Khóa luận Nghiên cứu phân lập các flavonoid từ loài bùm bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell. – Arg.]

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu phân lập các flavonoid từ loài bùm bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell. – Arg.]

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  NGUYỄN THỊ SINH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC FLAVONOID TỪ LOÀI BÙM BỤP [Mallotus apelta (Lour.) Muell. – Arg.] KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2020
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  NGUYỄN THỊ SINH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC FLAVONOID TỪ LOÀI BÙM BỤP [Mallotus apelta (Lour.) Muell. – Arg.] KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH2015.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN XUÂN NHIỆM ThS. HÀ THỊ THANH HƯƠNG HÀ NỘI- 2020
3. LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, bạn bè và gia đình. Em xin trân trọng bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán bộ của Viện về sự quan tâm, ủng hộ to lớn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn thầy cô trong khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dạy bảo em trong suốt quá trình học tập ở trường và hoàn thiện khóa luận. Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS.TS. Nguyễn Xuân Nhiệm và ThS. Hà Thị Thanh Hương - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Em trân trọng và biết ơn sâu sắc tới tất cả mọi người trong gia đình, bạn bè đã động viên, khích lệ giúp em trong quá trình học tập và làm khóa luận. Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này, mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng chắc chắn còn có những thiếu sót. Vì vậy, em kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý thầy, cô và các bạn để khóa luận em được hoàn chỉnh hơn. Em xin chân thành cảm cảm ơn! Hà Nội, tháng 06 năm 2020 Sinh viên Sinh Nguyễn Thị Sinh
4. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13C-NMR Carbon -13 nuclear magnetic Phổ côṇ g hưởng từ haṭ nhân resonance spectroscopy carbon 13 1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance Phổ công̣ hưởng từ haṭ nhân spectroscopy proton D-HBV Duck hepatitis B virus Virut viêm gan B trên vịt DMSO Dimethyl sulfoxid ESI-MS Electrospray ionization mass Phổ khối lượng ion hóa phun spectrum mù điêṇ tử Glc Glucose HepG2 Hepatocyte carcinoma cell Tế bào ung thư gan HL-60 Human promyelocytic leukemia cell Tế bào ung thư máu người HMBC Heteronuclear mutiple bond Phổ tương tác di ̣ haṭ nhân correlation qua nhiều liên kết HSQC Heteronuclear single quantum Phổ tương tác di ̣ hạt nhân correlation qua 1 liên kết IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm KB Human epidmoid carcinoma Tế bào ung thư biểu mô người KH Kí hiệu NF-B Nuclear factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu RP18 Reversed-phase C18 Pha đảo C18 RD Rhabdosarcoma Ung thư màng tim TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo
5. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu về chi Mallotus 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật 3 1.1.2. Tình hình sử dụng trong y học cổ truyền các loài thuộc chi Mallotus 4 1.2. Giới thiệu về loài M. apelta 4 1.2.1. Đặc điểm thực vật 4 1.2.2. Sinh thái và phân bố 5 1.2.3. Thành phần hóa học 5 1.2.3.1. Các hợp chất diterpen 5 1.2.3.2. Các hợp chất coumarinolignoid 7 1.2.3.3. Các hợp chất benzopyran 8 1.2.3.4. Các hợp chất flavonoid 11 1.2.3.5. Các hợp chất alcaloid 12 1.2.3.6. Các hợp chất steroid 12 1.2.3.7. Các hợp chất triterpenoid 13 1.2.4. Tác dụng sinh học 14 1.2.4.1. Tác dụng hỗ trợ và điều trị ung thư 14 1.2.4.2. Hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn 15 1.2.4.3. Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, ức chế miến dịch 15 1.2.5. Công dụng 16 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Mẫu thực vật 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất 17 2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 17 2.2.1.2. Sắc ký cột (CC) 17 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc 17 2.2.2.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 17
6. 2.2.2.2. Điểm nóng chảy (Mp) 18 2.2.3. .Dụng cụ và thiết bị tách chiết 18 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 18 2.3. Hóa chất 18 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất 20 3.1.1. Chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn 20 3.1.1. Phân lập các hợp chất 20 3.2. Kết quả xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được 21 3.2.1. Hợp chất MA1: Vitexin 21 3.2.2. Hợp chất MA2: apigenin-7-O-β-D-glucosid 23 3.2.3. Hợp chất MA3: apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid 25 3.3. Thảo luận kết quả 27 3.3.1. Vitexin 27 3.3.2. Apigenin-7-O-β-D-glucosid 28 3.3.3. Apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29
7. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Mallotus đặc hữu của Việt Nam 3 Bảng 1.2. Các hợp chất diterpen (1-5) từ loài M. apelta 6 Bảng 1.3. Các hợp chất coumarinolignoid (6-12) từ loài M. apelta 7 Bảng 1.4. Các hợp chất benzopyran (13-24) từ loài M. apelta 8 Bảng 1.5. Các hợp chất flavonoid (25-26) 11 Bảng 1.6. Các hợp chất alcaloid (27-28) 12 Bảng 1.7. Các hợp chất steroid (29-32) 12 Bảng 1.8. Các hợp chất triterpenoid (33-35) 13 Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất MA1 và hợp chất tham khảo 22 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của chất MA2 và chất tham khảo 24 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của chất MA3 và chất tham khảo 25
8. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh loài M. apelta 4 Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất diterpen (1-5) 7 Hình 1.3. Cấu trúc các hợp chất coumarinolignoid (6-12) 8 Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất benzopyran (13-24) 11 Hình 1.5. Cấu trúc các hợp chất flavonoid (25-26) 11 Hình 1.6. Cấu trúc các hợp chất alcaloid (27-28) 12 Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất steroid (29-32) 13 Hình 1.8. Cấu trúc các hợp chất triterpenoid (33-35) 14 Hình 3.1. Sơ đồ chiết, phân lập các hợp chất từ loài M. apelta 21 Hình 3.2. Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của hợp chất MA1 22 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất MA2 24 Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất MA3 25
9. MỞ ĐẦU Điều kiện tự nhiên và khí hậu đặc trưng và đa dạng giữa vùng miền, đã đem lại cho đất nước Việt Nam một hệ sinh thái thực vật phong phú. Bên cạnh đó, Việt Nam cũng là một trong những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại thảo dược trong điều trị bệnh và tăng cường sức khoẻ. Theo các nhà khoa học, Việt Nam có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao. Trong đó, hơn 4.000 loài được sử dụng làm dược liệu và thuốc chữa bệnh [1]. Vai trò của nguồn tài nguyên cây thuốc ngày càng được nâng cao do có tiềm năng to lớn trong việc nghiên cứu phát triển các loại thuốc trong điều trị bệnh. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), việc sử dụng các loại thuốc thảo dược truyền thống đã trở nên quan trọng hơn, ngay cả trong y học phương Tây [27]. Hướng nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các cây thuốc truyền thống đang là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan tâm. Đó là những nghiên cứu cơ bản về xác định thành phần hóa học và tìm ra hoạt chất thể hiện hoạt tính tác dụng chữa bệnh và nâng cao sức khỏe con người. Cho đến nay, trên thế giới đã tìm ra nhiều hợp chất có nguồn gốc tự nhiên sử dụng làm thuốc để điều trị và nâng cao sức khỏe. Chi Ba bét (Mallotus) là một chi khá lớn, gồm khoảng 150 loài, phân bố tại các khu vực từ Ấn Độ, Sri Lanka đến các nước Đông Nam Á.Trên thế giới, một số loài thuộc chi Mallotus được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các loại bệnh khác nhau. Ở Trung Quốc, loài bục núi cao M. japonicus được sử dụng để chữa bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng và điều hòa các chức phận của bộ máy tiêu hóa nói chung. Loài bục trườn M. repandus được sử dụng tại Thái Lan để chữa bệnh viêm dạ dày, viêm đau gan, viêm đau khớp và chữa rắn độc cắn. Ở nước ta, loài bai bái M. contubernalis làm thuốc chữa các bệnh thấp khớp, u phong, mụn nhọt và ngứa [5]. Các nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy các loài thuộc chi Mallotus chứa nhiều hợp chất nhóm flavonoid có hoạt tính tốt như: kháng nấm, kháng ký sinh trùng, gây độc tế bào, chống oxy hóa, [24]. Xuất phát từ các cơ sở trên, việc nghiên cứu và khai thác các chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong lĩnh vực Y-Dược từ các nguồn dược liệu ở Việt Nam là rất cần thiết và có ý nghĩa về mặt khoa học cũng như thực tiễn. Vì vậy, em đã lựa chọn loài M. apelta thuộc chi Mallotus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài: “Nghiên cứu phân lập các hợp chất flavonoid từ loài Bùm bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell. –Arg.]”. Với mục đích nghiên cứu thành phần 1
10. flavonoid có trong loài Bùm bụp và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã được phân lập. Nội dung của khóa luận tốt nghiệp bao gồm: 1. Chiết xuất, phân lập một số hợp chất flavonoid từ loài M. apelta bằng các phương pháp sắc ký; 2. Xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được bằng các phương pháp vật lý và hóa học. 2
11. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về chi Mallotus 1.1.1. Đặc điểm thực vật Chi Mallotus (Ba bét) thuộc bộ Malpighiales (Sơ ri), họ Euphorbiaceae (Thầu dầu), phân họ Acalyphoidae (Tai tượng). Chi Mallotus là loại cây bụi, bụi trườn hoặc gỗ nhỏ đến cây gỗ; cây thường đơn tính, khác gốc hoặc cùng gốc. Lá xếp xoắn ốc hoặc mọc đối. Cụm hoa đơn tính, mọc ở đầu cành hay nách lá; thường là chùm hoặc bông, ít khi là chùy. Hoa đơn tính; đài 2 – 4 (5) thùy, không cánh tràng. Quả nang nhẵn hoặc có lông hình sao hoặc nhẵn, khi khô nứt làm 3 mảnh. Hạt gần hình cầu hay hình trứng, vỏ nhẵn, bóng màu đen [5]. Mallotus là chi tương đối lớn trong họ Euphorbiaceae, gồm khoảng 150 loài [5, 24], phân bố rải rác ở vùng nhiêṭ đới Nam Á và Đông Nam Á như ở Malaysian có 75 loài, Trung Quốc có 40 loài, [7]. Nơi tập trung sự đa dạng cao nhất của chi này là vùng nhiệt đới Nam Á và Đông Nam Á [1]. Ở Việt Nam, theo thống kê có 40 loài thuộc chi Mallotus [7, 24] với 7 loài đặc hữu [7]. Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Mallotus đặc hữu của Việt Nam STT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố 1 Mallotus canii Thin Ba bét gia lai Gia Lai 2 Mallotus chuyenii Thin Ba bét hòa bình Hòa Bình 3 Mallotuseberhardtii Gagnep Đỏ đọt, ngoát, Các tỉnh miền Trung và ngút miền Nam như Thừa Thiên Huế, Kiên Giang 4 Mallotushanheoensis Thin Ba bét hòn hèo Các tỉnh miền Nam 5 Mallotuspoilanei Gagnep Si ta Các tỉnh miền Trung 3
12. 6 Mallotussathavensis Thin Ba bét sa thày Kon Tum 7 Mallotus cuneatus Ridl. var. Ba bét nhẵn Các tỉnh phía Bắc glabratus Thin 1.1.2. Tình hình sử dụng trong y học cổ truyền các loài thuộc chi Mallotus Trên thế giới, một số loài thuộc chi Mallotus được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các loại bệnh khác nhau. Ở Trung Quốc, loài bục núi cao M. japonicus được sử dụng để chữa bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng và điều hòa các chức phận của bộ máy tiêu hóa nói chung. Loài bục trườn M. repandus được sử dụng tại Thái Lan để chữa bệnh viêm dạ dày, viêm đau gan, viêm đau khớp và chữa rắn độc cắn. Ở nước ta, loài bai bái M. contubernalis làm thuốc chữa các bệnh thấp khớp, u phong, mụn nhọt và ngứa [2, 4, 5]. 1.2. Giới thiệu về loài M. apelta 1.2.1. Đặc điểm thực vật Hình 1.1. Hình ảnh loài M. apelta Tên khoa học: Mallotus apelta (Lour.) Muell.-Arg [1]. Tên Việt Nam: Bùm bụp, bông bét, lá cám, cây ruông, may tap chỉ (Tày), co po hu (Thái) [1]. Cấp bậc sinh giới [24]: Giới Thực vật: Plantae Ngành Ngọc Lan: Magnoliophyta Lớp Ngọc Lan: Magnoliophyta 4
13. Bộ Sơ ri: Malpighiales Họ Thầu dầu: Euphorbiaceae Chi: Mallotus Cây bụi hoặc cây gỗ nhỡ cao 1 – 6 m [21]. Cành non có lông màu vàng nhạt. Lá mọc so le, hình bầu dục hay hình trứng, nguyên hoặc chia 3 thùy nông, dài khoảng 20 cm, rộng 12 cm, mép nguyên hoặc khía răng thưa không rõ ràng, gốc hình tim hoặc gần bằng, mặt trên màu lục, mặt dưới phủ lông mềm và phấn màu trắng, gân lá hình mạng rõ, có 3 – 5 cái tỏa từ gốc, cuống lá dài 10 – 20 cm, có lông. Hoa đơn tính khác gốc mọc thành bông đuôi sóc, thõng xuống, dài 20 – 50 cm; cụm hoa đực đôi khi phân nhánh, hoa không cuống, dài có 4 răng, hơi dính nhau ở gốc, không có tràng, nhị rất nhiều, chỉ nhị nhẵn, không có nhụy lép; cụm hoa cái có đài hợp, 4 – 5 răng, có lông trắng, vòi nhụy 3 – 4, bầu có gai mềm [24]. Quả nang có nhiều gai mềm phủ đầy lông hình sao màu trắng nhạt, khi chín nứt làm 3 mảnh; hạt hình trứng, màu nâu đen. Ra hoa tháng 4 – 6, có quả tháng 7 – 9 [5]. 1.2.2. Sinh thái và phân bố Cây thường mọc ở ven rừng, ven đường, trên sườn đồi núi sau nương rẫy, trên bãi đất hoang, lên tới độ cao 700 m (so với mực nước biển). Khả năng tái sinh bằng hạt mạnh, nhất là ở những nơi đất còn tốt và chiếu sáng nhiều, cây mọc từ hạt sau 2 năm đã có thể ra hoa [1, 5]. Cây phân bố rộng rãi ở miền Nam Trung Quốc và ở các nước Đông Nam Á. Ở Việt Nam, cây phân bố tại Sơn La, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Hòa Bình, Ninh Bình, Hà Nam đến các tỉnh Tây Nguyên, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu [5, 21]. 1.2.3. Thành phần hóa học Theo những công trình đã được công bố cho thấy, thành phần hóa học của loài M. apelta, bao gồm các nhóm chất chính như: diterpenoid, coumarin, triterpene, steroid, benzopyran, flavonoid và alcaloid [21, 22]. Các hợp chất hóa học được phân lập từ các bộ phận khác nhau của loài này. 1.2.3.1. Các hợp chất diterpen Các nghiên cứu về hóa thực vật loài M. apelta đã được các nhà khoa học Trung Quốc quan tâm nghiên cứu khá sớm. Năm 1999, nhóm nghiên cứu của các 5
14. tác giả Cheng X.F. công bố sự phân lập và xác định cấu trúc của 5 hợp chất diterpen mới (1-5) (Bảng 1.1, Hình 1.2). Bảng 1.2. Các hợp chất diterpen (1-5) từ loài M. apelta KH Tên chất Bộ phận TLTK 1 10-Hydroxycembren-5-one Thân rễ [13, 24] 2 6-Hydroxycembrene-5,10-dione Thân rễ [13, 24] 3 malloapeltene (6,10- Thân rễ [12] dihydroxycembrene-5-one) 4 2α,4β,15,16- Thân rễ [12] tetrahydroxydolabradane 5 malloapeltin (4α,15,16- Thân rễ [12] tetrahydroxydolabradane) 6
15. Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất diterpen (1-5) 1.2.3.2. Các hợp chất coumarinolignoid Theo các công trình công bố, có 7 hợp chất coumarinolignoid được phân lập từ loài M. apelta (6-12) (Bảng 1.2, Hình 1.3) Bảng 1.3. Các hợp chất coumarinolignoid (6-12) từ loài M. apelta KH Tên chất Bộ phận TLTK 6 Malloapelin A Thân rễ [24] 7 Cleomiscosin A Thân rễ [5, 11] 8 Cleomiscosin B Thân rễ [24] 9 Malloapelin B Thân rễ [24] 10 Malloapelin C Thân rễ [24] 11 5'-dmethylaquillochin Thân rễ [5, 11] 12 Aquillochin Thân rễ [5, 11] 7
16. Hình 1.3. Cấu trúc các hợp chất coumarinolignoid (6-12) 1.2.3.3. Các hợp chất benzopyran Có 12 hợp chất benzopyran (13-24) đã được các nhà khoa học phân lập và xác định cấu trúc từ loài M. apelta (Bảng 1.3, Hình 1.4) Bảng 1.4. Các hợp chất benzopyran (13-24) từ loài M. apelta KH Tên chất Bộ phận TLTK 13 4-Hydroxy-2,6-dimethyl-6-(3,7-dimethyl-2, Lá [8] 6-octadienyl)-8-(3-methyl-2-butenyl)-2H-1- benzopyran-5,7(3H,6H)-dione 14 4-Hydroxy-2,6,8-trimethyl-6-(3,7-dimethyl-2,6- Lá [8] octadienyl)-2H-1-benzopyran -5,7(3H,6H)-dione 15 5-Hydroxy-2,8-dimethyl-6-(3-methyl-2-butenyl)- Lá [8] 8-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-2H-1- benzopyran-4,7(3H,8H)-dione 16 5-Hydroxy-2,6,8-trimethyl-8-(3,7-dimethyl-2,6- Lá [8] octadienyl)-2H-1-benzopyran-4,7(3H,8H)-dione 17 2,3-Dihydro-5,7-dihydroxy-2,6-dimethyl-8-(3- Lá [8] methyl-2-butenyl)-4H-1-benzopyran-4-one 8
17. 18 2,3-Dihydro-5,7-dihydroxy-2,8-dimethyl-6-(3- Lá [8] methyl-2-butenyl)-4H-1-benzopyran-4-one 19 2,3-Dihydro-5,7-dihydroxy-2,6,8-trimethyl-4H- Lá [8] 1-benzopyran-4-one 20 6β-hydroxy-2α,8β-dimethyl-6-(3-methyl-2- Lá [9] butenyl)-8-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-2H-1- benzopyran-4,5,7(3H,6H,8H)-trione 21 6β-hydroxy-2α,6α,8β-trimethyl-8-(3,7-dimethyl- Lá [9] 2,6-octadienyl)-2H-1-benzopyran- 4,5,7(3H,6H,8H)-trione 22 8-(1'-Oxo-2'-en-butyl)-5,7-dimethoxy-2,2- Lá [20] dimethyl-2H-1-benzopyran hay malloapelta B 23 6-(1'-Oxo-3'(R)-hydroxy-butyl)-5,7-dimethoxy- Lá [16] 2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran 24 6-(1'-Oxo-3'(R)-methoxy-butyl)-5,7-dimethoxy- Lá [16] 2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran 9
18. Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất benzopyran (13-24) 1.2.3.4. Các hợp chất flavonoid Qua tài liệu có 2 hợp chất flavonoid được phân lập từ loài này (25-26) (Bảng 1.4, Hình 1.5) Bảng 1.5. Các hợp chất flavonoid (25-26) KH Tên chất Bộ phận TLTK 25 Quercitrin Lá [23] 26 Astilbin Lá [23] Hình 1.5. Cấu trúc các hợp chất flavonoid (25-26) 11
19. 1.2.3.5. Các hợp chất alcaloid Theo các công trình công bố có 2 hợp chất alcaloid được phân lập từ loài M. apelta (27-28) (Bảng 1.5, Hình 1.6). Bảng 1.6. Các hợp chất alcaloid (27-28) KH Tên chất Bộ phận TLTK 27 Maloapentine Thân rễ [14] 28 Axit 4,5,4′-trimethyl-ellagic Thân rễ [14] Hình 1.6. Cấu trúc các hợp chất alcaloid (27-28) 1.2.3.6. Các hợp chất steroid Theo các công trình công bố, có 4 hợp chất steroid được phân lập từ loài M. apelta (29–32) (Bảng 1.6, Hình 1.7) Bảng 1.7. Các hợp chất steroid (29-32) KH Tên chất Bộ phận TLTK 29 β-sitosterol Thân, rễ, lá [24] 30 Sitosteryl β-D-glucose hay Thân cây, lá [24] daucosterol 31 Ergosterol Lá [24] 32 Stigmasterol Lá [24] 12
20. Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất steroid (29-32) 1.2.3.7. Các hợp chất triterpenoid Theo các công trình công bố, có 3 hợp chất triterpenoid được phân lập từ loài M. apelta (33–35) (Bảng 1.7, Hình 1.8) Bảng 1.8. Các hợp chất triterpenoid (33-35) KH Tên chất Bộ phận TLTK 33 3β,29-dihydroxylupane Thân rễ [24] 34 Erythrodiol-3-acetate Thân rễ [24] 35 Axit acetylursolic Thân rễ [24] 13
21. Hình 1.8. Cấu trúc các hợp chất triterpenoid (33-35) Như vậy: Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy thành phần hóa học của loài M. apelta rất đa dạng và phong phú. Nhiều hợp chất mới, có cấu trúc đặc trưng của loài M. apelta như một số hợp chất terpen, benzopyran, coumarinolignoid, flavonoid và steroid. Điều này góp phần tạo cơ sở khoa học lý giải công dụng chữa bệnh theo y học cổ truyền Việt Nam, Trung Quốc và các quốc gia khác. 1.2.4. Tác dụng sinh học 1.2.4.1. Tác dụng hỗ trợ và điều trị ung thư Hoạt tính sinh học của một số hợp chất được phân lập từ các loài thuộc chi Mallotus có hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro trên các dòng tế bào ung thư màng tim (RD), ung thư gan (Hep-2), ung thư biểu mô (KB) [8, 16, 24]. Hai hợp chất benzopyran 6-(1'-Oxo-3'(R)-hydroxy-butyl)-5,7-dimethoxy- 2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran (23) và 6-(1'-Oxo-3'(R)-methoxy-butyl)-5,7- dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran (24) được phân lập từ lá của loài M. apelta có hoạt tính gây độc tế bào . Kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất 6-(1'- Oxo-3'(R)-methoxy-butyl)-5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran (24) có 14
22. tác dụng gây độc tế bào mạnh trên 2 dòng tế bào ung thư Hep-2 và RD với giá trị IC50 lần lượt là 0,49 và 0,54 µg/ml, trong khi đó hợp chất 6-(1'-Oxo-3'(R)-hydroxy- butyl)-5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran (23) cho tác dụng vừa phải trên dòng tế bào ung thư Hep-2 với giá trị IC50 là 4,22 µg/ml [16]. Nghiên cứu cho thấy hợp chất malloapelta B (22) cho thấy tác dụng gây độc tế bào mạnh đối với 2 dòng tế bào ung thư gan (Hep-2) và ung thư biểu mô (KB) với giá trị IC50 lần lượt là 0,49 µg/m và 0,54 µg/m [23]. 1.2.4.2. Hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn Nghiên cứu công bố năm 1993 của tác giả Feng L. cho thấy 4 hợp chất erythrodiol-3-acetate (34), β-sitosterol (29), 3β,29-dihydroxylupane (33) và axit acetylursolic (35) có hoạt tính kháng khuẩn. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn cho thấy, các hợp chất (29), (33-35) thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn Staphulococus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, và Bacillus pyocyaneum [25]. Nhóm các tác giả An T. Y. đã tiến hành nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng sinh trên các chủng Staphulococus aureus, Micrococus lutens, Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli của 7 dẫn xuất benzopyran là 4-Hydroxy-2,6- dimethyl-6-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-8-(3-methyl-2-butenyl)-2H-1- benzopyran-5,7(3H,6H)-dione (13), 4-Hydroxy-2,6,8-trimethyl-6-(3,7-dimethyl- 2,6-octadienyl)-2H-1-benzopyran -5,7(3H,6H)-dione (14), 5-Hydroxy-2,8- dimethyl-6-(3-methyl-2-butenyl)-8-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-2H-1- benzopyran-4,7(3H,8H)-dione (15), 5-Hydroxy-2,6,8-trimethyl-8-(3,7-dimethyl- 2,6-octadienyl)-2H-1-benzopyran-4,7(3H,8H)-dione (16), 2,3-Dihydro-5,7- dihydroxy-2,6-dimethyl-8-(3-methyl-2-butenyl)-4H-1-benzopyran-4-one (17), 2,3- Dihydro-5,7-dihydroxy-2,8-dimethyl-6-(3-methyl-2-butenyl)-4H-1-benzopyran-4- one (18), 2,3-Dihydro-5,7-dihydroxy-2,6,8-trimethyl-4H-1-benzopyran-4-one (19). Kết quả thu được cho thấy, chỉ có hợp chất (13) thể hiện hoạt tính trung bình trên chủng M. lutens với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 7,34 µg/ml [8]. Hợp chất malloapleta B có hoạt tính ức chế yếu tố gây viêm NF-B với giái trị IC50 = 5,0 µM [23]. 1.2.4.3. Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, ức chế miến dịch Theo nghiên cứu, hợp chất astilbin (26) có hoạt tính chống oxy hóa, bảo vê ̣ gan, ứ c chế miễn dicḥ [6]. 15
23. Các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu khả năng kháng vi rút viêm gan B in vivo (duck hepatitis B virus: D-HBV) của rễ Bùm bụp trên vịt. Kết quả nghiên cứu cho thấy, rễ loài này có tác dụng ngăn cản sự phân chia của tế bào D- HBV in vivo. Mặc dù tác dụng yếu hơn chất đối chứng dương là lamivudine, rễ loài này lại có tác dụng kéo dài hơn [29]. Các coumarino-lignoit malloapelin A (6), B (9), C (10) được đánh giá có hoạt tính bảo vệ gan trên dòng tế bào gan chuột WB-F344. Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất (6), (9) và (10) đều thể hiện hoạt tính in vitro ở nồng độ 10-4 M và không thể hiện độc tính đáng kể khi so sánh với chất đối chứng dương là bicyclol và silybin (ức chế 45,5% ở 50 µM), là các hợp chất đã được biết đến với hoạt tính bảo vệ gan rất mạnh [28]. Như vậy: Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài M. apelta cho thấy loài này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học thú vị như gây độc tế bào ung thư, kháng khuẩn, bảo vệ gan, Chính vì thế, việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các hợp chất được phân lập từ loài Bùm bụp có ý nghĩa rất quan trọng để phục vụ cho cuộc sống. 1.2.5. Công dụng Trên thế giới, ở một số nước như Trung Quốc M.apelta được dùng như một vị thuốc cổ truyền để chữa các bệnh viêm nhiễm, máu trắng và các bệnh về gan và đường tiêu hoá. Gần đây các nhà khoa học trung quốc còn phát hiện ra dịch chiết MeOH của cây này có hoạt tính kháng HIV. Ở Việt Nam theo Võ Văn Chi, M. apelta có vị hơi đắng và chát, tính bình. Rễ có tác dụng hoạt huyết, bổ vị tràng. Lá và vỏ cây có tác dụng tiêu viêm, cầm máu. Rễ thường dùng chữa viêm gan mãn tính, sưng gan lá lách, sa tử cung và trực tràng, huyết trắng, phù thũng khi có thai, viêm ruột ỉa chảy, Lá và vỏ thân chống nôn, chữa viêm loét hành tá tràng, cầm máu. Ngoài ra còn chữa trị viêm tai giữa, cụm nhọt, các tổn thương và chảy máu [1]. 16
24. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Mẫu thân lá cây bùm bụp (M. apelta) được thu hái tại xã Ngọc Thanh, huyện Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc, được giám định bởi TS. Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản được lưu tại phòng Nghiên cứu cấu trúc -Viện Hóa Sinh Biển & Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. Mẫu thực vật được phơi khô, nghiền nhỏ trước khi đem chiết. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất 2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch axit sulfuric 10% được phân bố đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu. 2.2.1.2. Sắc ký cột (CC) Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel với kích thước hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh); pha đảo sử dụng loại RP-18 có cỡ hạt là 30-50 m (Fujisilysia Chemical Ltd.); Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.). 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định trên cơ sở sử dụng các phép xác định thông số vật lý và các phương pháp đo phổ bằng các thiết bị hiện đại đồng thời kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo. Các phương pháp đo được sử dụng gồm có: 2.2.2.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ NMR được đo trên máy đo trên máy Brucker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội là TMS), tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm: - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều:1 H-NMR, 13C-NMR. 17
25. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân haichiều: HSQC, HMBC. - Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: DMSO, CD3OD. 2.2.2.2. Điểm nóng chảy (Mp) Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro – hotstage của Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ việt Nam. 2.2.3. .Dụng cụ và thiết bị tách chiết Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch dược sử dụng bao gồm: + Bình chiết 30 lít + Máy cô quay chân không + Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 365 nm + Tủ sấy chân không + Máy sấy + Micropipet + Bình sắc ký loại phân tích và điều chế + Cột sắc ký pha thường và phao đảo các loại đường kính + Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% + Bếp điện 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của hợp chất + Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy BRUKER Avante 500 với chất chuẩn nội TMS (Tetrametyl Silan) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. + Máy đánh siêu âm POWERSON IC 603 của hãng Hwashin Technology, Korea. + Cân phân tích 4 số Ohaus P124 của hãng Ohaus Corporation, USA. + Máy cất quay chân không. + Tủ hút chân không. + Đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm. 2.3. Hóa chất 18
26. + Silica gel 60 (0,04 – 0,063 mm) Merck + Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30 – 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd) + Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC – Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) + Bản mỏng tráng sẵn pha đảo PR18 F254s (Merck) + Bản mỏng điều chế pha thường DC - Alufolien 60 F254 (Merck) + Các loại dung môi hữu cơ như acetone, ethyl acetate, hexan, methanol, water, dichloromethane, v.v 19
27. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất 3.1.1. Chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn Thân lá Bùm bụp (M. apelta) được rửa sạch, phơi khô, làm nhỏ. Cân 5 kg mẫu đã làm nhỏ và được ngâm chiết với 20L dung môi methanol kết hợp với siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 10 giờ, rút lấy dịch chiết lần một. Bổ sung thêm dung môi ngập dược liệu 2-3cm (20L/lần) và tiếp tục chiết thêm hai lần, thu được dịch chiết lần hai và lần ba. Gộp dịch chiết 3 lần, lọc các dịch chiết methanol thu được qua giấy lọc đem cất thu hồi methanol dưới áp suất giảm thu được khoảng 568 g cao chiết tổng methanol (MA). Hòa tan 500g cao đặc trong nước ấm, tỷ lệ thể tích cao đặc: nước cất ấm (1:1) thu được dịch chiết nước. Dịch chiết nước đem chiết với dung môi dichloromethane, tỷ lệ thể tích dichloromethane: nước ấm (1:1) chiết lặp lại 3 lần, mỗi lần 500ml dung môi trong 30 phút. Phân đoạn dịch chiết thu được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy ở nhiệt độ 600C đến cặn. Cặn chiết này được phân bố đều trong nước cất và chiết với CH2Cl2 thu được cặn CH2Cl2 (1A, 250 g) và lớp nước (1B, 318 g). 3.1.1. Phân lập các hợp chất Phần nước 1B được cất loại bỏ dung môi hữu cơ, sau đó đưa lên cột sắc ký trao đổi ion với chất hấp phụ là Diaion HP-20 với hệ dung môi tăng dần nồng độ methanol trong nước (25, 50, 75, 100%) thu được 4 phân đoạn 2A (15g), 2B (10g), 2C (6g) và 2D (7g). Phân đoạn 2C được chạy sắc ký trên cột silica gel pha thuận với hệ dung môi gradien CH2Cl2:MeOH (20:1→0:1) thu được 4 phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là 3A (500 mg), 3B (700 mg), 3C (1,2 g) và 3D (1 g). Phân đoạn 3C được tiến hành sắc ký qua cột RP-18 với hệ dung môi acetone:H2O (1:1,5) thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là 4A (120 mg), 4B (150 mg), 4C (300 mg), 4D (50 mg) và 4E (150 mg). Hợp chất MA1 (30,4 mg) và MA2 (10,6 mg) thu được từ phân đoạn 4C thông qua sắc ký cột sephadx LH-20, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (1:1). Tiến hành sắc ký phân đoạn 4E qua cột pha đảo YMC PR-18 sử dụng hệ dung môi acetone:H2O (1:3) thu được các phân đoạn 5A (20mg), 5B (30 mg) và 5C (50 mg). Gộp 2 phân đoạn 5A và 5B tiến hành sắc ký bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng 20
28. cao (HPLC) với dung môi 22% acetonitrile ACN:H2O thu được hợp chất MA3 (5,0 mg) ở thời gian lưu của pic 39,7 phút. Hình 3.1. Sơ đồ chiết, phân lập các hợp chất từ loài M. apelta 3.2. Kết quả xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được 3.2.1. Hợp chất MA1: Vitexin Chất bột màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy: tnc = 273 – 275 ˚C Công thức phân tử: C21H20O10, M = 432. 1 13 Số liệu phổ H- và C-NMR (DMSO-d6) của hợp chất MA1 và hợp chất tham khảo xem Bảng 3.1. 21
29. Hình 3.2. Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của hợp chất MA1 Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất MA1 và hợp chất tham khảo #,a a,b a,c C δC δC δH (mult, J= Hz) HMBC (H→C) 2 165.0 163.92 - 3 103.2 102.41 6.76 (s) 2,4,10,1′ 4 183.1 182.04 - 5 161.7 160.38 - 6 99.0 98.14 6.26 (s) 5,7,8,10 7 163.7 162.68 - 8 105.4 104.59 - 9 157.1 155.98 - 10 105.2 104.59 - 1′ 122.7 121.59 - 2′ 129.7 129.00 8.02 (d, 8.0) 2,4′,6′ 3′ 116.6 115.00 6.89 (d, 8.0) 1′,4′,5′ 4′ 162.2 161.3 - 5′ 116.6 115.00 6.89 (d, 8.0) 1′,2′,3′ 6′ 129.7 129.00 8.02 (d, 8.0) 2,2′,4′ 5-OH - - 13.15 (s) 5,6,10 1′′ 74.4 73.36 4.69 (d, 10.0) 7,8,9 2′′ 71.9 70.84 3.84 (t, 9.5) 8 3′′ 79.9 78.65 3.29 (m) 4′′ 71.6 70.54 3.34 (m) 5′′ 82.5 81.80 3.26 (m) 3.51 (m) 6′′ 62.4 61.28 3.76 (m) a b c # Đo trong DMSO-d6, 125 MHz, 500 MHz, δC của vitexin [18]. Hợp chất MA1 thu được dưới dạng bột vô định hình màu vàng. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất MA1 thấy có xuất hiện hai cặp tín hiệu doublet tại δH 6,89 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3′, H-5′) và 8,02 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2′, H-6′) đặc trưng cho vòng thơm thế para, tín hiệu hai proton thơm tại δH 6,76 (1H, s, H-3) và 6,26 (1H, s, H-6) cho phép dự đoán đây là một hợp chất flavonoid dạng apigenin. Ngoài ra, trên phổ này 22
30. cũng quan sát thấy tín hiệu của một proton anome tại δH 4,69 (1H, d, J =10,0 Hz, H-1'') gợi ý trong MA1 có mặt của một gốc đường. Các proton của một cấu tử đường cũng được phát hiện trong vùng tín hiệu δH 3,26 – 4,69 ppm. Đặc biệt, giá trị hằng số tương tác J của proton gắn vào cacbon anome có giá trị cao hơn (J =10,0 Hz) so với các giá trị tương ứng trong trường hợp nối qua liên kết O-glycosid. Điều này gợi ý sự có mặt của một cấu tử đường nối C-C vào aglycon. Trên phổ 13C-NMR của MA1 xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử cacbon. Trong đó có 6 tín hiệu tại δC 73,36 (C-1′′), 70,84 (C-2′′), 78,65 (C-3′′), 70,54 (C- 4′′), 81,80 (C-5′′), 61,28 (C-6′′) khẳng định sự có mặt của gốc đường glucose và tín hiệu 15 nguyên tử cacbon δC 163,92 (C-2), 102,41 (C-3), 182,04 (C-4), 160,38 (C- 5), 98,14 (C-6), 162,68 (C-7), 104,59 (C-8), 155,98 (C-9), 104,59 (C-10), 121,59 (C-1′), 129,00 (C-2′, 6′), 115,00 (C-3′, 5′), 161,3 (C-4′) thuộc vào khung flavonoid có vòng B thế para. So sánh số liệu phổ NMR của MA1 với của hợp chất vitexin [18] cho thấy sự tương đồng ở các vị trí tương ứng. Ngoài ra, việc ghi các phổ HSQC và HMBC cũng được thực hiện để có thể gán một cách chính xác các giá trị độ dịch chuyển hóa học của các vị trí tương ứng. Tương tác HMBC của H-1''glc với C-7, C-8 và C-9 khẳng định sự có mặt của liên kết C-C và vị trí của liên kết này với C-8. Tương tác HMBC của H-6 (δH 6,26) với C-8, C-10 cũng như tương tác của H-3 (δH 6,76) với C-10, C-1' cũng đã khẳng định sự có mặt của 2 nhóm hydroxyl tại C-5 và C-7, nối đôi tại C2/C3. Thêm vào đó, tương tác HMBC rất rõ của proton 5-OH (δH 13,15) với C-5 (δC 160,38) và tương tác H-1''glc với C-9 (δC 155,98) khẳng định δC của C-9 phải là 155,98 và C-5 phải là 160,38. Từ những dữ liệu trên cho phép xác định hợp chất MA1 là vitexin. 3.2.2. Hợp chất MA2: apigenin-7-O-β-D-glucosid Chất bột vô định hình màu vàng Nhiệt độ nóng chảy: tnc = 218 – 220 ˚C Công thức phân tử C21H20O10, M = 432 1 13 Số liệu phổ H- và C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.2. 23
31. Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất MA2 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của chất MA2 và chất tham khảo # a,b a,c C δC δC δH (Mult, J = Hz) 2 164.2 164.3 - 3 103.0 103.0 6.84 (1H, s) 4 181.6 182.0 - 5 161.0 161.6 - 6 99.6 99.6 6.43 (1H, d, 1.5) 7 162.8 162.9 - 8 94.9 94.9 6.82 (1H, d, 1.5) 9 156.8 156.9 - 10 105.3 105.3 - 1′ 121.1 120.9 - 2′, 6′ 128.1 128.6 7.94 (1H, d, 8.5) 3′, 5′ 115.8 116.1 6.92 (1H, d, 8.5) 4′ 160.9 161.1 - 1′′ 100.3 99.9 5.06 (1H, d, 7.5) 2′′ 73.1 73.1 3.26 (1H, dd, 7.5, 9.0) 3′′ 77.0 77.2 3.45 (1H, t, 9.0) 4′′ 69.9 69.6 3.19 (1H, t, 9.0) 5′′ 76.4 76.5 3.29 (1H, m) 3.71 (1H, d, 11.5) 6′′ 60.8 60.6 3.50 (1H, dd, 6.0, 11.5) a b c Đo trong DMSO-d6, 125 MHz, 500 MHz, # δC của apigenin-7-O-β-D-glucosid [19]. Hợp chất MA2 thu được dưới dạng bột vô định hình màu vàng. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất MA2 thấy có xuất hiện cặp tín hiệu doublet tại δH 6,43 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6) và 6,82 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8) điển hình cho hai proton ở vị trí C-6 và C- 24
32. 8 của vòng A và một proton thơm tại δH 6,84 (1H, s, H-3) của hợp chất flavonoid. Hai cặp tín hiệu doublet khác tại δH 6,92 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′) và 7,94 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′) đặc trưng cho vòng thơm B thế para, cho phép dự đoán đây là một hợp chất flavonoid dạng apigenin. Ngoài ra, trên phổ này cũng quan sát thấy tín hiệu của một proton anome tại δH 5,06 (1H, d, J =7,5 Hz, H-1'') gợi ý trong MA2 có mặt của một gốc đường. Phổ 13C-NMR và HSQC của hợp chất MA2 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 21 nguyên tử cacbon. Trong đó có 6 tín hiệu tại δC 99,9 (C-1′′), 73,1 (C-2′′), 77,2 (C-3′′), 69,6 (C-4′′), 76,5 (C-5′′), 60,6 (C-6′′) khẳng định sự có mặt của gốc đường glucose và tín hiệu 15 nguyên tử cacbon δC 164,3 (C-2), 103,0 (C-3), 182,0 (C-4), 161,6 (C-5), 99,6 (C-6), 162,9 (C-7), 94,9 (C-8), 156,9 (C-9), 105,3 (C-10), 120,9 (C-1′), 128,6 (C-2′, 6′), 116,1 (C-3′, 5′), 161,1 (C-4′) thuộc vào khung flavonoid có vòng B thế para. Các dữ kiện phổ 1H, 13C-NMR của MA2 gợi ý đây là một flavonoid dạng apigenin gắn với một đường glucose. So sánh các dữ liệu phổ NMR của MA2 với hợp chất apigenin-7-O-β-D-glucosid đã được công bố từ loài S. tenuifolia [19] cho thấy sự tương đồng ở các vị trí tương ứng. Như vậy, từ dữ liệu trên có thể khẳng định hợp chất MA2 là apigenin-7-O-β-D-glucosid. 3.2.3. Hợp chất MA3: apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid Chất bột vô định hình màu vàng Nhiệt độ nóng chảy: tnc = 297 - 298 ˚C Công thức phân tử C26H28O14, M = 564 1 13 Số liệu phổ H- và C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.3 Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất MA3 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của chất MA3 và chất tham khảo # a,b a,c C δC δC δH (mult., J=Hz) 2 167.0 167.1 - 25
33. 3 104.2 103.6 6.61 (1H, s) 4 184.0 184.2 - 5 163.1 164.5 - 6 101.1 101.0 6.46 (1H, d, 1.5) 7 164.8 164.8 - 8 96.2 95.8 6,77 (1H, d, 1.5) 9 159.1 158.9 - 10 107.2 107.0 - 1′ 123.1 121.9 - 2′,6′ 129.8 129.7 7.85 (2H, d, 8.5) 3′, 5′ 117.2 117.6 6.90 (2H, d, 8.5) 4′ 163.2 164.5 - Glu 1′′ 100.2 100.2 5.15 (1H, d, 8.0) 2′′ 78.9 78.7 3.71 (1H, dd, 8.0, 9.0) 3′′ 78.6 78.4 3.69 (1H, t, 9.0) 4′′ 71.5 71.3 3.45 (1H, t, 9.0) 5′′ 78.4 78.7 3.71 (1H, m) 3.95 (1H, dd, 2.0, 12.0) 6′′ 62.7 62.5 3.74 (1H, dd, 5.0, 12.0) Apio 1′′′ 111.1 110.9 5.48 (1H, d, 1.5) 2′′′ 78.3 78.1 3.99 (1H, d, 1.5) 3′′′ 80.8 80.7 - 4.07 (1H, d, 9.5) 4′′′ 75.6 75.4 3.84 (1H, d, 9.5) 5′′′ 66.0 65.9 3.58 (2H, br s) a b c Đo trong CD3OD, 125 MHz, 500 MHz, # δC của apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1->2)- β-D- glucopyranosid [15] Hợp chất MA3 phân lập được dưới dạng bột vô định hình, màu vàng. Trên 1 phổ H-NMR của hợp chất MA3 thấy có xuất hiện cặp tín hiệu doublet tại δH 6,46 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6) và 6,77 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8) đặc trưng cho hai proton ở vị trí C-6 và C-8 của vòng A và một proton thơm tại δH 6,61(1H, s, H-3) của hợp 26
34. chất flavonoid. Cặp hai tín hiệu doublet khác tại δH 6,90 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, 5′) và 7,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′) đặc trưng cho vòng thơm B thế para. Tín hiệu proton anome tại δH 5,15 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′) và 5,48 (1H, d, J = 1,5 Hz, H- 1′′′) gợi ý trong hợp chất MA3 có mặt 2 gốc đường. Phổ 13C-NMR và HSQC của hợp chất MA3 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 26 nguyên tử cacbon. Tín hiệu 15 nguyên tử cacbon tại δC 167,1 (C-2), 103,6 (C-3), 184,2 (C-4), 164,5 (C-5), 101,0 (C-6), 164,8 (C-7), 95,8 (C-8), 158,9 (C-9), 107,0 (C-10), 121,9 (C-1′), 129,7 (C-2′, 6′), 117,6 (C-3′, 5′) và 164,5 (C-4′) thuộc khung flavonoid có vòng B thế para tương tự như hợp chất MA2. Sự khác biệt duy nhất là có thêm một phân tử đường. Độ chuyển dịch hóa học tại C-2 tăng nhẹ (73,1 lên 78,7) gợi ý xuất hiện liên kết glycosid ở C-2 của đường glucose. So sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất MA3 với hợp chất apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)- β-D-glucopyranosid thấy sự phù hợp hoàn toàn [15]. Như vậy, có thể khẳng định hợp chất MA3 là apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid. 3.3. Thảo luận kết quả Từ phân lớp nước thu được 3 hợp chất flavonoid dạng flavon. Các howph chất thuộc nhóm flavon, cũng như một số dẫn xuất tổng hợp của chúng, đã được chứng minh là thể hiện một số hoạt động sinh học, bao gồm chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, chống nhiễm độc gen, chống dị ứng, bảo vệ thần kinh, bảo vệ tim mạch và kháng khuẩn. 3.3.1. Vitexin Hợp chất MA1 (vitexin) có mặt trong nhiều loại thực vật và có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Từ phân đoạn EtOAc của lá cây Gừa, bằng kỹ thuật sắc ký kết hợp với các phương pháp phổ NMR, MS đã phân lập và xác định được hợp chất polyphenol là vitexin với độ tinh khiết cao có thể dùng làm chất đối chiếu trong định tính, định lượng. Trong đó, vitexin lần đầu tiên được báo cáo có trong lá cây Gừa. Đã sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng mô hình DPPH của phân đoạn ethyl acetat, vitexin cho thấy các mẫu thử trên có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Lá Gừa là nguồn nguyên liệu rất có tiềm năng trong sản xuất thuốc chống oxy hóa [3]. 27
35. 3.3.2. Apigenin-7-O-β-D-glucosid Hợp chất này có mặt trong nhiều loài thực vật như Hương nhu Hải Châu (E. splendens), Kinh giới lá rách (S. tenuifolia), Cùm sọc (K. Striata, và có hoạt tính chống oxy hóa [10], chống HIV tại IC50 > 100 µg/ml và EC50 = 1,8 µg/ml [26] và chống ung thư [17]. Apigenin-7-O-β-D-glucosid thể hiện hoạt động chống tăng sinh và chống oxy hóa mạnh đối với các loại oxy phản ứng (ROS) trong ống nghiệm theo cách phụ thuộc nồng độ. Nghiên cứu in vitro thể hiện hoạt động chống tăng sinh đáng kể chống lại các tế bào khối u ác tính B16F10 sau 24 và 48 giờ ủ. Apigenin-7-O-β-D-glucosid tăng cường tổng hợp melanogenesis và hoạt động tyrosinas của các tế bào u ác tính B16F10, đặc biệt gây ra sự biệt hóa của các tế bào CD34 + đối với dòng hồng cầu và ức chế sự biệt hóa của tủy. 3.3.3. Apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid Hợp chất apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid có mặt trong nhiều loài thực vật như Crotalaria anagyroides, Kochujang, và có hoạt tính chống oxy hóa [15] và chống Hepatitis B virus (HBV) [30]. Nhằm cung cấp những kiến thức về nguyên liệu lá cây Bùm bụp góp phần ứng dụng trong chăm sóc sức khỏe, đề tài nghiên cứu đã phân lập được 3 hợp chất trên, ta thấy đây là nguồn dược liệu rất hữu ích, vì vậy cần nghiên cứu, phát triển hơn nữa để cây Bùm bụp có thể được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng. 28
36. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận: “Nghiên cứu phân lập các hợp chất flavonoid từ loài Bùm bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell. – Arg.]” đã thu được một số kết quả như sau: + Bằng các kỹ thuật sắc ký đã phân lập được 3 hợp chất flavonoid từ dịch chiết methanol của cây Bùm bụp (Mallotus apelta). + Kết hợp với các phương pháp phổ phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HMBC, HSQC) đã xác định được cấu trúc của 3 hợp chất lần lươṭ là vitexin (MA1), apigenin-7-O-β-D-glucosid (MA2) và apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid (MA3). Kiến nghị: Qua các nguồn tài liệu tham khảo trước có thể thấy loài thuộc chi Mallotus chứa nhiều hợp chất thuốc nhóm flavonoid có hoạt tính sinh học tốt cho sức khỏe con người. Do đó, em đề nghị tiếp tục nghiên cứu phân lập thêm các hợp chất có trong Mallotus apelta, đưa thêm chất này vào kho tàng dữ liệu các hợp chất thiên nhiên và đánh giá hoạt tính của các hợp chất phân lập được. 29
37. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Như, Nguyễn Tập &Trần Toàn; (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 2. Võ Văn Chi; (2001), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Công nghệ, Hà Nội. 3. Huỳnh Anh Duy &Huỳnh Ngọc Thụy; (2015), "Phân lập catechin, vitexin và xây dựng quy trình định lượng vitexin từ lá cây gừa (Ficus microcarpa Lf)", Tạp chí Dược học, 55 (4), 50-53. 4. Đỗ Tất Lợi; (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Công nghệ, Hà Nội. 5. Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Lã Đình Mỡi, Phạm Quốc Long, Nguyễn Thị Kim Thanh, Nguyễn Xuân Cường &Nguyễn Hoài Nam; (2009), Chi Mallotus hóa học, hoạt tính sinh học và sắc ký fingerprint, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội. 6. Lê Ngọc Tân, Đỗ Mạnh Dũng &Phạm Văn Hiển; (2019), "Đinḥ lương̣ đồng thời astilbin và emodin trong bài thuốc GK1 bằng phương pháp HPLC", Tạp chí Dược học,59 (6), 16-21. 7. Nguyễn Nghĩa Thìn; (2003), Danh lục các loài thực vật Việt Nam NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Tiếng Anh 8. T. An, L. Hu, X. Cheng &Z. Chen (2001), "Benzopyran derivatives from Mallotus apelta", Phytochemistry, 57 (2), 273-278. 9. Tian-Ying An, Li-Hong Hu, Xiao-Fang Cheng &Zhong-Liang Chen (2003), "Two new benzopyran derivatives from Mallotus apelta", Nat. Prod. Res., 17 (5), 325-328. 10. Zaixing Chen, Xixiang Ying, Shu Meng, Xu Zhu, Hong Jiang, Qishen Cao, Xuying Li &Fanhao; Meng (2011), "High-performance liquid chromatographic determination and pharmacokinetic study of apigenin-7-O- β-D-glucoside in rat plasma after intravenous administration", Arch Pharm Res, 34 (5), 741. 11. X. F. Cheng &Z. L. Chen (2000), "Coumarinolignoids of Mallotus apelta", Fitoterapia, 71 (3), 341-342. 12. Xiao-Fang Cheng &Zhong-Liang Chen (1999), "Three new diterpenoids from Mallotus apelta Muell. Arg", J. Asian Nat. Prod. Res., 1 (4), 319-325. 13. Xiao-Fang Cheng, Zhongliang Chen &Zeng-Mu Meng (1999), "Two new diterpenoids from Mallotus apelta Muell. Arg", J. Asian Nat. Prod. Res., 1 (3), 163-168. 14. Xiao-Fang Cheng, Zeng-Mu Meng &Zhong-Liang Chen (1998), "A pyridine- type alkaloid from Mallotus Apelta", Phytochemistry, 49 (7), 2193-2194.
38. 15. Jin Ho Chung, Heung-Chule Shin, Jeong-Yong Cho, Seong-Koo Kang, Hyoung Jae Lee, Soo-Cheol Shin, Keun-Hyung Park &Jae-Hak Moon (2009), "Isolation and structural determination of free radical scavenging compounds from Korean fermented red pepper paste (Kochujang)", Food Science Biotechnology,18 (2), 463-470. 16. Phan Van Kiem, Nguyen Hai Dang, Ha Viet Bao, Hoang Thanh Huong, Chau Van Minh, Le Mai Huong, Jung Joon Lee &Young Ho Kim (2005), "New cytotoxic benzopyrans from the leaves of Mallotus apelta", Arch. Pharmacal Res., 28 (10), 1131-1134. 17. Masao Kikuchi &Noriko Matsuda (1996), "Flavone glycosides from Lonicera gracilipes var. glandulosa", Journal of natural products,59 (3), 314-315. 18. Jin Hwa Kim, Bum Chun Lee, Jin Hui Kim, Gwan Sub Sim, Dong Hwan Lee, Kyung Eun Lee, Yeo Pyo Yun &Hyeong Bae Pyo (2005), "The isolation and antioxidative effects of vitexin fromAcer palmatum", Archives of pharmacal research,28 (2), 195. 19. Masayoshi Kubo, Hiroshi Sasaki, Tohru Endo, HEIHACHIRO TAGUCHI &ITIRO YOSIOKA (1986), "The Constituents of Schizonepeta tenuifolia BRIQ. II.: Structure of a New Monoterpene Glucoside, Schizonepetoside C", Chemical pharmaceutical bulletin, 34 (8), 3097-3101. 20. Phung Ngan Le, Dinh Chuong Pham, Dai Hai Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Vladimir Dimitrov, Petko Ivanov, Cuong Nguyen Xuan, Hoai Nam Nguyen &Cuu Khoa Nguyen (2017), "Poly (N-isopropylacrylamide)-functionalized dendrimer as a thermosensitive nanoplatform for delivering malloapelta B against HepG2 cancer cell proliferation", Adv. Nat. Sci.: Nanosci. Nanotechnol., 8 (2), 025014/1-025014/7. 21. Xin Chao Liu, Xu Bo Chen &Zhi Long Liu (2014), "Gas chromatography-mass spectrometric analysis and insecticidal activity of essential oil of aerial parts of Mallotus apelta (Lour.) Muell.-Arg. (Euphorbiaceae)", Trop. J. Pharm. Res., 13 (9), 1515-1520. 22. Tailiang Lu, Shengping Deng, Chen Li, Liangdeng Wu, Ruiyun Yang &Jun Li (2014), "A new chromone from the twig of Mallotus apelta", Nat. Prod. Res., 28 (21), 1864-1868. 23. Hoai Nam Nguyen, Hai Dang Nguyen, Van Kiem Phan, Van Chinh Luu, Thi Binh Phan, Dinh Moi La &Van Minh Chau (2007), "Study on benzopyrans and other isolated compounds from Mallotus apelta", Tap Chi Hoa Hoc, 45 (DB), 111-121. 24. C. Riviere, V. Nguyen Thi Hong, Q. Tran Hong, G. Chataigne, N. Nguyen Hoai, B. Dejaegher, C. Tistaert, T. Nguyen Thi Kim, Y. Vander Heyden, M. Chau Van &J. Quetin-Leclercq (2010), "Mallotus species from Vietnamese mountainous areas: phytochemistry and pharmacological activities", Phytochem. Rev., 9 (2), 217-253. 25. XQ Shan, LB Feng &CS Wu (1985), "Chemical constituents of the roots of Mallotus apelt a (Lour.) Muell.-Arg", Zhiwu Xuebao, 2 (27), 192-195.
39. 26. Renjiu Tang, Ke Chen, Mark Cosentino &Kuo-Hsiung Lee (1994), "Apigenin- 7-O-β-D-glucopyranoside, an anti-HIV principle from Kummerowia striata", Bioorg.Med.Chem.Lett, 4 (3), 455-458. 27. J. Viaene, M. Goodarzi, B. Dejaegher, C. Tistaert, A. Hoang Le Tuan, N. Nguyen Hoai, M. Chau Van, J. Quetin-Leclercq &Y. Vander Heyden (2015), "Discrimination and classification techniques applied on Mallotus and Phyllanthus high performance liquid chromatography fingerprints", Anal. Chim. Acta, 877 41-50. 28. Jian-Fu Xu, Zi-Ming Feng, Jian Liu &Pei-Cheng Zhang (2008), "New hepatoprotective coumarinolignoids from Mallotus apelta", Chem. Biodiversity, 5 (4), 591-597. 29. Shu Xu, Zhi-Ping Lü, Hong-Bing Cai, Xiao-Gang Zhang, Qiang Liu &Yan Tan (2006), "Inhibiting effects of root of Mallotus apelta on duck hepatitis B virus", Taylor & Francis, 4 (3), 285-288. 30. Bo Zhang, Ling Lai, Yanjun Tan, Qiuyun Liang, Facheng Bai, Wanting Mai, Qiujie Huang &Yong Ye (2020), "Hepatoprotective effect of total flavonoids of Mallotus apelta (Lour.) Muell. Arg. leaf against carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in rats via modulation of TGF-β1/Smad and NF-κB signaling pathways", Journal of Ethnopharmacology, 254 112714.
40. PHỤ LỤC DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT MA1 (vitexin) Hình 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất MA1 Hình 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất MA1
41. Hình 3. Phổ HSQC của hợp chất MA1 Hình 4. Phổ HMBC của hợp chất MA1
42. DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT MA2 (apigenin-7-O-β-D-glucosid) Hình 5. Phổ 1H - NMR của hợp chất MA2 Hình 6. Phổ 13C - NMR của hợp chất MA2
43. Hình 7.Phổ HSQC của hợp chất MA2 DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT MA3 (apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid) Hình 8. Phổ 1H-NMR của hợp chất MA3
44. Hình 9. Phổ 13C-NMR của hợp chất MA3 Hình 10.Phổ HSQC của hợp chất MA3