử dụng phương pháp EIA nằm trong khoảng 8-46,2%, có thể các chủng đột biến đã tránh được sự nhận biết của các kháng thể đơn dòng hoặc do sự có mặt của các týp huyết thanh bất thường không phát hiện được bởi các kháng thể đơn dòng vẫn thường được sử dụng để xác định RV ở người bằng phương pháp EIA. Ứng dụng RT-PCR xác định genome RV đã làm giảm số lượng các chủng không thể định týp. Tuy nhiên, những kĩ thuật này còn gặp phải những hạn chế vốn có. Các chủng chứa các đột biến lớn ở các vùng bám primer vẫn không thể xác định được. Vẫn còn một số nghiên cứu kết hợp EIA và RT- PCR và lai các đầu dò, tuy vậy khoảng 7,8% - 26,6% các chủng không thể định týp [94,130]. * Sự phân bố của các týp P và G dao động theo thời gian Sự phân bố G và P có sự thay đổi theo thời gian. Trong nghiên cứu 10 năm liên tiếp (1987-1997) ở Bangladesh cho thấy sự dao động hàng năm là một ví dụ tiêu biểu sự phân bố của các týp huyết thanh G1, G2, G3, G4 và G9. - Trong suốt 3 năm đầu tiên G2 là týp huyết thanh phổ biến nhất, tiếp theo là các týp G1 và G4. - Năm thứ 4 các týp G4 là phổ biến nhất và chiếm ưu thế đến năm 1995. Năm 1995 các týp G9 nổi lên và chiếm ưu thế, các týp G4 hiếm gặp hơn. Năm 1996 và 1997 týp G9 phổ biến nhất được xác định trong nước này với tần suất tương ứng là 34,4% và 53%.
  28. 15 Như vậy ta thấy các týp P và G của RV trong cùng một khu vực cũng không ổn định theo các năm, do đó việc nghiên cứu giám sát tiêu chảy do RV tại các nước là cần thiết để có hướng nghiên cứu biện pháp phòng bệnh hợp lý [128]. 1.2.4.2. Tại Việt Nam Hiện nay ở Việt Nam đã có một vài nghiên cứu về bệnh tiêu chảy cấp do virut Rota. Tỷ lệ phát hiện virut Rota bằng kỹ thuật ELISA đối với bệnh nhân tiêu chảy cấp là tương đối cao. Virut Rota lưu hành quanh năm, nhưng giảm vào các tháng nóng ẩm. Lứa tuổi mắc bệnh nhiều nhất là dưới 2 tuổi. Miền Bắc Việt Nam nằm trong vùng khí hậu cận nhiệt đới chia làm bốn mùa rõ rệt nên tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy do virut Rota cũng thay đổi theo mùa. Đỉnh điểm của mùa bệnh là từ tháng 11 đến tháng 5 (mùa đông - xuân) còn các mùa khác tỉ lệ mắc bệnh tiêu chảy do virut Rota ở trẻ em giảm đi rõ rệt [24,76,99]. Theo Đoàn Thị Ngọc Anh, từ 1981 đến 1985, tỷ lệ tiêu chảy cấp do virut Rota ở trẻ em từ 0 đến 5 tuổi tại Viện Nhi Thụy Điển chiếm 26,5%, tại bệnh viện Nhi Đồng 2 thành phố Hồ Chí Minh chiếm 28,1%, bệnh viện Xanh Pôn là 21,5% với tỷ lệ nam (59,5%) cao hơn nữ (40,5%). Bệnh tập trung cao nhất vào các tháng từ 11 đến tháng 1 (27,2% - 39,3%). Cũng theo tác giả này, lứa tuổi hay bị tiêu chảy cấp do virut Rota là từ 0 đến 2 tuổi, đặc biệt là nhóm tuổi 7 đến 12 tháng (26,8%). Theo tài liệu giám sát bệnh tiêu chảy do virut Rota ở trẻ em dưới 5 tuổi tại một số bệnh viện lớn của Việt Nam từ năm 1998 đến năm 2003, tỷ lệ phát hiện ra virut Rota ở bệnh nhi tiêu chảy cấp tại Viện Nhi Thụy Điển chiếm 55,64%, tại Bệnh viện Xanh Pôn chiếm 49,84%, Viện Nhi Hải Phòng là 59,28%, Bệnh viện Đa khoa Khánh Hoà là 58,32%, Viện Nhi Đồng 1 là 58,82%, Bệnh viện Nhi Đồng 2 là 58,65%. Trung bình tỷ lệ trẻ mắc tiêu chảy cấp do virut Rota trên cả nước là 57,39%, rõ ràng là một tỷ lệ rất cao [8,45,114].
  29. 16 Theo kết quả giám sát bệnh tiêu chảy do virut Rota tại các bệnh viện chính của Việt Nam từ 1998 đến 2011 cho thấy rằng: Chủng virut Rota lưu hành tại nước ta như sau [8]. Đồ thị 1. Chủng lưu hành gây bệnh theo týp G từ 1998 – 2009 Tổng quát trong 11 năm giám sát chủng G1, G2, G3 chiếm đa số với tỷ lệ tương ứng 38,8%: 11,7%: 19,9%. Chủng G4, G9 chiếm tỷ lệ thấp tương ứng 4,7% và 6,1%. Chưa xác định được týp G chiếm 14,9%. Tuy nhiên xét theo từng năm kết quả cho thấy rằng chủng G2 lưu hành chính năm 1998-2000 với tỷ lệ 53,6% sau đó giảm xuống dưới 20% từ năm 2000-2003, tỷ lệ tăng lên gần 30% năm 2002-2003 và giảm xuống dưới 10% từ năm 2004 đến nay. Trong khi đó chủng G1 năm 1998-2000 chỉ chiếm 13,1% nhưng đã tăng lên 76,5% năm 2000-2001, năm 2001-2002 chủng G1 hạ xuống 12% sau đó tăng lên trong những năm sau nhưng ở dưới mức 50%, cao nhất năm 2010-2011 với tỷ lệ 79,6%. Chủng G3 chiếm tỷ lệ rất thấp và hầu như không có trong những năm 1998-2004, nhưng tỷ lệ G3 tăng dần trong những năm sau và tăng cao trong năm 2008-2009 với tỷ lệ lên tới
  30. 17 44,7%. Chủng G9 chiếm tỷ lệ thấp ở hầu hết các năm nghiên cứu, tuy nhiên năm 2001-2002 đột nhiên tăng cao là chủng lưu hành chính với tỷ lệ 58,4%. Đồ thị 2. Chủng lưu hành gây bệnh theo týp P từ 2000 - 2011 Đồ thị 2 cho kết quả phân tích chủng lưu hành theo týp P. Không giống như phân tích chủng lưu hành theo týp G, týp P8 lưu hành chủ yếu với tính ổn định qua suốt thời kỳ từ 1998-2009 với tỷ lệ có năm lên gần 90%. Tỷ lệ trung bình qua 12 năm là 76,1%. Chủng G4 nổi lên vào năm 2002-2003 nhưng cũng chỉ chiếm 33,3% còn những năm khác xuất hiện với tỷ lệ thấp. Chủng P6 chiếm tỷ lệ thấp ở hầu hết các năm giám sát, cao nhất vào năm 2001-2002 với tỷ lệ 16,2% [8,114]. 1.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin Rota trên thế giới 1.3.1. Vắc xin đơn giá Ứng cử viên vắc xin RV đầu tiên là các vắc xin đơn giá "Monovalent vaccines" sử dụng chủng RV WC3 và RIT4237 được phân lập từ bò hoặc chủng RRV được phân lập từ khỉ Rhesus. Tuy nhiên, những vắc xin này không còn được sử dụng do có sự khác nhau lớn về hiệu lực vắc xin giữa các nước có thử nghiệm vắc xin [53,61,62].
  31. 18 Tại Viện Sinh phẩm Lan Châu Trung Quốc, bác sĩ Bai đã sản xuất vắc xin từ chủng virut Rota gây tiêu chảy cho cừu (LLR). LLR là vắc xin sống, uống, đơn týp, virut Rota nhóm A, phân týp I, G10P[12]. Chúng được cấy truyền 37 đời. Hiện nay vắc xin này đang được sử dụng rộng rãi trên toàn nước Trung Quốc để phòng bệnh tiêu chảy cho trẻ em [80,82]. Vắc xin dòng sơ sinh, bác sĩ Ruth Bishop đã phát triển chủng này trong phòng thí nghiệm của bà. Chủng này là chủng virut Rota người (G3P[6]) được phân lập từ một trẻ sơ sinh và làm giảm độc lực qua nhiều lần cấy truyền. Trong nghiên cứu dịch tễ học, trẻ sơ sinh bị nhiễm tự nhiên với chủng này và được phòng chống bệnh trong suốt hai năm đầu của trẻ. Trẻ được dùng vắc xin ở 3, 5, 7 tháng tuổi với liều gây nhiễm 6x105FFU/ liều [35,86]. Vắc xin của hãng Glaxo Smith Kline (Rotarix), bác sĩ Georges Thiry đưa ra những kế hoạch về phát triển vắc xin Rota chủng 89-12, chủng này được phân lập từ một trẻ 15 tháng tuổi bị hội chứng viêm dạ dày ruột tháng 12 năm 1988 và là chủng G1P[8]. 215 trẻ được chọn ngẫu nhiên để nhận 2 liều vắc xin (105FFU/liều) hoặc placebo tại tháng thứ 2 và tháng thứ 4. 100% trẻ này không phải tới bác sĩ, 20 trẻ bị tiêu chảy do virut Rota trong đó 18 trường hợp xuất hiện ở nhóm sử dụng Placebo và 2 trường hợp sử dụng vắc xin [71,75,81]. Vắc xin Rota của Glaxo Smith Kline đã được Viện Avant cấp phép, và kết quả nghiên cứu được công bố, ứng cử viên vắc xin này là chủng virut Rota người, sống, giảm độc lực, đơn týp (G1P[8]). Vắc xin này được sản xuất để sử dụng trên toàn thế giới và được thêm chất làm giảm độ axit. Vắc xin này ổn định tại nhiệt độ phòng thí nghiệm và sẽ sử dụng cho trẻ ở 2 và 4 tháng tuổi với liều 105 đơn vị tạo đám hoại tử [25,98,119]. - Rotarix là vắc xin sống giảm độc lực được sử dụng 2 liều, có nguồn gốc từ 1 chủng virut Rota người G1P[8]. Vắc xin này được thực nghiệm lâm
  32. 19 sàng giai đoạn I, II ở Mỹ, Châu Mỹ Latinh và châu Âu trên 9.400 trẻ cùng với lịch tiêm chủng mở rộng. Kết quả thử nghiệm cho thấy khoảng 73% phòng được viêm dạ dày ruột do bất kỳ týp RV nào và > 90% chống lại nhiễm cấp tính do RV, đặc biệt vắc xin này có hiệu lực phòng bệnh >83% do RV không thuộc týp G1 [112]. Thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III đã thực hiện trên 70.000 trẻ ở Châu Mỹ Latinh và vắc xin này đang hoàn thành thẩm định an toàn và hiệu lực, không có dấu hiệu chỉ ra rằng lồng ruột ở trẻ em liên quan đến việc sử dụng vắc xin này. Địa điểm nghiên cứu lâm sàng cỡ nhỏ hơn đang được tiến hành ở châu Á và châu Mỹ [32,39,54,65,71]. 1.3.2. Vắc xin đa giá Các vắc xin đa giá "Multivalent vaccines" được sản xuất năm 1985 bằng cách sử dụng kỹ thuật sắp xếp gen (gene assortant) [90]. Gen VP7 trong hệ gen của chủng RV động vật được thay thế bởi gen của RV người, gen này mã hoá cho protein VP7 thuộc các týp huyết thanh khác nhau, thông thường là các chủng phổ biến tại địa phương định sử dụng vắc xin. Rota Shield là vắc xin tứ liên "Tetravalent vaccines", là vắc xin sống giảm độc lực uống được sản xuất từ chủng virut Rota ở khỉ Rherus (RRV - TV) có tên là MMU18006. Chủng này có cùng đặc tính trung hoà với các chủng virut Rota G3 của người, MMU18006 phù hợp cho việc phát triển vắc xin bởi vì nó phát triển tốt trong nuôi cấy tế bào. So với các vắc xin dùng các chủng virut Rota bò, MMU 18006 an toàn và tạo miễn dịch tốt. Các thử nghiệm lâm sàng ở trẻ em tại Bắc Mỹ, Nam Mỹ và Châu Âu cho thấy RotaShield là vắc xin an toàn và rất hiệu quả, và vắc xin này đã được cấp phép tháng 10 năm 1998 tại Mỹ, khi 600.000 trẻ được sử dụng vắc xin tương đương với 1,2 triệu liều, vắc xin này bị đình chỉ sử dụng vì có liên quan đến tăng nguy cơ lồng ruột sau 3 tuần sử dụng liều đầu tiên với tỷ lệ ước tính 1/10.000 trẻ [70,107,117].
  33. 20 Vắc xin RotaTeq được tạo ra trong phòng thí nghiệm nghiên cứu của Merck. Vắc xin phối hợp dựa trên chủng của người và bò (WC3) tạo ra khả năng phòng chống bệnh rất tốt (70%) và phòng bệnh tiêu chảy cấp nặng (95-100%). Nói chung vắc xin này tương đối tốt, nó không gây sốt cao và có tỷ lệ đào thải thấp. Vì không có phản ứng phụ, nên khả năng gây lồng ruột ở trẻ em thấp. Vắc xin này là vắc xin 5 týp phối hợp chủng của người (G1,G2,G3,G4 và P[8]) và chủng của bò (WC3) [21,44]. Địa điểm nghiên cứu lâm sàng đã đánh giá an toàn và hiệu lực của vắc xin này khi cho trẻ sử dụng theo 2 lịch uống sau: 2,4,6 tháng tuổi và 2, 3, 4 tháng tuổi. Hiệu lực của liều 8x106FFU chống lại 100% khả năng viêm nhiễm đường ruột cấp tính và khoảng 68,7-76,6% phòng được sự viêm nhiễm đường ruột do bất kỳ chủng virut Rota nào [20,34,55,58]. Rota Teq là vắc xin sống uống giảm độc lực sử dụng 3 liều được bắt đầu nghiên cứu từ 1991. Địa điểm nghiên cứu lâm sàng chỉ ra rằng vắc xin này rất an toàn và hiệu lực, nó phòng được >70% sự xâm nhập của bất kỳ týp Rota virut nào và 100% chống lại viêm nhiễm đường tiêu hoá cấp tính do Rota virut sau liều đầu tiên ở nghiên cứu giai đoạn II [31]. Thử nghiệm lâm sàng chỉ ra rằng, Rota Teq không làm tăng nguy cơ lồng ruột so với placebo sau 42 ngày ở bất kỳ liều sử dụng nào [60,63,72]. 1.3.3. Hướng phát triển vắc xin khác Do tính chất gây nhiễm qua đường ruột, và chủ yếu các tổn thương xảy ra tại đường ruột, các vắc xin hiện tại phát triển đều là vắc xin sống, giảm động lực để cho uống nhằm gây miễn dịch bảo vệ ngay tại đường ruột. Tuy nhiên, đã có những nghiên cứu về vắc xin đưa qua các đường khác ví dụ vắc xin bất hoạt dùng để tiêm, vắc xin đưa theo đường mũi [95,96]. Mục đích của các vắc xin thể loại này là nhằm giảm tối đa nguy cơ gây lồng ruột. Đồng thời vắc xin tiêm có khả năng kết hợp với các vắc xin khác trong chương trình tiêm chủng mở rộng. Bản thân vắc xin phòng bại liệt cũng đã được chuyển hướng sang vắc xin bất hoạt dùng để tiêm. Điều bất cập của vắc xin bất hoạt là trong khi khả năng gây miễn dịch toàn thân cao, khả năng
  34. 21 tạo miễn dịch bảo vệ tại đường ruột còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng vắc xin, độ tinh khiết, tá dược. Trong khi vắc xin bất hoạt tỏ ra có khả năng bảo vệ cao ở chuột và khỉ thí nghiệm, vắc xin bất hoạt không bảo vệ lợn thí nghiệm khỏi tiêu chảy, mặc dù tạo ra hiệu giá kháng thể cao trong máu. Tuy nhiên, trong hoàn cảnh các vắc xin sống uống có khả năng có hiệu lực kém hơn ở các nước đang phát triển ở Châu Phi, Châu Á, so với các nước phát triển ở Châu Âu, Châu Mỹ, đây là một hướng đi mới cần tiếp tục được mở rộng [38,79,96]. Phương pháp sản xuất vắc xin Rota bao gồm vắc xin sống giảm độc lực, vắc xin tái tổ hợp, vắc xin bất hoạt, Mỗi loại vắc xin có ưu điểm và nhược điểm riêng [59,125,127]. Tuy nhiên, vắc xin sống theo đường uống có nhiều ưu điểm hơn cả: Thứ nhất dễ sử dụng, thứ hai tạo đáp ứng miễn dịch tại đường tiêu hoá cao, do vậy, hiệu quả cao trong phòng bệnh ngay khi virut hoang dại xâm nhập vào cơ thể theo đường phân miệng, thứ ba quá trình tạo miễn dịch theo đường uống giống như tạo miễn dịch tự nhiên rất hiệu quả. Hạn chế của vắc xin sống này cũng như các vắc xin sống khác là virut quay lại độc lực mặc dù rất hiếm, để khắc phục nhược điểm này cần tuân thủ nghiêm ngặt qui trình cấy truyền chủng cũng như qui trình sản xuất vắc xin sau này. 1.4. Nghiên cứu sản xuất vắc xin Rota ở Việt Nam POLYVAC là cơ sở đầu tiên, duy nhất tiến hành nghiên cứu và sản xuất VX Rota ở Việt Nam. Đây là VX được sản xuất từ chủng G1P[8] do Polyvac phân lập, tạo chủng gốc và chủng sản xuất vắc xin từ mẫu phân ký hiệu KH0118 của trẻ nữ bị tiêu chảy cấp do virut Rota phải nhập viện Đa khoa Khánh Hòa năm 2003 [11,109]. Dựa vào những đặc tính nổi trội của chủng G1P[8], Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế sử dụng chủng này sản xuất vắc xin Rotavin-M1 để phòng bệnh tiêu chảy do virut Rota tại nước ta.
  35. 22 Tế bào sử dụng cho sản xuất vắc xin Rotavin-M1 là tế bào Vero. Đây là loại tế bào mà virut Rota có thể nhân lên tốt và được WHO cho phép dùng sản xuất vắc xin cho người [22]. Các nguyên liệu, hóa chất và môi trường sử dụng là của các hãng nổi tiếng và có uy tín như Gibco, Merck, Sigma. Tóm tắt hồ sơ chủng G1P[8]:[11,12] Hồ sơ tóm tắt chủng virut Rota G1P[8] (KH0118) Tên hệ thống chủng: Chủng virut Rota gốc týp G1P[8] (KH0118), chủng giống gốc G1P[8]-MS (KH0118), chủng sản xuất G1P[8]-WS (KH0118). Xuất xứ: Chủng G1P[8] (KH0118) có nguồn gốc từ mẫu phân của trẻ nữ 6 tháng tuổi vào khoa Nhi, bệnh viện đa khoa tỉnh Khánh Hòa vì tiêu chảy cấp tháng 12 năm 2003. Mẫu phân được thu thập từ dự án giám sát bệnh tiêu chảy do virut Rota năm 2003-2004 của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) do GS. TSKH. Nguyễn Văn Mẫn làm chủ nhiệm dự án. Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã xét nghiệm mẫu phân bằng phương pháp EIA cho kết quả dương tính với virut Rota, và xác định týp gây bệnh là týp G1P[8] bằng phương pháp RT-PCR. Sau đó mẫu phân được xử lý theo qui trình của phòng thí nghiệm virut đường ruột của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh tật CDC-Atlantta- Hoa Kỳ để sử dụng cho tạo chủng virut Rota gốc týp G1P[8]. Hình 1.4. Hình ảnh hạt virut Rota G1P [8] dưới kính hiển vi điện tử tại lần cấy truyền thứ 30 trên tế bào thận khỉ tiên phát chụp dưới kính hiển vi điện tử - Viện VSDTTƯ
  36. 23 Qui trình tạo chủng virut Rota gốc G1P[8] (KH0118); qui trình sản xuất vắc xin rotavin M1 và các thử nghiệm kiểm tra chất lượng [19,67,109]. Qui trình tạo chủng virut Rota gốc Các thử nghiệm kiểm tra chất lượng G1P[8] Mẫu phân KH0118 Định týp bằng phương pháp RT-PCR Phân lập trên MA104 (3 lần liên tiếp) Tách dòng, chọn lọc dòng trên hỗn dịch tế bào MA104 (1 lần) Xác định sự nhân lên của virut (chỉ số OD) bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán Nhân dòng trên hỗn dịch MA104 Rotaclone (EIA) (3 lần liên tiếp) Thích nghi dòng trên MA104 một lớp (1 lần) Thích nghi dòng trên tế bào thận khỉ tiên phát (3 lần liên tiếp) Xác định sự nhân lên của virut (chỉ số OD) bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán Cấy truyền dòng trên tế bào thận khỉ tiên Rotaclone (EIA) phát (6 lần liên tiếp)
  37. 24 Qui trình tạo chủng virut Rota gốc Các thử nghiệm kiểm tra chất lượng G1P[8] Thích nghi dòng trên tế bào vero một lớp -Xác định sự nhân lên của virut (chỉ (3 lần liên tiếp) số OD) bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán Rotaclone (EIA) Cấy truyền dòng trên tế bào vero 1 lớp -Chuẩn độ hiệu giá virut Rota bằng (13 lần liên tiếp) phương pháp miễn dịch huỳnh quang Cấy truyền dòng trên tế bào thận khỉ -Xác định sự nhân lên của virut (chỉ tiên phát số OD) bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán (3 lần liên tiếp) Rotaclone (EIA) -Chuẩn độ hiệu giá virut Rota bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang Cấy truyền dòng trên tế bào vero một -Xác định sự nhân lên của virut (chỉ lớp số OD) bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán (8 lần liên tiếp) Rotaclone (EIA) -Chuẩn độ hiệu giá virut Rota bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang -Thử nghiệm nhận dạng bằng RT- PCR - Xác định trình tự gen Tinh sạch dòng, chọn lọc dòng trên tế Xác định sự nhân lên của virut (chỉ số bào vero OD) bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán (2 lần liên tiếp) Rotaclone (EIA) Chủng virut Rota gốc G1P[8](KH0118)
  38. 25 Qui trình tạo chủng virut Rota gốc Các thử nghiệm kiểm tra chất lượng G1P[8] Tạo chủng giống gốc Kiểm định chất lượng theo hướng dẫn (Virus Master Seed) của Tổ chức Y tế thế giới TRS 941 G1P[8] MS 2007 Tạo chủng sản xuất (Virus Working Kiểm định chất lượng theo hướng dẫn Seed) của Tổ chức Y tế thế giới TRS 941 G1P[8] WS 2007 Nuôi cấy tế bào Vero Kiểm tra chất lượng tế bào Gây nhiễm virut Kiểm định chất lượng theo hướng dẫn của Tổ chức y tế thế giới Hỗn dịch virut Kiểm định chất lượng theo hướng dẫn của Tổ chức y tế thế giới Lọc vô trùng Kiểm định chất lượng theo hướng dẫn của Tổ chức y tế thế giới Vắc xin bán thành phẩm Kiểm định chất lượng theo hướng dẫn của Tổ chức y tế thế giới Vắc xin thành phẩm Kiểm định chất lượng theo hướng dẫn của Tổ chức y tế thế giới
  39. 26 1.5. Các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng [3] Để phát triển một loại thuốc hay một loại vắc xin, bắt buộc phải trải qua các giai đoạn thử nghiệm kéo dài trong nhiều năm trong đó mỗi giai đoạn là một thử nghiệm lâm sàng hoàn toàn độc lập. Nếu loại thuốc/vắc xin được thử nghiệm thành công qua các giai đoạn 1, 2 và 3 thì sẽ được phê duyệt để sử dụng trong cộng đồng. Giai đoạn 4 là những nghiên cứu tiếp theo sau khi vắc xin đã được phê duyệt. Tuy nhiên, để được phép thử nghiệm lâm sàng một loại thuốc hoặc vắc xin qua 4 giai đoạn trên, các sản phẩm này phải được được trải nghiệm qua các nghiên cứu tiền lâm sàng và giai đoạn 0. Nghiên cứu tiền Nghiên cứu lâm sàng Giám sát hậu lâm sàng trên người mãi qui mô lớn Dược động học Độc tính học ốc mới Giai đoạn 1 thu ơ Chế tạo Giai đoạn 2 ồ s công thức Giai đoạn 3 ảo sát một loại thuốc mới Kh FDA xem xét H Giai đoạn 4 2 – 5 năm 5 năm 2 năm Hình 1.5. Tóm tắt qui trình phát triển một loại thuốc mới
  40. 27 1.5.1. Giai đoạn tiền lâm sàng Các nghiên cứu tiền lâm sàng là những thực nghiệm trong phòng thí nghiệm (in vitro) và trên cơ thể động vật (in vivo) sử dụng các liều khác nhau để thu thập các thông tin ban đầu về hiệu lực, độc tính và các tác động hoá dược đối với cơ thể sống. Khi có một hợp chất được định hướng là ứng cử viên hàng đầu, cần tiến hành các nghiên cứu tiền lâm sàng thu thập đầy đủ các thông tin cần thiết để có thể tiến hành nghiên cứu trên người. Nghiên cứu tiền lâm sàng là phần nghiên cứu bắt buộc trước khi tiến hành các thử nghiệm lâm sàng. Các thành tố của nghiên cứu tiền lâm sàng bao gồm (i) phần nghiên cứu in vitro nuôi cấy tế bào và các mô phân lập để xác định phân tử đích và cơ chế hoạt động, và (ii) phần nghiên cứu in vivo để xác định hiệu lực và độc tính của dược phẩm. Ngoài việc phải đảm bảo tuân thủ Thực hành Phòng thí nghiệm Tốt (GLP) các nghiên cứu tiền lâm sàng cần cân nhắc một số yếu tố như (1) các tác động về sinh học và dược động học, (2) lựa chọn các loài động vật thích hợp, (3) số lượng và giới tính động vật thí nghiệm, (3) chọn liều và đường dùng, (4) tính sinh miễn dịch. Các tác động về sinh học/ dược động học Các tác động về sinh học/ dược động học có thể được lượng giá sử dụng các phân tích trong phòng thí nghiệm. Sử dụng các dòng tế bào hoặc nuôi cấy tế bào nguyên thuỷ để khảo sát hiệu lực trực tiếp lên kiểu hình và sự nhân lên của tế bào. Do đặc tính với từng loài của từng loại dược phẩm có nguồn gốc từ công nghệ sinh học, điều quan trọng là phải lựa chọn 4 loài động vật thích hợp để thử nghiệm độc tính. Những dòng tế bào sử dụng trong thử nghiệm in vitro có nguồn gốc từ tế bào của động vật có vú có thể được sử dụng để tiên lượng cơ chế hoạt động trong thử nghiệm in vivo và đánh giá độ nhạy của các loài khác nhau kể cả cơ thể người đối với sinh phẩm. Những nghiên cứu này còn có thể xác định quá trình chiếm hữu cơ quan cảm thụ, ái tính với cơ quan cảm thụ, tác dụng dược lý và hỗ trợ cho quá trình lựa chọn các loài động vật thích hợp cho các thử nghiệm về dược lý học và độc tính trên động vật (in vivo). Kết quả tổng hợp giữa nghiên cứu trong ống nghiệm và trên động vật sẽ giúp cho việc định hướng các kết quả trên
  41. 28 người. Các nghiên cứu đánh giá dược lý học bao gồm cả cơ chế hoạt động trên động vật sẽ được sử dụng để làm cơ sở đề xuất tiếp tục tiến hành các thử nghiệm lâm sàng. Lựa chọn động vật thực nghiệm Việc lựa chọn thử nghiệm trên loài động vật nào để có kết quả tốt nhất là một vấn đề quan trọng hàng đầu trong các nghiên cứu tiền thử nghiệm. Loài thích hợp là một loài mà vật liệu thử nghiệm có tác động dược lý nhờ biểu hiện của cơ quan cảm thụ hoặc yếu tố quyết định kháng nguyên. Một số các kỹ thuật khác nhau có thể sử dụng để xác định loài thích hợp như test chức năng hoặc test hoá miễn dịch. Các loài động vật để thử nghiệm kháng thể đơn dòng là những loài biểu hiện yếu tố quyết định kháng nguyên mong muốn và cho thông tin về phản ứng chéo trên mô động vật tương tự như trên mô con người. Một loài động vật không biểu hiện yếu tố quyết định kháng nguyên vẫn có thể thích hợp để đánh giá độc tính nếu phản ứng chéo trên mô không định trước với phần tương ứng trên người được chứng minh. Các nghiên cứu đánh giá tính an toàn thường được thực hiện trên hai loài động vật. Tuy nhiên, trong một số trường hợp ví dụ khi chỉ xác định được một loài thích hợp hoặc khi các đặc tính sinh học của sinh phẩm đã được hiểu đầy đủ thì có thể chỉ cần thử nghiệm trên một loài. Mặt khác có thể cần hai loài để xác định độc tính trong các nghiên cứu ngắn hạn, nhưng chỉ có thể sử dụng một loài để xác định độc tính trong những nghiên cứu dài hạn. Những nghiên cứu về độc tính trên những loài không thích hợp có thể đưa đến những kết quả sai lệch vì vậy được khuyến cáo không nên sử dụng. Trong trường hợp không có loài thích hợp, người ta có thể sử dụng những động vật biến đổi gen tương thích có các có quan cảm thụ tương tự con người hoặc các protein tương đồng để thực hiện nghiên cứu. Khi không có khả năng sử dụng mô hình động vật biến đổi gen tương thích hoặc các protein tương đồng có thể đánh giá một số đặc tính của độc tính bằng cách lặp lại liều đã dùng trong vòng 14 ngày. Những năm gần đây đã có rất nhiều tiến bộ trong phát triển nghiên cứu trên các mô hình động vật tương tự như con người.
  42. 29 Những mô hình này có thể giúp các nhà nghiên cứu hiểu thấu đáo hơn không chỉ về xác định dược lý học, dược động học và liều lượng mà còn có thể hỗ trợ trong việc xác định tính an toàn của sản phẩm nghiên cứu. Chọn liều và đường dùng Đường dùng và số lần dùng càng giống như đường dùng và số lần dùng dự kiến như trong thử nghiệm lâm sàng càng tốt. Dược động học và sinh khả dụng của sản phẩm trên loài được sử dụng và lượng sử dụng an toàn như sử dụng trên người nên được cân nhắc. Trong các trường hợp này, mức độ phơi nhiễm của động vật thí nghiệm tương quan đến mức phơi nhiễm trên lâm sàng nên được xác định cùng với các tác động của khối lượng, độ tập trung, công thức dược phẩm và đường dùng. Tuy nhiên, đường dùng trên động vật có thể khác với đường dùng trên lâm sàng nếu đường dùng bắt buộc phải thay đổi do sinh khả dụng bị hạn chế, những giới hạn do đường dùng hoặc do kích thước/ sinh lý học của loài động vật thí nghiệm. Mức liều dùng khác nhau dựa trên thông tin về mối quan hệ giữa sự đáp ứng của cơ thể và liều dùng. Trong một số trường hợp, sản phẩm thử nghiệm không có hoặc có rất ít độc tính nên không thể xác định liều tối đa. Những trường hợp này cần dựa vào đánh giá một cách khoa học các yếu tố cơ bản để chọn liều. Tính sinh miễn dịch Rất nhiều dược phẩm có nguồn gốc công nghệ sinh học giành cho con người lại có đáp ứng miễn dịch trên động vật. Do vậy, cần đo lường kháng thể sản xuất từ cơ thể sau khi dùng sản phẩm nghiên cứu để có thể phiên giải kết quả nghiên cứu. Các đặc tính của kháng thể như hiệu giá kháng thể trên số động vật có đáp ứng, kháng thể có trung hoà hay không trung hoà cũng nên được cụ thể hoá. Ngoài ra các tác động của quá trình tạo kháng thể với các thông số dược động học, tỷ lệ hiện mắc, mức độ nặng, các tác dụng bất lợi cũng nên được xem xét khi phiên giải số liệu. Trong hầu hết các trường hợp, đáp ứng miễn dịch của động vật với các sinh phẩm rất khác nhau cũng giống như quá trình đáp ứng miễn dịch trên người. Nếu quá trình phiên giải số liệu
  43. 30 không lưu ý vấn đề này thì sẽ không nhận ra ý nghĩa của quá trình đáp ứng miễn dịch. Quá trình sinh kháng thể ở động vật không thể dự báo khả năng hình thành kháng thể ở người vì con người có thể tạo ra các kháng thể dịch thể chống lại các protein giống con người và các kháng thể này tồn tại rất lâu trong cơ thể. Sự xuất hiện đáp ứng quá mẫn mạnh mẽ đối với các protein tái tổ hợp rất hiếm gặp trên người. Do vậy những kết quả nghiên cứu dương tính với các loại dược phẩm có protein trên chuột lang thường không tiên lượng được các phản ứng trên cơ thể người và ít có giá trị khi ứng dụng trên người. Như vậy dựa vào các thông tin như trên, các công ty dược sẽ quyết định xem dược phẩm mới có đáp ứng yêu cầu khoa học để tiếp tục nghiên cứu phát triển. 1.5.2. Giai đoạn I Giai đoạn 1 là giai đoạn lần đầu tiên thử nghiệm hoạt chất mới hay công thức mới của thuốc trên người. Thông thường giai đoạn này người ta thường chọn thử nghiệm trên một nhóm nhỏ những người tình nguyện, khoẻ mạnh khoảng 20 – 50 người. Mục đích nghiên cứu giai đoạn 1 nhằm thiết lập đánh giá sơ bộ về tính an toàn, dược động học và dược lực học của hoạt chất trên đối tượng là con người. Giai đoạn này thường được thử nghiệm tại các cơ sở nội trú để bệnh nhân có thể được cán bộ y tế theo dõi liên tục. Các đối tượng nghiên cứu thường được giám sát cho đến khi qua thời gian bán thải của thuốc. Giai đoạn I thường bao gồm cả việc dò liều để xác định liều thích hợp nhất cho con người. Mặc dù giai đoạn I thường được tiến hành trên những người khoẻ mạnh, nhưng vẫn có một số trường hợp vẫn tiến hành trên bệnh nhân mắc bệnh giai đoạn cuối và không có các biện pháp điều trị nào. Những trường hợp ngoại lệ này thường áp dụng ở những bệnh nhân bị ung thư hoặc HIV. Có một số loại thử nghiệm giai đoạn I khác nhau.
  44. 31 1.5.3. Giai đoạn II Khi tính an toàn đã được xác định ở giai đoạn I giai đoạn II sẽ được tiến hành trên những nhóm đối tượng lớn hơn, tuy nhiên, vẫn trên số lượng bệnh nhân hạn chế khoảng 20 – 300. Mục đích nghiên cứu giai đoạn 2 nhằm đánh giá hoạt động trị liệu, tính an toàn của hoạt chất trên các bệnh nhân, xác định liều sử dụng và chế độ liều thích hợp để đưa ra trị liệu tối ưu cho thử nghiệm lâm sàng. Đôi khi giai đoạn II được chia làm hai giai đoạn IIA và IIB. - Giai đoạn IIA được thiết kế để đánh giá liều lượng cần thiết. - Giai đoạn IIB để đánh giá hiệu lực của dược/sinh phẩm. 1.5.4. Giai đoạn III Giai đoạn III là nghiên cứu thử nghiệm đa trung tâm, ngẫu nhiên, có đối chứng được nghiên cứu trên số lượng bệnh nhân lớn hơn từ 300 – 3.000 hoặc nhiều hơn nữa tuỳ thuộc loại bệnh và sản phẩm nghiên cứu. Mục đích nghiên cứu giai đoạn III nhằm xác định tính ổn định của công thức, tính an toàn/ hiệu quả ngắn hạn và dài hạn của hoạt chất, đánh giá giá trị trị liệu ở mức tổng thể. Nghiên cứu các phản ứng bất lợi thường xuyên xảy ra, phát hiện các đặc điểm đặc biệt của sản phẩm nghiên cứu. Các điều kiện thử nghiệm lâm sàng trong giai đoạn này được tiến hành gần với điều kiện sử dụng thông thường [3,19]. Mặc dù không bắt buộc đối với tất cả các trường hợp nhưng thông thường mỗi loại thuốc, dược phẩm mới cần được thử nghiệm thành công ít nhất hai lần để chứng minh hiệu lực và tính an toàn của thuốc và sau đó được phê duyệt từ các cơ quan có thẩm quyền như Cục quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) của Mỹ, Cục quản lý hàng hoá trị liệu (TGA) của Úc và Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu (Cộng đồng Châu Âu). Khi thuốc đã thử nghiệm thành công giai đoạn III, kết quả thử nghiệm sẽ được tập hợp thành báo cáo mô tả toàn diện phương pháp, kết quả trên động vật và người, công thức, qui trình
  45. 32 sản xuất và thời hạn sử dụng. Tài liệu này sẽ trở thành bộ tài liệu chính thức cung cấp cho các nước khác xem xét để có thể phê duyệt cho sử dụng trong nước. Hầu hết các thuốc đã trải qua thử nghiệm giai đoạn III có thể đưa vào sử dụng trên thị trường theo tiêu chuẩn của FDA. Tuy nhiên, khi có các tác dụng bất lợi trầm trọng được báo cáo sau khi thuốc/ dược phẩm đã đưa ra thị trường, thuốc hoặc dược phẩm có thể bị rút khỏi thị trường. 1.5.5. Giai đoạn IV Giai đoạn IV là các nghiên cứu lâm sàng được tiến hành sau khi thuốc đã được lưu hành. Thử nghiệm lâm sàng giai đoạn này được tiến hành trên cơ sở của các đặc tính của sản phẩm đã được phép lưu hành, thông thường dưới hình thức giám sát hậu mãi hay đánh giá giá trị trị liệu hoặc đánh giá các chiến lược điều trị. Thử nghiệm giai đoạn này còn nhằm mục đích giám sát tính an toàn sau khi thuốc được bán trên thị trường. Giám sát tính an toàn được thiết kế để phát hiện những tác dụng bất lợi hiếm gặp hoặc xuất hiện khi sử dụng thuốc lâu dài trên cộng đồng dân cư đông hơn. Phương pháp nghiên cứu trong giai đoạn này có thể khác nhau nhưng sử dụng các tiêu chuẩn khoa học và đạo đức giống với tiêu chuẩn trước khi thuốc lưu hành. 1.6. Các vấn đề cần lưu ý trong thử nghiệm vắc xin trên người [3,24] Các giai đoạn thử nghiệm vắc xin nhìn chung cũng tuân thủ các giai đoạn quy định thử nghiệm lâm sàng một loại thuốc hoặc dược phẩm mới. Để có một vắc xin được phép sử dụng trên thị trường cũng phải trải qua các giai đoạn thử nghiệm trên động vật và trên người (Hình 1.6). Giai đoạn I và II nhằm đánh giá tính an toàn, và tính sinh miễn dịch trên một nhóm nhỏ đối tượng. Nếu vắc xin đã được chứng minh tính an toàn và sinh miễn dịch giai đoạn I và giai đoạn II, vắc xin sẽ được tiếp tục thử nghiệm trong giai đoạn III để chứng minh hiệu lực. Giai đoạn III phải được thiết kế với những giả thuyết rõ ràng và thực hiện trên
  46. 33 cộng đồng dân cư sẽ sử dụng vắc xin này trong tương lai. Sau khi được cấp giấy phép, giai đoạn IV được tiến hành để giám sát khả năng bảo vệ của vắc xin. Có thể đánh giá khả năng bảo vệ của vắc xin thông qua đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch với vắc xin của cộng đồng sau khi đưa vắc xin sử dụng vào lịch tiêm chủng. Tuy nhiên, một cách chính xác hơn là đánh giá trực tiếp và so sánh giữa đối tượng sử dụng vắc xin và đối tượng không dùng vắc xin để trả lời câu hỏi có phải vắc xin thực sự có hiệu lực bảo vệ và an toàn khi sử dụng trên cộng đồng hay không? Thiết kế sử dụng cho giai đoạn này thường là nghiên cứu mô tả có thể là nghiên cứu thuần tập hoặc ca bệnh chứng. Mặc dù vậy khi tiến hành các giai đoạn thử nghiệm trên thực tế cũng có một số các vấn đề cần quan tâm. Vắc xin có Mục đích Hiệu lực có an toàn trên ổn định? cộng đồng? Liều thích hợp nhất? Có an toàn? Có an toàn Có an toàn không? Có đáp ứng miễn không? Mức đáp ứng MD? dịch không? Có đáp ứng Có bảo vệ khi nhiễm MD không? VR/VK GĐ tiền LS Giai đoạn I Giai đoạn II Giai đoạn III Giai đoạn IV Động vật 30-50 người 200-300 người Đối tượng 300-3000 người Cộng đồng Hình 1.6. Tóm tắt các giai đoạn thử nghiệm vắc xin
  47. 34 1.6.1. Đề cương nghiên cứu Để có một cuộc thử nghiệm vắc xin thành công, việc xây dựng đề cương chất lượng và khoa học là yếu tố quyết định. Đề cương giai đoạn I có thể không cần chi tiết bằng đề cương các giai đoạn II, III, và IV nhưng cũng được qui định rõ những thành tố bắt buộc của đề cương. Theo qui định của Bộ luật các Qui định Liên bang - Mỹ, đề cương bắt buộc phải bao gồm các thành tố sau: (1) chi tiết mục tiêu, mục đích của nghiên cứu; (2) tên và địa chỉ của nghiên cứu viên, của các cơ sở nghiên cứu, và của các Hội đồng đạo đức sẽ tham gia đánh giá nghiên cứu; (3) số đối tượng tham gia nghiên cứu và các tiêu chuẩn chọn vào loại ra; (4) thiết kế nghiên cứu và đặc điểm nhóm đối chứng; (6) mô tả kết quả đầu ra được đánh giá như thế nào; (7) mô tả các phương pháp giám sát đối tượng nghiên cứu và phương pháp giảm thiểu các tác dụng bất lợi cho đối tượng. Bên cạnh đó đề cương cũng bao gồm các nội dung về tổng quan và sự cần thiết phải có nghiên cứu, thông tin về bệnh nghiên cứu như đặc điểm lâm sàng, dịch tễ học, những thông tin đã biết về miễn dịch bảo vệ cũng như đánh giá giữa sự cần thiết phải nghiên cứu và những rủi ro của những người tham gia. Các đề cương nghiên cứu cũng cần mô tả rõ loại nghiên cứu như có đối chứng hay không, mù đơn hay mù kép, phương pháp ngẫu nhiên, cỡ mẫu, phân tích kết quả ra sao. Trong các thiết kế nghiên cứu liên quan đến đối tượng nghiên cứu là trẻ em cần được cân nhắc kỹ lưỡng hơn. Vấn đề đầu tiên cần cân nhắc là tuổi tiêm/uống vắc xin. Điều này hoàn toàn phụ thuộc vào lứa tuổi nào có nguy cơ cao mắc bệnh mà vắc xin có thể bảo vệ. Đối với hầu hết các tác nhân gây bệnh, lý tưởng nhất là cung cấp vắc xin có khả năng bảo vệ khi trẻ càng nhỏ càng tốt. Tuy nhiên, ở giai đoạn đầu đời trẻ được thừa hưởng miễn dịch từ mẹ và có thể làm bất hoạt một số vắc xin từ virut sống như vắc xin sởi. Do vậy vắc xin sởi không thể tiêm ngay trong những tháng đầu. Mặt khác, giai đoạn đầu đời là thời gian trẻ được tiêm nhiều loại vắc xin, nên cần cân nhắc việc thử nghiệm vắc xin mới cùng thời gian với những vắc xin đang sử dụng. Thông thường những thử nghiêm giai đoạn I thường cho trẻ tiêm/uống vắc
  48. 35 xin nghiên cứu cách các vắc xin khác trong vòng 2 tuần để giảm các yếu tố nhiễu về độ an toàn hoặc các đáp ứng miễn dịch với các vắc xin dùng đồng thời. Về tính kinh tế và thực tế, vắc xin mới nên được thiết kế lịch tiêm trùng với các vắc xin thường quy để giảm chi phí và thời gian. Do vậy những đánh giá về tính an toàn và hiệu lực với ảnh hưởng của các loại vắc xin dùng dồng thời sẽ được đánh giá ở giai đoạn II cùng với những cân nhắc về số liều vắc xin trên một trẻ. Thiết kế một đề cương nghiên cứu trên trẻ em cần phải cân nhắc kỹ lưỡng để giảm thiểu những phiền hà cho đối tượng nghiên cứu nhưng vẫn phải đảm bảo thu thập các số liệu cần thiết. Vấn đề cần quan tâm nữa là đối với các vắc xin sử dụng công nghệ tái tổ hợp ADN hoặc chứa ADN tái tổ hợp vì mặc dù công nghệ ADN phân tử rất chính xác nhưng một số người cho rằng ADN tái tổ hợp sẽ là mối đe doạ môi trường tự nhiên. Do vậy những vắc xin sử dụng công nghệ này trong phần đề cương, cần giải thích những hậu quả đối với môi trường sau khi sử dụng vắc xin này cho người, khả năng sống của các chủng trong vắc xin trong các điều kiện môi trường khác nhau như nước, đất, thực phẩm đặc biệt là có những so sánh với các chủng hoang dại. Hiện nay có nhiều loại vắc xin sử dụng chủng vi khuẩn hoặc virut sống có thể thải ra môi trường qua đường hô hấp (như vắc xin Rubella) hoặc qua phân (vắc xin tả hoặc vắc xin bại liệt) có khả năng lây nhiễm từ người sang người. Lây truyền virut vắc xin bại liệt đường uống được lưu tâm ngay từ thời gian đầu tiên sử dụng vắc xin vì vắc xin này tạo ra miễn dịch cộng đồng. Ngoài ra lây truyền virut vắc xin hoặc các virut tái tổ hợp trong một số trường hợp có thể gây bệnh do virut vắc xin. Do vậy, đề cương các giai đoạn I và II phải chú trọng việc mô tả biện pháp đo lường khả năng truyền từ người sang người của các loại vắc xin sống. 1.6.2. Lựa chọn đối tượng tình nguyện tham gia nghiên cứu Các giai đoạn nghiên cứu cần tuyển chọn người những người khoẻ mạnh đặc biệt là giai đoạn I để tránh những yếu tố nhiễu đến đánh giá tính an toàn của vắc xin. Để có thể lựa chọn đối tượng phù hợp với loại vắc xin
  49. 36 nghiên cứu, cần xác định rõ tiêu chuẩn chọn vào loại ra. Do vậy đề cương phải nói rõ sẽ làm những loại xét nghiệm nào hoặc khám sàng lọc như thế nào để tuyển chọn đối tượng. Không chỉ thăm khám lâm sàng và xét nghiệm, các đối tượng nghiên cứu cần được kiểm tra tiền sử để đảm bảo chắc chắn không mắc và không có tiền sử suy giảm miễn dịch. Những đối tượng có nguy cơ lây nhiễm cao cũng nên loại khỏi nghiên cứu. Ngoài việc thăm khám sàng lọc, các đối tượng cần phải đồng ý tham gia và ký vào phiếu chấp thuận. Chấp thuận không có nghĩa là chỉ đơn giản là đối tượng được thông báo và giải thích để ký vào phiếu chấp thuận mà là một quá trình truyền thông liên tục giữa các đối tượng tham gia nghiên cứu và nghiên cứu viên về tất cả các thông tin liên quan đến nghiên cứu trong suốt quá trình để các đối tượng có thể tự quyết định tiếp tục tham gia hay từ chối. Trong Bộ luật các Qui định của liên bang - Mỹ đã có các yêu cầu về các thông tin bắt buộc trong phiếu chấp thuận và qui trình lấy chấp thuận. Các yêu cầu bắt buộc trong phiếu chấp thuận bao gồm: (1) mục tiêu, qui trình và nội dung của đề cương; (2) lợi ích và nguy cơ khi tham gia nghiên cứu; (3) thông tin về các vắc xin hiện có (4) thông tin chi tiết để liên lạc với nghiên cứu viên; (5) khẳng định sự tham gia của đối tượng là tình nguyện và có thể ngừng tham gia nghiên cứu bất cứ lúc nào; (6) thông báo quyền lợi của những người tham gia, nếu có; (7) khẳng định giữ bí mật các thông tin; (8) khả năng bồi thường và điều trị y tế nếu bị bệnh. Điều quan trọng là các thông tin trong phiếu chấp thuận phải đơn giản, dễ hiểu và sử dụng ngôn ngữ của các đối tượng tham gia. Đối với đối tượng nghiên cứu là trẻ em, các phiếu chấp thuận tham gia thường phải có sự đồng ý của cha mẹ hoặc người bảo hộ trừ khi trẻ có khả năng hiểu hoàn toàn nội dung và tự quyết định được có tham gia nghiên cứu hay không. Các nghiên cứu viên, nhà tài trợ và các Hội đồng y đức phải có trách nhiệm hơn trong những nghiên cứu liên quan đến trẻ em và phải đảm
  50. 37 bảo giảm thiểu các yếu tố nguy cơ, cha mẹ hoàn toàn hiểu rõ về nghiên cứu và hoàn toàn tự nguyện tham gia nghiên cứu. 1.6.3. Phân nhóm Phân nhóm ngẫu nhiên là phương pháp quan trọng để giảm sai lệch trong thử nghiệm vắc xin. Trước khi phân nhóm phải có kế hoạch về tỷ lệ phân hai nhóm bằng nhau hay khác nhau và kế hoạch phân ngẫu nhiên. Các nghiên cứu thử nghiệm thường giữ tỷ lệ đồng đều khi chỉ có hai nhóm vắc xin và giả dược. Trong các nghiên cứu thử nghiệm một nhóm không tiêm vắc xin so sánh với nhiều nhóm tiêm vắc xin, có nhiều ý kiến khác nhau về tỷ lệ đối tượng giữa các nhóm bằng nhau hay không bằng nhau. Trên khía cạnh đạo đức người ta cho rằng số lượng ở nhóm không tiêm vắc xin nên ít hơn các nhóm tiêm vắc xin. Mặt khác nếu cỡ mẫu các nhóm không đều nhau, qui trình phân ngẫu nhiên sẽ dễ dàng hơn. Gán mã phân tầng là khi các đối tượng được phân đồng đều vào các nhóm nhỏ hơn tuỳ theo các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh sẽ phòng được bằng vắc xin. Ví dụ có thể phân tầng nhóm đối tượng trẻ và già. Đây là phương pháp được cho là làm tăng đặc tính tương đồng giữa các nhóm so sánh. Phương pháp này còn giúp làm giảm sai lệch trong những thử nghiệm với cỡ mẫu nhỏ, đặc biệt khi các đối tượng nghiên cứu rất khác nhau về nguy cơ mắc bệnh. Do vậy phương pháp này không chỉ được ứng dụng trong những thử nghiệm phương pháp điều trị bệnh nhân mà còn trong những thử nghiệm vắc xin có cỡ mẫu nhỏ vì mặc dù cỡ mẫu nhỏ nhưng cũng có nhiều ưu điểm so với thử nghiệm ngẫu nhiên trên qui mô lớn. Gán mã khối cũng thường được ứng dụng trong các thử nghiệm qui mô nhỏ. Với phương pháp này mã số của vắc xin và giả dược sẽ được phân thành từng khối có thể khối bốn mã số hoặc khối sáu mã số. Các đối tượng được phân liên tiếp theo các khối như vậy sẽ đảm bảo trong từng khối số đối tượng
  51. 38 tiêm vắc xin và giả dược là như nhau. Ví dụ với khối bốn mã số sẽ có liên tục hai đối tượng thuộc nhóm vắc xin, hai đối tượng thuộc nhóm giả dược. 1.6.4. Giai đoạn giám sát Các thử nghiệm vắc xin phải theo dõi giám sát bốn loại tình trạng bệnh cơ bản. Thứ nhất, hệ thống giám sát phải giám sát sự xuất hiện của bệnh mà vắc xin dự kiến phòng. Hệ thống giám sát này phải đảm bảo thu thập đầy đủ các thông tin một cách hệ thống khi bệnh xuất hiện và đối tượng ở cả hai nhóm vắc xin và giả dược phải được chẩn đoán và điều trị như nhau khi có bệnh. Do vậy giám sát mù kép là phương pháp tin cậy và hiệu lực nhất đảm bảo không sai lệch. Thứ hai, phải giám sát để phát hiện các tác dụng bất lợi sau tiêm/uống vắc xin. Tất cả các vắc xin trước khi thử nghiệm trên người đã được nghiên cứu về các tác dụng phụ có thể xảy ra sau khi uống/tiêm vắc xin. Do vậy các đối tượng nghiên cứu phải được giám sát để phát hiện các tác dụng bất lợi dự kiến có thể xảy ra và những tác dụng bất lợi khác. Thứ ba, đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin phải được giám sát. Nếu vắc xin chứng minh hiệu lực phòng bệnh đánh giá đáp ứng miễn dịch có thể cho phép đánh giá mối quan hệ giữa mức độ đáp ứng và mức độ bảo vệ. Thứ tư, cần phải giám sát những diễn biến của bệnh mà vì nó đối tượng nghiên cứu phải ngừng tham gia nghiên cứu như tử vong hoặc từ chối tiếp tục tham gia do mắc bệnh. Tử vong không chỉ là một nguyên nhân làm đối tượng không thể tiếp tục tham gia mà có thể là biến chứng nặng của bệnh. Hơn thế tất cả các sự kiện này làm cho mất cân bằng về thời gian giám sát giữa những đối tượng tiếp tục tham gia và các đối tượng không tiếp tục tham gia, do vậy khi phân tích phải tính cả giai đoạn có nguy cơ mắc bệnh. Nếu xu hướng không tiếp tục tham gia nghiên cứu xảy ra nhiều ở một trong hai nhóm sẽ tạo ra sự khác biệt khi so sánh tỷ lệ mắc bệnh ở cả hai nhóm.
  52. 39 Mức độ nặng nhẹ của các bệnh phát hiện được phụ thuộc vào cách thiết kế hệ thống giám sát. Giám sát thụ động thông qua việc bệnh nhân đến khám tại các cơ sở y tế là một phương pháp đơn giản, tiêt kiệm kinh phí. Tuy nhiên, với phương pháp này, chỉ có những bệnh nhân có dấu hiệu bệnh nặng hoặc những bệnh nhân có điều kiện thuận lợi để tiếp cận cơ sở y tế như những bệnh nhân có bảo hiểm y tế mới được phát hiện và ghi nhận trong hệ thống giám sát. Giám sát chủ động bằng cách sắp xếp lịch thăm từng đối tượng nghiên cứu dù có bệnh hay không sẽ phát hiện được bệnh ở các mức độ khác nhau thậm chí cả những trường hợp có bệnh nhưng không có triệu chứng. Như vậy giám sát chủ động có ưu điểm hơn vì có thể phát hiện được nhiều trường hợp bệnh hơn kể cả những trường hợp bệnh nhẹ. Trong một số địa điểm nghiên cứu nghiên cứu vắc xin tại Matlab, Bangladesh, khi so sánh hệ thống giám sát thụ động và chủ động cho thấy rằng chỉ có 6% trường hợp tiêu chảy được phát hiện thông qua hệ thống giám sát chủ động tại các cơ sở y tế. Tuy nhiên, giám sát thụ động tốn kém về con người, thời gian và tiền bạc hơn giám sát chủ động. Mặc dù vậy phụ thuộc vào mục đích của thử nghiệm mà nhiều thử nghiệm chỉ thiết kế hệ giám sát thụ động. Ở những nghiên cứu này mục đích là đánh giá hiệu lực bảo vệ của vắc xin đối với bệnh nặng, do vậy những trường hợp bệnh được phát hiện tại nhà lại không được coi là trường hợp bệnh nặng do không phải đến điều trị tại cơ sở y tế. Ví dụ thử nghiệm đánh giá hiệu lực đối với bệnh nặng của vắc xin tả hoặc vắc xin toàn tế bào ho gà dựa vào hệ thống giám sát thụ động lại có ý nghĩa nhiều hơn giám sát chủ động. Thời gian giám sát phải được thiết kế thích hợp đảm bảo trả lời câu hỏi nghiên cứu. Các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên địa điểm nghiên cứu sẽ giúp các nhà nghiên cứu có cơ hội để đánh giá thời gian bảo vệ của vắc xin thông qua giám sát dài hạn. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu không thể kéo dài
  53. 40 thời gian giám sát đơn thuần chỉ để tăng tỷ lệ mắc tích luỹ của bệnh phòng được bằng vắc xin nghiên cứu và nhờ vậy có thể giảm được cỡ mẫu. Để thu thập thông tin về các tác dụng phụ, tác dụng bất lợi nhiều thử nghiệm giới hạn thời gian giám sát trong giai đoạn ngắn, ngay sau khi tiêm/uống vắc xin mặc dù những giám sát dài hạn có thể cho những kết quả của những tác dụng phụ xuất hiện muộn. Tương tự với giám sát về đáp ứng miễn dịch, các thử nghiệm lâm sàng thường đưa ra những kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch ngắn hạn ngay sau khi tiêm vắc xin để xem vắc xin có tạo mức đáp ứng miễn dịch bảo vệ mong muốn không, nhưng những đánh giá đáp ứng miễn dịch dài hạn có thể cho những kết quả về mức độ miễn dịch giảm dần theo thời gian. Thời gian thử nghiệm có thể giảm nếu có những tác dụng bất lợi trầm trọng xuất hiện trong khi uống/tiêm vắc xin, có chống chỉ định tăng liều hoặc có lợi rõ rệt về sức khoẻ ở nhóm sử dụng vắc xin thì vấn đề về đạo đức cần được xem xét. Thông thường các nghiên cứu viên thường mong muốn kéo dài thời gian nghiên cứu để có những kết quả bảo vệ dài hạn của vắc xin nhưng những quyết định dừng hay kéo dài nghiên cứu được giao cho hội đồng khoa học những người hoàn toàn không tham gia nghiên cứu mà đứng về quyền lợi của đối tượng tham gia nghiên cứu chịu trách nhiệm giám sát nghiên cứu. 1.6.5. Các nghiên cứu sau khi vắc xin được cấp giấy phép Sau khi vắc xin được cấp giấy phép lưu hành trên thị trường, cần tiếp tục giám sát các tác dụng bất lợi và mức độ bảo vệ của cộng đồng trên cộng đồng vì trên thực tế khi đưa các vắc xin vào sử dụng sẽ có nhiều loại đối tượng hơn trong các giai đoạn thử nghiệm nên hiệu lực bảo vệ của vắc xin có thể thay đổi.
  54. 41 Mặt khác, khi sản xuất vắc xin hàng loạt có thể có những lô vắc xin không đạt yêu cầu, không những không có tác dụng bảo vệ mà còn gây hại cho sức khoẻ cho cộng đồng. Sự kiện này đã xảy ra đối với lô vắc xin bại liệt Salk do có sự cố trong quá trình sản xuất, vắc xin đã gây liệt cho những người tiêm vắc xin này trong những năm năm mươi. Một số các vắc xin không có lỗi trong quá trình sản xuất những công thức hoặc liều dùng không phù hợp khi sử dụng trên qui mô lớn. Vắc xin bại liệt uống Sabin là một ví dụ. Lịch uống của vắc xin này trên trẻ em Mỹ lại không có hiệu lực bảo vệ khi áp dụng cho trẻ ở các nước kém phát triển hơn. Ngoài ra, hiệu giá kháng thể của ba typ huyết thanh có trong vắc xin cần phải thay đổi do nghiên cứu sau khi vắc xin được cấp giấy phép phát hiện ra vắc xin này không đem lại mức hiệu giá kháng thể đủ để bảo vệ cho những trẻ tại các nước đang phát triển. Do vậy vắc xin này đã được khuyến nghị phải tăng liều vắc xin đối với những trẻ sống ở khu vực đang phát triển. Một trong các lý do cần phải giám sát sau khi vắc xin được cấp giấy phép vì một số tác dụng bất lợi tiềm tàng không phát hiện được trong thử nghiệm giai đoạn III nhưng được phát hiện khi sử dụng rộng rãi trong cộng đồng và trong thời dài. Vắc xin bất hoạt phòng cúm lợn trước khi được phê duyệt đã được thử nghiệm và chứng minh tính an toàn, nhưng khi sử dụng qui mô lớn hơn đã cho thấy có mối liên hệ hiếm gặp giữa hội chứng Guillain- Barré và tiêm vắc xin. Ngoài ra, một số các vấn đề có thể gặp phải khi đưa vắc xin sử dụng trên thị trường như việc bảo quản và cách tiêm/uống vắc xin không đúng có thể làm giảm hiệu lực bảo vệ của vắc xin. Tiêm/uống đồng thời với một số các vắc xin khác hoặc thuốc khác có thể làm giảm hiệu lực của vắc xin. Sử dụng vắc xin trên qui mô lớn có thể làm hiệu lực bảo vệ của vắc xin cao hơn giai đoạn III.
  55. 42 - Nghiên cứu đánh giá trước sau là thiết kế nghiên cứu đơn giản nhất giám sát tỷ lệ mắc bệnh hoặc các tác dụng phụ trên toàn thể cộng đồng trước và sau khi vắc xin được đưa vào thị trường. Đây là đánh giá gián tiếp ảnh hưởng của vắc xin vì thiết kế này không trực tiếp so sánh nhóm tiêm/uống vắc xin và nhóm không sử dụng vắc xin. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là không so sánh với nhóm không sử dụng vắc xin nên không chắc chắn những thay đổi về tỷ lệ mắc là do vắc xin hay do thay đổi về dịch tễ học của bệnh hay do phương pháp giám sát không chặt chẽ hay do các can thiệp khác được triển khai đồng thời với vắc xin hoặc thậm chí do định nghĩa hoặc tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh thay đổi. - Nghiên cứu thuần tập có đối chứng có thể sử dụng để đánh giá trực tiếp hiệu quả sử dụng vắc xin. Các nhóm so sánh có thể được đánh giá tỷ lệ mắc bệnh và các tác dụng bất lợi thông qua giám sát dọc sau khi sử dụng vắc xin. Ưu điểm của phương pháp này là có thể cho phép phân tích đánh giá nhiều bệnh mà chỉ cần tiến hành một nghiên cứu. Hạn chế của phương pháp này là để có lực mẫu thích hợp đánh giá hiệu lực của vắc xin, cần phải có đủ số lượng ca bệnh. Do vậy, phương pháp này thích hợp với những bệnh có thể xảy ra thường xuyên hoặc xảy ra ngay sau tiêm vắc xin. Đối với các nghiên cứu sau khi các vắc xin được phê duyệt tập trung vào các tác dụng phụ hiếm gặp hoặc tiềm tàng, thiết kế thuần tập thường không được áp dụng. - Nghiên cứu ca bệnh - chứng: Khi bệnh nghiên cứu hiếm gặp hoặc xảy ra sau khi uống vắc xin trong thời gian dài, nghiên cứu ca bệnh-chứng là phù hợp và khả thi nhất. Với thiết kế này, các nhóm hình thành không dựa trên cơ sở có tiêm/uống vắc xin hay không mà dựa trên sự xuất hiện bệnh (ca bệnh) và không xuất hiện bệnh (chứng). Ca bệnh và ca chứng không mẫu thuẫn với việc có sử dụng vắc xin hay không thông qua khai thác tiền sử.
  56. 43 Thiết kế nghiên cứu ca bệnh - chứng có một số ưu điểm do số ca bệnh liên kết trực tiếp với thiết kế nghiên cứu nên thiết kế này rất phù hợp với những tác dụng phụ hiếm gặp hoặc tiềm tàng trong thời gian dài sau sử dụng vắc xin. Mặt khác các nghiên cứu viên có thể chủ động quyết định chọn số lượng ca chứng trên một ca bệnh để có tỷ lệ lý tưởng nhất và có thể chủ động thiết kế lực mẫu tối đa để có thể phát hiện những mối liên hệ với việc sử dụng vắc xin hoặc có thể giảm cỡ mẫu hoặc thậm chí chủ động giảm các chi phí không cần thiết trong quá trình điều tra. Nhược điểm của thiết kế này là không cung cấp thông tin về tỷ lệ mắc bệnh giữa nhóm vắc xin và giả dược do vậy không tính toán trực tiếp hiệu lực bảo vệ của vắc xin và thiết kế này chỉ cho kết quả phân tích về một bệnh hoặc một tác dụng bất lợi do vắc xin. Một số các nghiên cứu đã ứng dụng thiết kế ca bệnh - chứng đã cho những kết quả đánh giá rất hiệu quả về hiệu lực bảo vệ của vắc xin Hib và phế cầu sau khi được cấp giấy phép. - Các thiết kế nghiên cứu khác: Hiệu quả của vắc xin có thể đánh giá thông qua các cuộc điều tra để đánh giá tỷ lệ bao phủ của vắc xin trên đối tượng đích. Tại cuộc điều tra, các đối tượng được hỏi về ngày tiêm/uống vắc xin và ngày xuất hiện bệnh. Đặc điểm của thiết kế này là tập trung vào các nhóm đối tượng đã tiêm/uống vắc xin và nhóm không tiêm/uống vắc xin tại thời điểm điều tra và hiệu lực bảo vệ của vắc xin sẽ được tính toán trên những đối tượng được điều tra mà không tính đến những đối tượng đã tử vong hoặc chuyển chỗ ở trước thời điểm điều tra.
  57. 44 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Giai đoạn 1: 30 người lớn, khỏe mạnh, tình nguyện là học sinh của Trung tâm giáo dục thường xuyên huyện Thanh Sơn và cán bộ Trung tâm y tế huyện Thanh Sơn, Phú Thọ, gồm 12 nam và 18 nữ, tuổi từ 19 – 30. Thời gian thực hiện từ 16/08/2009 – 11/10/2009. - Giai đoạn 2: 200 trẻ em khỏe mạnh, gồm 119 bé trai và 81 bé gái, tuổi từ 6-12 tuần, sinh sống ở 15 xã, thị trấn được chọn của huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ. Được chia thành 5 nhóm, 4 nhóm dùng văc xin rotavin M1 với các liều và lịch khác nhau, một nhóm dùng văc xin rotarix làm đối chứng. Thời gian thực hiện từ tháng 10/2009 đến tháng 3/2010. - Giai đoạn 3: 799 trẻ khỏe mạnh từ 6-12 tuần tuổi tại huyện Thanh Sơn của tỉnh Phú Thọ và thành phố Thái Bình tỉnh Thái Bình. Số trẻ ở mỗi địa điểm được chia thành 4 nhóm bằng nhau, 3 nhóm uống văc xin rotavin M1 và 1 nhóm dùng giả dược. Thời gian thực hiện tháng 5-8/2010. 2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn 2.1.2.1. Tiêu chuẩn lựa chọn cho giai đoạn 1: - Người lớn khỏe mạnh bình thường từ 18 - 40 tuổi ở cả 2 giới, - Không có bệnh tật, - Đồng ý tham gia nghiên cứu và ký đơn tình nguyện tham gia nghiên cứu.
  58. 45 2.1.2.2. Tiêu chuẩn lựa chọn giai đoạn 2 và 3 - Trẻ em khỏe mạnh 6-12 tuần tuổi (vừa tròn 42 ngày đến 84 ngày) ở cả 2 giới. - Sinh đủ tháng (≥ 37 tuần) - Trọng lượng trẻ khi sinh ra ít nhất là 2,5 kg. - Không mắc bệnh gì được đánh giá qua thăm khám lâm sàng và hỏi tiền sử sức khỏe trước khi tham gia vào nghiên cứu. - Chưa uống vắc xin Rota. - Cha, mẹ trẻ đồng ý và ký xác nhận vào đơn tình nguyện tham gia nghiên cứu. 2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ 2.1.3.1. Tiêu chuẩn loại trừ giai đoạn 1 - Nữ giới đang trong thời kỳ mang thai hoặc dự định mang thai trong thời gian tham gia nghiên cứu. - Mắc bệnh mãn tính (các bệnh tim mạch, bệnh gan, bệnh thận). - Đang bị mắc các bệnh cấp tính. - Đang uống các thuốc Corticoid (liều dùng > 1mg/kg). - Trong 4 tuần trước ngày uống có nhận biện pháp điều trị có thể làm giảm đáp ứng miễn dịch (truyền máu hoặc các chế phẩm từ máu hoặc điều trị corticoid dài hạn > 2 tuần). - Mắc bệnh suy giảm miễn dịch. - Dị ứng với bất kỳ thành phần nào của vắc xin bao gồm phản ứng quá mẫn và sốc phản vệ đối với các kháng sinh. - Sốt (>38oC) trong vòng 3 ngày trước hoặc vào ngày uống vắc xin. - Các rối loạn về máu, bệnh bạch cầu, ung thư máu hoặc khối u ác tính tác động đến tuỷ xương hoặc hệ bạch huyết. - Sử dụng bất kỳ một loại thuốc đang nghiên cứu hay chưa được cấp phép khác hoặc sử dụng các vắc xin ngoài vắc xin của nghiên cứu này trong thời gian tham gia nghiên cứu. 2.1.3.2. Tiêu chuẩn loại trừ giai đoạn 2 và 3. - Mắc bệnh mãn tính (các bệnh tim mạch, bệnh gan, bệnh thận). - Đang bị mắc các bệnh cấp tính.
  59. 46 - Đang uống các thuốc Corticoid (liều dùng > 1mg/kg). - Trong 4 tuần trước ngày uống vắc xin nghiên cứu, trẻ nhận biện pháp điều trị có thể làm giảm đáp ứng miễn dịch (truyền máu hoặc các chế phẩm từ máu hoặc điều trị corticoid dài hạn > 2 tuần). - Mắc bệnh suy giảm miễn dịch. - Tiền sử gia đình có bệnh suy giảm miễn dịch. - Có tiền sử sốt cao co giật. - Dị ứng với bất kỳ thành phần nào của vắc xin bao gồm phản ứng quá mẫn và sốc phản vệ đối với các kháng sinh. - Trẻ sinh thiếu tháng (mang thai 38oC) trong vòng 3 ngày trước hoặc vào ngày uống vắc xin. - Suy dinh dưỡng. - Các rối loạn về máu, bệnh bạch cầu, ung thư máu hoặc khối u ác tính tác động đến tuỷ xương hoặc hệ bạch huyết. - Sử dụng bất kỳ một loại thuốc đang nghiên cứu hay chưa được cấp phép khác hoặc sử dụng các vắc xin ngoài vắc xin của nghiên cứu này trong thời gian tham gia nghiên cứu. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Các nguyên vật liệu, dụng cụ dùng cho uống văc xin, lấy mẫu và xét nghiệm trong phòng thí nghiệm Dụng cụ uống vắc xin, lấy máu, xét nghiệm máu, lấy mẫu phân, xét nghiệm phân: Bơm kim tiêm 5ml tiệt trùng, sử dụng 1 lần; Bông cồn, dây garo, kìm kẹp bông; Ống chứa máu, chống đông 5ml; Găng tay cao su; Các dụng cụ xét nghiệm sinh hóa, huyết học; Các nguyên liệu, dụng cụ lấy mẫu phân và bộ sinh phẩm chẩn đoán virut Rota trong mẫu phân (kit ProSpecT, Oxoid, Anh); Các nguyên liệu, dụng cụ định týp virut Rota bằng phương pháp RT-PCR.
  60. 47 2.2.2. Vắc xin thử nghiệm - Vắc xin thử nghiệm giai đoạn 1: VX Rotavin-M1 do POLYVAC sản xuất từ chủng G1P[8]-WS (KH0118) do chính Polyvac phân lập. + Lô số: 032008 + Hạn sử dụng: 01/2010 + Dạng bào chế: Đóng lọ 2ml /1 lọ, 1ml/ liều. + Kháng nguyên: Chủng virut Rota G1P[8] ít nhất 1.000.000 ffu/mL + Chất ổn định: Đường Sacazoza 35% + Kháng sinh: Kanamycin Sulfate: dưới 10μg /liều - Vắc xin dùng cho giai đoạn 2 và 3: Rotavin M1 lô số 03R2009, hạn sử dụng tháng 07/2011. Các thành phần khác hoàn toàn giống với vắc xin sử dụng ở giai đoạn 1. - Vắc xin đối chứng: Rotarix, do hãng GSK sản xuất + Lô số: + Hạn sử dụng: + Dạng bào chế: Chủng G1P[8] hiệu giá tối thiểu 1.000.000 PFU/mL Quản lý và bảo quản vắc xin Điều kiện vận chuyển Vắc xin nghiên cứu sẽ được đóng gói và vận chuyển tới trung tâm nghiên cứu theo lịch trình định trước. Với mỗi lần vận chuyển người chịu trách nhiệm quản lý vắc xin sẽ kiểm tra dây chuyền lạnh có được duy trì trong suốt quá trình vận chuyển hay không. Nếu có bất kỳ vấn đề gì, người này sẽ phải thông báo cho giám sát viên nghiên cứu ngay lập tức.
  61. 48 Điều kiện bảo quản Vắc xin cần phải được bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 200C, ở điều kiện tối tránh ánh sáng trong quá trình vận chuyển từ Hà Nội đến Thanh Sơn và bảo quản trong kho. Trong thời gian vận chuyển và cho uống vắc xin tại địa điểm nghiên cứu, phải giữ vắc xin trong thùng lạnh ở nhiệt độ 2-8oC. Nhiệt độ cần phải giám sát và ghi vào biên bản theo dõi trong suốt cuộc thử nghiệm. Nếu có sự cố về dây chuyền lạnh vắc xin sẽ không được sử dụng. Nghiên cứu viên hoặc người có trách nhiệm phải tiếp xúc với giám sát viên để có quyết định phù hợp. Vắc xin được khuyến cáo sử dụng càng sớm càng tốt sau khi đông tan băng. Nếu lọ vắc xin đã mở mà không sử dụng trong vòng 8 giờ thì phải loại bỏ. Chủ nhiệm đề tài/nghiên cứu viên chính là người chịu trách nhiệm bảo quản các hồ sơ chính xác về viện nhận và phân phối toàn bộ sản phẩm thử nghiệm. Nghiên cứu viên chỉ cấp vắc xin cho đối tượng được tuyển chọn và nghiên cứu. Các mẫu về kiểm kê vắc xin sẽ do nghiên cứu viên thiết kế và ghi chép để đảm bảo số lượng vắc xin chính xác. Khi vắc xin được chuyển đến, nghiên cứu viên phải xác nhận số lượng vắc xin nhận được và thông báo lại cho người giám sát nghiên cứu hoặc người được chỉ định biết. Hồ sơ kiểm kê vắc xin nghiên cứu có cả thông tin người nhận vắc xin, số lượng và ngày phân phối vắc xin, ghi chép lại khi có bất kỳ lọ vắc xin nào được hoàn trả hoặc không được dùng đến. Hồ sơ này sẽ được gộp cùng với bất kỳ thông tin kiểm kê vắc xin nào được ghi chép lại trong phiếu điều tra. Những hồ sơ này sẽ được giám sát viên hoặc cán bộ kiểm tra của POLYVAC kiểm tra ngay lập tức hoặc sẽ được kiểm tra theo thẩm quyền qui định khác vào bất cứ lúc nào.
  62. 49 Khi hoàn trả lại vắc xin, nghiên cứu viên phải ký vào sổ ghi chép việc trả lại vắc xin nghiên cứu để xác định rằng toàn bộ các lọ vắc xin chưa được sử dụng hay đã được sử dụng một phần đã được hoàn trả và không còn có lọ vắc xin nghiên cứu nào còn sót lại trong tay nghiên cứu viên. Một bản sao toàn bộ hồ sơ kiểm kê và cam kết về việc hoàn trả vắc xin được nghiên cứu viên lưu giữ trong hồ sơ nghiên cứu. Tại thời điểm kết thúc nghiên cứu, ngoại trừ có qui định cụ thể khác, toàn bộ vắc xin chưa được sử dụng kể cả các lọ vắc xin đã được sử dụng một phần và sổ ghi chép kiểm kê vắc xin được chuyển cho POLYVAC. Kiểm định chất lượng vắc xin Trước khi triển khai nghiên cứu, hiệu giá của vắc xin cần được kiểm định bởi POLYVAC. Trong thời gian nghiên cứu địa điểm nghiên cứu lâm sàng, cần lấy mẫu nghiên cứu các lọ vắc xin chưa sử dụng để chuyển về POLYVAC làm thử nghiệm kiểm tra hiệu giá để xác nhận việc bảo quản có ảnh hưởng đến hiệu giá vắc xin hay không. 2.2.3. Vật liệu thu thập thông tin nghiên cứu Phiếu nghiên cứu (case report form) Là hồ sơ tập hợp đầy đủ các thông tin cần thiết cho từng đối tượng nghiên cứu sẽ được thông kê nghiên cứu sử dụng để tổng hợp và phân tích số liệu. Tất cả thông tin sẽ được thu thập bởi nghiên cứu viên/người được chỉ định bao gồm: Tên, tuổi, ngày sinh, tình trạng sức khoẻ, mã số quản lý, mã số vắc xin trẻ uống (đối với nghiên cứu trên nhóm trẻ, ngày (giờ) uống vắc xin, các phản ứng sau uống (nếu có) đáp ứng miễn dịch. Sau khi sàng lọc, thăm khám, uống vắc xin, nghiên cứu viên phải ghi đầy đủ thông tin vào các mục yêu cầu trong Phiếu nghiên cứu cho từng đối tượng. Các mẫu phiếu thu thập thông tin trong nghiên cứu sẽ được thiết kế và cấp phát trước khi triển khai nghiên cứu địa điểm nghiên cứu.
  63. 50 Tất cả các số liệu về phản ứng phô được thu thập tại các trung tâm y tế. Các tham số về kháng huyết thanh Rota được thu thập tại phòng Xét nghiệm. Số liệu của mỗi đối tượng được ghi trong phiếu điều tra. Phiếu theo dõi phản ứng (Diary card) Phiếu này là công cụ để đối tượng nghiên cứu, có thể tự theo dõi, ghi lại các phản ứng xảy ra sau uống vắc xin 30 ngày tại gia đình. Phiếu sẽ được cấp phát ngay sau khi sử dụng vắc xin, người nhận phiếu cần được hướng dẫn, giải thích cách ghi lại. Kết thúc thời kỳ theo dõi, ở lần thăm 2, đối tượng nghiên cứu, nộp lại phiếu cho nghiên cứu viên để nghiên cứu viên hoặc người có trách nhiệm kiểm tra và chuyển thông tin thu được vào phiếu điều tra cho từng đối tượng. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu giai đoạn 1 Là nghiên cứu mở, không đối chứng 2.3.1.1. Cỡ mẫu Theo cỡ mẫu cho nghiên cứu thử nghiệm địa điểm nghiên cứu lâm sàng giai đoạn 1 là 30 người. 2.3.1.2. Phân nhóm đối tượng 40 người 18 – 40 tuổi Khám, loại trừ Nhóm A 30 người, uống vắc xin Rotavin-M1 2 liều cách nhau 1 tháng Hình 2.1. Sơ đồ tuyển chọn và phân nhóm đối tượng giai đoạn 1 (nhóm A)
  64. 51 - Cung cấp thông tin cơ bản về VX và nội dung, các bước thử nghiệm. Trả lời mọi thắc mắc của người tình nguyện. Thu đơn tình nguyện tham gia nghiên cứu của 40 người (theo mẫu quy định). - Khám và tuyển chọn 30 người vào nghiên cứu. Mỗi đối tượng được uống 2 liều vắc xin Rotavin-M1 cách nhau 30 + 3 ngày. 2.3.1.3. Tiến trình thực hiện giai đoạn 1 Ngày Ngày Ngày 10 ngày 10 ngày 0 30±3 60±5 Lấy mẫu Lấy mẫu Lấy mẫu Lấy mẫu phân các đợt phân hàng phân các đợt phân hàng M3 M1, ngày tiêu chảy M2, ngày tiêu chảy V1 V2 Theo dõi hàng ngày Hình 2.2. Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu theo dõi an toàn giai đoạn 1 Lấy máu lần thứ nhất (Mo) ngay trước khi uống vắc xin để làm các xét nghiệm huyết học, sinh hóa: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, SGOT, SGPT và urê huyết thanh; Uống vắc xin Rotavin-M1 liều 1 (2ml/liều) ở thời điểm quyết định uống vắc xin Rotavin-M1 (ngày 0); Theo dõi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện trong 30 phút đầu và đến ngày thứ 30 sau sử dụng vắc xin theo đúng mẫu qui định; Lấy máu lần thứ 2 (M2) ở thời điểm ngay trước khi uống vắc xin liều 2 để làm các xét nghiệm huyết học, sinh hóa (tương tự MO); Uống vắc xin Rotavin-M1 liều 2 (2ml/liều), cách uống vắc xin liều 1 từ 30 + 3 ngày. Lấy máu lần thứ 3 (M3) sau khi uống vắc xin liều 2 từ 30 + 3 ngày để làm các xét nghiệm huyết học, sinh hóa (tương tự, M2).
  65. 52 Lấy mẫu phân (P) 10 ngày liên tục (10 ngày tính từ sau khi uống mỗi liều vắc xin) và những trường hợp bị tiêu chảy trong thời gian theo dõi, làm xét nghiệm virut Rota đào thải ra phân. Nếu xác định được virut Rota trong phân, sẽ định týp, nếu là G1P[8] sẽ phải xác định là virut vắc xin hay virut hoang dại bằng phương pháp xác định trình tự gen và kỹ thuật tạo đám hoại tử để xác định virut còn sống hay đã chết. 2.3.1.4. Tiêu chuẩn đánh giá tính an toàn giai đoạn 1 Tính an toàn của vắc xin Rotavin-M1: bao gồm các phản ứng tại chỗ, phản ứng toàn thân và sự biến động của các chỉ số men gan SGOT, SGPT sau mỗi liều uống, khả năng đào thải virut vắc xin ở người tình nguyện. Vắc xin được đánh giá là an toàn khi đáp ứng được các tiêu chí sau đây: - Không có tác dụng phụ nặng, nghiêm trọng: Sốc, tụt huyết áp, tử vong - Không gây độc cho gan: SOGT, SGPT không tăng sau uống VX. - Không gây độc cho thận: Urê huyết thanh không tăng sau uống VX. - Các chỉ số hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu không thay đổi sau uống VX. - Không hoặc có ít tác dụng phụ toàn thân và tại chỗ sau uống VX: sốt, dị ứng, đau cơ khớp, nôn, tiêu chảy Phương pháp xác định các chỉ tiêu đánh giá tính an toàn Các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng xuất hiện trong vòng 30 phút và 28 ngày sau uống VX được theo dõi theo đúng quy định của Tổ chức Y tế thế giới (WHO – 1997, 2000) [29], [30]. + Lâm sàng: Tính an toàn được đánh giá bằng tỷ lệ người xuất hiện phản ứng phụ trong vòng 30 phút và 28 ngày sau uống VX. Công thức: Số người uống VX có phản ứng phụ Tỷ lệ phản ứng phụ (%) =  100 Tổng số người uống VX + Xét nghiệm: Ngoài các dấu hiệu lâm sàng, tính an toàn còn được đánh giá thông qua sự biến đổi một số chỉ số sinh hóa, huyết học sau uống
  66. 53 VX: Hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu, công thức bạch cầu, tiểu cầu, SGOT, SGPT và urê huyết thanh. VX được đánh giá đạt yêu cầu về tính an toàn nếu các chỉ số SGOT, SGPT và urê huyết thanh không tăng so với trước uống VX. VX được đánh giá đạt yêu cầu về tính an toàn nếu sau uống VX: . Hồng cầu, huyết sắc tố, tiểu cầu không giảm. . Sự biến động của bạch cầu, công thức bạch cầu. Phân tích số liệu: - Các số liệu được xử lý trên phần mềm Stata 9.1 - Các thông tin định lượng được phân tích bằng thuật toán t-student. 2.3.1.5. Kỹ thuật nghiên cứu - Xác định các phản ứng phụ xuất hiện trong 30 phút và 28 ngày sau uống VX bằng kỹ thuật khám lâm sàng (do các bác sỹ Trung tâm Y tế huyện Thanh Sơn thực hiện). - Các xét nghiệm huyết học được thực hiện trên máy UNFPA BC- 1800 và Sysmex KX-21 tại khoa Sinh hóa (Bệnh viện Đa khoa Thanh Sơn, Phú Thọ). - Các xét nghiệm sinh hóa được thực hiện trên máy BS-300 Chemistry Analyzer (Mindray) tại khoa Sinh hóa (Bệnh viện Đa khoa Thanh Sơn, Phú Thọ). - Các xét nghiệm kháng nguyên virut Rota trong mẫu phân của đối tượng sau uống vắc xin bằng kỹ thuật Elisa được thực hiện tại khoa Sinh học phân tử và miễn Dịch, Viện Vệ Sinh dịch tễ Trung ương. 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu giai đoạn 2. Giai đoạn 2 được thiết kế nghiên cứu mù có đối chứng. 2.3.2.1. Phân nhóm nghiên cứu: 200 trẻ được phân bổ ngẫu nhiên và đồng đều vào 5 nhóm nghiên cứu kí hiệu B, C, E, N, R với số lượng bằng nhau 40 trẻ/nhóm.
  67. 54 Sơ đồ tuyển chọn và phân nhóm trẻ tham gia giai đoạn 2 như sau: 348 trẻ 6 – 12 tuần tuổi ở 15 xã 310 trẻ 6 – 12 tuần tuổi có cha mẹ đồng ý tham gia Khám, loại trừ Vào NC: 200 trẻ Nhóm B: 40 trẻ Nhóm C: 40 trẻ Nhóm N: 40 trẻ Nhóm E: 40 trẻ Nhóm R: 40 trẻ Hình 2.3. Sơ đồ tuyển chọn và phân nhóm đối tượng giai đoạn 2 - Nhóm B: Uống 2 liều vắc xin Rotavin M1 cách nhau 2 tháng hàm lượng 106 FFU/liều - Nhóm C:Uống 3 liều Rotavin M1 cách nhau 1 tháng hàm lượng 106 FFU/liều - Nhóm E: Nhóm đối chứng sử dụng 2 liều vắc xin Rotarix - Nhóm N: Uống 3 liều Rotavin M1 cách nhau 1 tháng hàm lượng 106,3 FFU/liều - Nhóm R: Uống 2 liều Rotavin M1 cách nhau 2 tháng hàm lượng 106,3 FFU/liều
  68. 55 2.3.2.2. Phương pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắc xin thử nghiệm Vx 1 Vx 2 Vx 3 0 7 30±3 37±3 60±3 67±3 90±3 MÁU 1 MÁU 2 MÁU 3 mẫu phân(7) mẫu phân(7) mẫu phân(7) Lấy mẫu phân khi tiêu chảy Theo dõi hàng ngày Hình 2.4. Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu xét nghiệm giai đoạn 2 nhóm C, E và N Vx Vx 0 7 30±3 60±3 67±3 90±3 MÁU MÁU mẫu mẫu mẫu phân khi tiêu chảy Theo dõi hàng ngày Hình 2.5. Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu xét nghiệm giai đoạn 2 nhóm B và R
  69. 56 Lấy máu lần thứ nhất (M1) ngay trước khi uống vắc xin để làm các xét nghiệm huyết học, sinh hóa: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, SGOT, SGPT và urê huyết thanh. Xác định hiệu giá kháng thể IgG và IgA đặc hiệu RV nền. Uống vắc xin Rotavin-M1 liều 1 (1ml/liều hoặc 2ml/liều) thời điểm quyết định uống (ngày 0). Theo dõi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện trong 30 phút đầu và hàng ngày trong vòng 30 ngày sau uống vắc xin theo đúng mẫu qui định; Uống vắc xin Rotavin-M1 liều 2 (1ml/liều hoặc 2ml/liều sau liều 1) thời điểm quyết định uống (thời điểm 30 3 hoặc 60+5) (lô vắc xin thử nghiệm đã được chọn uống liều 1); Theo dõi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện trong 30 phút đầu và hàng ngày trong vòng 30 ngày sau uống vắc xin theo đúng mẫu qui định; Lấy mẫu phân (P) 7 ngày liên tục (7 ngày tính từ sau khi uống vắc xin) và những trường hợp bị tiêu chảy trong thời gian theo dõi, làm xét nghiệm virut Rota đào thải ra phân. Nếu xác định được virut Rota trong phân, sẽ định týp, nếu là G1P [8] sẽ phải xác định là virut vắc xin hay virut hoang dại bằng phương pháp xác định trình tự gen. Lấy máu lần thứ 2 (M2) ở thời điểm 30+3 ngày sau uống vắc xin liều 2 để xét nghiệm tìm sự biến động hiệu giá kháng thể và xác định Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, SGOT, SGPT và urê huyết thanh sau uống vắc xin liều 2 như M0; Sau 90 ngày theo dõi an toàn về lâm sàng và cận lâm sàng (so sánh các xét nghiệm huyết học, sinh hóa giữa M0, M2), nếu vắc xin được đánh giá là an toàn, nhóm nghiên cứu sẽ báo cáo với Chủ tịch hoặc Phó chủ tịch Hội đồng Y đức - Bộ Y tế để cho phép tiến hành ngay giai đoạn 3. 2.3.2.3. Chỉ tiêu đánh giá tính an toàn Giai đoạn 2 đánh giá dựa trên phân tích thống kê bằng so sánh tỷ lệ trẻ bị phản ứng phụ trong 30 ngày sau khi uống mỗi liều vắc xin Rotavin-M1 và
  70. 57 phản ứng phụ trong 30 ngày sau khi uống mỗi liều vắc xin Rotavin-M1 giữa nhóm sử dụng vắc xin Rotavin-M1 với nhóm sử dụng vắc xin Rotarix. Phản ứng tức thì sau uống (phản ứng tại chỗ, toàn thân xảy ra trong vòng 30 phút sau sử dụng vắc xin): nôn hoặc sặc. Phản ứng tại chỗ, phản ứng toàn thân (kể cả các phản ứng phụ xảy ra ngoài dự kiến xảy ra trong vòng 30 ngày sau khi sử dụng vắc xin): lồng ruột (xảy ra trong vòng 30 ngày sau uống vắc xin, chẩn đoán xác định bằng mổ hoặc chụp X quang, siêu âm), sốt, cáu ngắt, kích thích, chán ăn, nôn, tiêu chảy, xuất tiết đường hô hấp trên (ho và chảy nước mũi), đầy hơi, viêm đường hô hấp dưới (viêm cuống phổi hoặc viêm phế quản). Những phản ứng phụ nghiêm trọng (SAEs) diễn ra từ ngày uống vắc xin cho đến ngày thứ 30 sau ngày sử dụng vắc xin liều 2: tiêu chảy nặng, viêm dạ dày ruột cấp tính, mất nước, tử vong do lồng ruột hoặc viêm phổi hoặc tiêu chảy mất nước, chứng co giật. So sánh các xét nghiệm huyết học, sinh hóa trước và sau uống vắc xin. 2.3.2.4. Chỉ tiêu đánh giá tính sinh miễn dịch của vắc xin Rotavin-M1 Đây là chỉ tiêu nghiên cứu ở cả hai giai đoạn 2,3. Tiêu chí đánh giá dựa trên phân tích thống kê bằng cách so sánh tỷ lệ trẻ có chuyển đổi kháng thể trung hòa và kháng thể IgG, IgA của huyết thanh trước khi sử dụng vắc xin và sau 30 + 3 ngày sử dụng uống liều 2 giữa nhóm uống vắc xin Rotavin-M1 với nhóm uống vắc xin Rotarix. Định nghĩa chuyển đổi kháng thể Một trẻ không có kháng thể trung hòa hoặc không có kháng thể IgG, IgA virut Rota trước khi sử dụng vắc xin được coi là có sự chuyển đổi kháng thể khi tình trạng kháng thể trong huyết thanh thay đổi từ âm tính sang dương tính.