›

Đồ án Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong điều kiện nuôi cấy in vitro

pdf 84 trang thiennha21 13/04/2022 4880
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong điều kiện nuôi cấy in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_anh_huong_cua_dieu_kien_nuoi_cay_len_kha_nang_nhan_nha.pdf

Nội dung text: Đồ án Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong điều kiện nuôi cấy in vitro

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH SINH KHỐI PHÔI SÂM NGỌC LINH TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Hà Thị Loan Sinh viên thực hiện : Phạm Thảo My MSSV: 1411100365 Lớp: 14DSH02 TP. Hồ Chí Minh, Tháng 8 Năm 2018
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH SINH KHỐI PHÔI SÂM NGỌC LINH TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. Hà Thị Loan Phạm Thảo My TP. Hồ Chí Minh, Tháng 8 Năm 2018
  3. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cha mẹ và gia đình tôi, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể học tập tại Trƣờng đại học Hutech thành phố Hồ Chí Minh. Cảm ơn cha mẹ đã luôn động viên tôi để tôi có thể hoàn thành tốt khóa học của mình. Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh nói chung và phòng thực nghiệm cây trồng nói riêng đã cho phép và hỗ trợ mọi mặt về cơ sở vật chất để tôi thực hiện đƣợc khóa luận tạ đây. Xin đƣợc gửi lời cơm ơn sâu sắc đến TS. Hà Thị Loan và KS. Đào Bá Uy những ngƣời đã hƣớng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt kiến thức, kỹ năng, tài liệu trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi cũng xin cảm ơn tất cả các anh chị trong phòng thực nghiệm cây trồng đã luôn sẵn sàng giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong công việc và học tập. Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến trƣờng Đại học Hutech thành phố Hồ Chí Minh, cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hoài Hƣơng Viện Khoa học Ứng dụng Hutech đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc gặp gỡ tiếp xúc với môi trƣờng làm việc thực tế và đƣợc nghiên cứu đề tài tại Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh. Cuối cùng tôi xin kính chúc ban giám hiệu trƣờng Đại học Hutech, ban lãnh đạo Trung tâm Công Nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, TS. Hà Thị Loan, KS. Đào Bá Uy luôn dooif dào sức khỏe, gặt hái đƣợc nhiều thành công trong công việc, cuộc sống luôn tràn đầy niềm vui và hạnh phúc. Tp. Hồ Chí Minh, ngày Tháng Năm 2018 Sinh viên thực hiện i
  4. CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC HUTECH Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và đƣợc sự hƣớng dẫn khoa học của TS. Hà Thị Loan và KS. Đào Bá Uy; Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chƣa công bố dƣới bất kỳ hình thức nào trƣớc đây. Những số liệu trong các bảng, Biểu đồ phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá đƣợc chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng nhƣ số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác, đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung khóa luận của mình. Trƣờng Đại học Hutech không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tao gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có). Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm2018 Tác giả Phạm Thảo My ii
  5. TÓM TẮT Sinh viên thực hiện: Phạm Thảo My Ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: 14DSH02 MSSV:1411100365 Tên đề tài: “Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro”. Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Hà Thị Loan. Địa điểm: đề tài đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm thực nghiệm cây trồng Trung tâm Công nghệ Sinh học quận 12 thành phố Hồ Chí Minh. Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1, phƣờng Trung Mỹ Tây, quận 12 TP HCM Đề tài gồm 5 thí nghiệm lần lƣợt khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật BA, BA kết hợp nới NAA, Oligochitosan, của điều kiện nuôi cấy ánh sáng và nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Sau 10 tuần nuôi cấy, ở thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của BA, BA và NAA, kết quả cho thấy mẫu đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/l BA và 0,5m/l NAA (nghiệm thức đạt kết quả tốt nhất thí nghiệm 2) cho kết quả tốt hơn so với phôi đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng MS chỉ bổ sung 0,5mg/l BA (nghiệm thức đạt kết quả tốt nhất thí nghiệm 1) với Hệ số nhân sinh khối là 9,55 lần. Bên cạnh đó đối với thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của Oligochitosan, kết quả cho thấy Oligochitosan không những không kích thích khả năng tăng sinh khối cho phôi sâm Ngọc Linh mà còn ức chế khả năng sinh trƣởng phôi sâm Ngọc Linh. Ở thí nghiệm ánh sáng, mẫu phôi sâm Ngọc Linh sinh trƣởng mạnh nhất ở điều kiện nuôi cấy dƣới ánh đèn LED phối hợp theo tỉ lệ 60 đỏ:40 xanh. Và đồng thời qua kết quả thí nghiệm 4 chúng tôi nhận thấy mẫu phôi sâm Ngọc Linh thích hợp sinh trƣởng trong iii
  6. khoảng nền nhiệt từ 190C – 230C tuy nhiên trong đề tài này nhiệt độ tốt nhất là 230C. iv
  7. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH ii TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC HUTECH ii TÓM TẮT iii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ x DANH MỤC HÌNH ẢNH xi CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3 Nội dung nghiên cứu 2 1.4 Ý nghĩa đề tài 2 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 3 2.1 Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật 3 2.1.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là gì? 3 2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 4 2.1.3 Ứng dụng 5 2.2 Tổng quan về cây sâm Ngọc Linh 6 2.2.1 Lịch sử phát hiện 6 2.2.2 Nơi phân bố của sâm Ngọc Linh 7 2.2.3 Đặc điểm của sâm Ngọc Linh 7 2.2.4 Tình hình nghiên cứu sâm ngọc linh 9 2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 v
  8. 3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành 19 3.2 Vật liệu thí nghiệm 19 3.2.1 Vật liệu 19 3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 20 3.2.3 Hóa chất 20 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 20 3.4 Bố trí thí nghiệm 21 3.4.1 Thí nghiệm 1: ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. 21 3.4.2 Thí nghiệm 2: ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. 22 3.4.3 Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. 23 3.4.4 Thí nghiệm 4: ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. 25 3.4.5 Thí nghiệm 5: ảnh hƣởng của nồng độ chitosan lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. 26 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết quả thí nghiệm 1: ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 28 4.2 Kết quả thí nghiệm 2: ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 31 4.3 Kết quả thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 35 4.4 Kết quả thí nghiệm 4: ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 39 vi
  9. 4.5 Kết quả thí nghiệm 5: ảnh hƣởng của Oligochitosan lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. 43 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 50 vii
  10. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA : 6 – Benzylaminopurine NAA : Naphthalene acetic acid IAA : 3 – Indoleacetic acid IBA : 3 – indol butyric acid MS : Murashige và Skoog (1962) 2i – P : 2 – isopentenyladenine Tp. Hồ Chí Minh : Thành phố Hồ Chí Minh KHCN : Khoa học công nghệ Cty TNHH : công ty trách nhiệm hƣu hạn viii
  11. DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh 21 Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với NAA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh 23 Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh 24 Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh 25 Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Oligochitosan lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh 26 Bảng 4.1: so sánh ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân phôi và chồi sâm Ngọc Linh 28 Bảng 4.2: so sánh ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân phôi và chồi sâm Ngọc Linh 31 Bảng 4.3: so sánh ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân phôi và chồi sâm Ngọc Linh 35 Bảng 4.4: so sánh ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân phôi và chồi sâm Ngọc Linh 40 Bảng 4.5: so sánh ảnh hƣởng của Oligochitosan lên khả năng nhân phôi và chồi sâm Ngọc Linh 43 ix
  12. DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các nồng độ BA khác nhau 28 Biểu đồ 4.2: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các nồng độ BA và NAA khác nhau 32 Biểu đồ 4.3: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các loại ánh sáng khác nhau 36 Biểu đồ 4.4: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi giữa các mức nhiệt độ khác nhau 40 Biểu đồ 4.5: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các nồng độ Oligochitosan khác nhau 43 x
  13. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Hình ảnh cây sâm Ngọc Linh 6 Hình 2.2: Các bộ phận của cây sâm Ngọc Linh 8 Hình 2.3: Axit 2,4 dicloro - phenoxiaxetic(2,4D) 14 Hình 2.4: Naphthalene acetic acid (NAA) 14 Hình 2.5: Zeatin 14 Hình 2.6: Benzyladenine 14 Hình 2.7: GA3 15 Hình 3.1: Phôi sâm Ngọc Linh 2 tháng tuổi tại Trung Tâm Công Nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh 19 Hình 4.1: Ảnh hƣởng của BA lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần 29 Hình 4.2: Sự thay đổi số chồi giữa các nghiệm thức thí nghiệm 1 30 Hình 4.3: Hình ảnh số lƣợng chồi ở 4 nghiệm thức thí nghiệm 2 32 Hình 4.4: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi 33 Hình 4.5: Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự nhân nhanh sinh khối phôi samm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi 37 Hình 4.6: Sự khởi tạo lại phôi non xung quanh phôi già (thái hóa) trong thí nghiệm ánh sang 38 xi
  14. Hình 4.7: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi 41 Hình 4.8: Màu sắc phôi sâm Ngọc Linh của các nghiệm thức thí nghiệm 42 Hình 4.9: Ảnh hƣởng của Oligochitosan lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi 44 xii
  15. CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Sâm Ngọc Linh là loại sâm thứ 20 đƣợc tìm thấy trên thế giới, chỉ mọc ở nơi có độ cao từ 1200 mét trở lên, đƣợc phát hiện vào năm 1973 trên núi Ngọc Linh (tỉnh KonTum). Điều đáng bất ngờ ở đây sâm Ngọc Linh là một trong những loại sâm có chứa hàm lƣợng saponin (là một trong những thành phần hóa học của các loại thảo mộc, có tác dụng giảm cholesterol trong máu, chống ung thƣ, tăng cƣơng sức khỏe của xƣơng và kích thích hệ miễn dịch) nhiều nhất so với các loại sâm khác trên thế giới. Những kết quả phân tích thân rễ và củ của sâm Ngọc Linh, các nhà khoa học đã xác định đƣợc có tới 52 loại Saponin. Ngoài ra, trong các công trình nghiên cứu khác ngƣời ta còn xác định đƣợc thành phần dƣợc tính trong sâm Ngọc Linh có 17 acid amin, 20 chất khoáng vi lƣợng và hàm lƣợng tinh dầu là 0,1%. Tất cả những điều đó khiến sâm Ngọc Linh trở thành một loại sâm quý, một loại “thần dƣợc” mang tính Quốc Gia. Tuy nhiên tình hình nhân rộng diện tích trồng sâm Ngọc Linh còn nhiều khó khăn và hạn chế, do nguồn hạt giống khá hiếm hoi vì thời gian để một cây sâm Ngọc Linh ra quả là khá lâu khoảng từ 4 - 5 năm, cộng với việc giá của một cây con sâm Ngọc Linh lại quá cao, rơi tầm từ 150.000 - 200.000 đồng một cây. Do đó việc nghiên cứu để nhân giống sâm Ngọc Linh In vitro là một yêu cầu cần thiết. Hiện tại sâm Ngọc Linh vẫn đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu, nhân nhanh giống In vitro, để phục vụ sản xuất cây giống và để sản xuất sinh khối thu hợp chất thứ cấp saponin. Do đó tôi quyết định làm đề tài “Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro” nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy thuận lợi nhất cho phôi sâm Ngọc Linh, tạo ra nguồn mẫu In vitro lớn cho các nghiên cứu sau này và cung cấp nguồn cây giống cho Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM và thị trƣờng trong nƣớc. 1
  16. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Tìm ra nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng thực vật bổ sung và các điều kiện môi trƣờng thích hợp (nhiệt độ, ánh sáng) cho quá trình nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh nhằm tạo ra số lƣợng lớn mẫu sâm Ngọc Linh In vitro. 1.3 Nội dung nghiên cứu Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của Oligochitosan lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. 1.4 Ý nghĩa đề tài Thông qua đề tài nghiên cứu, có thể tìm đƣợc điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất cho sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh. Tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu về sâm Ngọc Linh sau này. Đồng thời góp phần nghiên cứu để sản xuất cây giống sâm Ngọc Linh ở quy mô công nghiệp, làm nguồn nguyên liệu để nhân sinh khối, đáp ứng nhu cầu trong nƣớc và nƣớc ngoài. Giúp cho sinh viên hiểu và có nhiều kiến thức hơn về sâm Ngọc Linh. Tìm hiểu và nắm rõ kiến thức về phƣơng pháp nghiên cứu khoa học, thu thập, xử lý và phân tích số liệu. Biết cách trình bày một nghiên cứu khoa học. 2
  17. CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 2.1 Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là gì? Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật đƣợc sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trƣờng nuôi cấy giàu dinh dƣỡng với những thành phần đã xác định. (Trần Văn Minh, 1997) Theo ông Dƣơng Công Kiên (2003) các kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể cung cấp những lợi thế nhất định so với phƣơng pháp nhân giống truyền thống, bao gồm: Tạo ra chính xác số cây nhân bản giúp tạo ra các loại hoa, quả chất lƣợng cao hoặc có những tính trạng mong muốn khác. Tạo ra các cây trƣởng thành một cách nhanh chóng Tạo ra hàng loạt các cây mà không cần đến hạt hoặc quá trình thụ phấn để tạo hạt. Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các tế bào thực vật đã đƣợc biến đổi gen. Tạo ra các cây trong điều kiện vô trùng, để có thể vận chuyển mà hạn chế tối đa khả năng phát tán bệnh, sâu bệnh hoặc các nhân tố gây bệnh. Có thể tạo ra các cây từ hạt mà nếu không có nuôi cấy mô thì thƣờng có tỷ lệ nảy mầm thấp hoặc sinh trƣởng yếu, ví dụ: hoa lan hoặc cây nắp ấm. Làm sạch các cây bị nhiễm virus nhất định hoặc các nhân tố lây nhiễm khác và nhân nhanh các cây này nhƣ là nguồn nguyên liệu sạch phục vụ đồng ruộng và nông nghiệp. Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên thực tế là rất nhiều các tế bào thực vật có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh (còn gọi là totipotency – khả năng biệt hóa của tế bào đơn lẻ thành những tế bào chuyên biệt với số lƣợng không giới hạn). Các tế bào đơn lẻ, các tế bào thực vật không có thành tế bào (protoplast), các mảnh 3
  18. lá, rễ hoặc thân, thƣờng có thể đƣợc sử dụng để tạo ra các tế bào mới trên môi trƣờng nuôi cấy bổ sung các chất dinh dƣỡng và hormone thực vật. (Dƣơng Công Kiên, 2003) Nguồn ảnh: 2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đƣa ra ý tƣởng cấy mô sinh vật ra ngoài cơ thể nhƣng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công. Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua. Năm 1951, Skoog và Miller đã cải tiến môi trƣờng nuôi cấy đánh dấu một bƣớc tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trƣờng của họ đã đƣợc dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn đƣợc sử dụng rọng rãi cho đến ngày nay. Năm 1964, Ball là ngƣời đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn. Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn từ môi trƣờng nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chƣa hoàn chỉnh. Sau đó nhiều 4
  19. nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh dƣỡng qua trọng cần thiết cho sự phát triển của các tế bào đƣợc nuôi cấy. Năm 1960 - 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. Từ kết quả đó, lan đƣợc xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên đƣợc thƣơng mai hóa. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đƣợc phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và đƣợc ứng dụng thƣơng mại hóa. (Dƣơng Công Kiên, 2003) 2.1.3 Ứng dụng Nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu thực vật, lâm nghiệp, và đồng ruộng (BioMedia VN, 2016). Các ứng dụng bao gồm: Thƣơng mại hóa sản xuất các loài thực vật sử dụng nhƣ là cây cảnh, trang trí phong cảnh và các lĩnh vực liên quan đến hoa, là thứ mà sử dụng nuôi cấy mô phân sinh và chồi để tạo ra số lƣợng lớn các cá thể giống hệt nhau. Bảo tồn các giống cây hiếm hoặc đang bị đe dọa. Các nhà nhân giống có thể ƣu tiên sử dụng nuôi cây mô để sàng lọc các tế bào hơn là sàng lọc cây trồng để tìm các tính trạng tốt, ví dụ kháng/chống chịu thuốc diệt cỏ. Sinh trƣởng quy mô lớn các tế bào thực vật trong môi trƣờng lỏng trong các bioreactors để tạo ra các hợp chất có giá trị, giống nhƣ sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật và protein tái tổ hợp, đƣợc sử dụng nhƣ là dƣợc phẩm sinh học. Lai xa các loài thực vật bằng cách bởi dung hợp protoplast và tái sinh các phép lai mới. Nghiên cứu nhanh cơ sở phân tử của các cơ chế sinh lý, sinh hóa và sinh sản ở thực vật, ví dụ nhƣ chọn lọc in vitro các cây chống chịu với các điều kiện bất lợi và các nghiên cứu quá trình ra hoa in vitro. 5
  20. Lai - thụ phấn các loài xa nhau và sau đó nuôi cấy tế bào hợp tử đƣợc tạo thành (thƣờng dễ bị chết nếu diễn ra trong tự nhiên) (cứu phôi). Các thể đột biến nhân đôi nhiễm sắc thể và sự hình thành của các thể đa bội, ví dụ nhân đôi đơn bội, tứ bội và các dạng khác của thể đa bội có đƣợc tạo ra bằng cách áp dụng các chất chống phân bào (antimitotic) nhƣ là colchicine hoặc oryzalin. Các mô tế bào nuôi cấy sau khi biến nạp có thể sử dụng để thử nghiệm ngắn hạn các cấu trúc di truyền (genetic constructs) hoặc tái sinh tạo các cây chuyển gen. Các kỹ thuật nhất định nhƣ là nuôi cấy đỉnh phân sinh có thể đƣợc sử dụng để tạo nguồn nguyên liệu thực vật sạch từ nguồn bị lây nhiễm virus nhƣ là khoai tây và rất nhiều các loài có quả mềm. Có thể tạo ra các loài lai vô trùng giống hệt nhau 2.2 Tổng quan về c y s m Ngọc Linh Hình 2.1. hình ảnh cây sâm Ngọc Linh (Nguồn: nhansamlinhchi.net.vn) 2.2.1 Lịch sử phát hiện Năm 1973, đoàn Điều tra dƣợc liệu Ban Dân Y khu 5 do dƣợc sỹ Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang hƣớng dẫn đã phát hiện đƣợc một loài Panax mọc thành quần thể ở độ cao 1800m tại vùng Ngọc Lây, Huyện Đắc Tô, Tỉnh KonTum và đặt tên là “sâm đốt trúc“ với tên khoa học sơ bộ xác định là Panax articulates L. , họ Nhân sâm (Araliaceae) 6
  21. Trải qua hơn 30 năm sâm K5 còn gọi là sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam, một loài sâm đặc hữu của nƣớc ta đã đƣợc thế giớ biết đến với tên khoa học là Panax vietnamenis Ha et Grushv. (Hà Thị Dụng và Grushvisky, 1985) 2.2.2 Nơi ph n bố của sâm Ngọc Linh Cây sâm đƣợc phát hiện ở độ cao từ 1200 m trở lên,có tài liệu cho biết cao độ tìm thấy sâm Ngọc Linh là khoảng 1500m (Cam Lu – Trƣơng Hiệu, 2003), đạt mật độ cao nhất ở khoảng từ 1700 - 2000m dƣới tán rừng già, và cho tới nay chỉ có hai tỉnh KonTum và Quảng Nam là có cây sâm này. Sâm mọc tập trung dƣới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2578m với lớp đất vàng đỏ trên đá Granit dày trên 50 cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng, nên đƣợc gọi là sâm Ngọc Linh Những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc Lum Heo thuộc Xã Phƣớc Lộc, Huyện Phƣớc Sơn, Tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc KonTum, núi Langbian ở Lạc Dƣơng Tỉnh Lâm Đồng cũng rất có thể có loại sâm này. (báo Thanh Niên, 2006) 2.2.3 Đặc điểm của sâm Ngọc Linh a) Đặc điểm hình thái Đây là một loại cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 cm đến 100 cm, thoạt nhìn rất giống nhân sâm Triều Tiên, nhƣng nhìn kỹ sẽ thấy thân rễ có sẹo và các đốt nhƣ đốt trúc do thân khí sinh rụng hàng năm để lại. Sâm Ngọc Linh có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ, có đƣờng kính thân độ 4 - 8 mm, thƣờng tàn lụi hàng năm tuy nhiên thỉnh thoảng cũng tồn tại một vài thân trong vài năm. Thân rễ: có đƣờng kính 1 - 2 cm, mọc bò ngang nhƣ củ hoàng tinh trên hoặc dƣới mặt đất độ 1 - 3 cm, mang nhiều rễ nhánh và củ. 7
  22. Các thân mang lá và lá: tƣơng ứng với mỗi thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5 - 0,7 cm, tuy nhiên sâm chỉ có một lá duy nhất không rụng suốt từ năm thứ 1 đến năm thứ 3 và chỉ từ năm thứ 4 trở đi mới có thêm 2 đến 3 lá. Trên đỉnh của thân mang lá là lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3 - 5 nhánh lá. Cuống lá kép dài 6 - 12mm, mang 5 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn hơn cả với độ dài 12 - 15 cm, rộng 3 - 4 cm. Lá chét phiến hình bầu dục, mép khía răng cƣa, chóp nhọn, lá có lông ở cả hai mặt. Hoa: hình tán đơn mọc dƣới các lá thẳng với thân, cuống tán hoa dài 10 - 20 cm có thể kèm 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dƣới tán chính. Mỗi tán có 60 - 100 hoa, cuống hoa ngắn 1 - 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, màu vàng nhạt, nhị 5, bầu một ô với 1 vòi nhụy(đối với cây 4 - 5 tuổi). Quả: mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8 cm - 1 cm và rộng khoảng 0,5 cm - 0,6 cm, sau hai tháng bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm, vàng lục, khi chín ngả màu đỏ cam với một chấm đen không đều ở đỉnh quả. Mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả. Hình 2.2. Các bộ phận của cây sâm Ngọc Linh (Nguồn agi.gov.vn) 8
  23. b) Đặc điểm sinh lí: Mọc dƣới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C - 25°C, ban đêm 15°C - 18°C, sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm (Võ Tuấn, 2014, báo Lao Động), sinh trƣởng khá chậm. Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. Vào đầu tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trƣởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông hết tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà ngƣời ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có một sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm (Cam Lu – Trƣơng Hiệu, 2003). d)Dƣợc tính Theo tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt cán bộ Viện Dƣợc liệu thì về mặt hoá học, thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh hiện nay (2007) đã phân lập đƣợc 52 saponin trong đó 26 sanopin thƣờng thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật. Trong lá và cọng đã phân lập đƣợc 19 saponin pammaran, trong đó có 8 saponin có cấu trúc mới. Đã xác định đƣợc trong sâm Ngọc Linh 17 axít amin, 20 chất khoáng vi lƣợng và hàm lƣợng tinh dầu là 0,1% ( Võ Tuấn, 2014, báo Lao Động) 2.2.4 Tình hình nghiên cứu sâm ngọc linh Hiện tại cả nƣớc cả nƣớc có 4 địa điểm nghiên cứu và sản xuất sâm Ngọc Linh chính đó là KonTum, Quảng Nam, Đà Lạt và Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Tp. Hồ Chí Minh. Tại Đà Lạt có Nhà sƣ Thích Huệ Đăng ở chùa Thanh Quang đƣợc Cục Sở hữu trí tuệ của Bộ KHCN trao bằng “độc quyền sáng chế” với công trình: “Quy 9
  24. trình trồng cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô”. Thầy đã chọn phƣơng pháp nhân giống vô tính cho cây Ngọc Linh bằng việc áp dụng nuôi cấy lan bằng giá thể vỏ cà phê sang việc nuôi cấy sâm Ngọc Linh với nguồn nguyên liệu sẵn có giúp giảm giá thành trong chi phí sản xuất. Sau một thời gian huy động trí lực của khá nhiều ngƣời cùng với việc bỏ ra hàng tỉ đồng để lập phòng thí nghiệm và nuôi cấy mô, Cty TNHH xuất khẩu hoa lan Thanh Quang đã thành công trong việc nhân giống hàng loạt và trồng thử nghiệm thành công (tỉ lệ cây sống đạt khá cao – khoảng 60%) cây sâm Ngọc Linh tại Đà Lạt. Nhóm nghiên cứu của GS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt thuộc viện nghiên cứu khoa học Tây Nghiên đã nghiên cứu tạo nguồn cây giống chất lƣợng phục vụ cho công tác phát triển sản xuất quy mô lớn, tiến tới làm chủ nguồn giống, giảm sự phụ thuộc nguồn cây giống từ hạt trong tự nhiên đang đƣợc trồng nhƣ hiện nay tại 2 tỉnh Quảng Nam và KonTum. Kết quả tạo ra cây In vitro hoàn chỉnh, đảm bảo tỉ lệ sống sau trồng hơn 80%. Ông là ngƣời đầu tiên bắt cây sâm Ngọc Linh ra hoa đồng thời cũng là ngƣời đi đầu trong việc áp dụng đèn LED đơn sắc trong việc nhân giống vô tính sâm Ngọc Linh. (báo Lâm Đồng, 2017) TS.Nguyễn Hữu Hổ, Viện Sinh học Nhiệt Đới đã nghiên cứu thành công đề tài “Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất sinh khối tế bào và rễ Sâm Ngọc Linh in vitro”. Nhóm nghiên cứu của ông đã thực hiện thành công quy trình nuôi cấy nhân giống các loại mô sâm mang tính mới cao đó là nuôi nhân mô phôi vô tính, rễ bất định, nhân rễ bằng bioreactor sục khí , sánh kịp các nƣớc trong khu vực và thế giới về trình độ khoa học – công nghệ. Hơn nữa, do thao tác nuôi cấy không phức tạp; sinh khối thu đƣợc có thể đáp ứng cho nhiều mục đích sử dụng khác nhau nhƣ thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và y dƣợc; và điều kiện nuôi không chịu sự chi phối của môi trƣờng bên ngoài. (Nguyễn Hữu Hổ, 2014) Nghiên cứu tạo và nuôi nhân mô sẹo có khả năng sinh phôi soma từ mô sẹo lá trong môi trƣờng lỏng; tạo mô phôi soma từ mô sẹo có khả năng sinh phôi, sự phát sinh hình thái chồi/rễ của mô phôi soma trong nuôi cấy và nuôi nhân phôi 10
  25. soma sâm Ngọc Linh trong môi trƣờng lỏng tạo kết quả tiền đề cho nghiên cứu nhân sinh khối quy mô lớn hai loại mô có khả năng sản sinh hàm lƣợng hợp chất thứ cấp cao do chúng đã mang ít nhiều trạng thái biệt hóa. (Nguyễn Hữu Hổ, 2014) Tại Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh nhóm nghiên cứu Hà Thị Loan đã nghiên cứu thành công đề tài “nghiên cứu tạo rễ tóc sâm ngọc linh Panax vietnamensis bằng phương pháp chuyển gen rol nhờ vi khuẩn agrobacterium rhizogenes”. Vì sâm Ngọc Linh có hàm lƣợng saponin trong thân rễ cao hơn so với những loài sâm cùng chi Panax. Biến nạp gen nhằm thay đổi thông tin di truyền giúp cải thiện tạo đƣợc những hoạt chất sinh học có giá trị, đặc biệt là dùng vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes chứa gen rol cảm ứng tạo rễ tóc. (Tạp chí sinh học, 2014) GS.TS Dƣơng Tấn Nhựt tạo mô sẹo sâm Ngọc Linh bằng cách lấy mảnh lá (0,5 x 0,5 cm) đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo MS có 2 mg/l 2,4-D. Mô sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng MS + 1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l NAA + 0,2 mg/l kinetin + 10% nƣớc dừa để tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi và môi trƣờng MS½ + 0,2 mg/l 2,4-D + 10% nƣớc dừa để tạo mô phôi. Mô sẹo có khả năng sinh phôi tăng nhanh sinh khối qua nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng MS + 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l NAA. Mô phôi có khả năng tăng sinh nhanh trong môi trƣờng lỏng MS½ + 0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l BA. Tùy môi trƣờng nuôi cấy ban đầu và ở các giai đoạn tiếp theo, mô phôi phát triển theo hƣớng tạo chồi hoặc rễ tạo quần thể chồi hoặc rễ. (Dƣơng Tấn Nhựt, 2012) 2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo ông Dƣơng Công Kiên (2003). Nuôi cấy mô thực vật (tập 1, 2, 3). NXB ĐHQG TP.HCM nuôi cấy mô tế bào thực vật bị ảnh hƣởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm: a) Khoáng đa lƣợng: - Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. 11
  26. - Ảnh hƣởng do sự có mặt của khoáng vi lƣợng không quan trọng bằng khoáng đa lƣợng. Nếu thiếu khoáng đa lƣợng sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến sự phát triển của cây. - Các nguyên tố đa lƣợng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg. b) Khoáng vi lƣợng: - Trƣớc đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, ngƣời ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lƣợng vào môi trƣờng nuôi cấy. - Các nguyên tố vi lƣợng cần cung cấp cho tế bào là: Fe, Mn, Cu, B, Co, I, Mo, c) Carbon và nguồn năng lƣợng: - Đƣờng là một thành phần không thể thiếu trong bất cứ môi trƣờng nuôi cấy nào, nó đƣợc sử dụng làm nguồn carbon cung cấp năng lƣợng chủ yếu trong môi trƣờng nuôi cấy nhiều loài thực vật. Ngoài ra, đƣờng còn đóng vai trò thẩm thấu chính của môi trƣờng. - Hai dạng đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng nhất trong nuôi cấy mô là glucose và sucrose với nồng độ sử dụng là 1 – 8% - Các nguồn carbonhydrate khác cũng đƣợc tiến hành thử nghiệm nhƣ lactose, galactose, maltose và tinh bột nhƣng các carbonhydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose. d) Vitamin: - Vitamin có vai trò xúc tác các quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào. Hầu hết các mô nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp các vitamin cần thiết nhƣng không đầy đủ về số lƣợng, vì vậy để đạt đƣợc sự sinh trƣởng tối ƣu ngƣời ta thƣờng bổ sung thêm một số loại vitamin. - Các vitamin thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol. - Các vitamin thƣờng đƣợc dùng ở nồng độ 0,1 – 1mg/L. e) Chất điều hoà sinh trƣởng thực vật: 12
  27. Là chất hữu cơ có mặt trong cây với hàm lƣợng rất nhỏ, đƣợc vận chuyển đến các bộ phận của cây để điều tiết và đảm bảo sự hài hoà các hoạt động sinh trƣởng. Phân loại: Gồm 2 nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trƣởng: auxin, cytokinin và gibberellin. Nhóm các chất ức chế sinh trƣởng: acid abscisic và ethylene. Các chất kích thích sinh trƣởng thực vật (phytohormone) Auxin (IAA, NAA, IBA, 2,4,5-T, phenoxyacetic acid, ) Cytokinin (zeatin, 2i-P, BA, kinetin, TDZ, ) Tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) xác định dạng phân hoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy: - Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao: kích thích ra rễ, - Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp: kích thích sự tạo chồi, - Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin gần bằng một: kích thích sự tạo mô sẹo. Auxin: là nhóm chất điều hoà sinh trƣởng của thực vật thƣờng gặp trong thiên nhiên, có ở mô phân sinh chồi, là mầm và rễ. Auxin vận chuyển hƣớng cực: từ đỉnh chồi ngọn tới cơ quan khác. - Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trƣởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. - Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ, nhƣng cũng cản trở sự tăng trƣởng của các sơ khởi này. 13
  28. Hình 2.3. Axit 2,4 dicloro - Hình 2.4. Naphthalene phenoxiaxetic(2,4D) acetic acid (NAA) Vai trò của Auxin: - Thúc đẩy sự tăng trƣởng và giãn nở của tế bào. - Tăng cƣờng quá trình sinh tổng hợp và trao đổi các chất. - Kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính, - Kích thích sự hình thành rễ. - Gây ra tính hƣớng động. - Ƣu thế ngọn. - Sinh trƣởng quả và tạo quả không hạt, Cytokinin: có mặt ở tất cả các loại cây trồng, hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ. Cytokinin vận chuyển không hƣớng cực, có thể hƣớng ngọn hoặc hƣớng gốc. - Kích thích tế bào phân chia (với điều kiện có auxin). - Cytokinin tác động trên cả hai bƣớc của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Hình 2.5. zeatin Hình 2.6. Benzyladenine 14
  29. Vai trò của nhóm Cytokinin: - Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trƣởng chồi in vitro - Ức chế sự tạo rễ và sự sinh trƣởng của mô sẹo (auxin kích thích tạo rễ) - Tăng sự phát sinh phôi vô tính - Sự phân hoá các cơ quan (nhất là sự phân hoá chồi) - Sự nảy mầm - Quá trình trao đổi chất - Ngăn chặn sự già hoá, Gibberellin (GA): gây ra sự tăng dài nhanh chóng bằng cách kích thích sự phân cắt tế bào và sự tăng dài của tế bào, kích thích hay ức chế sự ra hoa, kết trái của một số loài. Hình 2.7. GA3 Sự khác nhau trong vài trò của gibberellin và auxin: - Gibberellin đƣợc vận chuyển qua mô gỗ và mô libe, trong khi auxin đƣợc di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác một chiều. - Gibberellin có ảnh hƣởng trên toàn bộ của cây chứ không phải trên từng vùng nhƣ ở auxin. - Gibberellin đƣợc tạo ra trong những mô còn non của thân và trong hạt đang phát triển còn auxin ở các mô phân sinh chồi, lá mầm và rễ. Các chất ức chế sinh trƣởng thực vật (phytohormone) - Acid adscisic (ABA) - Ethylene 15
  30. Acid adscisic: ức chế tăng trƣởng, kiểm soát sự rụng lá, cảm ứng trạng thái ngủ chồi và hạt vào mùa thu để đợi đến mùa xuân; giúp đóng các khí khẩu khi cây chịu khô hạn. Acid adscisic đƣợc tạo ra từ lá trƣởng thành và đƣợc vận chuyển qua mô libe. Ethylene: gia tăng sự rung lá và trái, sự lão hoá; phá vỡ sự ngủ của chồi và hạt của một số loài; kích thích trổ hoa ở một số loài thực vật khác nhƣ khóm. Ethylene đƣợc tổng hợp trong các mô đang xảy ra sự lão hoá hay sắp chín nhƣ ở trái. f) Các chất hữu cơ không xác định: Bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào môi trƣờng nuôi cấy thƣờng mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trƣởng của mô. Các chất bổ sung này là: Protein hydrolysate, nƣớc dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, nƣớc cam, nƣớc cà chua, g) Nguồn cung cấp nitrogen: Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhƣng sự bổ sung các amino acid vào môi trƣờng nuôi cấy là để kích thích sự tăng trƣởng của tế bào. Các nguồn nitrogen hữu cơ thƣờng sự dụng là hỗ trợ amino acid nhƣ casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparine và adenine. h) Yếu tố làm đặc (tạo gel) môi trƣờng: - Agar là chất thƣờng sử dụng để tạo môi trƣờng đặc hay môi trƣờng bán rắn trong nuôi cấy mô thực vật. 16
  31. - Agar không phản ứng với các chất trong môi trƣờng. Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trƣờng. - Ngoài agar trong nuôi cấy mô tế bào thực vật còn sử dụng một số tác nhân tạo gel khác nhƣ: alginate, phytagel, methacel và gel-rite, - Một số môi trƣờng đƣợc sử dụng chủ yếu để nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhƣ môi trƣờng MS (Murashige và Skoog, 1962), B5 (Gambog và cộng sự, 1969), SH (Schenk và Hilderbrandt, 1972) có hàm lƣợng khoáng đa lƣợng cao và một số môi trƣờng khác đƣợc phát triển bởi White , Gautheret, Nitsch, Loyd và Mc Cown có hàm lƣợng khoáng đa lƣợng thấp hơn. 2.4 Sơ lƣợc về Oligochitosan 2.4.1 Oligochitosan Chitosan là một polysacarit mạch thẳng đƣợc cấu tạo từ các D – glucosamine (đơn vị đã deaxetyl hóa) và N – acetyl – D Glucosamine (đơn vị chứa nhóm acetyl) liên kết tại vị trí β-(1-4). Nó đƣợc sản xuất từ quá trình xử lý vỏ các loại giáp xác (ví dụ vỏ tôm, cua) với dung dịch kiềm NaOH. Oligochitosan là sản phẩm từ Chitosan đƣợc cắt mạch và có khối lƣợng trung bình khoảng 20kDa. Trong đó phần olichitosan tan ở pH 7 có khối lƣợng phân tử thƣờng nhỏ hơn 5kDa (Nguyan Thi Hieu & Đang Van Luyen,1999) trong đề tài này Oligochitosan có khối lƣợng phân tử là 3kDa. 2.4.2 Ứng dụng của Oligochitosan Oligochitosan thể hiện một số hoạt tính sinh học nhƣ tính chống oxi hóa, kích thích hệ miễn dịch chống nhiễm bệnh đối với vật nuôi, cây trồng (jeon, Park & Nishi, 1997). Oligochitosan có khả năng tan trong nƣớc, kìm hãm quá trình sinh sản của vi sinh vật gây bệnh và nấm độc nên đƣợc sử dụng để bảo quản đóng gói thức ăn, bảo quản thực phẩm, hoa quả, rau tƣơi (Hirano, 1996; Shahidi, Arachchi & Jeon, 1999). 17
  32. Đặc biệt trong y dƣợc dùng làm thuốc điều trị suy giảm miễn dịch, có khả năng hạn chế sự phát triển của tế bào u, tế bào ung thƣ . Ngoài ra Oligochitosan còn đƣợc dùng làm vạt liệu y sinh nhƣ màng sinh học, chất nền cho da, mô cấy ghép (Huang & cs, 2007; Luo, Cai, He, Xue, Wu & Cao, 2009; Suzuki, 1996; Yin ,Zhao & Du, 2010). 2.4.3 Vai trò của Oligochitosan trong nuôi cấy mô Với khả năng kháng khuẩn, diệt nấm, kích thích hệ miễn dịch Oligochitosan là một chất điều hòa sinh trƣởng tiềm năng và khá mới mẻ hiện vẫn đang đƣợc nghiên cứu để đánh giá khả năng ảnh hƣởng của nó lên sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật trong nuôi cấy in vitro. Lê Hồng Giang và Nguyễn Bảo Toàn (2012) Trƣờng đại học Cần Thơ đã làm thí nghiệm khảo sát hiệu quả của Oligochitosan lên sự sinh trƣởng của cụm chồi và cây con lan Hồ Điệp (Phalaenopsos sp.) in vitro. Kết quả cho thấy môi trƣờng ½ MS bổ sung 5 - 25 mg/l chitosan có hiệu quả lên sự sinh trƣởng của cụm chôi lan Hồ Điệp với số chồi, chiều cao chồi gia tăng tƣơng đối và tỷ lệ tạo rễ đều đạt nhiều giá trị cao. Nồng độ 15mg/l và 25mg/l có hiệu quả lên sự gia tăng chiều cao và sự hình thành rễ mới của cây con lan Hồ điệp in vitro, với chiều cao gia tăng tƣơng đối đạt 67,4% và 66,5%, tỷ lệ tạo rễ mới đạt 66,7% và 83,3% . 18
  33. CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành Địa điểm: đề tài đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm thực nghiệm cây trồng Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học quận 12 thành phố Hồ Chí Minh. Địa chỉ: 2374 Quốc Lộ 1, phƣờng Trung Mỹ Tây, quận 12, TP. HCM Đề tài đƣợc tiến hành từ tháng 12 năm 2017 đến tháng 7 năm 2018 3.2 Vật liệu thí nghiệm 3.2.1 Vật liệu Đối tƣợng nghiên cứu là phôi sâm Ngọc Linh (Panax vietnamenis) tại phòng thí nghiệm thực nghiệm cây trồng Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh. a b Hình 3.1. Phôi sâm Ngọc Linh 2 tháng tuổi tại Trung Tâm Công Nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh Ghi chú: (a) hình ảnh phôi sâm Ngọc Linh 2 tháng tuổi trong bình thí nghiệm; (b) Lượng mẫu phôi sâm Ngọc Linh ban đầu (1 gram) dùng để cấy nghiệm thức thí nghiệm. 19
  34. Lựa phôi sâm sinh trƣởng và phát triển tốt, không bị hiễm nấm, bệnh chọn làm nguồn mẫu ban đầu 3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ Ống đong (1000 mL, 100 mL) Pipet (1 mL, 2mL, 5mL) Dao cấy (số 11), cán dao. Đèn cồn, đĩa cấy, bông thấm. Cân điện tử 2 số lẻ (Denver Instrument TP 1502 - Đức). Máy đo pH (Schott Lab 860 - SI Analytic - Đức). Máy cất nƣớc 2 lần (Bibby Scientific (Stuart) - A4000D - Anh). Tủ sấy (Member t UNE 550 - Đức). Tủ cấy vô trùng (ESCo LHC - A41 - Indonesia). Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave) (CL - 40M - Nhật Bản). Tủ lạnh (Hitachi - Nhật Bản). 3.2.3 Hóa chất Môi trƣờng MS cơ bản (Murashige & Skoog, 1962). Cồn 96o, cồn 70o. Đƣờng saccharose. HCl, NaOH. Agar. Các chất điều hòa sinh trƣởng: NAA (MERCK - Đức), BA (BIO BASIC - Canada). 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm Các thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần (mỗi lần lặp lại 3 bình). Các nghiệm thức đƣợc bố trí trong phòng nuôi cây với điều kiện tùy vào từng yêu cầu của thí nghiệm. 20
  35. Thu thập số liệu và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và SAS (Statistical Analysis Software), kiểm định Least-Significant Difference (LSD) ở mức ý nghĩa 5% 3.4 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Thí nghiệm 1: ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Mục đích: khảo sát khả năng nhân phôi sâm Ngọc Linh trên môi trƣờng MS có bổ sung thêm BA Vật liệu: Phôi sâm Ngọc Linh khoảng 2 tháng tuổi Môi trƣờng: Môi trƣờng MS có bổ sung thêm 30g/l đƣờng 9g/l agar với pH đƣợc điều chỉnh về 5,7 - 5,8 trƣớc khi hấp khử trùng môi trƣờng. Tiến hành thí nghiệm : Thao tác đƣợc tiến hành trong tủ cấy vô trùng, phôi sâm Ngọc Linh đƣợc cắt thành những khối vuông nhỏ có trọng lƣợng khoảng 0,3g. Mẫu phôi đƣợc cấy vào bình tam giác có chứa 60 mL môi trƣờng và đƣợc bổ sung BA với nồng độ theo bảng 3.1. Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh Nghiệm thức BA (mg/l) 1A 0 1B 0,5 1C 1 Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 3 bình tam giác. Mỗi bình tam giác cấy khoảng 1g ± 0,1g mẫu 21
  36. Mẫu đƣợc nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 190C ± 20C, trong điều kiện ánh sáng phòng, độ ẩm trung bình 55 - 60%. Sau đó tiến hành quan sát, xử lí số liệu và nhận xét. Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sau 10 tuần Khối lƣợng mẫu thu đƣợc từ các nghiệm thức thí nghiệm. Số lƣợng chồi Màu sắc của phôi. Xem sự khác biệt của phôi theo từng tuần Ghi chú các biểu hiện bất thƣờng của phôi 3.4.2 Thí nghiệm 2: ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Mục đích: khảo sát khả năng nhân nhanh sinh khối phôi của sâm Ngọc Linh trên môi trƣờng MS có bổ sung thêm NAA và BA.Từ đó đƣa ra đƣợc nồng độ thích hợp nhất cho sâm Vật liệu: Phôi sâm Ngọc Linh khoảng 2 tháng tuổi Môi trƣờng: Môi trƣờng MS có bổ sung thêm 30g/l đƣờng 9g/l agar với pH đƣợc điều chỉnh về 5,7 - 5,8 trƣớc khi hấp khử trùng môi trƣờng. Tiến hành thí nghiệm : Thao tác đƣợc tiến hành trong tủ cấy vô trùng, phôi sâm Ngọc Linh đƣợc cắt thành những khối vuông nhỏ có trọng lƣợng khoảng 0,3g. Mẫu phôi đƣợc cấy vào bình tam giác có chứa 60 mL môi trƣờng và đƣợc bổ sung BA với nồng độ theo bảng 3.2. 22
  37. Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với NAA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh Nghiệm thức BA (mg/l) NAA (mg/l) 2A 0 0 2B 0,5 0,2 2C 1 0,2 2D 1 0,5 Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 3 bình tam giác. Mỗi bình tam giác cấy khoảng 1g ± 0,1g mẫu. Mẫu đƣợc nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 190C ± 20C, trong điều kiện ánh sáng phòng, độ ẩm trung bình 55 - 60%. Sau đó tiến hành quan sát, xử lí số liệu và nhận xét. Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sau 10 tuần Khối lƣợng mẫu thu đƣợc từ các nghiệm thức thí nghiệm. Số lƣợng chồi Màu sắc của phôi. Xem sự khác biệt của phôi theo từng tuần Ghi chú các biểu hiện bất thƣờng của phôi 3.4.3 Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Mục đích: khảo sát khả năng nhân phôi của sâm Ngọc Linh đối với nhiều loại sánh sáng khác nhau. Vật liệu: Phôi sâm Ngọc Linh khoảng 2 tháng tuổi Môi trƣờng: Từ kết quả thí nghiệm 2 tiến hành chọn đƣợc môi trƣờng tối ƣu nhất để nuôi cấy phôi là: 23
  38. Môi trƣờng MS có bổ sung thêm 1 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30g/l đƣờng, 9g/l agar với pH đƣợc điều chỉnh về 5,7 - 5,8 trƣớc khi hấp khử trùng môi trƣờng. Tiến hành thí nghiệm : Thao tác đƣợc tiến hành trong tủ cấy vô trùng, phôi sâm Ngọc Linh đƣợc cắt thành những khối vuông nhỏ có trọng lƣợng khoảng 0,3g. Mẫu phôi đƣợc cấy vào bình tam giác có chứa 60 mL và đƣợc nuôi cấy ở điều kiện ánh sáng theo bảng 3.3 Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh Nghiệm Thời gian chiếu Điều kiện ánh sáng thức sáng 3A LED trắng 12/24 3B LED đỏ 12/24 3C LED phối hợp 60 đỏ:40 xanh 12/24 3D Huỳnh quang 12/24 3E Không đèn (tối) 0 Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 3 bình tam giác. Mỗi bình tam giác cấy khoảng 1g ± 0,1g mẫu. Nuôi cấy và tiến hành quan sát nhận xét kết quả Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sau 10 tuần Khối lƣợng mẫu thu đƣợc từ các nghiệm thức thí nghiệm. Màu sắc của phôi. Xem sự khác biệt của phôi theo từng tuần Ghi chú các biểu hiện bất thƣờng của phôi 24
  39. 3.4.4 Thí nghiệm 4: ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Mục đích: khảo sát khả năng nhân phôi của sâm Ngọc Linh đối từng điều kiện nhiệt độ khác nhau Môi trƣờng: Từ kết quả thí nghiệm 2 tiến hành chọn đƣợc môi trƣờng tối ƣu nhất để nuôi cấy phôi là: Môi trƣờng MS có bổ sung thêm 1 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30g/l đƣờng, 9g/l agar với pH đƣợc điều chỉnh về 5,7 - 5,8 trƣớc khi hấp khử trùng môi trƣờng. Tiến hành thí nghiệm : Thao tác đƣợc tiến hành trong tủ cấy vô trùng, phôi sâm Ngọc Linh đƣợc cắt thành những khối vuông nhỏ có trọng lƣợng khoảng 0,3g. Mẫu phôi đƣợc cấy vào bình tam giác có chứa 60 mL và đƣợc nuôi cấy ở điều kiện nhiệt theo bảng 3.4 Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh Nghiệm thức Nhiệt độ (0C) 4A 19 4B 21 4C 23 Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 3 bình tam giác. Mỗi bình tam giác cấy khoảng 1g ± 0,1g mẫu Mẫu đƣợc nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng phòng, độ ẩm trung bình 55 - 60%. Sau đó tiến hành quan sát, xử lí số liệu và nhận xét. Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sau 10 tuần Khối lƣợng mẫu thu đƣợc từ các nghiệm thức thí nghiệm. 25
  40. Màu sắc của phôi. Xem sự khác biệt của phôi theo từng tuần Ghi chú các biểu hiện bất thƣờng của phôi 3.4.5 Thí nghiệm 5: ảnh hƣởng của nồng độ chitosan lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Mục đích: khảo sát khả năng nhân phôi của sâm Ngọc Linh đối từng điều kiện nhiệt độ khác nhau Môi trƣờng: Sử dụng môi trƣờng MS có bổ sung thêm 1 mg/l BA và 0,5mg/l NAA và Oligochitosan với nồng độ đƣợc bố trí nhƣ bảng 3.5 Tiến hành thí nghiệm : Thao tác đƣợc tiến hành trong tủ cấy vô trùng, phôi sâm Ngọc Linh đƣợc cắt thành những khối vuông nhỏ có trọng lƣợng khoảng 0,3g. Các cục phôi đƣợc cấy vào bình tam giác có chứa 60 mL và đƣợc bổ sung nồng độ Oligochitosan theo bảng 3.5 Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chitosan lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh Nghiệm thức Chitosan(mg/l) 5A 0 5B 0,5 5C 1 5D 1,5 Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 3 bình tam giác. Mỗi bình tam giác cấy khoảng 1g ± 0,1g mẫu 26
  41. Mẫu đƣợc nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng phòng, độ ẩm trung bình 55 - 60%. Sau đó tiến hành quan sát, xử lí số liệu và nhận xét. Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sau 10 tuần Khối lƣợng mẫu thu đƣợc từ các nghiệm thức thí nghiệm. Màu sắc của phôi. Xem sự khác biệt của phôi theo từng tuần Ghi chú các biểu hiện bất thƣờng của phôi 27
  42. CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thí nghiệm 1: ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro Thí nghiệm này gồm 3 nghiệm thức, khảo sát ảnh hƣởng của BA ở 3 nồng độ khác nhau gồm 0 mg/l, 0,5 mg/l, 1mg/l. Đƣợc theo dõi trong khoảng thời gian 4 tuần, 6 tuần, 10 tuần. Kết quả đƣợc ghi nhận sau 10 tuần nuôi cấy và đƣợc thể hiện chi tiết thông qua bảng 4.1. Bảng 4.1: so sánh ảnh hƣởng của BA lên sự nhân nhanh sinh khối phôi và chồi của sâm Ngọc Linh Chỉ tiêu theo dõi sau 10 tuần Nghiệm BA Khối Hệ số nhân Số Thức (mg/l) Màu sắc lƣợng (g) sinh khối (lần) chồi 1A 0 5,32b 5,32 2,66c Vàng xanh 1B 0,5 8,24a 8,24 7,33c Vàng xanh Vàng xanh, một số chỗ 1C 1 4,02c 4,02 9,67a phôi có màu nâu CV% 6,41 8,81 Chú thích: Những chữ cái khác nhau (a, b, c) trong cùng một cột bảng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p 0,05 trong phép thử LSD 12 9.67 10 8.24 8 7.33 6 5.32 4.02 Khối lượng (Gram) 4 2.66 Số chồi 2 0 0ml/L 0,5ml/L 1ml/L NAA (mg/l) Biểu đồ 4.1: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các nồng độ BA khác nhau 28
  43. a1 a2 a3 b1 b2 b3 c1 c2 c3 Hình 4.1. Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoan 4 tuần và 10 tuần Ghi chú: (a1, b1, c1) mẫu phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi của lần lượt các nghiệm thức 1A, 1B, 1C (a2, b2, c2) mẫu phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoạn 10 tuần tuổi của lần lượt các nghiệm thức 1A, 1B, 1C (a3, b3, c3) mẫu phôi 10 tuần tuổi sau khi đem cân và quan sát của lần lượt các nghiệm thức 1A, 1B, 1C 29
  44. a b c Hình 4.2. Sự thay đổi số chồi giữa các nghiệm thức thí nghiệm 1 Ghi chú: (a) số chồi trên mẫu phôi của nghiệm thức A (b) số chồi trên mẫu phôi của nghiệm thức B (c) số chồi trên mẫu phôi của nghiệm thức C Nhận xét: Sau 4 tuần nuôi cấy, phôi ở cả 3 nồng độ 0 mg/l (mẫu đối chứng), 0,5 mg/l, 1mg/l đều chƣa có sự khác biệt rõ rệt về khối lƣợng và màu sắc so với ban đầu. Tiếp tục theo dõi đến tuần thứ 6, đã có biểu hiện của sự tăng sinh khối phôi, xuất hiện những đốm trắng nhỏ trên phôi. Tiếp tục theo dõi và ghi nhận kết quả ở tuần thứ 10. Quan sát bƣớc đầu cho thấy khối lƣợng phôi ở 3 nồng độ 0 mg/l, 0,5 mg/l, 1 mg/l có tăng so với tuần thứ 4 (hình 4.1).Kết quả cho thấy giữa các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt về mặt xử lí số liệu thống kê (bảng 4.1b). Nuôi cấy tăng sinh khối phôi ở môi trƣờng MS có bổ sung 0,5 mg/l khối lƣợng phôi tăng cao hơn mẫu đối chứng. Nhƣng khi tăng nồng độ lên 1mg/l khối lƣợng phôi giảm và thấp hơn mẫu đối chứng (Biểu đồ 4.1). Khối lƣợng phôi mẫu đối chứng là 5,32 g, ở nồng độ 0,5 mg/l BA cho kết quả cao nhất với khối lƣợng phôi đạt 8,24 g (Biểu đồ 4.1). Theo GS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt (2012) môi trƣờng tái sinh chồi sâm Ngọc Linh là MS + 0,5 mg/l BA. Nhƣng trong nghiên cứu này tôi nhận thấy nồng độ BA 1mg/l cho số chồi cao nhất (9,67 chồi/mẫu), nồng độ cho số chồi thấp nhất là mẫu đối chứng (2,66 chồi/mẫu) (Biểu đồ 4.1, hình 4.2). Bên cạnh đó phôi ở nồng độ 0 30
  45. mg/l, 0,5mg/l đều giữ màu sắc vàng xanh ban đầu, ở nồng độ 1 mg/l một số chỗ trên mẫu phôi có màu nâu đen. Từ kết quả trên, kết luận môi trƣờng thích hợp nhất cho sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh là MS có bổ sung 0,5 mg/l BA. 4.2 Kết quả thí nghiệm 2: ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro Thí nghiệm này khảo sát ảnh hƣởng nồng độ của NAA và BA lên khả năng nhân sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ở nhiều nồng độ khác nhau. Qua 10 tuần nuôi cấy thu đƣợc bảng kết quả sau: Bảng 4.2: so sánh ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nh n phôi và chồi sâm Ngọc Linh Chỉ tiêu theo dõi sau 10 tuần Nghiệm BA NAA Khối Hệ số nhân Số chồi thức (mg/l) (mg/l) Màu sắc lƣợng (g) sinh khối (lần) (chồi/mẫu) 2A 0 0 4,47c 4,47 2,33d Vàng xanh 2B 0,5 0,2 6,81b 6,81 3,67c Vàng xanh Vàng nâu – 2C 1 0,2 8,50a 8,50 13,00a Vàng xanh Xanh vàng, 2D 1 0,5 9,55a 9,55 7,67b có cây con CV% 4,40 10,6 Chú thích: Những chữ cái khác nhau (a, b, c, d) trong cùng một cột bảng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p 0,05 trong phép thử LSD 31
  46. 14 13 12 9.55 10 8.5 7.67 8 6.81 Khối lƣợng (gram) 6 4.47 Số chồi (chồi/mẫu) 3.67 4 2.33 2 . 0 0:00 0,5:0,2 1:0,2 1:0,5 BA:NAA (mg/l) Biểu đồ 4.2: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các nồng độ BA và NAA khác nhau a b c d Hình 4.3. Hình ảnh số lƣợng chồi ở 4 nghiệm thức thí nghiệm 2 Ghi chú: (a, b, c, d) lần lượt là hình ảnh biểu hiện số lượng chồi trên mẫu nghiệm thức A, B, C, B của thí nghiệm 32
  47. a1 a2 a3 b1 b2 b3 c1 c2 c3 d1 d2 d3 Hình 4.4. Ảnh hƣởng của NAA và BA lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi Ghi chú: (a1, b1, c1, d1) mẫu phôi sâm Ngọc Linh 4 tuần tuổi của lần lượt các nghiệm thức 2A, 2B, 2C, 2D 33
  48. (a2, b2, c2, d2) mẫu phôi sâm Ngọc Linh 10 tuổi của lần lượt các nghiệm thức 2A, 2B, 2C, 2D (a3, b3, c3, d3) mẫu phôi 10 tuổi sau khi đem cân và quan sát của lần lượt các nghiệm thức 2A, 2B, 2C, 2D Nhận xét: Sau 4 tuần nuôi cấy, phôi sâm Ngọc Linh đã có dấu hiệu tăng sinh khối so với ban đầu (hình 4.4 a1, b1, c1, d1). Tiếp tục theo dõi đến tuần thứ 6 trên phôi bắt đầu xuất hiện những đốm trắng nhỏ đó là phôi non in vitro. Đến tuần thứ 10 phôi phát triển mạnh hơn, khác biệt rõ rệt so với 4 tuần đầu tiên (hình 4.4), đồng thời các đốm trắng dần phát triển thành các chồi non in vitro, bắt đầu hình thành 2 lá mầm trắng nhỏ. Riêng nghiệm thức D đã có sự hình thành của cây con in vitro. Sau 10 tuần nuôi cấy, khi tăng dần nồng độ BA từ 0,5 mg/l đến 1 mg/l và nồng độ NAA từ 0,2 mg/l đến 0,5 mg/l thì khối lƣợng phôi tăng dần và hai nghiệm thức nồng độ BA 1mg/l không có sự khác biệt về mặt thống kê (bảng 4.2). Trong nghiên cứu này mẫu có bổ sung BA và NAA đều đạt khối lƣợng phôi tƣơi cao hơn mẫu đối chứng (4,47g) (Biểu đồ 4.2). Khối lƣợng phôi tƣơi ở nồng độ 1 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA cho khối lƣợng phôi đạt kết quả cao nhất là 9,55 g phôi tƣơi,(Hình 4.4, Biểu đồ 4.2) ,tiếp đến là khối lƣợng ở 2 nồng độ 0,5 mg/l BA, 0,2 mg/l NAA và 1 mg/l BA, 0,2 mg/l NAA lần lƣợt là 6,81 g và 8,50g. Tƣơng tự về yếu tố số chồi, mẫu ở nồng độ 1mg/l BA , 0,2 mg/l NAA đạt kết quả cao nhất (13 chồi/mẫu), ở các nồng độ 0,5 mg/l BA, 0,2 mg/l NAA và 1 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA số chồi trên mẫu lần lƣợt là 3,67 chồi/mẫu, 7,67 chồi/mẫu và đều cao hơn mẫu đối chứng (2,33 chồi/mẫu) (hình 4.3, Biểu đồ 4.2) . Phôi ở nồng độ 1 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA phát triển khỏe mạnh và có màu sắc phôi xanh tốt. Phôi ở nồng độ 1 mg/l BA 0,2 mg/l NAA phôi có màu vàng một số chỗ trên phôi có màu nâu đen. 2 nghiệm thức còn lại phôi phát triển bình thƣờng, mẫu phôi có màu vàng xanh (hình 4.4 a3, b3, c3, d3). 34
  49. Từ kết quả đó chúng tôi nhận thấy môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA thích hợp nhất cho sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh. 4.3 Kết quả thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng cúa ánh sáng lên khả năng nhân sinh khối của sâm Ngọc Linh gồm 5 nghiệm thức với 5 loại ánh sáng khác nhau là LED Trắng, LED đỏ, LED phối hợp (60 đỏ:40 xanh), huỳnh quang, không đèn (tối). Kết quả đƣợc ghi nhận sau 10 tuần nuôi cấy và đƣợc thể hiện chi tiết trong bảng 4.3. Bảng 4.3: so sánh ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nh n phôi và chồi sâm Ngọc Linh Chỉ tiêu theo dõi sau 10 tuần Nghiệm Ánh sáng Khối lƣợng Hệ số nhân thức Màu sắc (g) sinh khối (lần) 3A LED trắng 5,00d 5,00 Xanh Vàng 3B LED đỏ 6,22b 6,22 Xanh vàng LED phối hợp 3C 7,32a 7,32 Xanh vàng (60đỏ:40xanh) 3D Huỳnh quang 5,77bc 5,77 Xanh lá 3E Không đèn (tối) 5,33cd 5,33 Vàng nhạt CV% 6,94 Chú thích: Những chữ cái khác nhau (a, b, c, d) trong cùng một cột bảng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p 0,05 trong phép thử LSD 35
  50. Khối lượng (gram) 8 7.32 7 6.22 5.77 6 5.33 5 5 4 3 Khối lượng (gram) 2 Khốilƣợng (gram) 1 0 Led trắng Led đỏ Led phối Huỳnh Không hợp quang đèn Biểu đồ 4.3: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi giữa các loại ánh sáng khác nhau 36
  51. a1 a2 a3 b1 b2 b3 c1 c2 c3 d1 d2 d3 e1 e2 e3 Hình 4.5. Ảnh hƣởng của các loại ánh sáng lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi 37
  52. Ghi chú: (a1, b1, c1, d1, e1) mẫu phôi sâm Ngọc Linh 4 tuần tuổi của lần lượt các nghiệm thức 3A, 3B, 3C, 3D, 3E (a2, b2, c2, d2, e2) mẫu phôi sâm Ngọc Linh 10 tuần tuổi của lần lượt các nghiệm thức 3A, 3B, 3C, 3D, 3E (a3, b3, c3, d3, e3) mẫu phôi 10 tuần tuổi sau khi đem cân và quan sát của lần lượt các nghiệm thức 3A, 3B, 3C, 3D, 3E. a b Hình 4.6. Sự khởi tạo lại phôi non xung quanh phôi già (thái hóa) trong thí nghiệm ánh sáng Ghi chú: (a, b) lần lượt là mặt trên và mặt dưới của mẫu phôi sâm Ngọc linh được nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng đơn sắc Nhận xét: Kết quả cho thấy ở tất cả các nghiệm thức đƣợc nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng đều có khả năng khởi tạo phôi. Hình 4.6 cho thấy sau 10 tuần nuôi cấy, phôi non đã bọc kín xung quanh mẫu phôi ban đầu, trong khi phôi nuôi cấy ở điều kiện không chiếu sáng (mẫu đối chứng), mẫu phôi già sẽ chuyển qua màu nâu sẫm và chết mà không phát sinh thêm phôi. Điều này chứng tỏ ánh sáng kích thích tốt đến sự khởi tạo mô non. Qua bảng kết quả 4.3 và Biểu đồ 4.3 cho thấy, phôi ở nghiệm thức đèn LED phối hợp tỉ lệ (60 đỏ:40 xanh) đạt kết quả cao nhất với khối lƣợng phôi là 7,3 lần, tiếp đến là khối lƣợng phôi tƣơi ở nghiệm thức đèn LED đỏ (6,2 lần) (Biểu đồ 4.3). Ở ánh sáng LED trắng phôi bị ức chế tăng sinh với khối lƣợng phôi (5,00g) nhỏ hơn 38
  53. mẫu đối chứng (5,33g). Loại đèn huỳnh quang khối lƣợng mẫu phôi chỉ 5,73 g. Điều đó cho thấy đèn huỳnh quang không phải là loại đèn tối ƣu nhất cho sự phát triển của phôi sâm Ngọc Linh mặc dù nó là loại đèn đƣợc sử dụng phổ thông nhất hiện nay. Theo GS. TS Dƣơng Tấn Nhật (2012) và nhóm nghiên cứu của ông cho rằng mô sẹo sâm Ngọc Linh bị ức chế tăng sinh dƣới ánh đèn huỳnh quang và tăng sinh mạnh nhất ở ánh sáng phối hợp 50 đỏ: 50 xanh, tiếp đến là ánh sáng đỏ. Trong nghiên cứu này phôi sâm Ngọc Linh đƣợc nuôi cấy dƣới ánh đèn huỳnh quang kết quả tăng sinh khối phôi thấp (5,77g) tuy nhiên vẫn cao hơn so với mẫu đối chứng (5,33) và mẫu phôi có màu xanh tốt (hình 4.5 d3). Từ kết luận thí nghiệm chúng tôi thấy rằng trong điều kiện LED trắng và không đèn (tối) không thích hợp nhân sinh khối phôi. Nghiệm thức C sử dụng đèn LED phối hợp 60 đỏ:40 xanh cho kết quả tốt nhất. 4.4 Kết quả thí nghiệm 4: ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro Qua thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự nhân sinh khối phôi sâm Ngọc Linh sau 10 tuần thu đƣợc kết quả nhƣ bảng sau: 39
  54. Bảng 4.4: so sánh ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nh n phôi và chồi sâm Ngọc Linh Chỉ tiêu sau 10 tuần theo dõi Nghiệm Nhiệt độ Khối Hệ số nhân thức Số chồi Màu sắc lƣợng (g) sinh khối (lần) 4A 190C 8,56b 8,56 7,33ns Vàng xanh 4B 210C 9,36ab 9,36 6,67ns Vàng xanh 4C 230C 10,10a 10,10 6,33ns Xanh vàng CV% 5,11 8.51 Chú thích: Những chữ cái khác nhau (a, b) trong cùng một cột bảng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p 0,05 trong phép thử LSD ns:Trong các nghiệm thức thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa. 12 10.21 10 9.57 8.56 8 7.33 6.67 6.33 6 Khối lượng (gram) Số chồi (chồi/mẫu) 4 2 0 19 21 23 Nhiệt độ (0C) Biểu đồ 4.4: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các mức nhiệt độ khác nhau 40
  55. a1 a2 a3 b1 b2 b3 c1 c2 c3 Hình 4.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi Ghi chú: (a1, b1, c1) mẫu phôi sâm Ngọc Linh 4 tuần tuổi của lần lượt các nghiệm thức 4A, 4B, 4 (a2, b2, c2) mẫu phôi sâm Ngọc Linh 10 tuần tuổi của lần lượt các nghiệm thức 4A, 4B, 4C (a3, b3, c3) mẫu phôi 10 tuần tuổi sau khi đem cân và quan sát của lần lượt các nghiệm thức 4A, 4B, 4C. 41
  56. a b c Hình 4.8. Màu sắc phôi sâm Ngọc Linh của các nghiệm thức thí nghiệm 4 Ghi chú: (a,b,c) lần lượt là hình ảnh màu sắc phôi sâm Ngọc Linh ở nghiệm thức 4A (190C), 4B (210C), 4C (230C). Nhận xét: Qua bảng 4.4 và Biểu đồ 4.4 cho thấy có sự khác biệt giữa các nghiệm thức thí nghiệm. Khi tăng nhiệt độ từ 190C - 230C khối lƣợng phôi tăng dần, tuy nhiên không có sự khác biệt ở mức nhiệt 190C - 210C và 210C - 230C về mặt thống kê (bảng 4.4). Ở mức nhiệt độ 230C khối lƣợng phôi cao nhất, sinh trƣởng mạnh và xanh tốt. Hai mức nhiệt độ 190C và 220C khối lƣợng mẫu phôi lần lƣợt là 8,56g và 9,36g, phôi sinh trƣởng mạnh có màu vàng xanh (hình 4.8). Bên cạnh đó trong quá trình quan sát chúng tối nhận thấy số chồi ở cả 3 nghiệm thức không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức về mặt thống kê (bảng 4.4). Số lƣợng chồi đạt 6 - 8 chồi/mẫu, điều đó chứng tỏ nhiệt độ không ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh chồi ở sâm Ngọc Linh. Nhƣ vậy, nhìn chung phôi sâm Ngọc Linh thích hợp ở điều kiện nhiệt độ 190C - 230C và tốt nhất là ở 230C. 42
  57. 4.5 Kết quả thí nghiệm 5: ảnh hƣởng của Oligochitosan lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Thí nghiệm này khảo sát ảnh hƣởng của Oligochitosan lên sự nhân sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ở nhiều mức nồng độ khác nhau, gồm 0 mg/l, 0,5 mg/l, 1 mg/l, 1,5 mg/l sau 10 tuần nuôi cấy thu đƣợc bảng kết quả sau: Bảng 4.5: so sánh ảnh hƣởng của Oligochitosan lên khả năng nh n phôi và chồi sâm Ngọc Linh Chỉ tiêu sau 10 tuần theo dõi Nghiệm Oligochitosan Hệ số nhân Khối thức (mg/l) sinh khối Số chồi Màu sắc lƣợng (g) (lần) 5A 0 8,06a 8,06 7,67a Xanh 5B 0,5 4,51b 4,51 4,67b Vàng xanh 5C 1 4,23b 4,23 3,33c Vàng xanh 5D 1,5 3,44c 3,44 3,44d Vàng sẫm Cv% 7,42 14,19 Chú thích: Những chữ cái khác nhau (a, b, c, d) trong cùng một cột bảng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p 0,05 trong phép thử LSD 9 8.06 8 7.67 7 6 4.67 5 4.51 4.23 4 3.33 3.44 Khối lượng (gram) 3 số chồi (chồi/mẫu) 2 1 0.67 0 0 mg/l 0,5 mg/l 1 mg/l 1,5 mg/l Nồng độn Oligochitosan Biểu đồ 4.5: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các nộng độ Oligochitosan khác nhau 43
  58. a1 a2 a3 b1 b2 b3 c1 c2 c3 d1 d2 d3 Hình 4.9. Ảnh hƣởng của Oligochitosan lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi Ghi chú: (a1, b1, c1, d1) mẫu phôi sâm Ngọc Linh 4 tuần tuổi của lần lượt các nghiệm thức 4A, 4B, 4C, 4D 44
  59. (a2, b2, c2, d2) mẫu phôi sâm Ngọc Linh 10 tuần ngày tuổi của lần lượt các nghiệm thức 4A, 4B, 4C, 4D (a3, b3, c3, d3) mẫu phôi 10 tuần tuổi sau khi đem cân và quan sát của lần lượt các nghiệm thức 4A, 4B, 4C, 4D. Nhận xét: Kết quả thí nghiệm cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các nghiệm thức về mặt thống kê (bảng 4.5). Trong thí nghiệm này các nghiệm thức có bổ sung Oligochitosan cho khối lƣợng và số chồi/mẫu thấp hơn nghiệm thức không bổ sung Oligochitosan (mẫu đối chứng). Khi tăng dần nồng độ Oligochitosan từ nồng độ 0,5 mg/l - 1,5 mg/l khối lƣợng và số chồi giảm dần (Biểu đồ 4.5). Khối lƣợng mẫu đối chứng là 8,06g, phôi khỏe mạnh xanh tốt. Ở nồng độ Oligochitosan từ 0,5 mg/l - 1,5 mg/l khối lƣợng phôi đều dƣới 4,50g và thấp hơn mẫu đối chứng (bảng 4.5). Mẫu phôi ở nồng độ 1,5 mg/l phát triển yếu phôi có màu vàng sẫm, 2 nghiệm thức còn lại phôi phát triển chậm, phôi có màu vàng xanh. Tƣơng tự số chồi ở mẫu đối chứng cao hơn ở mẫu có bổ sung Oligochitosan. Số lƣợng chồi mãu đối chứng 7,67 chồi/mẫu. Số Lƣợng chồi ở các nồng độ 0,5 mg/l, 1 mg/l và 1,5 mg/l lần lƣợt là 4,67 chồi/mẫu, 3,33 chồi/mẫu, 0,67 chồi/mẫu. Từ kết quả thí nghiệm chứng tỏ Oligochitosan ở nồng độ 0,5 mg/l - 1,5 mg/l không thích hợp kích thích nhân phôi ở sâm Ngọc Linh mà ngƣợc lại còn ức chế khả năng tăng sinh khối của phôi so với mẫu đối chứng. 45
  60. CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua quá trình thực hiện đề tài, các thí nghiệm đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau: BA có ảnh hƣởng đến quá trình tăng sinh phôi đồng thời cũng kích thích đến sự phát sinh chồi ở phôi sâm Ngọc Linh, trong thí nghiệm này nồng độ 0,5mg/l BA đem lại kết quả tốt nhất với Hệ số nhân sinh khối là 8,24 lần. Thí nghiệm BA kết hợp với NAA đem lại kết quả tốt hơn so thí nghiệm chỉ bổ sung mỗi BA vào môi trƣờng nuôi cấy. Và nồng độ bổ sung BA và NAA thích hợp nhất cho sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh là 1 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA với Hệ số nhân sinh khối là 9,5 lần. Về ảnh hƣởng của các yếu tố ánh sáng và nhiệt độ cũng đem lại một kết quả triển vọng và mở ra một hƣớng nuôi cấy mới cho tăng sinh phôi sâm Ngọc Linh. Ánh sáng thích hợp cho sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh là ánh sáng phối hợp tỉ lệ 60 đỏ:40 xanh với Hệ số nhân sinh khối đạt 7,3 lần. Điều kiện nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh là từ 19 - 230C. Riêng với thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của Oligochitosan cho thấy Oligochitosan ở nồng độ từ 0,5 – 1,5 mg/l hoàn toàn không kích thích phôi tăng trƣởng mà ngƣợc lại là ức chế quá trình nhân phôi của sâm Ngọc Linh. Từ các kết quả đó, tôi rút ra kết luận điều kiện tốt nhất cho sự nhân nhanh sinh khối của phôi sâm Ngọc Linh là môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA, đƣợc nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 19 - 230C. 5.2 Kiến nghị. Dựa vào kết quả thí nghiệm, tôi nhận thấy cần phải tiếp tục nghiên cứu một số nội dung sau liên quan đến đề tài: Khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng gián tiếp lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi của sâm Ngọc Linh. 46
  61. Khảo sát ảnh hƣởng của BA và NAA lên khả năng tái sinh chồi sản xuất cây giống sâm Ngọc Linh phục vụ công trình phát triển cây sâm VN. 47
  62. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng việt [1]. Cam Lu – Trƣơng Hiệu. Thông cáo báo chí. Ngọc linh, từ cây sâm quý đến thƣơng hiệu quý, 7/2018, [2]. Chu Đức Hà, Lê Hùng Linh, Nguyễn Văn Kết, Lê Tiến Dũng, Đỗ Mạnh Cƣờng, Hoàng Thanh Tùng, Dƣơng Tấn Nhựt (2018). Sâm Ngọc Linh: cây dƣợc liệu quý mang thƣơng hiệu quốc gia. Tạp chí Khoa học - Công nghệ và Đổi mới sáng tạo. Số1: 32 – 35. [3]. Dƣơng Công Kiên (2003). Nuôi cấy mô thực vật (tập 1, 2,3). NXB ĐHQG TP.HCM. [4]. Hà Thị Loan, Dƣơng Hoa Xô, Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Hoàng Quân, Vũ Thị Đào, Nathalie Pawlichi-Jullian, Eric Gontier (2014). Nghiên cứu tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis bằng phương pháp chuyển gel rol nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Tạp chí sinh học. 36(1se): 293 – 300. [5]. Hoàng Văn Cƣơng, Nguyễn Bá Nam, Trần Công Luận, Bùi Thế Vinh, Dƣơng Tấn Nhựt (2012). Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và khả năng tích lũy saponin thông qua nuôi cấy mô sẹo và cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et grushv.) in vitro. Tạp chí khoa học và công nghệ. 50 (4): 475 – 490. [6]. Lê Hồng Giang, Nguyễn Bảo Toàn (2012). Hiệu quả của chitosan lên sự sinh trưởng của cụm chồi và cây con lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) in vitro. Tạp chí khoa học 24a: 88 – 95. [7]. Mai Trƣờng, Trần Thị Ngọc Hà, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tuấn Đức, Trần Trọng Tuấn, Đỗ Đăng Giáp, Bùi Đình Thạch, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Kết, Trần Công Luận, Nguyễn Hữu Hổ (2013). Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo có khả năng sinh phôi và mô phôi soma sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et grushv.). Tạp chí sinh 48
  63. học 35(3se): 145 – 157. [8]. Thanh Niên. Quảng Nam: Phát hiện thêm một đỉnh núi có sâm Ngọc Linh, 7/2018, them-mot-dinh-nui-co-sam-ngoc-linh-167839.htm [9]. Trần văn Minh (1997). Nuôi cấy mô tế bào thực vật. NXB Nông Nghiệp. [10]. Võ Tuấn. Mong Manh thƣơng hiệu "sâm Việt", 7/2018, g-manh-thuong-hieu-sam-Viet/20075/38448.laodong 2. Tài liệu tiếng anh [1]. Duc N.M., R. Kasai, K. Ohtani, A. Ito, N.T.Nham, K. Yamasaki and O. Tanaka, New saponins from Vietnamese ginseng: Highlights on biogenesis of dammarane triterpenoids. Advances in Experimental Medicine and Biology, vol. 404, Edi., by G.R. Waller and K. Yamasaki, Plenum Press, New York and London(1996) 129. [2]. Furuya T., T. Yoshikawa, T. Ishii, K. Kaji, Effects of auxins on growth and saponin production in callus cultures of P. ginseng, Planta Med., 47 (3), (1983) 183. [3]. Kim S. J, Hahn E. J., heo J. W., and Paek K. Y. Effects of LEDs on net photosynthetic rate, growth and leaf stomata of Chrysanthemum plantlets in vitro, Sci. Hort. 101 (2004) 143-151. 49
  64. PHỤ LỤC A. XỬ LÍ SỐ LIỆU TRỌNG LƢỢNG PHÔI TƢƠI THÍ NGHIỆM 1 The SAS System 11:59 Monday, July 5, 2018 6 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TRONGLUONGTUOIPHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 28.06162222 14.03081111 99.47 F BA 2 28.06162222 14.03081111 99.47 <.0001 The SAS System 11:59 Monday, July 5, 2018 7 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TRONGLUONGTUOIPHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.141056 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 0.7504 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N BA A 8.2433 3 0.5 B 5.3233 3 0 C 4.0200 3 1 50
  65. B . XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ CHỒI THÍ NGHIỆM 1 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 42 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values BA 3 0 0.5 1 SOCHOI 6 2 3 7 8 9 10 Number of observations 9 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 43 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 76.22222222 38.11111111 114.33 F BA 2 76.22222222 38.11111111 114.33 <.0001 51
  66. The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 44 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.333333 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.1535 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N BA A 9.6667 3 1 B 7.3333 3 0.5 C 2.6667 3 0 52
  67. C. XỬ LÍ SỐ LIỆU TRỌNG LƢỢNG PHÔI TƢƠI THÍ NGHIỆM 2 The SAS System 22:47 Friday, July 16, 2018 8 The GLM Procedure Least Squares Means Adjustment for Multiple Comparisons: Dunnett H0:LSMean= TRONGLUONGPHOITUOI Control B N LSMEAN Pr > |t| 0 0 4.46666667 0.5 0.2 9.55333333 <.0001 1 0.2 6.81333333 <.0001 1 0.5 8.50333333 <.0001 53
  68. The SAS System 22:47 Friday, July 16, 2018 9 The GLM Procedure Class Level Information Class Levels Values BN 4 0.50.2 00 10.2 10.5 Number of observations 12 54
  69. The SAS System 22:47 Friday, July 16, 2018 10 The GLM Procedure Dependent Variable: TRONGLUONGPHOITUOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 44.35642500 14.78547500 141.78 F BN 3 44.35642500 14.78547500 141.78 F BN 3 44.35642500 14.78547500 141.78 <.0001 55
  70. The SAS System 22:47 Friday, July 16, 2018 11 The GLM Procedure t Tests (LSD) for TRONGLUONGPHOITUOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.104283 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 0.608 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N BN A 9.5533 3 0.50.2 B 8.5033 3 10.5 C 6.8133 3 10.2 D 4.4667 3 00 56
  71. D.XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ CHỒI NGHIỆM THỨC 2 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 13 The GLM Procedure Dependent Variable: SOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 206.6666667 68.8888889 137.78 F B 2 164.0000000 82.0000000 164.00 F B 1 130.6666667 130.6666667 261.33 <.0001 N 1 42.6666667 42.6666667 85.33 <.0001 B*N 0 0.0000000 . . . 57
  72. The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 16 The GLM Procedure Level of Level of SOCHOI B N N Mean Std Dev 0 0 3 2.3333333 0.57735027 0.5 0.2 3 3.6666667 0.57735027 1 0.2 3 13.0000000 1.00000000 1 0.5 3 7.6666667 0.57735027 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 17 The GLM Procedure Least Squares Means Adjustment for Multiple Comparisons: Dunnett H0:LSMean= SOCHOI Control B N LSMEAN Pr > |t| 0 0 2.3333333 0.5 0.2 3.6666667 0.1165 1 0.2 13.0000000 <.0001 1 0.5 7.6666667 <.0001 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 18 The GLM Procedure Class Level Information Class Levels Values BN 4 0.50.2 00 10.2 10.5 Number of observations 12 58
  73. The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 19 The GLM Procedure Dependent Variable: SOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 206.6666667 68.8888889 137.78 F BN 3 206.6666667 68.8888889 137.78 F BN 3 206.6666667 68.8888889 137.78 <.0001 59
  74. The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 20 The GLM Procedure t Tests (LSD) for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.5 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 1.3314 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N BN A 13.0000 3 10.2 B 7.6667 3 10.5 C 3.6667 3 0.50.2 D 2.3333 3 00 60
  75. E. XỬ LÍ SỐ LIỆU TRỌNG LƢỢNG PHÔI TƢƠI THÍ NGHIỆM 3 The SAS System 19:56 Monday, July 19, 2018 5 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values ANHSANG 5 D HQ KD PH T TRONGLUONGTUOIPHOI 15 4.81 4.99 5.03 5.06 5.21 5.35 5.69 5.9 5.96 6.01 6.19 6.78 7.03 7.22 7.73 Number of observations 15 The SAS System 19:56 Monday, July 19, 2018 6 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TRONGLUONGTUOIPHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 9.83409333 2.45852333 14.50 0.0004 Error 10 1.69560000 0.16956000 Corrected Total 14 11.52969333 R-Square Coeff Var Root MSE TRONGLUONGTUOIPHOI Mean 0.852936 6.943176 0.411777 5.930667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F ANHSANG 4 9.83409333 2.45852333 14.50 0.0004 61
  76. The SAS System 19:56 Monday, July 19, 2018 7 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TRONGLUONGTUOIPHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.16956 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.7491 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N ANHSANG A 7.3267 3 PH B 6.2200 3 D B C B 5.7733 3 HQ C C D 5.3300 3 KD D D 5.0033 3 T 62
  77. F. XỬ LÝ SỐ LIỆU TRỌNG LƢỢNG PHÔI TƢƠI THÍ NGHIỆM 4 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values ND 3 19 21 23 TRONGLUONGTUOIPHOI 9 8.13 8.53 8.55 9.01 9.57 9.88 9.95 10.12 10.31 Number of observations 9 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TRONGLUONGTUOIPHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 3.58968889 1.79484444 7.04 0.0267 Error 6 1.52940000 0.25490000 Corrected Total 8 5.11908889 R-Square Coeff Var Root MSE TRONGLUONGTUOIPHOI Mean 0.701236 5.406170 0.504876 9.338889 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F ND 2 3.58968889 1.79484444 7.04 0.0267 63
  78. The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TRONGLUONGTUOIPHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.2549 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.0087 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N ND A 10.1033 3 23 A B A 9.3567 3 21 B B 8.5567 3 19 64
  79. G. XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ CHỒI THÍ NGHIỆM 4 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 22 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values ND 3 19 21 23 SOCHOI 3 6 7 8 Number of observations 9 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 23 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 1.55555556 0.77777778 2.33 0.1780 Error 6 2.00000000 0.33333333 Corrected Total 8 3.55555556 R-Square Coeff Var Root MSE SOCHOI Mean 0.437500 8.518283 0.577350 6.777778 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F ND 2 1.55555556 0.77777778 2.33 0.1780 65
  80. The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 24 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.333333 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.1535 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N ND A 7.3333 3 21 A A 6.6667 3 19 A A 6.3333 3 23 66
  81. H. XỬ LÝ SỐ LIỆU TRỌNG LƢỢNG PHÔI TƢƠI THÍ NGHIỆM 5 The SAS System 11:52 Wednesday, July 21, 2018 9 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values OLIGOCHITOSAN 4 0 0.5 1 1.5 TRONGLUONGTUOIPHOI 12 3.11 3.29 3.93 4.17 4.24 4.28 4.35 4.56 4.63 7.56 7.91 8.72 Number of observations 12 The SAS System 11:52 Wednesday, July 21, 2018 10 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TRONGLUONGTUOIPHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 37.86402500 12.62134167 89.50 F OLIGOCHITOSAN 3 37.86402500 12.62134167 89.50 <.0001 67
  82. The SAS System 11:52 Wednesday, July 21, 2018 11 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TRONGLUONGTUOIPHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.141025 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 0.7071 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N OLIGOCHITOSAN A 8.0633 3 0 B 4.5133 3 0.5 B B 4.2300 3 1 C 3.4433 3 1.5 68
  83. I. XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ CHỒI THÍ NGHIỆM 5 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 38 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values OLIGOCHITOSAN 4 0 0.5 1 1.5 SOCHOI 7 0 1 3 4 5 7 8 Number of observations 12 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 39 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 76.25000000 25.41666667 76.25 F OLIGOCHITOSAN 3 76.25000000 25.41666667 76.25 <.0001 69
  84. The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 40 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.333333 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 1.0871 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N OLIGOCHITOSAN A 7.6667 3 0 B 4.6667 3 0.5 C 3.3333 3 1 D 0.6667 3 1.5 70