›

Khóa luận Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thống

pdf 102 trang thiennha21 13/04/2022 6863
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thống", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_phan_lap_va_nhan_sinh_khoi_mot_so_chung_nam_moc_tu.pdf

Nội dung text: Khóa luận Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thống

  1. HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ NHÂN SINH KHỐI MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC TỪ BÁNH MEN RƯỢU TRUYỀN THỐNG HÀ NỘI - 2019
  2. HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ NHÂN SINH KHỐI MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC TỪ BÁNH MEN RƯỢU TRUYỀN THỐNG Người thực hiện : Trần Thị Thu Trang Mã SV: 600978 Khóa : 60 Ngành : Công nghệ sau thu hoạch Giáo viên hướng dẫn : TS. Đinh Thị Hiền TS. Đặng Hồng Ánh Địa điểm thực tập : Viện Công Nghiệp Thực phẩm HÀ NỘI - 2019
  3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn và các thông tin được trích dẫn trong chuyên đề này đã được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Trần Thị Thu Trang 1
  4. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Đinh Thị Hiền - Bộ môn Công nghệ chế biến, khoa Công nghệ Thực phẩm và TS. Đặng Hồng Ánh - Bộ môn Công nghệ đồ uống, Viện Công nghiệp thực phẩm, người đã dành nhiều thời gian, công sức tận tình giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài. Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể các thầy cô trong Khoa công nghệ thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã truyền đạt những kiến thức bổ ích, quý báu giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu tại trường. Cuối cùng tôi muốn dành lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, các anh chị em, bạn bè đã luôn cảm thông, chia sẻ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Trần Thị Thu Trang 2
  5. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN 1 LỜI CẢM ƠN 2 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 6 DANH MỤC BẢNG 8 DANH MỤC HÌNH/ĐỒ THỊ 9 PHẦN I. MỞ ĐẦU 10 1.1. Đặt vấn đề 12 1.2. Mục đích 14 1.3. Yêu cầu 14 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 2.1. Tổng quan chung về bánh men rượu 12 2.1.1. Sơ lược về bánh men trên thế giới và Việt Nam 12 2.1.2. Phân loại bánh men rượu 13 2.2. Giới thiệu về công nghệ sản xuất bánh men rượu truyền thống 13 2.2.1. Nguyên liệu sản xuất bánh men rượu 13 2.2.1.1. Gạo 13 2.2.1.2. Men giống 14 2.2.2. Hệ vi sinh vật trong bánh men 15 2.2.2.1. Nấm men 16 2.2.2.2. Nấm mốc 16 2.2.2.3. Vi khuẩn 17 2.2.3. Quy trình sản xuất bánh men rượu truyền thống 17 2.2.3.1. Sơ đồ quy trình công nghệ 18 2.2.3.2. Thuyết minh quy trình 19 2.3. Nấm mốc – Vi sinh vật có khả năng đường hoá. 20 2.3.1. Cấu tạo và hình thức sinh sản. 21 2.3.1.1. Cấu tạo. 21 2.3.1.2. Hình thức sinh sản. 21 3
  6. 2.3.2. Một số nấm mốc có khả năng đường hóa trong sản xuất rượu. 22 2.3.3. Phương pháp nuôi cấy. 23 2.3.3.1. Phương pháp nuôi cấy bề sâu. 23 2.3.3.2. Phương pháp nuôi cấy bề mặt. 23 2.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 23 2.3.4.1. Độ ẩm môi trường. 23 2.3.4.2. Nhiệt độ nuôi cấy. 23 2.3.4.3. Thời gian nuôi . 24 2.3.4.4. pH môi trường. 24 2.4. Tầm quan trọng của việc sử dụng chế phẩm bánh men vi sinh thuần chủng trong sản xuất rượu truyền thống. 25 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 3.1. Đối tượng nghiên cứu 26 3.2. Phạm vi nghiên cứu 26 3.2.1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 26 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu 27 3.2.3. Thời gian nghiên cứu 27 3.3. Nội dung nghiên cứu 27 3.4. Phương pháp nghiên cứu 27 3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm 27 3.4.1.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống 28 3.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. 28 3.4.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu 30 3.4.1.4. Thí nghiệm 4: Thử hoạt lực bột mốc từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 31 3.4.2. Phương pháp phân tích 31 3.4.2.1. Các phương pháp vi sinh 31 3.4.2.2. Các phương pháp hóa sinh. 32 4
  7. 3.4.2.3. Phương pháp xử lý số liệu 34 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống 35 4.1.1. Phân lập nấm mốc trong bánh men 35 4.1.2. Đánh giá sơ bộ khả năng đường hóa của các chủng nấm mốc phân lập được .41 4.2. Kết quả nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 43 4.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 43 4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 44 4.2.3. Ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 45 4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu 47 4.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến TSS trong quá trình lên men rượu 48 4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ chua trong quá trình lên men rượu 49 4.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ cồn trong quá trình lên men rượu 50 4.4. Kết quả đánh giá hoạt lực bột mốc thu được 52 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 5.1. Kết luận 54 5.2. Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 5
  8. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CT Công thức NXB Nhà xuất bản PGS Phó giáo sư TS Tiến sĩ TSS Hàm lượng chất khô tổng số MTB Men thuốc bắc LMA Lên men ẩm LMD Lên men dịch HSLM Hiệu suất lên men 6
  9. DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Bánh men được sử dụng ở các nước trên thế giới 12 Bảng 3.1: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định thời gian nuôi lắc nhân sinh khối 29 Bảng 3.2: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi lắc nhân sinh khối 30 Bảng 3.3: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định số vòng lắc nuôi lắc nhân sinh khối 30 Bảng 3.4: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm nghiên cứu tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu 31 Bảng 4.1: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ bánh men Đức Ngọ 35 Bảng 4.2: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ bánh men Thái Nguyên 37 Bảng 4.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc 41 Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 43 Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 44 Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn 46 Bảng 4.7: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến TSS trong quá trình lên men 48 Bảng 4.8: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ chua của quá trình lên men 49 Bảng 4.9: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ cồn của quá trình lên men 51 Bảng 4.10: Kết quả đánh giá hoạt lực của bột mốc so với bánh men Đức Ngọ gốc về một số chỉ tiêu sau 6 ngày LMD. 53 7
  10. DANH MỤC HÌNH/ĐỒ THỊ Hình 2.1:Quy trình sản xuất bánh men thuốc bắc (Nguyễn Đức Lượng, 2002) 18 Hình 4.1: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 38 Hình 4.2: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Aspergillus oryzae 38 Hình 4.3: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Penicilium 39 Hình 4.4: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Penicilium 39 Hình 4.5: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Mucor 39 Hình 4.6: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Mucor 39 Hình 4.7: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Rhizopus 40 Hình 4.8: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Rhizopus 40 Hình 4.9: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Aspergillus niger 40 Hình 4.10: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Aspergillus niger 40 Hình 4.11: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Aspergillus oryzae 41 Hình 4.12: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Aspergillus niger 41 Hình 4.23: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Penicilium 42 Hình 4.34: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Mucor 42 Hình 4.45: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Rhizopus 42 Hình 4.16: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01 43 Hình 4.17: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01 45 Hình 4.18: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01 46 Hình 4.19: Bốn mẫu cơm rượu khi kết bắt đầu quá trình lên men ẩm 47 Hình 4.20: Bình lên men rượu khi bắt đầu lên men dịch. 48 Hình 4.21: Đồ thị kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ bột mốc tới độ chua của dịch lên men 50 Hình 4.22: Đồ thị kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ bột mốc tới độ cồn của dịch lên men 51 Hình 4.24: Mẫu cơm rượu khi bắt đầu lên men ẩm 52 Hình 4.25: Bình lên men rượu khi bắt đầu lên men dịch. 52 8
  11. PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Rượu là đồ uống có từ lâu đời. Trong cuộc sống, nếu biết sử dụng hợp lý rượu sẽ rất tốt cho sức khỏe, và cần thiết trong giao tiếp. Rượu và các đồ uống có cồn chiếm một vị trí đáng kể trong công nghiệp thực phẩm. Chúng đa dạng tùy theo truyền thống và thị hiếu của người tiêu dùng mà các nhà sản xuất làm ra nhiều loại rượu khác nhau. Trong sản xuất rượu, hệ vi sinh vật trong bánh men đóng vai trò rất quan trọng. Chúng góp phần chuyển hóa các chất từ nguyên liệu thành đường và từ đường thành rượu nhờ quá trình đường hóa và lên men. Chúng cùng với nguyên liệu tạo nên chất lượng rượu. Ở nước ta, nghề nấu rượu thủ công có từ ngàn xưa và chưa có tài liệu nào cho biết chính xác có từ khi nào. Ở miền núi, đồng bào các dân tộc dùng gạo, ngô, khoai, sắn nấu chín rồi cho lên men, men giống được nuôi với một số lá rừng được gọi là men lá. Nếu tiến hành cất rượu thì thu được sản phẩm là rượu trắng và nếu không qua chưng cất thì sản phẩm gọi là rượu cần – Một sản phẩm nổi tiếng ở vùng núi. Ở đồng bằng, nhân dân biết làm men từ bột gạo với các vị thuốc bắc – thường gọi là men thuốc bắc (MTB) để lên men rượu từ các nguyên liệu khác nhau có chứa tinh bột như gạo nếp, gạo tẻ, ngô, sắn, và thu được loại rượu trắng với chất lượng khác nhau, trong đó có loại rất ngon và nổi tiếng. Như vậy, nghề làm rượu cổ truyền ở nước ta từ trước đến nay vẫn dùng men giống ở dạng men bánh hoặc men lá. Các men này có khả năng đường hóa tinh bột và lên men thành rượu. Trong các men này là một tập hợp các vi sinh vật có hoạt tính trên. Mãi đến cuối thế kỷ XIX (khoảng năm 1895), các nhà sinh vật học Pháp: Calmette, Boidin đã phân lập được một loài nấm mốc trong bánh men thuốc bắc, đặt tên là Mucor rouxii (hay Amylomyces). Loài nấm mốc này phát triển tốt trên môi trường có gluxit, nhất là gạo, nhiệt độ tối thích 33÷35°C, tích lũy phức hệ enzyme tương đối hoàn chỉnh, nên không những có khả năng phân giải tinh bột đật hiệu suất cao mà còn có khả năng lên men một phần đường thành rượu. Tuy nhiên, nhiều loại men rượu trên thị trường hiện nay không rõ nguồn gốc xuất xứ, không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, không kiểm soát được hệ vi sinh vật cả về chủng loại, số lượng và tiềm ẩn nhiều nguy cơ ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng. 9
  12. Bởi vậy, việc nghiên cứu tìm ra một số chủng nấm mốc thuần chủng từ bánh men rượu truyền thống và từ đó ứng dụng sản xuất các chế phẩm bánh men vi sinh thuần chủng là một nhu cầu thiết yếu và có ý nghĩa quan trọng vào ngành công nghiệp sản xuất rượu. Từ những lý do trên, được sự đồng ý của Khoa Công nghệ thực phẩm – Học viện Nông nghiệp Việt Nam cùng với sự giúp đỡ và hướng dẫn của TS Đinh Thị Hiền và TS Đặng Hồng Ánh – Bộ môn Công nghệ đồ uống, Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, chúng tôi tiến hành đề tài : “Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thống”. 1.2. Mục đích Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và nhân sinh khối chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống để sản xuất bánh men rượu. 1.3. Yêu cầu Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống. Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus Penicillium và Aspergillus tuyển chọn được. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc/ nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu. Thử hoạt lực bột mốc thu được từ chủng nấm mốc tuyển chọn được. 10
  13. PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan chung về bánh men rượu 2.1.1. Sơ lược về bánh men trên thế giới và Việt Nam Trên thế giới, bánh men rượu truyền thống rất đa dạng và phong phú về chủng loại. Thái Lan có men Loopang dạng bột, Nhật Bản có men Koji dạng hạt, Hàn Quốc có men Nuruk và Meju dạng bánh lớn, v.v ( Haard, 1999). Men rượu là hỗn hợp các vi sinh vật có sự tác động tương hỗ trong quá trình lên men được nuôi trên cơ chất là các nguyên liệu giàu tinh bột như bột gạo, ngô, sắn, khoai, v.v Bảng 2.1: Bánh men được sử dụng ở các nước trên thế giới Tên nước Tên gọi Thành phần Dạng men Hệ vi sinh vật Nhật Bản Koji Lúa mỳ, gạo Dạng hạt Aspergillus Thái Lan Loopang Cám Dạng bột Amylomyces Aspergillus Malaysia Amylomyces Ragi Gạo Dạng bánh nhỏ Indonesia Endomycopsis Lúa mỳ, kê, gạo, Dạng bánh, dạng Rhizopus Trung Quốc Chu bo bo hạt Amylomyces Hansenula anomala Ấn Độ Marchaa Gạo Dạng bánh Mucor fragilis Rhizopus arrhizus Mucor, Rhizopus Phillipines Bubod Gạo Dạng bánh Saccharomyces (Haard, N. F. Fermented cereals: a global perspective, 1999) Nước ta có hai loại bánh men chính là: Bánh men thuốc bắc được sản xuất từ một số vị thuốc bắc với bột gạo và bánh men lá được sản xuất từ bột gạo và các loại lá, củ, quả 11
  14. rừng theo kinh nghiệm cổ truyền. Men thuốc bắc (MTB) được trộn từ các vị thuốc bắc với bột gạo. Bột gạo nghiền nhỏ, bột thuốc bắc nghiền nhỏ cùng bột bánh men cái, trộn đều (Lương Đức Phẩm, 2012). Trong bánh men thuốc bắc nhờ có các vị thuốc bắc với thành phần hợp lý mà hạn chế được sự phát triển của các tạp khuẩn từ không khí vào bánh men. Mặt khác một số vị thuốc còn có tác dụng kích thích sự phát triển của nấm men và nấm mốc, nhờ vậy mà quá trình đường hoá và rượu hoá sau này diễn ra tốt hơn (Lương Đức Phẩm, 2012). Ở các vùng núi cao men lá thường được sử dụng. Lá sử dụng thường là các loại có nhiều tinh dầu và có mùi thơm. Tùy thuộc vào từng địa phương mà trong men có các loại lá khác nhau. Để làm men lá, người K’Ho Tây Nguyên sử dụng bột thân cây “đòng” và nước chiết cây “me-kà-zut” trộn với bột gạo (Lương Đức Phẩm, 2012). Vùng tây Nghệ An dùng các loại lá: lá mít, lá mía, lá nhân và lá quế, (Lương Đức Phẩm, 2009). 2.1.2. Phân loại bánh men rượu Từ xa xưa, người ta đã biết sử dụng một thành phần của mẻ lên men trước để cho vào mẻ lên men sau, cách làm này nhằm rút ngắn thời gian lên men đồng thời làm giảm những hư hỏng xảy ra trong quá trình lên men. Ngày nay người ta đã chủ động nuôi cấy các vi sinh vật đã chọn lọc để sản xuất những chế phẩm vi sinh đáp ứng tốt yêu cầu của quá trình lên men rượu. Các chế phẩm này gọi là bánh men rượu. Bánh men rượu được sản xuất chủ yếu từ gạo (nguyên liệu chính cung cấp tinh bột trong sản xuất bánh men) và men giống là các vi sinh vật để tiến hành đường hóa và rượu hóa, người ta cũng có thể trộn chung với các loại vị thuốc thảo mộc khác. Tùy từng địa phương, việc sử dụng các vị thuốc là rất khác nhau. Tạm thời có thể chia làm 3 loại: Bánh men rượu không có thuốc bắc (Bánh men thường). Bánh men rượu có thuốc bắc. Bánh men rượu có lá rừng (Bánh men lá). 2.2. Giới thiệu về công nghệ sản xuất bánh men rượu truyền thống 2.2.1. Nguyên liệu sản xuất bánh men rượu 2.2.1.1. Gạo Gạo được chọn làm nguyên liệu chính để cung cấp tinh bột cho sản xuất bánh men. 12
  15. Thành phần hóa học của gạo phụ thuộc vào nhiều yếu tố như đất đai, khí hậu, phân bón, giống lúa cũng như kỹ thuật chế biến và bảo quản. Theo Lê Vĩnh Thảo và cs. (2004), tinh bột gạo thuộc loại tinh bột phức tạp có kích thước rất nhỏ, thành phần tinh bột gạo tẻ gồm khoảng 17% amylose và 83% amylopectin. Tinh bột gạo có hình đa giác, kích thước nhỏ, trong khoảng 2-10 m. Hạt tinh bột gạo có kích thước nhỏ và nằm sát nhau nên quá trình hồ hóa khó khăn hơn, nhiệt độ hồ hóa khoảng 70 - 80oC. Tinh bột có 2 loại: Amylose có cấu tạo mạch thẳng và amylopectin có cấu tạo mạch nhánh, tỷ lệ thành phần này liên quan đến độ dẻo của hạt. Các loại gạo Việt Nam có hàm lượng amylose thay đổi từ 15 - 35%. Ngoài ra trong gạo còn có các thành phần hóa học như protein chiếm 6 – 8%, lipit khoảng 2,02% phân bố ở lớp vỏ gạo và phôi, và có một lượng các vitamin đặc biệt là vitamin B như vitamin B1 là 0,45 mg/100 hạt. Thành phần chính của gạo: - Tinh bột (70% – 75% chất khô). - Các loại đường ( 2% – 5% chất khô). - Protit (6% - 8% chất khô). - Chất béo (1% - 1,5% chất khô). Tinh bột gạo chiếm 90% - 95% tổng khối lượng các nguyên liệu dùng làm bánh men. 2.2.1.2. Men giống Men giống được sử dụng là các loại bánh men cũ phát triển trên cơ chất là tinh bột, tiến hành đường hóa và rượu hóa. Cũng có thể không dùng bánh men cũ mà chỉ dùng bột gạo, thuốc bắc để làm men thuốc bắc, lúc đó, các vi sinh vật trong không khí sẽ vào bánh men, những chủng nấm mốc, nấm men nào không bị chất kháng khuẩn của thuốc bắc tiêu diệt thì sẽ phát triển nhờ quá trình phân giải tinh bột thành đường glucose và lên men rượu từ các đường cơ bản. Tuy nhiên trong sản xuất bánh men cổ truyền, nếu làm như vậy thì thời gian ủ bánh sẽ kéo dài vì các chủng nấm men, nấm mốc cần thời gian xâm nhập, thích nghi và phát triển, đồng thời chủng giống cũng sẽ yếu hơn so với việc dùng bánh men cũ làm giống. Trên môi trường nuôi cấy cơ chất là tinh bột gạo và ở điều kiện thích hợp, các chủng nấm men, nấm mốc có khả năng sản sinh ra enzyme amylase để thủy phân tinh bột thành 13
  16. đường glucose, còn các chủng nấm men rượu sẽ sử dụng đường khử để duy trì quá trình sống và phát triển. Và sau khi đã đạt đến thời điểm nuôi cấy, đem sấy tới độ ẩm bảo quản thì các chủng vi sinh vật này sẽ cùng tồn tại trên một môi trường bánh men. Thời gian để một bánh men giống có khả năng lên men rượu cao phụ thuộc vào nhiều điều kiện khác nhau, tùy thuộc vào các giống vi sinh vật (nấm mốc, nấm men), điều kiện ủ và chế độ sấy. 2.2.2. Hệ vi sinh vật trong bánh men Thực chất bánh men là canh trường không thuần khiết của hệ vi sinh vật có khả năng sinh trưởng tổng hợp enzyme đường hóa và lên men rượu, nói cách khác hệ vi sinh vật trong bánh men rất đa dạng. Trong đó, có 3 loại phổ biến nhất: Nấm men, nấm mốc, vi khuẩn (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Các kết quả nghiên cứu khoa học cho thấy giá trị pH bánh men Việt Nam trong khoảng 5,76, độ ẩm khoảng 13,5%, nấm mốc 3,4×106, nấm men 5,8×107 cfu/gam bánh men. Trong tổng số 119 vi sinh vật phân lập được thì có 53 tế bào mốc, 51 tế bào nấm men và 15 tế bào vi khuẩn. Các chủng nấm mốc xác định được: Rhizopus oryzae, Mucor indicus, Mucor circinilloides, Amylomyces rouxii và các chủng nấm men thường gặp: Saccharomyces cerevisiae, Hyphopichia burtonii, Sacchromycopsis fibuligera, Pichia anomala và Candidas sp (A.H.Rose, 1977). Việc nghiên cứu tuyển chọn các chủng nấm mốc, nấm men để bổ sung vào sản xuất bánh men nhằm làm giàu các chủng vi sinh vật này để nâng cao chất lượng và ổn định bánh men là cần thiết. Tiêu chí để tuyển chọn các chủng nấm mốc, nấm men như sau: - Đối với các chủng nấm men: Có hoạt lực lên men mạnh, hiệu suất lên men rượu cao, chịu được nồng độ đường cao. Chịu được môi trường có nồng độ axit cao. Tạo hương thơm và sinh ít tạp chất. - Đối với nấm mốc: Sinh trưởng tốt trên môi trường nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm. Có khả năng sinh tổng hợp hệ emzyme amylase cao, trong một thời gian ngắn. Tạo hương thơm. 14
  17. 2.2.2.1. Nấm men Nấm men là nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào và nhân chuẩn thường sinh sản bằng cách nảy chồi. Hình dạng nấm rất phong phú phụ thuộc vào giống loài, nó có thể dạng hình cầu, hình trứng hay hình bầu dục, hình tam giác Đối với nấm men trong qua trình hoạt động sống, chúng đồng hóa các monosacarit trong điều kiện yếm khí, thải ra môi trường xung quanh sản phẩm dị hóa là rượu etylic và khí cacbonic nhờ tác dụng của phức hệ các enzyme ( Nguyễn Lân Dũng, 2002). Đây là một trong những đặc trưng quan trọng của nấm men đã được nhân dân ta ứng dụng từ lâu đời để sản xuất rượu bằng bánh men. Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), trong mỗi gam bánh men có từ vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào nấm men. Gồm 2 chi chủ yếu là: - Endomycopsis (chủ yếu là Endo. Fibuligenes): là nấm men rất giàu enzyme amylase, glucoamylase. Do đó vừa có khả năng rượu hóa vừa có khả năng đường hóa. - Sacharomyces (Chủ yếu là S.Cerevisiae): Đây là loại nấm men đóng vai trò quan trọng trong quá trình rượu hóa. Chúng có khả năng lên men rất nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, maltose, fructose, rafinose, galactose và lên men được ở nhiệt độ cao (khoảng từ 36 - 40°C), chịu được axit. Đặc điểm quan trọng hơn hết là loài nấm men này có khả năng lên men các loại nguyên liệu rất khác nhau như gạo, ngô, khoai, sắn với lượng đường trong dung dịch từ 12 – 14%, có khi 16 – 18%. Nồng độ rượu trong dịch lên men là 10 – 12%. Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 – 32°C. Ngoài hai chủng nấm men trên, trong bánh men còn thấy nhiều loại nấm dại khác nhau. Chúng vừa có khả năng thủy phân tinh bột, vừa có khả năng chuyển đường thành cồn, tuy sự chuyển hóa này còn rất thấp. Điều đặc biệt là các loài nấm men dại này chịu nhiệt độ rất cao, có khi lên tới 60 -65°c và chịu được chất sát trùng ở nồng độ 0,05 – 1%. 2.2.2.2. Nấm mốc Trong bánh men thuốc bắc có nhiều loại nấm mốc phát triển thuộc Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus. Các loại nấm mốc này có thành phần và tỷ lệ rất khác nhau tùy thuộc vào từng loại bánh men, từng vùng sản xuất và từng hộ gia đình. Vai trò của nấm mốc trong bánh men rượu chính là nguồn cung cấp enzym amylase. Khi các loại nấm mốc này phát triển trên môi trường với cơ chất là tinh bột thì chúng có khả năng sinh tổng hợp 15
  18. enzym amylase để thủy phân tinh bột thành đường, nhưng trong đó, Mucor và Rhizopus thấy phát triển nhiều hơn cả (Nguyễn Đức Lượng, 2002). 2.2.2.3. Vi khuẩn Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào, có cấu tạo đơn giản và có kích thước rất nhỏ. Mỗi tế bào vi khuẩn có thể hoạt động sống độc lập (Nguyễn Lân Dũng, 2002). Vi khuẩn trong men rượu thường là vi khuẩn lactic và axetic (Lương Đức Phẩm, 2012). Sự đa dạng vi khuẩn trong bánh men rượu của Việt Nam đã được nghiên cứu. Chúng chủ yếu thuộc các chi Bacillus, Lactobacillus, Acetobacter, (Thanh et al., 2008). Chúng có vai trò đảm bảo quá trình lên men thuận lợi hơn, nâng cao được dinh dưỡng cho nấm men do vi khuẩn lactic tích tụ các hợp chất nitơ dễ được nấm men đồng hóa và tăng được hiệu suất tạo thành rượu (Lương Đức Phẩm, 2004). Ngoài ra, các vi khuẩn này nhờ khả năng lên men đường tạo thành các axit hữu cơ như axit lactic, axit axetic, axit pyruvic đóng vai trò tạo nên hương vị cho rượu. Khi hàm lượng axit hữu cơ trong rượu ở một hàm lượng nhất địnhh sẽ tạo hương vị và mùi thơm cho rượu, tuy nhiên nếu nồng độ cao sẽ ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng rượu và làm rượu bị chua. 2.2.3. Quy trình sản xuất bánh men rượu truyền thống Bánh men là một loại men rượu được sản xuất thủ công tại Việt Nam. Mỗi địa phương và mỗi dân tộc có phương pháp sản xuất riêng. Việc sản xuất bánh men chính là sản xuất hỗn hợp các hệ vi sinh vật cần thiết cho quá trình sản xuất rượu. Phương pháp bánh men có các đặc điểm cơ bản khác với các bánh men khác ở chỗ nấm mốc và nấm men được nuôi cấy cùng một lúc trên môi trường tinh bột sống. Thực chất bánh men chỉ là nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật trên môi trường tinh bột sống ở trạng thái khô, sau quá trình tạo bánh, ủ và sấy tới độ ẩm bảo quản, các vi sinh vật được chuyển từ trạng thái hoạt động sang trạng thái ngủ nghỉ. Chúng sẽ hoạt động trở lại trong điều kiện môi trường thích hợp, sản sinh và phát triển đồng thời sinh tổng hợp phức hệ enzyme đường hóa và rượu hóa. 16
  19. 2.2.3.1. Sơ đồ quy trình công nghệ Gạo vo sạch, để ráo Làm sạch Ngâm nước Nghiền mịn Nước Bánh men Trộn gốc Thuốc bắc Tạo hình Ủ Hong khô Bánh men thuốc bắc Hình 2.1: Quy trình sản xuất bánh men thuốc bắc (Nguyễn Đức Lượng, 2002) 17
  20. 2.2.3.1. Thuyết minh quy trình Làm sạch Mục đích: Việc làm sạch nhằm loại bỏ bớt tạp chất và tránh tạp nhiễm khỏi bánh men. Ngâm nước Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình nghiền và ở quá trình này đã làm mềm hạt gạo để quá trình nghiền bột được dễ dàng hơn, bột sẽ dẻo và mịn hơn. Gạo được ngâm vào trong nước, với lượng nước vừa đủ để ngập hết khối hạt trong thời gian thích hợp để nước thấm đều trong hạt gạo, cần tránh sự sinh trưởng của vi khuẩn trong nguyên liệu. Cách thực hiện: Gạo sau khi được làm sạch đem ngâm với tỉ lệ nước gạo tương ứng là 1:2. Thời gian ngâm 1,5 – 2h ở nhiệt độ 28°C. Nghiền Mục đích: Giảm kích thước hạt tạo thuận lợi trong quá trình phối trộn cùng men giống, thuốc bắc và để dễ dàng cho nấm men, nấm mốc tiếp cận với tinh bột. Ở đây không sử dụng nghiền khô nhằm không làm cho nhiệt độ khối bột tăng do ma sát giữa hạt và thiết bị gây biến tính tinh bột ảnh hưởng đến chất lượng bánh men. Cách thực hiện: Sử dụng máy nghiền cối đá để tiến hành xay. Kết thúc quá trình nghiền ướt tiến hành lọc bột nhằm mục đích làm giảm độ ẩm của khối bột bởi độ ẩm tối thịnh của nấm mốc là 50 – 55%. Phối trộn Mục đích: Gạo sau khi xay thành bột được nhào trộn đều với bột thuốc bắc và men giống đã được nghiền nhuyễn, theo tỉ lệ nhất định nhằm làm cho nguyên liệu được trộn đều với nhau và men giống được tiếp xúc đều với thuốc bắc, tinh bột đảm bảo sự phát triển đều của nấm men và nấm mốc trong bánh men. Các biến đổi: Vật lý: Khối bột, thuốc bắc, men giống được trộn đều vào với nhau. Sinh học: Nấm men, nấm mốc được tiếp xúc đều với thuốc bắc, tinh bột chúng sử dụng dinh dưỡng để sinh trưởng và phát triển. Khối lượng vi sinh vật tăng lên. Cách thực hiện: Sau khi đã lọc bớt nước từ khối bột rắc đều hỗn hợp men giống và 18
  21. thuốc bắc với tỉ lệ bột gạo, thuốc bắc và men giống là 100 g gạo : 1g thuốc bắc : 1,5g men giống rồi trộn đều. Tiếp đó thêm nước với tỉ lệ thích hợp để độ ẩm của khối bột khoảng 53%. Sau đó định hình thành dạng viên, đặt vào các khay. Ủ Mục đích: Để cho hệ nấm men, nấm mốc sử dụng dinh dưỡng từ tinh bột, thuốc bắc sinh trưởng và phát triển trong môi trường tối ưu của chúng. Các biến đổi: Vật lý: Khối bột nở xốp ra, bề mặt nhăn do độ xốp tăng cộng với sự phát triển của nấm mốc. Sinh học: Bào tử nấm men, nấm mốc phát triển mạnh mẽ. Nhiệt độ tăng lên và sự phát triển của nấm men, nấm mốc toát ra một mùi thơm rượu dịu nhẹ rất đặc trưng. Cách thực hiện: Sau khi khối bột được tạo hình thành các viên trên các khay đã lót trấu, chúng ta sử dụng một khay úp lên mặt trên các khay có chứa bột đã tạo hình. Tiếp đó dùng chăn hoặc sử dụng vải để quấn quanh khối bột nhằm giữ nhiệt cho khối bột để tạo môi trường thích hợp cho nấm men, nấm mốc và đồng thời giữ ẩm cho môi trường. Sau đó giữ ấm khối bột ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 24h. Các làng nghề truyền thống do ủ thủ công không có định được nhiệt độ nên không thể cố định được thời gian. Hong khô Mục đích: Nhằm giảm độ ẩm của bánh men để tiện cho quá trình bao gói và bảo quản được lâu dài. Cách thực hiện: Sau khi kết thúc quá trình ủ đem các bánh men thành phẩm để trong nơi thoáng mát trong phòng từ 1 đến 2 ngày rồi đem sấy khô. 2.3. Nấm mốc – Vi sinh vật có khả năng đường hoá. Nấm mốc thuộc về nhiều họ trong nhóm nấm (Fungi) được xếp chung là vi nấm. Chúng là các giống nấm hiển vi, tế bào có hoặc không có vách ngăn, phát triển thành hệ sợi (mixen). Nấm mốc chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí, sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào cơ chất và hút các chất dinh dưỡng ở trong đó (khuẩn ty cơ chất), trong khi đó một phần hệ sợi nấm phát triển trên bề mặt của cơ chất ( khuẩn ty khí sinh). Nấm mốc sinh sản bằng khúc sợi nấm hoặc bằng bào tử ( sinh sản vô tính), ngoài ra cũng có thể 19
  22. sinh sản hữu tính. Đặc biệt là nấm mốc khi phát triển trên cơ chất (nuôi bề mặt hoặc nuôi về sâu) luôn tiết ra một lượng lớn enzyme thủy phân nhằm phân cắt các polysaccharite của cơ chất đó thành các đơn vị mà nấm mốc có thể hấp thu được. Chính nhờ đặc tính này, nấm mốc đã được dùng nhiều trong ngành sản xuất chế phẩm enzyme (amylase, protease, pectinase, ) 2.3.1. Cấu tạo và hình thức sinh sản. 2.3.1.1. Cấu tạo. Hầu hết màng tế bào nấm có chất kitin, chất dự trữ hydrat carbon của nấm là chất glycogen. Đặc biệt trong tế bào nấm rất giàu các chất có hoạt tính sinh học (enzyme) và rất giàu kháng sinh (Nguyễn Đức Lượng, 1996). Cấu tạo thành tế bào: polisaccharite (80÷90%), lipit (3÷8%), hexozamin (1÷3%), protein (4%), chất màu (melanin). + Loại nấm mốc có vách ngăn: Khuẩn ty của loại nấm mốc này được tạo thành do một chuỗi tế bào nối tiếp nhau. Ngăn cách hai tế bào là một màng ngăn. Mỗi tế bào nấm hầu như có đủ cơ quan của một tế bào trong đó quan trọng là có nhân. + Loại nấm không có vách ngăn: Đây là những loại nấm đa hạch không có màng ngăn. 2.3.1.2. Hình thức sinh sản. - Sinh sản sinh dưỡng: + Phát triển bằng khuẩn ty: Khuẩn ty của nấm mốc có thể có một hay nhiều tế bào hình cầu có màng dày bao bọc, bên trong có nhiều chất dự trữ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, các tế bào này sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới. + Sinh sản bằng hạch nấm: Trong một số loài nấm lại có khả năng tạo thành hạch nấm. Bên trong hạch nấm là một tổ chức sợi xốp vfa thường có màu trắng. Hạch nấm có thể giúp cơ thể nấm qua những điều kiện khó khăn. Khi gặp điều kiện thuẩn lợi chúng lại phát triển bình thường. - Sinh sản vô tính: Đây là kiểu sinh sản chủ yếu bằng bào tử, các bào tử có thể được tạo thành từ những phương pháp sau: + Do sự cắt đoạn của các sợi nấm. 20
  23. + Từ tế bào sinh bào tử bằng cách nảy chồi và đồng thời bản than các bào tử sinh ra ở kiểu này chúng có khả năng nảy chồi để tạo thành bào tử tiếp theo. + Tạo bào tử bằng cách ngăn vách với tế bào ngay khi bào tử mới hình thành và hoàn toàn không có khả năng sinh ra được những bào tử tiếp theo. - Sinh sản hữu tính: hai đầu sợi nấm tiếp hợp với nhau rồi mọc lên một cơ thể mới (Nguyễn Đức Lượng, 1996). 2.3.2. Một số nấm mốc có khả năng đường hóa trong sản xuất rượu. - Rhizopus: Có nhiều loài R.japonicus, R.oryzae, R.peka II, R.tonkinensis Rhizopus có đặc điểm sinh trưởng “giả chi” để lan rộng trên bề mặt môi trường. Ở chỗ có giả căn, thân bò tiếp tục phát triển và sinh ra các cuống bào tử nang chứa nhiều bào tử. Lúc non bào tử trắng, lúc già màu đen, bên trong có nhiều bào tử. Bào tử hình trứng hay bán cầu, mặt có nếp nhăn, kích thước 5÷8µm. Nhiệt độ phát triển thích hợp 32÷34°C. Rhizopus thường được nuôi trên môi trường lỏng giàu dinh dưỡng và có thông khí, hệ enzyme amylase tương đối hoàn chỉnh. Thường được dùng trong sản xuất rượu theo phương pháp amyloza và nuôi cấy nấm mốc lỏng (Nguyễn Lân Dũng, 2002). - Mucor: Rất giống Rhizopus song có thể phân biệt ở 3 điểm: Mucor không có giả căn, cuống bào tử nang có thể sinh ra ở bất kì chỗ nào và nang trụ không có hình bán cầu, không sát nách với vách bào tử nang. Trong sản xuất rượu thường có nhiều loại Mucor nhưng ở nước ta thường gặp Mucor rouxii. Ở Mucor rouxii, ngoài hệ enzyme amylase còn có enzyme rượu hóa nên trong điều kiện yếm khí, enzyme của chủng này có thể biến đường thành rượu. Khuẩn ty của Mucor rouxii phân nhánh nhiều, không vách ngăn, đa hạch, khuẩn lạc cao, không nếp nhăn. Cuống bào tử nang phân nhánh không có thứ tự nhất định, bào tử nang thường tròn, đường kính 60÷80µm. Nang trụ 20÷50µm. Bào tử tròn đường kính 6÷7µm. Khuẩn ty lúc non màu trắng, già có màu xám nhạt. Bào tử nang từ màu trắng chuyển dần sang màu hơi vàng, đỏ xám, đen, làm cho khuẩn lạc xám dần. Chủng Mucor rouxii thường được dùng cho phương pháp amyloza (Nguyễn Lân Dũng, 2002). - Penicillium sp: Là nấm mốc có cấu tạo đa bào, hệ sợi có vách ngăn, bộ phận mang bào tử phân nhánh hình chổi. Cuống có thể phân nhánh 1,2,3 tầng trên đó là các thể bình rồi đến bào tử đính. Có khả năng sinh cellulose. 21
  24. - Aspergillus oryzae: Là nấm mốc có cấu tạo đa bào, hệ sợi có vách ngăn. Khi mới phát triển hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển dần sang lục, khi già có màu vàng hoa cau. Phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng từ 15°C - 40°C, nhiệt độ tối ưu là 30 °C - 32°C. Chúng có khả năng sinh enzyme rất mạnh, trong đó chủ yếu là các loại enzyme amylase, protease, maltase. - Aspergillus niger: Là nấm mốc có cấu tạo đa bào, hệ sợi có vách ngăn. Khi mới phát triển hệ sợi có màu trắng, sau đó sẫm lại nhưng không hoàn toàn đen. Bào tử của chúng có màu đen tuyền. Từ cuống đầu tiên mọc tiếp 2÷4 nhánh cuống nhỏ rồi mới tiếp đến các đính bào tử. Nấm sợi này có khả năng tạo ra rất nhiều loại enzyme khác nhau như: amylase, maltase, protease, pectinase, cellulose. Mốc này có thể chịu được pH thấp, nhiệt độ thích hợp từ 30÷32°C và phát triển trên môi trường tinh bột. - Aspergillus flavus: là nấm mốc có cấu tạo đa bào, hệ sợi có vách ngăn. Lúc đầu khuẩn lạc có màu vàng sáng, sau chuyển thành màu nâu oliu. Kích thước nhỏ hơn Aspergillus oryzae, các tầng cuống hình chùy mang đính bào tử và khuẩn lạc có màu trội về màu xanh lục hơn. Mốc này sinh ra các hệ enzyme giống Aspergillus oryzae. 2.3.3. Phương pháp nuôi cấy. 2.3.3.1. Phương pháp nuôi cấy bề sâu. Nấm mốc nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng lỏng, có không khí. Khuẩn ty thể hình thành được phân bố và lơ lửng trong môi trường. Đặc biệt, trong quá trình nuôi cấy, enzyme amylase được khuếch tán ra môi trường. Trong sản xuất bánh men rượu truyền thống ở nước ta, vì điều kiện sản xuất còn bị hạn chế nên phương pháp nuôi cấy bề mặt sẽ có nhiều ưu điểm hơn cả vì đơn giản, phù hợp với sản xuất thủ công, yêu cầu kỹ thuật nuôi cấy không đòi hỏi cao, do đó mag phương pháp này được nhân dân áp dụng là chủ yếu. 2.3.3.2. Phương pháp nuôi cấy bề mặt. Trong sản xuất, mốc giống ban đầu trước khi đưa vào môi trường sản xuất cần phải được nhân giống. Mốc giống được nuôi cấy trên môi trường thạch – malt 7÷8 ngày, sau đó chuyển vào bình tam giác 500ml trên môi trường cám mì (hoặc ngô, tấm gạo, ) đã được thanh trùng trong 1 giờ, nuôi ở 30°C trong 3 ngày, sau đó chuyển sang nuôi trên khay 22
  25. nhôm hoặc mành. Nuôi mốc trên khay trong các buồng 28÷32°C có thông gió và giữ độ ẩm không khí 90÷95%. Thời gian nuôi mốc từ 36÷48 giờ và kết thúc khi mốc sinh bào tử nhiều. Đây chính là mốc trung gian dùng để cấy trộn vào môi trường sản xuất tiếp theo. Trong quá trình nuôi cần chú ý lật và bẻ nhỏ cám vì hệ sợi mốc phát triển làm cơ chất kết thành bánh. (Lương Đức Phẩm, 1998) Môi trường nuôi cấy phải có tỉ lượng thích hợp giữa các thành phần, chất lượng để thu được chế phẩm enzyme thô (glucoamilase) có hoạt lực là cao nhất. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi nấm mốc trực tiếp trên bề mặt của hạt gạo, hạt mì, đã được thanh trùng hấp chin. Nói chung trong tất cả mọi trường hợp, vi sinh vật lấy thức ăn từ những chất chứa trong môi trường và sử dụng oxy phân tử của không khí để hô hấp. Môi trường để nuôi cấy nấm mốc phải có đủ chất dinh dưỡng cần thiết, có cấu trúc tơi xốp trong trạng thái ẩm và nhiệt độ thích hợp cho nấm mốc phát triển. 2.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy. 2.3.4.1. Độ ẩm môi trường. Trong điều kiện sản xuát độ ẩm ban đầu thích hợp đối với giống Aspergillus là 58÷60% và giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50÷55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như việc tạo glucoamilase (Rodzevich, 1973). 2.3.4.2. Nhiệt độ nuôi cấy. Toàn bộ chu trình phát triển của nấm mốc trên môi trường cám có thể chia thành ba thời kì sau: + Trong 10÷14 giờ đầu, xảy ra sự trương đính bào tử và bắt đầu mọc nấm. Trong thời kì này phòng nuôi cấy cần giữ ở nhiệt độ không dưới 28÷30°C để không kìm hãm sự phát triển ban đầu của nấm mốc. + Qua thời gian trên, hệ sợi nấm bắt đầu phát triển nhanh. Thời kì này kéo dài trong 14÷18 giờ. Nấm mốc phát triển mạnh mẽ, sử dụng một lượng lớn các chất dinh dưỡng, hô hấp rất mạnh và lượng nhiệt thoát ra nhiều. Vì vậy, trong lớp canh trường nhiệt độ tăng lên đến 37÷40°C và có thể còn cao hơn tùy thuộc vào độ dày của lớp. Do đó cần phải thôi không khí điều tiết có nhiệt độ không thấp hơn 28÷29° và có độ ẩm tương đối cực đại. 23
  26. + Thời kì thứ ba kéo dài trong 10÷20 giờ. Trong thời kì này, quá trình trao đối chất xảy ra không mạnh mẽ lắm và dần dần yếu đi, lượng nhiệt thoát ra bé hơn, nhưng tạo nên enzyme khá mạnh, kéo dài. Phụ thuộc vào tính chất sinh lý của chúng và sự kết thúc sinh tổng hợp enzyme, mà có thể ngừng sự phát triển của nấm mốc vào một thời gian bất kỳ. Vậy nhiệt độ tối thích cho sinh tổng hợp amylase trên môi trường rắn là 28÷32°C. Nhiệt độ dưới 24°C hoặc trên 45°C nấm mốc phát triển chậm, thời gian nuôi kéo dài, giảm khả anwng sinh tổng hợp amylase (Đặng Thị Thu, 1989). 2.3.4.3. Thời gian nuôi . Quá trình nuôi nấm mốc thường kéo dài từ 35÷48 giờ tùy thuộc vào thời gian hoàn thành việc tạo ra enzyme. Ở một số loài Aspergillus, sự tạo thành lượng enzyme tối đa sẽ trùng với sự bắt đầu tạo ra đính bào tử, do đó cho ngừng quá trình phát triển vào lúc này là thích hợp nhất. Trong một số trường hợp khác, sự tích lũy enzyme có thể còn tiếp tục kéo dài trong cả thời gian tạo ra đính bào tử một cách mạnh mẽ. Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng vi sinh vật vì sự ngừng tổng hợp enzyme có thể làm ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào cần thiết. Do nhu cầu cần mốc giống nên khi nuôi, ta chọn thời điểm mà mốc phát triển mạnh nhất để thu được nhiều sinh khối bào tử để khi đưa vào bánh men thì nấm mốc sẽ thích nghi sớm và phát triển mạnh, ở điều kiện thích hợp sẽ tạo được nhiều glucoamilase có hoạt lực cao như mong muốn. 2.3.4.4. pH môi trường. Nuôi bằng phương pháp bề mặt thì pH không thay đổi đáng kể trong quá trình nuôi do môi trường có dung lượng cao và hàm ẩm thấp. Khống chế các điều kiện nuôi cấy thích hợp, nhiệt độ các buồng 28÷32°C có thông gió và giữ độ ẩm không khí 90÷95%, trong quá trình nuôi cấy cần lật và bẻ nhỏ cám vì hệ sợi mốc phát triển làm cơ chất kết thành bánh. Nuôi tới khi mốc sắp đến giai đoạn tạo thành bào tử, độ ẩm canh trường 40÷50%. Đem sấy khô không quá 45°C cho tới độ ẩm 10÷12% và nghiền nhỏ. Đựng mốc trong các bao hoặc thùng kín, bảo quản ở chỗ mát (≤20°C) và để dùng dần. 24
  27. 2.4. Tầm quan trọng của việc sử dụng chế phẩm bánh men vi sinh thuần chủng trong sản xuất rượu truyền thống. Trước đây, ở hầu hết các nước rượu được sản xuất theo kinh nghiệm gia truyền, qui mô sản xuất nhỏ, theo lối thủ công, sử dụng nguồn vi sinh vật hoàn toàn tự nhiên. Do đó chất lượng sản phẩm không ổn định, phụ thuộc hoàn toàn vào điều kiện thời tiết, môi trường, kinh nghiệm người sản xuất, không quản lý được nguồn vi sinh vật tự nhiên cho lên men, điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm không được đáp ứng. Quy trình sản xuất tiềm ẩn nhiều mối nguy. Hiện nay, cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, tại các nước phát triển các sản phẩm lên men truyền thống đã được duy trì và phát triển một cách bền vững bằng việc ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật công nghệ vào thực tế sản xuất và quy trình sản xuất được kiểm soát một cách chủ động. Một trong những kỹ thuật được nhiều nước áp dụng nhất là việc sử dụng giống khởi động thuần chủng. Ở Việt nam, vẫn chưa có một cơ sở sản xuất bánh men rượu truyền thống nào mang tính chất quy mô công nghiệp mà chủ yếu là những hộ kinh doanh nhỏ lẻ, không đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, chất lượng bánh men không ổn định, hiệu quả lên men không cao. Do đó, việc sử dụng các chế phẩm bánh men vi sinh vật thuần chủng vào sản xuất không chỉ giúp cho quá trình sản xuất dễ cơ giới hóa, dễ kiểm soát, mà còn tạo ra các sản phẩm chất lượng luôn ổn định, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm mà vẫn duy trì được các đặc điểm truyền thống của sản phẩm. 25
  28. PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu men gốc Đức Ngọ và men Thái Nguyên được lấy từ xưởng sản xuất Bộ môn Công nghệ đồ uống – Viện Công Nghiệp Thực Phẩm. 3.2. Phạm vi nghiên cứu 3.2.1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất  Thiết bị: - Máy ly tâm. - Kính hiển vi điện tử Nikon eclipe e800 (Nhật Bản). - Máy nuôi lắc ổn nhiệt SHELLAB 1575R (Mỹ). - Nuôi ổn nhiệt Heraus (Đức). - Nồi hấp khử trùng HIRAYAMA ( HICLAVE HV-110) ( Nhật Bản). - Tủ cấy vi sinh Sanyo BIOCLEAN BENCH ( Nhật Bản). - Máy votec. - Cân 4 số Meter TOLEDO A B204-S ( Thụy Điển). - Cân 3 số Sartorius BL310 ( Đức). - Tủ sấy dụng cụ thiết bị BINDER ( Đức). - Tủ lạnh Electrolux (Nhật). - Bộ cất cồn.  Dụng cụ: - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml. - Ống đong hình trụ bằng thủy tinh. - Bình định mức 50ml, 100ml, 500ml. - Bình tam giác 250ml. - Buret 25ml khắc vạch 0,1ml. - Cốc đong. - Ca nhựa 1500ml, 2000ml. - Bình schott, ống nghiệm, đĩa petri, ống falcon. - Lọ nhựa, rổ, khay nhựa. 26
  29.  Hóa chất: - NaOH 0,1N. - Phenol phtalein. - Lugol. - Tinh bột. - NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl, FeSO4.  Môi trường cần chuẩn bị: + Môi trường Czapeck-dox : NaNO3 - 2g , KH2PO4 - 1g, KCl – 1g, MgSO4.7H2O - 0,5g, FeSO4.7H2O - 0,01g, Agar – 20g , Nước cất – 1000ml, Saccarose – 30g. (TCVN 9298:2014) 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ đồ uống – Viện Công Nghiệp Thực Phẩm. 3.2.3. Thời gian nghiên cứu Thời gian nghiên cứu đề tài từ 01/2019 đến tháng 5/2019. 3.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống. Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus tuyển chọn được. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu của quá trình lên men rượu. Thử hoạt lực bột mốc thu được từ chủng nấm mốc tuyển chọn được. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm 3.4.1.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống. Men Đức Ngọ và men Thái Nguyên được mang về phòng thí nghiệm tiến hành đem phân lập chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus trên môi trường 27
  30. Czapeck - dox. Tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus phân giải tinh bột tốt nhất. Các chỉ tiêu theo dõi: Phân lập ra chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium, Aspergillus đánh giá và tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột tốt nhất bằng vòng thủy phân tinh bột. 3.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. Sau khi tiến hành phân lập được chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao, chúng tôi tiến hành nhân sinh khối nấm mốc. Tiến hành thí nghiệm: Cấy truyền một ống nghiệm giống mốc đã phân lập được ở trên vào bình tam giác chứa 100ml môi trường nuôi cấy Czapeck-dox. Nuôi lắc rồi đem ly tâm 4000 vòng/ phút trong thời gian 15 phút, thu sinh khối và đem cân lượng sinh khối thu được. Trộn 1 ống sinh khối vừa ly tâm với 100g gạo ta thu được bột mốc. Các thông số điều kiện nuôi lắc: Số vòng lắc, nhiệt độ, thời gian được thay đổi lần lượt theo từng thí nghiệm để nghiên cứu sự ảnh hưởng của điều kiện nuôi lắc đến quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. Bảng 3.1: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định thời gian nuôi lắc nhân sinh khối. Thời gian Số vòng lắc Công thức Nhiệt độ nuôi (°C) (giờ) (vòng/phút) CT2.1.1 24 CT2.1.2 36 30 150 CT2.1.3 48 Bảng 3.2: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi lắc nhân sinh khối. 28
  31. Nhiệt độ Thời gian Số vòng lắc Công thức (°C) (giờ) (vòng/phút) CT2.2.1 28 CT2.2.2 30 Thời gian được chọn 150 CT2.2.3 32 ở thí nghiệm bảng 3.1 CT2.2.4 35 Bảng 3.3: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định số vòng lắc nuôi lắc nhân sinh khối. Số vòng lắc Nhiệt độ Công thức Thời gian (giờ) (vòng/ phút) (°C) CT2.3.1 100 Thời gian được chọn Nhiệt độ được chọn ở CT2.3.2 150 ở thí nghiệm bảng thí nghiệm bảng 3.2 3.1 CT2.3.3 200 Chỉ tiêu theo dõi: - Lượng sinh khối thu được. 3.4.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu. - Hoạt hóa men khô: 0,5g men : 0,5g Glucose. Nhiệt độ 30°C -33°C trong vòng 30 phút. - Nấu 100g gạo nứt với 120g nước đem trộn với lượng bột mốc theo các tỷ lệ theo công thức như trong bảng 1, cho cơm rượu vào rổ đậy khăn ẩm ủ lên men ẩm ở 30°C trong 29
  32. 24h đầu, 24h tiếp theo cho cơm rượu vào bình, sau 24h đem lên men dịch cho 200ml nước vào bình lên men ở nhiệt độ 28°C. Bảng 3.4: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm nghiên cứu tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu. Công thức Tỷ lệ bột mốc (gam) CT3.1 1 CT3.2 1,5 CT3.3 2 CT3.4 2,5 Các chỉ tiêu theo dõi: - Độ cồn của dịch lên men. - Độ chua của dịch lên men. - Hàm lượng chất khô (TSS). 3.4.1.4. Thí nghiệm 4: Thử hoạt lực bột mốc từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. Mẫu 1 (CT4.1): Hoạt hóa men khô: 1g men : 1g Glucose. Nhiệt độ 30°C -33°C trong vòng 30 phút. - Nấu 100g gạo nứt với 120g nước đem trộn với lượng bột mốc theo các tỷ lệ tìm được ở thí nghiệm 3, cho cơm rượu vào rổ đậy khăn ẩm ủ lên men ẩm ở 30°C trong 24h đầu, 24h tiếp theo cho cơm rượu vào bình, sau 24h đem lên men dịch cho 200ml nước vào bình. Mẫu 2 (CT4.2): Nấu 100g gạo nứt với 120g nước đem trộn với 1,5g lượng bánh men gốc ban đầu, cho cơm rượu vào rổ đậy khăn ẩm ủ lên men ẩm ở 30°C trong 24h đầu, 24h tiếp theo cho cơm rượu vào bình, sau 24h đem lên men dịch cho 200ml nước vào bình. Các chỉ tiêu theo dõi: - Độ cồn của dịch lên men. - Độ chua của dịch lên men. - Hàm lượng chất khô (TSS). 30
  33. 3.4.2. Phương pháp phân tích 3.4.2.1. Các phương pháp vi sinh a. Phân lập vi sinh vật Nguyên lý: Một lượng nhỏ vi sinh vật đã được pha loãng trước được dàn đều lên trên bề mặt hộp petri có chứa môi trường phân lập. Tiến hành: Môi trường agar nóng chảy được đổ vào hộp petri đã vô trùng, để cho đặc lại. Dùng pipetman hút 100µl dung dịch hỗn hợp vi sinh cần phân lập ở các nồng độ khác nhau cho vào hộp petri chứa môi trường agar ở trên. Sau đó dùng que trang vô khuẩn dàn đều ra khắp bề mặt. Lật ngược hộp peptri để nuôi trong tủ ấm ở 30℃. Sau khoảng 24h bắt đầu theo dõi quan sát và tách rời các khuẩn lạc trên môi trường đặc. b. Phương mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, hình dạng bào tử, đính bào tử của các chủng nấm mốc Hình dạng khuẩn lạc được quan sát ở mặt trước và mặt sau sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường Czapeck-dox. Hình thái tế bào, khuẩn ty, đính bào tử được quan sát trên kính hiển vi sau 48 giờ nuôi cấy. Phân loại chủng nấm mốc phân lập dựa vào khóa phân loại nấm mốc và tài liệu của Barnett(1973). c. Phương pháp xác định số lượng nấm mốc trong chế phẩm Số lượng vi sinh vật được xác định bằng phương pháp trang cấy trên các đĩa peptri với các môi trường tương ứng. Môi trường được chọn có cơ chất đặc hiệu cho loài phát triển. Sau một thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường và dựa vào tỉ lệ pha loãng cùng thể tích ban đầu đem cấy từ đó suy ra khuẩn lạc có trong 1ml mẫu. Dùng môi trường Czapeck-dox để định lượng nấm mốc. d. Giữ giống vi sinh vật Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa môi trường agar đông đặc. Cấy truyền vi sinh vật sang ống nghiệm và để một thời gian ở nhiệt độ tối ưu cho vi sinh vật phát triển. Sau đó đem bảo quản ở nhiệt độ lạnh ( khoảng 4℃). 3.4.2.2. Các phương pháp hóa sinh a. Xác định độ rượu: Sử dụng bộ cất cồn. Hàm lượng cồn trong rượu được xác định bằng bộ xác định độ cồn thông qua đo 31
  34. điểm sôi của dung dịch (Lê Thanh Mai, 2005). Nguyên lý: Trong dịch lên men thường chứa một lượng cồn và một số chất bay hơi khi đun nóng. Cồn có nhiệt độ sôi thấp hơn nước cất, dung dịch sẽ có độ sôi nhất định, từ đó tra bảng (đã được tính sẵn) cho biết độ cồn trong dịch theo thể tích. Cách tiến hành: Đầu tiên đo nhiệt độ sôi của nước cất. Chuẩn bị nước làm mát ống sinh hàn, lắp nhiệt kế vào đầu bình gia nhiệt sao cho đầu trên của thanh gia nhiệt cách bầu thủy phân dưới 1,5 - 2 cm. Dùng nước cất hai lần để tráng bình cất. Cho nước cất hai lần vào bình cất sao cho bề mặt lõm của nước cất tiếp xúc với mép trên của vạch định mức (thể tích mẫu khoảng 50 ml). Bật lửa để đốt đèn cồn, sau 6 - 10 phút khi nhiệt độ tăng lên dần và ổn định thì đọc nhiệt độ sôi và ghi lại, tắt máy và tháo nước ra. Tiếp theo tiến hành đo nhiệt độ sôi của rượu. Tráng bình cất mẫu rượu và thực hiện cất rượu giống như phần cất nước ở trên. Tính kết quả: Dùng bảng chuẩn tra (kèm theo máy) để xác định độ rượu dựa trên nhiệt độ sôi. Cách tra như sau: ta xoay vòng sao cho nhiệt độ sôi của nước cất hai lần trùng với giá trị độ rượu bằng 0% (v/v). Sau đó từ giá trị nhiệt độ sôi của mẫu rượu đọc trên nhiệt kế tra bảng suy ra nồng độ rượu theo % (v/v). b. Xác định độ chua của dịch lên men: Phương pháp trung hòa Nguyên lý: Một độ chua là số ml NaOH có nồng độ 1N cần thiết để trung hòa axit tự do chưa trong 20ml dịch giấm. Nếu số ml NaOH quy về 1N bằng 1, ta nói dịch giấm chín có độ chua bằng 1. Một độ chua tương đương với 2,45g H2SO4/lit. Tiến hành: Lấy 20ml dung dịch lọc của giấm chín hoặc dịch lên men cho vào bình tam giác chứa sẵn 50ml nước cất. Tiếp theo dùng NaOH 0,1N để chuẩn độ đến khi xuất hiện màu hồng nhạt với chất chỉ thị là phenolphtalein. Tính kết quả: Độ chua được tính theo công thức: n Độ chua = (độ) 10 Trong đó: n: Là số ml NAOH 0,1N tiêu hao khi định phân 20ml dịch lọc. Trong điều kiện lên men bình thường, độ chua (độ axit) của dịch giấm chín tăng 32
  35. khoảng 0,5 đến 0,7 g/l so với độ chua của dịch đường hóa (Lê Thanh Mai, 2005). c. Xác định nồng độ chất hòa tan (TSS) Xác định TSS trong thời gian lên men dịch: xác định bằng chiết quang kế tự động DIGITAL REFACTOMETER – ATAGO (Nhật Bản) 0-53% Brix (± 0.2) theo TCVN 7771:2007. Nguyên lý: Dựa vào nguyên lý khúc xạ của ánh sáng: khi ánh sáng đi từ môi trường không khí vào một môi trường chất lỏng, tia sáng sẽ bị lệch đi. Dựa trên độ lệch của tia sáng ta có thể xác định được nồng độ chất hòa tan có trong dung dịch. Tiến hành: Nhỏ vài giọt nước cất vào chiết quang kế điện tử, nhấn start chỉnh về mức 0.0 hàm lượng chất khô. Lau sạch nước nhỏ vài giọt mẫu lên chiết quang kế điện tử, nhấn start, đọc số hiện thị trên chiết quang kế. Tính kết quả: Đọc kết quả hiển thị, đó chính là hàm lượng chất khô tính theo % của mẫu đem phân tích. d. Xác định khả năng phân giải tinh bột Xác định bằng đường kính vòng thủy phân tinh bột của các chủng trên môi trường thạch đĩa có chứa tinh bột. Tiến hành: Chuẩn bị môi trường Czapeck (0,5% tinh bột) cho 40 đĩa petri 20ml (800ml). Hấp khử trùng 121℃ trong 30 phút, pH 5.0-5.5. Cho 20ml môi trường trên vào đĩa peptri đã vô trùng, các đĩa petri bằng nhau. Làm nguội, dùng que cấy chấm nhẹ các mẫu mốc vào giữa đĩa petri. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ. Cho thuốc thử và đo đường kính vòng phân giải Thuốc thử lugol : 1g I2 và 0,5g KI trong 100ml nước cất, lắc cho tan hết. e. Phương pháp trích ly enzyme amylase. Cân 5 gam sinh khối/ chế phẩm cho vào ống Falcon 50ml, bổ sung thêm 30ml nước cất, nuôi lắc 3 giờ tốc độ 180 vòng/ phút. Ly tâm 6000 vòng /phút trong 10 phút. Lấy dịch ở phía trên thu được dịch chiết ly enzym. 3.4.2.3 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê trên phần mềm Excel và Minitab 18. 33
  36. IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chủng giống bánh men là một yếu tố rất quan trọng quyết định đến chất lượng rượu, nồng độ rượu. Việc lựa chọn loại bánh men giống là bước đầu tiên vô cùng cần thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên hai mẫu men Đức Ngọ và Thái Nguyên cho độ rượu tốt và mùi thơm đặc trưng. 4.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống. 4.1.1. Phân lập nấm mốc trong bánh men. Hệ vi sinh vật trong bánh men rất phong phú bao gồm : nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Các chủng nấm mốc trong bánh men đóng vai trò sinh enzyme amylaza để thủy phân tinh bột, lượng đường do enzyme amylaza thủy phân tinh bột tạo ra là yếu tố quan trọng quyết định đến lượng cồn được tạo ra khi lên men. Do đó, tôi sẽ tập trung vào phân lập và tuyển chọn được chủng nấm mốc có khả năng đường hóa cao. Đầu tiên, tiến hành phân lập nấm mốc trong bánh men. Sử dụng môi trường tối ưu cho nấm mốc là môi trường Czapeck-dox. Khi tách được các khuẩn lạc riêng biệt, nuôi cấy tạo giống thuần chủng. Sau đó tiến hành làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi. Kết hợp việc quan sát hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào với khóa phân loại để phân loại nấm mốc và tài liệu của Barnett(1973). Kết quả thu được như sau: Bảng 4.1: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ bánh men Đức Ngọ. Chủng vi STT Kí hiệu Tên chủng Hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào sinh vật Hệ sợi rất phát triển, Khuẩn ty đơn bào ban đầu màu trắng, không có vách ngăn, 1 ĐN01 Nấm mốc Mucor sau đó sẫm hơn và bào tử kín. Đầu sợi ngả sang màu đen. nấm là cuống bào tử nang. Nang bào tử hình cầu, khi thành 34
  37. của nang bào tử nứt ra giải phóng bào tử. Khuẩn lạc hình tròn, Khuẩn ty phân nhánh, sợi mảnh, ngắn, có có vách ngăn ngang, màu vàng hoa cau, bào tử trần, cuống khi già có màu xanh mang bào tử phát triển ĐN02 lục. từ tế bào chân, phần Aspergillus 2 ĐN03 Nấm mốc cuối phồng lên thành 1 oryzae cái bọng (vesicle), trên ĐN04 bọng mọc lên các thể bình, trên thể bình sinh ra các chuỗi bào tử xòe ra như bông hoa cúc. Khuẩn lạc hình tròn, Khuẩn ty phân nhánh, sợi mảnh, ngắn, có có vách ngăn ngang, ĐN05 màu đen. bào tử trần, cuống mang bào tử phát triển ĐN06 từ tế bào chân, phần Aspergillus 3 ĐN07 Nấm mốc cuối phồng lên thành 1 niger cái bọng (vesicle), trên ĐN08 bọng mọc lên các thể ĐN09 bình, trên thể bình sinh ra các chuỗi bào tử xòe ra như bông hoa cúc. ĐN10 Khuẩn lạc hình tròn Khuẩn ty đa nhân có 4 Nấm mốc Penicilium sợi rất ngắn, có màu vách ngăn, bào tử trần, ĐN11 xanh nhạt,ở trung cuống mang bào tử 35
  38. tâm lồi lên, có những hình thành ngay lớp rãnh từ trung tâm đi thể bình và các bào tử. ra. Khuẩn ty có màu Khuẩn ty đơn bào, đen, rễ cắm sâu vào hông có vách ngăn, cơ chất, ban đầu có bào tử kín. Trên khuẩn 5 ĐN12 Nấm mốc Rhizopus màu trắng, sau đó có ty hình thành những màu đen hoàn toàn. nút (đế chồi) mọc những rễ cắm sâu vào cơ chất. Bảng 4.2: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ bánh men Thái Nguyên. Chủng vi STT Kí hiệu Tên chủng Hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào sinh vật TN01 Khuẩn lạc hình tròn Khuẩn ty đa nhân có sợi rất ngắn, có màu vách ngăn, bào tử trần, TN02 xanh nhạt,ở trung cuống mang bào tử TN03 tâm lồi lên, có những hình thành ngay lớp 1 Nấm mốc Penicilium rãnh từ trung tâm đi thể bình và các bào tử. TN04 ra. TN.B TN.H Khuẩn ty có màu Khuẩn ty đơn bào, 2 TN05 Nấm mốc Rhizopus đen, rễ cắm sâu vào hông có vách ngăn, cơ chất, ban đầu có bào tử kín. Trên khuẩn màu trắng, sau đó có ty hình thành những 36
  39. màu đen hoàn toàn. nút (đế chồi) mọc những rễ cắm sâu vào cơ chất. Khuẩn lạc hình tròn, Khuẩn ty phân nhánh, sợi mảnh, ngắn, có có vách ngăn ngang, TN06 màu vàng hoa cau, bào tử trần, cuống TN.A khi già có màu xanh mang bào tử phát triển lục. từ tế bào chân, phần TN.C Aspergillus 3 Nấm mốc cuối phồng lên thành 1 oryzae TN.D cái bọng (vesicle), trên TN.E bọng mọc lên các thể bình, trên thể bình sinh TN.G ra các chuỗi bào tử xòe ra như bông hoa cúc. Nhận xét: Kết thúc quá trình phân lập từ hai mẫu bánh men Đức Ngọ và Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập được 1 chủng Mucor, 2 chủng Rhizopus, 8 chủng Penicilium, 10 chủng Aspergillus oryzae và 5 chủng Aspergillus niger. 37
  40. Hình 4.1: Cấu trúc hình thái Hình 4.2: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc chủng nấm mốc Aspergillus Aspergillus oryzae. oryzae. Hình 4.3: Cấu trúc hình thái Hình 4.4: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc chủng nấm mốc Penicilium. Penicilium. 38
  41. Hình 4.5: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Mucor. Hình 4.6: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Mucor. Hình 4.7: Cấu trúc hình thái Hình 4.8: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc chủng nấm mốc Rhizopus. Rhizopus. 39
  42. Hình 4.9: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Aspergillus niger. Hình 4.10: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Aspergillus niger. 4.1.2. Đánh giá sơ bộ khả năng đường hóa của các chủng nấm mốc phân lập được. Từ các chủng nấm mốc phân lập được, tiến hành xác định khả năng phân giải tinh bột của chúng bằng phương pháp cấy chấm điểm mốc ở tâm hộp peptri chứa môi trường Czapeck có bổ sung cơ chất tinh bột, sử dụng dịch chiết emzyme amylase thu được từ các chủng nấm mốc ( mục 3.4.2.1-d, trang 28) để kiểm tra hoạt tính. Nuôi ở nhiệt độ 30°C sau 48 giờ, kiểm tra hoạt tính bằng thuốc thử thuốc thử Lugol và đo đường kính vòng thủy phân tinh bột. Đường kính vòng thủy phân tỉ lệ thuận với khả năng phân bột của nấm mốc. Đường kính càng lớn thì khả năng phân giải tinh bột của chủng nấm mốc đó càng lớn. Kết quả thu được: 40
  43. Bảng 4.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc. STT Chủng mốc Đường kính vòng thủy phân tinh bột 1 Aspergillus oryzae 0,7mm 2 Penicilium 1,5mm 3 Mucor 4,0mm 4 Rhizopus 3,2mm 5 Aspergillus niger 0,7mm Hình 4.11: Vòng phân giải tinh bột của Hình 4.52: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Aspergillus oryzae. chủng nấm Aspergillus niger. 41
  44. Hình 4.63: Vòng phân giải tinh bột của Hình 4.74: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Penicilium. chủng nấm Mucor. Hình 4.85: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Rhizopus. Nhận xét: Từ bảng 3.4 cho thấy, các chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột tốt. Sơ bộ dựa vào đường kính vòng phân giải tinh bột cho thấy chủng nấm Mucor có khả năng phân giải tinh bột tốt nhất có đường kính vòng thủy phân tinh bột là 1,4 cm, sau đó lần lượt là các chủng nấm Rhizopus (1,2cm), chủng nấm Penicillium (0,9cm) và khả năng phân giải tinh bột kém nhất là chủng nấm Aspergillus (0,7cm). Như vậy, chủng mốc Mucor (ĐN01) được lựa chọn cho những thí nghiệm tiếp theo. 42
  45. 4.2. Kết quả nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. Trong quá trình nuôi sinh khối lỏng, các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, thời gian, số vòng lắc đều ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Chúng tôi tối ưu điều kiện nuôi cấy bằng cách xác định lượng sinh khối thu được sau khi kết thúc quá trình nuôi cấy. 4.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. Tiến hành nuôi sinh khối chủng nấm mốc ĐN01 trên môi trường Czapeck lỏng ở nhiệt độ 30°C, số vòng lắc 150 vòng/phút. Trong khoảng 24÷48 giờ, lấy mẫu ra cân lượng sinh khối thu được, kết quả được trình bày ở bảng 4.4: Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. STT Công thức Lượng sinh khối trung bình thu được (g/l) 1 CT2.1.1 6,54b ± 0,965 2 CT2.1.2 10,67a ± 0,992 3 CT2.1.3 10,92a ± 1,008 Kết quả ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01. 12 48, 10.92 10 36, 10.67 8 6 24, 6.54 4 Lượng sinh khối thu được (gam) 2 0 0, 0 Lượng sinh khối (gam) 0 20 40 60 Thời gian nuôi (giờ) Hình 4.16: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01. 43
  46. Nhận xét: Từ bảng 4.4 và đồ thị 4.16 ta thấy, tại thời điểm từ 24÷36 giờ là khoảng thời gian mà chủng nấm mốc ĐN01 phát triển mạnh nhất, gia tăng lượng sinh khối nhiều nhất 4,13g sinh khối. Từ khoảng thời gian 36÷48 giờ, ta thấy chủng nấm mốc ĐN01 phát triển chậm lại, lượng sinh khối gia tăng không nhiều 0,25g. Như vậy ta có thể chọn thời gian nuôi sinh khối vừa tạo ra lượng sinh khối lớn vừa rút ngắn thời gian nuôi sinh khối là 36 giờ. 4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. Tiến hành nuôi sinh khối chủng nấm mốc ĐN01 trên môi trường Czapeck lỏng trong thời gian 36 giờ, số vòng lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ nuôi lần lượt là 28°C, 30°C, 32°C. Kết thúc quá trình nuôi sinh khối lỏng lấy mẫu ra cân lượng sinh khối thu được, kết quả được trình bày ở bảng 4.5: Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. STT Công thức Lượng sinh khối trung bình thu được (g/l) 1 CT2.2.1 10,47ab ± 0,345 2 CT2.2.2 11,75a ± 0,659 3 CT2.2.3 11,46ab ± 0,685 4 CT2.2.4 10,05b ± 0,763 44
  47. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01. 12 30, 11.75 11.5 32, 11.46 11 10.5 28, 10.47 Lượng sinh khối thu được(gam) 10 35, 10.05 Lượng sinh khối (gam) 9.5 0 10 20 30 40 Nhiệt độ (°C) Hình 4.17: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01. Nhận xét: Từ bảng 4.5 và đồ thị 4.16 ta thấy, trong khoảng nhiệt độ từ 30÷32°C chủng nấm mốc ĐN01 phát triển tốt nhất, lượng sinh khối sinh ra nhiều nhất. Trong khoảng nhiệt độ 28°C đến dưới 30°C và trên 32°C không phải là khoảng nhiệt độ tối ưu cho chủng nấm mốc ĐN01 phát triển, lượng sinh khối sinh ra thấp hơn khi cho chủng nấm mốc phát triển ở nhiệt độ 30÷32°C. Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 30°C chủng nấm mốc ĐN01 nhân được nhiều sinh khối nhất. 4.2.2. Ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. Tiến hành nuôi sinh khối chủng nấm mốc ĐN01 trên môi trường Czapeck lỏng ở nhiệt độ 30°C, trong thời gian 36 giờ, số vòng lắc lần lượt là 100, 150, 200 vòng/phút. Kết thúc quá trình nuôi sinh khối lỏng lấy mẫu ra cân lượng sinh khối thu được, kết quả được trình bày ở bảng 4.6: 45
  48. Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. STT Công thức Lượng sinh khối trung bình thu được (g/l) 1 CT2.3.1 8,46c ± 0,894 2 CT2.3.2 12,23b ± 0,824 3 CT2.3.3 14,22a ± 0,527 Kết quả ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01. 16 14 200, 14.22 12 150, 12.23 10 8 100, 8.46 6 Lượng sinh khối thu được (gam) 4 Lượng sinh khối (gam) 2 0 0 50 100 150 200 250 Số vòng lắc (vòng/phút) Hình 4.18: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01. Nhận xét: Từ bảng 4.6 và đồ thị 4.18 ta thấy, khi nuôi lắc nấm mốc ở 200 vòng/phút lượng sinh khối trung bình thu được là lớn nhất. Bởi vì, trong quá trình sinh trưởng và phát triển, oxy cần phải được cung cấp đủ, nếu oxy không đủ vi sinh vật sẽ chết hoặc chuyển sang trạng thái yếm khí. Đối với vi sinh vật hiếu khí và kị khí, tỷ lệ tăng trưởng và trao đổi chất của chúng phụ thuộc vào lượng oxy hòa tan có sẵn trong môi trường. Khi rung lắc bình, chất lỏng sẽ tráng lên thành bình, làm tăng diện tích tiếp xúc với không khí, do vậy sẽ tăng được lượng oxy hòa tan. Rung lắc càng mạnh lượng oxy hòa tan vào môi trường càng lớn. Tuy vậy cũng không nên tăng tốc độ lắc lên quá cao, do tốc độ cao tạo ra ứng suất cắt 46
  49. có thể gây hại cho tế bào vi sinh vật. Bởi vậy, ta chọn số vòng lắc khi nuôi nấm mốc là 200 vòng/phút. 4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu. Quá trình lên men rượu thông thường cần sử dụng bao gồm cả nấm mốc, nấm men và một số loại vi khuẩn. Nguyên liệu gạo sau khi hấp được làm nguội thì bánh men được đưa vào trộn đều, ở giai đoạn lên men ban đầu nhằm mục đích tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đường hóa nhờ nấm mốc và quá trình rượu hóa nhờ nấm men. Trong thí nghiệm này, để nghiên cứu tỷ lệ bột mốc cho vào cơm rượu, tiến hành lên men rượu với tỷ lệ giữa bột mốc cho vào 100g gạo lần lượt là 1g; 1,5g; 2g; 2,5g. Nhiệt độ lên men ẩm: 30°C. Thời gian lên men ẩm: 2 ngày. Nhiệt độ lên men dịch: 28°C. Thời gian lên men dịch: 6 ngày. Lượng nước cho vào để lên men dịch: 200ml. Hình 4.19: Bốn mẫu cơm rượu khi kết bắt đầu quá trình lên men ẩm. 47
  50. Hình 4.20: Bình lên men rượu khi bắt đầu lên men dịch. 4.3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến TSS trong quá trình lên men rượu. Trong quá trình lên men rượu, nấm mốc có vai trò quan trọng thực hiện quá trình đường hóa chuyển các chất có khối lượng cao phân tử thành các chất có khối lượng phân tử thấp hơn (chuyển tinh bột thành đường) và nấm men sẽ chuyển hóa đường có trong dịch lên men thành rượu. Thí nghiệm này nhằm mục đích khảo sát sự thay đổi TSS trong quá trình lên men khi thay đổi tỷ lệ bột mốc và nguyên liệu. Bảng 4.7: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến TSS trong quá trình lên men. TSS sau khi TSS qua các ngày LMD (°Bx) CT kết thúc LMA (°Bx) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 8,8d ± 8,1d ± 7,4d ± 7,1d ± 6,8d ± 6,6d ± CT3.1 15,3d ± 0,058 0,058 0,1 0,10 0,058 0,00 0,00 11,9c ± 10,2c ± 8,5c ± 7,6c ± 7,2c ± 7,0c ± CT3.2 23,8a ± 0,058 0,00 0,058 0,058 0,058 0,058 0,058 12,6b ± 10,4b ± 8,8b ± 8,2b ± 7,9b ± 7,5b ± CT3.3 22,5b ± 0,10 0.058 0,10 0,058 0,00 0,058 0,10 48
  51. 13,8a ± 11,9a ± 9,8a ± 8,6a ± 8,2a ± 7,9a ± CT3.4 20,3c ± 0.058 0,10 0,058 0,058 0,10 0,058 0,00 Nhận xét: Từ bảng 4.7 cho thấy, TSS sau khi kết thúc quá trình LMA là rất cao do trong quá trình LMA, nấm mốc đã chuyển hóa tinh bột thành đường. Trong đó, TSS cao nhất ở CT3.2 với 23,8°Bx. Khi tăng tiếp tỷ lệ nấm mốc lên từ 2-2,5g ở CT3.3 và CT3.4 thì TSS giảm dần lần lượt chỉ còn 22,5°Bx và 20,3 °Bx, bởi vì tỷ lệ nấm mốc cao, lượng nấm mốc nhiều, các nấm mốc sẽ cạnh tranh nhau sử dụng cơ chất môi trường và ức chế nhau khiến cho TSS giảm. Trong quá trình LMD từ bảng 4.7, ta dễ dàng nhận thấy TSS giảm dần qua từng ngày, vì trong quá trình LMD, nấm men chuyển hóa đường thành rượu. Trong đó, độ giảm TSS ở CT3.2 là lớn nhất từ 23,8°Bx xuống còn 7,0°Bx chứng tỏ các chủng nấm mốc phát triển tốt. 4.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ chua trong quá trình lên men rượu. Trong quá trình lên men, bên cạnh nấm men sẽ sản sinh ra khí CO2 và CO2 có tác dụng với nước tạo thành axit làm tăng độ chua của dịch lên men thì vi khuẩn hoạt động mạnh cũng là nguyên nhân gây nên độ chua của dịch lên men cao. Bảng 4.8: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ chua của quá trình lên men. CT Độ chua qua các ngày lên men dịch (độ) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 CT3.1 0.05d ± 0.073d ± 0.09d ± 0.112d ± 0.19d ± 0.2d ± 0,00 0,00058 0,0025 0,00 0,0020 0,00 CT3.2 0.065c ± 0.106c ± 0.158c ± 0.206c ± 0.232c ± 0.248c ± 0,0030 0,0020 0,0020 0,00 0,002 0,00 CT3.3 0.076b ± 0.124b ± 0.212b ± 0.276b ± 0.312b ± 0.332b ± 49
  52. 0,0020 0,00 0,0020 0,0020 0,00 0,0020 CT3.4 0.082a ± 0.149a ± 0.242a ± 0.304a ± 0.343a ± 0.351a ± 0,002 0,0010 0,0020 0,00 0,0025 0,0010 Ảnh hưởng tỷ lệ bột mốc tới độ chua của dịch lên men qua từng ngày 0.4 0.35 0.3 0.25 CT3.1 0.2 CT3.2 0.15 CT3.3 Độ chua (g/ml) 0.1 CT3.4 0.05 0 1 2 3 4 5 6 Hình 4.21: Đồ thị kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ bột mốc tới độ chua của dịch lên men. Nhận xét: Từ bảng 4.8 và hình 4.12 ta thấy, độ chua của dịch lên men tăng dần qua từng ngày. Các công thức có độ chua sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: CT3.4>CT3.3>CT3.2>CT3.1. CT3.4 có độ chua cao nhất 0,351 (độ) và công thức có độ chua nhỏ nhất là CT3.1 với độ chua là 0,2 (độ). Các công thức có độ chua cao có thể là do hệ nấm men hoạt động phát triển tốt sản sinh ra nhiều khí CO2 do quá trình rượu hóa tạo ra. Tuy nhiên từ kết quả bảng 4.7 ta có thể thấy ở 2 công thức CT3.3 và CT3.4 TSS trong quá trình LMD là khá cao, lượng đường có trong dịch lên men khá cao tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển khiến độ chua của dịch lên men tăng nhanh. 4.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ cồn trong quá trình lên men rượu. Nồng độ cồn là chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá hoạt lực lên men rượu. Bánh men có chất lượng tốt là loại bánh men cho ra rượu có chất lượng tốt, hiệu suất cao. Bảng 50
  53. 4.9 dưới đây là kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ cồn của dịch lên men: Bảng 4.9: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ cồn của quá trình lên men. Độ cồn qua các ngày lên men dịch (%V) CT HSLM Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 5.2d ± 8.8d ± 10.5d ± 11.4d ± 12.1c ± 12.3c ± CT3.1 38,2% 0,200 0,00 0,00 0,00 0,115 0,058 7.5a ± 10,0b ± 12,1a ± 13.4a ± 13.9a ± 13.9a ± CT3.2 43,16% 0,00 0,115 0,058 0,00 0,00 0,058 6.9b ± 10.6a ± 11.2c ± 12.4b 12.6b ± 12.6b ± CT3.3 39,13% 0,058 0,00 0,00 ±0,00 0,00 0,058 6.5d ± 9.8c ± 11.4b ± 12.0c 12.0c ± 12.0d ± CT3.4 37,27% 0,00 0,058 0,100 ±0,00 0,00 0,00 Ảnh hưởng tỷ lệ bột mốc tới độ cồn của dịch lên men 16 14 12 10 8 6 Độ cồn Độ(%V) cồn 4 2 0 CT3.1 CT3.2 CT3.3 CT3.4 Công thức Hình 4.22: Đồ thị kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ bột mốc tới độ cồn của dịch lên men 51
  54. Nhận xét: Từ bảng 4.9 ta thấy, hiệu suất lên men của CT3.2 là cao nhất đạt 43,16%, sau đó đến CT3.3 đạt 39,13%, CT3.1 đạt 38,2% và cuối cùng là CT3.4 đạt 37,27%. Như vậy, từ kết quả bảng 4.7, 4.8 và 4.9 ta thấy, TSS của CT3.2 sau khi kết thúc quá trình LMA là cao nhất và độ giảm TSS khi kết thúc quá trình LMD cũng là lớn nhất. Độ chua CT3.1 là thấp nhất tuy nhiên độ cồn và HSLM đạt được sau khi kết thúc LMD lại chỉ đứng thứ 3 sau CT3.3 và CT3.2. Ở CT3.2 ta thấy dù độ chua chỉ thấp thứ 2 sau CT3.1 nhưng độ cồn và HSLM đạt là cao nhất với 13,9 độ cồn và HSLM lên tới 43,16%. 4.4. Kết quả đánh giá hoạt lực bột mốc thu được: Trong thí nghiệm này, để đánh giá hoạt lực của bột mốc thu được, tiến hành lên men rượu mẫu bột mốc thu được so với mẫu bánh men gốc với công thức như sau: + Mẫu 1 (CT4.1): Hoạt hóa men khô: 1g men : 1g Glucose. Nhiệt độ 30°C -33°C trong vòng 30 phút. Nấu 100g gạo nứt với 120g nước đem trộn với 1,5g bột mốc ĐN01. + Mẫu 2 (CT4.2): Nấu 100g gạo nứt với 120g nước đem trộn với 1,5g lượng bánh men gốc ban đầu. Nhiệt độ lên men ẩm: 30°C. Thời gian lên men ẩm: 2 ngày. Nhiệt độ lên men dịch: 28°C. Thời gian lên men dịch: 6 ngày. Lượng nước cho vào để lên men dịch: 200ml. Hình 4.24: Mẫu cơm rượu khi bắt đầu lên men Hình 4.25: Bình lên men rượu khi bắt đầu ẩm. lên men dịch. 52
  55. Phân tích mẫu dịch qua từng ngày thu được kết quả như sau: Bảng 4.10: Kết quả đánh giá hoạt lực của bột mốc so với bánh men Đức Ngọ gốc về một số chỉ tiêu sau 6 ngày LMD. Chỉ CT4.1 CT4.2 tiêu Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 TSS 6,9a ± 7,2a ± 5,5b ± 6,9b ± 7,0a ± 0,00 6,6b ± 0,00 (°Bx) 0,058 0,058 0,058 0,058 Độ 0,248b ± 0,25a ± 0,262b ± 0,352a ± chua 0,3a ± 0,00 0,2b ± 0,00 0,002 0,00 0,002 0,002 (độ) Độ cồn 13,9a ± 13,8a ± 13,5a ± 12,6b ± 13,4b ± 11,6b ± (%V) 0,058 0,00 0,058 0,00 0,00 0,00 HSLM 43,16% 42,86% 41,93% 39,13% 41,62% 36,02% Nhận xét: Qua 3 lần thí nghiệm của mỗi công thức cho thấy, ở CT4.2 với mẫu men Đức Ngọ gốc khi lên men các mẻ ở cùng điều kiện lên men như nhau thì hiệu suất lên men, TSS và độ chua đều có sự chênh lệch nhau rõ rệt. Điều này chứng tỏ khi lên men sử dụng bánh men Đức Ngọ gốc thì kết quả chất lượng rượu không ổn định. Đối với mẫu bột mốc ĐN01 thu được, qua 3 lần lên men cho hiệu suất lên men, TSS và độ chua ở cả 3 mẻ không chênh lệch nhau nhiều cho chất lượng rượu ổn định. So sánh hai quá trình lên men cho thấy hiệu suất lên men rượu và TSS của mẫu bột mốc ĐN 01 cao hơn hẳn, còn độ chua thấp hơn nhiều so với mẫu Đức Ngọ gốc. Qua việc đánh giá sơ bộ chất lượng rượu bột mốc ĐN01 cũng tốt hơn nhiều và quá trình lên men diễn ra đồng đều hơn. Đây chính là cơ sở rất quan trọng để từ đó phương pháp lên men rượu cải tiến có thể được áp dụng với qui mô công nghiệp, tạo ra sản phẩm rượu có chất lượng cao đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. 53
  56. PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận 1. Phân lập và tuyển chọn được chủng nấm mốc có khả năng đường hóa cao là: chủng Mucor (ĐN01). 2. Xác định được điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01 là: - Thời gian nhân sinh khối: 36 giờ. - Nhiệt độ nhân sinh khối: 30°C. - Số vòng lắc nhân sinh khối: 200 vòng/phút. 3. Tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu thích hợp: 1,5g bột mốc/ 100 gạo. 4. Sau 6 ngày lên men dịch, bột mốc cho độ cồn và TSS cao hơn, độ chua thấp hơn so với bánh men Đức Ngọ gốc. Qua 3 mẻ lên men cho thấy chất lượng rượu ổn định hơn. 5.2. Kiến nghị Vì thời gian có hạn nên chưa tiến hành tối ưu hóa quy trình sản xuất rượu từ chủng nấm mốc ĐN01, chưa xác định được thời gian bảo quản bột mốc. Do đó, hướng nghiên cứu tiếp theo chúng tôi đề nghị: - Tối ưu hóa quy trình sản xuất rượu để có thể ứng dụng được vào thực tiễn sản xuất. - Tiếp tục nghiên cứu để tìm ra thời hạn bảo quản của chế phẩm bột mốc. - Nghiên cứu thêm về các phương pháp bảo quản bột mốc. 54
  57. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: [1] Phan Văn Bản và cộng sự (2002), Nghiên cứu ổn định và nâng cao chất lượng rượu cồn từ gạo xuất khẩu, Báo cáo khoa học, mã số 86 – 01RD/HĐ – CNCL, Viện nghiên cứu bia rượu và nước giải khát. [2]. Nguyễn Văn Hiệu (1993), Nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất bánh men cổ truyền và ứng dụng trong sản xuất rượu, Báo cáo khoa học, Đại học Bách Khoa Hà Nội. [3]. Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh, Tập 3– Thực phẩm lên men truyền thống, NXB Đại học quốc gia, Tp.HCM. [4]. Nguyễn Thành Đạt (2004) , Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học Sư Phạm, tập(2) . [5]. Vũ Thị Minh Đức (1999), Thực tập vi sinh vật học, Đại học Quốc gia Hà Nội, trường Khoa học tự nhiên. [6]. Trần Liên Hà (2007) , Đại cương vi sinh vật thực phẩm, NXB Khoa học và Kỹ thuật. [7]. Lương Đức Phẩm (2010), Giáo trình công nghệ lên men, NXB giáo dục Việt Nam. [8]. Vũ Nguyên Thành (2009), Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học, Bộ Công thương, Viện Công nghiệp Thực Phẩm. [9]. Nguyễn Đình Thưởng (2002), Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, NXB khoa học và kỹ thuật, Tp.HCM. [10]. Lương Đức Phẩm và Hồ Xưởng (1978), Vi sinh vật tổng hợp, NXB Khoa học kĩ thuật Hà Nội. [11]. Lê Ngọc Tú và cộng sự (1997), Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. [12]. Lê Thanh Mai (2001), Công nghệ sản xuất rượu vang và các loại rượu khác. Bộ môn Công nghệ sinh học thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội. [13]. PGS. Lê Thanh Mai cùng cộng sự (2005), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa học và kỹ thuật. [14]. ThS. Phạm Thị Thu (2013), Nghiên cứu công nghệ sản xuất một số loại rượu truyền thống từ gạo đặc sản của Đồng bằng sông Cửu Long. 55
  58. [15]. Lương Đức Phẩm (2009). Nấm men công nghiệp. Tái bản lần 2. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [16]. Lương Đức Phẩm (2012), Công nghệ lên men, NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội. [17]. Nguyễn Lân Dũng (2002), Vi sinh vật học, NXB giáo dục, Hà Nội. [18]. Dự án Zaika (2002- 2007), Viện Công nghiệp thực phẩm, Hà Nội. [19]. Nguyễn Đức Lượng (1996), Công nghệ vi sinh vật, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội. [20]. Đặng Thị Thu (1989), Nghiên cứu glucoamilaza của Endomycopis fibuliger và một vài ứng dụng. Luận án phó tiến sĩ khoa học kỹ thuật, Hà Nội. [21]. Nguyễn Mạnh Tuấn (1999), Nghiên cứu công nghệ sản xuất bánh men rượu từ các vi sinh vật thuần chủng phân lập tại Việt Nam, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội. [22]. TCVN 3217-1979 (1979), Rượu phân tích cảm quan phương pháp cho điểm Alcohols – Sensory analysis Points Score method, Hà Nội. [23]. TCVN 9298:2014 (2014), Vi sinh vật – Bảo quản dài hạn vi sinh vật dùng trong nông nghiệp. [24]. TCVN 378-86 Rượu trắng, phương pháp thử, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh: [21]. Julie A. R., Carolyn L. V. & Doris J. B. – Clin. Microbiol. Rev 13.2 (2000) 236 –301. [22]. A.H.Rose (1977), Alcoholic beverages, V.I, Acedamic Press, London, New York, San Francisco. [23]. Whitake, R.L. and Daniel J.R. (1984), Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, New York, pp.312 – 456. [24]. Lee C., and Anthony and Fujio Y., 199: Amylolytic activities of fungal isolates from Banh men, afermenting starter from viet nam, Annual reports of IC biotech, vol.20. International center for Biotechnology, Osaka, Japan, 155 – 162 [25]. Hesseltine C. W., Rogers R.& Winarno F. G.(1988), “ Microbiological studies on amylolytic oriental fermentation starters”, Mycopathologia 101, pp.141-155. [26]. Haard, N. F. (1999). Fermented cereals: a global perspective. Food & Agriculture Org. Vol. 138: p 63-65. 56
  59. Phụ lục 1: Số liệu thống kê Kết quả xử lý số liệu bằng phần mềm minitab 18 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. One-way ANOVA: Lượng sinh khối thu được versus Thời gian nuôi Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Thời gian nuôi 3 CT2.1.1, CT2.1.2, CT2.1.3 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Thời gian nuôi 2 36.309 18.1544 18.58 0.003 Error 6 5.864 0.9773 Total 8 42.172 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.988562 86.10% 81.46% 68.72% Means Thời gian nuôi N Mean StDev 95% CI CT2.1.1 3 6.540 0.965 (5.143, 7.937) CT2.1.2 3 10.667 0.992 (9.270, 12.063) CT2.1.3 3 10.923 1.008 (9.527, 12.320) Pooled StDev = 0.988562 57
  60. Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Thời gian nuôi N Mean Grouping CT2.1.3 3 10.923 A CT2.1.2 3 10.667 A CT2.1.1 3 6.540 B Means that do not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: Lượng sinh khối thu được versus Nhiệt độ nuôi Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Nhiệt độ nuôi 4 CT2.2.1, CT2.2.2, CT2.2.3, CT2.2.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Nhiệt độ nuôi 3 6.981 2.3269 5.80 0.021 Error 8 3.211 0.4013 Total 11 10.191 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.633496 68.50% 56.68% 29.12% Means Nhiệt độ nuôi N Mean StDev 95% CI 58
  61. CT2.2.1 3 10.137 0.345 (9.293, 10.980) CT2.2.2 3 11.750 0.659 (10.907, 12.593) CT2.2.3 3 11.457 0.685 (10.613, 12.300) CT2.2.4 3 10.050 0.763 (9.207, 10.893) Pooled StDev = 0.633496 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Nhiệt độ nuôi N Mean Grouping CT2.2.2 3 11.750 A CT2.2.3 3 11.457 A B CT2.2.1 3 10.137 A B CT2.2.4 3 10.050 B Means that do not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: Lượng sinh khối thu được versus Số vòng lắc Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Số vòng lắc 3 CT2.3.1, CT2.3.2, CT2.3.3 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Số vòng lắc 2 51.351 25.6753 43.85 0.000 Error 6 3.513 0.5856 Total 8 54.864 Model Summary 59
  62. S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.765223 93.60% 91.46% 85.59% Means Số vòng lắc N Mean StDev 95% CI CT2.3.1 3 8.460 0.894 (7.379, 9.541) CT2.3.2 3 12.230 0.824 (11.149, 13.311) CT2.3.3 3 14.220 0.527 (13.139, 15.301) Pooled StDev = 0.765223 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Số vòng lắc N Mean Grouping CT2.3.3 3 14.220 A CT2.3.2 3 12.230 B CT2.3.1 3 8.460 C Means that do not share a letter are significantly different. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc/ nguyên liệu đến một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu. One-way ANOVA: TSS sau khi kết thúc LMA versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value 60
  63. Công thức 3 127.647 42.5489 8509.78 0.000 Error 8 0.040 0.0050 Total 11 127.687 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0707107 99.97% 99.96% 99.93% Means Công thức N Mean StDev 95% CI CT3.1 3 15.2667 0.0577 (15.1725, 15.3608) CT3.2 3 23.8333 0.0577 (23.7392, 23.9275) CT3.3 3 22.5000 0.1000 (22.4059, 22.5941) CT3.4 3 20.2667 0.0577 (20.1725, 20.3608) Pooled StDev = 0.0707107 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.2 3 23.8333 A CT3.3 3 22.5000 B CT3.4 3 20.2667 C CT3.1 3 15.2667 D Means that do not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: TSS LMD ngày 1 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values 61
  64. Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 40.1892 13.3964 3215.13 0.000 Error 8 0.0333 0.0042 Total 11 40.2225 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0645497 99.92% 99.89% 99.81% Means Công thức N Mean StDev 95% CI CT3.1 3 8.8333 0.0577 (8.7474, 8.9193) CT3.2 3 11.90 0.00 (11.81, 11.99) CT3.3 3 12.5667 0.0577 (12.4807, 12.6526) CT3.4 3 13.8000 0.1000 (13.7141, 13.8859) Pooled StDev = 0.0645497 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.4 3 13.8000 A CT3.3 3 12.5667 B CT3.2 3 11.90 C CT3.1 3 8.8333 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs 62
  65. One-way ANOVA: TSS LMD ngày 2 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 21.6333 7.21111 1081.67 0.000 Error 8 0.0533 0.00667 Total 11 21.6867 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0816497 99.75% 99.66% 99.45% Means Công thức N Mean StDev 95% CI 63
  66. CT3.1 3 8.1000 0.1000 (7.9913, 8.2087) CT3.2 3 10.1667 0.0577 (10.0580, 10.2754) CT3.3 3 10.4000 0.1000 (10.2913, 10.5087) CT3.4 3 11.8667 0.0577 (11.7580, 11.9754) Pooled StDev = 0.0816497 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.4 3 11.8667 A CT3.3 3 10.4000 B CT3.2 3 10.1667 C CT3.1 3 8.1000 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs One-way ANOVA: TSS LMD ngày 3 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. 64
  67. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 8.49667 2.83222 566.44 0.000 Error 8 0.04000 0.00500 Total 11 8.53667 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0707107 99.53% 99.36% 98.95% Means Công thức N Mean StDev 95% CI CT3.1 3 7.4000 0.1000 (7.3059, 7.4941) CT3.2 3 8.5333 0.0577 (8.4392, 8.6275) CT3.3 3 8.7667 0.0577 (8.6725, 8.8608) CT3.4 3 9.7667 0.0577 (9.6725, 9.8608) Pooled StDev = 0.0707107 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.4 3 9.7667 A CT3.3 3 8.7667 B CT3.2 3 8.5333 C CT3.1 3 7.4000 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs 65
  68. One-way ANOVA: TSS LMD ngày 4 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 3.82917 1.27639 306.33 0.000 Error 8 0.03333 0.00417 Total 11 3.86250 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0645497 99.14% 98.81% 98.06% Means Công thức N Mean StDev 95% CI 66
  69. CT3.1 3 7.1333 0.0577 (7.0474, 7.2193) CT3.2 3 7.5667 0.0577 (7.4807, 7.6526) CT3.3 3 8.200 0.000 (8.114, 8.286) CT3.4 3 8.6000 0.1000 (8.5141, 8.6859) Pooled StDev = 0.0645497 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.4 3 8.6000 A CT3.3 3 8.200 B CT3.2 3 7.5667 C CT3.1 3 7.1333 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs One-way ANOVA: LMD ngày 5 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. 67
  70. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 3.68667 1.22889 491.56 0.000 Error 8 0.02000 0.00250 Total 11 3.70667 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.05 99.46% 99.26% 98.79% Means Công thức N Mean StDev 95% CI CT3.1 3 6.800 0.000 (6.733, 6.867) CT3.2 3 7.2333 0.0577 (7.1668, 7.2999) CT3.3 3 7.8667 0.0577 (7.8001, 7.9332) CT3.4 3 8.2333 0.0577 (8.1668, 8.2999) Pooled StDev = 0.05 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.4 3 8.2333 A CT3.3 3 7.8667 B CT3.2 3 7.2333 C CT3.1 3 6.800 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs 68
  71. One-way ANOVA: TSS LMD ngày 6 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 2.86250 0.954167 286.25 0.000 Error 8 0.02667 0.003333 Total 11 2.88917 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0577350 99.08% 98.73% 97.92% Means Công thức N Mean StDev 95% CI 69
  72. CT3.1 3 6.600 0.000 (6.523, 6.677) CT3.2 3 7.0333 0.0577 (6.9565, 7.1102) CT3.3 3 7.5000 0.1000 (7.4231, 7.5769) CT3.4 3 7.900 0.000 (7.823, 7.977) Pooled StDev = 0.0577350 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.4 3 7.900 A CT3.3 3 7.5000 B CT3.2 3 7.0333 C CT3.1 3 6.600 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs One-way ANOVA: Độ chua LMD ngày 1 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. 70
  73. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 0.001742 0.000581 134.00 0.000 Error 8 0.000035 0.000004 Total 11 0.001777 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0020817 98.05% 97.32% 95.61% Means Công thức N Mean StDev 95% CI CT3.1 3 0.050333 0.000577 (0.047562, 0.053105) CT3.2 3 0.06500 0.00300 (0.06223, 0.06777) CT3.3 3 0.07600 0.00200 (0.07323, 0.07877) CT3.4 3 0.08200 0.00200 (0.07923, 0.08477) Pooled StDev = 0.00208167 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.4 3 0.08200 A CT3.3 3 0.07600 B CT3.2 3 0.06500 C CT3.1 3 0.050333 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs 71
  74. One-way ANOVA: Độ chua LMD ngày 2 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 0.009278 0.003093 1091.56 0.000 Error 8 0.000023 0.000003 Total 11 0.009301 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0016833 99.76% 99.66% 99.45% Means Công thức N Mean StDev 95% CI 72
  75. CT3.1 3 0.07267 0.00252 (0.07043, 0.07491) CT3.2 3 0.10600 0.00200 (0.10376, 0.10824) CT3.3 3 0.1240 0.0000 (0.1218, 0.1262) CT3.4 3 0.149000 0.001000 (0.146759, 0.151241) Pooled StDev = 0.00168325 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.4 3 0.149000 A CT3.3 3 0.1240 B CT3.2 3 0.10600 C CT3.1 3 0.07267 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs One-way ANOVA: Độ chua LMD ngày 3 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. 73
  76. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 0.040113 0.013371 4457.00 0.000 Error 8 0.000024 0.000003 Total 11 0.040137 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0017321 99.94% 99.92% 99.87% Means Công thức N Mean StDev 95% CI CT3.1 3 0.09000 0.00000 (0.08769, 0.09231) CT3.2 3 0.15800 0.00200 (0.15569, 0.16031) CT3.3 3 0.21200 0.00200 (0.20969, 0.21431) CT3.4 3 0.24200 0.00200 (0.23969, 0.24431) Pooled StDev = 0.00173205 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.4 3 0.24200 A CT3.3 3 0.21200 B CT3.2 3 0.15800 C CT3.1 3 0.09000 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs 74
  77. One-way ANOVA: Độ chua LMD ngày 4 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 0.065913 0.021971 10985.50 0.000 Error 8 0.000016 0.000002 Total 11 0.065929 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0014142 99.98% 99.97% 99.95% Means Công thức N Mean StDev 95% CI 75
  78. CT3.1 3 0.11200 0.00200 (0.11012, 0.11388) CT3.2 3 0.2060 0.0000 (0.2041, 0.2079) CT3.3 3 0.27600 0.00200 (0.27412, 0.27788) CT3.4 3 0.3040 0.0000 (0.3021, 0.3059) Pooled StDev = 0.00141421 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.4 3 0.3040 A CT3.3 3 0.27600 B CT3.2 3 0.2060 C CT3.1 3 0.11200 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs One-way ANOVA: Độ chua LMD ngày 5 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. 76
  79. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 0.044657 0.014886 5762.19 0.000 Error 8 0.000021 0.000003 Total 11 0.044678 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0016073 99.95% 99.94% 99.90% Means Công thức N Mean StDev 95% CI CT3.1 3 0.1900 0.0000 (0.1879, 0.1921) CT3.2 3 0.23200 0.00200 (0.22986, 0.23414) CT3.3 3 0.3120 0.0000 (0.3099, 0.3141) CT3.4 3 0.34267 0.00252 (0.34053, 0.34481) Pooled StDev = 0.00160728 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.4 3 0.34267 A CT3.3 3 0.3120 B CT3.2 3 0.23200 C CT3.1 3 0.1900 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs 77
  80. One-way ANOVA: Độ chua LMD ngày 6 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 0.045416 0.015139 12111.00 0.000 Error 8 0.000010 0.000001 Total 11 0.045426 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0011180 99.98% 99.97% 99.95% Means Công thức N Mean StDev 95% CI 78
  81. CT3.1 3 0.2000 0.0000 (0.1985, 0.2015) CT3.2 3 0.2480 0.0000 (0.2465, 0.2495) CT3.3 3 0.33200 0.00200 (0.33051, 0.33349) CT3.4 3 0.351000 0.001000 (0.349511, 0.352489) Pooled StDev = 0.00111803 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.4 3 0.351000 A CT3.3 3 0.33200 B CT3.2 3 0.2480 C CT3.1 3 0.2000 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs One-way ANOVA: Độ cồn LMD ngày 1 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. 79
  82. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 8.62000 2.87333 265.23 0.000 Error 8 0.08667 0.01083 Total 11 8.70667 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.104083 99.00% 98.63% 97.76% Means Công thức N Mean StDev 95% CI CT3.1 3 5.200 0.200 (5.061, 5.339) CT3.2 3 7.500 0.000 (7.361, 7.639) CT3.3 3 6.9333 0.0577 (6.7948, 7.0719) CT3.4 3 6.500 0.000 (6.361, 6.639) Pooled StDev = 0.104083 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.2 3 7.500 A CT3.3 3 6.9333 B CT3.4 3 6.500 C CT3.1 3 5.200 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs 80
  83. One-way ANOVA: Độ cồn LMD ngày 2 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 5.27583 1.75861 422.07 0.000 Error 8 0.03333 0.00417 Total 11 5.30917 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0645497 99.37% 99.14% 98.59% Means Công thức N Mean StDev 95% CI 81
  84. CT3.1 3 8.800 0.000 (8.714, 8.886) CT3.2 3 10.0667 0.1155 (9.9807, 10.1526) CT3.3 3 10.60 0.00 (10.51, 10.69) CT3.4 3 9.5667 0.0577 (9.4807, 9.6526) Pooled StDev = 0.0645497 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.3 3 10.60 A CT3.2 3 10.0667 B CT3.4 3 9.5667 C CT3.1 3 8.800 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs One-way ANOVA: Độ cồn LMD ngày 3 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. 82
  85. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 3.74250 1.24750 374.25 0.000 Error 8 0.02667 0.00333 Total 11 3.76917 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0577350 99.29% 99.03% 98.41% Means Công thức N Mean StDev 95% CI CT3.1 3 10.50 0.00 (10.42, 10.58) CT3.2 3 12.0667 0.0577 (11.9898, 12.1435) CT3.3 3 11.20 0.00 (11.12, 11.28) CT3.4 3 11.4000 0.1000 (11.3231, 11.4769) Pooled StDev = 0.0577350 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.2 3 12.0667 A CT3.4 3 11.4000 B CT3.3 3 11.20 C CT3.1 3 10.50 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs 83
  86. One-way ANOVA: Độ cồn LMD ngày 4 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 6.36000 2.12000 * * Error 8 0.00000 0.00000 Total 11 6.36000 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0 100.00% 100.00% 100.00% Means Công thức N Mean StDev 95% CI 84
  87. CT3.1 3 11.40 0.00 (11.40, 11.40) CT3.2 3 13.40 0.00 (13.40, 13.40) CT3.3 3 12.40 0.00 (12.40, 12.40) CT3.4 3 12.00 0.00 (12.00, 12.00) Pooled StDev = 0 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.2 3 13.40 A CT3.3 3 12.40 B CT3.4 3 12.00 C CT3.1 3 11.40 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs One-way ANOVA: Độ cồn LMD ngày 5 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. 85
  88. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 6.98250 2.32750 698.25 0.000 Error 8 0.02667 0.00333 Total 11 7.00917 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.0577350 99.62% 99.48% 99.14% Means Công thức N Mean StDev 95% CI CT3.1 3 12.0667 0.1155 (11.9898, 12.1435) CT3.2 3 13.90 0.00 (13.82, 13.98) CT3.3 3 12.60 0.00 (12.52, 12.68) CT3.4 3 12.00 0.00 (11.92, 12.08) Pooled StDev = 0.0577350 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.2 3 13.90 A CT3.3 3 12.60 B CT3.1 3 12.0667 C CT3.4 3 12.00 C Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs 86
  89. One-way ANOVA: Độ cồn LMD ngày 6 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Công thức 4 CT3.1, CT3.2, CT3.3, CT3.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Công thức 3 6.44250 2.14750 859.00 0.000 Error 8 0.02000 0.00250 Total 11 6.46250 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.05 99.69% 99.57% 99.30% Means Công thức N Mean StDev 95% CI 87
  90. CT3.1 3 12.3333 0.0577 (12.2668, 12.3999) CT3.2 3 13.9333 0.0577 (13.8668, 13.9999) CT3.3 3 12.6333 0.0577 (12.5668, 12.6999) CT3.4 3 12.00 0.00 (11.93, 12.07) Pooled StDev = 0.05 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Công thức N Mean Grouping CT3.2 3 13.9333 A CT3.3 3 12.6333 B CT3.1 3 12.3333 C CT3.4 3 12.00 D Means that do not share a letter are significantly different. Tukey Simultaneous 95% CIs Thí nghiệm 4: Thử hoạt lực bột mốc từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. One-way ANOVA: Độ cồn LMD mẻ 1 versus Công thức Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 88